JP2016052265A - 改良されたｒｔ−ｐｃｒ反応 - Google Patents

Abstract

【課題】核酸増幅反応において、非特異反応を低減すること。【解決手段】試料中に含まれるＲＮＡを検出するための方法であって、少なくとも一つのデオキシヌクレオチド三リン酸ではないリン酸を含む分子存在下で、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素を用いてＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅することからなる方法。【選択図】なし

Description

本発明は、核酸増幅によるＲＮＡの検出法に関する。本発明は、具体的には逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による特異性の改善された核酸増幅及び検出に関する。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。

核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
代表的な核酸増幅法はＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。ＲＮＡを分析する場合、このＰＣＲの前段として、鋳型ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を実施する。これをＲＴ−ＰＣＲという。

このＲＴ−ＰＣＲは、（１）非共役ＲＴ−ＰＣＲ、（２）単一酵素を利用する共役ＲＴ−ＰＣＲ、（３）逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを利用する二酵素系共役ＲＴ−ＰＣＲ、の３つに大別される。

非共役ＲＴ−ＰＣＲにおいては、逆転写及びＰＣＲ増幅がそれぞれ独立した工程で行われる。そこで、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼそれぞれに最適な条件で反応させることができる。

一方、共役ＲＴ−ＰＣＲにおいては、逆転写及びＰＣＲ増幅が単一反応混合物中で行われる。単一酵素共役ＲＴ−ＰＣＲでは、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼやＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが利用される。一方、二酵素系共役ＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの少なくとも２種類の酵素が使用される。逆転写酵素としては、レトロウイルスあるいは細菌由来の逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ （Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）２−ＲＴ、ＥＩＡＶ（Ｅｑｕｉｎｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｎｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼなど）やその変異体が利用される。また、ＤＮＡポリメラーゼとしては。Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやその変異体などが利用される。

共役ＲＴ−ＰＣＲでは、非共役ＲＴ−ＰＣＲと異なり、２つの反応ステップの間に、反応液の一部を別の反応容器に分取したり、試薬を添加するような労力を必要としない上、コンタミネーションのリスクも低減できる。しかし、単一酵素共役ＲＴ−ＰＣＲ法は、非共役ＲＴ−ＰＣＲよりも感度が低いことが知られる（非特許文献１）。これに対し、二酵素系共役ＲＴ−ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性と比べ、レトロウイルス由来の逆転写酵素の逆転写効率が高いことから、単一酵素共役ＲＴ−ＰＣＲよりも感度が高いとされる（非特許文献２）。

しかし、二酵素系共役ＲＴ−ＰＣＲは、非共役ＲＴ−ＰＣＲよりも感度が高いが、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼが干渉し、効率を低下させることが報告されている（非特許文献３）。この干渉を抑えるため、鋳型ＲＮＡの増加、逆転写酵素に対するＤＮＡポリメラーゼ比率の増加、あるいは非ホモログｔＲＮＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、硫黄又は酢酸塩含有分子（特許文献１）などの使用が行われてきた。

しかしながら、鋳型ＲＮＡの増量は、サンプル量が限られる各種検査においては有効ではない。また、酵素間の干渉を調節する試薬についても効果は十分でなく、ＲＴ−ＰＣＲの効率低下や非特異産物の発生を防げない。そこで、共役ＲＴ−ＰＣＲのさらなる改善が要望されていた。

米国特許６，７６７，７２４号

ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７，１０３４−１０３６（１９９４） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２５，２３０−２３４（１９９８） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，１４８７−１４９０（１９９２） Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１，１９７０−１９７８（２００７） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ， ４１， １５４８−１５５７ （２００３）

本発明の目的は、ＲＮＡを鋳型とする共役ＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅反応において、非特異産物の発生を低減することである。

本発明者らは、ＲＮＡを鋳型とする共役ＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅反応において、Ｔｒｉｓ−リン酸バッファーが共役ＲＴ−ＰＣＲにおいて非特異産物の発生を抑制することをみいだした。
さらに本発明者らは、リン酸水素カリウムなど、Ｔｒｉｓ緩衝液ではないリン酸塩についても非特異抑制効果があることを見出し、反応基質となるデオキシヌクレオチド三リン酸以外のリン酸を含有する分子の共役ＲＴ−ＰＣＲにおける非特異抑制効果を見出し、本発明を完成した。

代表的な本願発明は以下の通りである。
[項１]
試料中に含まれるＲＮＡを検出するための方法であって、少なくとも一つのデオキシヌクレオチド三リン酸ではないリン酸を含む分子存在下で、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅することからなる方法。
[項２]
リン酸を含む分子がＴｒｉｓ−リン酸、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウムの郡より選択される、項１に記載の方法。
[項３]
Ｔｒｉｓ−リン酸が５０ｍＭ〜７５ｍＭである、請求項２に記載の方法。
[項４]
リン酸水素カリウムが１５ｍＭ以上である、請求項３に記載の方法。
[項５]
さらに、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物のいずれかを含む、請求項１〜４に記載の方法。
[項６]
試料が、血液、尿、糞便、喀痰、鼻腔液、膣分泌液及び口腔内粘膜からなる群から選択される、請求項１〜５に記載の方法。
[項７]
少なくとも一つのデオキシヌクレオチド三リン酸ではないリン酸を含む分子、ｄＮＴＰ、Ｍｇ塩、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素を含む、特異性が向上した核酸増幅のための組成物。
[項８]
リン酸を含む分子がＴｒｉｓ−リン酸、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウムの群より選択される、請求項７に記載の組成物。
[項９]
Ｔｒｉｓ−リン酸が５０ｍＭ〜７５ｍＭである、請求項８に記載の組成物。
[項１０]
リン酸水素カリウムが１５ｍＭ以上である、請求項９に記載の組成物。
[項１１]
さらに、２本鎖ＤＮＡ結合蛍光性化合物を含む、請求項７〜１０に記載の組成物。

本発明によって、共役ＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅において、非特異産物が抑制され、試料中に含まれる目的ＲＮＡの検出が効率よく、正確に行うことが可能になる。さらに、共役型ＲＴ−ＰＣＲによる検出によって、使用する試薬量の低減やキャリーオーバーのリスクの低減、労力の低減など、検査業務においてその効果は顕著となる。

各種Ｔｒｉｓ緩衝剤を用いたＲＴ−ＰＣＲの増幅産物の比較 ５０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−リン酸を用いたＲＴ−ＰＣＲの増幅産物の比較 ０〜２０ｍＭ リン酸水素カリウムの添加効果の比較 二本鎖ＤＮＡ結合色素化合物存在下でのリン酸水素カリウムを含むＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の融解曲線解析

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。

本発明の一局面は、検査対象試料中に含まれるＲＮＡを検出するための方法であって、少なくとも一つのデオキシヌクレオチド三リン酸ではないリン酸を含む分子存在下で、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅することからなる方法である。

検査対象試料中に含まれるＲＮＡとしては特に限定されるものではないが、動植物細胞由来のＲＮＡ、ウイルスや細菌由来のＲＮＡが挙げられる。これらＲＮＡは精製されたものであることが望ましいが、ＲＮＡ精製されていない試料であってもよい。

ＲＮＡを精製しない場合、サンプルを前処理することによって、検出の効率が向上する。前記前処理工程としては、アルカリ処理、加熱処理、有機溶媒による処理または、これらの処理を複数組み合わせた処理、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一方、これらの処理は、核酸が増幅の鋳型としての機能を保持されるように行われなければならない。すなわち、アルカリ処理のｐＨは９−１１の範囲が好ましい。熱処理の条件にはさらに注意が必要で、特にＲＮＡを鋳型とする場合は、８５℃以下、かつ２分以下が好ましい。上記の処理を終えた検査対象試料は、試料の移送をともなう核酸の分離精製を経ることなく核酸増幅反応液に添加される。前記処理により沈殿物などが生じた場合は遠心分離を行ってもよい。この場合、遠心分離に適用できる容器を用いて前記処理を行えば、試料の移送をともなう必要がない。

本発明の核酸増幅に用いられる、少なくとも一つのデオキシヌクレオチド三リン酸ではないリン酸としては、リン酸でｐＨ調整された緩衝剤やリン酸塩などが挙げられ、ターゲット遺伝子以外の非特異的な増幅産物の発生を抑制する効果のあるものである。

本発明で使用される、リン酸でｐＨ調整された緩衝剤としては、ｐＨ調整前にｐＨ７を超える緩衝剤が挙げられ、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。特に好ましくは、Ｔｒｉｓ−リン酸である。調整後のｐＨは、ｐＨ６〜９、より好ましくはｐＨ７〜８である。また、添加する濃度としては、好ましい下限は１０ｍＭ、さらに好ましくは２０ｍＭ、さらに好ましくは３０ｍＭ、さらに好ましくは４０ｍＭ、さらに好ましくは５０ｍＭである。一方、添加濃度の好ましい上限は２００ｍＭ、さらに好ましくは１００ｍＭ、さらに好ましくは９０ｍＭ、さらに好ましくは８０ｍＭ、さらに好ましくは７５ｍＭである。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが加えられる。Ｔｒｉｓ−リン酸緩衝液においては、ＰＣＲの効率を改善することが報告される（非特許文献４）。しかしながら、当該報告では１０ｘ濃度で１１０ｍＭ、すなわち１ｘで１１ｍＭと濃度が低く、本発明の共役ＲＴ−ＰＣＲ系で見出された５０〜７５ｍＭよりもはるかに低い。

本発明で使用される、リン酸塩としては、ナトリウム塩よりもカリウム塩が望ましく、リン酸二水素カリウム、リン酸水素カリウム、リン酸三カリウムが挙げられる。特に好ましくは溶液が中性に近いリン酸水素カリウムであって、添加濃度の好ましい下限は１０ｍＭ、さらに好ましくは１２ｍＭ、さらに好ましくは１３ｍＭ、さらに好ましくは１４ｍＭ、さらに好ましくは１５ｍＭである。一方、添加濃度の好ましい上限は１００ｍＭ、さらに好ましくは８０ｍＭ、さらに好ましくは６０ｍＭ、さらに好ましくは４０ｍＭ、さらに好ましくは２０ｍＭである。この場合、別途、リン酸以外でｐＨ調整された緩衝剤が加えられる。また、さらにイオン強度を最適化するため、リン酸塩以外の塩溶液が加えられる。

耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやその変異体が挙げられるが、特に限定されない。望ましくは、非特異抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、逆転写反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制され、ホットスタートＰＣＲできることが望ましい。

逆転写酵素としては、ＭＭＬＶ−ＲＴ、ＡＭＶ−ＲＴ、ＨＩＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、ＥＩＡＶ−ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼ）やその変異体が使用されるが、これに限定されない。

本発明のプライマーとしては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーが挙げられる。別の態様として、上記プライマーが２対以上含まれる、いわゆるマルチプレックスＰＣＲも挙げられる。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プライマーを含んでもよい。

この増幅反応には、さらにｄＮＴＰ、マグネシウム塩またはマンガン塩、プライマーなどが含まれる。ｄＮＴＰとしてはｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰがそれぞれ０．１〜０．５ｍＭ、最も一般的には０．２ｍＭ加えられる。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションの予防処置をとってもよい。マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、マンガン塩としては、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示され、１〜５ｍＭ程度加えられる。

さらに、本発明で開示されるリン酸含有分子とは別に、当該分野で知られるＲＴ−ＰＣＲを促進するような物質と組み合わせて使用することもできる。本発明において有用な促進物質とは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），ゼラチン、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデットＰ４０などが挙げられるが、これに限定されない。

本発明は、別の態様としては、さらに、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含む核酸増幅方法である。これによって、増幅産物の分析を通常の電気泳動ではなく、蛍光シグナルのモニタリングで監視することができ、解析労力が低減される。さらに反応容器を開放する必要がなく、コンタミネーションのリスク低減が可能である。

ハイブリダイゼーションプローブとしては、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（米国特許５，２１０，０１５号、５，５３８，８４８号、５，４８７，９７２号、５，８０４，３７５号）、モレキュラービーコン（米国特許５，１１８，８０１号）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（ＷＯ９７／４６７０７，ＷＯ９７／４６７１２，ＷＯ９７／４６７１４）などが挙げられる。

２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物としては、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ，ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＰ−１３、ＳＹＴＯ−８２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）などが挙げられる。

本発明の別の一局面は、少なくとも一つのデオキシヌクレオチド三リン酸ではないリン酸を含む分子、ｄＮＴＰ、Ｍｇ塩、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素を含む、特異性が向上した核酸増幅のための組成物である。

本発明の別の一局面は、Ｔｒｉｓ−リン酸、ｄＮＴＰ、Ｍｇ塩、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素を含む、特異性が向上した核酸増幅のための組成物である。

本発明の別の一局面は、緩衝剤、リン酸化水素カリウム、ｄＮＴＰ、Ｍｇ塩、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素を含む、特異性が向上した核酸増幅のための組成物である。

本発明の別の一局面は、少なくとも一つのデオキシヌクレオチド三リン酸ではないリン酸を含む分子、ｄＮＴＰ、Ｍｇ塩、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素、２本鎖ＤＮＡ結合蛍光性化合物を含む、特異性が向上した核酸増幅のための組成物である。

以下実施例をもって本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１．各種Ｔｒｉｓ緩衝剤を用いたＲＴ−ＰＣＲの比較
・ 糞便懸濁処理液の調製
１０％（重量％）となるようにヒト糞便を含む懸濁液を１ｍｌ調製した。前記糞便溶液１μｌとグリシン１０ｍＭ、ＥＧＴＡ５ｍＭ溶液４μｌを混合し、８５℃で１分間インキュベートした。
・ ＲＴ−ＰＣＲ試料の調製
配列番号１を鋳型として人工合成したノロウイルス遺伝子ＲＮＡ断片２０コピー／μｌとなるように水、または前記のように処理した糞便懸濁処理済液と混合し、ＲＴ−ＰＣＲの試料とした。また、ネガティブコントロールとして、ノロウイルス遺伝子ＲＮＡ断片を含まない水、糞便懸濁処理済液を使用した。
（３）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（３−１）反応液
以下に示される組成の反応液を調製した。
７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸、Ｔｒｉｓ−硫酸、Ｔｒｉｓ−シュウ酸、またはＴｒｉｓ−リン酸（ｐＨ７．５）
３．７５ｍＭ 硫酸マグネシウム
１５ｍＭ 酢酸カリウム
０．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
０．３μＭ ＣＯＧ２Ｆプライマー（配列番号２）
０．３μＭ ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号３）
（上記２種のプライマーは非特許文献５に記載の配列である。）
０．１μＭ 内部標準配列Ｆプライマー（配列番号４）
０．１μＭ 内部標準配列Ｆプライマー（配列番号５）
１０００コピー 内部標準配列ＤＮＡ ｐＢＲ３２２ プラスミドＤＮＡ
０．２ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．２ｕｎｉｔ／μｌ ａｎｔｉ Ｔａｑ ｈｉｇｈ（東洋紡）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（３−２）反応
前記反応液４５μｌを（１）で処理した各試料５μｌに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。
５０℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ ５分、
９４℃ １０秒−５６℃ ４５秒 ４５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
図１に電気泳動解析の結果を示す。使用した前記プライマーセット（ＣＯＧ２ＦおよびＣＯＧ２Ｒ）は９８ｂｐの増幅断片を生成する。
ＰＣＲ反応液緩衝剤として一般に使用される、Ｔｒｉｓ−塩酸、Ｔｒｉｓ−硫酸、さらにＴｒｉｓ−シュウ酸では、単に水を試料したネガティブコントロール（ＮＴＣ）でさえ、非特異的な増幅サンプルが顕著に発生しているのに対し、Ｔｒｉｓ−リン酸ではこの非特異的な増幅が抑制されている。この非特異抑制効果は糞便の有無に関わらず、認められた。

実施例２．Ｔｒｉｓ―リン酸濃度の比較
・ 試料の調製
実施例１と同様に、試料を調製した。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液
以下に示される組成の反応液を調製した。
５０、７５、または１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−リン酸（ｐＨ７．５）
３．７５ｍＭ 硫酸マグネシウム
１５ｍＭ 酢酸カリウム
０．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
０．３μＭ ＣＯＧ２Ｆプライマー
０．３μＭ ＣＯＧ２Ｒプライマー
０．１μＭ 内部標準配列Ｆプライマー（配列番号１）
０．１μＭ 内部標準配列Ｆプライマー（配列番号２）
１０００コピー 内部標準配列ＤＮＡ ｐＢＲ３２２ プラスミドＤＮＡ
０．２ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．２ｕｎｉｔ／μｌ ａｎｔｉ Ｔａｑ ｈｉｇｈ（東洋紡）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２−２）反応
前記反応液４５μｌを（１）で処理した各試料５μｌに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。
５０℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ ５分、
９４℃ １０秒−５６℃ ４５秒 ４５サイクル（ＰＣＲ）
（３）結果
図１に電気泳動解析の結果を示す。使用した前記プライマーセット（ＣＯＧ２ＦおよびＣＯＧ２Ｒ）は９８ｂｐの増幅断片を生成する。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−リン酸では、単に水を試料したネガティブコントロール（ＮＴＣ）でさえ、非特異的な増幅サンプルが発生しているのに対し、Ｔｒｉｓ−リン酸ではこの非特異的な増幅が抑制されている。この非特異抑制効果は糞便の有無に関わらず、認められた。

実施例３．リン酸水素カリウムの非特異低減効果の確認
・ 試料の調製
実施例１と同様に、人工合成したノロウイルス遺伝子ＲＮＡ断片 １０コピー／μｌとなるように糞便懸濁処理済液と混合し、ＲＴ−ＰＣＲの試料とした。また、ネガティブコントロールとして、ノロウイルス遺伝子ＲＮＡ断片を含まない糞便懸濁処理済液を使用した。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液
以下に示される組成の反応液を調製した。
７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸（ｐＨ７．５）
３．７５ｍＭ 硫酸マグネシウム
０、５、１０、１５、または２０ｍＭ リン酸水素カリウム
０．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
０．３μＭ ＣＯＧ２Ｆプライマー
０．３μＭ ＣＯＧ２Ｒプライマー
０．１μＭ 内部標準配列Ｆプライマー（配列番号１）
０．１μＭ 内部標準配列Ｆプライマー（配列番号２）
１０００コピー 内部標準配列ＤＮＡ ｐＢＲ３２２ プラスミドＤＮＡ
０．２ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．２ｕｎｉｔ／μｌ ａｎｔｉ Ｔａｑ ｈｉｇｈ（東洋紡）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２−２）反応
前記反応液４５μｌを（１）で処理した各試料に添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。
５０℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ ５分、
９４℃ １０秒−５６℃ ４５秒 ４５サイクル（ＰＣＲ）
（３）結果
図１に電気泳動解析の結果を示す。使用した前記プライマーセット（ＣＯＧ２ＦおよびＣＯＧ２Ｒ）は９８ｂｐの増幅断片を生成する。
０〜１０ｍＭリン酸水素カリウム存在下では、ネガティブコントロール（ＮＴＣ）において、非特異的増幅産物が発生しているのに対し、１５〜２０ｍＭリン酸水素カリウム存在下では、非特異的増幅産物の発生が抑制されている。この非特異抑制効果は糞便の有無に関わらず、認められた。

実施例４．２本鎖結合蛍光物質存在下での核酸増幅
・ 試料の調製
実施例１と同様に、人工合成したノロウイルス遺伝子ＲＮＡ断片２、１０、５０、２５０、１２５０コピー／μｌとなるように糞便懸濁処理済液と混合し、ＲＴ−ＰＣＲの試料とした。また、ネガティブコントロールとして、ノロウイルス遺伝子ＲＮＡ断片を含まない糞便懸濁処理済液を使用した。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液
以下に示される組成の反応液を調製した。
７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸（ｐＨ７．５）
３．７５ｍＭ 硫酸マグネシウム
１５ｍＭ リン酸水素カリウム
０．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＵＴＰ
０．３μＭ ＣＯＧ２Ｆプライマー
０．３μＭ ＣＯＧ２Ｒプライマー
０．１μＭ 内部標準配列Ｆプライマー（配列番号１）
０．１μＭ 内部標準配列Ｆプライマー（配列番号２）
１０００コピー 内部標準配列ＤＮＡ ｐＢＲ３２２ プラスミドＤＮＡ
０．２ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．２ｕｎｉｔ／μｌ ａｎｔｉ Ｔａｑ ｈｉｇｈ（東洋紡）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
１ｘＥｖａＧｒｅｅｎ ｄｙｅ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）
（２−２）反応
前記反応液４５μｌを（１）で処理した各試料に添加した。ＢｉｏＲａｄ社製ＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎを用いて、これを以下の温度サイクルで反応した。
５０℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ ５分、
９４℃ １０秒−５６℃ ４５秒 ４５サイクル（ＰＣＲ）
（２−３）融解曲線解析
反応終了後、直ちに「７０℃ ０．５℃／秒 ９０℃融解曲線解析」に供した。すなわち、７０℃から ０．５℃／秒 で９０℃まで上昇させた。
（３）結果
図４に融解曲線解析の結果を示す。使用した前記プライマーセット（ＣＯＧ２ＦおよびＣＯＧ２Ｒ）は、ノロウイルスＧ２タイプが存在すると８０℃付近にピークを与えることがわかっている。また、使用した内部標準配列プライマーセットは、反応液に含まれる内部標準配列ＤＮＡのピークを８５℃付近に与えることがわかっている。
この結果、２本鎖ＤＮＡ結合性蛍光色素であるＥｖａＧｒｅｅｎ存在下でも、０コピーにおいては内部標準のみのピークが認められ、Ｇ２ ＲＮＡ存在下ではＧ２由来のピークと内部標準に由来するピークのみが認められ、特異的な検出が行えた。

本発明は、分子生物学研究、さらに臨床検査や食品衛生管理、食品における品種の特定や遺伝子組み換えの有無の判別などを目的とした検査に用いられる。

Claims (11)

1. 試料中に含まれるＲＮＡを検出するための方法であって、少なくとも一つのデオキシヌクレオチド三リン酸ではないリン酸を含む分子存在下で、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅することからなる方法。
2. リン酸を含む分子がＴｒｉｓ−リン酸、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウムの郡より選択される、請求項１に記載の方法。
3. Ｔｒｉｓ−リン酸が５０ｍＭ〜７５ｍＭである、請求項２に記載の方法。
4. リン酸水素カリウムが１５ｍＭ以上である、請求項３に記載の方法。
5. さらに、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物のいずれかを含む、請求項１〜４に記載の方法。
6. 試料が、血液、尿、糞便、喀痰、鼻腔液、膣分泌液及び口腔内粘膜からなる群から選択される、請求項１〜５に記載の方法。
7. 少なくとも一つのデオキシヌクレオチド三リン酸ではないリン酸を含む分子、ｄＮＴＰ、Ｍｇ塩、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素を含む、特異性が向上したＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅のための組成物。
8. リン酸を含む分子がＴｒｉｓ−リン酸、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウムの郡より選択される、請求項７に記載の組成物。
9. Ｔｒｉｓ−リン酸が５０ｍＭ〜７５ｍＭである、請求項８に記載の組成物。
10. リン酸水素カリウムが１５ｍＭ以上である、請求項９に記載の組成物。
11. さらに、２本鎖ＤＮＡ結合蛍光性化合物を含む、請求項７〜１０に記載の組成物。