JP2023113515A - SARS-CoV-2のオミクロン株を検出するオリゴヌクレオチド - Google Patents
SARS-CoV-2のオミクロン株を検出するオリゴヌクレオチド Download PDFInfo
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Abstract
【課題】夾雑物を含みうる試料から事前に核酸の単離精製作業を実施することなくSARS-CoV-2オミクロン株を検出する方法を提供する。【解決手段】以下の工程を包含する方法:(1)核酸の単離処理を行っていない試料と、(a)ある特定5種の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び(b)前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含むプライマーセットと、(c)前記ある特定5種とは異なる、ある特定7種の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つ蛍光プローブと、RT-PCR反応液とを混合する工程;及び(2)前記混合液を用いてRT-PCR反応を実施する工程。【選択図】なし
Description
本発明は、核酸増幅によりSARS-CoV-2のオミクロン株を検出できるオリゴヌクレオチド、並びにこれを利用した検出方法及び検出キット等に関する。本発明により、例えば、咽頭および鼻腔ぬぐい液、喀痰、唾液等の生体試料から核酸精製せずにSARS-CoV-2のオミクロン株を高感度で検出することが可能である。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。代表的な核酸増幅法は、PCR(Polymerase Chain Reaction)である。PCRは、(1)熱処理によるDNA変性(2本鎖DNAから1本鎖DNAへの解離)、(2)鋳型1本鎖DNAへのプライマーのアニーリング、(3)DNAポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という3ステップを1サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、2ステップで行う場合もある。
RNAを分析する場合、このPCRの前段として、鋳型RNAをcDNAに変換する逆転写(Reverse Transcription;RT)を実施する。これをRT-PCRという。このRT-PCRは、(1)RT、PCRを非連続に実施する2ステップRT-PCR、(2)RT、PCRを、単一酵素を利用して連続して実施する一酵素系1ステップRT-PCR、(3)逆転写酵素とDNAポリメラーゼの2種類の酵素を利用して、RT、PCRを連続的に実施する二酵素系1ステップRT-PCRの3つに大別される。
PCRおよびRT-PCRは、遺伝子検査やウイルス検査にも広く用いられている。このような検査の対象となるRNAウイルスの代表例としては、コロナウイルスやインフルエンザウイルスなどの病原性RNAウイルスが挙げられる。
コロナウイルスは、風邪を含む呼吸器感染症引き起こす原因ウイルスであり、風邪の流行期において約10~35%程度はコロナウイルスが原因と言われている。変異型ウイルスが発生することも知られており、稀にSARS(重症急性呼吸器症候群)コロナウイルスやMERS(中東呼吸器症候群)コロナウイルス、新型コロナウイルス感染症(COVID-19)コロナウイルス(SARS-nCOV-2、又はSARS-CoV-2などと呼ばれる)など致死性の重篤な呼吸器疾患を齎すものが発生することが知られている。
コロナウイルスは、風邪を含む呼吸器感染症引き起こす原因ウイルスであり、風邪の流行期において約10~35%程度はコロナウイルスが原因と言われている。変異型ウイルスが発生することも知られており、稀にSARS(重症急性呼吸器症候群)コロナウイルスやMERS(中東呼吸器症候群)コロナウイルス、新型コロナウイルス感染症(COVID-19)コロナウイルス(SARS-nCOV-2、又はSARS-CoV-2などと呼ばれる)など致死性の重篤な呼吸器疾患を齎すものが発生することが知られている。
このSAR-CoV-2は、2019年に中国武漢で発生して以来、世界各国で感染が広がり、パンデミックとなっている。感染が続く中で、より感染性が高い変異株や重症化しやすい変異株も発生している。感染拡大防止の観点や診断用途において、このように感染・伝播性の増加や抗原性の変化が懸念される変異株(VOC;Variant of Concern)を簡便、迅速、高感度に検出および特定することが重要であることは言うまでもない。VOCに関連するSARS-CoV-2変異株としてはこれまでにアルファ株、ベータ株、ガンマ株、デルタ株など様々な変異株が発見されており、感染力の非常に強いオミクロン株が現在大きな問題となっている。従って、感染拡大防止の観点から、オミクロン株を早期に簡便、迅速、高感度に特定することが求められている。
ウイルスの変異の特定方法としては、一般的なSNP解析方法が通常用いられる。例えば変異を含む領域を挟むように増幅できるPCRプライマーと、異なる蛍光で標識された野生株と変異株それぞれに相補的なTaqManプローブを用い、これらのプライマーとTaqManプローブとウイルスRNAとを混合し、RT-PCRを行うことで、野生株、変異株を区別することができる。その他にも、変異株のみを増幅できるようなプライマーを設計し、増幅の有無で変異株の特定を行う手法(ASP)、増幅産物に蛍光プローブを反応させ融解曲線解析で変異の有無を判定する手法、SYBRなどのインタカーレター色素を用い、増幅産物の融解曲線解析で変異の有無を判定する手法など、様々な手法が知られている(非特許文献1)。これらの方法は組み合わせることも可能であり、複数の箇所の変異を同時に検出するマルチプレックスの手法も開発されている。
しかしながら、TaqManプローブとRT-PCR反応を用いて変異株を特定する場合、野生株と変異株で異なるシグナルを得る必要があり、反応条件の最適化が非常に重要となる。すなわち、上記のように野生株と変異株で異なるTaqManプローブを用いて特定する場合は、わずか1塩基又は数塩基の違いで蛍光シグナルを変化させる必要があり、プローブの長さや配列の選定等の条件設定が重要となる。また同様に、変異株のみを増幅できるようなプライマーを用いる場合も、わずか1塩基又は数塩基しか違わない野生型では増幅しないようにプライマーの長さや配列等を調整する必要があり容易でない。
また、呼吸器感染症の遺伝子検査では、咽頭および鼻腔ぬぐい液、喀痰、唾液等の生体試料をサンプルとしRT-PCRによる遺伝子検査が行われる。生体試料は、RT-PCR反応を阻害する夾雑物や、非特異的な増幅を引き起こすウイルス由来以外の核酸を多く含んでいる。従って、核酸の単離処理をせずに、このような生体試料を夾雑物を含む状態でそのまま用いてRT-PCR反応を行う場合、反応が阻害されて増幅不良で検出不能となったり、反応系が複雑となることで非特異反応が生じ、検出感度が低下することなどが懸念される。このような検出感度の低下は、わずか1塩基の違いで蛍光シグナルを変化させて野生株と変異株を判定する必要があるような場合に、それらの識別を困難にするので特に問題となり得る。
現在、感染拡大防止の観点から、迅速かつ簡便にSARS-CoV-2のオミクロン株を判定する方法が強く求められている。特に咽頭および鼻腔ぬぐい液や唾液、糞便試料、ふき取り環境試料等より、核酸の単離処理を行わずにそのままRT-PCR反応を行い判定できる有用な方法の開発が望まれていた。
YAKUGAKU ZASSHI 122(7) 451―463(2002)
本発明は上記従来技術に鑑みてなされたものであり、SARS-CoV-2のオミクロン株を簡便且つ高感度に特定・検出できる方法を提供することを目的とする。また本発明は、検査をより迅速・簡便化するため、核酸の単離処理をせずに、例えば、唾液、咽頭および鼻腔ぬぐい液等の生体試料に由来する夾雑物を含む状態の試料から、SARS-CoV-2のオミクロン株を特定・検出できる方法を提供することを更なる目的とする。
本発明者は、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、数多の候補配列の中から特定配列を含むプライマー及びプローブを組み合わせて用いることで、オミクロン株を高感度に野生株から区別して特定・検出できることを見出した。また、このプライマー及びプローブと共に、SARS-CoV-2の野生株を増幅し得るプライマーを含むプライマーセットで核酸増幅を行い、更に野生株由来の増幅産物を検出し得る蛍光プローブを組み合わせて用いることにより、夾雑物を含みうる唾液等の生体試料から事前に核酸の単離精製作業を実施することなくRT-PCR反応を行う場合であっても、SARS-CoV-2のオミクロン株を野生株と区別して特定・検出が可能であることを見出し、本発明に到達した。
代表的な本願発明は、以下の通りである。
[項1] 核酸の単離処理をせずにSARS-CoV-2のオミクロン株を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法:
(1)核酸の単離処理を行っていない試料と、(a)配列番号14~18のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び(b)前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含むプライマーセットと、(c)配列番号2~8のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つ蛍光プローブと、RT-PCR反応液とを混合する工程;及び
(2)前記混合液を用いてRT-PCR反応を実施する工程。
[項2] 前記(b)プライマーが、配列番号11に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーである、項1に記載の方法。
[項3] 前記プライマーセットが、配列番号12に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーを更に含む、項1又は2に記載の方法。
[項4] 前記工程(1)において、(c)配列番号9若しくは10に記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に混合する、項1~3のいずれかに記載の方法。
[項5] SARS-CoV-2のオミクロン株を、SARS-CoV-2の野生株、ガンマ株、又はベータ株と判別して検出する、項3又は4に記載の方法。
[項6] 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項1~5のいずれかに記載の方法。
[項7] 核酸の単離処理をせずにSARS-CoV-2のオミクロン株を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット:
(1)(a)配列番号14~18のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び(b)前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含む:
(2)(c)配列番号2~8のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つの蛍光プローブを含む;並びに
(3)核酸の単離処理を行っていない試料からRT-PCR反応が可能な反応試薬を含む。
[項8] 前記(b)プライマーが、配列番号11に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーである、項7に記載のキット。
[項9] 配列番号12に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーを更に含む、項7又は8に記載のキット。
[項10] 配列番号9若しくは10に記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に含む、項7~9のいずれかに記載のキット。
[項11] SARS-CoV-2のオミクロン株を、SARS-CoV-2の野生株、ガンマ株、又はベータ株と判別して検出するために用いられる、項9又は10に記載のキット。
[項12] 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項7~11のいずれかに記載のキット。
[項1] 核酸の単離処理をせずにSARS-CoV-2のオミクロン株を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法:
(1)核酸の単離処理を行っていない試料と、(a)配列番号14~18のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び(b)前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含むプライマーセットと、(c)配列番号2~8のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つ蛍光プローブと、RT-PCR反応液とを混合する工程;及び
(2)前記混合液を用いてRT-PCR反応を実施する工程。
[項2] 前記(b)プライマーが、配列番号11に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーである、項1に記載の方法。
[項3] 前記プライマーセットが、配列番号12に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーを更に含む、項1又は2に記載の方法。
[項4] 前記工程(1)において、(c)配列番号9若しくは10に記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に混合する、項1~3のいずれかに記載の方法。
[項5] SARS-CoV-2のオミクロン株を、SARS-CoV-2の野生株、ガンマ株、又はベータ株と判別して検出する、項3又は4に記載の方法。
[項6] 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項1~5のいずれかに記載の方法。
[項7] 核酸の単離処理をせずにSARS-CoV-2のオミクロン株を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット:
(1)(a)配列番号14~18のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び(b)前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含む:
(2)(c)配列番号2~8のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つの蛍光プローブを含む;並びに
(3)核酸の単離処理を行っていない試料からRT-PCR反応が可能な反応試薬を含む。
[項8] 前記(b)プライマーが、配列番号11に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーである、項7に記載のキット。
[項9] 配列番号12に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーを更に含む、項7又は8に記載のキット。
[項10] 配列番号9若しくは10に記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に含む、項7~9のいずれかに記載のキット。
[項11] SARS-CoV-2のオミクロン株を、SARS-CoV-2の野生株、ガンマ株、又はベータ株と判別して検出するために用いられる、項9又は10に記載のキット。
[項12] 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項7~11のいずれかに記載のキット。
本発明によって、SARS-CoV-2のオミクロン株を迅速・簡便に特定・検出することができる。とりわけ、本発明によれば、唾液等の生体試料を特定配列のプライマーを含むプライマーセット及び特定配列の蛍光プローブと共にRT-PCR反応液に添加後、RT-PCR反応を実施するだけで、SARS-CoV-2のオミクロン株の検出ができるため、事前に生体試料から核酸単離処理を行う必要がなく、よって、核酸の単離処理時のコンタミネーションリスクの減少や検査時間の短縮に貢献できる。このような検査業務の効率化は、患者に対して正確な治療を行えるまでの時間が短縮できるとともに、感染防止の迅速な対応につながり感染症予防にも大いに寄与し得る。
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本発明は、核酸の単離処理をせずにSARS-CoV-2のオミクロン株を検出する方法、および該方法を実施するためのキット等に関する。オミクロン株は、これまでに知られているSARS-CoV-2の他の変異株と異なり、野生型のSARS-CoV-2のゲノム配列(配列番号1)において非常に多数の変異を含むことが知られている。SARS-CoV-2のオミクロン株における変異は、特にスパイクタンパク質(Sタンパク質ともいう)をコードする塩基配列に多数含まれることが知られており、例えば、G142D、G339D、S371L、S373P、S375F、S477N、T478K、E484A、Q493K、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、P681Hをコードする塩基配列において変異を有することが分かっている。SARS-CoV-2等のウイルスは変異しやすく、オミクロン株も今後変異を繰り返していくと推定される。本明細書において、SARS-CoV-2のオミクロン株とは、Aine O’Toole等の文献(Virus Evolution,2021,7(2),1-9(参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる))に記載のPangolin tool(Pangolin:Phylogenetic Assignment of Named Global Outbreak Lineages)を使用し、B.1.1.529に分類されるSARS-CoV-2の変異株(例えば、BA.2株等を含む)を指し、また、現在判明しているオミクロン株(B.1.1.529系統)と同等の塩基配列(例えば、当該オミクロン株のSタンパク質をコードする領域において99%以上の同一性を有する塩基配列)を有するオミクロン株の派生株を含む。このようなオミクロン株の派生株としては、例えば、E484Aをコードする塩基配列をゲノムRNAに含むSARS-CoV-2であり得るが、これらに限定されない。本発明のSARS-CoV-2のオミクロン株を検出する方法は、SARS-CoV-2のE484A変異を検出する方法ともいうことができる。本明細書では、特に一方のみを言及していることが明らかでない限り、SARS-CoV-2のオミクロン株と、E484A変異を有するSARS-CoV-2とは互換可能に使用される。
本発明では、SARS-CoV-2のオミクロン株を検出するために、SARS-CoV-2のSタンパクにおけるE484位の周辺領域、具体的には、配列番号1において23029~23054番目に示される塩基配列に対応する領域を標的として設計したプライマーと、配列番号1において23001~23025番目に示される塩基配列に対応する領域を標的として設計した蛍光プローブとを組み合わせて用いることで、SARS-CoV-2のオミクロン株を特異的に検出することを一つの特徴としている。この本発明で用いるプライマーは、配列番号1で示される野生型SARS-CoV-2の塩基配列において、23048番目の塩基のCがTに、23040番目の塩基のTがCに置換されている塩基配列に基づき設計される。また、本発明で用いる蛍光プローブでは、配列番号1で示される野生型SARS-CoV-2の塩基配列において、23013番目の塩基のAがCに置換されている。本発明では、このようなプライマーとプローブとを組み合わせて用いてRT-PCR反応を行うことで、上記のようなSARS-CoV-2のオミクロン株を、野生株と区別して検出することができる。
一つの実施形態において、本発明は、核酸の単離処理をせずに、SARS-CoV-2のオミクロン株(E484A変異を有するSARS-CoV-2)を検出する方法であって、少なくとも以下の(1)及び(2)の工程を含む方法を提供する:
(1)核酸の単離処理を行っていない試料と、(a)配列番号14~18のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び(b)前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含むプライマーセットと、(c)配列番号2~8のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つの蛍光プローブと、RT-PCR反応液とを混合する工程;並びに
(2)前記混合液を用いてRT-PCR反応を実施する工程。
本発明は、前記工程(1)において、特定の塩基配列から構成されるプライマー及びプローブを組み合わせて用いることにより、SARS-CoV-2のオミクロン株を高度に識別して検出でき、また例えば、唾液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液等の夾雑物質を含む生体試料をそのまま用いる場合であっても、これらの生体試料中に含まれ得るSARS-CoV-2オミクロン株を高感度に検出できることを見出したことに基づく。
(1)核酸の単離処理を行っていない試料と、(a)配列番号14~18のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び(b)前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含むプライマーセットと、(c)配列番号2~8のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つの蛍光プローブと、RT-PCR反応液とを混合する工程;並びに
(2)前記混合液を用いてRT-PCR反応を実施する工程。
本発明は、前記工程(1)において、特定の塩基配列から構成されるプライマー及びプローブを組み合わせて用いることにより、SARS-CoV-2のオミクロン株を高度に識別して検出でき、また例えば、唾液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液等の夾雑物質を含む生体試料をそのまま用いる場合であっても、これらの生体試料中に含まれ得るSARS-CoV-2オミクロン株を高感度に検出できることを見出したことに基づく。
上記の実施態様において、本発明の方法は、核酸の単離処理を行っていない試料を使用することを一つの特徴とする。例えば、本発明は、各種試料から市販の核酸精製キットで核酸を単離したり、あるいはウイルスのゲノム核酸をキャプシド構造などから露出させるための事前の熱処理等をしていない未処理試料を用いることができる。手間のかかる精製等の前処理が不要となるため簡便であるという観点から、これらの未処理試料を用いることが好ましい。また、夾雑物質を除去するような分離精製を伴わない核酸抽出を行った試料であってもよい。ここで、分離精製を伴わない核酸抽出を行った試料とは、試料中で核酸を露出させた状態にすることを意味し、例えば、試料中で細胞膜やカプシド、エンベロープ等を破壊し、これらに内包されていた核酸を抽出して露出させること(但し、破壊後に残存する細胞膜やカプシド、エンベロープの断片等は除去しないこと)をいう。本発明では、このような単離精製の手間を省いて用意した試料であっても良好に核酸増幅でき、安定してSARS-CoV-2のオミクロン株を検出ことが可能である。このような分離精製を伴わない核酸抽出処理は、前記工程(1)に先立って行うことができる。
本発明において用いられる試料は、核酸の単離処理を行っていないものであれば特に限定されない。本発明に用いる試料が、唾液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液等の夾雑物質および不溶性物質を含みうる試料である場合、当該試料は事前に水または緩衝液等にて懸濁した懸濁液であってよく、唾液試料等であればそのまま使用してもよく、糞便試料等の固形試料をPCR反応液に直接添加してもよい。例えば咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻咽頭ぬぐい液、喀痰、嘔吐物、唾液、うがい液、涙液、糞便(排泄便、直腸便)などが挙げられるが、特に限定されるものではなく、生体に由来するもの全般に用いることが可能である。特には、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻咽頭ぬぐい液、喀痰、肺吸引物、脳脊髄液、うがい液、唾液、涙液、糞便、培養細胞、培養上清からの検出に有用であり、なかでも唾液試料、喀痰試料、うがい液、涙液、咽頭ぬぐい液試料、鼻咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液試料、糞便試料の検出に有用である。本発明によれば、これら試料から市販のRNA精製キット等を用いてRNAを単離してRT-PCR反応に供する必要がないという利点がある。前記試料は直接検出に供してもよいし、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料であってもよい。前記緩衝液としては、特に限定されるものではないが、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、HEPES緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。また、粘性の強い生体試料(例えば、粘性の強い喀痰を含む試料)の場合は、特に限定されないが、スプタザイム酵素液で処理した試料であってもよい。
更に、本発明において用いられる試料は、キャプシドや細胞壁などの堅牢な構造からRNAまたはDNAを抽出しやすくするために、前記試料を緩衝液や、酸またはアルカリ性溶液、有機溶媒などを含む溶液と混合した試料であってもよい。前記溶液に含まれるものとして、酸性溶液としては、酸性の溶液であれば特に限定されない。酸性溶液としては、例えば、ギ酸水溶液、酢酸水溶液、酪酸水溶液、塩酸水溶液、硝酸水溶液、硫酸水溶液、クエン酸水溶液、乳酸水溶液、リン酸水溶液、安息香酸水溶液、シュウ酸水溶液、酒石酸水溶液、アスコルビン酸水溶液、スルホン酸水溶液などが挙げられ、1種単独又は2種以上組み合わせて使用できる。アルカリ性溶液においても、アルカリ性の溶液であれば特に限定されない。アルカリ性溶液としては、例えば水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、水酸化バリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸マグネシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液(TAPSO,POPSO、HEPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPS)などが挙げられ、1種単独又は2種以上組み合わせて使用できる。有機溶媒として、具体的にはエタノール、メタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、2-ブタノール、トリエチルアミン、ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルホスホリックトリアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、ピリジン等が挙げられるがこれに限られるものではない。さらには、本発明に用いられる試料は、前記溶液と混合後熱処理に供されたものであっても良い。熱処理の条件は、特に限定されないが、60℃以上、好ましくは70℃以上、より好ましくは80℃以上、更により好ましくは90℃以上で、1秒以上処理されたものであってよい。
本発明のSARS-CoV-2のオミクロン株を検出する方法は、オミクロン株のスパイクタンパク質をコードするゲノムRNA領域の一部(スパイクタンパク質のアミノ酸配列におけるE484位の変異箇所を含む一部)を増幅するために特定配列のプライマーを含むプライマーセットを用いることを一つの特徴とする。本発明において使用するプライマーセットは、(a)配列番号14~18のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマーと、(b)前記(a)プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含み、RT-PCR反応においてE484位をコードする領域を含む核酸を増幅し得るように設計されたプライマーセットであれば特に限定されない。好ましい一つの実施形態では、本発明に使用するプライマーセットは、50~500bp程度を増幅し得るように設計されたプライマーセットであり、50~300bp程度を増幅し得るように設計されたプライマーセットであることがより好ましく、50~150bp程度を増幅し得るように設計されたプライマーセットであることが更に好ましい。なお、本明細書において、特定の配列番号で示される塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーとは、前記塩基配列の5’末端及び/又は3’末端に1又は数個(例えば1~3個、好ましくは1~2個、より好ましくは1個)の塩基が付加されたものであってもよい。このような塩基の付加は標的配列に応じて当業者により適宜設計され得る。また、本発明に用いるプライマーセットは、(a)プライマー及び(b)プライマーを各々一つずつ含むものであってもよいし、(a)プライマーを二つ以上及び/又は(b)プライマーを二つ以上含んでいてもよい。例えば、(a)プライマーとして、配列番号14~17のいずれかに記載の塩基配列又はこれらに相補的な塩基配列を含むプライマーと、配列番号18に記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を含むプライマーとを含むものを好適な一例として挙げることができる。
本発明に用いる前記プライマーセットにおいて、(a)配列番号14~18のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマーは、フォワードプライマー(Fwdプライマーとも略記する)であってもよく、リバースプライマー(Revプライマーとも略記する)であってもよい。好ましくは、前記(a)プライマーはリバースプライマーであって、前記(b)プライマーはフォワードプライマーとして設計されるプライマーである。好ましくは、フォワードプライマーとして設計される前記(b)プライマーは、配列番号11に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーである。なかでも、前記(a)プライマーとして配列番号14~16のいずれかに記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマー及び(b)プライマーとして配列番号11に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーとを含むプライマーセットであることが好ましく、前記(a)プライマーとして配列番号14~16のいずれかに記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプライマー及び(b)プライマーとして配列番号11に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセットであることがより好ましく、前記(a)プライマーとして配列番号14~16に記載の塩基配列からなるプライマー及び(b)プライマーとして配列番号11に記載の塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセットであることが更に好ましい。このようなプライマーセットを用いてRT-PCR反応を行うことで、核酸の単離処理を行っていない試料を用いて夾雑物を含み得る反応液でRT-PCR反応を行う場合であっても、高感度にオミクロン株を増幅し検出することができる。
本発明に用いる上記プライマーセットは、前記(a)プライマー及び前記(b)プライマー以外のプライマーを含むものであってもよい。このようなプライマーとしては、例えば、SARS-CoV-2の野生株又はガンマ株若しくはベータ株等の他のSARS-CoV-2変異株のゲノムRNAを増幅し得るように設計されたプライマーであり得るが、好ましくは野生株のゲノムRNAを増幅し得るように設計されたプライマーである。前記(a)プライマー及び前記(b)プライマーに加えて、このようなプライマーも組み合わせて含むプライマーセットを用いることで、SARS-CoV-2のオミクロン株だけでなく、野生株等を同時検出することも可能となり、生体試料中に含まれるSARS-CoV-2が、オミクロン株とそれ以外の株のいずれであるか(例えば、オミクロン株と野生株のいずれであるか等)を識別できるという利点がある。このような更なるプライマーとしては、好ましくは、前記(b)プライマーと一緒になってSARS-CoV-2のオミクロン株以外の株のゲノムRNAを増幅し得るプライマーであり、より好ましくは、前記(b)プライマーと一緒になってSARS-CoV-2の野生株のゲノムRNAを増幅し得るプライマーであり、更に好ましくは、配列番号12に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーであり、更により好ましくは配列番号12に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプライマーであり、特に好ましくは配列番号12に記載の塩基配列からなるプライマーである。このようなプライマーを組み合わせて用いることで、SARS-CoV-2のオミクロン株と野生株とを、同じRT-PCR反応液を用いて区別して良好に判別できることが後述の試験例の結果に示されている。
本発明では、前記プライマーセットで増幅した核酸増幅産物にハイブリダイズし得るように設計された特定の塩基配列を含む蛍光標識核酸プローブ(以下,(c)プローブともいう)を用いて、SARS-CoV-2のオミクロン株を検出することを更なる一つの特徴とする。このような蛍光標識プローブとしては、目的の核酸増幅産物があるときに強いシグナルを発生するプローブであれば特に限定されないが、例えば、TaqManプローブ(米国特許第5,210,015号公報、米国特許第5,538,848号公報、米国特許第5,487,972号公報、米国特許第5,804,375号公報)、モレキュラービーコン(米国特許第5,118,801号公報)、FRETハイブリダイゼーションプローブ(国際公開第97/46707号パンフレット,国際公開第97/46712号パンフレット,国際公開第97/46714号パンフレット)などが挙げられる。好ましくは、TaqManプローブである。
プローブに用いられ得る蛍光化合物は、当該分野で公知の任意のものを使用することができ、例えば、使用したいqPCR機器に合わせて選択することができる。蛍光化合物の具体例としては、例えば、ローダミン(ROX)若しくはその誘導体(例えば、5-カルボキシ-X-ローダミン、6-カルボキシ-X-ローダミン、5-カルボキシローダミン6G(CR6G)、テトラメチルローダミン(TAMRA))、又はそれらの塩などのローダミン系化合物;フルオロセイン又はその誘導体(例えば、FAM(カルボキシフルオレセイン)、JOE(6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ2’,7’-ジメトキシフルオレセイン)、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)、TET(テトラクロロフルオレセイン)、HEX(5’-ヘキサクロロ-フルオレセイン-CEホスホロアミダイト))、VIC(登録商標)、BODIPY(登録商標)シリーズ、ローダミン又はその誘導体(例えば、5-カルボキシローダミン6G(CR6G)やテトラメチルローダミン(TAMRA))、Cy(登録商標)色素(例えば、Cy3、Cy5)、若しくはそれらの誘導体、又はそれらの塩等の非ローダミン系化合物等があげられるが、これらに限定されない。蛍光化合物は、必要に応じて、使用する蛍光物質にあった消光物質を使用することができる。上記のような蛍光物質に対応した消光物質としては、例えば、TAMRA(テトラメチル-ローダミン)、DABCYL(4-(4-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸)、BHQ1(BHQ:Black Hole Quencher(登録商標))、BHQ2、BHQ3等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明におけるSARS-CoV-2のオミクロン株を検出する(c)プローブは、E484Aを検出するプローブ(E484A変異検出蛍光プローブともいう)であり得る。このような蛍光プローブとしては、配列番号2~8のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列を含む核酸を蛍光標識したプローブであり、好ましくは配列番号2~8のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであり得る。なかでも、配列番号3~8のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることが好ましく、配列番号6で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸を蛍光標識したプローブであることがより好ましい。なお、本明細書において、特定の配列番号で示される塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプローブとは、前記塩基配列の5’末端及び/又は3’末端に1又は数個(例えば1~3個、好ましくは1~2個、より好ましくは1個)の塩基が付加されたものであってもよい。このような塩基の付加は標的配列に応じて当業者により適宜設計され得る。本発明では、上記のような蛍光プローブを一つ使用してもよいし、二つ以上を組み合わせて使用してもよい。
本発明に用いる上記プライマーセットは、前記(c)プローブ以外の蛍光プローブを含むものであってもよい。このような蛍光プローブとしては、例えば、SARS-CoV-2の野生株、又はガンマ株若しくはベータ株等の他のSARS-CoV-2変異株のゲノムRNAからの核酸増幅産物を検出し得るように設計された蛍光プローブであり得る。前記(c)プローブに加えて、このような蛍光プローブも組み合わせて用いることで、SARS-CoV-2のオミクロン株だけでなく、野生株又はガンマ株若しくはベータ株等の他のSARS-CoV-2変異株を判別しながら同時検出することも可能となるという利点がある。このような更なる蛍光プローブとしては、好ましくは、SARS-CoV-2の野生株のゲノムRNAからの核酸増幅産物を検出し得る蛍光プローブであり、より好ましくは、配列番号9若しくは10に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブであり、さらに好ましくは配列番号9に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる蛍光標識プローブであり、特に好ましくは配列番号9に記載の塩基配列からなる蛍光プローブである。このような蛍光プローブを組み合わせて用いることで、SARS-CoV-2のオミクロン株と野生株とを、同じRT-PCR反応液を用いて区別して良好に判別できる。
本発明のSARS-CoV-2のオミクロン株を検出する方法では、核酸の単離処理を行っておらず夾雑物質が含まれる試料からであっても、夾雑物質の阻害を受けることなくRT-PCR反応が実施され得るRT-PCR反応液(RT-PCR試薬)を用いてRT-PCR反応を実施する。このようなRT-PCT反応液は、例えば、夾雑物質に対して耐性を示すことが公知のDNAポリメラーゼ等を含むものが好ましいが、特に限定されない。
前記RT-PCR反応液に含まれるDNAポリメラーゼとしては、当該分野で公知の任意のDNAポリメラーゼを用いることができる。好ましくは、夾雑物耐性を持つことが当該分野で公知の任意のDNAポリメラーゼを用いることができる。夾雑物耐性とは、RT-PCR阻害物質の存在下においても、核酸増幅反応に十分なDNAポリメラーゼの高い酵素活性を有する性質を指す。夾雑物耐性を持つDNAポリメラーゼとして、特に限定されるものではないが、Tth,Bst,KOD,Pfu,Pwo、Tbr,Tfi,Tfl,Tma,Tne、Vent,DEEP VENT、HawkZ05やこれらの変異体が挙げられるが、特に限定されない。好ましくは、TthおよびHawkZ05又はこれらの変異体の使用である。特に好ましくはTth又はその変異体の使用である。通常夾雑耐性を有しないTaqなどのDNAポリメラーゼにおいても、アミノ酸変異により夾雑耐性を有する変異体である場合は使用することが可能である。前記PCR反応液に含まれる前記夾雑物耐性を有するDNAポリメラーゼの総量は、一例として、少なくとも4.2ng/μL以上あればよく、5.0ng/μL以上であることが好ましく、5.8ng/μL以上であることがより好ましい。なかでも好ましくは、8.3ng/μL以上である。前記夾雑物耐性を有するDNAポリメラーゼの総量の上限は特に限定されないが、一例として、20ng/μL以下とすることができ、16.7ng/μL以下であっても十分に本発明の効果を得ることができる。ポリメラーゼの量は、Bradford法もしくはNanodrop(サーモフィッシャー社)により定量した値であり、安全データシート(SDS)から概算してもよい。BSAなどのタンパク質を含む場合は、後者の方法で算出することが望ましい。非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗DNAポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のDNAポリメラーゼへ導入することで、PCR反応開始までのDNAポリメラーゼの酵素活性を抑制し、ホットスタートRT-PCRへの適用ができることが好ましい。
本発明に用いられるRT-PCR反応液は、DNAポリメラーゼおよび必要に応じて逆転写酵素を含む。前記RT-PCR反応液に含まれる逆転写酵素の由来としては、RNAをDNAに変換できれば特に限定されないが、MMLV(Moloney Murine Leukemia Virus)-RT、AMV-RT(Avian Myeloblastosis Virus)、HIV-RT、RAV2-RT、EIAV-RT、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン(Carboxydothermus hydrogenoformam)DNAポリメラーゼ)やその変異体が例示される。特に好ましい例としては、MMLV-RT、AMV-RT、またはそれらの変異体が挙げられる。
本発明において用いられるRT-PCR反応液は、逆転写酵素活性を併せ持つDNAポリメラーゼを含むものであっても良い。逆転写活性を有するDNAポリメラーゼとは、RNAをcDNAに変換する能力とDNAを増幅する能力を兼ね備えたDNAポリメラーゼである。逆転写活性を有するDNAポリメラーゼは、逆転写活性及び夾雑物耐性に加えて、耐熱性を有することが好ましい。耐熱性とは、70℃で1分以上の熱処理を実施しても、酵素活性が半分以上低下しないことをいう。由来は特に限定されるものではないが、Taq、Tth,Bst,Bca,KOD,Pfu,Pwo、Tbr,Tfi,Tfl,Tma,Tne、Vent,DEEPVENTやこれらの変異体が挙げられる。これまでに逆転写活性を有するDNAポリメラーゼとして、Thermus aquaticus由来のDNAポリメラーゼ(Taq)、Thermus thermophilus HB8由来のDNAポリメラーゼ(Tth)やThermus sp Z05由来のDNAポリメラーゼ(Z05)、Thermotoga maritima由来のDNAポリメラーゼ(Tma)、Bacillus caldotenax由来のDNAポリメラーゼ(Bca)、Bacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼ(Bst)などが挙げられ、これらの逆転写活性と耐熱性DNAポリメラーゼ活性が失われていない変異体であってもよい。また、Thermococcus kodakaraensis由来のDNAポリメラーゼ(KOD)の変異体であって、逆転写活性を有するものが知られており(例えば、RTX:reverse transcription xenopolymerase)、本発明にはこのような逆転写酵素活性を併せ持つ耐熱性DNAポリメラーゼも使用できる。特に好ましくは、Tth、Z05及びこれらの変異体からなる群より選択される逆転写活性を有するDNAポリメラーゼが挙げられる。
本明細書において、夾雑物耐性を有するDNAポリメラーゼの変異体とは、その由来である野生型DNAポリメラーゼのアミノ酸配列に対して、例えば85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上、なかでも好ましくは99%以上の配列同一性を有し、且つ、夾雑物質の存在下においても高いDNAポリメラーゼ活性を有するものをいう。逆転写活性も兼ね備えたDNAポリメラーゼである場合、夾雑物質の存在下においてもRNAをcDNAに変換する活性及びDNAを増幅する活性を有するものをいう。ここで、アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、当該分野で公知の任意の手段で行うことができる。例えば、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、一例として、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の相同性アルゴリズムBLAST(Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト(初期設定)のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出することが可能である。また、本発明に用いられ得る変異体は、その由来である野生型DNAポリメラーゼのアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加(以下、これらを纏めて「変異」ともいう)したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、且つ、野生型DNAポリメラーゼと同様にRNAをcDNAに変換する活性及びDNAを増幅する活性を有するものであってもよい。ここで1又は数個とは、例えば、1~80個、好ましくは1~40個、よりこのましくは1~10個、さらに好ましくは1~5個であり得るが、特に限定されない。
本発明に用いられるRT-PCR反応液には、DNAポリメラーゼの他、緩衝剤、適当な塩、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
本発明で使用される緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス(Tris),トリシン(Tricine),ビスートリシン(Bis-Tricine),ビシン(Bicine)などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでpHを6~9、より好ましくはpH7~9に調整されたものである。また、添加する緩衝剤の濃度としては、10~200mM,より好ましくは20~150mMで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが挙げられる。
本発明で使用されるdNTPとしては、dATP,dCTP,dGTP,dTTPがそれぞれ0.1~0.5mM、最も一般的には0.2mM程度加えられる。dTTPの代わり及び/又は一部としてdUTPを使用することによって、クロスコンタミネーションに対する予防処置をとってもよい。クロスコンタミネーションに対する予防処置を講じる場合、Uracil-N-glycosylase(UNG)を含むことが好ましい。
更に、本発明では、RT-PCR反応液に、2価陽イオンを含むことが好ましい。このように2価陽イオンを含むことで、より安定して高い夾雑耐性が得られ高感度な検出が可能となる。2価陽イオンとしては、特に限定されないが、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、銅イオン、鉄イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン等を挙げることができる。好ましくは、2価陽イオンとして、マグネシウムイオン、マンガンイオンを含むことが好ましい。本発明において、PCR反応液にマグネシウムイオンやマンガンイオン等を添加する場合は、マグネシウムやマンガンを添加してもよいし、これらの塩を添加してもよい。マグネシウム又はその塩としては、マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等が例示され、マンガン又はその塩としては、マンガン、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示される。このようなマグネシウム、マンガン、又はこれらの塩は、RT-PCR反応液中に1~10mM程度加えられることが好ましい。本発明の検出方法において、一酵素系RT-PCRを実施する場合、安定的に高い感度が得られ易いという観点からは、マンガン又はその塩を含むことが好ましい。特定の実施態様では、RT-PCR反応液において1mM以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、1.5mM以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、2.0mM以上のマンガン又はその塩を含むことがより好ましい。また、二酵素系RT-PCRを実施する場合、安定的に高い感度が得られ易いという観点からは、マグネシウム又はその塩を含むことが好ましい。特定の実施態様では、RT-PCR反応液において1mM以上のマグネシウム又はその塩を含むことが好ましく、1.5mM以上のマグネシウム又はその塩を含むことが好ましく、2.0mM以上のマグネシウム又はその塩を含むことがより好ましい。
さらにRT-PCR反応液に含まれる添加剤として、アミノ酸におけるアミノ基に3個のメチル基を付加した構造を有する第4級アンモニウム塩(以下、「ベタイン様4級アンモニウム」という)、ポリペプチド(ウシ血清アルブミン、セリシン、Blocking peptide fragment(以下BPFともいう)、ゼラチン)、グリセロール、グリコール及び界面活性剤よりなる群から選択された少なくとも1つを含んでいてもよい。
本発明に用いられる前記ポリペプチドは、分子量が5~500kDaである限り、特に限定されないが、好ましくは、6~400kDaである。本明細書において、分子量を示すときは、他の意味であることが明らかでない限り、SDS-PAGEを用いて決定した値をいう。SDS-PAGEでの分子量の測定は、当該分野で一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカー等を用いて行うことができる。例えば、「分子量50kDa」とは、SDS-PAGEで分子量を測定した際に、当業者が、通常50kDaの位置にバンドがあると判断する範囲にあることをいう。また、本発明に用いられるポリペプチドは、上記分子量の範囲内のポリペプチドの混合物であってもよい。
本発明に用いられる前記ポリペプチドは、本発明の効果を奏する限り特に限定されず、複数のアミノ酸がペプチド結合で連なって形成されたタンパク質をいう。また、本発明に用いられるポリペプチドは、アミノ酸が連結されたポリペプチド構造を有する限り、例えば、熱変性等により三次元構造が解かれたような熱変性ポリペプチド(例えば、ゼラチン)等であってもよい。具体的には、本発明に使用され得るポリペプチドとして、例えば、アルブミン(例えば、ウシ血清アルブミン、ラクトアルブミン、ヒト血清アルブミン、卵由来アルブミン)、ゼラチン(例えば、魚ゼラチン、豚ゼラチン)、セリシン、カゼイン、フィブロイン等の天然由来タンパク質(天然由来ポリペプチド);Blocking peptide fragment(以下BPFともいう)、コラーゲン加水分解物、ポリペプトン、酵母エキス、ビーフエキストラクト等の合成・分解等により人為的に製造されたポリペプチド等を用いることができる。より一層優れた本発明の効果が奏されるという観点から、好ましくは、本発明に用いられるポリペプチドは、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、Blocking peptide fragment(以下BPF)、及び/又はセリシンである。少量でも高い効果が発揮され得るという観点から、より好ましくは、ウシ血清アルブミン、ゼラチン(なかでも魚ゼラチン)を用いるのが好適である。これらのポリペプチドは、1種類だけ使用してもよいし、2種類以上を組合わせて使用してもよい。また、これらのポリペプチドは、天然からの抽出や合成等の手段により調製してもよく、また市販品も好適に使用することができる。
本発明において、前記ポリペプチドの使用量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、前記試料と一酵素系1ステップRT-PCR反応液とを混合した混合液中において、終濃度0.0001~200mg/mLとなるような量、好ましくは0.01~150mg/mL、より好ましくは0.1~130mg/mL、更に好ましくは0.5~100mg/mLで使用することができる。より優れた効果を発揮させるために好ましい量は、使用するポリペプチドの種類や所望される効果の程度等によって変動し得るが、例えば、以下のような使用量を例示することができる。
・ウシ血清アルブミンを用いる場合:RT-PCR反応液中終濃度として、例えば0.5mg/mL以上、好ましくは1mg/mL以上、より好ましくは2mg/mL以上、更に好ましくは3mg/mL以上。上限値は特に限定されないが、例えば、10mg/mL以下とすることができる。
・ゼラチンを用いる場合:RT-PCR反応液中終濃度として、例えば0.1mg/mL以上、好ましくは1mg/mL以上、より好ましくは5mg/mL以上、更に好ましくは7.5mg/mL以上、さらにより好ましくは15mg/mL以上。上限値は特に限定されないが、例えば、50mg/mL以下とすることができる。
・セリシンを用いる場合:RT-PCR反応液中終濃度として、例えば1mg/mL以上、好ましくは5mg/mL以上、より好ましくは10mg/mL以上、更に好ましくは20mg/mL以上、更により好ましくは50mg/mL以上。上限値は特に限定されないが、例えば、100mg/mL以下とすることができる。
・BPFを用いる場合:RT-PCR反応液中終濃度として、例えば1mg/mL以上、好ましくは5mg/mL以上、より好ましくは10mg/mL以上、更に好ましくは20mg/mL以上、更により好ましくは30mg/mL以上。上限値は特に限定されないが、例えば、50mg/mL以下とすることができる。
・ウシ血清アルブミンを用いる場合:RT-PCR反応液中終濃度として、例えば0.5mg/mL以上、好ましくは1mg/mL以上、より好ましくは2mg/mL以上、更に好ましくは3mg/mL以上。上限値は特に限定されないが、例えば、10mg/mL以下とすることができる。
・ゼラチンを用いる場合:RT-PCR反応液中終濃度として、例えば0.1mg/mL以上、好ましくは1mg/mL以上、より好ましくは5mg/mL以上、更に好ましくは7.5mg/mL以上、さらにより好ましくは15mg/mL以上。上限値は特に限定されないが、例えば、50mg/mL以下とすることができる。
・セリシンを用いる場合:RT-PCR反応液中終濃度として、例えば1mg/mL以上、好ましくは5mg/mL以上、より好ましくは10mg/mL以上、更に好ましくは20mg/mL以上、更により好ましくは50mg/mL以上。上限値は特に限定されないが、例えば、100mg/mL以下とすることができる。
・BPFを用いる場合:RT-PCR反応液中終濃度として、例えば1mg/mL以上、好ましくは5mg/mL以上、より好ましくは10mg/mL以上、更に好ましくは20mg/mL以上、更により好ましくは30mg/mL以上。上限値は特に限定されないが、例えば、50mg/mL以下とすることができる。
前記RT-PCR反応液に含まれる界面活性剤としては、トリトンX-100(TritonX-100)、トリトンX-114(TritonX-114)、ツイーン20(Tween20),ノニデットP40、Briji35、Briji58、SDS、CHAPS、CHAPSO、Emulgen420などが挙げられるが、特に限定されない。RT-PCR反応液中の前記界面活性剤の濃度も特に限定はされないが、好ましくは0.0001%以上、より好ましくは0.002%以上、さらに好ましくは0.005%以上で、良好な検出が可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、0.1%以下とすることができる。
前記RT-PCR反応液に含まれるベタイン様4級アンモニウムとしては、ベタイン(トリメチルグリシン)、カルニチンなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。ベタイン構造は分子内に安定な正、負の両電荷を持つ化合物で、界面活性剤のような性質を示し、ウイルス構造の不安定化を引き起こすと考えられる。さらに、DNAポリメラーゼの核酸増幅を促進することが知られる。好ましい前記ベタイン様4級アンモニウム濃度は、0.1M~2M、より好ましくは0.2M~1.2Mである。
さらには、当該技術分野でPCRまたはRT-PCRを促進することが知られる物質と組み合わせて使用することもできる。本発明において有用な促進物質とは、例えば、グリセロール、ポリオール、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質(SSB)、T4遺伝子32タンパク質、tRNA、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド(DMSO)、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン(PVP)、塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)、水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)、酢酸テトラメチルアンモニウム(TMAA)、ポリエチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N’,N’-四酢酸(EGTA)、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N’,N’-四酢酸(BAPTA)のようなキレート剤を含んでいてもよい。
また、核酸の単離処理を行っておらず夾雑物質が含まれる試料からであっても、夾雑物質の阻害を受けることなくRT-PCR反応が実施され得るRT-PCR反応液(RT-PCR試薬)としては、市販品も使用することができ、例えば、SARS-CoV-2 Detection Kit(東洋紡)、SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(TaKaRa)、2019新型コロナウイルス検出試薬キット(島津)などを使用することができる。好ましくは、SARS-CoV-2 Detection Kit(東洋紡)を使用するのがよい。
前記工程(2)におけるRT-PCR反応のサイクルは、1.熱処理や2.逆転写反応のステップを含んでよい。また、各ステップの前後に、ホットスタート酵素を活性化させるための熱処理工程を含んでもよい。1の熱処理工程では、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させる、及び/もしくは核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させる工程を含み得る。前記熱処理工程の温度及び時間は、60℃以上であり、かつ1秒以上であればよく、好ましくは70℃、30秒以上、より好ましくは80℃、30秒以上、特に好ましくは85℃、30秒以上である。2の逆転写反応の温度は、使用する逆転写酵素の逆転写活性と、プライマー及びプローブのTm値によって決定され、少なくとも25℃以上であればよい。より好ましくは37℃以上である。PCRでは、[1]熱処理によるDNA変性(2本鎖DNAから1本鎖DNAへの解離)、[2]鋳型1本鎖DNAへのプライマーのアニーリング、[3]DNAポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、の3ステップを含んでいればよく、[2]と[3]を同一の温度で実施して、2ステップとしてもよい。迅速なRT-PCRを実施するためには、前記RT-PCR反応に使用するサーマルサイクラーは、前記[2]と[3]のステップの伸長時間を合わせて15秒以下、より好ましくは10秒以下の測定プログラムを設定することが望ましい。なお、本明細書において「PCRの伸長時間」とは、サーマルサイクラーでの設定時間を指す。
本発明の別の一態様は、上記のような特定塩基配列のプライマー及びプローブを含むことを特徴とする、SARS-CoV-2のオミクロン株検出キットである。具体的には、この本発明のキットは、(a)配列番号14~18のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマーと、(b)前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーとを含み、更に(c)配列番号2~8のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つの蛍光プローブを含む。好ましくは、前記(b)プライマーとして配列番号11に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーを含むものであり得る。このキットは更に、核酸の単離処理を行っておらず夾雑物質が含まれる試料からであっても、夾雑物質の阻害を受けることなくRT-PCR反応が可能な反応試薬を含むことが好ましい。また、これらのキットは、SARS-CoV-2の野生株又はガンマ株若しくはベータ株等の他の変異株のゲノムRNAを増幅し得る他のプライマー及び/又はSARS-CoV-2の野生株又はガンマ株若しくはベータ株等の他の変異株のゲノムRNAからの増幅産物を検出し得る他の蛍光標識プローブを含むことが更に好ましい。この本発明のキットに含み得るプライマー、蛍光プローブ、及びその他に含み得る成分は、上記の変異検出方法において詳述されたものと同様であり得る。本発明のキットにおいて、上記のようなSARS-CoV-2のオミクロン株を検出するためのプライマー(プライマーセット)及び蛍光プローブ、並びにRT-PCR反応が可能な反応試薬、更に必要に応じて含んでいてもよい、SARS-CoV-2のオミクロン株以外の他の変異株(例えば、ガンマ株、ベータ株)又は野生株等を検出するための蛍光プローブ、プライマー(プライマーセット)などは、1つの試薬としてキットに含まれてもよいし、別々の試薬としてキットに含まれ、使用前に混合して用事調製される態様で提供されてもよい。
以下、実施例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
試験例1.SARS-CoV-2のオミクロン株検出プライマーの評価
SARS-CoV-2 Detection Kit -Multi-(東洋紡)に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、オミクロン株に特有のE484Aの変異が検出できるプライマーを評価した。上記キットの前処理液3μLに陰性唾液検体8μLを添加し、室温5分、95℃5分反応後、反応液30μL及び酵素液5μL、10μMの配列番号11に記載のFwdプライマー1.2μL、10μMの配列番号12に記載のRevプライマー1.2μL、及び配列番号13~17に記載のRevプライマー1.2μLをそれぞれ組み合わせ、10μMの配列番号2に記載のオミクロン株のE484A変異検出Cy5―BHQ3標識プローブ、10μMの配列番号9に記載の野生株E484検出FAM―BHQ1標識プローブそれぞれを0.3μL添加し、滅菌水で最終液量が40μLとなるようにRT-PCR反応液を調製した。比較例として、配列番号13~17に記載のRevプライマーを含まない以外は上記と同様にして調製し、滅菌水で最終液量を40μLとしたRT-PCR反応液も用意した。これらの反応液にSARS-CoV-2のオミクロン変異株RNA、又は野生株RNA1μL(それぞれ10000、50、25、0コピー/μL)を添加し、RT-PCR反応を行った。RT―PCRは42℃5分、95℃10秒の反応の後、95℃5秒→60℃30秒の繰り返しを45サイクルする条件で実施した。
SARS-CoV-2 Detection Kit -Multi-(東洋紡)に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、オミクロン株に特有のE484Aの変異が検出できるプライマーを評価した。上記キットの前処理液3μLに陰性唾液検体8μLを添加し、室温5分、95℃5分反応後、反応液30μL及び酵素液5μL、10μMの配列番号11に記載のFwdプライマー1.2μL、10μMの配列番号12に記載のRevプライマー1.2μL、及び配列番号13~17に記載のRevプライマー1.2μLをそれぞれ組み合わせ、10μMの配列番号2に記載のオミクロン株のE484A変異検出Cy5―BHQ3標識プローブ、10μMの配列番号9に記載の野生株E484検出FAM―BHQ1標識プローブそれぞれを0.3μL添加し、滅菌水で最終液量が40μLとなるようにRT-PCR反応液を調製した。比較例として、配列番号13~17に記載のRevプライマーを含まない以外は上記と同様にして調製し、滅菌水で最終液量を40μLとしたRT-PCR反応液も用意した。これらの反応液にSARS-CoV-2のオミクロン変異株RNA、又は野生株RNA1μL(それぞれ10000、50、25、0コピー/μL)を添加し、RT-PCR反応を行った。RT―PCRは42℃5分、95℃10秒の反応の後、95℃5秒→60℃30秒の繰り返しを45サイクルする条件で実施した。
RT-PCRの結果得られたCt値を表1に示す。N/Aは増幅しなかったことを示す。野生株はFAMのシグナルが、変異株はCy5のシグナルが得られればよい。配列番号13~17のプライマーを含むプライマーセットの組み合わせを評価したところ、配列番号14~17のプライマーを用いる場合にオミクロン株を検出でき、変異株、野生株をうまく分離できていた。特に、配列番号14~16のプライマーを含む組合せでは低コピーの場合にもオミクロン株を良好に検出できることが示された。一方、配列番号14~17と同様に配列番号1における23048番目及び23040番目の塩基置換を含んでいるものの、更に23055番目の塩基置換(TからCへの置換)も含むように設計された配列番号13のプライマーを用いた場合には、非特異増幅が生じることが認められた。また、配列番号14~17のプライマーを含まない場合(配列番号11-12)は、配列番号14~17のプライマーを含む場合と比較して、野生型の検出では大きな影響はなかったものの、オミクロン株の検出においては高コピーの場合でもCt値が非常に高く、オミクロン株の検出には不適であることが示された。以上の結果から、SARS-CoV-2のオミクロン株の検出には配列番号14~17に相当する塩基配列で構成されるプライマーを含むプライマーセットを用いることが必要であり、またこのプライマーセットは野生株を検出する反応液に添加されていても問題がなく使用できることが明らかとなった。更に、RT-PCR反応液に添加するプライマーセットに配列番号12に示されるプライマーを加えておくことで、オミクロン株だけではなく、野生株も判別して同時に検出できることが分かった。
また、唾液の代わりに鼻咽頭拭い液、鼻腔拭い液、糞便懸濁液を用いても同様の結果を示した。
また、唾液の代わりに鼻咽頭拭い液、鼻腔拭い液、糞便懸濁液を用いても同様の結果を示した。
試験例2.SARS-CoV-2のオミクロン株検出プローブの評価
SARS-CoV-2 Detection Kit -Multi-(東洋紡)に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、試験例1と同様にオミクロン株に特有のE484Aの変異株が検出できるプローブを評価した。E484A変異株を特異的に検出するプローブは、E484Aの変異をもたないRNA(野生型のゲノムRNA)には反応しないか又は反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液3μLに陰性唾液検体8μLを添加し、室温5分、95℃5分反応後、反応液30μL及び酵素液5μL、10μMの配列番号11に記載のFwdプライマー1.2μL、10μMの配列番号12のRevプライマー、配列番号15に記載のRevプライマー1.2μLを加え、更に10μMの配列番号9に記載の野生株E484検出FAM―BHQ1標識プローブを0.3μL及び10μMの配列番号2~8に記載のオミクロン株のE484A変異検出FAM―BHQ1標識プローブをそれぞれ0.3μL添加し、滅菌水で最終液量が40μLとなるようにRT-PCR反応液を調製した。そこに変異株RNA、又は野生株RNA1μL(それぞれ10000、50、25、0コピー/μL)を添加し、RT-PCR反応を行った。RT―PCRは42℃5分、95℃10秒の反応の後、95℃5秒→60℃30秒の繰り返しを45サイクルする条件で実施した。
RT-PCRの結果得られたCt値を表2に示す。N/Aは増幅しなかったことを示す。配列番号2~8の全てのプローブで、SARS-CoV-2のオミクロン株を良好に検出できることが認められた。そして、これらのオミクロンのE484A変異検出プローブは、配列番号9に示される野生型E484検出プローブと組み合わせて用いることで、野生株とオミクロン変異株をうまく分離できていた。
SARS-CoV-2 Detection Kit -Multi-(東洋紡)に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、試験例1と同様にオミクロン株に特有のE484Aの変異株が検出できるプローブを評価した。E484A変異株を特異的に検出するプローブは、E484Aの変異をもたないRNA(野生型のゲノムRNA)には反応しないか又は反応効率が悪いものが好ましい。上記キットの前処理液3μLに陰性唾液検体8μLを添加し、室温5分、95℃5分反応後、反応液30μL及び酵素液5μL、10μMの配列番号11に記載のFwdプライマー1.2μL、10μMの配列番号12のRevプライマー、配列番号15に記載のRevプライマー1.2μLを加え、更に10μMの配列番号9に記載の野生株E484検出FAM―BHQ1標識プローブを0.3μL及び10μMの配列番号2~8に記載のオミクロン株のE484A変異検出FAM―BHQ1標識プローブをそれぞれ0.3μL添加し、滅菌水で最終液量が40μLとなるようにRT-PCR反応液を調製した。そこに変異株RNA、又は野生株RNA1μL(それぞれ10000、50、25、0コピー/μL)を添加し、RT-PCR反応を行った。RT―PCRは42℃5分、95℃10秒の反応の後、95℃5秒→60℃30秒の繰り返しを45サイクルする条件で実施した。
RT-PCRの結果得られたCt値を表2に示す。N/Aは増幅しなかったことを示す。配列番号2~8の全てのプローブで、SARS-CoV-2のオミクロン株を良好に検出できることが認められた。そして、これらのオミクロンのE484A変異検出プローブは、配列番号9に示される野生型E484検出プローブと組み合わせて用いることで、野生株とオミクロン変異株をうまく分離できていた。
本発明は、臨床検査、感染症拡大防止などを目的とした検査の他、分子生物学研究等においても好適に利用できる。
Claims (12)
- 核酸の単離処理をせずにSARS-CoV-2のオミクロン株を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法:
(1)核酸の単離処理を行っていない試料と、(a)配列番号14~18のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び(b)前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含むプライマーセットと、(c)配列番号2~8のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つ蛍光プローブと、RT-PCR反応液とを混合する工程;及び
(2)前記混合液を用いてRT-PCR反応を実施する工程。 - 前記(b)プライマーが、配列番号11に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーである、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマーセットが、配列番号12に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーを更に含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記工程(1)において、(c)配列番号9若しくは10に記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に混合する、請求項1~3のいずれかに記載の方法。
- SARS-CoV-2のオミクロン株を、SARS-CoV-2の野生株、ガンマ株、又はベータ株と判別して検出する、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項1~5のいずれかに記載の方法。
- 核酸の単離処理をせずにSARS-CoV-2のオミクロン株を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット:
(1)(a)配列番号14~18のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び(b)前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含む:
(2)(c)配列番号2~8のいずれかに記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つの蛍光プローブを含む;並びに
(3)核酸の単離処理を行っていない試料からRT-PCR反応が可能な反応試薬を含む。 - 前記(b)プライマーが、配列番号11に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーである、請求項7に記載のキット。
- 配列番号12に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーを更に含む、請求項7又は8に記載のキット。
- 配列番号9若しくは10に記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に含む、請求項7~9のいずれかに記載のキット。
- SARS-CoV-2のオミクロン株を、SARS-CoV-2の野生株、ガンマ株、又はベータ株と判別して検出するために用いられる、請求項9又は10に記載のキット。
- 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項7~11のいずれかに記載のキット。
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