CN114729347A - 未分化标记基因高灵敏度检测法 - Google Patents
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Abstract
提供应用等温核酸扩增法、尤其是LAMP法的再生医疗等制品的中间制品和/或最终制品中混入的未分化的人多能干细胞的高灵敏度且简易的检测法及其试剂盒。检查非未分化细胞群中未分化细胞混入的有无的方法,该方法包括通过等温核酸扩增法检测样品中的未分化细胞与非未分化细胞间表达量具有显著差异的未分化标记基因来源的RNA,其中所述样品包含成为检查对象的细胞群来源的核酸。用于检查非未分化细胞群中未分化细胞混入的有无的试剂盒,其包含能够通过等温核酸扩增法检测未分化细胞与非未分化细胞间表达量具有显著差异的未分化标记基因来源的RNA的试剂。
Description
技术领域
本发明涉及高灵敏度地检测未分化标记基因的方法。
背景技术
在再生医疗等制品中,用于确保人细胞加工制品的品质和安全性的技术要件被规定在多个指南等中(非专利文献1)。在向人移植、施用最终制品的情形中,由于以如人胚胎干细胞(人ES细胞)加工品、人人工多能干细胞(人iPS细胞)加工品的具有致肿瘤性的人多能干细胞为原料,具有起因于混入的未分化多能干细胞的肿瘤形成的风险。
为了防止未分化多能干细胞(下文称为未分化细胞)的混入,需要通过分化效率的提高(培养基成分、细胞因子、生长因子等分化条件的设定)增加目的细胞的存在比率,按需要经纯化、提纯工序(应用抗体、凝集素选择性分离等)排除混入的未分化细胞。同时,在向人移植、施用再生医疗等制品的治疗手段的实用化中,确认未分化细胞的除去和残留的试验法是不可缺的,强烈需要尽可能高灵敏度的未分化细胞检测能力。
与再生医疗等制品的中间制品和/或最终制品中混入的未分化细胞的检测相关,通过用体外试验检测特异性分子标记的评价法是有效的。作为该方法,除了利用细胞表面上的特异性抗原的有无的流式细胞术法、检测培养上清中的分子标记(足糖萼蛋白(podocalyxin)、层粘连蛋白、CD30等,非专利文献2、3、4)的方法之外,列举以见到未分化细胞中的高表达的基因为对象的定量RT-PCR法(quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction(定量逆转录-聚合酶链式反应),下文称为qRT-PCR法(非专利文献5)和数字PCR法(非专利文献6)。成为qRT-PCR法和数字PCR法的基础的聚合酶链式反应(PCR法)通过将1)热变性(94~98℃、30秒等)→2)引物的退火(50~65℃、30秒等)→3)延伸反应(68~72℃、60秒等)的三阶段的温度变化重复25~40次,理论上可以指数相关地扩增靶DNA量。由于通过PCR法的扩增产物量与样品中的模板核酸量和反应循环次数具有相关性,也可应用标记了荧光染料等的探针定量分析,作为可以在比较短时间扩增少量模板核酸的方法,其被认为是基因扩增中的标准方法。
但是,即使在未分化标记基因的检测中应用已知为高灵敏度的方法的qRT-PCR法,定量和/或判定精度也不能说是足够的。这是由于成为再生医疗等制品的中间制品和/或最终制品中的靶的未分化标记基因的分子数非常少,因而靶分子的扩增效率降低,不引起指数相关的扩增。在这样的情形中,可通过增加每1反应的核酸测试量、增加靶分子确保扩增效率,但在用一般液体量的qRT-PCR法的情形中,每1反应100ng左右是上限。这是由于伴随夹杂核酸的增加,产生扩增反应抑制和非特异性扩增。为了增加核酸测试量至该上限以上,需要增加每1反应的反应液量,但对于一般的PCR反应,为了迅速且正确进行上述三阶段的温度变化,反应管置于作为专用仪器的热循环仪上的热块中,限定于5~100μL左右的反应液量,不是优选的。
PCR是以往在一个容器内进行的反应,但数字PCR是将核酸样品分散于微小隔室内(油滴等)有限稀释后进行核酸扩增反应,作为利用统计方法定量靶核酸的分子数的方法受到关注。但是,也具有需要特殊且昂贵的专用装置、试验成本高等缺点,尚未广泛普及。
此外,在处理多个种类的细胞和多个个体(细胞提供者)来源的细胞的设备中,通过SNPs(单核苷酸多态性)分析来分析细胞的污染的有无,但用SNPs分析无法检测同一个体的细胞彼此的污染,例如未分化的细胞对分化细胞的交叉污染。
迄今为止进行了多数作为标准的核酸扩增法的PCR法的改良研究,开发了以温和的温度条件为基础快速进行扩增反应、扩增效率也高的等温核酸扩增法。作为规定温度条件下可扩增核酸的方法,报告了LAMP法(Loop-mediated Isothermal Amplification(环介导等温扩增),专利文献1)、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification(基于核酸序列的扩增),专利文献2,3)、SDA法(Strand Displacement Amplification(链置换扩增),专利文献4)、TRC法(Transcription Reverse-transcription Concerted reaction(转录逆转录协同反应),专利文献5)、ICAN法(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids(等温和嵌合引物引发的核酸扩增),专利文献6)等多个方法。它们在各方法中分别具有需要多个酶、限定模板核酸的种类、需要嵌合引物等特殊引物的特征,需要相应于目的选择最适方法。
由于任一方法都分别在规定温度(40~70℃)连续进行扩增反应,因不需要如PCR法的严格温度控制而具有优点,但至今,尚未报告建立了利用等温核酸扩增法的优点、高灵敏度的未分化标记基因检测法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:关于涉及人细胞加工制品的未分化多能干细胞·转化细胞检测试验、致肿瘤性试验和遗传稳定性评价的指南(日本药生机审发0627第1号、令和元年6月27日)
非专利文献2:Tateno H et al.A medium hyperglycosylated podocalyxinenables noninvasive and quantitative detection of tumorigenic humanpluripotent stem cells.Sci Rep.2014;4:4069.
非专利文献3:Tano K et al.A novel in vitro method for detectingundifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapyproducts using a highly efficient culture system.PLoS One.2014;9:e110496.
非专利文献4:Immunologic targeting of CD30 eliminates tumourigenichuman pluripotent stem cells,allowing safer clinical application of hiPSC-based cell therapy.Sci Rep.2018 Feb 27;8(1):3726.
非专利文献5:Kuroda T et al.Highly sensitive体外methods for detectionof residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cellsderived from human iPS cells.PLoS One.2012;7:e37342.
非专利文献6:Kuroda,T et al.Highly sensitive droplet digital PCRmethod for detection of residual undifferentiated cells in cardiomyocytesderived from human pluripotent stem cells.Regen Therapy 2015;2:17-23.
非专利文献7:Lin,Y et al.Genome dynamics of the human embryonic kidney293lineage in response to cell biology manipulations.Nat Commun 2014;5:4767.
非专利文献8:Sekine,K et al.Robust detection of undifferentiated iPSCamong differentiated cells.Sci Rep 2020;10:10293.
专利文献
专利文献1:日本专利第3313358号
专利文献2:日本专利第2650159号
专利文献3:日本专利第3152927号
专利文献4:美国专利第5270184号
专利文献5:日本专利第4438110号
专利文献6:日本专利第3433929号
发明概述
发明要解决的问题
本发明鉴于上述现状做出,其目的是提供:用于通过应用等温核酸扩增法、尤其是LAMP法,高灵敏度且简易地检测再生医疗等制品的中间制品和/或最终制品中混入的未分化细胞的方法及其试剂盒。
用于解决问题的手段
本发明人关注于,在伴随反应温度变化重复解离和聚合的PCR法中,[1]为了迅速且正确控制反应温度变化反应液量受限,不增加核酸样品的测试量,[2]在带入许多靶核酸以外的夹杂核酸的情形中,具有引起非特异性核酸扩增的可能性、引起核酸扩增和检测的抑制的可能性。认为通过应用在规定温度的条件下、实现高特异性和高扩增效率的核酸扩增的等温核酸扩增法,可增加反应液量,在带入许多夹杂核酸的情形中也可特异性地检测未分化标记基因。深入研究的结果是,通过用LAMP法检测未分化细胞中表达多的未分化标记基因,建立了再生医疗等制品的中间制品和/或最终制品中混入的未分化细胞的高灵敏度且简易的检测法。进一步,对多个未分化标记基因的适用研究的结果是,确认为具有通用性的方法,从而完成本发明。
即,本发明由如下构成组成。
(1)检查非未分化细胞群中未分化细胞混入的有无或混入量的方法,其包括:通过等温核酸扩增法检测在包含成为检査对象的细胞群来源的核酸的样品中的未分化细胞与非未分化细胞间表达量具有显著差异的未分化标记基因来源的RNA。
(2)(1)记载的方法,其中,评价从未分化细胞向非未分化细胞分化诱导时和/或分化诱导后的成为检査对象的细胞群的分化状态。
(3)(2)记载的方法,其中,未分化细胞是多能干细胞或成体干细胞。
(4)(1)~(3)的任一项记载的方法,其中,以非未分化细胞群中混入未分化细胞的样品中的未分化标记基因来源的RNA存在量为前述等温核酸扩增法的检测界限以上、非未分化细胞中的RNA存在量为前述等温核酸扩增法的检测界限以下的RNA为检测对象,在样品中检测到成为检测对象的RNA的情形中,判定为阳性,在样品中未检测到成为检测对象的RNA的情形中,判定为阴性。
(5)(1)~(4)的任一项记载的方法,其中,未分化标记基因来源的RNA满足下述(i)和/或(ii)的条件:
(i)未分化细胞中的RNA表达量与非未分化细胞中的表达量的比是104倍以上,
(ii)非未分化细胞中的RNA表达量是每1μg总RNA量1x104拷贝以下。
(6)(1)~(5)的任一项记载的方法,其中,对于成为检测对象的RNA为模板合成的核酸,应用能够与前述核酸的至少6处的区域退火的至少4种引物,在等温进行核酸扩增。
(7)(1)~(6)的任一项记载的方法,其中,通过具有链置换活性的DNA聚合酶扩增核酸。
(8)(7)记载的方法,其包括:对于成为检测对象的RNA为模板通过逆转录酶合成的核酸,应用能够与前述核酸的至少6处的区域退火的至少4种引物,通过具有链置换活性的DNA聚合酶在等温进行核酸扩增的工序。
(9)(6)~(8)的任一项记载的方法,其中,进一步,应用用于促进反应的引物进行核酸扩增。
(10)(9)记载的方法,其包括:对于成为检测对象的RNA为模板通过逆转录酶合成的核酸,在能够与前述核酸的至少6处的区域退火的至少4种引物中进一步追加用于促进反应的引物,通过具有链置换活性的DNA聚合酶在等温进行核酸扩增的工序。
(11)(1)~(10)的任一项记载的方法,其中,连续进行从成为检测对象的RNA的逆转录至扩增、然后至检测。
(12)用于检查非未分化细胞群中未分化细胞混入的有无或混入量的试剂盒,其包含能够通过等温核酸扩增法检测未分化细胞与非未分化细胞间表达量具有显著差异的未分化标记基因来源的RNA的试剂。
(13)(12)记载的试剂盒,其中,试剂包含引物。
(14)(13)记载的试剂盒,其中,试剂进一步包含探针和/或比色试剂。
发明效果
根据如上述构成的本发明,应用等温核酸扩增法、尤其是LAMP法可以进行高灵敏度的未分化标记基因的检测,可以提高判定再生医疗等制品的中间制品和/或最终制品中未分化细胞的有无的试验的试验精度。进一步,由于本发明利用难以受到夹杂物质的影响的扩增反应,可以利用简易的核酸样品配制法。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请特愿2019-207004的说明书和/或附图中记载的内容。
附图简述
[图1]显示RT-LAMP法的引物设计。
[图2]显示RT-LAMP法的扩增原理。
[图3]显示环引物的设计。
[图4]显示通过未分化iPS细胞添加实验的未分化标记基因的检测灵敏度的研究结果。通过对肝内胚层细胞添加未分化iPS细胞、与未分化iPS细胞非添加群比较,用qRT-PCR研究检测灵敏度。图4(a)显示iPS细胞混入率0至5%中的表达量(相对于18S rRNA)。另一方面,图4(b)显示图4(a)中iPS细胞混入率0至0.25%的结果的放大图。
[图5]显示从人iPSC向肝细胞分化诱导的各分化阶段中未分化标记基因(LINC00678)的表达量(相对于18S rRNA)。“DE”是Definitive Endoderm(胚体内胚层),“HE”是Hepatic Endoderm(肝内胚层),“IH”是Inmature hepatocyte-like cell(未成熟肝细胞样细胞),“MH”是Mature hepatocyte-like cell(成熟肝细胞样细胞)。
[图6]显示从人iPSC向肝细胞分化诱导的各分化阶段中未分化标记基因(PRDM14)的表达量(相对于18S rRNA)。“DE”是Definitive Endoderm(胚体内胚层)、“HE”是HepaticEndoderm(肝内胚层),“IH”是Inmature hepatocyte-like cell(未成熟肝细胞样细胞),“MH”是Mature hepatocyte-like cell(成熟肝细胞样细胞)。
用于实施发明的方式
以下,详细说明本发明。
本发明提供检查非未分化细胞群中未分化细胞混入的有无或混入量的方法,该方法包括:通过等温核酸扩增法检测在包含成为检査对象的细胞群来源的核酸的样品中的来自未分化细胞与非未分化细胞间表达量(存在量)具有显著差异的未分化标记基因的RNA。
在本发明中,未分化细胞可以是人或人以外的哺乳动物的具有多能性的细胞,例如,未分化细胞是选自胚胎肿瘤细胞(EC细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、成体(组织)干细胞等的至少一种多能干细胞。
在本发明中,非未分化细胞只要是能够与未分化细胞区别的细胞即可,例如,可以列举来自多能干细胞的、不是初期状态的未分化细胞原样、向靶细胞(例如,肝细胞、血管内皮细胞、神经细胞等)“充分分化的细胞”、“分化途中的细胞”等。“分化途中的细胞”的分化程度不论,可以是分化为注定向靶细胞分化程度的细胞,也可以是分化为尚未注定向靶细胞分化程度的细胞。非未分化细胞可以是“向靶细胞(例如,肝细胞、血管内皮细胞、神经细胞等)分化的过程中构成充分分化的细胞、尚在分化途中的细胞等多种状态的细胞群的细胞”。此外,非未分化细胞可以是“不限于来自多能干细胞的分化细胞的培养细胞”。
在本发明中,样品是“包含成为检査对象的细胞群来源的核酸的样品”,可以示例“从细胞群提取的核酸”、“不经核酸的提取过程的细胞群”、“不经核酸的提取工序、包含细胞群的培养液”、“不经核酸的提取工序、不含细胞群的培养液”等。“成为检査对象的细胞群”可以是可包含未分化细胞的非未分化细胞群。
在本发明的方法中,通过等温核酸扩增法检测未分化细胞与非未分化细胞间表达量具有显著差异的未分化标记基因来源的RNA。未分化细胞与非未分化细胞间表达量具有显著差异的未分化标记基因来源的RNA只要是未分化细胞与非未分化细胞间表达量具有显著差异的RNA即可,优选伴随分化过程进行的时间经过,显示减少变化的RNA,例如,基于通过qRT-PCR得到的定量分析数据,在学生t检验中,通过在将显著水平设为5%的情形中将p值不足0.05作为具有显著差异,可以求得显著差异的有无。
在本发明的检查非未分化细胞群中未分化细胞混入的有无的方法中,优选将分化过程中表达量减少的RNA作为检测对象,进一步优选该表达量的减少是显著的变化。在需要高灵敏度的检测性能的以否定未分化细胞混入为目的的检査中,检测对象的RNA在未分化细胞中的表达量越高越好,并且,非未分化细胞中的表达量越低越好。具体地,未分化细胞中的RNA表达量与非未分化细胞中的表达量的比优选是104倍以上,更优选是105倍以上,最优选是106倍以上。和/或非未分化细胞中的RNA表达量优选是每1μg总RNA量1x104拷贝以下,更优选是1x103拷贝以下,更优选是1x102拷贝以下,进一步优选是1x10拷贝以下,理想地可以接近零。作为可以在本发明中使用的RNA的具体实例,除LINC00678、SFRP2、PRDM14、USP44、ESRG、CNMD、LIN28A、SOX2、OCT4、NANOG、TDGF1、TNFRSF8之外,还列举转录组分析、进一步定量PCR法中在未分化细胞中表达高、在非未分化细胞中表达低的论文等中公知的基因,但不限于这些。
另外,RNA可以是从基因组DNA(在真核生物的情形中,也包含线粒体基因组等细胞小器官具有的基因组DNA)转录的RNA,进一步,也可以是转录后接受修饰和加工的那种,例如microRNA、环状RNA。此外,进一步,可以是不编码蛋白的那种,此外,也可以是包含核酸扩增的靶序列的RNA的部分分解产物等。基因组可以是编码蛋白的区域、编码启动子或增强子等转录调节区域的区域、此外的非编码区域的任一种。
关于上面项目中具体描述的非未分化细胞与未分化细胞中未分化标记基因的RNA表达量的差异,可用以下的计算条件(模拟)说明。
作为确定高灵敏度检测微量混入的未分化细胞的方法的要素,列举[1]每一反应的核酸测试量、[2]未分化标记基因的RNA表达量、[3]未分化细胞混入率。
[1]关于每一反应的核酸测试量,作为被检样品的非未分化细胞群的培养状况和细胞的回收数、细胞回收后的提取操作中的核酸样品的提取率、提纯度和浓缩率是有关的。其另一方面,关于基因扩增反应中每一反应的核酸测试量,已知有规定的限制量。在以基因检査中的基因扩增反应公知的PCR法中,已知大量过剩的核酸测试量抑制PCR反应、靶产物的检测。作为其原因,列举因赋予核酸的结构稳定化的镁离子消耗聚合酶的功能降低、因热变性核酸样品的单链化延迟。因此,在PCR中人基因组DNA的情形中,每一反应直至最大500ng(0.5μg)设为每一反应的测试量的上限量目标。此外,在以定量为目的用一般的液体量的qRT-PCR法的情形中,每1反应100ng左右设为上限。因此,在PCR反应中,由于每一反应的核酸测试量限制为少量,难以进一步提高未分化细胞混入率的检测界限(LOD;Limit ofDetection)。作为本发明的试验的特征,在一次基因检査中,由于需要尽可能大量测试来自具有混入未分化细胞的可能性的细胞群的核酸样品,优选不被大量过剩量的核酸样品抑制或难以被其抑制的试验法。
[2]关于未分化标记基因的表达量,优选来自在从未分化细胞的状态至细胞、组织、器官、个体形成的特化(分化)过程中RNA表达量显著变化的基因。具体地,优选分化过程中显示表达量减少变化的RNA,进一步,其表达量的减少显著变化(未分化细胞中的表达量高,并且分化细胞中的表达量低)。
在具有作为被检样品的非未分化细胞的分化过程中RNA表达量不变化、或几乎不变化的特性的基因的情形中,即使可定量RNA表达量的测定系统,也无法把握分化过程的进行度、或未分化细胞混入率。
此外,在具有未分化细胞的状态的RNA表达量不存在或微量、分化过程中RNA表达量增加的特性的基因的情形中,不适于作为否定具有致肿瘤性的未分化细胞少量混入的试验中的标记。
如前述,未分化细胞中的RNA表达量高、并且分化细胞中的RNA表达量低是本发明中的标记基因的条件,进一步,其分化过程中的RNA表达量的减少变化显著是进一步优选的。
[3]在未分化细胞混入率为0.1%(1x10-3)至0%的范围,下文具体地用数值显示模型实例。
作为实例,将未分化细胞和向非未分化细胞分化过程中的标记基因的RNA表达量设为以下条件。
非常高:
1x107拷贝以上/1μg(总RNA)(1x102拷贝以上/10pg总RNA)
3x106拷贝以上/1μg(总RNA)(3x10拷贝以上/10pg总RNA)
1x106拷贝以上/1μg(总RNA)(1x10拷贝以上/10pg总RNA)
高:
3x105拷贝以上/1μg(总RNA)(3拷贝以上/10pg总RNA)
1x105拷贝以上/1μg(总RNA)(1拷贝以上/10pg总RNA)
略低:
3x104拷贝以上/1μg(总RNA)
1x104拷贝以上/1μg(总RNA)
3x103拷贝以上/1μg(总RNA)
低:
1x103拷贝以下/1μg(总RNA)
3x102拷贝以下/1μg(总RNA)
1x102拷贝以下/1μg(总RNA)
非常低:
3x10拷贝以下/1μg(总RNA)
1x10拷贝以下/1μg(总RNA)
0拷贝/1μg(总RNA)
在分化过程中的非未分化细胞群中未分化细胞混入率为0.1%(1x10-3)至0.00005%(5x10-7)的范围,如以下6个方式假设和计算每10μg总RNA的标记基因RNA表达量。
1)标记基因在未分化细胞中表达直至非常高的水平、在检査的非未分化细胞中非常低(接近零)的情形:(分化前后的表达量比是106~107以上)
2)标记基因在未分化细胞中表达直至高水平、在检査的非未分化细胞中非常低(接近零)的情形:(分化前后的表达量比是直至105~106)
3)标记基因在未分化细胞中表达直至略低水平、在检査的非未分化细胞中非常低(接近零)的情形:(分化前后的表达量比是直至104~105)
4)标记基因在未分化细胞中表达直至非常高的水平、在检査的非未分化细胞中低的情形:(分化前后的表达量比是直至104~105)
5)标记基因在未分化细胞中表达直至高水平、在检査的非未分化细胞中低的情形:(分化前后的表达量比是直至102~103)
6)标记基因在未分化细胞中表达直至略低水平、在检査的非未分化细胞中低的情形:(分化前后的表达量比是直至10~102)。
另外,基于由PCR代表的基因扩增法的检査法是特异性扩增检査样品中包含的靶序列、扩增后或与扩增同时检测的方法,其检测灵敏度由每一反应的靶序列拷贝数表示。理论上,扩增反应从1拷贝/实验开始进行,已知为显示高灵敏度且高特异性的检査法。对于该特性,作为相同基因扩增法之一的LAMP法也同样,在以LAMP法为原理的临床诊断目的的检査试剂(市售品)中,以最小检测灵敏度10拷贝/实验(例如:Loopamp SARS冠状病毒检测试剂盒)为特征。如此,在扩增、检测来自病原微生物的特异性碱基序列的感染病检査中,数拷贝/实验水平的高灵敏度检测性能是必需的,通过改变包括应用的引物的碱基序列、引物的量、底物、酶及其催化剂等的浓度的反应组成条件,也可从10拷贝/实验至数千拷贝/实验调整检测灵敏度。即,相应于涉及反应的各条件,其检测灵敏度可变。尤其是,在本发明的方法中,可提供通过反应底物(例如dNTPs)调整检测灵敏度的方法。
本发明中应用的反应底物(dNTPs)的浓度没有特别限定,例如,可设为0.25~3.0mM、0.5~2.5mM、1~2mM,能够通过组合包含使用的引物的碱基序列、引物的量、酶及其催化剂等的其它反应组成条件而改变。例如,在包含少量的模板核酸拷贝数(每一实验10拷贝等)的反应组成中,仅将反应底物(dNTPs)浓度作为可变参数(例如0.5~2.5mM等),在试验开始后的规定时间内(90分钟等)试验扩增反应的有无和反应速度。该情形中,可以说扩增反应的开始越早(例如,20分钟以内),为底物的最适浓度或最接近。基于这样的试验,可以确定能够高灵敏度检测的底物(dNTPs)的最适浓度。
因此,本发明中应用的反应底物(dNTPs)的浓度可设为最适浓度的±50%以内(例如,在最适浓度1.0mM的情形中,0.5~1.5mM)、优选±30%以内(例如,在最适浓度1.0mM的情形中,0.7~1.3mM),能够通过其浓度调整检测灵敏度。
在下述分化过程中的表达量组合方式中的表中,各矩阵中显示每一反应10μg总RNA中包含的未分化标记基因的RNA表达拷贝数。关于作为可调整检测灵敏度的本方法,在将1)~3)的最小检测灵敏度设定为10拷贝/实验、4)~6)设定为4x103拷贝/实验的情形中,成为阳性的细胞显示为灰色。
1)标记基因在未分化细胞中表达直至非常高水平、在检査的非未分化细胞中非常低(接近零)的情形:(分化前后的表达量比是106~107以上)
在每一反应的LAMP反应(在反应中测试总RNA10μg)的最小检测灵敏度为10拷贝的情形中,混入率的检测界限(LOD)成为0.00005%(5x10-7)。即使每一实验的总RNA测试量减少至1/10的1μg,也可检测直至0.0001%(1x10-6)。
即使非未分化细胞中的RNA表达量不是零,如果非常小,通过调整LAMP反应的最小检测灵敏度(例如调整为50~100拷贝成为阳性),也不大幅损害混入率的检测界限(LOD)。
2)标记基因在未分化细胞中表达直至高水平、在检査的非未分化细胞中非常低(接近零)的情形:(分化前后的表达量比是直至105~106)
在每一反应的LAMP反应(在反应中测试总RNA10μg)的最小检测灵敏度为10拷贝的情形中,混入率的检测界限(LOD)成为0.0005%(5x10-6)。
但是,通过调整为进一步提高LAMP反应的最小检测灵敏度,也可与上述1)的LOD同等。
3)标记基因在未分化细胞中表达直至略低水平、在检査的非未分化细胞中非常低(接近零)的情形:(分化前后的表达量比是直至104~105)
在每一反应的LAMP反应(在反应中测试总RNA10μg)的最小检测灵敏度为10拷贝的情形中,混入率的检测界限(LOD)成为直至0.005%(5x10-5)。
4)标记基因在未分化细胞中表达直至非常高水平、在检査的非未分化细胞中低的情形(分化前后的表达量比是直至104~105)
在每一反应的LAMP反应(在反应中测试总RNA10μg)的最小检测灵敏度为4x103拷贝的情形中,混入率的检测界限(LOD)成为0.001%(1x10-5)。
与上述1)~3)不同,由于在非未分化细胞中也表达规定量的标记基因的RNA,需要调整LAMP反应的最小检测灵敏度,通过调整包含引物的种类和量等反应组成的各条件,可进行灵敏度调整。
5)标记基因在未分化细胞中表达直至高水平、在检査的非未分化细胞中低的情形:(分化前后的表达量比是直至102~103)
在每一反应的LAMP反应(在反应中测试总RNA10μg)的最小检测灵敏度为4x103拷贝的情形中,混入率的检测界限(LOD)成为0.1%(1x10-3)。
6)标记基因在未分化细胞中表达直至略低水平、在检査的非未分化细胞中低的情形:(分化前后的表达量比是直至10~102)
在每一反应的LAMP反应(在反应中测试总RNA10μg)的最小检测灵敏度为4x103拷贝的情形中,即使是混入率0.1%(1x10-3),未分化细胞的检测也困难。
由于以上,在检查本发明的非未分化细胞群中未分化细胞混入的有无的方法中,优选以分化过程中表达量减少的RNA为检测对象,进一步,优选其表达量的减少是显著的变化。在需要高灵敏度的检测性能的以否定未分化细胞混入为目的的检査中,检测对象的RNA在未分化细胞中的表达量越高越好,并且,在非未分化细胞中的表达量越低越好。具体地,未分化细胞中的RNA表达量与非未分化细胞中的表达量的比优选是104倍以上,更优选是105倍以上,最优选是106倍以上。此外,非未分化细胞中的RNA表达量优选是每1μg总RNA量1x104拷贝以下,更优选是1x103拷贝以下,更优选是1x102拷贝以下,进一步优选是1x10拷贝以下,理想地可以接近零。
另外,每一反应的总RNA测试量只要在可控制LAMP反应的最小检测灵敏度的范围,可以是10μg以上,也可以增加为30μg、100μg。此时,对于每一反应的未分化标记基因的RNA拷贝数,与未混入未分化细胞的非未分化细胞比较,混入未分化细胞的非未分化细胞一方以大的增量增加,因此,通过本方法可进一步使未分化细胞混入率的检测界限(LOD)为高灵敏度。
作为等温核酸扩增法,可以示例LAMP法、NASBA法、SDA法、TRC法、ICAN法等,其中,优选进行如LAMP法的特异性高、有效的核酸扩增的方法。下文,作为具体实例记载LAMP法,但只要是具有同样特征的核酸扩增法,则没有特别限定。在通过LAMP法以RNA为靶进行核酸扩增的情形(RT-LAMP法)中,对于成为检测对象的RNA为模板合成的核酸(cDNA)的至少6处区域,应用至少4种引物在等温扩增,在核酸的扩增中,应用具有链置换活性的DNA聚合酶(下文,也记载为“链置换型DNA聚合酶”)。“链置换型DNA聚合酶”指在合成与模板DNA互补的DNA链的过程中,在延伸方向具有双链区域的情形中,能够边解离该链边继续互补链合成的DNA聚合酶。此外,通过链置换型DNA聚合酶,在合成与模板DNA互补的DNA链的过程中,在延伸方向具有双链区域的情形中,边解离该链边进行互补链合成,将其称为“链置换反应”。
进一步,也可添加用于促进反应的引物(例如,应用LAMP法的环引物)进行核酸扩增。
在本发明的方法中,在作为等温核酸扩增法应用RT-LAMP法的情形中,等温核酸扩增法可以包括对于成为检测对象的RNA为模板通过逆转录酶合成的核酸、应用能够与前述核酸的至少6处的区域退火的至少4种引物、通过具有链置换活性的DNA聚合酶在等温进行核酸扩增的工序。在RT-LAMP法中应用环引物的情形中,可以包括对于成为检测对象的RNA为模板通过逆转录酶合成的核酸、在能够与前述核酸的至少6处区域退火的至少4种引物中进一步追加用于促进反应的引物、通过具有链置换活性的DNA聚合酶在等温进行核酸扩增的工序。
作为等温核酸扩增法之一的LAMP法的特征是,设计如图1所示针对靶基因的6处区域的4种引物,利用链置换反应在规定温度反应。在对象基因为DNA的情形中,通过将成为样品的基因、引物、链置换型DNA聚合酶、底物等共同在规定温度(60~65℃附近)保温,可以用一步骤的工序进行从基因的扩增反应至检测。在对象基因为RNA的情形中,通过从最初向试剂添加逆转录酶,可以与DNA同样用一步骤进行扩增、检测(RT-LAMP法)。
在RT-LAMP法中,针对靶RNA的碱基序列中U(尿嘧啶)置换为T(胸腺嘧啶)的序列,设计如图1的4种引物。即,关于靶基因,规定从3’末端侧称为F3c、F2c、F1c的3个区域、在5’末端侧称为B1、B2、B3的3个区域,针对该6个区域,设计4种引物(FIP、F3引物、BIP、B3引物)。FIP被设计为在3’末端侧具有与靶基因的F2c区域互补的F2区域、在5’末端侧具有与靶基因的F1c区域相同的序列,F3引物被设计为具有与靶基因的F3c区域互补的F3区域。反向链侧的BIP、B3引物也同样设计(图1)。引物设计可以利用PrimerExplorer(注册商标)V5(https://primerexplorer.jp/)进行。
RT-LAMP法的原理在图2说明。
(逆转录反应(RT)步骤)
步骤1(图2(1)):配制样品溶液后,混合样品溶液与反应液,通过在60~65℃温育,如图2(1)所示BIP与对象的RNA退火,通过逆转录酶合成互补的cDNA。
步骤2(图2(2)):B3引物与BIP的外侧退火,通过逆转录酶的作用,边剥离之前从BIP延伸合成的cDNA链,边合成新的互补cDNA。
步骤3(图2(3)):通过步骤2的步骤,FIP与从BIP延伸合成后成为单链DNA状态的cDNA退火。
(直至产生起点结构的步骤)
步骤4(图2(4)):从上述的逆转录反应步骤(步骤3、图2(3)),通过链置换型DNA聚合酶的作用,以FIP的F2区域的3′末端为起点,合成与成为模板的cDNA互补的DNA链。
步骤5(图2(5)):F3引物与FIP的外侧退火,以其3′末端为起点,边剥离来自之前合成的FIP的DNA链DNA边延伸。
步骤6(图2(6)):以从F3引物合成的DNA链为模板,DNA成为双链。
步骤7(图2(7)):从步骤5(图2(5))的过程中剥离的FIP合成的DNA链由于两端具有互补序列而自身退火,形成环、成为哑铃型结构。这成为LAMP法中扩增循环的起点结构。
(LAMP法扩增循环步骤)
步骤8(图2(8)):首先,以图2(7)的结构,以3′末端的B1区域为起点,以自身为模板,DNA合成延伸,此时,5′末端侧的环被剥离拉伸。进一步,3′末端侧的环的B2c区域是单链因而BIP可以退火,以其B2区域的3′末端为起点,边剥离来自之前合成的B1区域的DNA链DNA合成边延伸。
步骤9(图2(9)):随后在图2(8)的结构中,通过从BIP延伸合成的DNA链剥离,从成为单链的B1区域延伸的DNA链具有与其3′末端侧互补的区域因而形成环。从该环的F1区域的3′末端,以成为单链的自身为模板,开始DNA合成。然后,将来自其DNA链成为双链部分的BIP的DNA链边剥离边延伸,成为图2(9)的结构。
步骤10(图2(10)):通过上述过程,从BIP合成的DNA链成为单链,由于其两端具有分别互补的区域、F1c、F1和B1、B1c,自身退火形成环,成为图2(10)的结构。该图2(10)的结构成为与图2(7)的结构完全互补的结构。
步骤11(图2(11)):在图2(10)的结构中,与步骤7的情形同样,以F1区域的3′末端为起点以自身为模板进行DNA合成,进一步,FIP与成为单链的F2c区域退火,将来自F1区域的DNA链边剥离边进行DNA合成。由此,恰与步骤7、8、10的过程同样,经步骤10、11的过程再次产生图2(7)的结构。
步骤12(图2(12)):此外,在图2(9)或图2(12)的结构中,FIP(或BIP)与成为单链的F2c(或B2c)区域退火,边剥离双链部分DNA链边合成。然后,这些过程的结果是,相同链上重复互补序列的结构的扩增产物以各种大小产生。
在LAMP法中,进一步,可以追加设计环引物(环引物;图3)。环引物是具有与作为扩增反应的起点结构的哑铃样结构和扩增产物中形成的环结构区域之内、5’末端侧的环的单链部分(B1区域与B2区域之间、或F1区域与F2区域之间)互补的序列的引物(分别为环引物B、环引物F)。通过应用环引物增加DNA合成的起点,可缩短扩增反应时间,提高特异性。环引物能够通过“LAMP法引物设计支援软件PrimerExplorer V5”(富士通“Net Laboratory”)设计。
LAMP法可扩增DNA和RNA的任一种,特异性和扩增效率极高,通过反应副产物的焦磷酸镁的白色沉淀的形成有无和螯合剂钙黄绿素引起的荧光显色的有无,可用1步骤的工序进行从扩增至检测。由于作为原理是核酸扩增法之一,也可与前述的数字PCR同样,分散于微小隔室内有限稀释后进行LAMP反应,通过统计方法定量靶核酸(数字LAMP)。此外,在以靶核酸为模板、从成为起点的引物合成扩增产物(特征是具有茎环结构)的情形中,由于从该单链环区域的扩增反应在等温条件下连续进行,是除过剩量的核酸之外、也难以受到夹杂物引起的反应抑制的反应。进一步,通过除基本的4种引物外追加进一步有效利用扩增产物的单链环区域的合成起点的环引物,可提高扩增效率,缩短扩增反应。另外,在本发明中,关注分化诱导的过程中表达显著变化的未分化标记基因的外显子和内含子等RNA结构,可将未分化细胞中的存在量比非未分化细胞中的存在量多的RNA结构作为检测对象设定引物和/或探针。
通过应用LAMP法,可连续进行从成为检测对象的RNA的逆转录至扩增、然后直至检测。可以在一个管内连续进行逆转录→扩增→检测。逆转录和扩增的温度可以变化,也可统一温度(例如,63℃)实施转录和扩增。
此外,与为了以秒单位迅速且正确控制反应温度的升降需要将反应液量限制为少量(5~100μL)的PCR法不同,由于LAMP法保持等温连续进行扩增反应,在等温核酸扩增法、尤其是LAMP法中,可增加样品液量,每1实验的总核酸测试量(重量)可以为0.5μg以上。此外,每1实验的总核酸测试量(重量)可以是5μg以上、优选10.0μg以上、更优选50μg以上,最优选也可以为100.0μg以上。例如,与PCR法同样,对于每1实验的反应液量为5~直至100μL的情形,总核酸测试量(重量)是0.5μg以上不足5μg,对于反应液量为100~直至1,000μL的情形,是0.5μg以上不足50μg,对于反应液量为1~直至10mL的情形,是0.5μg以上不足100μg,进一步,对于反应液量为10mL以上的情形,是100.0μg以上,通过增加反应液量,总核酸测试量也可增加。
如上节所述,若增加每1实验的总核酸测试量(重量),具有检测对象的特异性序列的核酸以外的夹杂核酸的带入增加,同时核酸以外的样本来源成分(蛋白、脂质、糖类等)也在反应中大量带入。已知对于PCR法,由于赋予核酸的结构稳定化的镁离子消耗引起聚合酶的功能降低、和热变性引起核酸样品的单链化延迟,过剩量的模板核酸抑制特异性扩增反应。与之相比,在等温核酸扩增法、尤其是LAMP法中,在温和的加温条件(60~65℃附近)下,无需通过加热变性单链化,引物与扩增产物的结构内合成的多个单链区域特异性退火,以该处为合成起点进行新的扩增反应。因此,难以受到过剩量的核酸样品引起的反应抑制,也难以受到核酸以外的夹杂物引起的影响。利用这样的特征,可将提纯度低的样本提取液原样用于扩增反应,作为用于食品、环境检査的试剂市售,在碱性条件下将包含被检食品的培养液加热变性,中和后,可将简易离心分离的上清原样作为核酸样品应用。
本发明中应用的引物具有在构成本发明的各种核酸合成反应中、在给定环境下能够边维持必要的特异性边进行与互补链的碱基对结合的程度的链长。具体地,为5-200碱基、更优选10-50碱基对。由于催化序列依赖性核酸合成反应的公知聚合酶识别的引物的链长是最低5碱基左右,需要退火部分的链长是其以上。此外,为了期待作为碱基序列的特异性,优选随机利用10碱基以上的长度。另一方面,由于过长的碱基序列难以通过化学合成配制,示例如前述的链长作为优选的范围。另外,此处示例的链长是始终与互补链退火部分的链长。例如,FIP由至少2个区域F2和F1c组成。因此,此处示例的链长应理解为构成引物的各区域的链长。
扩增的核酸可以用浊度、荧光、电泳等检测。
在核酸扩增反应的过程中,作为副产物产生焦磷酸镁。由于该副产物与扩增产物成比例地产生,在扩增产物非常多的LAMP法中,观察到混浊。因此,可以用混浊的有无确认靶基因的有无。浊度可以用浊度计测定。
扩增的核酸也能够通过荧光检测。在代表性荧光检测方法中,有应用嵌入剂的方法和应用荧光标记探针的方法,可以是任一方法,也可以应用两者,也可以是其它检测法。在嵌入剂法中,可以应用SYTO63、溴化乙锭、SYBR(注册商标)Green、SYBR(注册商标)Gold、噁唑黄、噻唑橙、PicoGreen、GelGreen等。荧光标记探针有多种,可以示例QProbe(注册商标)、TaqMan(注册商标)探针、分子信标(Molecular Beacon)、循环探针等。在多种荧光标记探针中,组合荧光物质与猝灭剂,用FRET的原理进行检测。荧光物质吸收某特定的波长的光成为激发状态,回到原来的基态时发出与吸收的光的波长不同的波长的光。猝灭剂接受来自荧光物质的光能,将其作为光或热能放出。作为荧光物质,可以示例FITC、TMR、6-joe、Bodipy(注册商标)-FL/C6、Bodipy(注册商标)-FL/C3、TAMRA、FAM、HEX等,作为猝灭剂,可以示例BHQ(注册商标)-1、BHQ(注册商标)-2等。Qprobe是猝灭探针,不需要猝灭剂。Qprobe在杂交时与修饰了荧光染料的碱基互补的碱基附近具有鸟嘌呤时产生荧光共振能量转移,荧光猝灭。作为Qprobe具有的荧光染料,列举FITC、TMR、6-joe、Bodipy(注册商标)-FL/C6、Bodipy(注册商标)-FL/C3等。
本发明中应用的探针具有在给定环境下能够边维持必要的特异性边进行与互补链的碱基对结合的程度的链长。探针的链长没有特别限定,具体地,优选5-50碱基的范围,更优选10-40碱基的范围。
在LAMP法中,具有合成非常大量的核酸、作为副产物的焦磷酸离子也大量生成的特征。作为荧光目视检测试剂,若应用螯合剂钙黄绿素,钙黄绿素在扩增前与锰离子结合和猝灭,但若进行LAMP反应,生成焦磷酸离子,通过锰离子剥夺而发出荧光。进一步,通过与反应液中的镁离子结合荧光被增强。通过该原理,通过荧光显色的有无,可以容易地目视判定通过LAMP反应的扩增的有无。
在通过电泳的检测中,例如,用2%左右的琼脂糖对核酸扩增反应液进行电泳,通过用溴化乙啶或SYBR(注册商标)Green I等染色用试剂染色,可以观察电泳图。
通过本发明的方法,可以评价从未分化细胞向分化细胞分化诱导时和/或分化诱导后的细胞的分化状态。
在本发明中,非未分化细胞可以是分化的细胞。非未分化细胞可为来自人或人以外的哺乳动物的人工多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)等多能干细胞的分化细胞、不限于来自前述多能干细胞的分化细胞的培养细胞。不限于来自前述多能干细胞的分化细胞的培养细胞没有特别限定,作为具体实例列举HEK293T细胞(https://www.wikiwand.com/ja/HEK293细胞)、HeLa细胞(https://ja.wikipedia.org/wiki/HeLa细胞)、HUVEC细胞(https://www.wikiwand.com/en/Human_umbilical_vein_endothelial_cell)等。在非未分化细胞是来自多能干细胞的分化细胞的情形中,能够通过本发明高灵敏度地检测该非未分化细胞的分化诱导时、分化诱导后以未分化状态残存(混入)的细胞(未分化细胞)的有无。另一方面,在非未分化细胞是不限于来自多能干细胞的分化细胞的培养细胞的情形中,能够通过本发明高灵敏度地检测该培养细胞群中混入(混入)的未分化细胞的有无,可有效检测处理多种细胞的细胞加工设备内的装置和自动细胞培养装置中未分化细胞的污染、尤其是未分化细胞对SNPs(单核苷酸多态性)分析中无法检出的同一个体的分化细胞的交叉污染。
在本发明的方法中,以非未分化细胞群中混入未分化细胞的样品中的RNA存在量是前述等温核酸扩增法的检测界限以上、非未分化细胞中的RNA存在量是前述等温核酸扩增法的检测界限以下的RNA为检测对象,在样品中检测到成为检测对象的RNA的情形中,可以判定为阳性,在样品中未检测到成为检测对象的RNA的情形中,可以判定为阴性。
检测界限可以是例如,从非未分化细胞提纯的RNA Xμg中不足10拷贝。X是在用RT-LAMP针对成为100、10、5拷贝/实验的方式添加作为检测对象的RNA的样品进行试验的情形中,应用100、10拷贝/实验为阳性、5拷贝/实验为阴性的系统,用RT-LAMP对从非未分化细胞提纯的RNA进行试验时判定为阴性的最大RNA重量。在高灵敏度地检测未分化细胞的情形中,优选X是1以上,更优选10以上,进一步优选100以上。
X可以相应于作为检测对象的RNA的存在量适宜设定,只要能够在检测界限之间正确判定阳性、阴性即可。例如,在检查从非未分化细胞中混入未分化细胞的状态配制的样品的情形中,若以非未分化细胞中完全不表达的RNA为检测对象,未分化细胞中的表达量即使没有那么高,也可通过增加测试的RNA量正确判定阳性。
在本发明中,未分化细胞向非未分化细胞群中的混入比例可为0.1%以下、0.05%以下、0.025%以下、0.01%以下、0.005%以下、0.0025%以下、0.001%以下、0.0001%以下等。
本发明还提供用于检查非未分化细胞群中未分化细胞混入的有无的试剂盒,其包含能够通过等温核酸扩增法检测未分化细胞与非未分化细胞间表达量具有显著差异的未分化标记基因来源的RNA的试剂。
能够通过等温核酸扩增法检测未分化细胞与非未分化细胞间表达量具有显著差异的未分化标记基因来源的RNA的试剂可以包含引物。为了检测扩增的核酸,试剂可以进一步包含探针和/或比色试剂。关于引物和探针的功能、构成等在上文论述。探针可以被荧光标记。比色试剂只要是可检测扩增的核酸的物质即可,可以示例生成可测定浊度的焦磷酸镁的镁离子、作为荧光目视检测试剂的钙黄绿素、作为电泳中应用的染色用试剂的溴化乙啶、SYBR Green I等。
试剂盒可以进一步包含对核酸扩增必要的试剂(底物(4种碱基:dGTP、dCTP、dATP、dTTP)、镁离子(例如,氯化镁)、缓冲液、钾离子等)、用于核酸扩增的酶(DNA聚合酶(例如,链置换型DNA聚合酶)、逆转录酶等)、蒸馏水、用于阳性对照的RNA和用于其扩增的引物、检测用荧光探针等。
本发明的试剂盒中包含的试剂可以是干燥状态,在该情形中,例如,将干燥的试剂固定于反应管内(底部、盖等),使用时,可以将引物溶液和样品溶液添加于反应管,用这些溶液溶解干燥试剂,进行核酸扩增反应。
实施例
以下,通过实施例具体说明本发明。本发明的范围不限于以下实施例。
[实施例1]
在iPS细胞向肝细胞分化诱导的过程中,将分化至肝内胚层细胞(Hepaticendoderm cell,下文称为HE细胞)的阶段作为非未分化细胞,制备向其阶段性添加iPS细胞(未分化细胞)的稀释系列。将该稀释系列作为样品,通过qRT-PCR法试验未分化细胞向非未分化细胞群中混入的比例的最小值。另外,作为检测对象的未分化标记基因,选择LINC00678。
·样品配制法
1.各细胞的处理按照Cell Rep.2017 Dec 5;21(10):2661-2670.。
2.通过10天的分化诱导使iPS细胞成为HE细胞后,应用胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司)回收细胞,作为HE细胞悬浮液。
3.应用Accutase(ICT公司)回收保持未分化状态的iPS细胞,作为iPS细胞悬浮液。
4.计测各自的细胞数后,对HE细胞悬浮液混合iPS细胞悬浮液使iPS细胞成为图4的“iPS细胞混入率”,作为样品。
5.从各样品通过离心分离除去上清,应用PureLink RNA Mini Kit(Invitrogen公司)从细胞沉淀提纯RNA。
6.应用Nanodrop2000c(Thermo Fisher Scientific公司)定量提纯的RNA的浓度。
7.以提纯的RNA为模板,应用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific公司),合成cDNA。
·qRT-PCR法
LINC00678检测用RT-PCR引物、探针
[qRT-PCR反应方案]
关于用直至上述样品配制法7得到的cDNA,实施2步骤RT-PCR。应用THUNDERBIRDProbe qPCR Mix(东洋纺)、上述引物、探针、LightCycler480(Roche公司),进行qRT-PCR反应,以18S rRNA(ABI公司)作为内标通过ΔΔCp法定量基因表达量。对于本反应中的RNA最终测试量,以12.5ng/实验配制反应液。
重复进行该试验5次,通过t检验实施各iPS细胞混入样品与非混入样品的显著差异检验,将显著性水平作为5%,将比判定为无显著差异的最大的iPS细胞混入率大1级混入率的iPS细胞混入率作为检测界限(Limit Of Detection:LOD)。
[结果]
如图4(a)、(b)所示,qRT-PCR法的LOD是0.05%。
t检验中5%显著(P值<0.05)表示为“*”,1%显著(P值<0.01)表示为“**”。
[实施例2]
与实施例1同样,将分化至HE细胞的阶段作为非未分化细胞,将向其阶段性添加iPS细胞的稀释系列作为样品,用RT-LAMP法和qRT-PCR法比较未分化细胞的检测。检测对象的未分化标记基因与实施例1同样为LINC00678。
在RT-LAMP法中,LAMP引物组应用PrimerExplorer设计(组1),应用用直至上述样品配制法6得到的RNA,进行包含逆转录反应的RT-LAMP。
qRT-PCR用与实施例1同样的方法进行试验(RNA最终测试量是12.5ng/实验)。
·RT-LAMP法
使用的各引物和探针的碱基序列在以下显示。
LINC00678检测用RT-LAMP引物、探针(组1)
[RT-LAMP反应方案]
1.关于用直至上述样品配制法6得到的RNA,以RNA最终测试量1.0μg/实验配制反应液。
2.应用Lightcycler480(Roche公司),在55℃进行10分钟逆转录反应后,在63℃进行90分钟LAMP扩增反应,每20秒间隔实时测定探针的荧光强度。荧光强度在465/510nm测定。
3.装置启动后,将与初始荧光强度的差成为-1的时间作为Tt值,将Tt值不足90分钟的情形判定为“具有LAMP反应”,将Tt值为90分钟以上的情形作为“没有LAMP反应”。将各样品同时多次(N=2)试验,将均成为“具有LAMP反应”的样品判定为阳性(下表中用〇表示),将均成为“没有LAMP反应”的样品判定为阴性(下表中用×表示)。
每RT-LAMP反应的各试剂浓度
(RNA样品添加后的最终浓度)
结果
在qRT-PCR法中,将比判定为不可检测的最大iPS细胞混入率大1级混入率的iPS细胞混入率作为检测界限(Limit Of Detection:LOD)。在RT-LAMP法中,将比判定为全部阴性的最大iPS细胞混入率大1级混入率的iPS细胞混入率作为检测界限(Limit Of Detection:LOD)。
其结果,qRT-PCR法的LOD是比实施例1高灵敏度的0.005%,RT-LAMP法的LOD是进一步高灵敏度的0.0025%。此外,该LAMP反应中测试的每1实验的样品中的核酸重量超过一般PCR反应中作为上限量目标的500ng(0.5μg),为1.0μg,可良好地检测。
○:N=2的实验中全部有LAMP反应
×:N=2的实验中全部没有LAMP反应
N.D.:不可检测(末被检测)
qRT-PCR结果中的数值表示以18S rRNA为内标通过ΔΔCp法的基因表达量。
[实施例3]
与[实施例2]同样,除分化直至HE细胞(内胚层组织)的阶段外,将分化直至EC细胞(血管内皮细胞(endothelial cells)、中胚层组织)的阶段作为非未分化细胞,将向其阶段性添加iPS细胞的稀释系列作为样品,用RT-LAMP法试验未分化细胞的检测。
应用HE细胞的稀释系列中检测对象的未分化标记基因与实施例1和2相同为LINC00678,但设计与实施例2不同的LAMP引物组(组2)。另一方面,应用EC细胞的稀释系列中检测对象的未分化标记基因选择ESRG,进行设计。
在RT-LAMP法中,应用用直至前述样品配制法6得到的RNA,进行包含逆转录反应的RT-LAMP。
·RT-LAMP法
使用的各引物和探针的碱基序列在以下显示。
LINC00678检测用RT-LAMP引物、探针(组2)
ESRG检测用RT-LAMP引物、探针
[RT-LAMP反应方案]
1.关于用直至前述样品配制法6得到的RNA,以RNA最终测试量5.0μg/实验配制反应液。
2.除每RT-LAMP反应的各试剂浓度(RNA样品添加后的最终浓度)在LIN00678(组2)中是1.4mM dNTPs、3U Warmstart Bst、3U Warmstart RTx,与之相比,在ESRG中是0.9mMdNTPs、9U Warmstart Bst、1.5U Warmstart RTx,以及每引物、探针组的底物和各酶的浓度不同之外,与[实施例2]所示条件相同。
3.应用Lightcycler480(Roche公司),在55℃进行10分钟逆转录反应后,LINC00678(组2)在67℃、ESRG在63℃的反应温度进行90分钟LAMP扩增反应,每20秒间隔实时测定探针的荧光强度。荧光强度在465/510nm测定。
4.装置启动后,将与初始荧光强度的差成为-1的时间作为Tt值,将Tt值不足90分钟的情形判定为“具有LAMP反应”,将Tt值为90分钟以上的情形作为“没有LAMP反应”。将各样品同时多次(N=2)试验,将均成为“具有LAMP反应”的样品判定为阳性(下表中用〇表示),将均成为“没有LAMP反应”的样品判定为阴性(下表中用×表示)。
结果
对于二个RT-LAMP法的各LOD,LINC00678(组2)是0.00003%,ESRG是0.00032%,显示实施例2的RT-PCR的LOD的约102~103以上的高灵敏度。是以相同未分化标记基因的LINC00678为靶的RT-LAMP,但显示比组1高的灵敏度,这起因于包含引物和检测探针的设计的反应条件的最适化,因将进一步测试的每1实验的样品中的核酸重量增加为5.0μg的结果而引起。这显示即使夹杂核酸增加,也可良好地检测包含检测对象的特异性序列的少量核酸。此外,是从相同iPS细胞分化的细胞,但对于显示与HE细胞(肝内胚层细胞)和EC细胞(血管内皮细胞)不同的细胞功能的分化细胞,也同样可检测微量的iPS细胞混入。
对各非未分化细胞(HE细胞/EC细胞)的掺入试验
○:多重测定(N=2)中全部有LAMP反应
×:多重测定(N=2)中全部没有LAMP反应
LINC00678:向HE细胞掺入iPS细胞
ESRG:向EC细胞掺入iPS细胞
[实施例4]
将作为不限于来自多能干细胞的分化细胞的培养细胞的人胎儿肾细胞株的HEK293T(外胚层组织(非专利文献7))、或来自人宫颈癌的细胞的HeLa细胞用作非未分化细胞,与实施例1、2和3同样,将阶段性添加iPS细胞的稀释系列作为样品,用RT-LAMP法试验未分化细胞的检测。
检测对象的未分化标记基因除与实施例1、2和3同样为LINC00678之外,选择SFRP2、CNMD、USP44和LIN28A。
LINC00678的RT-LAMP引物、探针组使用上述的组1和组2。由此,也包含新设计的SFRP2、CNMD、USP44和LIN28A的引物、探针组,比较总计6种RT-LAMP的检测灵敏度。
SFRP2检测用RT-LAMP引物、探针
CNMD检测用RT-LAMP引物、探针
USP44检测用RT-LAMP引物、探针
LIN28A检测用RT-LAMP引物、探针
·样品配制法
1.分别地个别培养、回收HEK293T细胞和HeLa细胞,配制各细胞悬浮液。
2.应用Accutase(ICT公司)回收保持未分化状态的iPS细胞,作为iPS细胞悬浮液。
3.计测各自的细胞数后,对HEK293T细胞和HeLa细胞的各细胞悬浮液添加iPS细胞悬浮液使iPS细胞成为下表的“iPS细胞混入率”,作为样品。
4.从各样品通过离心分离除去上清,应用PureLink RNA Mini Kit(Invitrogen公司)从细胞沉淀提纯RNA。
5.应用Nanodrop2000c(Thermo Fisher Scientific公司),定量提纯的RNA的浓度。
[RT-LAMP反应方案]
1.除了每一RT-LAMP反应的各试剂浓度(RNA样品添加后的最终浓度)在SFRP2和LIN28A中是1.4mM dNTPs、3U Warmstart Bst、3U Warmstart RTx,与之相比,在CNMD和USP44中是0.9mM dNTPs、9U Warmstart Bst、1.5U Warmstart RTx,以及每一引物、探针组的底物和各酶的浓度不同之外,与[实施例2]所示的条件同样。另外,关于LIN00678组1和同组2,分别与[实施例2]和[实施例3]所示的条件同样。
2.关于用直至上述样品配制法5得到的RNA,应用Lightcycler480(Roche公司)在55℃进行10分钟逆转录反应后,在63℃(LINC00678组1、CNMD、USP44、LIN28A)或65℃(SFRP2)或67℃(LINC00678组2)进行90分钟LAMP扩增反应,每20秒间隔实时测定探针的荧光强度。荧光强度在465/510nm测定。
3.装置启动后,将与初始荧光强度的差成为-1的时间作为Tt值,将Tt值不足90分钟的情形判定为“具有LAMP反应”,将Tt值为90分钟以上的情形作为“没有LAMP反应”。将各样品同时多次(N=2)试验,将均成为“具有LAMP反应”的样品判定为阳性(下表中用〇表示),将均成为“没有LAMP反应”的样品判定为阴性(下表中用×表示)。关于任一方成为“具有LAMP反应”的样品,下表中用△表示。
结果
对HEK293T细胞的掺入试验
○:多重测定(N=2)中全部有LAMP反应
△:多重测定(N=2)中有一个LAMP反应
×:多重测定(N=2)中全部没有LAMP反应
空白部分未实施试验
对Hela细胞的掺入试验
○:多重测定(N=2)中全部有LAMP反应
△:多重测定(N=2)中有一个LAMP反应
×:多重测定(N=2)中全部没有LAMP反应
在向HEK293T细胞的iPS细胞掺入试验中,LINC00678(组1)是LOD 0.001%(RNA最终测试量10.0μg),LINC00678(组2)是LOD 0.001%(RNA最终测试量1.0μg),SFRP2是LOD0.001%(RNA最终测试量1.0μg)和LOD 0.0001%(RNA最终测试量5.0μg),CNMD是LOD0.0005%(RNA最终测试量3.0μg)。在向HeLa细胞的iPS细胞掺入试验中,LINC00678(组2)、USP44和LIN28A的任一中均为LOD 0.00032%(RNA最终测试量5.0μg)。
对于试验中应用的非未分化细胞的种类、检测对象选择的未分化标记基因的任一中,都可以确认LOD是0.001~0.0001%的高检测灵敏度。尤其是在SFRP2中显示,通过应用相同的引物、探针组增加RNA测试量,可以改善LOD。此外,与非未分化细胞的种类有关,实施例3中应用分类为内、中胚层的细胞,实施例4中应用分类为外胚层的细胞,可以确认本方法的有用性。因此,认为非未分化细胞可以是内胚层、中胚层、和外胚层的任一分化细胞的群。
[实施例5]
与上述实施例所示添加已知量的未分化细胞的掺入试验不同,在通过培养分化诱导未分化细胞得到的分化细胞中,研究是否可高灵敏度地检测不进行如假设的分化而残存的未分化细胞。作为来自iPS细胞的分化细胞,应用HE细胞。
另外,在该领域中一般推荐使用的、不足约35次传代的传代数少的iPS细胞株(作为“正常株”)中,由于在本说明书记载的培养条件进行向HE细胞的分化诱导的情形中不残存未分化细胞,在本研究中,作为未分化细胞容易残存的iPS细胞株(非专利文献8),联用35次传代以上的传代数多的iPS细胞株(作为“过传代株”)。分化的HE细胞中残存的未分化细胞数通过培养扩增法(非专利文献3)确认。
[培养扩增法]
应用正常株和过传代株,与[实施例1]同样配制HE细胞悬浮液,移至RNA提纯和RT-LAMP法的试验,同时分取细胞悬浮液的一部分,应用已包被层粘连蛋白的24孔板,在添加ROCK抑制剂(和光纯药)的StemFit培养基(味之素)中以1.6x105细胞/孔接种后,每日边用StemFit培养基进行培养基交换边在37℃培养,形成未分化细胞的集落。
一周后,为了检测未分化细胞集落,应用作为多能性标记的初次抗体的抗SOX2抗体、或者抗OCT4A抗体(Cell Signaling Technologies)、以及作为可检测初次抗体的已荧光标记的二次抗体(Thermo Fisher Scientific),进行免疫染色。以通过免疫染色取得的图像为基础,计数阳性集落的数目,通过该集落数除以接种细胞数,算出未分化细胞残存率。
另外,免疫染色用以下顺序实施。
通过用4%低聚甲醛处理15分钟固定细胞。用PBS洗涤2次后,通过加入PBS中的0.1%TritonX-100(PBST)处理10分钟透过细胞膜。其后,应用PBST中的5%FBS进行封闭处理。1小时后,除去封闭缓冲液,添加适当稀释的初次抗体溶液,在4℃过夜处理。其后,用PBS洗涤3次,添加稀释的二次抗体溶液,遮光下在室温静置1小时。最后用PBS洗涤3次,添加Apathy包封剂(和光纯药)用于观察。观察中应用一体式荧光显微镜BZ-X710(Keyence)通过4倍物镜拍摄整个1孔的绿色荧光。以取得的图像为基础目视计数集落数。
[RT-LAMP反应方案]
检测对象的未分化标记基因除与实施例3同样为ESRG和LINC00678(组2)外,选择PRDM14。
新设计的PRDM14的引物、探针组在以下显示。
1.关于用直至前述样品配制法6得到的RNA,以RNA最终测试量1.0μg/实验配制反应液。
2.除每一PRDM14的RT-LAMP反应的各试剂浓度(RNA样品添加后的最终浓度)是0.6mM dNTPs、9U Warmstart Bst、1.5U Warmstart RTx,以及底物和各酶的浓度不同之外,与[实施例2]所示条件同样。另外,关于LIN00678组2和ESRG,分别与[实施例3]所示条件同样。
3.应用Lightcycler480(Roche公司),在55℃进行10分钟逆转录反应后,在LINC00678(组2)是67℃、ESRG和PRDM14是63℃的反应温度,进行90分钟LAMP扩增反应,每20秒间隔实时测定探针的荧光强度。荧光强度在465/510nm测定。
4.装置启动后,将与初始荧光强度的差成为-1的时间作为Tt值,将Tt值不足90分钟的情形判定为“具有LAMP反应”,将Tt值为90分钟以上的情形作为“没有LAMP反应”。将各样品同时多次(N=2)试验,将均成为“具有LAMP反应”的样品判定为阳性(下表中用〇表示),将均成为“没有LAMP反应”的样品判定为阴性(下表中用×表示)。
结果
○:多重测定(N=2)中全部有LAMP反应
×:多重测定(N=2)中全部没有LAMP反应
关于来自正常iPS细胞株的HE细胞,在培养扩增法中,检测不到残留未分化细胞。另一方面,关于来自过传代iPS细胞株的HE细胞,通过培养扩增法检测微量的残留未分化细胞。将从用培养扩增法得到如上结果的细胞悬浮液提取的RNA作为被验样品,进行RT-LAMP法的试验,结果,用培养增殖法检测不到残留未分化细胞的RNA作为被验样品的情形判定为阴性,用培养增殖法检测到残留未分化细胞的RNA作为被验样品的情形全部判定为阳性。
[实施例6]
由于基于酶反应的核酸扩增反应通过以底物浓度和酶活性为首的反应组成条件和温度等反应速度变化,规定时间内可扩增的模板核酸量变化。本发明中的等温核酸扩增法、尤其是LAMP法也同样,通过变更包含应用的引物的碱基序列、引物的量、底物、酶及其催化剂等的浓度的反应组成条件,检测灵敏度变化。利用这些,研究是否可检查样本中包含的模板核酸量。
·样品配制法
以包含用上述[实施例3]所示LINC00678检测用RT-LAMP引物、探针(组2)扩增的碱基序列的人工基因(序列编号53)为样品。对通过吸光度测定定量的人工基因,以成为每实验0~1,000拷贝的方式制备阶段稀释系列,在下述RT-LAMP反应中测试。
[RT-LAMP反应方案]
1.上述[实施例2]所示LINC00678检测用RT-LAMP引物、探针(组2)的每一RT-LAMP反应的各试剂浓度(样品添加后的最终浓度)中,配制仅作为底物的dNTPs从0.4至1.4mM变化的各扩增反应液。
2.向各扩增反应液添加用上述样品配制法制成的人工基因的阶段稀释系列后,应用Lightcycler480(Roche公司),在67℃进行90分钟LAMP扩增反应,每20秒间隔实时测定探针的荧光强度。荧光强度在465/510nm测定。
3.装置启动后,将与初始荧光强度的差成为-1的时间作为Tt值,将Tt值不足90分钟的情形判定为“具有LAMP反应”,将Tt值为90分钟以上的情形作为“没有LAMP反应”。将各样品同时多次(N=2)试验,将均成为“具有LAMP反应”的样品判定为阳性(下表中用〇表示),将均成为“没有LAMP反应”的样品判定为阴性(下表中用×表示)
结果
通过dNTPs浓度变化的灵敏度调整(LINC00678组2)
○:多重测定(N=2)中全部有LAMP反应
×:多重测定(N=2)中全部没有LAMP反应
由于随着底物的dNTPs浓度减少判定为阳性,需要更多拷贝数的人工基因。这显示通过作为反应组成之一的底物dNTPs的浓度,可容易地调整检测灵敏度。
通过利用该多个反应条件的不同引起的检测灵敏度的差异,可以检查测试的样本中包含的模板核酸量。
例如,在dNTPs浓度是[1]1.2mM、[2]1.0mM、[3]0.6mM 3种LINC00678 RT-LAMP(组2)反应组成中,在反应中测试LINC00678的RNA拷贝数未知的相同样本,在例1)[1][2][3]的全部条件成为阳性的情形中,在反应中测试的样本中存在1000拷贝以上的LINC00678RNA,或者,在仅例2)[1]和[2]的条件成为阳性的情形中,在反应中测试的样本中存在10拷贝以上不足1000拷贝的LINC00678RNA,在仅例3)[1]的条件扩增的情形中,在反应中测试的样本中存在10拷贝以上不足100拷贝的LINC00678RNA,如此可检查样本中的模板核酸的存在量。
[实施例7]
上述[实施例6]是应用人工基因的试验,但与[实施例3]和[实施例4]同样在非未分化细胞中混入未分化细胞的条件下进行混入量的检査的研究。
·样品配制法
1.培养、回收HeLa细胞,配制细胞悬浮液。
2.应用Accutase(ICT公司)回收保持未分化状态的iPS细胞,作为iPS细胞悬浮液。
3.计测各自的细胞数后,对HeLa细胞的细胞悬浮液添加iPS细胞悬浮液使iPS细胞成为下表的“iPS细胞混入率”,作为样品。
4.从各样品通过离心分离去除上清,应用PureLink RNA Mini Kit(Invitrogen公司)从细胞沉淀提纯RNA。
5.应用Nanodrop2000c(Thermo Fisher Scientific公司),定量提纯的RNA的浓度。
[RT-LAMP反应方案]
1.上述[实施例4]所示USP44检测用RT-LAMP引物、探针的每一RT-LAMP反应的各试剂浓度(样品添加后的最终浓度)中,配制仅作为底物的dNTPs为0.8mM和0.9mM的各扩增反应液。
2.关于用直至上述样品配制法5得到的RNA,应用Lightcycler480(Roche公司)在55℃进行10分钟逆转录反应后,在63℃进行90分钟LAMP扩增反应,每20分钟间隔实时测定探针的荧光强度。荧光强度在465/510nm测定。
3.装置启动后,将与初始荧光强度的差成为-1的时间作为Tt值,将Tt值不足90分钟的情形判定为“具有LAMP反应”,将Tt值为90分钟以上的情形作为“没有LAMP反应”。将各样品同时多次(N=2)试验,将均成为“具有LAMP反应”的样品判定为阳性(下表中用〇表示),将均成为“没有LAMP反应”的样品判定为阴性(下表中用×表示)
结果
通过dNTPs浓度变化的灵敏度调整(对USP44系、Hela细胞的iPS细胞混入试验)
○:多重测定(N=2)中全部有LAMP反应
×:多重测定(N=2)中全部没有LAMP反应
与[实施例6]同样,随着底物的dNTPs浓度减少,反应灵敏度变化,为了显示扩增反应需要混入多的iPS细胞。通过利用该多个反应条件的差异引起的检测灵敏度的差异,可以检查测试的非未分化细胞群中包含的未分化细胞混入量。
例如,在dNTPs浓度是[1]0.9mM、[2]0.8mM2种USP44 RT-LAMP反应组成中,将未分化细胞(iPS细胞)混入率未知的相同样本在反应中测试,在例1)[1][2]任一条件扩增的情形中,未分化细胞混入率是0.0032%以上,在仅例2)[1]的条件扩增的情形中,该混入率是0.001%以上不足0.0032%,在例3)[1][2]任一条件不扩增的情形中,该混入率是不足0.001%,如此可检查未分化细胞混入量。
考察
未分化标记基因LINC00678的qRT-PCR中的LOD是0.05~0.005%,与之相比,通过此次的LAMP法的LOD显示0.00032~0.00003%的高检测灵敏度。此外,检测对象的未分化标记基因应选择分化过程中显示其表达量减少的量的变化的那种,但如此次以多数基因为对象的实施例所示,不限于特定的未分化标记基因,应选择富于通用性的标记基因。此外,作为可能混入未分化细胞的非未分化细胞,不限于从多能干细胞(人ES细胞、人iPS细胞等)和成体干细胞分化和/或衍生的那种,也可以是HEK293T细胞、HeLa细胞等从体细胞分离的细胞。
在检测未分化细胞混入的本试验中,由于需要尽可能大量测试来自可能混入未分化细胞的细胞群的核酸样品,不优选反应液量和核酸测试量受限的方法。通常,在过剩量的核酸存在下,由于PCR容易受到反应抑制,在PCR检测iPS细胞的微量混入中,混入率相对高已成为前提。与之相比,由于LAMP法在RNA最终测试量是1~10μg过剩的情形中也显示良好的扩增反应、检测灵敏度也高,是适合作为混入试验法的方法。此外,作为本方法中作为检测对象选择的未分化标记基因,优选未分化细胞中的RNA表达量高、并且分化细胞中的RNA表达量低的基因,但本方法如上述不限于特定的标记基因,此外,是成为待混入的非未分化细胞的范围不限、认识到广泛通用性的方法。
此外,在本发明中的等温核酸扩增法、尤其是LAMP法中,通过变更包含应用的引物的碱基序列、引物的量、底物、酶及其催化剂等浓度的反应组成条件,也可从10拷贝/实验至数千拷贝/实验调整检测灵敏度。即,相应于与反应有关的各条件,其检测灵敏度可变。利用该特性,通过准备多个检测灵敏度不同的反应组成条件,在各条件的试验中测试一个样品,不仅未分化细胞的有无的判定、未分化细胞混入量也可检査。另外,除按每一反应容器(管)设定多个检测灵敏度不同的反应组成条件,也可以是一个装置却通过内部流动路径的分支可一次在多个反应条件下进行试验的形式,细节不限。
[参考例1]
作为未分化细胞标记基因的LINC00678和PRDM14
以成为iPS细胞的指标的标记基因的提取为目的,实施小鼠发育阶段的微阵列分析和来自iPS细胞的肝细胞的分化诱导过程的单细胞RNA序列分析,研究未分化iPS细胞中特异性且高表达、分化细胞中表达低的基因。
结果
在多个候选基因之中,作为通过qRT-PCR在iPS细胞中表达高、在来自iPS细胞的胚体内胚层细胞(DE)和肝内胚层细胞(HE)等分化细胞中表达降低的基因,提取LINC00678(图5)和PRDM14(图6)。
本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请按原样作为参考并入本说明书。
产业上的可利用性
本发明可以用于高灵敏度地检测从未分化细胞向分化细胞分化诱导时和分化诱导后以未分化的状态混入的细胞(未分化细胞)的有无。此外,本发明也可以用于高灵敏度地检测培养不限于来自多能干细胞的分化细胞的细胞时该培养细胞群中未分化细胞混入的有无。
Claims (14)
1.检查非未分化细胞群中未分化细胞混入的有无或混入量的方法,其包括:通过等温核酸扩增法检测样品中的未分化细胞与非未分化细胞间表达量具有显著差异的未分化标记基因来源的RNA,其中所述样品包含成为检查对象的细胞群来源的核酸。
2.权利要求1所述的方法,其中,评价从未分化细胞向非未分化细胞分化诱导时和/或分化诱导后的成为检查对象的细胞群的分化状态。
3.权利要求2所述的方法,其中,未分化细胞是多能干细胞或成体干细胞。
4.权利要求1~3的任一项所述的方法,其中,以非未分化细胞群中混入未分化细胞的样品中的未分化标记基因来源的RNA存在量为所述等温核酸扩增法的检测界限以上、非未分化细胞中的RNA存在量为所述等温核酸扩增法的检测界限以下的RNA为检测对象,在样品中检测到成为检测对象的RNA的情形中,判定为阳性,在样品中未检测到成为检测对象的RNA的情形中,判定为阴性。
5.权利要求1~4的任一项所述的方法,其中,未分化标记基因来源的RNA满足下述(i)和/或(ii)的条件:
(i)未分化细胞中的RNA表达量与非未分化细胞中的表达量的比是104倍以上,
(ii)非未分化细胞中的RNA表达量是每1μg总RNA量1x104拷贝以下。
6.权利要求1~5的任一项所述的方法,其中,对于成为检测对象的RNA为模板合成的核酸,应用能够与所述核酸的至少6处的区域退火的至少4种引物,在等温进行核酸扩增。
7.权利要求1~6的任一项所述的方法,其中,通过具有链置换活性的DNA聚合酶扩增核酸。
8.权利要求7所述的方法,其包括:对于成为检测对象的RNA为模板通过逆转录酶合成的核酸,应用能够与所述核酸的至少6处的区域退火的至少4种引物,通过具有链置换活性的DNA聚合酶在等温进行核酸扩增的工序。
9.权利要求6~8的任一项所述的方法,其中,进一步,应用用于促进反应的引物进行核酸扩增。
10.权利要求9所述的方法,其包括:对于成为检测对象的RNA为模板通过逆转录酶合成的核酸,在能够与所述核酸的至少6处的区域退火的至少4种引物中进一步追加用于促进反应的引物,通过具有链置换活性的DNA聚合酶,在等温进行核酸扩增的工序。
11.权利要求1~10的任一项所述的方法,其中,连续进行从成为检测对象的RNA的逆转录至扩增、然后至检测。
12.用于检查非未分化细胞群中未分化细胞混入的有无或混入量的试剂盒,其包含能够通过等温核酸扩增法检测RNA的试剂,其中所述RNA来自未分化细胞与非未分化细胞间表达量具有显著差异的未分化标记基因。
13.权利要求12所述的试剂盒,其中,试剂包含引物。
14.权利要求13所述的试剂盒,其中,试剂进一步包含探针和/或比色试剂。
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