KR20140024411A - 토크 테노 바이러스 진단 - Google Patents

토크 테노 바이러스 진단 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플 중 돼지 토크 테노 바이러스의 존재를 검출하기 위한 방법, 샘플 중 돼지 토크 테노 바이러스의 복제를 검출하기 위한 방법, 토크 테노 바이러스 (RT)-PCR 프라이머 및 프로브, 및 샘플 중 돼지 토크 테노 바이러스의 존재 및 복제를 검출하기 위한 진단 시험용 키트에 관한 것이다.

Description

토크 테노 바이러스 진단 {TORQUE TENO VIRUS DIAGNOSTICS}
본 발명은 샘플 중 돼지 토크 테노 바이러스의 존재를 검출하기 위한 방법, 샘플 중 돼지 토크 테노 바이러스의 복제를 검출하기 위한 방법, 토크 테노 바이러스 (RT)-PCR 프라이머 및 프로브, 및 샘플 중 돼지 토크 테노 바이러스의 존재 및 복제를 검출하기 위한 진단 시험용 키트에 관한 것이다.
토크 테노 바이러스 (TTV)는 환형 (-)-센스 단일 가닥 DNA (ssDNA) 게놈을 가지는 작은 외피 비보유 바이러스이다. 상기 바이러스는 아넬로비리다에(Anelloviridae) 과에 속한다. TTV는 1997년 니시자와 T(Nishizawa T) 등에 의해 최초로 특징이 규명되었다. 상기 바이러스는 수혈후 간염을 앓고 있으며, 비정상적인 간 효소 수치를 나타내지만, 전형적인 간염 바이러스는 보이지 않는 환자의 혈액 중에서 확인되었다. 이후 TTV는 많은 비인간 종, 예컨대, 비인간 영장류, 고양이, 개, 나무타기쥐 및 돼지에서 검출되었다 (문헌 [Leary et al., 1999], [Martinez et al., 2006]). 둘 모두 가축용 돼지 및 멧돼지를 감염시키는 것인 (이에 돼지 TTV로, 또는 간략하게 sTTV 지칭되기도 한다) 토크 테노 수스 바이러스 1 (TTSuV1) 및 토크 테노 수스 바이러스 2 (TTSuV2)는 이오타토크바이러스(Iotatorquevirus) 속에 속하는 것으로 분류된다. TTV는 일부 질환의 발병에 영향을 줄 수 있거나, 심지어는 혈액 또는 조직 중에 존재함으로써 질환의 결과를 조절할 수 있는 것으로 여겨지고 있다 (문헌 [Okamoto, 2009]). 발병에 있어 TTV의 뚜렷한 역할에 대해서는 현재까지 입증된 바 없고, 다른 병원체와의 공동 감염시 그의 역할은 논쟁 중에 있는데, 특히 돼지 써코바이러스 질환 (PCVD)과 관련해서 그러하다 (문헌 [Kekarainen et al., 2006], [Ellis et al., 2008], [Taira et al., 2009]). TTV는 돼지 및 가금류의 경제적 측면에서 중요한 환형 ssDNA 바이러스, 즉 둘 모두 써코비리다에(Circoviridae) 과의 구성원인 돼지 써코바이러스-2 (PCV2) 및 닭 빈혈 바이러스 (CAV)와 보존되는 게놈 영역 및 보존되는 작용을 공유하다. sTTV는 인간을 감염시키는 TTV와 유사한 게놈 조직을 가지지만, 45% 미만의 뉴클레오티드 서열 동일성을 공유한다 (문헌 [Niel et al., 2005]; [Okamoto et al., 2002]). 또한, 최근 연구를 통해 다양한 sTTV, 예컨대, sTTV1 및 sTTV2 사이의 고도한 유전자 가변성이 입증되었다 (문헌 [Huang et al., 2010], [Cortey et al., 2010]). sTTV 게놈의 길이는 대략 2.8 kbp이고, 2개의 주요 잠재적 단백질 코딩 유전자인 오픈 리딩 프레임 (ORF) 1 및 ORF2는 뉴클레오티드 서열로부터 유추될 수 있다. 관련된 ssDNA 바이러스와의 유사성에 의해, ORF1은 바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 것으로 여겨진다. ORF2는 바이러스 복제에 관여하는 것으로 간주되는 비-구조 단백질을 코딩한다 (문헌 [Hijikata et al., 1999]; [Huang et al., 2010]). TTV ORF2는 또한 NF78 KB 경로 억제와 관련이 있었다 (문헌 [Zheng at al., 2007]). sTTV 뉴클레오티드 서열 분석을 통해, RNA 스플라이싱에 의해 생성되고, ORF2와 그의 5'-말단을 공유하는 추가의 ORF인 ORF3이 존재한다는 것이 밝혀졌다. ORF3은 작용이 알려지지 않은 비-구조 단백질을 코딩하는 것으로 여겨진다 (문헌 [Okamoto et al., 2000]; [Biagini et al., 2001]). 아넬로바이러스에 관한 연구는 거의 오직 PCR 기법에만 기반하여 이루어졌다. 최근에 주장한 바에 따르면, 비록 증식이 비효율적이기는 하지만, 인간 TTV 복제를 지원하는 조직 배양 시스템이 보고되었다 (문헌 [Kakkola et al., 2007]; [Leppik et al., 2007]). 그러나, sTTV에 대해서는 sTTV 성장 및 복제를 지원하는 어떤 조직 배양 시스템도 공지된 바 없다.
sTTV를 시험관내에서 성장시키지 못하는 것은 sTTV 연구를 심각하게 방해하여 왔다. 그러한 이유에서 현재까지의 연구는 주로 중점적으로 상이한 인간 TTV 유전자형의 분자 바이러스학적 성질, 전사 및 발현 전략법에 대해 이루어져 왔다. COS-1 세포에서 추정 프로모터에 의해 구동되는 TTV 유전자형 1 게놈을 함유하는 플라스미드로 형질감염한 후 3가지 mRNA가 생산되었다 (문헌 [Kamahora et al., 2000]). 또한, 선택적 스플라이싱 및 선택적 번역 과정 이후, 유전자형 6으로부터 6가지의 상이한 단백질, 및 단리물 P/1C1 (유전자형 1)로부터 7가지의 상이한 단백질이 기술되었다 (문헌 [Qiu at al., 2005]; [Mueller et al., 2008]). 림프종-유래 및 T-세포 백혈병 세포주에서 추가의 스플라이싱 이벤트 및 TTV의 게놈내 재배열이 확인되었다 (문헌 [Leppik et al., 2007]). 인간 TTV 단백질 국소화에 대한 연구는 극히 적으며, 결과는 상당히 모순적이다. TTV 유전자형 6 ORF1 및 ORF2 단백질은 형질감염된 세포의 세포질에 국소화되었다 (문헌 [Qiu et al., 2005]). 대조적으로, 보다 최근의 연구에서는 ORF1 단백질은 핵에 위치하는 반면 (구체적으로 핵소체내), ORF3은 핵에서는 관찰되었지만, 핵소체에서는 관찰되지 않았다. 같은 연구에서, ORF2 단백질은 앞서 기술되어 있는 바와 같이, 세포질에서 발견되었다 (문헌 [Mueller at al., 2008]). 연구들 간에 관찰되는 차이는 TTV 단리물에서 발견되는 게놈의 다양성은 바이러스 단백질의 상이한 발현 및 국소화 전략법과 관련이 있을 수 있다고 제안한다 (문헌 [Mueller et al., 2008]). sTTV의 전사 프로파일은 인간 TTV에서 발견된 것 (문헌 [Okamoto et al., 2002])과 유사할 수 있다고 제안된 바 있지만, 실험상의 증거는 여전히 부족하다.
세포 배양물 중에서는 sTTV의 증식이 불가능한 것에 기인하여, sTTV 검출 및 진단은 현재 종래 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 방법에 기반하여 이루어진다. 특히, 심지어는 동일한 특이적인 숙주 또는 숙주 군을 감염시키는 서브군 내에서도 극도로 가변성인 게놈을 가지는, TTV와 같은 ssDNA 바이러스를 검출하기 위해 적절한 PCR 프라이머 결합 부위, 및 원하는 경우, 프로브 결합 부위를 선택하는 것이 중요하다. sTTV 검출을 위한 PCR 프라이머에 관한 일반적인 문제는, 비록 상기 프라이머가 동일한 지리학적 기원 및 동일한 유전자형의 sTTV 균주에 대해서는 고도한 특이성을 가질 수 있지만, 가능하게는 다른 지리학적 기원 또는 또 다른 유전자형의 sTTV 균주와는 반응할 수 없다는 점이다. 그 결과, 돼지 무리 뿐만 아니라, 생물학적 물질에 일부 sTTV 균주가 존재하는 것은 여전히 간과될 수 있다.
단지 동물 중 sTTV가 존재하는지 여부를 검출하고자 하는 경우, 돼지 무리의 sTTV를 검출하기 위한 신뢰성 있는 범용 진단 도구가 필수적이라는 것은 명백하다. 상기와 같은 도구는 또한 sTTV의 지리학적 확산을 모니터링하는 데 필수적일 수 있다. 이는 그 중에서도 상이한 지리학적 위치의 돼지에서 특정 지리학적 기원 또는 특정 유전자형으로부터의 sTTV 균주의 존재 여부를 밝혀낼 수 있다. 또한 백신 제조 분야에서 신뢰성 있는 진단 도구 또한 요구되고 있다. 다수의 돼지 바이러스 백신 (및 돼지 백신 또한) 세포 배양물 중에서 제조된다. 특정의 세포 배양 배지 성분 및 세포주는 돼지 기원의 것이다. 따라서, 상기 세포 배양물 중에, 또는 상기 세포 배양물을 사용하여 제조된 백신에서 sTTV의 부재에 대해 체크하는 것은 중요하다.
다양한 유형의 샘플 물질 중 sTTV의 존재 뿐만 아니라, 그의 양을 지시할 수 있는 정량적 방법 및 진단 도구는 더욱더 요구되고 있다. 그 중에서도 sTTV의 병리학적 성질에 관한 연구를 크게 가속화시킬 것이다.
그리고, 가장 중요하게는 sTTV는 조직에 존재할 수 있는데, 여기서, sTTV는 복제되거나, 또는 복제되지 않는다. TTV는 실제로 모든 조직 및 기관에서 발견되는 것으로 알려져 있지만, TTV가 혈액에 의해 조직으로 수송되기 때문에 단지 조직에서만 발견이 되는 것인지, 또는 조직에서 활발하게 복제되는 것인지 여부는 알려져 있지 않다. 그러므로, 예컨대, 단순히 sTTV가 조직에 존재하는 것과, 그 조직에서 바이러스가 활발하게 복제되는 것을 구별할 수 있는 시험이 고도로 요구된다. 상기와 같은 시험을 통해서 추가로 세포 배양물 중 미량의 sTTV가 비-복제 형태로 존재하는지 여부를 검출할 수 있었다. 이를 통해 세포 배양물 중에서의 sTTV 백신 제조는 더욱더 안정화될 것이다.
따라서, 상기 sTTV 균주의 지리학적 기원 및 유전자형과는 상관없이, sTTV 균주를 검출할 수 있는 신뢰성 있는 방법 및 진단 도구가 확실히 요구되고 있다. 또한, 상기 sTTV 균주의 바이러스 복제 활성을 검출할 수 있는 신뢰성 있는 방법 및 진단 도구도 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 방법 및 진단 도구를 제공하는 것이다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러 특이적인 프라이머 세트는, 원하는 경우, 특이적인 프로브와 조합되어 sTTV 균주의 지리학적 기원 또는 유전자형과 상관없이 상기 sTTV 균주의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
본 발명에 따른 방법에서, 샘플 중의 TTV를 검출하는 방법은 이제
a) 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머, 또는 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 상기 샘플의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 실시하는 단계;
b) 단계 (a)의 PCR 증폭 결과를 검사하는 단계
를 실시함으로써 수행될 수 있다.
"프라이머"라는 용어는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 인식하고, 그에 결합하여 상보적인 가닥을 따라 핵산을 합성 또는 복제하기 위한 개시점으로서의 역할을 할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 기술하는 것으로 사용된다.
"상보적인 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있는"이라는 용어는 하이브리드화 조건하에 상기 폴리뉴클레오티드와 이중체 구조를 형성할 수 있다는 것을 의미하는 것이다.
"프로브"라는 용어는 관심 폴리뉴클레오티드에 상보적이고, 하이브리드화 조건하에 상기 폴리뉴클레오티드와 이중체 구조를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. "프로브"라는 단어는 기본적으로 특이적인 마커를 추가로 보유하는 프라이머 폴리뉴클레오티드의 특징을 가진다. 상기 마커는 그 중에서도 형광단, 예컨대, 택맨(TaqMan) 프로브 (하기 참조)에서 사용되는 형광단일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 단쇄 핵산 중합체를 기술한다. 상기와 같은 단쇄 중합체의 길이는 일반적으로 10 내지 100개의 핵산 길이가 될 것이다.
"하이브리드화 조건"이라는 용어는 프라이머 또는 프로브가 관심 폴리뉴클레오티드에 어닐링할 수 있게 허용하는 조건에 관한 것이다. 상기 조건은 하이브리드화가 일어나는 용액의 이온 강도 및 온도에 따라 달라진다. 하이브리드화 반응 및 조건은 당업계에 주지되어 있고, 그 중에서도 문헌 [Maniatis/Sambrook (34)]의 표준 실험실 매뉴얼에 기술되어 있다. 하이브리드화 조건을 결정하는 데는 기본적으로 하기 식이 사용된다:
13개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열보다 긴 서열에 대한 기본 용융 온도 (Tm)를 계산하기 위해서는, 하기 등식이 사용될 수 있다:
Figure pct00001
여기서, w, x, y 및 z는 각각 서열 중 염기 A, T, G 및 C의 개수이다 (문헌 [Marmur,J., and Doty,P. (1962) J Mol Biol 5: 109-118]). 추가 정보는 하기 문헌에 제시되어 있다: 문헌 [Wallace,R.B., Shaffer,J., Murphy,R.F., Bonner,J., Hirose,T., and Itakura,K. (1979) Nucleic Acids Res 6:3543-3557] 및 [Sambrook,J., and Russell,D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY]. 상기 등식을 통해 어닐링은 50 nM 프라이머, 50 mM Na+, 및 pH 7.0인 표준 조건하에 이루어진 것으로 추정된다.
염기성 염 조정 용융 온도 (Tm) 계산을 위해서는 하기 등식이 사용될 수 있다:
Figure pct00002
여기서, w, x, y 및 z는 각각 서열 중 염기 A, T, G 및 C의 개수이다. 16.6*로그10([Na+])라는 용어가 염 농도 변화에 따라 Tm을 조정한다 (추가 정보는 하기 문헌에 제시되어 있다: 문헌 [Howley, P.M; Israel, M.F.; Law, M-F.; and M.A. Martin "A rapid method for detecting and mapping homology between heterologous DNAs. Evaluation of polyomavirus genomes." J. Biol. Chem. 254, 4876-4883, 1979]).
PCR 기법도 또한 당업계에 주지되어 있고, 예컨대, 문헌 ["Real-Time PCR: Current Technology and Applications"], ["PCR primers, a laboratory manual"], 및 [Maniatis/Sambrook] (하기 문헌 목록의 참고 문헌 참조)와 같은 실험실 매뉴얼에 추가로 광범위하게 기술되어 있다.
하이브리드화 조건이, 상보성이 불완전함에도 불구하고 어닐링이 일어날 수 있도록 하는 조건이 되는 한, 프라이머 또는 프로브는 관심 폴리뉴클레오티드에 완전하게 상보적일 필요는 없다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 원칙적으로는 예컨대, 상기 제공된 등식, 또는 상기 인용된 문헌에 기재된 충분한 정보를 이용하여 Tm을 하강시키거나, 또는 염 농도를 변경시킴으로써 하나 이상의 뉴클레오티드의 미스매치를 보완할 수 있다.
미스매치를 가지는 프라이머를 사용할 경우, 보통은 덜 엄격한 하이브리드화 조건을 사용하여야 한다는 것을 이해하여야 한다. 또한 이를 통해 결국은 종종 특이성은 감소될 수 있다. TTV-게놈의 크기가 작다면, 이것이 반드시 문제가 되는 것은 아니다. 미스매치를 가지는 프라이머가 비특이 TTV-서열에 결합할 수 있는 기회는 극히 적다. 그럼에도 불구하고, 서열 번호 1, 2 또는 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 대해 100% 상보성으로 매치되는 프라이머가 바람직하다는 것은 자명하다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브는 그 중에서도 동물, 또는 상기 동물의 샘플 중의 sTTV를 검출하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "샘플"이라는 용어는 sTTV를 함유할 것으로 의심되는 임의의 생물학적 물질을 의미한다. 생물학적 물질은 그 중에서도 조직, 예컨대, 돼지 간, 비장, 골, 또는 근육 조직일 수 있지만, 이는 또한 체액, 예컨대, 혈액, 뇨, 배설물 물질, 양수일 수 있다. 물질은 또한 총 배설강, 구강, 또는 비강 면봉 또는 예컨대, 파괴된 세포일 수도 있다. 시험하고자 하는 물질은 또한 돼지가 아닌 다른 것이 기원이 될 수 있다는 것은 말할 필요도 없다. 돼지가 아닌 다른 종이 sTTV를 보유할 것으로 의심되거나, 또는 그가 sTTV를 보유한다는 것을 배제시키기 위해 시험될 수도 있다.
추가로 PCR로도 지칭되는 폴리머라제 연쇄 반응은 프라이머 세트의 존재하에서 DNA 분자를 용융 온도보다 높은 온도로 가열시키는 단계, 이어서, 프라이머 세트의 프라이머가 각각의 상보적인 DNA 가닥에 결합할 수 있도록 냉각시키는 단계를 포함한다. DNA-프라이머 복합체는 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP) 형태의 4가지 DNA 빌딩 블록 A, T, G 및 C의 존재하에서 효소 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보적인 DNA 가닥을 합성하기 위한 출발점을 형성한다. DNA 폴리머라제는 상기 빌딩 블록을 이용하여 새 DNA 가닥을 합성한다. 샘플 중의 sTTV-DNA의 양 (단, 존재할 경우)에 따라, 검출하고자 하는 충분한 양의 물질이 존재하기 전에 수회에 걸쳐 PCR 사이클이 수행되어야 할 것이다. 평균적으로 30 내지 45회 사이클이 일반적일 것이다. 당업자는 프라이머 및 프로브의 서열에 기초하여 예컨대, 상기 또는 표준 실험실 매뉴얼 (상기 참조)에서 제시된 공식을 사용하여 PCR 사이클의 다양한 단계에 대해 최적인 온도 조건을 결정할 수 있을 것이다.
"서열 번호 ~에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프라이머"라는 용어는 프라이머가 적어도 서열 번호 ~에 기재된 올리고뉴클레오티드에 결합하는 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치의 길이를 가져야 한다는 것을 의미한다. 단지 일례로서, FDNA-TTV는 서열 번호 1에 기재된 서열 cgaatggctgagtttatgccgc를 가질 수 있다. 따라서, "서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프라이머"는 적어도 이러한 순서의 뉴클레오티드 cgaatggctgagtttatgccgc로부터의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치로 구성되어야 한다. 그러나, 예컨대, 뉴클레오티드 cgaatggctgagtttatgccgc를 포함하고, 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드를 가지는 보다 긴 장쇄일 수 있다. (비록 명백하게도 소광 분자가 더 이상은 형광단을 소광시키지 못하는 길이는 가지지 않아야 하지만; 하기 참조) 프로브도 상기와 같다. 서열 번호 2에 기재된 올리고뉴클레오티드는 17개의 핵산 길이를 가지지만, 또한 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브의 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드에 결합하는 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드 길이의 최소 길이를 가져야 한다. 5'-말단 및/또는 3'-말단에 추가의 뉴클레오티드를 가지는 프라이머 (또는 프로브)를 선택할 경우, 상기 뉴클레오티드는 프라이머가 결합하는 상보적인 가닥의 3' 및/또는 5' 측면 영역에 상보적일 수 있거나, 또는 상보적이지 않을 수 있다. 일부 경우, 다양한 RT-PCR 사이클의 온도는 가능하게는 증가된 프라이머 길이에 맞게, 및 추가의 뉴클레오티드 중 하나 이상이 상보적이라는 사실에 맞게 적합화되어야 한다. 또한 당업자는 프라이머 및 프로브의 서열에 기초하여 예컨대, 상기 또는 본원에서 언급된 PCR 교재 (상기 참조)에서 제시된 공식을 사용하여 PCR 사이클의 다양한 단계에 대해 최적인 온도 조건을 결정할 수 있을 것이다.
서열 번호 1-8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드의 15, 16, 17, 18, 19개 또는 심지어 20개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프라이머 (서열 번호 2의 경우, 최대 개수는 17개)는 상기와 같은 선호도 순서로 바람직한데, 그 이유는 상기 프라이머가 sTTV-서열에 대해 더욱더 선택적으로 어닐링하기 때문이다.
서열 번호 2 및 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드의 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브 (서열 번호 2의 경우, 최대 개수는 17개)는 상기와 같은 선호도 순서로 바람직한데, 그 이유는 상기 프로브가 sTTV-서열에 대해 더욱더 선택적으로 어닐링하기 때문이다.
원칙적으로, 본 발명의 방법의 단계 a) 후, 이제 단계 b)를 수행하는 데에는 상이한 여러 방법이 존재한다. PCR 단계를 통해 PCR 생성물이 생성되고, 그의 길이 및 양을 예컨대, 종래 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 검사할 수 있다. 샘플 중에 sTTV DNA가 존재할 경우, 프라이머 쌍은 어닐링할 것이며, 따라서, 단계 a) 후, 겔 상에서는 예상되는 길이의 PCR 생성물이 검출될 것이다. 샘플 중에 sTTV DNA가 존재하지 않을 경우, 프라이머 쌍, 또는 프라이머 중 하나 이상은 어닐링하지 못할 것이며, 따라서, 예상되는 길이의 PCR 생성물은 검출되지 않을 것이다.
언급한 바와 같이, 서열 번호 1, 2, 3, 4 및 5에 기재된 올리고뉴클레오티드는 상기 영역에서의 개별 바이러스의 (소수의) 서열차를 반영한다. 프라이머 개발을 위해 가능한 결과는 하기에서 논의한다 (하기 참조). 하기 표 I은 69개의 공지된 sTTV-서열의 서열 정렬을 제공하고, 본 표에서 1-5 번호로 표시된 화살표는 서열 번호 1, 2, 3, 4 및 5가 위치하는 대략적 부위를 나타낸다. 표 I로부터 알 수 있는 바와 같이, FDNA-TTV에 결합하는 본 발명에 따른 정방향 프라이머, 및 RDNA-TTV-r1에 결합하는 본 발명에 따른 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 또는 FDNA-TTV에 결합하는 본 발명에 따른 정방향 프라이머, 및 RDNA-TTV-r2에 결합하는 본 발명에 따른 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 모든 경우에, 즉, 그의 지리학적 기원 또는 그의 유전자형과는 상관없이, 시험되는 모든 분야의 단리물에 대해서 PCR 생성물을 제공할 수 있다
표 I로부터 알 수 있는 바, FDNA-TTV 및 RDNA-TTV-r2에 결합하는 프라이머 세트에 의해 생성된 PCR 생성물은 대략 83 내지 88개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 것이다. 이는 물론 두 프라이머 사이의 영역의 정확한 길이에 따라 달라진다. 또한, 프라이머 사이의 상기 영역의 가변성은 높고, 심지어는 sTTV 군 내에서도 그러하기 때문에, 정확한 길이를 예측하는 것은 불가능하다. 그러나, PCR 생성물의 정확한 길이는 중요하지 않다: PCR 생성물의 정확한 크기가 아닌, PCR 생성물의 존재 여부만이 오직 관련이 있다.
종래 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 잠재적인 PCR 생성물을 분석하는 시간 소비형 분석법에 대한 대안 방법은 SYBR 그린 시스템을 사용하는 것이다 (상기 및 하기 참조). SYBR 그린은 이중 가닥 (ds) DNA와 인터칼레이션하는 염료이다. 이러한 인터칼레이션을 통해 SYBR 그린은 형광을 낸다. 그러므로, SYBR 그린 존재하에 PCR 반응을 수행하면, 각각의 새 dsDNA 카피는 일정량의 SYBR 그린을 채용하여 형광을 낼 것이다. 실시간 PCR 기기는 이러한 형광을 검출할 수 있고, 전용 소프트웨어는 형광 강도로부터 Ct 값을 계산할 수 있다. 이를 통해 제조된 cDNA의 양을 직접적으로 정량화할 수 있다 (그러나, SYBR 그린을 사용하면, 반응 단계가 예상대로 진행되고 있는 여부를 나타내는 내부 대조군은 존재할 수 없다). SYBR 그린 기반 RT-PCR 방법은 맥케이 I.M.(Mackay, I.M.) 등에 의해 기술되었다.
따라서, 상기 방법은 TTV 균주의 지리학적 기원 또는 유전자형과 상관없이 샘플 중 sTTV의 존재 여부를 선택적으로 검출할 수 있는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 제1 실시양태는 a) 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머, 또는 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 실시하는 단계; 및 b) 단계 (a)의 PCR 증폭 결과를 검사하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 돼지 토크 테노 바이러스 (sTTV)의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 실시양태의 바람직한 형태에서, 프라이머 세트 중 한 프라이머는 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 전장의 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV에 결합하고, 프라이머 세트 중 다른 프라이머는 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 전장의 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1, 또는 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 전장의 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2에 결합한다.
단지 일례로서, 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 전장의 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV에 결합하는, 프라이머 세트 중의 한 프라이머는 예컨대, 22개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 서열 cgaatggctg agtttatgcc gc를 가지는 프라이머이다.
예컨대, 서열 번호 1에서, 2번 위치의 뉴클레오티드는 S (즉, G 또는 C일 수 있다)라고 말할 수 있다. 적합한 프라이머를 개발하는 것과 관련하여, 2번 위치의 S가 별다른 큰 영향을 미치는 것은 아니다. 이는 프라이머 연장이 일어나는 지점으로부터 상대적으로 먼거리에 위치한다. 프라이머는 상기 위치에 G를 가지는 DNA 및 C를 가지는 DNA 둘 모두와 어닐링할 것이다. 그러므로, 서열 cgaatggctg agtttatgcc gc를 가지는 프라이머, 및 서열 ccaatggctg agtttatgcc gc를 가지는 프라이머, 두가지 모두 적합하다. 당업자는 가능한 미스매치를 보완하기 위해 PCR 단계의 온도를 보정하는 방법을 알고 있을 것이다. 별법으로, 서열 cgaatggctg agtttatgcc gc를 가지는 프라이머 및 서열 ccaatggctg agtttatgcc gc를 가지는 프라이머 둘 모두를 포함하는 축퇴 프라이머가 사용될 수 있다. 단지 또 다른 일례로서, 18번 위치의 뉴클레오티드 R은 더욱 크게 관련되어 있는데, 그 이유는 프라이머 연장이 일어나는 지점에 가깝게 위치하고 있기 때문이다. 그러므로, 보다 짧은 프라이머, 예컨대, cgaatggctg agtttat를 사용하거나, 또는 18번 위치에 A를 가지는 프라이머 및 G를 가지는 프라이머를 포함하는 축퇴 프라이머를 사용하는 것이 바람직할 것이다.
서열 번호 1, 2, 3, 4 및 5에 기재된 각 서열에 있어, 명백한 컨센서스 서열이 존재한다. 이는 표 I로부터 바로 알 수 있다.
서열 번호 1에 대한 컨센서스 서열은 cgaatggctgagtttatgccgc이다.
서열 번호 2에 대한 컨센서스 서열은 ctgggcgggtgccggag이다.
서열 번호 3에 대한 컨센서스 서열은 cggagtcaaggggcctatcgggcagg이다.
서열 번호 4에 대한 컨센서스 서열은 tgtctagccgcctgggcgggtgccggag이다.
서열 번호 5에 대한 컨센서스 서열은 cggagtcaaggggcctatcgggcagg이다.
상기 서열에 결합하는 프라이머를 디자인할 때, 컨센서스 서열이 바람직한 서열이다.
표 I에서 분석되고, 그에 제시되어 있는 sTTV 서열 중 38개에서 서열 번호 4의 서열은 ygtctarcmgmctgggcgggtgccgvag라는 것에 주목하여야 한다. 그러나, 표 I에서 분석되고, 그에 제시되어 있는 sTTV 서열 중 32개에서 서열 번호 4의 서열은 ygtctarcgmctgggcgggtgccgvag인데, 이는 하나의 뉴클레오티드 갭 때문이다. 갭은 프라이머 연장이 일어나는 지점으로부터 상대적으로 먼거리에 위치하는 바, 적합한 프라이머를 디자인할 때, 이를 고려할 필요는 없다.
PCR 생성물의 존재를 검출하는 데 더욱 효율적인 선택적인 방법은 프로브 기반 실시간 PCR이다. 상기 방법은 기본적으로 상기 기술된 PCR 방법에 의존하지만, 이는 상기 기술된 PCR 방법의 선택성을 능가하는 선택성 수준을 가진다. 이는 본 발명에 따라 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브를 사용하는 것에 의존하다. 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브는, 상기 프로브가 형광단 및 그에 부착된 소광제 분자를 포함하는 올리고뉴클레오티드라는 점에서, 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프라이머와는 다른 것이다. 사용되는 형광단 또는 소광제, 또는 프로브/소광제 조합 후의 작동 기전과 관련하여 여러 버전의 프로브가 존재한다. 단지 일례로서, 상기와 같은 프로브는 택맨 프로브, 스콜피온스(Scorpions) 프로브 및 몰레큘러 비콘(Molecular Beacons) 프로브로서 상업적으로 이용가능하다 (하기 참조).
프로브를 사용하는 방법에서, 예컨대, 본 발명에 따른 프로브를 사용함으로써 검출을 수행할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 이러한 프로브는 예컨대, 본 발명에 따라 FDNA-TTV/RDNA-TTV-r2 결합 프라이머 세트를 사용하는 PCR 반응에서 제조된 cDNA의 내부 서열과 선택적인 방식으로 결합한다. 예를 들어, 균주 TTV2_(HM633239.1)/1-2797 (표 I 참조)에서, 프로브는 단계 b)에서 정렬 중 380-396번 위치의 cDNA RDNA-TTV-r2 영역에 어닐링할 것이다. 그러나, 이는 오직 증폭된 DNA가 실제로 sTTV 기원인 경우에만 이루어진다. 두 선택성 프라이머가 비-TTV DNA를 증폭시키게 하는 예상 밖의 경우에서, 프로브가 어닐링하지 않는 바, 이를 단계 b에서 언급할 것이다. 그러므로, 본 발명에 따른 프로브는 단순한 PCR 반응보다 더욱더 특이적인 방식으로 sTTV를 검출할 수 있다. 또한, 프로브를 사용하면 PCR 생성물을 검출하는 데 겔을 사용할 필요가 없다. 그리고 마지막으로, 실시간 PCR 써멀 사이클러에서 검출되는 형광 수준은 유리된 형광단에 정비례하며, 따라서, PCR에 존재하는 DNA 주형의 양에 정비례한다 (하기 참조). 그러므로, 본 방법은 실시간 PCR 반응에 매우 적합하다.
택맨 기반 실시간 RT-PCR 방법은 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems: 미국 캘리포니아주 94404 포스터 시티 링커 센터 드라이브 850)에 의해 개발된 것이다. 택맨 기반 실시간 RT-PCR 방법은 그 중에서도 참고 문헌 8, 10 및 33에 기술되어 있다. 스콜피온스 및 몰레큘러 비콘에 기반한 실시간 RT-PCR 방법은 프리미어 바이오소프트 인터내셔널(PREMIER Biosoft International: 미국 캘리포니아주 94303-4504 팔로알토 코닝 웨이 3786)을 통해 이용가능하다.
몰레큘러 비콘에 기반한 실시간 PCR을 사용하는 것은 그 중에서도 문헌 [Molecular Beacons; A New Tool to Identify Point Mutations and to Analyze Gene Expression in Mycobacterium tuberculosis by Manganelli, R., Tyagi, S. and Smith, I., in: Methods in Molecular Medicine, vol. 54: page 295-310, Mycobacterium Tuberculosis Protocols, Edited by: T. Parish and N. G. Stoker ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ]에 상세하게 기술되어 있다.
택맨 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브의 5'-말단에 공유적으로 부착되어 있는 형광단, 및 3'-말단의 소광제로 구성되어 있다. 여러 상이한 형광단 (예컨대, 6-카르복시플루오레세인 (두문자어: FAM), 또는 테트라클로로플루오레세인 (두문자어: TET) 및 소광제 (예컨대, 테트라메틸로다민 (두문자어: TAMRA), 또는 디히드로시클로피롤로인돌 트리펩티드 마이너 그루브 결합제 (두문자어: MGB)가 이용가능하다. 소광제 분자는 FRET (형광 공명 에너지 전이)를 통해 사이클러의 광원에 의해 여기되었을 때, 형광단에 의해 방출된 형광을 소광시킨다. 형광단 및 소광제가 근접해 있는 한, 소광은 임의의 형광 신호를 억제시킨다. 택맨 프로브는 특이적인 프라이머 세트에 의해 증폭된 DNA 영역 내에 어닐링되도록 디자인된다. Taq 폴리머라제가 프라이머를 연장하고, 초기 가닥을 합성함에 따라, 폴리머라제의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성은 주형에 어닐링된 프로브를 분해한다. 프로브가 분해되면, 그로부터 형광단이 유리되고, 소광제와 매우 가깝게 위치하는 근접성은 파손됨으로써, 소광 효과는 완화되어 형광단은 형광을 낼 수 있게 된다. 그러므로, 실시간 PCR 써멀 사이클러에서 검출되는 형광은 유리된 형광단에 정비례하며, PCR에 존재하는 DNA 주형의 양에 정비례한다.
택맨 프로브는 본 발명에 따른 방법 및 진단 도구에서 사용하기에 바람직한 프로브이다.
사실상, 본원에 기술된 택맨 프로브인 프로브 TTV-r1은 서열 번호 2에 기재된 DNA 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드이되; 단 그에 형광단 및 소광제가 부착되어 있는 것이다. 그러나, 설명한 바와 같이 (상기 참조), 프로브는 또한 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 보다 짧은, 또는 보다 긴 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 방법에서 프라이머 및 프로브 둘 모두의 어닐링은 한 공정에서 이루어지는 바, 색상 반응은 실제로 DNA 증폭과 동시에 전개된다. 그러므로, 상기 반응을 실시간 PCR 반응이라고 언급할 수 있다.
따라서, 본 실시양태의 또 다른 바람직한 형태는
a) 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 실시하는 단계; 및
b) 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브를 사용하여 단계 (a)의 PCR 증폭 결과를 검사하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 돼지 토크 테노 바이러스 (sTTV)의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 실시양태의 더욱 바람직한 형태에서, 프라이머 세트 중 한 프라이머는 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 전장의 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV에 결합하고, 프라이머 세트 중 다른 프라이머는 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 전장의 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2에 결합한다.
본 실시양태의 또 다른 더욱 바람직한 형태에서, 프로브는 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 전장의 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1에 결합한다.
상기 언급한 바와 같이, sTTV는 조직에 존재할 수 있는데, 여기서, 복제되거나, 또는 복제되지 않는다. TTV는 실제로 모든 조직 및 기관에서 발견되는 것으로 알려져 있지만, TTV가 혈액에 의해 조직으로 수송되기 때문에 단지 조직에서만 발견이 되는 것인지, 또는 조직에서 활발하게 복제되는 것인지 여부는 알려져 있지 않다. 그러므로, 예컨대, 단순히 sTTV가 조직에 존재하는 것과, 그 조직에서 바이러스가 활발하게 복제되는 것을 구별할 수 있는 시험이 고도로 요구된다. 상기와 같은 시험을 통해서 추가로 세포 배양물 중 미량의 sTTV가 불활성화된 형태로 존재하는지 여부를 검출할 수 있게 되며; sTTV 바이러스 복제 결여에 대한 확신을 통해 세포 배양물 중에서의 바이러스 백신 제조는 더욱 안정화될 것이다.
TTV의 게놈 복제는 회전 환형 모델을 통해 진행된다: 복제 동안 주형으로서 (-) 가닥 게놈 바이러스 DNA 가닥을 사용하여 (+) 가닥 ssDNA가 제조되고, 결국 상기의 (+) 가닥 DNA는 새로운 (-) 가닥 DNA를 제조하는 데 있어 주형으로서의 역할을 한다. 원칙적으로, (+) 가닥 DNA는 복제를 검출하는 데 사용될 수 있고; 이어서, (+) DNA 가닥에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하는 가닥-특이 PCR 시험 (ssPCR)을 사용함으로써 DNA 복제를 나타낼 수 있다. 그러나, TTV가 비-허용 세포, 즉, 새로운 바이러스 입자를 형성하는 것을 비롯한, 바이러스의 완전한 증식, 복제 사이클을 지원하지 않는 세포로 진입하였을 때에는 문제가 발생한다. 그럼에도 불구하고, 상기와 같은 비-허용 세포에서, 세포 기전은 바이러스 ssDNA 복제를 개시할 것이며, 그 결과로 (+) 가닥 DNA가 형성되겠지만, 이는 증식성 바이러스 복제라고 맞지 않게 제안하는 것이다. 그러므로, ssPCR은 증식성 바이러스 복제를 확인하는 데 있어서는 신뢰성 있는 시험은 아니다.
더 크게 신뢰할 수 있는 바이러스 복제에 대한 지표는 sTTV mRNA의 존재인데, 이는 활발한 바이러스 복제는 mRNA의 출현을 통해서 그 자체로 나타나기 때문이다. 이어서, 상기 mRNA는 추가로 RT-PCR로도 지칭되는 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 검출될 수 있다. 그러나, 다양한 sTTV의 게놈 서열은 극도로 가변성이기 때문에, 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)에서 사용하기 위한 범용 프라이머를 확인하는 것은 매우 어렵다.
스플라이싱 패턴에 있어서 다양한 sTTV 사이에는 상당한 차이가 있는 것으로 보인다는 사실을 제외하면, sTTV의 RNA 스플라이싱 패턴에 대해서는 알려진 바가 별로 없다는 사실에 의해 두번째 문제가 제기된다. sTTV 바이러스 복제의 특징이 되는 스플라이싱에 기인하여, 일부 프라이머는 RNA 스플라이싱시에 손실되는 영역에 어닐링하기 때문에, 이는 전혀 사용되지 않을 수도 있다. mRNA의 스플라이싱 후, 상기 영역은 손실될 것이며, 그 결과로 어떤 RT-PCR 생성물도 발견되지 않을 것이다. 그리고 결국에는 어떤 바이러스 sTTV 복제도 일어나지 않았다고 잘못 지시될 수 있을 것이다.
놀랍게도, 이에 PCR-프라이머가 결합하는 영역 RDNA-TTV-r1 및 RDNA-TTV-r2는 또한 sTTV의 mRNA에도 존재한다는 것을 발견하게 되었다. 더욱더 놀랍게도, 상기 영역은 mRNA 스플라이싱 과정 동안 스플라이싱 아웃되는 영역 바깥쪽에 위치하는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 상기 영역은 임의의 sTTV에 따른 mRNA 스플라이싱 패턴과는 상관없이 sTTV의 mRNA에 항상 존재한다.
이는 sTTV의 지리학적 기원 또는 그의 유전자형과 상관없이, sTTV의 바이러스 복제 동안 mRNA를 검출하기 위한 RT-PCR 반응에서의 정방향 프라이머를 개발하는 데 영역 RDNA-TTV-r1 및 RDNA-TTV-r2 또한 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 상기 시험을 통해 단순히 sTTV ssDNA가 조직에 존재하는 것과, 그 조직에서 바이러스가 활발하게 복제되는 것을 최초로 구별할 수 있다.
역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)은 두 반응 단계를 포함한다. 제1 단계에서, 프라이머 세트 중 한 프라이머는 TTV-RNA에 결합할 수 있고, 이 복합체는 4가지 DNA 빌딩 블록 A, T, G 및 C의 존재하에서 효소 역전사효소 (RNA 의존성 DNA 폴리머라제)에 의해 RNA 가닥의 cDNA 가닥을 합성하기 위한 출발점을 형성한다. 제2 단계에서, 상기와 같이 형성된 RNA-DNA 하이브리드를 변성시키기 위해 가열한 후, 프라이머 세트 중의 나머지 다른 한 프라이머가 cDNA 가닥에 결합할 수 있도록 냉각시킨다. 이어서, 상기 나머지 다른 한 프라이머는 다시 DNA 빌딩 블록의 존재하에서 DNA 폴리머라제에 의한 제2 DNA 가닥을 합성하기 위한 출발점으로서 작용한다. 샘플 중의 sTTV-RNA의 양 (단, 존재할 경우)에 따라, 검출하고자 하는 충분한 양의 물질이 존재하기 전에 수회에 걸쳐 PCR 사이클이 수행되어야 할 것이다. 평균적으로 30 내지 45회 사이클이 일반적일 것이다. 당업자는 프라이머 및 프로브의 서열에 기초하여 예컨대, 상기에서 또는 상기 언급된 교재 (상기 참조)에서 제시된 공식을 사용하여 PCR 사이클의 다양한 단계에 대해 최적인 온도 조건을 결정할 수 있을 것이다.
상기 언급한 바와 같이, 적합한 정방향 프라이머는 RDNA-TTV-r1 및 RDNA-TTV-r2에 상보적인 프라이머이다. 본 발명에 따른 상기 정방향 프라이머는 서열 번호 4에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치, 또는 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합한다.
역방향 프라이머로서, mRNA의 폴리-A 테일에 결합하는 프라이머가 사용된다. 따라서, 상기 프라이머는 폴리-T 스트레치를 포함할 것이다. 상기 프라이머는 바람직하게는 14개 이상의 연속되는 T로 구성된다. 상기 프라이머가 폴리-A 테일의 임의의 부위에 랜덤 결합하는 것을 막기 위해, 역방향 프라이머는 바람직하게는 폴리-T 스트레치의 3'-말단에 뉴클레오티드 G, 뉴클레오티드 C 또는 뉴클레오티드 A를 보유한다. 이를 통해 프라이머는 폴리-A 테일의 5'-말단에 특이적으로 결합할 수 있을 것이다. 바이러스의 서열 분석을 통해 폴리-A 테일 앞의 마지막 뉴클레오티드의 특징을 알게 되면, 폴리-T 스트레치의 3'-말단에 있는 뉴클레오티드를 상기 마지막 뉴클레오티드에 상보적이 되도록 만들 수 있다. 특징을 알지 못할 경우, 각각은 폴리-T 스트레치의 3'-말단에 G, C 또는 A를 가지는 것인 3가지 폴리-T 프라이머로 이루어진 혼합물을 성공적으로 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 역방향 프라이머는 서열 번호 6에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-1, 서열 번호 7에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-2, 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-3의 가장 5' 방향쪽의 말단 뉴클레오티드에 결합하는 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치를 포함한다.
단지 일례로서, 본 발명에 따른 역방향 프라이머로서, 서열 번호 6에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-1의 14개 이상의 연속되는 5'-말단 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 것인 상기 역방향 프라이머는 예컨대, 뉴클레오티드 서열 TTTTTTTTTTTTTTTA, TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTA 또는 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTA를 가질 수 있다.
T/A 이중체의 용융 온도는 상대적으로 낮다. 따라서, 원하는 경우, 폴리-A 테일에 결합하는 프라이머는 예컨대, 15개의 뉴클레오티드로 된, 공지되어 있으나 랜덤인 서열을 이용하여 5'-말단에서 연장될 수 있다. 상기 5' 연장된 프라이머가 사용되는 경우, 프라이머의 폴리-T 부분과 mRNA의 폴리-A 테일 사이에 어닐링이 성공적으로 이루어질 수 있도록 하기 위해서는 단 1회의 PCR 사이클만 성공적으로 진행되면 된다. 후속 사이클에서는 이제 폴리-T 프라이머의 5' 연장부에 상보적인 제2 프라이머가 사용될 수 있다는 사실에 기인하여 어닐링 반응은 더욱더 효율적일 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는
a) 서열 번호 4에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 또는 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-1, 서열 번호 7에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-2, 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-3의 14개 이상의 연속되는 5'-말단 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)을 실시하는 단계; 및
b) 단계 (a)의 RT-PCR 증폭 결과를 검사하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 복제 sTTV의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
정방향 프라이머로서, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프라이머가 사용된다: 이로써 실시간 RT-PCR 반응에서 RT-PCR 생성물을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브를 사용할 수 있다.
따라서, 상기 실시양태의 바람직한 형태는 상기 정방향 프라이머가 서열 번호 4에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 것을 특징으로 하는, 복제 sTTV의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
기본적으로 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브는 소광제 분자 및 형광단을 포함한다.
따라서, 상기 실시양태의 더욱 바람직한 형태는 상기 방법이 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브를 사용하여 단계 (a)의 PCR 증폭 결과를 검사하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 복제 sTTV의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
이상적으로는, sTTV DNA 검출에 대해 상기 제시된 방법, 및 sTTV 바이러스 복제 검출에 대해 상기 제시된 방법은 한 바이알에서 동시에 적용될 것이다. 이를 통해 sTTV DNA의 존재 및 sTTV 바이러스 복제의 복제 둘 모두를 동시에 검출할 수 있게 된다. 그러나, DNA 및 RNA 검출을 위한 프라이머를 정확하게 선택할 수 있도록 주의를 기울어야 한다. DNA를 검출하는 데 FDNA-TTV 및 RDNA-TTV-r2에 결합하는 프라이머가 사용될 경우, mRNA 검출을 위한, FRNA-b에 결합하는 프라이머를 사용하는 것은 피해야 하는데, 만약 그와 같이 사용할 경우, FRNA-b에 결합하는 프라이머가 RDNA-TTV-r2에 결합하는 프라이머에 어닐링될 수 있기 때문이다. 같은 이유에서, DNA를 검출하는 데 FDNA-TTV 및 RDNA-TTV-r1에 결합하는 프라이머가 사용될 경우, mRNA 검출을 위한, FRNA-a에 결합하는 프라이머를 사용하는 것은 피해야 하는데, 만약 그와 같이 사용할 경우, FRNA-a에 결합하는 프라이머가 RDNA-TTV-r1에 결합하는 프라이머에 어닐링될 수 있기 때문이다. 같은 이유에서, DNA를 검출하는 데 RDNA-TTV-r2에 결합하는 프라이머가 사용되고, RNA를 검출하는 데 FRNA-a에 결합하는 프라이머가 사용될 경우, 이때는 DNA 및 RNA 검출을 위해서 RDNA-TTV-r1 및 FRNA-b에 상보적인 프로브는 사용될 수 없다. 그러므로, 본 발명에 따른 프로브를 사용해서는 각각의 PCR-생성물 및 RT-PCR 생성물을 동시에 검출하는 것은 수행할 없다. 따라서, 상기 생성물은 다른 수단, 예컨대, 겔 전기영동에 의해 분석하여야 하다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는
a) 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 실시하는 단계; 및 동시에
b) 서열 번호 4에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-1, 2 또는 3의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)을 실시하는 단계; 및
c) 단계 a) 및 b)의 PCR 증폭 결과를 검사하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 복제 sTTV의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시양태는
a) 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 실시하는 단계; 및 동시에
b) 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)을 실시하는 단계; 및
c) 단계 a) 및 b)의 RT-PCR 증폭 결과를 검사하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 복제 sTTV의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
각각 상기의 FDNA-TTV 및 RDNA-TTV-r2에 결합하는 프라이머 세트에 의해 생성된 DNA PCR 생성물에 대하여 논의된 바와 같이, 예컨대, FRNA-a에 결합하는 정방향 프라이머 및 RRNA-1에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용할 때, RT-PCR 생성물의 정확한 길이가 제공될 수는 없다. 우선, 프라이머 사이의 영역의 가변성은 높고, 심지어는 sTTV 군 내에서도 그러하기 때문에, 상기 생성물의 정확한 길이를 예측하는 것은 불가능하다. 게다가, RT-PCR 생성물의 경우, TTV에 대해 아주 많은 스플라이스 변이체가 공지되어 있는 바, 예측한다는 것은 더욱더 불가능하다. 그러나, RT-PCR 생성물의 정확한 길이는 또한 중요하지 않다: RT-PCR 생성물의 정확한 크기가 아닌, RT-PCR 생성물의 존재 여부만이 오직 관련이 있다.
RT-PCR에 의존하는 본 발명에 따른 방법은 소위 내부 대조군 RNA (IC-RNA)라고 불리는 것을 부가함으로써 추가로 개선될 수 있다. 사실상, 내부 대조군은, 상기 대조군 RNA (IC-RNA)에 대해 특이적인 프라이머 및 프로브 뿐만 아니라, 일정량의 대조군 RNA를 시험 샘플에 첨가하는 병행 실험이다. (또는 별법으로, 비록 덜 바람직하기는 하지만, 병행 RT-PCR 시험에서 대조군 RNA 및 프라이머 및 프로브를 따로따로 시험한다). 상기 프라이머 및 프로브는 TTV와 관련이 없는 것이어야 한다; TTV와 관련이 있는 경우, 이는 방법 중 TTV 특이 부분을 방해할 수 있다. TTV-특이 형광과 IC-RNA-특이 형광을 구별하기 위해서는 TTV-프로브의 형광단의 색상과 비-TTV-프로브의 형광단의 색상은 상이하여야 한다는 것을 명백하다. IC-RNA의 존재를 보이는 성공적인 반응을 위한 성분 모두가 존재하기 때문에, 특이적인 형광이 존재할 것이며, 이는 다양한 과정 단계가 성공적이었다는 것을 나타낸다. 바람직하게, IC-RNA 시험은 sTTV 검출 시험과 같은 시험관에서 수행된다. 따라서, IC-RNA 특이 형광단의 형광이 검출된 경우, 이에 따라 시험은 신뢰성이 있다는 것이며, 추가로 TTV 특이 형광단의 형광이 검출된 경우, 이는 TTV 물질의 존재를 입증하는 것이다. IC-RNA 특이 형광단의 형광은 검출되었지만, TTV 특이 형광단의 형광은 검출되지 않은 경우, 이는 TTV 물질의 부재를 입증하는 것이다. IC-RNA 특이 형광단의 형광이 검출되지 않은 경우, 시험은 신뢰성이 없다는 것이며, 고려하지 않아야 한다. 따라서, 내부 대조군을 사용하는 것은 예컨대, 비효율적인 RNA 단리, 비효율적인 역전사효소 반응 또는 PCR 억제에 기인한 위음성 결과를 배제시키는 데 중요하다.
원칙적으로, 합성 RNA가 내부 대조군에 대한 출발 물질로서 사용될 수 있다. RNA의 합성 단편에 대한 대안으로서, 숙주의, 또는 다른 병원체로부터 유래된 하우스키핑 유전자 또는 다른 유전자가 내부 대조군으로서 사용될 수 있다. 그러나, 그의 비공지의 농도 및 가변 농도, 불안정 및 생물학적 안전성에 관한 우려 사항으로 인해 PCR 검정에서 취급하고 통합하는 데 있어서 시험관내에서 전사된 RNA보다 더 어려울 수 있다. 이러한 이유에서, 바람직한 내부 대조군 시스템은 호프만(Hoffmann) 등에 의해 디자인된 범용 이종성 내부 대조군 시스템이다. 이는 RNA에 기반한 것이며, 성공적인 RNA 추출 및 RT-PCR을 체크하도록 하기 위해 검정에 쉽게 적합화되고 통합될 수 있다.
따라서, 상기 실시양태의 더욱더 바람직한 형태는 상기 방법 중 실시간 RT-PCR 반응을 수행하는 단계가 추가로 하나 이상의 추가의 비-TTV 관련 프라이머 세트 및 하나 이상의 추가의 비-TTV 관련 RNA 주형을 사용하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
PCR 반응의 정량화가 요구되는 경우, 공지된 양의 TTV-DNA 또는 TTV-mRNA 및 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브가 존재하는 별개의 병행 시험을 실시할 수 있다. 이를 통해 병행 시험에서 DNA 또는 RNA의 양과 형광 검출 역치에 도달하는 데 필요한 사이클 횟수 사이의 관련성을 제공하는 표준 곡선을 도출해낼 수 있다. 이어서, 상기 표준 곡선을 사용하여 샘플 중 TTV-DNA 또는 TTV-mRNA의 비공지된 양을 측정할 수 있다. 그러므로, 표준 곡선을 작성하고, 이어서, 이를 사용하여 샘플 중 TTV-DNA 또는 TTV-mRNA의 양을 정량화하는 데 사용하기 위해 별개의 병행 시험을 실시하는 것인, 본 발명에 따른 방법을 정량적 방법이라고 지칭한다.
생물학적 물질은 바람직하게는 추가의 정제 단계를 따른다는 것으로 명백하다. sTTV 검출 방법이 바이러스 ssDNA 및/또는 mRNA에 기반하는 것이기 때문에, 이러한 ssDNA 및 RNA는 바람직하게 일정한 정도로 샘플로부터 정제된다. 이와 관련하여 정제란 샘플을 본 발명에 따른 방법에 따라 사용하기 이전에 샘플 중의 TTV-DNA 또는 mRNA 이외의 물질이 일정 정도까지 샘플로부터 제거되는 것을 의미한다. 상기 정제는 예컨대, 탈단백질화, 세포 파쇄물 제거, DNA 추출, RNA 추출 등을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 더욱더 바람직한 형태는 상기 방법이 단계 a) 이전에 RNA 및/또는 DNA 정제 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머 또는 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 실시양태는 서열 번호 4에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 또는 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-1, 서열 번호 7에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-2, 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-3의 14개 이상의 연속되는 5'-말단 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브, 또는 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시양태는 샘플 중 돼지 토크 테노 바이러스 (sTTV)의 존재를 검출하기 위한 진단 시험용 키트에 관한 것이다. 상기 키트를 통해 본 발명에 따른 방법을 실행할 수 있다.
따라서, 본 실시양태의 제1 형태는 키트가 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 및 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머, 또는 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 돼지 토크 테노 바이러스 (sTTV)의 존재를 검출하기 위한 진단 시험용 키트에 관한 것이다.
상기 실시양태의 바람직한 형태에서, sTTV의 존재를 검출하기 위한 상기 진단 시험용 키트는 추가로 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브를 포함한다.
또한, 또 다른 실시양태는 키트가 서열 번호 4에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 또는 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-1, 서열 번호 7에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-2, 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-3의 14개 이상의 연속되는 5'-말단 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 복제 sTTV의 존재를 검출하기 위한 진단 시험용 키트에 관한 것이다.
상기 실시양태의 바람직한 형태에서, 복제 sTTV의 존재를 검출하기 위한 상기 진단 시험용 키트는 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브를 추가로 포함한다.
상기의 다양한 프라이머 및 프로브는 키트 중 별개의 바이알에 존재할 수 있다. 이는 또한 하나의 동일한 바이알에 존재할 수 있다. 쉬운 조작을 위해, 그리고, 불필요한 오염의 위험을 피하기 위해, 심지어는 샘플이 첨가된 시험 바이알에 존재할 수도 있다. 이는 바람직하게는 실내 보관 조건하에서 안정하게 유지될 수 있도록 하기 위해 건조된 형태로 존재할 것이다.
또 다른 실시양태는 키트가 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열 번호 4에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 sTTV ssDNA 및 sTTV 바이러스 복제의 존재를 동시에 검출하기 위한 진단 시험용 키트에 관한 것이다.
또한, 또 다른 실시양태는 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 sTTV ssDNA 및 sTTV 바이러스 복제의 존재를 동시에 검출하기 위한 진단 시험용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 진단 시험용 키트는 역전사효소 및/또는 열 안정성 DNA 폴리머라제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 효소는 실시간 RT-PCR을 수행하는 데 필요하고, 따라서, 용이한 사용을 위해 진단 시험용 키트에 이미 혼입되어 있을 수 있다. 실시간 RT-PCR의 내부 대조군이 필요할 경우, IC-RNA 뿐만 아니라, 프라이머 및 프로브의 제2 세트, 본 경우에는 상기에서 논의된 바 있는 비-TTV 프라이머 및 비-TTV RNA 주형 및 비-TTV 프로브가 진단 시험용 키트에 포함될 수 있다. 말할 필요도 없이, 4가지 DNA 빌딩 블록 및 필요한 완충제 또한 진단 시험용 키트에 추가로 포함될 수 있다.
(RT)-PCR 반응의 정량화가 요구되는 경우, 공지된 양의 TTV-RNA 및/또는 TTV-DNA, 및 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브가 존재하는 병행 시험을 실시할 수 있다. 이를 통해 병행 시험에서 RNA 및/또는 DNA의 양과 형광 검출 역치에 도달하는 데 필요한 사이클 횟수 사이의 관련성을 제공하는 표준 곡선을 도출해낼 수 있다. 이어서, 상기 표준 곡선을 사용하여 샘플 중 TTV-RNA 및/또는 TTV-DNA의 양을 측정할 수 있다. 그러므로, 바람직하게 진단 시험용 키트는 정량화할 수 있게 하는 공지된 양의 TTV-RNA 및/또는 TTV-DNA를 추가로 포함한다.
하기에 본 발명에 따른 방법을 수행하는 방법에 관한 일례를 제공한다. 당연히, 실시예가 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.
도면 설명
도 1: 돼지 TTV에 대한 광범위 스펙트럼 qPCR의 증폭 곡선 (도 1a) 및 표준 곡선 (도 1b) 차트. 증폭 차트에서, 회색 곡선은 표준 희석액 시리즈를 나타내고, 검은색 곡선은 샘플을 나타낸다. 표준 곡선 차트에서, 점 표시는 표준 희석액 시리즈를 나타내고, X 표시는 샘플을 나타낸다.
도 2: 앰플리콘의 용융 피크. 회색 곡선은 표준 희석액 시리즈를 나타내고, 검은색 곡선은 샘플을 나타낸다. 샘플 모두 하나의 피크를 보였으며, 용융 온도는 85.0℃ 내지 86.5℃였는데, 이는 측정된 형광이 단 하나의 PCR 생성물로부터 유래된 것임을 시사하는 것이다.
도 3: sTTV 유전자형 2 (sTTV2) 바이러스의 323개의 염기쌍을 포함하는 플라스미드 TTV008의 개략도.
문헌
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예
실시예 1
sTTV 바이러스 DNA 검출을 위한 정량적 실시간 PCR
사용된 장치
0.2 ml 써모-스트립(thermo-strip): 써모 사이언티픽(Thermo Scientific: 웨스트버그)
경질-쉘 96-웰 PCR 플레이트: 바이오래드(Biorad) (카탈로그 번호 HSP-9635)
마이크로실 'B' 필름(Microseal 'B' Film): 바이오래드 (카탈로그 번호 MSB 1001)
이소프리즈(IsoFreeze)™ PCR 냉각기 랙: 이소프리즈
히팅 블록: 써모믹서 컴포트(Thermomixer comfort) (에펜도르프(Eppendorf))
마이크로원심분리기: 에펜도르프 5418
마이크로티터 플레이트용 원심분리기: 에펜도르프 5804R
PCR-워크스테이션: 히어로랩 클렌캡(Herolab CleneCab)
CFX 96 실시간 시스템: 바이오래드
DNA 단리
QIA앰프® 민일루트® 바이러스 스핀용 키트(QIAamp® MinElute® Virus Spin Kit) (퀴아젠(Qiagen) 카탈로그 번호 57704)를 사용하여 다른 돼지 5마리로부터 유래된 200 ㎕의 혈청으로부터의 DNA를 단리시켰다. 키트와 함께 제공된 핸드북에 제조사를 통해 기술된 방법을 적용시켰다. 완충제 AVE를 프로테아제 재현탁용 완충제로 사용하고, 완충제 AW1을 사용하여 권고된 세척 단계를 수행하였다. 권고된 56℃에서의 막 건조는 수행하지 않았다. 칼럼으로부터 DNA를 용리시키기 위해, 50 ㎕의 완충제 AVE를 사용하였다.
PCR -반응
15개의 반응을 위한 마스터 믹스:
187.5 ㎕의 iQ™-SYBR® 그린 수퍼믹스(iQ™-SYBR® Green Supermix) (바이오래드, 카탈로그 번호 170-8882)
82.5 ㎕의 주사용수
15.0 ㎕의 10 μM 정방향 프라이머: TTVall-F1: CGAATGGCTGAGTTTATGCCGC
15.0 ㎕의 10 μM 역방향 프라이머: TTVall-R4: CCTGCCCGATAGGCCCCTTG
300.0 ㎕
96웰 플레이트 중 13개의 웰에 20 ㎕의 마스터-믹스, 및 5 ㎕의 단리된 DNA DNA, 플라스미드 DNA의 표준 희석액 시리즈 또는 물을 첨가하였다.
표준 희석액 시리즈:
표준 희석액 시리즈는 5 x 105개의 카피/㎕에서부터 5 x 100개의 카피/㎕까지인 농도의 플라스미드 TTV008 (TTSuV 2형의 5' UTR의 320 bp-단편 함유, 부록 1 참조)을 포함하는 6개의 샘플을 함유하였다. 각 PCR-반응에 5 ㎕의 표준을 첨가하였는 바, PCR에서 표준 희석 곡선은 2.5 x 106개의 카피수 내지 2.5 x 101개의 카피수의 DNA 범위였다.
PCR -기기 프로그래밍
CFX 96 실시간 시스템 (바이오래드)을 하기와 같이 프로그래밍하였다:
단계 1: 95℃에서 5분
단계 2: 95℃에서 30초
62℃에서 15초
68℃에서 30초 (<=형광 측정): 상기 세 과정을 40x 실시
단계 3: 68℃에서 7분
단계 4: 용융 곡선: 70℃-95℃, 0.5℃/5sec씩 증가.
결과
도 1에는 돼지 TTV에 대한 광범위 스펙트럼 qPCR의 증폭 곡선 (도 1a) 및 표준 곡선 (도 1b) 차트가 제시되어 있다. 증폭 차트에서, 회색 곡선은 표준 희석액 시리즈를 나타내고, 검은색 곡선은 샘플 및 주형이 없는 대조군을 나타낸다. 표준 곡선 차트에서, 점 표시는 표준 희석액 시리즈를 나타내고, X 표시는 샘플을 나타낸다.
Figure pct00006
도 2에는 앰플리콘의 용융 피크가 제시되어 있다. 회색 곡선은 표준 희석액 시리즈를 나타내고, 검은색 곡선은 샘플을 나타낸다. 샘플 모두 하나의 피크를 보였으며, 용융 온도는 85.0℃ 내지 86.5℃였는데, 이는 측정된 형광이 단 하나의 PCR 생성물로부터 유래된 것임을 시사하는 것이다.
Figure pct00007
결론
5개의 샘플 모두 TTV 양성인 것으로 나타났다. 농도는 1.34 x 104 내지 2.34 x 101개의 카피수/반응 범위였고, 이는 혈청 1 ml당 6.71 x 105 내지 1.17 x 103개 카피수의 TTV DNA와 동일한 값이었다.
실시예 2
sTTV 바이러스 mRNA 검출을 위한 RT - PCR
전체 RNA는 2.5 x 105개의 돼지 신장 (PK) 세포로부터 추출하는 것으로 하였다. 600 ㎕의 트리졸(TRIZOL)® 시약 (인비트로겐(Invitrogen)) 및 120 ㎕의 1-브로모-3-클로로프로판 (BCP, 시그마(Sigma))을 사용하여 세포를 파괴시킨 후, 4℃에서 15분 동안 12,000 x g로 현탁액을 원심분리하는 것으로 하였다. 수성상을 수득하고, 300 ㎕의 100% 이소프로필 알콜로 침전시킨 후, 4℃에서 10 min 동안 12,000 x g로 원심분리하는 것으로 하였다. 생성된 RNA 펠릿을 1 ml 75% 에탄올로 세척하고, 대기 건조시켰다. 이어서, RNA를 RNase 무함유 물에 용해시켰다. 터보 DNA-프리™ 키트(TURBO DNA-free™ Kit) (앰비온(Ambion), 어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 RNA 시료로부터 오염 DNA를 제거하였다. 간략하면, RNA 10 ㎍당 2 유니트의 DNase를 첨가하고, 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. DNase를 불활성시키고, 1.5 min 동안 10,000 x g로 원심분리시켜 RNA 샘플로부터 제거하고, RNA를 새 튜브로 옮겨 놓았다. RNA를 정량화하고, 나노드롭(NanoDrop) (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)) 분광광도계를 사용하여 순도를 체크하는 것으로 하였다.
폴리dT 프라이머 (5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3' (V=A/C/G)) 및 슈퍼스크립™ II 리버스 트랜스크립타제 (RT) 시스템(SuperScrip™ II Reverse Transcriptase (RT) System) (인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation))을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 상기와 같이 수득된 500 ng의 RNA를 상보적인 DNA (cDNA)로 전환시켰다. 슈퍼스크립™ II RT 대신 멸균수를 사용하여 음성 RT 대조군을 실시하였다. TTSuV mRNA의 존재 여부를 확인하기 위해, 폴리dT 프라이머 및 FW1 (5'-CTGGGCGGGTGCCG-3') 또는 FW2 (5'-AGTCAAGGGGCCTATCGRGC-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이어서, 1.8% 아가로스 겔 상에 증폭 생성물을 전개시키고, 상기 겔로부터 PCR 생성물을 추출하고, 서열 분석하여 올바른 증폭을 확인하였다.
<표 I>
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> Intervet Int. B.V. <120> Torque Teno virus Diagnostics <130> 2011.019 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> swine torque teno virus <400> 1 csaatggcwg artytatrcc gc 22 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> swine torque teno virus <400> 2 ctgggcgggt gccgvag 17 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> swine torque teno virus <400> 3 cgragycaag ggrcywaycg rgcdgg 26 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> swine torque teno virus <400> 4 ygtctarcmg mctgggcggg tgccgvag 28 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> swine torque teno virus <400> 5 cgragycaag ggrcywaycg rgcdgg 26 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> swine torque teno virus <400> 6 taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> swine torque teno virus <400> 7 gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> swine torque teno virus <400> 8 caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 25 <210> 9 <211> 323 <212> DNA <213> swine torque teno virus <400> 9 agttacacat aaccaccaaa ccacaggtaa actctgcaaa aaagaggaaa taaatctcat 60 tggttgggcc agaagtcctc attagaatac taaaaggacc aatcagaaac acttcctctt 120 ttagagtata taagtaagtg cgcagacgaa tggctgagtt tatgccgctg gtggtagaca 180 cgaacagagc tgagtgtcta accgcctggg cgggtgccgg agctcctgag agcggagtca 240 aggggcctat cgggcaggcg gtaatccagc ggaaccgggc ccccccctca atggaagaaa 300 gatggctgac ggtagcgtac tgc 323 1

Claims (16)

  1. a) 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 실시하는 단계; 및
    b) 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브를 사용하여 단계 (a)의 PCR 증폭 결과를 검사하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 돼지 토크 테노 바이러스 (swine Torque Teno virus, sTTV)의 존재를 검출하는 방법.
  2. a) 서열 번호 4에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 또는 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-1, 서열 번호 7에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-2, 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-3의 14개 이상의 연속되는 5'-말단 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)을 실시하는 단계; 및
    b) 단계 (a)의 RT-PCR 증폭 결과를 검사하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 복제 sTTV의 존재를 검출하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 정방향 프라이머가 서열 번호 4에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 것을 특징으로 하는, 복제 sTTV의 존재를 검출하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브를 사용하여 단계 (a)의 PCR 증폭 결과를 검사하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 복제 sTTV의 존재를 검출하는 방법.
  5. a) 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 실시하는 단계; 및 동시에
    b) 서열 번호 4에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-1, 서열 번호 7에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-2, 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-3의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)을 실시하는 단계; 및
    c) 단계 a) 및 b)의 (RT)-PCR 증폭 결과를 검사하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 복제 sTTV의 존재를 검출하는 방법.
  6. a) 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 실시하는 단계; 및 동시에
    b) 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-1, 서열 번호 7에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-2, 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-3의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플의 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)을 실시하는 단계; 및
    c) 단계 a) 및 b)의 (RT)-PCR 증폭 결과를 검사하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 복제 sTTV의 존재를 검출하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, PCR 및/또는 RT-PCR 반응을 실시하는 단계가 하나 이상의 추가의 비-TTV 관련 프라이머 세트 및 하나 이상의 추가의 비-TTV 관련 주형을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 이전에 RNA 및/또는 DNA 정제 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머, 또는 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.
  10. 서열 번호 4에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 또는 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-1, 서열 번호 7에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-2, 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA-3의 14개 이상의 연속되는 5'-말단 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.
  11. 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치, 또는 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 프로브.
  12. 제9항에 따른 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 sTTV의 존재를 검출하기 위한 진단 시험용 키트.
  13. 제10항에 따른 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 복제 sTTV의 존재를 검출하기 위한 진단 시험용 키트.
  14. 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r2의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열 번호 4에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-a의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 sTTV ssDNA 및 sTTV 바이러스 복제의 존재를 동시에 검출하기 위한 진단 시험용 키트.
  15. 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FDNA-TTV의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 2에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RDNA-TTV-r1의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열 번호 5에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 FRNA-b의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 또는 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 RRNA의 14개 이상의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 스트레치에 결합하는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 sTTV ssDNA 및 sTTV 바이러스 복제의 존재를 동시에 검출하기 위한 진단 시험용 키트.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 비-TTV 관련 프라이머 세트 및 하나 이상의 추가의 비-TTV 관련 주형을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 시험용 키트.
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