JP2023029191A - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株検出用オリゴヌクレオチド - Google Patents
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株検出用オリゴヌクレオチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023029191A JP2023029191A JP2022015948A JP2022015948A JP2023029191A JP 2023029191 A JP2023029191 A JP 2023029191A JP 2022015948 A JP2022015948 A JP 2022015948A JP 2022015948 A JP2022015948 A JP 2022015948A JP 2023029191 A JP2023029191 A JP 2023029191A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- primer
- nucleotide sequence
- mutation
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株、具体的にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質におけるＮ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異、Ｌ４５２Ｒ変異、Ｌ４５２Ｑ変異を特定・検出できる方法を提供すること。【解決手段】夾雑物を含みうる試料から事前に核酸の単離精製作業を実施することなくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異、Ｌ４５２Ｒ変異、及び／又はＬ４５２Ｑ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法を提供する：（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、特定の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。【選択図】なし
Description
本発明は、核酸増幅によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株、具体的にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパクにおけるＮ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｌ４５２Ｑのような変異を検出できるオリゴヌクレオチド、並びにそれらを利用した検出方法及び検出キット等に関する。本発明により、例えば、咽頭および鼻腔ぬぐい液、喀痰、唾液等の生体試料から核酸精製せずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を高感度で検出することが可能である。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。
ＲＮＡを分析する場合、このＰＣＲの前段として、鋳型ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を実施する。これをＲＴ－ＰＣＲという。このＲＴ－ＰＣＲは、（１）ＲＴ、ＰＣＲを非連続に実施する２ステップＲＴ－ＰＣＲ、（２）ＲＴ、ＰＣＲを、単一酵素を利用して連続して実施する一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ、（３）逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの２種類の酵素を利用して、ＲＴ、ＰＣＲを連続的に実施する二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲの３つに大別される。
ＰＣＲおよびＲＴ－ＰＣＲは、遺伝子検査やウイルス検査にも広く用いられている。このような検査の対象となるＲＮＡウイルスの代表例としては、コロナウイルスやインフルエンザウイルスなどの病原性ＲＮＡウイルスが挙げられる。
コロナウイルスは、風邪を含む呼吸器感染症引き起こす原因ウイルスであり、風邪の流行期において約１０～３５％程度はコロナウイルスが原因と言われている。変異型ウイルスが発生することも知られており、稀にＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルスやＭＥＲＳ（中東呼吸器症候群）コロナウイルス、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）コロナウイルスF（ＳＡＲＳ－ｎＣＯＶ－２、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などと呼ばれる）など致死性の重篤な呼吸器疾患を齎すものが発生することが知られている。
コロナウイルスは、風邪を含む呼吸器感染症引き起こす原因ウイルスであり、風邪の流行期において約１０～３５％程度はコロナウイルスが原因と言われている。変異型ウイルスが発生することも知られており、稀にＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルスやＭＥＲＳ（中東呼吸器症候群）コロナウイルス、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）コロナウイルスF（ＳＡＲＳ－ｎＣＯＶ－２、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などと呼ばれる）など致死性の重篤な呼吸器疾患を齎すものが発生することが知られている。
このＳＡＲ－ＣｏＶ－２は、２０１９年に中国武漢で発生して以来、世界各国で感染が広がり、パンデミックとなっている。感染が続く中で、より感染性が高い変異株や重症化しやすい変異株も発生している。感染拡大防止の観点や診断用途において、このように感染・伝播性の増加や抗原性の変化が懸念される変異株（ＶＯＣ；Ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ Ｃｏｎｃｅｒｎ）を簡便、迅速、高感度に検出および特定することが重要であることは言うまでもない。ＶＯＣに関連するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異としてはこれまでにＬ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｌ４５２Ｑなどが知られているが、今後も変化し、増加していく可能性がある。
ウイルスの変異の特定方法としては、一般的なＳＮＰ解析方法が通常用いられる。例えば変異を含む領域を増幅できるＰＣＲプライマーと、異なる蛍光で標識された野生株と変異株それぞれに相補的なＴａｑＭａｎプローブを用い、これらのプライマーとＴａｑＭａｎプローブとウイルスＲＮＡとを混合し、ＲＴ－ＰＣＲを行うことで、野生株、変異株を区別することができる。その他にも、変異株のみを増幅できるようなプライマーを設計し、増幅の有無で変異株の特定を行う手法（ＡＳＰ）、増幅産物に蛍光プローブを反応させ融解曲線解析で変異の有無を判定する手法、ＳＹＢＲなどのインタカーレター色素を用い、増幅産物の融解曲線解析で変異の有無を判定する手法など、様々な手法が知られている（非特許文献１）。これらの方法は組み合わせることも可能であり、複数の箇所の変異を同時に検出するマルチプレックスの手法も開発されている。
しかしながら、ＴａｑＭａｎプローブとＲＴ－ＰＣＲ反応を用いて変異株を特定する場合、野生株と変異株で異なるシグナルを得る必要があり、反応条件の最適化が非常に重要となる。すなわち、上記のように野生株と変異株で異なるＴａｑＭａｎプローブを用いて特定する場合は、わずか１塩基の違いで蛍光シグナルを変化させる必要があり、プローブの長さや配列の選定等の条件設定が重要となる。また同様に、変異株のみを増幅できるようなプライマーを用いる場合も、わずか１塩基しか違わない野生型では増幅しないようにプライマーの長さや配列等を調整する必要があり容易でない。
また、呼吸器感染症の遺伝子検査では、咽頭および鼻腔ぬぐい液、喀痰、唾液等の生体試料をサンプルとしＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子検査が行われる。生体試料は、ＲＴ－ＰＣＲ反応を阻害する夾雑物や、非特異的な増幅を引き起こすウイルス由来以外の核酸を多く含んでいる。従って、核酸の単離処理をせずに、このような生体試料を夾雑物を含む状態でそのまま用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を行う場合、反応が阻害されて増幅不良で検出不能となったり、反応系が複雑となることで非特異反応が生じ、検出感度が低下することなどが懸念される。このような検出感度の低下は、わずか１塩基の違いで蛍光シグナルを変化させて野生株と変異株を判定する必要があるような場合に、それらの識別を困難にするので特に問題となり得る。
現在、感染拡大防止の観点から、迅速かつ簡便にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を判定する方法が強く求められている。特に咽頭および鼻腔ぬぐい液や唾液、糞便試料、ふき取り環境試料等より、核酸の単離処理を行わずにそのままＲＴ－ＰＣＲ反応を行い判定できる有用な方法の開発が望まれていた。
ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ １２２（７） ４５１―４６３（２００２）
本発明は上記従来技術に鑑みてなされたものであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株、具体的にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパクにおけるＮ５０１位、Ｅ４８４位、Ｌ４５２位での変異（特には、Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｌ４５２Ｑ変異）を野生型配列と区別して特定・検出できる蛍光プローブ、及びそれらの蛍光プローブを用いることで前記変異を野生型配列と区別して特定・検出できる方法を提供することを目的とする。また本発明は、検査をより迅速・簡便化するため、核酸の単離処理をせずに、例えば、唾液、咽頭および鼻腔ぬぐい液等の生体試料に由来する夾雑物を含む状態の試料から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパクにおけるＮ５０１位、Ｅ４８４位、Ｌ４５２位での変異（特には、Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｌ４５２Ｑ変異）を有する変異株を、それらの変異を有さない野生株等から特定・検出できる蛍光プローブ、及びそれらの蛍光プローブを用いることで前記変異株を、それらの変異を有さない野生株等から区別して特定・検出できる方法を提供することを更なる目的とする。
本発明者は、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、数多の候補配列の中から野生株と変異株を高感度に区別して特定・検出できるプローブ配列を見出した。また、このプローブを用いることにより、夾雑物を含みうる唾液等の生体試料から事前に核酸の単離精製作業を実施することなくＲＴ－ＰＣＲ反応を行う場合であっても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１位、Ｅ４８４位、Ｌ４５２位における変異（特には、Ｎ５０１Ｙ変異株、Ｅ４８４Ｋ変異株、Ｌ４５２Ｒ変異株、Ｌ４５２Ｑ変異株）を野生株と区別した特定・検出が可能であることを見出し、本発明に到達した。
代表的な本願発明は、以下の通りである。
［項１］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１Ｙ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、配列番号２～６のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＮ５０１Ｙ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項２］ 前記工程（１）において、配列番号７に記載の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に混合する、項１に記載の方法。
［項３］ 前記工程（１）において、配列番号１で示される塩基配列において２３０６３番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に混合する、項１又は２に記載の方法。
［項４］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項１～３のいずれかに記載の方法。
［項５］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１Ｙ変異を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）配列番号２～６のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＮ５０１Ｙ変異検出蛍光プローブを含む；及び
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。
［項６］ 前記検出キットが、配列番号７に記載の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に含む、項５に記載の検出キット。
［項７］ 前記検出キットが、配列番号１で示される塩基配列において２３０６３番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に含む、項５又は６に記載の検出キット。
［項８］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項５～７のいずれかに記載の検出キット。
［項９］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ４８４Ｋ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、配列番号１３～１８のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＥ４８４Ｋ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項１０］ 前記工程（１）において、配列番号１９～２５のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に混合する、項９に記載の方法。
［項１１］ 前記工程（１）において、配列番号１で示される塩基配列において２３０１２番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に混合する、項９又は１０に記載の方法。
［項１２］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項９～１１のいずれかに記載の方法。
［項１３］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ４８４Ｋ変異を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）配列番号１３～１８のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＥ４８４Ｋ変異検出蛍光プローブを含む；及び
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。
［項１４］ 前記検出キットが、配列番号１９～２５のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に含む、項１３に記載の検出キット。
［項１５］ 前記検出キットが、配列番号１で示される塩基配列において２３０１２番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に含む、項１３又は１４に記載の検出キット。
［項１６］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項１３～１５のいずれかに記載の検出キット。
［項１７］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５２Ｒ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、配列番号３３～３９のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＬ４５２Ｒ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項１８］ 前記工程（１）において、配列番号４０～４３のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に混合する、項１７に記載の方法。
［項１９］ 前記工程（１）において、配列番号１で示される塩基配列において２２９１７番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に混合する、項１７又は１８に記載の方法。
［項２０］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項１７～１９のいずれかに記載の方法。
［項２１］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５２Ｒ変異を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）配列番号３３～３９のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＬ４５２Ｒ変異検出蛍光プローブを含む；及び
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。
［項２２］ 前記検出キットが、配列番号４０～４３、若しくは４８～５１のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に含む、項２１に記載の検出キット。
［項２３］ 前記検出キットが、配列番号１で示される塩基配列において２２９１７番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に含む、項２１又は２２に記載の検出キット。
［項２４］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項２１～２３のいずれかに記載の検出キット。
［項２５］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５２Ｑ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、配列番号４８～５１のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＬ４５２Ｑ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項２６］ 前記工程（１）において、配列番号３３～４３のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に混合する、項２５に記載の方法。
［項２７］ 前記工程（１）において、配列番号１で示される塩基配列において２２９１７番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に混合する、項２５又は２６に記載の方法。
［項２８］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項２５～２７のいずれかに記載の方法。
［項２９］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５２Ｑ変異を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）配列番号４８～５１のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＬ４５２Ｑ変異検出蛍光プローブを含む；及び
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。
［項３０］ 前記検出キットが、配列番号３３～４３のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に含む、項２９に記載の検出キット。
［項３１］ 前記検出キットが、配列番号１で示される塩基配列において２２９１７番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に含む、項２９又は３０に記載の検出キット。
［項３２］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項２９～３１のいずれかに記載の検出キット。
［項１］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１Ｙ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、配列番号２～６のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＮ５０１Ｙ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項２］ 前記工程（１）において、配列番号７に記載の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に混合する、項１に記載の方法。
［項３］ 前記工程（１）において、配列番号１で示される塩基配列において２３０６３番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に混合する、項１又は２に記載の方法。
［項４］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項１～３のいずれかに記載の方法。
［項５］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１Ｙ変異を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）配列番号２～６のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＮ５０１Ｙ変異検出蛍光プローブを含む；及び
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。
［項６］ 前記検出キットが、配列番号７に記載の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に含む、項５に記載の検出キット。
［項７］ 前記検出キットが、配列番号１で示される塩基配列において２３０６３番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に含む、項５又は６に記載の検出キット。
［項８］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項５～７のいずれかに記載の検出キット。
［項９］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ４８４Ｋ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、配列番号１３～１８のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＥ４８４Ｋ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項１０］ 前記工程（１）において、配列番号１９～２５のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に混合する、項９に記載の方法。
［項１１］ 前記工程（１）において、配列番号１で示される塩基配列において２３０１２番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に混合する、項９又は１０に記載の方法。
［項１２］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項９～１１のいずれかに記載の方法。
［項１３］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ４８４Ｋ変異を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）配列番号１３～１８のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＥ４８４Ｋ変異検出蛍光プローブを含む；及び
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。
［項１４］ 前記検出キットが、配列番号１９～２５のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に含む、項１３に記載の検出キット。
［項１５］ 前記検出キットが、配列番号１で示される塩基配列において２３０１２番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に含む、項１３又は１４に記載の検出キット。
［項１６］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項１３～１５のいずれかに記載の検出キット。
［項１７］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５２Ｒ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、配列番号３３～３９のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＬ４５２Ｒ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項１８］ 前記工程（１）において、配列番号４０～４３のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に混合する、項１７に記載の方法。
［項１９］ 前記工程（１）において、配列番号１で示される塩基配列において２２９１７番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に混合する、項１７又は１８に記載の方法。
［項２０］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項１７～１９のいずれかに記載の方法。
［項２１］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５２Ｒ変異を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）配列番号３３～３９のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＬ４５２Ｒ変異検出蛍光プローブを含む；及び
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。
［項２２］ 前記検出キットが、配列番号４０～４３、若しくは４８～５１のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に含む、項２１に記載の検出キット。
［項２３］ 前記検出キットが、配列番号１で示される塩基配列において２２９１７番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に含む、項２１又は２２に記載の検出キット。
［項２４］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項２１～２３のいずれかに記載の検出キット。
［項２５］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５２Ｑ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、配列番号４８～５１のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＬ４５２Ｑ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項２６］ 前記工程（１）において、配列番号３３～４３のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に混合する、項２５に記載の方法。
［項２７］ 前記工程（１）において、配列番号１で示される塩基配列において２２９１７番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に混合する、項２５又は２６に記載の方法。
［項２８］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項２５～２７のいずれかに記載の方法。
［項２９］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５２Ｑ変異を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）配列番号４８～５１のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＬ４５２Ｑ変異検出蛍光プローブを含む；及び
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。
［項３０］ 前記検出キットが、配列番号３３～４３のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に含む、項２９に記載の検出キット。
［項３１］ 前記検出キットが、配列番号１で示される塩基配列において２２９１７番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に含む、項２９又は３０に記載の検出キット。
［項３２］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項２９～３１のいずれかに記載の検出キット。
本発明によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株を迅速・簡便に特定・検出することができる。とりわけ、本発明によれば、唾液等の生体試料を各変異検出蛍光プローブと共にＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加後、ＲＴ－ＰＣＲ反応を実施するだけで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株の検出ができるため、事前に生体試料から核酸単離処理を行う必要がなく、よって、核酸の単離処理時のコンタミネーションリスクの減少や検査時間の短縮に貢献できる。このような検査業務の効率化は、患者に対して正確な治療を行えるまでの時間が短縮できるとともに、感染防止の迅速な対応につながり感染症予防にも大いに寄与し得る。
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本発明は、核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異を検出する方法、および該方法を実施するためのキット等に関する。本発明におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパクにおけるＮ５０１位、Ｅ４８４位、Ｌ４５２位での変異を指し、特には、Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ変異、Ｌ４５２Ｑ変異をいう。具体的には、配列番号１で示される野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の塩基配列において、２３０６３番目の塩基のＡがＴに置換されたものがＮ５０１Ｙ変異、２３０１２番目の塩基のＧがＡに置換されたものがＥ４８４Ｋ変異、２２９１７番目の塩基のＴがＧに置換されたものがＬ４５２Ｒ変異、２２９１７番目の塩基のＴがＡに置換されたものがＬ４５２Ｑ変異として知られている。本発明では、前記のような変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株を野生株と区別して検出することができる。
一つの実施形態において、本発明は、核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異、Ｌ４５２Ｒ変異、及び／又はＬ４５２Ｑ変異を検出する方法であって、
少なくとも以下の（１）及び（２）の工程を含む方法を提供する：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、特定塩基配列からなるＮ５０１Ｙ変異検出蛍光プローブ、Ｅ４８４Ｋ変異検出蛍光プローブ、Ｌ４５２Ｒ変異検出蛍光プローブ、及び／又はＬ４５２Ｑ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；並びに
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
本発明は、前記工程（１）において、特定領域に結合するように設計された特定の塩基配列から構成される蛍光検出プローブを用いることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質におけるＮ５０１位、Ｅ４８４位、Ｌ４５２位での変異（特には、Ｎ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異、Ｌ４５２Ｒ変異、及び／又はＬ４５２Ｑ変異）を有する変異株を、これらの変異を有さないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から高度に識別して検出でき、また例えば、唾液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液等の夾雑物質を含む生体試料をそのまま用いる場合であっても、これらのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異を高感度に検出できることを見出したことに基づく。
少なくとも以下の（１）及び（２）の工程を含む方法を提供する：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、特定塩基配列からなるＮ５０１Ｙ変異検出蛍光プローブ、Ｅ４８４Ｋ変異検出蛍光プローブ、Ｌ４５２Ｒ変異検出蛍光プローブ、及び／又はＬ４５２Ｑ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；並びに
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
本発明は、前記工程（１）において、特定領域に結合するように設計された特定の塩基配列から構成される蛍光検出プローブを用いることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質におけるＮ５０１位、Ｅ４８４位、Ｌ４５２位での変異（特には、Ｎ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異、Ｌ４５２Ｒ変異、及び／又はＬ４５２Ｑ変異）を有する変異株を、これらの変異を有さないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から高度に識別して検出でき、また例えば、唾液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液等の夾雑物質を含む生体試料をそのまま用いる場合であっても、これらのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異を高感度に検出できることを見出したことに基づく。
上記の実施態様において、本発明の方法は、核酸の単離処理を行っていない試料を使用することを一つの特徴とする。例えば、本発明は、各種試料から市販の核酸精製キットで核酸を単離したり、あるいはウイルスのゲノム核酸をキャプシド構造などから露出させるための事前の熱処理等をしていない未処理試料を用いることができる。手間のかかる精製等の前処理が不要となるため簡便であるという観点から、これらの未処理試料を用いることが好ましい。また、夾雑物質を除去するような分離精製を伴わない核酸抽出を行った試料であってもよい。ここで、分離精製を伴わない核酸抽出を行った試料とは、試料中で核酸を露出させた状態にすることを意味し、例えば、試料中で細胞膜やカプシド、エンベロープ等を破壊し、これらに内包されていた核酸を抽出して露出させること（但し、破壊後に残存する細胞膜やカプシド、エンベロープの断片等は除去しないこと）をいう。本発明では、このような単離精製の手間を省いて用意した試料であっても良好に核酸増幅でき、安定してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異を検出ことが可能である。このような分離精製を伴わない核酸抽出処理は、前記工程（１）に先立って行うことができる。
本発明において用いられる試料は、核酸の単離処理を行っていないものであれば特に限定されない。本発明に用いる試料が、唾液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液等の夾雑物質および不溶性物質を含みうる試料である場合、当該試料は事前に水または緩衝液等にて懸濁した懸濁液であってよく、唾液試料等であればそのまま使用してもよく、糞便試料等の固形試料をＰＣＲ反応液に直接添加してもよい。例えば咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻咽頭ぬぐい液、喀痰、嘔吐物、唾液、うがい液、涙液、糞便（排泄便、直腸便）などが挙げられるが、特に限定されるものではなく、生体に由来するもの全般に用いることが可能である。特には、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻咽頭ぬぐい液、喀痰、肺吸引物、脳脊髄液、うがい液、唾液、涙液、糞便、培養細胞、培養上清からの検出に有用であり、なかでも唾液試料、喀痰試料、うがい液、涙液、咽頭ぬぐい液試料、鼻咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液試料、糞便試料の検出に有用である。本発明によれば、これら試料から市販のＲＮＡ精製キット等を用いてＲＮＡを単離してＲＴ－ＰＣＲ反応に供する必要がないという利点がある。前記試料は直接検出に供してもよいし、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料であってもよい。前記緩衝液としては、特に限定されるものではないが、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。また、粘性の強い生体試料（例えば、粘性の強い喀痰を含む試料）の場合は、特に限定されないが、スプタザイム酵素液で処理した試料であってもよい。
更に、本発明において用いられる試料は、キャプシドや細胞壁などの堅牢な構造からＲＮＡまたはＤＮＡを抽出しやすくするために、前記試料を緩衝液や、酸またはアルカリ性溶液、有機溶媒などを含む溶液と混合した試料であってもよい。前記溶液に含まれるものとして、酸性溶液としては、酸性の溶液であれば特に限定されない。酸性溶液としては、例えば、ギ酸水溶液、酢酸水溶液、酪酸水溶液、塩酸水溶液、硝酸水溶液、硫酸水溶液、クエン酸水溶液、乳酸水溶液、リン酸水溶液、安息香酸水溶液、シュウ酸水溶液、酒石酸水溶液、アスコルビン酸水溶液、スルホン酸水溶液などが挙げられ、１種単独又は２種以上組み合わせて使用できる。アルカリ性溶液においても、アルカリ性の溶液であれば特に限定されない。アルカリ性溶液としては、例えば水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、水酸化バリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸マグネシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液（ＴＡＰＳＯ，ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ）などが挙げられ、１種単独又は２種以上組み合わせて使用できる。有機溶媒として、具体的にはエタノール、メタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、トリエチルアミン、ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルホスホリックトリアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、ピリジン等が挙げられるがこれに限られるものではない。さらには、本発明に用いられる試料は、前記溶液と混合後熱処理に供されたものであっても良い。熱処理の条件は、特に限定されないが、６０℃以上、好ましくは７０℃以上、より好ましくは８０℃以上、更により好ましくは９０℃以上で、１秒以上処理されたものであってよい。
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異を検出する方法は、変異部位にハイブリダイズする特定の塩基配列からなる蛍光プローブを用いることを一つの特徴とする。所定の変異があるときに強いシグナルを発生するプローブであれば特に限定されないが、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられる。好ましくは、ＴａｑＭａｎプローブである。
プローブに用いられ得る蛍光化合物は、当該分野で公知の任意のものを使用することができ、例えば、使用したいｑＰＣＲ機器に合わせて選択することができる。蛍光化合物の具体例としては、例えば、ローダミン（ＲＯＸ）若しくはその誘導体（例えば、５－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、又はそれらの塩などのローダミン系化合物；フルオロセイン又はその誘導体（例えば、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ２’，７’－ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５’－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト））、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）シリーズ、ローダミン又はその誘導体（例えば、５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、Ｃｙ（登録商標）色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、若しくはそれらの誘導体、又はそれらの塩等の非ローダミン系化合物等があげられるが、これらに限定されない。蛍光化合物は、必要に応じて、使用する蛍光物質にあった消光物質を使用することができる。上記のような蛍光物質に対応した消光物質としては、例えば、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル－ローダミン）、ＤＡＢＣＹＬ（４－（４－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）、ＢＨＱ１（ＢＨＱ：Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標））、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明におけるＮ５０１Ｙを検出するプローブ（Ｎ５０１Ｙ変異検出蛍光プローブともいう）としては、配列番号２～６のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであり得る。なかでも、配列番号２、３、若しくは６のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることが好ましい。
本発明におけるＥ４８４Ｋを検出するプローブ（Ｅ４８４Ｋ変異検出蛍光プローブともいう）としては、配列番号１３～１８のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであり得る。なかでも、配列番号１３、１４、１７～１８のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることが好ましく、配列番号１４、１７、若しくは１８のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることがより好ましい。
本発明におけるＬ４５２Ｒを検出するプローブ（Ｌ４５２Ｒ変異検出蛍光プローブともいう）としては、配列番号３３～３９のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであり得る。なかでも、配列番号３４～３９のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることが好ましい。
本発明におけるＬ４５２Ｑを検出するプローブ（Ｌ４５２Ｑ変異検出蛍光プローブともいう）としては、配列番号４８～５１のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであり得る。なかでも、配列番号４８～５０のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることが好ましく、配列番号４９若しくは５０のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることがより好ましい。
上記のようなプローブを選択して用いることにより、後述の試験例の結果に示されるように、唾液等の夾雑物質を含む生体試料から直接検出する場合でも、より高感度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質変異を検出できる。上記のような特定塩基配列からなるＮ５０１Ｙ変異検出蛍光プローブ、Ｅ４８４Ｋ変異検出蛍光プローブ、Ｌ４５２Ｒ変異検出蛍光プローブ、及び／又はＬ４５２Ｑ変異検出蛍光プローブは、一つを選択して使用してもよいし、二以上を組み合わせて使用してもよい。
本発明におけるＥ４８４Ｋを検出するプローブ（Ｅ４８４Ｋ変異検出蛍光プローブともいう）としては、配列番号１３～１８のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであり得る。なかでも、配列番号１３、１４、１７～１８のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることが好ましく、配列番号１４、１７、若しくは１８のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることがより好ましい。
本発明におけるＬ４５２Ｒを検出するプローブ（Ｌ４５２Ｒ変異検出蛍光プローブともいう）としては、配列番号３３～３９のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであり得る。なかでも、配列番号３４～３９のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることが好ましい。
本発明におけるＬ４５２Ｑを検出するプローブ（Ｌ４５２Ｑ変異検出蛍光プローブともいう）としては、配列番号４８～５１のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであり得る。なかでも、配列番号４８～５０のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることが好ましく、配列番号４９若しくは５０のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることがより好ましい。
上記のようなプローブを選択して用いることにより、後述の試験例の結果に示されるように、唾液等の夾雑物質を含む生体試料から直接検出する場合でも、より高感度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質変異を検出できる。上記のような特定塩基配列からなるＮ５０１Ｙ変異検出蛍光プローブ、Ｅ４８４Ｋ変異検出蛍光プローブ、Ｌ４５２Ｒ変異検出蛍光プローブ、及び／又はＬ４５２Ｑ変異検出蛍光プローブは、一つを選択して使用してもよいし、二以上を組み合わせて使用してもよい。
一つの実施形態において、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異を検出する方法は、野生株を検出するプローブをさらに組み合わせて用いることが好ましい。ここで野生株を検出するプローブとは、国立感染症研究所が発表している「病原体検出マニュアル２０１９－ｎＣｏＶ」、アメリカ疾病予防管理センターが発表する「２０１９－Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ （２０１９－ｎＣｏＶ）Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ Ｐａｎｅｌ Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｅｓ」および「Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｕｓｅ Ｏｎｌｙ ＣＤＣ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ （Ｆｌｕ ＳＣ２）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｅｓ」「Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｕｓｅ Ｏｎｌｙ ２０１９－Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ （２０１９－ｎＣｏＶ） Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｅｓ」およびパスツール研究所が発表している「Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」などに記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子の塩基配列（配列番号１）、もしくはその逆相補鎖にハイブリするプローブであれば特に限定されないが、Ｎ５０１位、Ｅ４８４位、Ｌ４５２位に変異（例えば、Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｌ４５２Ｑのそれぞれに変異）があるときにはシグナルを生じにくく設計されたものが好ましい。このような野生株を検出するプローブを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株検出プローブと組み合わせて使用することにより、試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が含まれている場合に、そのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＳタンパク質においてＮ５０１位、Ｅ４８４位、Ｌ４５２位に変異（例えば、Ｎ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異、Ｌ４５２Ｒ変異、又はＬ４５２Ｑ変異）を有するものか、或いはこれらの変異を有していないもの（例えば、野生株）であるかを、より明確に判別することができ誤判定を回避することが容易になる。
好ましい実施形態では、Ｎ５０１位における変異（特に、Ｎ５０１Ｙ変異）を検出する方法においては、このような野生株を検出できるプローブとして、配列番号７に示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブを用いるのがよい。
Ｅ４８４位における変異（特に、Ｅ４８４Ｋ変異）を検出する方法においては、配列番号１９～２５のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブを用いることが好ましく、配列番号２０～２５のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブを用いることがより好ましく、配列番号２０、２３、２４、若しくは２５のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブを用いることが更に好ましい。
Ｌ４５２位における変異（特に、Ｌ４５２Ｒ変異又はＬ４５２Ｑ変異）を検出する方法においては、配列番号４０～４３のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブを用いることが好ましく、配列番号４０、４２、若しくは４３のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブを用いることがより好ましい。
Ｅ４８４位における変異（特に、Ｅ４８４Ｋ変異）を検出する方法においては、配列番号１９～２５のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブを用いることが好ましく、配列番号２０～２５のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブを用いることがより好ましく、配列番号２０、２３、２４、若しくは２５のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブを用いることが更に好ましい。
Ｌ４５２位における変異（特に、Ｌ４５２Ｒ変異又はＬ４５２Ｑ変異）を検出する方法においては、配列番号４０～４３のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブを用いることが好ましく、配列番号４０、４２、若しくは４３のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブを用いることがより好ましい。
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質におけるＮ５０１位、Ｅ４８４位、Ｌ４５２位での変異（特には、Ｎ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異、Ｌ４５２Ｒ変異、及び／又はＬ４５２Ｑ変異）を検出する方法では、上記の各変異を含む領域を増幅可能なプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する。このようなプライマーとしては、例えばＮ５０１Ｙ変異を検出する方法においては、配列番号１で示される野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の塩基配列において２３０６３番目の塩基を挟み込むように５’側及び３’側に相当する位置にそれぞれ配置されたプライマーであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットであれば特に限定されず、任意のプライマーセットを使用することができる。Ｅ４８４Ｋ変異を検出する方法、Ｌ４５２Ｒ変異、及び／又はＬ４５２Ｑ変異を検出する方法に用いられるプライマーも上記と同様にして、配列番号１で示される野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の塩基配列において２３０１２番目の塩基を挟み込むように及び／又は２２９１７番目の塩基を挟み込むように設計されたプライマーセットを使用することができる。ここで、これらのプライマーセットに挟み込まれて増幅され得る領域の長さは、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、一例として５０～５００ｂｐ程度であり得、５０～３００ｂｐ程度であることが好ましく、５０～１５０ｂｐ程度であることがより好ましい。
好ましい実施形態では、Ｎ５０１Ｙ変異を検出する方法において用いるプライマーセットは、配列番号１０に記載の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列から選択される少なくとも一つのプライマーと、配列番号１１若しくは１２に記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列から選択される少なくとも一つのプライマーとで構成されるプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットであり得る。
また、Ｅ４８４Ｋ変異を検出する方法において用いるプライマーセットは、配列番号２６～３１のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列から選択される少なくとも一つのプライマーと、配列番号３２に記載の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列から選択される少なくとも一つのプライマーとで構成されるプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットであることが好ましい。
更に、Ｌ４５２Ｒ変異及び／又はＬ４５２Ｑ変異を検出する方法において用いるプライマーセットは、配列番号４５に記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列から選択される少なくとも一つのプライマーと、配列番号４６若しくは４７に記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列から選
択される少なくとも一つのプライマーとで構成されるプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットであることが好ましい。
上記のようなプライマーセットを本発明の各変異検出蛍光プローブと組み合わせて使用することで、核酸の単離処理を行っていない試料をそのまま用いる場合であっても、良好にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１Ｙ変異株、Ｅ４８４Ｋ変異株、Ｌ４５２Ｒ変異株、又はＬ４５２Ｑ変異株を野生株から識別することができる。
また、Ｅ４８４Ｋ変異を検出する方法において用いるプライマーセットは、配列番号２６～３１のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列から選択される少なくとも一つのプライマーと、配列番号３２に記載の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列から選択される少なくとも一つのプライマーとで構成されるプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットであることが好ましい。
更に、Ｌ４５２Ｒ変異及び／又はＬ４５２Ｑ変異を検出する方法において用いるプライマーセットは、配列番号４５に記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列から選択される少なくとも一つのプライマーと、配列番号４６若しくは４７に記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列から選
択される少なくとも一つのプライマーとで構成されるプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットであることが好ましい。
上記のようなプライマーセットを本発明の各変異検出蛍光プローブと組み合わせて使用することで、核酸の単離処理を行っていない試料をそのまま用いる場合であっても、良好にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１Ｙ変異株、Ｅ４８４Ｋ変異株、Ｌ４５２Ｒ変異株、又はＬ４５２Ｑ変異株を野生株から識別することができる。
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質におけるＮ５０１位、Ｅ４８４位、Ｌ４５２位での変異（特には、Ｎ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異、Ｌ４５２Ｒ変異、及び／又はＬ４５２Ｑ変異）を検出する方法では、核酸の単離処理を行っておらず夾雑物質が含まれる試料からであっても、夾雑物質の阻害を受けることなくＲＴ－ＰＣＲ反応が実施され得るＲＴ－ＰＣＲ反応液（ＲＴ－ＰＣＲ試薬）を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する。このようなＲＴ－ＰＣＴ反応液は、例えば、夾雑物質に対して耐性を示すことが公知のＤＮＡポリメラーゼ等を含むものが好ましいが、特に限定されない。
前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるＤＮＡポリメラーゼとしては、当該分野で公知の任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。好ましくは、夾雑物耐性を持つことが当該分野で公知の任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。夾雑物耐性とは、ＲＴ－ＰＣＲ阻害物質の存在下においても、核酸増幅反応に十分なＤＮＡポリメラーゼの高い酵素活性を有する性質を指す。夾雑物耐性を持つＤＮＡポリメラーゼとして、特に限定されるものではないが、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ、ＨａｗｋＺ０５やこれらの変異体が挙げられるが、特に限定されない。好ましくは、ＴｔｈおよびＨａｗｋＺ０５又はこれらの変異体の使用である。特に好ましくはＴｔｈ又はその変異体の使用である。通常夾雑耐性を有しないＴａｑなどのＤＮＡポリメラーゼにおいても、アミノ酸変異により夾雑耐性を有する変異体である場合は使用することが可能である。前記ＰＣＲ反応液に含まれる前記夾雑物耐性を有するＤＮＡポリメラーゼの総量は、一例として、少なくとも４．２ｎｇ／μＬ以上あればよく、５．０ｎｇ／μＬ以上であることが好ましく、５．８ｎｇ／μＬ以上であることがより好ましい。なかでも好ましくは、８．３ｎｇ／μＬ以上である。前記夾雑物耐性を有するＤＮＡポリメラーゼの総量の上限は特に限定されないが、一例として、２０ｎｇ／μＬ以下とすることができ、１６．７ｎｇ／μＬ以下であっても十分に本発明の効果を得ることができる。ポリメラーゼの量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法もしくはＮａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャー社）により定量した値であり、安全データシート（ＳＤＳ）から概算してもよい。ＢＳＡなどのタンパク質を含む場合は、後者の方法で算出することが望ましい。非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、ＰＣＲ反応開始までのＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制し、ホットスタートＲＴ－ＰＣＲへの適用ができることが好ましい。
本発明に用いられるＲＴ－ＰＣＲ反応液は、ＤＮＡポリメラーゼおよび必要に応じて逆転写酵素を含む。前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素の由来としては、ＲＮＡをＤＮＡに変換できれば特に限定されないが、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）－ＲＴ、ＡＭＶ－ＲＴ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ－ＲＴ、ＲＡＶ２－ＲＴ、ＥＩＡＶ－ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼ）やその変異体が例示される。特に好ましい例としては、ＭＭＬＶ－ＲＴ、ＡＭＶ－ＲＴ、またはそれらの変異体が挙げられる。
本発明において用いられるＲＴ－ＰＣＲ反応液は、逆転写酵素活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを含むものであっても良い。逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとは、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する能力とＤＮＡを増幅する能力を兼ね備えたＤＮＡポリメラーゼである。逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、逆転写活性及び夾雑物耐性に加えて、耐熱性を有することが好ましい。耐熱性とは、７０℃で１分以上の熱処理を実施しても、酵素活性が半分以上低下しないことをいう。由来は特に限定されるものではないが、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，Ｂｃａ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体が挙げられる。これまでに逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）やＴｈｅｒｍｕｓ ｓｐ Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ）などが挙げられ、これらの逆転写活性と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性が失われていない変異体であってもよい。また、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ）の変異体であって、逆転写活性を有するものが知られており（例えば、ＲＴＸ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｘｅｎｏｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、本発明にはこのような逆転写酵素活性を併せ持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼも使用できる。特に好ましくは、Ｔｔｈ、Ｚ０５及びこれらの変異体からなる群より選択される逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
本明細書において、夾雑物耐性を有するＤＮＡポリメラーゼの変異体とは、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、なかでも好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つ、夾雑物質の存在下においても高いＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものをいう。逆転写活性も兼ね備えたＤＮＡポリメラーゼである場合、夾雑物質の存在下においてもＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性及びＤＮＡを増幅する活性を有するものをいう。ここで、アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、当該分野で公知の任意の手段で行うことができる。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、一例として、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出することが可能である。また、本発明に用いられ得る変異体は、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」ともいう）したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、且つ、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同様にＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性及びＤＮＡを増幅する活性を有するものであってもよい。ここで１又は数個とは、例えば、１～８０個、好ましくは１～４０個、よりこのましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個であり得るが、特に限定されない。
本発明に用いられるＲＴ－ＰＣＲ反応液には、ＤＮＡポリメラーゼの他、緩衝剤、適当な塩、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
本発明で使用される緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６～９、より好ましくはｐＨ７～９に調整されたものである。また、添加する緩衝剤の濃度としては、１０～２００ｍＭ，より好ましくは２０～１５０ｍＭで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが挙げられる。
本発明で使用されるｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰがそれぞれ０．１～０．５ｍＭ、最も一般的には０．２ｍＭ程度加えられる。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションに対する予防処置をとってもよい。クロスコンタミネーションに対する予防処置を講じる場合、Ｕｒａｃｉｌ－Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）を含むことが好ましい。
更に、本発明では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液に、２価陽イオンを含むことが好ましい。このように２価陽イオンを含むことで、より安定して高い夾雑耐性が得られ高感度な検出が可能となる。２価陽イオンとしては、特に限定されないが、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、銅イオン、鉄イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン等を挙げることができる。好ましくは、２価陽イオンとして、マグネシウムイオン、マンガンイオンを含むことが好ましい。本発明において、ＰＣＲ反応液にマグネシウムイオンやマンガンイオン等を添加する場合は、マグネシウムやマンガンを添加してもよいし、これらの塩を添加してもよい。マグネシウム又はその塩としては、マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等が例示され、マンガン又はその塩としては、マンガン、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示される。このようなマグネシウム、マンガン、又はこれらの塩は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中に１～１０ｍＭ程度加えられることが好ましい。本発明の検出方法において、一酵素系ＲＴ－ＰＣＲを実施する場合、安定的に高い感度が得られ易いという観点からは、マンガン又はその塩を含むことが好ましい。特定の実施態様では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において１ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、１．５ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、２．０ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことがより好ましい。また、二酵素系ＲＴ－ＰＣＲを実施する場合、安定的に高い感度が得られ易いという観点からは、マグネシウム又はその塩を含むことが好ましい。特定の実施態様では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において１ｍＭ以上のマグネシウム又はその塩を含むことが好ましく、１．５ｍＭ以上のマグネシウム又はその塩を含むことが好ましく、２．０ｍＭ以上のマグネシウム又はその塩を含むことがより好ましい。
さらにＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる添加剤として、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、ポリペプチド（ウシ血清アルブミン、セリシン、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦともいう）、ゼラチン）、グリセロール、グリコール及び界面活性剤よりなる群から選択された少なくとも１つを含んでいてもよい。
本発明に用いられる前記ポリペプチドは、分子量が５～５００ｋＤａである限り、特に限定されないが、好ましくは、６～４００ｋＤａである。本明細書において、分子量を示すときは、他の意味であることが明らかでない限り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて決定した値をいう。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの分子量の測定は、当該分野で一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカー等を用いて行うことができる。例えば、「分子量５０ｋＤａ」とは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常５０ｋＤａの位置にバンドがあると判断する範囲にあることをいう。また、本発明に用いられるポリペプチドは、上記分子量の範囲内のポリペプチドの混合物であってもよい。
本発明に用いられる前記ポリペプチドは、本発明の効果を奏する限り特に限定されず、複数のアミノ酸がペプチド結合で連なって形成されたタンパク質をいう。また、本発明に用いられるポリペプチドは、アミノ酸が連結されたポリペプチド構造を有する限り、例えば、熱変性等により三次元構造が解かれたような熱変性ポリペプチド（例えば、ゼラチン）等であってもよい。具体的には、本発明に使用され得るポリペプチドとして、例えば、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン、ラクトアルブミン、ヒト血清アルブミン、卵由来アルブミン）、ゼラチン（例えば、魚ゼラチン、豚ゼラチン）、セリシン、カゼイン、フィブロイン等の天然由来タンパク質（天然由来ポリペプチド）；Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦともいう）、コラーゲン加水分解物、ポリペプトン、酵母エキス、ビーフエキストラクト等の合成・分解等により人為的に製造されたポリペプチド等を用いることができる。より一層優れた本発明の効果が奏されるという観点から、好ましくは、本発明に用いられるポリペプチドは、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）、及び／又はセリシンである。少量でも高い効果が発揮され得るという観点から、より好ましくは、ウシ血清アルブミン、ゼラチン（なかでも魚ゼラチン）を用いるのが好適である。これらのポリペプチドは、１種類だけ使用してもよいし、２種類以上を組合わせて使用してもよい。また、これらのポリペプチドは、天然からの抽出や合成等の手段により調製してもよく、また市販品も好適に使用することができる。
本発明において、前記ポリペプチドの使用量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、前記試料と一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液中において、終濃度０．０００１～２００ｍｇ／ｍＬとなるような量、好ましくは０．０１～１５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１～１３０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０．５～１００ｍｇ／ｍＬで使用することができる。より優れた効果を発揮させるために好ましい量は、使用するポリペプチドの種類や所望される効果の程度等によって変動し得るが、例えば、以下のような使用量を例示することができる。
・ウシ血清アルブミンを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば０．５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは３ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・ゼラチンを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば０．１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは７．５ｍｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・セリシンを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、１００ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・ＢＰＦを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは３０ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・ウシ血清アルブミンを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば０．５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは３ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・ゼラチンを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば０．１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは７．５ｍｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・セリシンを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、１００ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・ＢＰＦを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは３０ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる界面活性剤としては、トリトンＸ－１００（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、トリトンＸ－１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊｉ３５、Ｂｒｉｊｉ５８、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｅｍｕｌｇｅｎ４２０などが挙げられるが、特に限定されない。ＲＴ－ＰＣＲ反応液中の前記界面活性剤の濃度も特に限定はされないが、好ましくは０．０００１％以上、より好ましくは０．００２％以上、さらに好ましくは０．００５％以上で、良好な検出が可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、０．１％以下とすることができる。
前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるベタイン様４級アンモニウムとしては、ベタイン（トリメチルグリシン）、カルニチンなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。ベタイン構造は分子内に安定な正、負の両電荷を持つ化合物で、界面活性剤のような性質を示し、ウイルス構造の不安定化を引き起こすと考えられる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼの核酸増幅を促進することが知られる。好ましい前記ベタイン様４級アンモニウム濃度は、０．１Ｍ～２Ｍ、より好ましくは０．２Ｍ～１．２Ｍである。
さらには、当該技術分野でＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲを促進することが知られる物質と組み合わせて使用することもできる。本発明において有用な促進物質とは、例えば、グリセロール、ポリオール、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール－ビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでいてもよい。
また、核酸の単離処理を行っておらず夾雑物質が含まれる試料からであっても、夾雑物質の阻害を受けることなくＲＴ－ＰＣＲ反応が実施され得るＲＴ－ＰＣＲ反応液（ＲＴ－ＰＣＲ試薬）としては、市販品も使用することができ、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（東洋紡）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）、２０１９新型コロナウイルス検出試薬キット（島津）などを使用することができる。好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（東洋紡）を使用するのがよい。
前記工程（２）におけるＲＴ－ＰＣＲ反応のサイクルは、１．熱処理や２．逆転写反応のステップを含んでよい。また、各ステップの前後に、ホットスタート酵素を活性化させるための熱処理工程を含んでもよい。１の熱処理工程では、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させる、及び／もしくは核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させる工程を含み得る。前記熱処理工程の温度及び時間は、６０℃以上であり、かつ１秒以上であればよく、好ましくは７０℃、３０秒以上、より好ましくは８０℃、３０秒以上、特に好ましくは８５℃、３０秒以上である。２の逆転写反応の温度は、使用する逆転写酵素の逆転写活性と、プライマー及びプローブのＴｍ値によって決定され、少なくとも２５℃以上であればよい。より好ましくは３７℃以上である。ＰＣＲでは、［１］熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、［２］鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、［３］ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、の３ステップを含んでいればよく、［２］と［３］を同一の温度で実施して、２ステップとしてもよい。迅速なＲＴ－ＰＣＲを実施するためには、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応に使用するサーマルサイクラーは、前記［２］と［３］のステップの伸長時間を合わせて１５秒以下、より好ましくは１０秒以下の測定プログラムを設定することが望ましい。なお、本明細書において「ＰＣＲの伸長時間」とは、サーマルサイクラーでの設定時間を指す。
本発明の別の一態様は、上記のような特定塩基配列からなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異検出蛍光プローブを含むことを特徴とする、Ｎ５０１Ｙ変異検出キット、Ｅ４８４Ｋ変異検出キット、Ｌ４５２Ｒ変異及び／又はＬ４５２Ｑ変異検出キットである。これらのキットは更に、核酸の単離処理を行っておらず夾雑物質が含まれる試料からであっても、夾雑物質の阻害を受けることなくＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含むことが好ましい。また、これらのキットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生株を検出するプローブ、Ｎ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異、Ｌ４５２Ｒ変異、及び／又はＬ４５２Ｑ変異の各変異を含む領域をそれぞれ増幅可能なプライマーセット含むことが更に好ましい。その他に含み得る成分は、上記の変異検出方法において詳述されたものと同様であり得る。本発明のキットにおいて、上記の変異検出蛍光プローブ及びＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬、並びに必要に応じて含んでいてもよい、野生型検出プローブ、プライマーセットなどは、１つの試薬としてキットに含まれてもよいし、別々の試薬としてキットに含まれ、使用前に混合して用事調製される態様で提供されてもよい。
以下、実施例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
試験例１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＮ５０１Ｙ変異検出プローブの評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｎ５０１Ｙの変異が検出できるプローブを評価した。変異株を検出するプローブはＮ５０１Ｙの変異をもつＲＮＡにのみ反応し、野生株には反応しない、もしくは反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号１０に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号１１に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭ配列番号２～６に記載の変異株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブいずれかを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。なお、ここで用意されたＲＴ－ＰＣＲ反応液は唾液由来の夾雑物質を取り除く操作を行っていないため、核酸の単離処理を行っていない疑似試料とみなすことができる。以降の試験例でも同様にしてＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製して評価を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｎ５０１Ｙの変異が検出できるプローブを評価した。変異株を検出するプローブはＮ５０１Ｙの変異をもつＲＮＡにのみ反応し、野生株には反応しない、もしくは反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号１０に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号１１に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭ配列番号２～６に記載の変異株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブいずれかを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。なお、ここで用意されたＲＴ－ＰＣＲ反応液は唾液由来の夾雑物質を取り除く操作を行っていないため、核酸の単離処理を行っていない疑似試料とみなすことができる。以降の試験例でも同様にしてＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製して評価を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表１に示す。Ｎ／Ａは増幅しなかったことを示す。配列番号２、３、６のプローブは変異株でのみシグナルが得られ、野生株と変異株をうまく分離できていた。配列番号４、５のプローブは野生株にも反応している結果となったが、Ｃｔを比較すると野生型の方がＣｔ値が大きく、変異株の方が野生株より、効率的に反応している結果となった。この結果から、これらのプローブ（特に、配列番号２、３、６で示されるプローブ）が結合する領域（標的核酸領域）に結合するように設計されたプローブを用いることにより、Ｎ５０１位に変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株が効率的に検出できることが分かる。
試験例２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＮ５０１検出プローブの評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｎ５０１の野生株が検出できるプローブを評価した。野生株を検出するプローブはＮ５０１Ｙの変異をもつＲＮＡには反応しない、もしくは反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号１０に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号１１に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号７に記載の野生株検出ＦＡＭ―ＢＨＱ１標識プローブを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｎ５０１の野生株が検出できるプローブを評価した。野生株を検出するプローブはＮ５０１Ｙの変異をもつＲＮＡには反応しない、もしくは反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号１０に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号１１に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号７に記載の野生株検出ＦＡＭ―ＢＨＱ１標識プローブを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表２に示す。Ｎ／Ａは増幅しなかったことを示す。配列番号７のプローブは野生株でのみシグナルが得られ、野生株と変異株をうまく分離できていた。
試験例３．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＮ５０１Ｙ検出プライマーの評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｎ５０１Ｙの変異が検出できるプライマーを評価した。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号８及び１０に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号９及び１１、１２に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬをそれぞれ組み合わせ、１０μＭの配列番号２に記載の変異株検出ＲＯＸ―ＢＨＱ３標識プローブ、１０μＭの配列番号７に記載の野生株検出ＦＡＭ―ＢＨＱ１標識プローブそれぞれを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｎ５０１Ｙの変異が検出できるプライマーを評価した。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号８及び１０に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号９及び１１、１２に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬをそれぞれ組み合わせ、１０μＭの配列番号２に記載の変異株検出ＲＯＸ―ＢＨＱ３標識プローブ、１０μＭの配列番号７に記載の野生株検出ＦＡＭ―ＢＨＱ１標識プローブそれぞれを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表３に示す。Ｎ／Ａは増幅しなかったことを示す。野生株はＦＡＭのシグナルが、変異株はＲＯＸのシグナルが得られればよい。配列番号８と９、１０と１１、８と１１、９と１０、１０と１２の組み合わせを評価し、１０と１１、８と１１、１０と１２の組み合わせでは変異株、野生株をうまく分離できていた。
また、唾液の代わりに鼻咽頭拭い液、鼻腔拭い液、糞便懸濁液を用いても同様の結果を示した。
試験例４．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＥ４８４Ｋ変異検出プローブの評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｅ４８４Ｋの変異が検出できるプローブを評価した。変異株を検出するプローブはＥ４８４Ｋの変異をもつＲＮＡにのみ反応し、野生株には反応しない、もしくは反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号２７に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３２に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号１３～１８に記載の変異株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブいずれかを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｅ４８４Ｋの変異が検出できるプローブを評価した。変異株を検出するプローブはＥ４８４Ｋの変異をもつＲＮＡにのみ反応し、野生株には反応しない、もしくは反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号２７に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３２に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号１３～１８に記載の変異株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブいずれかを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表４に示す。Ｎ／Ａは増幅しなかったことを示す。配列番号１４、１７、１８のプローブは変異株でのみシグナルが得られ、野生株と変異株をうまく分離できていた。配列番号１５、１６のプローブは野生株にも反応している結果となりうまく分離ができなかった。また配列番号１３も唾液の影響のためか、２５００コピーのＲＮＡを添加してもシグナルが弱く、十分な分離はできなかった。この結果から、これらのプローブ（特に、配列番号１４、１７、１８で示されるプローブ）が結合する領域（標的核酸領域）に結合するように設計されたプローブを用いることにより、Ｅ４８４位に変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株が効率的に検出できることが分かる。
試験例５．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＥ４８４検出プローブの評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｅ４８４の野生株が検出できるプローブを評価した。野生株を検出するプローブはＥ４８４Ｋの変異をもつＲＮＡには反応しない、もしくは反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号２７に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３２に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号１９～２６に記載の野生株検出ＦＡＭ―ＢＨＱ１標識プローブいずれかを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｅ４８４の野生株が検出できるプローブを評価した。野生株を検出するプローブはＥ４８４Ｋの変異をもつＲＮＡには反応しない、もしくは反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号２７に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３２に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号１９～２６に記載の野生株検出ＦＡＭ―ＢＨＱ１標識プローブいずれかを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表５に示す。Ｎ／Ａは増幅しなかったことを示す。配列番号２０、２３、２４、２５のプローブは野生株でのみシグナルが得られ、野生株と変異株をうまく分離できていた。配列番号２１、２２のプローブは変異株にも反応している結果となったが、Ｃｔを比較すると変異型の方がＣｔ値が大きく、野生株の方が変異株より、効率的に反応している結果となった。配列番号１９のプローブは唾液の影響のためか、６２５コピーまでしか十分な検出はできず、低コピーでの分離はできなかった。
試験例６．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＥ４８４Ｋ検出プライマーの評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｅ４８４Ｋの変異が検出できるプライマーを評価した。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号２６～３１に記載のＦｗｄプライマーいずれかを１．２μＬ、１０μＭの配列番号３２に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬをそれぞれ組み合わせ、１０μＭの配列番号１５に記載の変異株検出ＨＥＸ―ＴＡＭＲＡ標識プローブ、１０μＭの配列番号２１に記載の野株検出ＦＡＭ―ＴＡＭＲＡ標識プローブそれぞれを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｅ４８４Ｋの変異が検出できるプライマーを評価した。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号２６～３１に記載のＦｗｄプライマーいずれかを１．２μＬ、１０μＭの配列番号３２に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬをそれぞれ組み合わせ、１０μＭの配列番号１５に記載の変異株検出ＨＥＸ―ＴＡＭＲＡ標識プローブ、１０μＭの配列番号２１に記載の野株検出ＦＡＭ―ＴＡＭＲＡ標識プローブそれぞれを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表６に示す。野生株はＦＡＭのシグナルが、変異株はＨＥＸのシグナルが得られればよい。すべての組み合わせでは変異株、野生株をうまく分離できていた。
試験例７．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＥ４８４、Ｅ４８４Ｋ検出プローブの組み合わせ評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｅ４８４の野生株を検出できるプローブとＥ４８４Ｋの変異が検出できるプローブの組み合わせを評価した。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号２７に記載のＦｗｄプライマーを１．２μＬ、１０μＭの配列番号３２に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号１１４及び１８に記載の変異株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブ、１０μＭの配列番号２３及び２４に記載の野株検出ＦＡＭ―ＢＨＱ１標識プローブそれぞれを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（１０４、５０、２５、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｅ４８４の野生株を検出できるプローブとＥ４８４Ｋの変異が検出できるプローブの組み合わせを評価した。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号２７に記載のＦｗｄプライマーを１．２μＬ、１０μＭの配列番号３２に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号１１４及び１８に記載の変異株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブ、１０μＭの配列番号２３及び２４に記載の野株検出ＦＡＭ―ＢＨＱ１標識プローブそれぞれを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（１０４、５０、２５、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表７に示す。Ｎ／Ａは増幅しなかったことを示す。野生株はＦＡＭのシグナルが、変異株はＣｙ５のシグナルが得られればよい。すべての組み合わせ（配列番号１８と２４、１８と２３、１４と２３）で変異株、野生株をうまく分離できていた。
また、唾液の代わりに鼻咽頭拭い液、鼻腔拭い液、糞便懸濁液を用いても同様の結果を示した。
試験例８．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＬ４５２Ｒ変異検出プローブの評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｌ４５２Ｒの変異が検出できるプローブを評価した。変異株を検出するプローブはＬ４５２Ｒの変異をもつＲＮＡにのみ反応し、野生株には反応しない、もしくは反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号４５に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号４６に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３３～３９に記載の変異株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブいずれかを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｌ４５２Ｒの変異が検出できるプローブを評価した。変異株を検出するプローブはＬ４５２Ｒの変異をもつＲＮＡにのみ反応し、野生株には反応しない、もしくは反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号４５に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号４６に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３３～３９に記載の変異株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブいずれかを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表８に示す。Ｎ／Ａは増幅しなかったことを示す。配列番号３４，３５，３６、３７、３８、３９のプローブは変異株でのみシグナルが得られ、野生株と変異株をうまく分離できていた。配列番号３３のプローブは野生株にも反応している結果となったが、Ｃｔを比較すると野生型の方がＣｔ値が大きく、変異株の方が野生株より、効率的に反応している結果となった。この結果から、これらのプローブ（特に、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９で示されるプローブ）が結合する領域（標的核酸領域）に結合するように設計されたプローブを用いることにより、Ｌ４５２位に変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株が効率的に検出できることが分かる。
試験例９．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＬ４５２検出プローブの評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｌ４５２の野生株が検出できるプローブを評価した。野生株を検出するプローブはＬ４５２Ｒの変異をもつＲＮＡには反応しない、もしくは反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μ
Ｌ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号２７に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３２に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号４０～４３に記載の野生株検出ＦＡＭ―ＢＨＱ１標識プローブいずれかを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｌ４５２の野生株が検出できるプローブを評価した。野生株を検出するプローブはＬ４５２Ｒの変異をもつＲＮＡには反応しない、もしくは反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μ
Ｌ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号２７に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３２に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号４０～４３に記載の野生株検出ＦＡＭ―ＢＨＱ１標識プローブいずれかを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表９に示す。Ｎ／Ａは増幅しなかったことを示す。配列番号４０、４２、４３のプローブは野生株でのみシグナルが得られ、野生株と変異株をうまく分離できていた。配列番号４１のプローブは唾液の影響のためか、２５００コピーまでしか十分な検出はできず、低コピーでの分離はできなかった。
試験例１０．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＬ４５２Ｒ検出プライマーの評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｌ４５２Ｒの変異が検出できるプライマーを評価した。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号４４、４５に記載のＦｗｄプライマーいずれかを１．２μＬ、１０μＭの配列番号４６、４７に記載のＲｅｖプライマーいずれかを１．２μＬ、１０μＭの配列番号３３に記載の変異株検出ＨＥＸ―ＴＡＭＲＡ標識プローブを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｌ４５２Ｒの変異が検出できるプライマーを評価した。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号４４、４５に記載のＦｗｄプライマーいずれかを１．２μＬ、１０μＭの配列番号４６、４７に記載のＲｅｖプライマーいずれかを１．２μＬ、１０μＭの配列番号３３に記載の変異株検出ＨＥＸ―ＴＡＭＲＡ標識プローブを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（２５００、６２５、１５６、３９、１０、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表１０に示す。Ｎ／Ａは増幅しなかったことを示す。野生株はシグナルが得られず、変異株はＨＥＸのシグナルが得られればよい。すべての組み合わせでは変異株、野生株をうまく分離できていた。
試験例１１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＬ４５２、Ｌ４５２Ｒ検出のプローブの組み合わせ評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｌ４５２の野生株を検出するプローブとＬ４５２Ｒの変異が検出できるプローブの組み合わせを評価した。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号４５に記載のＦｗｄプライマーを１．２μＬ、１０μＭの配列番号４６に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３４及び３６，３７に記載の変異株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブ、１０μＭの配列番号４０に記載の野株検出ＦＡＭ―ＢＨＱ１標識プローブそれぞれを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（１０４、５０、２５、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｌ４５２の野生株を検出するプローブとＬ４５２Ｒの変異が検出できるプローブの組み合わせを評価した。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号４５に記載のＦｗｄプライマーを１．２μＬ、１０μＭの配列番号４６に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３４及び３６，３７に記載の変異株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブ、１０μＭの配列番号４０に記載の野株検出ＦＡＭ―ＢＨＱ１標識プローブそれぞれを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（１０４、５０、２５、０コピー／μＬそれぞれ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表１１に示す。Ｎ／Ａは増幅しなかったことを示す。野生株はＦＡＭのシグナルが、変異株はＣｙ５のシグナルが得られればよい。すべての組み合わせ（配列番号３４と４０、３６と４０、３７と４０）で変異株、野生株をうまく分離できていた。
また、唾液の代わりに鼻咽頭拭い液、鼻腔拭い液、糞便懸濁液を用いても同様の結果を示した。
試験例１２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＬ４５２、Ｌ４５２Ｒ、Ｌ４５２Ｑ検出のプローブの組み合わせ評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｌ４５２の野生株を検出するプローブ、Ｌ４５２Ｒ変異株を検出するプローブ、及びＬ４５２Ｑ変異株を検出できるプローブの組み合わせを評価した。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号４５に記載のＦｗｄプライマーを１．２μＬ、１０μＭの配列番号４６に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３７に記載のＬ４５２Ｒ変異株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブを０．３μＬ、１０μＭの配列番号４８～５０に記載のＬ４５２Ｑ変異株検出ＲＯＸ－ＢＨＱ２標識プローブを０．３μＬ、及び１０μＭの配列番号４０に記載の野生株検出ＦＡＭ－ＢＨＱ１標識プローブを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ（Ｌ４５２Ｒ変異株のＲＮＡ若しくはＬ４５２Ｑ変異株のＲＮＡ）又は野生株ＲＮＡ１μＬ（それぞれ１０４、５０、２５、０コピー／μＬ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ－ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、Ｌ４５２の野生株を検出するプローブ、Ｌ４５２Ｒ変異株を検出するプローブ、及びＬ４５２Ｑ変異株を検出できるプローブの組み合わせを評価した。上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μＬ及び酵素液５μＬ、１０μＭの配列番号４５に記載のＦｗｄプライマーを１．２μＬ、１０μＭの配列番号４６に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３７に記載のＬ４５２Ｒ変異株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブを０．３μＬ、１０μＭの配列番号４８～５０に記載のＬ４５２Ｑ変異株検出ＲＯＸ－ＢＨＱ２標識プローブを０．３μＬ、及び１０μＭの配列番号４０に記載の野生株検出ＦＡＭ－ＢＨＱ１標識プローブを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこに変異株ＲＮＡ（Ｌ４５２Ｒ変異株のＲＮＡ若しくはＬ４５２Ｑ変異株のＲＮＡ）又は野生株ＲＮＡ１μＬ（それぞれ１０４、５０、２５、０コピー／μＬ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ－ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表１２に示す。Ｎ／Ａは増幅しなかったことを示す。野生株はＦＡＭのシグナルが、Ｌ４５２Ｒ変異株はＣｙ５のシグナルが、Ｌ４５２Ｑ変異株はＲＯＸのシグナルが得られればよい。特に配列番号４９、５０を用いた組み合わせにおいて、野生株のときはＦＡＭのみ、Ｌ４５２Ｒ変異株のときはＣｙ５のみ、Ｌ４５２Ｑ変異株のときはＲＯＸのみが見られ、野生株と変異株をうまく分離できていることが分かる。配列番号４８を用いた組み合わせでは、Ｌ４５２Ｑ変異株を高濃度含有する場合に野生株検出プローブにも多少反応している結果となったが、Ｃｔを比較すると野生株検出プローブの方がＣｔ値が大きく、Ｌ４５２Ｑ変異株検出プローブの方が効率的に反応している結果となった。
また、唾液の代わりに鼻咽頭拭い液、鼻腔拭い液、糞便懸濁液を用いても同様の結果を示した。
更に、配列番号５０で示される塩基配列と二塩基異なる配列番号５１のプローブ（配列番号５０で示される塩基配列から３’末端が二塩基短い塩基配列からなるプローブ）を別途設計し、上記と同様の手順で、標的核酸として１０４コピー／μＬの変異株ＲＮＡ（Ｌ４５２Ｒ変異株のＲＮＡ又はＬ４５２Ｑ変異株のＲＮＡ）又は野生株ＲＮＡ１μＬを用いて、Ｌ４５２の野生株を検出するプローブ（配列番号３７）、Ｌ４５２Ｒ変異株を検出するプローブ（配列番号４０）、及びＬ４５２Ｑ変異株を検出できるプローブ（配列番号５１）の組み合わせを評価した。その結果、高濃度の標的核酸を含む試験において、これらのプローブの組み合わせ（配列番号３７－４０－５１）でも、野生型と変異株（Ｌ４５２Ｒ変異株又はＬ４５２Ｑ変異株）をうまく分離して検出できることが確認された。
本発明は、臨床検査、感染症拡大防止などを目的とした検査の他、分子生物学研究等においても好適に利用できる。
Claims (32)
- 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１Ｙ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、配列番号２～６のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＮ５０１Ｙ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。 - 前記工程（１）において、配列番号７に記載の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に混合する、請求項１に記載の方法。
- 前記工程（１）において、配列番号１で示される塩基配列において２３０６３番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に混合する、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
- 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１Ｙ変異を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）配列番号２～６のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＮ５０１Ｙ変異検出蛍光プローブを含む；及び
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。 - 前記検出キットが、配列番号７に記載の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に含む、請求項５に記載の検出キット。
- 前記検出キットが、配列番号１で示される塩基配列において２３０６３番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に含む、請求項５又は６に記載の検出キット。
- 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項５～７のいずれかに記載の検出キット。
- 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ４８４Ｋ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、配列番号１３～１８のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＥ４８４Ｋ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。 - 前記工程（１）において、配列番号１９～２５のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に混合する、請求項９に記載の方法。
- 前記工程（１）において、配列番号１で示される塩基配列において２３０１２番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に混合する、請求項９又は１０に記載の方法。
- 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項９～１１のいずれかに記載の方法。
- 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ４８４Ｋ変異を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）配列番号１３～１８のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＥ４８４Ｋ変異検出蛍光プローブを含む；及び
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。 - 前記検出キットが、配列番号１９～２５のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に含む、請求項１３に記載の検出キット。
- 前記検出キットが、配列番号１で示される塩基配列において２３０１２番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に含む、請求項１３又は１４に記載の検出キット。
- 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１３～１５のいずれかに記載の検出キット。
- 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５２Ｒ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、配列番号３３～３９のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＬ４５２Ｒ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。 - 前記工程（１）において、配列番号４０～４３のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に混合する、請求項１７に記載の方法。
- 前記工程（１）において、配列番号１で示される塩基配列において２２９１７番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に混合する、請求項１７又は１８に記載の方法。
- 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１７～１９のいずれかに記載の方法。
- 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５２Ｒ変異を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）配列番号３３～３９のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＬ４５２Ｒ変異検出蛍光プローブを含む；及び
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。 - 前記検出キットが、配列番号４０～４３、若しくは４８～５１のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に含む、請求項２１に記載の検出キット。
- 前記検出キットが、配列番号１で示される塩基配列において２２９１７番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に含む、
請求項２１又は２２に記載の検出キット。 - 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項２１～２３のいずれかに記載の検出キット。
- 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５２Ｑ変異を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、配列番号４８～５１のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＬ４５２Ｑ変異検出蛍光プローブと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。 - 前記工程（１）において、配列番号３３～４３のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に混合する、請求項２５に記載の方法。
- 前記工程（１）において、配列番号１で示される塩基配列において２２９１７番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に混合する、請求項２５又は２６に記載の方法。
- 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項２５～２７のいずれかに記載の方法。
- 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５２Ｑ変異を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）配列番号４８～５１のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるＬ４５２Ｑ変異検出蛍光プローブを含む；及び
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。 - 前記検出キットが、配列番号３３～４３のいずれかに記載の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる蛍光プローブを更に含む、請求項２９に記載の検出キット。
- 前記検出キットが、配列番号１で示される塩基配列において２２９１７番目の塩基を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるように設計されたプライマーセットを更に含む、請求項２９又は３０に記載の検出キット。
- 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項２９～３１のいずれかに記載の検出キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021133600 | 2021-08-18 | ||
| JP2021133600 | 2021-08-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023029191A true JP2023029191A (ja) | 2023-03-03 |
Family
ID=85331842
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022015948A Pending JP2023029191A (ja) | 2021-08-18 | 2022-02-03 | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株検出用オリゴヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2023029191A (ja) |
-
2022
- 2022-02-03 JP JP2022015948A patent/JP2023029191A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2017212904A1 (ja) | 複数のプライマーセットを組み合わせたｌａｍｐ法を用いたアフリカ豚コレラウイルスの迅速検出法 | |
| CA2597383C (en) | Method of detection of classical swine fever | |
| US7595163B2 (en) | Method for detecting SARS coronavirus | |
| US9315860B2 (en) | Conjugates of nucleotides and method for the application thereof | |
| WO2018042598A1 (ja) | ジカウイルス検出用プライマーセット | |
| US20170275711A1 (en) | Broad detection of dengue virus serotypes | |
| WO2022050141A1 (ja) | マルチプレックスｐｃｒによる呼吸器感染症の検査方法 | |
| JP2017136086A (ja) | 標的核酸の検出方法及びキット | |
| US20120045747A1 (en) | Kit for detecting hepatitis b virus and method for detecting hepatitis b virus using the same | |
| KR102030244B1 (ko) | 뎅기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
| JP6467829B2 (ja) | 改良されたｒｔ−ｐｃｒ反応 | |
| TW202219272A (zh) | SARS-CoV-2之偵測 | |
| JP2016019495A (ja) | 核酸増幅法 | |
| EP3438280B1 (en) | Haemoplasma detection method | |
| KR102030245B1 (ko) | 치쿤군야 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
| WO2022024935A1 (ja) | 非特異的な核酸増幅を抑制する方法 | |
| US20050244813A1 (en) | Detection of human papillomavirus e6 mrna | |
| JP2023029191A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株検出用オリゴヌクレオチド | |
| JP5315519B2 (ja) | コイヘルペスウイルス（ｋｈｖ）の検出方法 | |
| JP2023113514A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出するオリゴヌクレオチド | |
| JP2023113515A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出するオリゴヌクレオチド | |
| KR20140024411A (ko) | 토크 테노 바이러스 진단 | |
| KR102238561B1 (ko) | 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트 | |
| JP2022021905A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用オリゴヌクレオチド及びその用途 | |
| WO2022210122A1 (ja) | マルチプレックスｐｃｒにより複数種類のウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドのセット |