CN113652473B

CN113652473B - 单分子检测dna损伤位点的荧光化学传感器及方法和应用

Info

Publication number: CN113652473B
Application number: CN202110741221.4A
Authority: CN
Inventors: 张春阳; 张艳; 马飞; 韩赟; 邹笑然
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN113652473A

Abstract

本发明涉及单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器及方法和应用。所述荧光化学传感器包括末端脱氧核苷酸转移酶、甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶、多核苷酸激酶，Fpg识别并切除DNA的两个8‑oxoG碱基，产生单链DNA片段和双链DNA片段。Fpg是一种双功能DNA糖基化酶，具有DNA糖基化酶和AP裂解酶活性，它可以识别并切除两个8‑oxoG碱基，产生两个DNA片段。PNK催化两个DNA片段的3’磷酸端去磷酸化，生成3’OH端。Fpg和PNK两种酶协同作用产生游离的3'OH。还包括poly A链。poly A链与得到的富含U和T的长链进行杂交，实现信号的放大。可检测到低至0.001％的氧化损伤水平。

Description

单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器及方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器及方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

基因组DNA不断受到各种活性氧(ROS)的破坏，如羟基自由基(OH·)、超氧自由基(O2·^-)和过氧化氢(H₂O₂)，内源性和外源性等原因均造成活性氧的破坏，包括细胞代谢副产物、紫外线辐射和化学诱变剂。由于鸟嘌呤(G)具有较低的氧化还原电位，所以在A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)和G四个DNA碱基中，鸟嘌呤(G)最容易受到氧化损伤。特别是氧化G基8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)是最常见的氧化性DNA损伤形式，因为它在突变、致癌和衰老中起着至关重要的作用。与G不同，8-oxoG在8号碳(C8)上有一个羰基，在7号氮(N7)上有一个氢原子，这使得它很容易通过氢键与A碱基对结合。由此产生的8-oxoG-A碱基对可导致DNA复制过程中的G碱基到T碱基的转位突变，从而扰乱正常的基因调控系统，导致多种人类疾病的发病，包括帕金森病、阿尔茨海默病和多种癌症。此外，8-oxoG被认为是估计细胞氧化应激水平的有效指标。因此，8-oxoG的检测在DNA氧化损伤相关的临床应用和基础生物学研究中都具有很高的价值。

传统的分析方法如高效液相色谱-电化学检测(HPLC-CED)、反相高效液相色谱、毛细管电泳、凝胶电泳、气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)法已广泛应用于8-oxoG的测定，其中以高效液相色谱-电化学检测法最为流行，高效液相色谱-电化学检测涉及大量数据分析以及需要进一步验证分析结果，因此非常耗时。毛细管电泳的重现性较差，往往费时费力。凝胶电泳存在操作繁琐、灵敏度较低、分析时间长等缺点。所以这些方法具有费时费力，易受生物基质干扰的缺点，需要熟练的人员，但是由于在样品加工过程中不可避免的产生鸟嘌呤碱基人工氧化，所以往往会高估结果。

基于抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化、电化学和化学发光方法已经应用于8-oxoG检测。其中酶联免疫吸附试验(ELISA)的操作较为繁琐，所测得的灵敏度较低，花费的成本高。然而，除了繁琐的程序外，这些方法中使用的抗体对8-oxoG靶点的特异性有限，因为总DNA样本中存在过量的未受损G碱基。近年来，已经构建了用于8-oxoG荧光检测的分裂荧光素酶生物传感器，具有较高的特异性，但构建多个重组蛋白技术难度较大，相对繁琐。此外，目前报道的8-oxoG检测由于缺乏信号放大策略，灵敏度较低，难以准确检测临床样本等有限来源的低含量8-oxoG损伤。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器及方法和应用。将特定的损伤位点超支化扩增与单分子检测相结合，构建了一种新的超灵敏8-oxoG检测荧光生物传感器。该方法具有高度的特异性，该发明的提出克服了以往方法的不足，引入单分子技术更是大大提高检测的灵敏度，真正实现了简单、准确、灵敏、高效等优势。该生物传感器可用于多种人类细胞系提取的基因组DNA中8-oxoG损伤的定量检测。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

第一方面，单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)、甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶(Fpg)、多核苷酸激酶(PNK)，Fpg识别并切除DNA的两个8-oxoG碱基，产生单链DNA片段和双链DNA片段。

Fpg是一种双功能DNA糖基化酶，具有DNA糖基化酶和AP裂解酶活性，它可以识别并切除两个8-oxoG碱基，产生两个DNA片段。PNK催化两个DNA片段的3’磷酸端去磷酸化，生成3’OH端。Fpg和PNK两种酶协同作用产生游离的3'OH。

随后通过末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)介导的位点特异性超支化核酸扩增，触发大量Cy5标记的dUTP的掺入。产生丰富的Cy5-dUTP单核苷酸，通过单分子检测可灵敏地定量分析。该生物传感器具有较高的特异性，在大量正常DNA序列的干扰下，可检测到低至0.001％的氧化损伤水平。

末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)是一种不依赖模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸掺入DNA分子的3'-羟基端。具有介导的无需模板的超分支化扩增的作用，诱导超支化扩增产生大量带有Cy5标记的DNA产物，然后可以产生丰富的Cy5-dUTP单核苷酸，大大提高了检测灵敏度。

通过单分子检测可灵敏地定量分析。该生物传感器具有较高的特异性，在大量正常DNA序列的干扰下，可检测到低至0.001％的氧化损伤水平。

在本发明的一些实施方式中，还包括poly A链。poly A链与得到的富含U和T的长链进行杂交，poly A的3’-OH末端可以启动TDT介导的延伸反应，形成新的富含U和T的Cy5标记链。新的poly A链可能与新形成的U和T富链杂交，诱导超支化扩增产生大量带有Cy5标记的DNA产物。这个过程实现信号的放大。

在本发明的一些实施方式中，还包括链霉亲和素包裹的磁珠和生物素标记的核苷酸。加入生物素标记的核苷酸以抑制非特异性聚合。

在本发明的一些实施方式中，生物素标记的核苷酸包括biotin-ddATP、biotin-dCTP、biotin-dTTP。具体的，与DNA进行生物素标记时，对应的是biotin-ddATP；与DNA片段1的3’-OH末端标记时，对应的是biotin-dCTP；与DNA1和DNA2的3’羟基末端结合，对应的是biotin-dTTP。

在本发明的一些实施方式中，DNA损伤位点包括孤立性DNA损伤位点和聚集性DNA损伤位点。孤立的DNA损伤是一个远离其他损伤的损伤位点，而聚集的DNA损伤是两个或多个距离较近的损伤位点。

在本发明的一些实施方式中，还包括外切酶；进一步外切酶包括外切酶I(Exo I)和外切酶III(Exo III)。分离出游离Cy5-dUTP后，经过外切酶I(Exo I)和外切酶III(ExoIII)的切割，得到丰富的Cy5-dUTP单核苷酸。

第二方面，利用上述的单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器进行检测DNA损伤位点的方法，所述方法为：

生物素化的DNA与链霉亲和素包裹的磁珠混合发生捕获，得到磁珠DNA；

磁珠DNA被甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶处理，磁珠DNA被切除两个8-oxoG碱基，得到两个DNA片段；

然后加入多核苷酸激酶(PNK)，催化两个DNA片段的3’磷酸端去磷酸化，生成3’OH端，两个DNA片段的3’OH在TDT扩增酶的作用下与Cy5-dUTP、生物素标记的核苷酸(biotin-dTTP)结合，得到带有Cy5标记的富含U和T的长链；

通过链酶亲和素-生物素的相互作用，生物素化的DNA被链霉亲和素包裹的磁珠捕获；引入磁分离技术可以有效地消除生物基质和游离荧光Cy5-dUTP的干扰。

磁珠DNA被甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶(Fpg)处理，Fpg识别8-oxoG碱基并切除两个8-oxoG碱基，产生两个DNA片段。

DNA片段的3’磷酸端去磷酸化，生成3’OH端，利于后续进行扩增。

dTTP和Cy5-dUTP在TDT扩增酶的作用下结合到DNA1和DNA2的3’羟基末端，扩增出带有Cy5标记的富含U和T的长链，然后与poly A链杂交，诱导超支化扩增产生大量带有Cy5标记的DNA产物，大大提高了检测灵敏度。

通过poly A链杂交进行扩增得到大量带有Cy5标记的DNA产物，得到Cy5-dUTP单核苷酸进行检测可以定量分析，引入单分子检测和损伤位点超支化扩增诱导的高效信号增强技术，使该生物传感器对8-oxoG损伤检测具有较高的灵敏度和良好的特异性。

在本发明的一些实施方式中，生物素化的DNA的制备方法：通过末端脱氧核苷酸转移酶介导使生物素标记的核苷酸掺入DNA。在TDT酶的作用下，将生物素标记的biotin-ddATP掺入羟基末端以抑制非特异性聚合。

在本发明的一些实施方式中，两个DNA片段分别为单链DNA片段1(DNA1)和双链DNA片段2(DNA2)。

在本发明的一些实施方式中，单链DNA片段1的3’OH端用生物素标记的核苷酸(biotin-dCTP)整合。这个处理步骤，有利于促进DNA与磁珠的连接。

在本发明的一些实施方式中，带有Cy5标记的富含U和T的长链与poly A链杂交得到带有Cy5标记的DNA产物，分离出Cy5-dUTP后经过外切酶切割后得到Cy5-dUTP单核苷酸。

在本发明的一些实施方式中，poly A链的浓度≤0.5微摩尔每升。过量的poly A可能会导致引物形成二聚体，阻碍扩增反应。

在本发明的一些实施方式中，poly A链与富含U和T的长链进行杂交，poly A的3’-OH末端启动TDT介导的延伸反应，形成新的富含U和T的Cy5标记链。

在本发明的一些实施方式中，新的poly A链与新形成的U和T富链杂交，引发新的TDT介导的延伸反应周期，诱导超支化扩增产生大量带有Cy5标记的DNA产物。诱导超支化扩增产生大量带有Cy5标记的DNA产物，大大提高了检测灵敏度。

在本发明的一些实施方式中，分离出游离Cy5-dUTP后，经过外切酶I(Exo I)和外切酶III(Exo III)的切割，得到丰富的Cy5-dUTP单核苷酸。

在本发明的一些实施方式中，Cy5-dUTP单核苷酸通过单分子检测得到DNA的损伤位点结果。

第三方面，上述的单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器在DNA氧化损伤检测中的应用。

在本发明的一些实施方式中，DNA包括KRAS。

本发明一个或多个技术方案具有以下有益效果：

已有方法为了提高灵敏度引入了多种核酸扩增方法，但是这些方法通常需要特定的核酸内切酶识别序列，增加了DNA探针设计的复杂性。该方法利用了末端转移酶(TDT)不需要任何DNA模板即可实现催化脱氧核苷酸三磷酸重复加入DNA分子的3'-羟基末端(3'-OH)的特点，使得DNA探针设计简单化。

该方法利用Fpg羰基化酶具有DNA糖基化酶和AP裂解酶活性，它可以识别并切除两个8-oxoG碱基；加入多核苷酸激酶(PNK)催化两个DNA片段的3’磷酸端去磷酸化，生成3’OH端。将目标DNA损伤信号高效转导为可放大的DNA信号。

该方法引入磁珠可以有效地消除生物基质和游离荧光Cy5-dUTP的干扰，降低的背景信号。单分子检测降低检测成本并提高检测灵敏度。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：检测DNA损伤位点的方法机理图。

图2：(A)反应产物的PAGE分析，泳道1，正常KRAS(对照)，泳道2，KRAS-8-oxoG+polyA，泳道3，KRAS-8-oxoG；(B)在存在KRAS-8-oxoG+polyA(红线)、KRAS-8-oxoG(绿线)和正常KRAS(对照，黑线)情况下的荧光发射光谱；(C)Cy5荧光分子在正常KRAS(对照)、KRAS-8-oxoG和KRAS-8-oxoG+polyA存在下的单分子荧光图像，比例尺为2.5微米。

图3：产生的Cy5计数图，其中，(A)测量不同浓度的TDT产生的Cy5计数。(B)测量不同浓度的polyA产生的Cy5计数，误差棒显示了三个实验的标准偏差。

图4:测量不同浓度的KRAS-8-oxoG产生的Cy5计数结果，插图显示Cy5计数与KRAS-8-oxoG浓度在10阿摩尔每升到10纳摩尔每升范围内的对数之间呈线性关系。误差棒显示了三个实验的标准偏差。

图5：(A)Cy5计数与KRAS-8-oxoG和正常KRAS序列的混合物中的8-oxoG的水平之间的线性关系；(B)检测KRAS-8-oxoG-5和正常KRAS序列的混合物中的8-oxoG的水平的测量值与实际输入值之间的相关性，误差棒显示了三个实验的标准偏差。

图6：(A)HeLa细胞暴露于0～150微摩尔每升不同浓度H₂O₂时的Cy5计数结果图，(B)150微摩尔每升H₂O₂处理0.01～10纳克HeLa细胞后不同数量的基因组DNA对Cy5计数的响应。误差棒显示了三个实验的标准偏差。

图7：H₂O₂处理不同细胞的Cy5计数，误差棒显示了三个实验的标准偏差。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面结合实施例对本发明进一步说明

实施例1

如图1所示，DNA损伤的检测：为了阻断DNA的3’-OH末端，将1微升的KRAS-8-oxoG，1微摩尔每升的biotin-ddATP、1×TDT缓冲液、0.25毫摩尔每升CoCl₂和8单位的TDT分别放在10微升的反应液中37℃孵育1小时。为检测基因组DNA损伤，在封闭3’-OH前，将基因组DNA片段用总体积为10微升的溶液中处理(8单位APE1，1×NEBuffer 4)，在37℃下孵育1h，去除碱基位点。将链霉亲和素包被的磁珠加入反应混合物中，去除多余的生物素ddATP。为切除8-oxoG，将8-oxoG损伤的KARS基因、1×NEBuffer 1、1×BSA、1×PNK缓冲液、6单位Fpg和3单位PNK分别置于10微升反应液中37℃孵育1h。然后1微摩尔每升biotin-dCTP，1×TDT缓冲液,0.25毫摩尔每升CoCl₂和8单位TDT被添加到反应混合物总量的15微升溶液中，在37℃中孵育30分钟。分离生物素化的DNA链被添加在10μL反应混合物(1毫摩尔每升dTTP，12.5微摩尔每升Cy5-dUTP，1×TDT缓冲液，0.25毫摩尔每升CoCl₂和8单位TDT)，避光在37℃中孵育1h。随后，0.5微摩尔每升的polyA添加到反应混合物中，继续孵育30分钟。洗完磁珠之后，在含有1×Exo I和1×ExoIII反应缓冲液，8单位的核酸外切酶I和III的10微升反应体系中，37℃避光孵育1h。进行磁珠分离之后，取上清进行荧光光谱测量和单分子检测。

图1中的，streptavidin-coated magnetic bead表示链霉亲和素包裹的磁珠。

实验例

荧光检测：Cy5的荧光信号使用一台日立F-7000荧光仪测量收集，在激发波长635nm处测量Cy5的荧光光谱，记录的光谱范围为650～750nm。

单分子检测和数据分析：将1微升消化后的产物用成像缓冲液(10毫摩尔每升Tris-HCl，50毫摩尔每升氯化钾，5毫摩尔每升氯化镁，1毫摩尔每升Trolox，pH 8.0)稀释至2000μL，将10微升样品放在盖玻片上利用全内反射荧光显微镜(Ti-E TIRF，尼康，日本)进行单分子荧光成像。通过使用640nm激光激发Cy5荧光分子。通过Cy5检测通道(661.5-690.5nm滤光片)获取荧光信号。对于数据分析，使用Image J软件选择600×600像素的感兴趣区域。

凝胶电泳分析：反应产物在1×TBE缓冲液(9毫摩尔每升Tris-HCl，9毫摩尔每升硼酸，0.2毫摩尔每升EDTA，pH7.9)中进行了12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在110V恒定电压下室温50分钟。凝胶电泳图像由Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统进行拍摄。

特异性分析：为了研究所提出的方法对8-oxoG水平的特异性检测能力，我们制备了含有两个8-oxoG碱基的KRAS序列(即KRAS-8-oxoG)和正常KRAS序列的混合序列，以不同的比例进行混合。KRAS-8-oxoG和正常KRAS的总浓度为100nM，混合物中分别含有0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％和100％8-oxoG的KRAS。测量的8-oxoG水平是根据下列公式计算的：

式中L为本方法测得的KRAS-8-oxoG的量，N为正常KRAS的量。KRAS是一个正常的基因名称，KRAS突变是癌症最常见的基因突变。

正常KRAS序列(SEQ ID No.1)和(SEQ ID No.2)和合成的含有两个8-oxoG碱基的KRAS序列KRAS-8-oxoG及polyA链(SEQ ID No.3)如表1所示：

细胞培养和基因组DNA的提取：HeLa细胞、A549细胞、SW480细胞和MRC-5细胞在含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的改良培养液(DMEM；Gibco，美国)中培养，温度为37℃伴随百分之五的二氧化碳。然后用PBS缓冲液洗涤细胞，用不同浓度的H₂O₂在37℃、5％CO₂的培养箱中处理1小时。根据制造商的协议，使用QIAamp DNA微试剂盒(Qiagen，德国)提取基因组DNA。基因组DNA用dsDNA片段酶切至50-200bp，遵循制造商的方法。用NanoDrop 2000分光光度计测定基因组DNA的浓度(Thermo Scientific,Wilmington,U.S.A.)。

实验结果如下所示：

1.检测可行性实验

图2中control表示在正常KRAS的条件下，没有荧光传感器的作用过程；KRAS-8-oxoG表示没有poly A加入，没有实施例1的poly A扩增的过程；KRAS-8-oxoG+polyA表示如实施例1的检测方法过程。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对TDT扩增反应进行验证。在正常KRAS存在的情况下(图2A，泳道1)，只观察到目标DNA条带，说明没有发生聚合反应。在KRAS-8-oxoG和polyA的存在下(图2A,泳道2)，目标DNA的带强度变弱，出现分散的TDT扩增产物，说明KRAS-8-oxoG成功裂解，启动了TDT介导的超支化扩增。值得注意的是，当poly A被排除在体系之外时(图2A,泳道3)，仍然可以观察到目标DNA的弱带强度，说明KRAS-8-oxoG成功裂解，但只观察到单一的TDT延伸带，而没有观察到分散带。荧光测量显示，正常KRAS反应产生较低的信号(图2B，黑线)。相比之下，KRAS-8-oxoG的信号比正常KRAS提高了15.91倍(图2B，红线)，说明了超支化扩增诱导的信号放大效率较高。当poly A缺失时(图2B，绿线)，与正常KRAS组相比，信号增强仅为7.97倍，信号改善程度较低，且无超支化扩增。

单分子检测因其超高灵敏度、低样品消耗、高信噪比等显著优势，越来越受到生物传感器发展的关注。扩增产物经核酸酶处理酶切后，对含有荧光单核苷酸Cy5-dUTP的样品进行单分子检测。如图2C所示，在正常KRAS组中几乎看不到Cy5信号，说明在没有8-oxoG损伤的情况下，不能产生Cy5信号。相比之下，KRAS-8-oxoG存在时，Cy5点数丰富，当poly A加入时，Cy5点数进一步增加，表明超支化扩增诱导的信号放大。这些结果清楚地证明了该荧光生物传感器用于8-oxoG DNA损伤检测的可行性。

2.优化实验条件

为了获得最佳的分析性能，我们分别优化了poly A的浓度和TDT的量。如图3A所示，Cy5计数随着TDT的增加而增加，从4单位到8单位，在8单位处达到平台，因此，下面的研究使用TDT的量为8单位。Poly A是TDT介导的信号扩增的核心链。从图3B中可以看出，当poly A浓度从0微摩尔每升增加到0.5微摩尔每升时，Cy5计数增加，当浓度超过0.5微摩尔每升时，Cy5计数减少。这是因为poly A浓度越高，扩增效率越高，但过量的poly A可能会导致引物形成二聚体，阻碍扩增反应。因此，在后续实验中使用0.5微摩尔每升的poly A。

3.检测灵敏度

在最佳实验条件下，我们测量了不同浓度的8-oxoG DNA损伤，以检测该生物传感器的灵敏度。如图4所示，Cy5的数量随着KRAS-8-oxoG浓度的增加而增加，并且Cy5计数在10阿摩尔每升到10纳摩尔每升的大范围内与KRAS-8-oxoG的浓度呈线性关系。回归方程N＝796.15+42.02log₁₀ C(R²＝0.996)，其中N为Cy5计数，C代表KRAS-8-oxoG浓度(摩尔每升)。根据对照组的平均反应加3倍标准差的原则，检测极限可以达到7.62阿摩尔每升。值得注意的是，该方法的灵敏度与丝网印刷石墨电极的电化学方法(0.33微摩尔每升)相比，提高了10个数量级，与液相色谱/串联质谱法(25皮摩尔每升)相比提高了8个数量级，与毛细管电泳法(0.5纳摩尔每升)相比，提高有7个数量级。该生物传感器的高灵敏度可归因于:(1)Fpg和PNK两种DNA修复酶的协同作用，将目标DNA损伤信号高效转导为可放大的DNA信号；(2)磁分离可消除生物基质的干扰，去除游离荧光Cy5-dUTP，从而降低背景信号；(3)损伤位点特异性超支化扩增引起的信号放大；(4)单分子检测可提供高灵敏度和高信噪比。

4.检测选择性

我们通过在含有正常KRAS和KRAS-8-oxoG的混合物中检测KRAS-8-oxoG，研究所提出的生物传感器的特异性。在0.001％到100％的范围内，Cy5计数和输入8-oxoG水平之间得到了线性关系(图5A)。方程为N＝523.03+44.9log₁₀C(R²＝0.994)，其中N为Cy5计数，C为输入8-oxoG水平(％)。这一结果表明，即使存在过量的未受损碱基，该生物传感器对8-oxoG具有良好的特异性。根据图4中的校准曲线，可以计算出测量到的8-oxoG水平，且测量到的8-oxoG水平与实际输入的8-oxoG水平成线性正比(图5B)。方程为Y＝1.001X+0.095(R²＝0.995)，其中Y为测量的8-oxoG水平(％)，X为实际输入的8-oxoG水平(％)。这些结果表明，该方法可以在不含8-oxoG DNA序列干扰的情况下特异性地、灵敏地检测8-oxoG DNA损伤。

5.实际样品分析

通过测量不同浓度H₂O₂处理的HeLa细胞，我们进一步研究了该生物传感器用于实际样本分析的能力。如图6A所示，从0到150微摩尔每升，Cy5计数随着H₂O₂浓度的增加而增加，说明H₂O₂的增加可以引起内源8-oxoG水平的升高，这与前人的研究一致，即外源H₂O₂可通过细胞膜系统进入细胞核后诱导内源性8-oxoG水平升高。150微摩尔每升H₂O₂处理HeLa细胞后，Cy5计数随基因组DNA提取量的增加而增加，且Cy5计数与基因组DNA提取量的对数在0.01～10纳克范围内呈线性相关(图6B)。回归方程为N＝242.47+4 92.65log₁₀ A，其中N为测得的Cy5计数，A为基因组DNA的量(纳克)。值得注意的是，该生物传感器甚至可以检测低至0.01纳克基因组DNA的靶向8-oxoG DNA损伤，该方法优于基于Fpg的自动荧光检测碱性DNA展开(FADU)方法(1微克)。

我们进一步测量了人宫颈癌细胞系(HeLa)、人肺腺癌细胞细胞系(A549)、人结肠癌细胞系(SW480)和人胚胎肺成纤维细胞正常细胞系(MRC-5)的基因组8-oxoG DNA损伤。用150微摩尔每升H₂O₂处理HeLa细胞(红色柱)、A549细胞(绿色柱)、SW480细胞(蓝色柱)和MRC-5细胞(蓝色柱)，测定Cy5计数，如图7所示，KRAS-8-oxoG水平在HeLa细胞>SW480细胞>A549细胞>MRC-5细胞中依次降低，与癌症患者中较高的8-oxoG DNA损伤水平一致。这些结果清楚地表明，所提出的生物传感器可以准确、灵敏地检测实际样本中的8-oxoG DNA损伤。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器及方法和应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacactcttg cctacgccac cagctccaac tacactggc 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccagtgtag ttggagctgg tggcgtaggc aagagtgtc 39

<210> 3

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20

Claims

1.单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器，其特征在于：所述荧光化学传感器包括末端脱氧核苷酸转移酶、甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶Fpg和多核苷酸激酶，Fpg识别并切除DNA的两个8-oxoG碱基，产生单链DNA片段和双链DNA片段；DNA损伤位点包括孤立性DNA损伤位点和聚集性DNA损伤位点；还包括外切酶Exo I、外切酶Exo III、poly A链、链霉亲和素包裹的磁珠、生物素标记的核苷酸、dTTP和Cy5-dUTP；生物素标记的核苷酸包括biotin-ddATP和biotin-dCTP。

2.利用权利要求1所述的单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器进行非疾病诊断目的的检测DNA损伤位点的方法，其特征在于：所述方法为：生物素化的DNA与链霉亲和素包裹的磁珠混合发生捕获，得到磁珠DNA；生物素化的DNA的制备方法：通过末端脱氧核苷酸转移酶介导使生物素标记的核苷酸biotin-ddATP掺入DNA；磁珠DNA被甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶处理，磁珠DNA被切除两个8-oxoG碱基，得到两个DNA片段；两个DNA片段分别为单链DNA片段1和双链DNA片段2;然后多核苷酸激酶催化两个DNA片段的3’磷酸端去磷酸化，生成3’OH端，两个DNA片段的3’OH在TDT扩增酶的作用下与生物素标记的核苷酸biotin-dCTP结合；分离两个DNA片段在TDT扩增酶的作用下将dTTP和Cy5-dUTP结合到两个DNA片段的3’OH端，得到带有Cy5标记的富含U和T的长链；poly A链与富含U和T的长链进行杂交，poly A的3’- OH末端启动TDT介导的延伸反应，形成新的富含U和T的Cy5标记链；新的poly A链与新形成的U和T富链杂交，引发新的TDT介导的延伸反应周期，诱导超支化扩增产生大量带有Cy5标记的DNA产物；分离出游离Cy5-dUTP后，经过外切酶Exo I和外切酶Exo III的切割，得到丰富的Cy5-dUTP单核苷酸。

3.如权利要求2所述的检测DNA损伤位点的方法，其特征在于：单链DNA片段1的3’OH端用生物素标记的核苷酸biotin-dCTP整合。

4.如权利要求2所述的检测DNA损伤位点的方法，其特征在于：poly A链的浓度≤0.5微摩尔每升。