KR102291584B1

KR102291584B1 - 반려동물 및 가축의 질병진단을 위한 분자진단 방법

Info

Publication number: KR102291584B1
Application number: KR1020200160162A
Authority: KR
Inventors: 박정구; 강윤성; 박성연; 유희경; 배소일
Original assignee: 주식회사 아이리스바이오 (IRISBIO, Inc.)
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2021-08-24

Abstract

본 발명은 지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis) 검출을 위한 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification assay) 분석용 프라이머 세트 등에 관한 것으로, 상기 프라이머 세트 이용시 민감도 및 특이도가 뛰어나면서도 빠른 검사가 가능하고 색변화를 통해 지알디아 존재 여부를 확인 가능하여 기존 고비용의 분자진단 기기가 필요하지 않아 비용면에서도 효율적이다.

Description

반려동물 및 가축의 질병진단을 위한 분자진단 방법 {Molecular diagnosis method for disease diagnosis of companion animals and livestock}

본 발명은 지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis) 검출을 위한 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification assay) 분석용 프라이머 세트 등에 관한 것이다.

지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis)는 동물의 소장 및 십이지장에 기생하는 편모충이다. 영양형의 크기는 4.5-21 ㎛이고 자라모양으로 앞부분은 넓은 원형이며, 뒤쪽은 뾰족하고 좌우대칭이다. 4개의 난원형 핵은 흡반의 밑부분에 좌우 1쌍씩 존재한다. 8개의 편모가 전방, 중앙, 복부 그리고 꼬리 부분에 각각 1 쌍씩 있다. 포낭은 난원형 또는 타원형이고 크기는 8-12 ㎛이며 2-4개의 핵, 때로는 8개의 핵이 있고 헤마톡실린(hematoxylin)으로 진하게 염색되는 성질이 있다.

지알디아 인테스티날리스는 우리나라를 포함한 전 세계적으로 주요한 수인성 감염 원충으로 인식되어 있다. 이는 사람 또는 동물에서 설사를 유발시키며, 특히 집단 발병을 일으킨다고 알려져 있다. 따라서, 원충의 존재 여부에 대한 조사에 대한 수요는 높은 상태이며 미래에는 더욱 증가될 가능성이 높다.

이와 같은 지알디아 인테스티날리스의 검출은 PCR을 통해 가능한데 이중 등온증폭법(Isothermal DNA amplification)은 일본, 유럽 등 세계적으로는 신속검출 기법으로 알려져 있으나 국내에서는 잘 알려지지 않은 분자생물학적 검출기법이다. 분자생물학적 증폭으로는 중합효소 연쇄반응법(PCR, polymerase chain reaction)이 가장 많이 알려져 있으며 분자생물학의 발전을 주도한 방법이기도 하다. 그러나 중합효소 연쇄반응법은 값비싼 증폭장비, 실험자의 방법이해 및 숙련도, 전기영동장비와 유해 시약 등의 사용 등을 수반하는 문제점이 있다. 그러나 등온증폭법은 기존의 전용장비 없이 비교적 간단하게 실험을 진행할 수 있다. 다만 프라이머 설계가 어려운 문제가 있어 이에 대한 많은 연구가 요구되고 있다.

대한민국 공개특허 공보 10-2017-0030746

본 발명의 발명자는 등온증폭법을 이용한 지알디아 인테스티날리스 검출 방법을 연구한 결과 본 발명의 프라이머 세트를 발명하였다. 이에 상기 프라이머를 지알디아 인테스티날리스 검출에 이용한 결과 빠르고 정확한 검출이 가능한 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명의 목적은 지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis) 검출을 위한 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification assay) 분석용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 지알디아 인테스티날리스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 지알디아 인테스티날리스 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용한 지알디아 인테스티날리스 검출방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 F3 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 B3 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 FIP 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 BIP 프라이머를 포함하는 지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis) 검출을 위한 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification assay) 분석용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 5로 표시되는 LF프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 LB 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라미어 세트를 포함하는 LAMP 방법을 이용한 지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis) 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라미어 세트를 포함하는 LAMP 방법을 이용한 지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis) 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;

b) 상기 a)단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 프라이머를 이용하여 LAMP 방식으로 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및

c) 상기 b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis) 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로 상기 시료는 분변 또는 장세척액일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로 상기 LAMP 방식으로 표적 서열을 증폭은 63 ℃ 내지 67 ℃에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구현예로 상기 LAMP 방식으로 표적 서열을 증폭은 30분 내지 40분 동안 수행될 수 있다.

도 1a 내지 1d는 본 발명의 프라이머 4세트를 온도 조건을 달리하여 LAMP PCR 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 2c는 본 발명의 1번 프라이머 세트에 루프 프라이머를 추가하여 민감도 및 특이도 테스트를 수행한 결과이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명의 2번 프라이머 세트에 루프 프라이머를 추가하여 민감도 및 특이도 테스트를 수행한 결과이다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 LAMP 방법 및 일반적인 PCR 방법에 의한 검사 결과를 비교한 것이다.

이에 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 F3 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 B3 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 FIP 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 BIP 프라이머를 포함하는 지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis) 검출을 위한 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification assay) 분석용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 상기 프라이머 세트는 서열번호 5로 표시되는 LF프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 LB 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 표적 핵산에 상보성을 통해 특이적으로 결합을 하고 LAMP 방식으로 표적 핵산을 증폭한다. LAMP는 등온조건에서 높은 민감도와 특이성으로 표적 핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭 방법으로, 가닥교체(strand displacement) 활성을 갖는 DNA 폴리머레이즈 및 표적 핵산의 여러 부위에서 특이적으로 제작된 최소 4개의 프라이머 세트를 표준 방법으로 하여, 루프 프라이머 2개를 추가한 6개의 프라이머 세트를 이용할 수도 있다.

상기 본 발명의 서열번호 1 내지 6에 해당하는 프라이머 정보는 아래와 같다.

명칭	염기서열 (5' → 3')	서열번호
F3	GGGCGAGATGATGAAGCAG	1
B3	GCCCGAGATCTTGTAGACGT	2
FIP	TGATGTTGTCCCCGGTCCAGC-TGGAAGAAGGCCGAGGAG	3
BIP	CCGTGCCTGATCGACGCGA-TGGATCGGGAGGCGGA	4
LF	GGACGTCGGGATGTAGTCGA	5
LB	AAGCGCCCGACCGACAA	6

본 발명에서 "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명의 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

LAMP 분석에서 FIP(Forward Inner Primer)및 BIP(Backward Inner Primer)는 증폭 단위체(amplicon)를 형성하는 주요 프라이머이며, 증폭 반응의 시작 및 고리구조 형성에 관여한다. 또한 F3(Forward 3) 및 B3(Backward 3)는 최초 주형에서 FIP/BIP 프라이머로부터 만들어진 중합체가 주형과 떨어지는 strand displacement 현상을 유도하는 중합반응을 초래한다. LF(Loop Forward) 및 LB(Loop Backward)는 증폭 단위체의 고리 구조와 결합하여 더 많은 산물을 형성하는 데 역할을 한다.

상기 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, Loop F 프라이머 (LF), 및 Loop B (LB) 프라이머의 특징 및 기능은 종래 문헌을 참고할 수 있다(Notomi, T. et al. 2000.Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63 및 Nagamine, K. et al. 2002. Accelerated reaction by Loop mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes 16, 223-9).

상기 프라이머 세트는 바람직하게는, 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3의 서열 내의 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상, 38개 이상, 39개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5의 서열 내의 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 서열 내의 14개이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다.

또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 6의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명의 “검출”은 특정 대상시료 또는 개체 내의 지알디아 인테스티날리스 핵산의 존재여부 확인 또는 존재할 경우 그 양을 분석하는 것을 의미한다.

다른 양태로서 본 발명은 상기 프라미어 세트를 포함하는 LAMP 방법을 이용한 지알디아 인테스티날리스 검출용 조성물을 제공한다.

다른 양태로서 본 발명은 상기 프라미어 세트를 포함하는 LAMP 방법을 이용한 지알디아 인테스티날리스 검출용 키트를 제공한다.

상기 조성물 또는 키트에는 LAMP 분석을 위한 프라이머 세트, dNTPs, 완충액, 마그네슘 및 DNA 폴리머라제 및 시료가 포함될 수 있다. 또한 반응을 향상시키기 위한 베타인 또는 DMSO와 같은 물질을 추가로 포함할 수 있다. 반응물에 포함되는 프라이머 세트는 앞서 설명한 바와 같으며, 4개 또는 6개의 프라이머 세트가 사용될 수 있다.

완충액은 예를 들면 소디움포스페이트 완충액, 포타슘포스페이트 완충액, Tris-HCl 완충액 또는 Tricine 완충액 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 DNA 폴리머라제는 strand displacement(가닥 변위) 활성을 가질 것과 반응 산물인 중합체가 고리구조를 형성할 수 있는 열역학적 활동성이 유지되는 온도에서 중합반응을 일으킬 수 있을 것의 두 주요 요건을 만족하는 DNA 폴리머라제이면 족하며, 바람직하게는 Bst 중합효소일 수 있다.

또한 반응물에는 dNTP 대신에 뉴클레오타이드 유사체 (analog)도 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 변형되거나 또는 자연에서 발견되지 않는 것으로 주형 유도된 DNA 합성 과정에서 천연의 뉴클레오타이드와 함께 또는 단독으로 중합될 수 있는 것이다. 이러한 와슨 크릭 베이스 페어링을 통해 중합될 수 있는 유사체로 뉴클레오타이드 베이스의 유사를 포함하는 것은 예를 들면 치환된 퓨린 또는 피리미딘, 데아자퓨린, 메틸퓨린, 메틸 피리미딘, 아미노퓨린, 아미노피리미딘, 티오퓨린, 티오피리미딘, 인돌, 피롤, 7-데아자구아닌, 7-메틸구아닌, 하이포잔틴, 쉐도사이토신, 쉐도아이소사이토신, 아이소사이토신, 아이소구아닌, 2-티오피리미딘, 4-티오티민, 6-티오구아닌, 니트로피롤, 니트로인돌 및 4-메틸인돌을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 치환된 데옥시리보스 유사체를 포함하는 뉴클레오타이드는 치환 또는 비치환된 아라비노스, 치환 또는 비치환된 자일로스 및 치환 또는 비치환된 피라노스를 포함한다. 포스페이트 에스테르 유사체를 포함하는 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로아미데이트, 포스포로셀로노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐리데이트, 포스포로아미데이트, 보론포스페이트, 포스포트리에스테르 및 메틸포스포네이트와 같은 알킬포스포네이트를 포함한다.

다른 양태로서 본 발명은 a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;

본 발명에서 “표적 서열” 또는 “표적 핵산”은 본 발명의 프라이머 세트가 결합하여 특이적으로 증폭되는 핵산 서열을 일컫는 것으로, RNA 또는 DNA를 포함한다.

증폭 후 증폭반응 산물은 다양한 방법으로 검출될 수 있으며, 예를 들면 DNA 합성에 따른 반응액의 색변화, pH변화, 탁도변화, 형광 및/또는 전기영동으로 검출될 수 있으며, 검출된 산물은 양성 및/또는 음성 대조군 시료의 산물과 비교되어 지알디아 인테스티날리스의 정량 또는 정성분석에 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 일 구현예에서는 phenol red를 이용한 결과 육안으로도 검출 여부의 확인이 가능함을 확인하였다(분홍색 → 노란색).

본 발명에서 상기 시료는 지알디아 인테스티날리스의 존재가 의심되는 물질이면 제한없이 이용할 수 있으나 바람직하게는 분변 또는 장세척액일 수 있다.

상기 분변 또는 장세척액은 동물 유래의 것일 수 있으며, 바람직하게는 포유류 유래의 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인간, 개과 또는 고양이과 유래의 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 LAMP 방식으로 표적 서열을 증폭은 63 ℃ 내지 67 ℃에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 63℃에서 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 LAMP 방식으로 표적 서열을 증폭은 30분 내지 40분 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 30분 동안 수행될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

<실시예 1: 재료 및 실험 방법>

실시예 1-1. 재료 준비

반응액은 LAMP PCR을 단순하게 하기 위하여 PCR의 주형이 되는 핵산을 제외한 나머지 재료들을 혼합(Giardia LAMP PCR mix)하고 0.2 ml PCR 튜브에 분주하여 냉동보관하다가 검사시 필요한 검체만큼의 튜브만 해동하고 각 튜브에 핵산 5 ul를 넣어서 검사를 하도록 설계하였다.

Giardia LAMP PCR Mix 제조는 WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix 10 ul, LAMP Primer Mix (F3/B3 2 pmoles/ul, FIP/BIP 16 pmoles/ul, LF/LB 4 pmoles/ul) 1 ul 및 Nuclease Free Water (pH 8.0) 4 ul를 혼합하여 총 15ul가 되게 하였다(pH의 변화에 따라서 phenol red에 의한 색 변화가 나타나는 것이기 때문에 D.W의 pH가 중요하며, 일반적인 D.W의 pH는 7.0 임).

본 발명에서 장비는 Heating Block(대한과학 WB-6)과 Water Bath(대한과학 MaXtable H10) 2가지를 모두 이용하였으며 유사한 결과를 얻을 수 있다.

검체(분변 또는 장세척액)는 (주)아리리스바이오의 고객인 동물병원을 통하여 확보하였다.

기타 본 발명에 이용되는 시약 및 장비는 상업적으로 구매 가능한 것이다.

실시예 1-2. 실험방법

본 발명에서는 여러 방법들 중에서 가장 단순하면서도 순도가 떨어지는 열처리 방식을 통하여 추출된 핵산을 이용함으로써 정제와 농축 과정을 포함하고 있는 대부분의 추출 키트를 이용할 수 있음을 증명하고자 하였다.

① 분변 검체에서 핵산 추출

분변 채취용 면봉을 사용하여 면봉에 묻힌 반려견의 분변 검체를 희석액 500ul가 들어있는 2ml 튜브에 넣은 다음, 분변이 충분히 추출될 수 있도록 면봉을 휘저었다. 그 다음 면봉을 빼고 튜브 뚜껑을 닫고 상기 튜브를 95℃에서 5분간 반응시켜 분변 검체에서 핵산을 추출하였다.

② 검사 전 준비사항

냉동실 키트 박스에서 검체 개수만큼 반응액(상기 Giardia LAMP PCR mix)이 포함된 반응 튜브를 꺼내어 녹였으며, 양성 대조물질(Giardia elongation factor 1 gene을 클로닝한 plasmid, (주)바이오니아에 합성 의뢰) 및 음성 대조물질(멸균된 증류수)도 냉동실에서 꺼내어 얼음 위에서 녹였다. 녹은 반응액, 양성 대조물질 및 음성 대조물질이 들어있는 튜브 각각을 간단하게 원심분리(일반적인 table top 형식의 작은 원심분리기를 이용한 quick spin down 방식)한 후 얼음에 두었다. 한편, 등온증폭기기(Heat block)의 온도는 63℃로 맞춰 놓았다.

③ 검사과정

마이크로파이펫을 이용하여 양성 대조물질과 음성 대조물질이 담겨있는 튜브에서 각각 5ul를 반응 튜브로 옮기고 튜브 뚜껑에 양성 또는 음성을 표시하였다. 그리고 열처리가 끝난, 검체가 함유된 튜브에서 마이크로파이펫으로 상층액 5ul를 반응액이 담겨있는 튜브로 옮기고 뚜껑에 검체 표시를 하였다. 양성 대조물질, 음성 대조물질 및 검체가 담겨있는 반응액 튜브 각각을 미리 63

로 예열되어 있는 등온증폭기기(heat block)의 블록에 꽂아 넣었다. 30분 동안 반응시킨 후 결과를 판독하였으며, 40분 이후의 결과는 판독하지 않았다.

④ 결과 판정, 결과의 해석 및 정도관리

결과 판정 방법은 아래와 같다.

양성: 양성대조물과 검체를 넣은 튜브에서 색 변화(분홍에서 노란색)가 있는 경우

음성: 양성대조물을 넣은 튜브에서만 색 변화(분홍에서 노란색)가 있는 경우

재검사: 음성대조물을 넣은 튜브에서 색 변화가 생겼거나 양성대조물을 넣은 튜브에서 색 변화가 없는 경우

결과가 양성인 경우 검체에 지알디아 핵산이 존재하는 것으로 판단할 수 있고 음성인 경우, 검체 중에 지알디아 핵산이 존재하지 않은 것으로 판단할 수 있다.

모든 검사에서 양성대조물을 넣은 튜브에서는 색변화가 나타나야 한다. 양성 대조물 튜브에서 색변화가 나타나지 않으면 검사가 잘못된 경우 또는 시약의 품질에 문제가 있을 가능성이 있으므로 새로운 시약으로 재검사한다. 음성대조물을 넣은 튜브에서 색변화가 일어난 경우는 오염이 의심되기 때문에 같이 검사한 모든 검체에 대해서 재검사한다.

<실시예 2: F3/B3-FIP/BIP 프라이머 제작 및 효율 확인>

LAMP PCR을 이용하여 분변 검체에 지알디아 원충의 존재를 진단하기 위한 1차 과정은 증폭 대상 지알디아 유전자를 선정하는 것이며, 각종 문헌 정보들을 통하여 “elongation factor 1 apha(EF1a)” 유전자를 증폭하기로 하였다. LAMP PCR primer 제작을 위해 기준이 되는 gene sequence는 GenBank에 게제되어 있는 “AF069570.1” 654bp로 정하였다. 이 sequence를 대상으로 다양한 서열의 primer들을 제작한 결과 primer 설계 범위를 400bp 이내로 줄일 수 있었고 400bp를 유전자 합성을 하여 이후 실험을 진행하였다.

제작된 위치가 다른 4개 set의 F3/B3-FIP/BIP primer들을 선택하여 효율을 비교 분석하였으며 상기 프라이머 정보는 아래와 같다.

<Set 1>

F3: GGGCGAGATGATGAAGCAG (서열번호 1)

B3: GCCCGAGATCTTGTAGACGT (서열번호 2)

FIP: TGATGTTGTCCCCGGTCCAGC-TGGAAGAAGGCCGAGGAG (서열번호 3)

BIP: CCGTGCCTGATCGACGCGA-TGGATCGGGAGGCGGA (서열번호 4)

LF: GGACGTCGGGATGTAGTCGA (서열번호 5)

LB: AAGCGCCCGACCGACAA (서열번호 6)

<Set 2>

F3: ATGGACGACGGCCAGG

B3: CCCTCGTACCAGGGCATC

FIP: AGCCGATGTTCTTTGAGCTGCTT-GTACTCGAAGGAGCGCTACG

BIP: GGAAGAAGGCCGAGGAGTTCG-TTGTCGGACCTCTCCATGA

<Set 3>

F3: ACTCGAAGGAGCGCTACG

B3: GCGTCGATCAGGCACG

FIP: CTCGGCCTTCTTCCAGCCG-ACGAGATCAAGGGCGAGATG

BIP: TTCGACTACATCCCGACGTCCG-CCTCGTACCAGGGCATCT

<Set 4>

F3: CGAGATCAAGGGCGAGATGA

B3: GCCCGAGATCTTGTAGACGT

FIP: TGTTGTCCCCGGTCCAGCC-GAACATCGGCTGGAAGAAGG

BIP: TACGAGGGCCCGTGCCTGA-AGGGGCTTGTCGGTCG

모든 조건들을 동일하게 놓고, 합성된 EF1a plasmid((주)바이오니아에 합성 의뢰) DNA(10³ copy/test)를 주형으로 4 set primer들을 60도, 63도, 65도 또는 67도 조건 하에서 50분 동안 반응시켜 놓고 반응시간 및 비특이적 증폭을 비교하였다. Primer set 4에서는 증폭반응을 확인할 수 없었으며(추후 70도에서 반응이 일어남을 확인), set 3에서는 증류수만 넣은 반응 조건에서도 증폭반응이 일어나는 것이(위양성) 관찰되어 제외시켰다(도 1a 내지 1d).

이 후 낮은 농도의 plasmid DNA를 이용한 반복 테스트 결과 적정 온도는 63도가 제일 좋은 것으로 판단하였으며, 반응 속도를 높이기 위한 loop primer까지 첨가하여 두 세트를 추가 비교하기로 하였다.

<실시예 3: LF/LB 프라이머 제작 및 효율 확인>

상기 EF1a 및 F3/B3-FIP/BIP 정보를 이용하여 loop primer를 설계하였고 set 1은 3개의 LF primer와 1개의 LB primer, set 2는 4개의 LF primer와 1개의 LB primer를 설계하였다.

LF1: GGACGTCGGGATGTAGTCGAA

LF2: CGGACGTCGGGATGTAGTCG

LF3: GGACGTCGGGATGTAGTCGA

LB: AAGCGCCCGACCGACAA

LF1: ATCATCTCGCCCTTGATCTCG

LF2: TCATCTCGCCCTTGATCTCGT

LF3: CATCTCGCCCTTGATCTCGT

LF4: CATCATCTCGCCCTTGATCTCGT

LB: CTGGACCGGGGACAACA

63℃ 및 반응시간 30분 조건에서 각 세트의 loop primer들을 테스트한 결과 제일 효율이 높은 loop primer set를 선택할 수 있었다(set 1에서는 LF3, set 2에서는 LF1). 또한 반응시간 역시 처음 50분에서 30분으로 단축시킬 수 있음을 확인하였다(도 2a 내지 도 3c 참조).

상기 선택된 set 1 및 set 2 프라이머에 최적화된 loop primer를 적용시킨 후 EF1a plasmid DNA를 농도별로 희석하고 63℃ 30분 반응조건 하에서 최소검출한계를 시험하였다. 그 결과 두 primer 세트 모두가 50 copy/test까지는 95% 이상의 검출율을 보였으며, 낮은 빈도로 1 copy/test까지 검출을 할 수 있었다.

상기 분석적 민감도에 대한 구체적인 데이터는 아래와 같다.

	시험 1 (최소검출한계)	시험 2 (판정기준치)
Plasmid DNA 농도	10⁵, 10⁴, 10³, 10², 50, 10, 1, 0 copies	50, 10, 0 copies
시험 횟수	24 테스트(3 days X 2 tester x 2 test x duplicates)	20 테스트 (1 day x 1 tester x 20 test)

각 농도 별로 희석된 Giardia intestinallis의 elongation factor 1 유전자에 대한 plasmid DNA를 냉동고(-20 ± 5 ℃)에서 꺼내어 얼음 위 또는 냉장고(4 ± 4 ℃)에서 천천히 녹였으며, 플라스미드 정보는 아래와 같다.

Sample Type	Target Gene	GeneBank No.	Product	Size
Plasmid DNA	Elongation Factor 1	AF069570	Gene Synthesis	400bp

냉동고에 보관중인 “1SHot LAMP Giardia Detection Kit”에서 시험에 필요한 수만큼 반응 튜브를 꺼내어 얼음 위 또는 냉장고에서 천천히 녹였으며, 반응 튜브 안의 내용물이 완전히 녹은 것을 확인한 후 각 농도에 맞는 plasmid DNA 용액 5 ul를 반응 튜브에 넣었다.

Components (샘플)	Volume (uL)
LAMP Premix	15
Plasmin DNA	5
Total	20

Components (음성 대조군)	Volume (uL)
LAMP Premix	15
D.W	5
Total	20

히팅블럭의 온도를 63℃로 맞춘 다음 샘플 또는 음성 대조물들을 첨가한 각각의 반응 튜브들을 히팅블럭에 꽂은 후 30분 동안 반응시켰다.

양성 및 음성은 상술한 LAMP Premix 시약의 색변화 여부를 통해서 확인하였으며, 최소검출한계에 대한 Test 1은 모든 시험은 2 person, 1일 2회, 이중(duplicate)로 3일 동안 진행되었고 그 결과는 아래 표와 같다.

이와 같이 95% 이상의 검출율을 보이는 최소검출한계는 50 copy로 확인되었다.

또한, 95% 이상 검출되는 농도를 확인하기 위하여 50, 10, 0 copy 농도를 이용하여 1인이 20회 반복 테스트를 수행하였다(Test 2, 판정기준치). 그 결과 100% 검출율을 보이는 50 copy를 판정기준치로 설정하는 것이 타당한 것으로 판단하였다(하기 표 참조).

	50 copy	10 copy	0 copy
20 Test (%)	20 (100%)	9 (45%)	0 (0%)

또한 Giardia Intestinalis의 genomic DNA를 인하대학교의 “병원성원충글로벌중점소재은행”에서 분양 받아 plasmid DNA와 조건으로 시험한 결과 역시 유사함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 최종적 목표는 상기 프라이머를 이용한 진단키트를 개발하는 것이기 때문에 꼭 필요한 특이도를 대변 검체에서 발견될 수 있는 간섭물질 5종과 15종의 genomic DNA를 이용하여 분석하였다. 간섭물질 선정은 각종 문헌들을 근거로 Bile acid, Phospholipid, Uric acid, Urea, Metronidazole을 선택하였으며 시험 농도는 “CLSI Guideline, EP7-A2, Appendix”를 참조하였다. 시험결과 두 세트 모두 간섭물질에 의한 영향을 관찰되지 않았다.

타 균종 15종은 질병관리청의 인체자원은행에서 genomic DNA로 분양을 받았으며, 구체적인 정보는 아래와 같다.

개와 고양이의 분변 검체에서 검출될 수 있는 농도들 중에서 가장 높은 농도(10⁴ copy/test)로 희석을 하여 특이도 테스트를 진행하였다. 그 결과, set 1에서는 비특이적인 증폭 현상을 관찰할 수 없었던 반면, set 2에서는 E. coli, K. oxytoca와 B. cereus에서 약한 위양성 반응이 나타났다. 따라서, 특이도 시험을 바탕으로 set 2는 진단키트로의 이용이 힘든 것으로 결정을 내렸다(도 2c 및 도 3c 참조).

<실시예 5: 본 발명과 기존 real-time PCR 방법과의 효과 비교>

분자진단에 많이 이용되는 real-time PCR과 비교하여 LAMP PCR의 장점을 분석하기 위한 테스트를 진행하였다. 기존 real-time PCR 진단은 비특이적인 반응을 가리기 위하여 SYBR green과 같은 intercalating agent의 사용 보다는 형광물질이 부착된 taqman probe를 주로 이용한다. 대상 유전자 증폭을 위한 forward와 reverse primer sequence외에 probe에 의한 sequence를 추가함으로써 특이도를 높인다. 즉, primer에 의한 비특이적인 증폭이 생겨도 probe는 원래 target sequence에 결합하기 때문에 probe에 결합된 형광물질에 의해서 증폭이 확인되는 시스템에서는 비특이적인 반응을 감소시킬 수 있다는 장점이 있지만 그로 인하여 비용이 크게 증가된다는 단점이 있다.

본 실험에서는 set 1 LAMP PCR primer들 중에서 F3과 B3 primer와 real-time 장비(ABI StepOnePlus Real-time PCR)를 이용하여 지알디아의 EF1a 유전자를 증폭하여 비교하였다. 40 cycle 반응시키는데 90분이 소요되었으며, probe를 사용하지 않고 SYBR green을 사용해서 낮은 농도와 negative control에서 비특이적인 증폭 현상을 발견할 수 있었다. 추가된 40분 동안의 melting analysis를 통하여 낮은 농도와 negative control에서 나타난 증폭 곡선이 비특이적인 것임을 확인할 수 있었다(도 4a). 반면 모든 LAMP PCR primer들(F3/B3, FIP/BIP, LF/LB)을 사용한 LAMP PCR의 경우 결과를 색 변화를 통하여 30분 이내에 확인할 수 있었으며, 비특이적인 반응을 보기위한 추가 10분에서도 낮은 농도와 negative control에서 색 변화(비특이적 증폭)를 관찰할 수는 없었다(도 4b).

결론적으로 probe를 사용하지 않는 real-time PCR의 경우 반응의 특이도까지 확인하려면 대략 130분 정도의 시간과 고가의 PCR 장비가 필요한 반면, LAMP PCR은 3쌍의 primer 조합만으로도 비특이적 반응과 고가의 장비 없이 빠르고 정확한 진단을 할 수 있다는 장점이 있음을 확인할 수 있었다.

<110> Irisbio Inc. <120> Molecular diagnosis method for disease diagnosis of companion animals and livestock <130> P201017 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 <400> 1 gggcgagatg atgaagcag 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 <400> 2 gcccgagatc ttgtagacgt 20 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP <400> 3 tgatgttgtc cccggtccag ctggaagaag gccgaggag 39 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP <400> 4 ccgtgcctga tcgacgcgat ggatcgggag gcgga 35 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF <400> 5 ggacgtcggg atgtagtcga 20 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB <400> 6 aagcgcccga ccgacaa 17

Claims

서열번호 1로 표시되는 F3 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 B3 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 FIP 프라이머, 서열번호 4로 표시되는 BIP 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 LF프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 LB 프라이머를 포함하는 지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis) 검출을 위한 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification assay) 분석용 프라이머 세트.
삭제
제1항의 프라미어 세트를 포함하는 LAMP 방법을 이용한 지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis) 검출용 조성물.
제1항의 프라미어 세트를 포함하는 LAMP 방법을 이용한 지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis) 검출용 키트.
a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머를 이용하여 LAMP 방식으로 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 지알디아 인테스티날리스(Giardia Intestinalis) 검출방법.
제5항에 있어서, 상기 시료는 분변 또는 장세척액인 것인, 검출방법.
제5항에 있어서, 상기 LAMP 방식으로 표적 서열을 증폭은 63 ℃ 내지 67 ℃에서 수행되는 것인, 검출방법.
제5항에 있어서, 상기 LAMP 방식으로 표적 서열을 증폭은 30분 내지 40분 동안 수행되는 것인, 검출방법.