JP2023098185A - 標的塩基配列の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、核酸増幅反応による標的塩基配列の検出において、標的塩基配列の検出感度を低下させることを目的とする。【解決手段】本発明の一側面に係る試料中の標的塩基配列を検出する方法は、試料を、（ａ）一種以上のフォワードプライマー、（ｂ）一種以上のリバースプライマー、（ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｄ）競合オリゴヌクレオチドと混合して核酸増幅反応を行う工程を含み、標的塩基配列とその相補的配列のうち、センス配列はリバースプライマー結合領域を有し、アンチセンス配列はフォワードプライマー結合領域を有し、センス配列又はアンチセンス配列にはプローブ結合領域が存在し、競合オリゴヌクレオチドは、標的塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列であって、ただし、プローブ結合領域に対応する又は相補的な塩基配列は欠損しているか他の塩基配列に置換されている、塩基配列を含む、方法。【選択図】なし

Description

本発明は、試料中の標的塩基配列を検出する方法に関する。

近年、生体等より得られた試料に僅かに存在する微生物、ウイルス、若しくは細菌、又は病態に伴う遺伝子変異等の検出を目的として、核酸増幅法が用いられている。核酸増幅法は高感度であるため、標的塩基配列の検出において、試料間のクロスコンタミネーション等による夾雑物の混入、類縁菌との交差反応等による、標的塩基配列以外の塩基配列が多々検出される。これを回避するために、核酸増幅反応に用いるプライマーの配列若しくは濃度を変更し、又はプライマー以外の成分若しくはその濃度を変更することができるが、これらの変更によって、標的塩基配列の十分な検出感度を維持できるかの再検討が必要となる。また、目標とする検出感度ごとに、プライマー、プライマー以外の成分、又はそれらの濃度を変更する必要があるため、非常に煩雑であり、効率的でない。

一方、核酸増幅反応を利用した標的塩基配列の検出において、種々の目的で競合オリゴヌクレオチドを用いる技術が知られている。例えば特許文献１では、等温増幅法において、プライマーとの結合について標的核酸配列と競合する鋳型核酸を用いることによって、遺伝子検査の陰性結果を迅速かつ積極的に検出する方法が記載されている。しかしながら、核酸増幅反応における標的塩基配列以外の塩基配列の検出を抑制するために競合オリゴヌクレオチドを用いる技術は知られておらず、そのような目的に合った競合オリゴヌクレオチドも提供されていない。

特開２０１８－３３３７７号公報

本発明は、核酸増幅反応による標的塩基配列の検出において、標的塩基配列の検出感度を低下させることを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討した結果、特定の塩基配列を有する競合オリゴヌクレオチドの存在下で核酸増幅反応を行うことで、標的塩基配列の検出感度が低下し、その結果、標的塩基配列よりも量の少ない夾雑物、類縁菌等に由来する塩基配列の増幅を抑制できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。

本発明は、以下の［１］～［９］を提供する。
［１］ 試料中の標的塩基配列を検出する方法であって、
試料を、
（ａ）一種以上のフォワードプライマー、
（ｂ）一種以上のリバースプライマー、
（ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び
（ｄ）競合オリゴヌクレオチド
と混合して核酸増幅反応を行う工程を含み、
上記標的塩基配列とその相補的配列のうち、センス配列は、各上記リバースプライマーがアニールする任意のリバースプライマー結合領域を有し、アンチセンス配列は、各上記フォワードプライマーがアニールする任意のフォワードプライマー結合領域を有し、
上記センス配列における最も５’末端寄りの上記リバースプライマー結合領域と、上記センス配列における領域であって、上記アンチセンス配列における最も５’末端寄りの上記フォワードプライマー結合領域に相補的な領域との間、又は上記アンチセンス配列における最も５’末端寄りの上記フォワードプライマー結合領域と、上記アンチセンス配列における領域であって、上記センス配列における最も５’末端寄りの上記リバースプライマー結合領域に相補的な領域との間には、上記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする任意のプローブ結合領域が存在し、
上記標識オリゴヌクレオチドプローブは、上記プローブ結合領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、
上記競合オリゴヌクレオチドは、上記標的塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列であって、ただし、
（ｉ）上記プローブ結合領域に対応する又は相補的な塩基配列は、欠損しているか他の塩基配列に置換されており、該他の塩基配列は、該他の塩基配列又はその相補的配列に上記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできないように設計されており、
（ｉｉ）上記一種以上のフォワードプライマー又は上記一種以上のリバースプライマーに含まれる塩基配列に対応する塩基配列及びそれらに相補的な塩基配列以外の塩基配列における塩基は、欠失されているか他の塩基に置換されていてもよく、かつ
（ｉｉｉ）上記標的塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい
塩基配列を含む、方法。
［２］ 上記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応又はループ媒介等温増幅反応である、［１］に記載の方法。
［３］ 上記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応であり、
上記一種以上のフォワードプライマーが一種のフォワードプライマーであり、
上記一種以上のリバースプライマーが一種のリバースプライマーである、［２］に記載の方法。
［４］ 上記核酸増幅反応がループ媒介等温増幅反応であり、
上記一種以上のフォワードプライマーが、ＦＩＰプライマー及びＦ３プライマーであり、
上記一種以上のリバースプライマーが、ＢＩＰプライマー及びＢ３プライマーであり、
上記センス配列は、５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃをこの順に有し、領域Ｂ２ｃ及びＢ３ｃは上記リバースプライマー結合領域であり、
上記アンチセンス配列は、３’末端から５’末端の方向に、上記領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃにそれぞれ相補的な領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に有し、上記領域Ｆ３ｃ及びＦ２ｃは上記フォワードプライマー結合領域であり、
上記ＦＩＰプライマーは、上記領域Ｆ１に相補的な塩基配列を５’末端に有し、かつ上記領域Ｆ２ｃに相補的な塩基配列を３’末端に有し、
上記Ｆ３プライマーは、上記領域Ｆ３ｃに相補的な塩基配列を有し、
上記ＢＩＰプライマーは、上記領域Ｂ１に相補的な塩基配列を５’末端に有し、かつ上記領域Ｂ２ｃに相補的な塩基配列を３’末端に有し、
上記Ｂ３プライマーは、上記領域Ｂ３ｃに相補的な塩基配列を有する、［２］に記載の方法。
［５］ 上記プローブ結合領域が、上記領域Ｆ２とＦ１の間、上記領域Ｂ１ｃとＢ２ｃの間、上記領域Ｆ２ｃとＦ１ｃの間、又は上記領域Ｂ１とＢ２の間に存在する、［４］に記載の方法。
［６］ 上記核酸増幅反応の増幅産物を、上記標識オリゴヌクレオチドプローブの標識物質に基づいて検出する工程をさらに含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］ 上記標識オリゴヌクレオチドプローブが蛍光プローブであり、上記核酸増幅反応の増幅産物を検出する上記工程において、上記蛍光プローブから発せられる蛍光の強度に基づいて上記増幅産物を検出する、［６］に記載の方法。
［８］ 核酸増幅反応を用いた標的塩基配列の検出において該標的塩基配列の検出感度を低下させる方法であって、
試料を、
（ａ）一種以上のフォワードプライマー、
（ｂ）一種以上のリバースプライマー、
（ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び
（ｄ）競合オリゴヌクレオチド
と混合して核酸増幅反応を行う工程を含み、
上記標的塩基配列とその相補的配列のうち、センス配列は、各上記リバースプライマーがアニールする任意のリバースプライマー結合領域を有し、アンチセンス配列は、各上記フォワードプライマーがアニールする任意のフォワードプライマー結合領域を有し、
上記センス配列における最も５’末端寄りの上記リバースプライマー結合領域と、上記センス配列における領域であって、上記アンチセンス配列における最も５’末端寄りの上記フォワードプライマー結合領域に相補的な領域との間、又は上記アンチセンス配列における最も５’末端寄りの上記フォワードプライマー結合領域と、上記アンチセンス配列における領域であって、上記センス配列における最も５’末端寄りの上記リバースプライマー結合領域に相補的な領域との間には、上記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする任意のプローブ結合領域が存在し、
上記標識オリゴヌクレオチドプローブは、上記プローブ結合領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、
上記競合オリゴヌクレオチドは、上記標的塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列であって、ただし、
（ｉ）上記プローブ結合領域に対応する又は相補的な塩基配列は、欠損しているか他の塩基配列に置換されており、該他の塩基配列は、該他の塩基配列又はその相補的配列に上記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできないように設計されており、
（ｉｉ）上記一種以上のフォワードプライマー又は上記一種以上のリバースプライマーに含まれる塩基配列に対応する塩基配列及びそれらに相補的な塩基配列以外の塩基配列における塩基は、欠失されているか他の塩基に置換されていてもよく、かつ
（ｉｉｉ）上記標的塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい
塩基配列を含む、方法。
［９］ 標的塩基配列を検出するためのキットであって、
（ａ）一種以上のフォワードプライマー、
（ｂ）一種以上のリバースプライマー、
（ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び
（ｄ）競合オリゴヌクレオチド
を含み、
上記標的塩基配列とその相補的配列のうち、センス配列は、各上記リバースプライマーがアニールする任意のリバースプライマー結合領域を有し、アンチセンス配列は、各上記フォワードプライマーがアニールする任意のフォワードプライマー結合領域を有し、
上記センス配列における最も５’末端寄りの上記リバースプライマー結合領域と、上記センス配列における領域であって、上記アンチセンス配列における最も５’末端寄りの上記フォワードプライマー結合領域に相補的な領域との間、又は上記アンチセンス配列における最も５’末端寄りの上記フォワードプライマー結合領域と、上記アンチセンス配列における領域であって、上記センス配列における最も５’末端寄りの上記リバースプライマー結合領域に相補的な領域との間には、上記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする任意のプローブ結合領域が存在し、
上記標識オリゴヌクレオチドプローブは、上記プローブ結合領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、
上記競合オリゴヌクレオチドは、上記標的塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列であって、ただし、
（ｉ）上記プローブ結合領域に対応する又は相補的な塩基配列は、欠損しているか他の塩基配列に置換されており、該他の塩基配列は、該他の塩基配列又はその相補的配列に上記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできないように設計されており、
（ｉｉ）上記一種以上のフォワードプライマー又は上記一種以上のリバースプライマーに含まれる塩基配列に対応する塩基配列及びそれらに相補的な塩基配列以外の塩基配列における塩基は、欠失されているか他の塩基に置換されていてもよく、かつ
（ｉｉｉ）上記標的塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい
塩基配列を含む、キット。

本発明は、以下の［１０］及び［１１］を提供するともいえる。
［１０］ 試料中の標的塩基配列を検出する方法であって、
試料を、
（ａ）フォワードプライマー、
（ｂ）リバースプライマー、
（ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び
（ｄ）競合オリゴヌクレオチド
と混合して核酸増幅反応を行う工程を含み、
上記標的塩基配列とその相補的配列のうち、センス配列は、５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ及びＢｃをこの順に有し、アンチセンス配列は、３’末端から５’末端の方向に、上記領域Ｆ及びＢｃにそれぞれ相補的な領域Ｆｃ及びＢをこの順に有し、
上記領域ＦとＢｃの間又は上記領域ＦｃとＢの間には、上記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする任意のプローブ結合領域が存在し、
上記フォワードプライマーは上記領域Ｆｃと相補的な塩基配列Ｆ’を有し、
上記リバースプライマーは上記領域Ｂｃと相補的な塩基配列Ｂ’を有し、
上記標識オリゴヌクレオチドプローブは、上記プローブ結合領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、
上記競合オリゴヌクレオチドは、上記標的塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列であって、ただし、
（ｉ）上記プローブ結合領域に対応する又は相補的な塩基配列は、欠損しているか他の塩基配列に置換されており、該他の塩基配列は、該他の塩基配列又はその相補的配列に上記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできないように設計されており、
（ｉｉ）上記領域Ｆ、Ｂｃ、Ｆｃ、及びＢに対応する領域の塩基配列以外の塩基配列における塩基は、欠失されているか他の塩基に置換されていてもよく、かつ
（ｉｉｉ）上記標的塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい
塩基配列を含む、方法。
［１１］ 試料中の標的塩基配列を検出する方法であって、
試料を、
（ａ）ＦＩＰプライマー及びＦ３プライマー
（ｂ）ＢＩＰプライマー及びＢ３プライマー、
（ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｄ）競合オリゴヌクレオチド
と混合して核酸増幅反応を行う工程を含み、
上記標的塩基配列とその相補的配列のうち、センス配列は、５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃをこの順に有し、アンチセンス配列は、３’末端から５’末端の方向に、上記領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃにそれぞれ相補的な領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に有し、
上記領域Ｆ２とＢ２ｃの間又は上記領域Ｆ２ｃとＢ２の間には、上記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする任意のプローブ結合領域が存在し、
上記ＦＩＰプライマーは、上記領域Ｆ１に相補的な塩基配列を５’末端に有し、かつ上記領域Ｆ２ｃに相補的な塩基配列を３’末端に有し、
上記Ｆ３プライマーは、上記領域Ｆ３ｃに相補的な塩基配列を有し、
上記ＢＩＰプライマーは、上記領域Ｂ１に相補的な塩基配列を５’末端に有し、かつ上記領域Ｂ２ｃに相補的な塩基配列を３’末端に有し、
上記Ｂ３プライマーは、上記領域Ｂ３ｃに相補的な塩基配列を有し、
上記標識オリゴヌクレオチドプローブは、上記プローブ結合領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、
上記競合オリゴヌクレオチドは、上記標的塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列であって、ただし、
（ｉ）上記プローブ結合領域に対応する又は相補的な塩基配列は、欠損しているか他の塩基配列に置換されており、該他の塩基配列は、該他の塩基配列又はその相補的配列に上記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできないように設計されており、
（ｉｉ）上記領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３に対応する領域の塩基配列以外の塩基配列における塩基は、欠失されているか他の塩基に置換されていてもよく、かつ
（ｉｉｉ）上記標的塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい
塩基配列を含む、方法。

本発明によれば、核酸増幅反応による標的塩基配列の検出において、標的塩基配列の検出感度を低下させることができる。その結果、標的塩基配列よりも量の少ない夾雑物、類縁菌等に由来する塩基配列の検出を抑制することができる。

図１は、ポリメラーゼ連鎖反応による標的塩基配列の検出に用いるプライマー、標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び競合オリゴヌクレオチドと、これらの設計の基となる、標的塩基配列及びその相補的配列における領域を示す。 図２はループ媒介等温増幅反応による標的塩基配列の検出に用いるプライマー、標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び競合オリゴヌクレオチドと、これらの設計の基となる、標的塩基配列及びその相補的配列における領域を示す。 図３の（Ａ）は、実施例１における標的塩基配列（ｒｅｓ１の部分配列、配列番号１）を示し、図３の（Ｂ）は、実施例１における標的塩基配列及び競合オリゴヌクレオチドの塩基配列の概略を示す。 図４の（Ａ）は、実施例２及び３における標的塩基配列を含むＨＥＲ２遺伝子の塩基配列（配列番号９）を示し、図４の（Ｂ）は、実施例２及び３における標的塩基配列及び競合オリゴヌクレオチドの塩基配列の概略を示す。 図５の（Ａ）は、実施例４におけるＳＡＲＳコロナウイルス２のＮ遺伝子における標的塩基配列（配列番号１５）と、ＳＡＲＳコロナウイルスにおける対応する塩基配列（配列番号１６）とのアライメントを示し、図５の（Ｂ）は、実施例４における標的塩基配列及び競合オリゴヌクレオチドの塩基配列の概略を示す。

本発明の一側面に係る試料中の標的塩基配列を検出する方法は、試料を、
（ａ）一種以上のフォワードプライマー、
（ｂ）一種以上のリバースプライマー、
（ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び
（ｄ）競合オリゴヌクレオチド
と混合して核酸増幅反応を行う工程を含む。

試料は、標的塩基配列を含む核酸を含む可能性のある試料であれば特に限定されず、例えば、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、唾液、血液、血漿、血清、尿、糞便、組織、細胞、培養細胞から分離した細菌若しくはウイルスを含む検体等生体試料であってよい。試料は、上記生体試料に、分離、濃縮、精製等の処理を行ったものであってもよい。例えば、試料として、上記生体試料から抽出したＤＮＡ又はＲＮＡを用いてもよい。

本明細書において、用語「標的塩基配列」とは、後述するフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いた核酸増幅反応により増幅される塩基配列と、かかる増幅に必要なプライマーの設計領域の塩基配列とからなる塩基配列を指す。標的塩基配列は、核酸増幅反応により増幅させるのに必要な長さを有する塩基配列であれば特に限定されず、ＤＮＡの塩基配列であってもＲＮＡの塩基配列であってもよい。標的塩基配列の長さは、例えば、２５～１００，０００塩基、２８～１０，０００塩基、又は３０～２５０塩基であってよい。標的塩基配列を含む核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。

上記（ａ）～（ｄ）は、標的塩基配列とその相補的配列に基づいて設計される。標的塩基配列とその相補的配列のうち、センス配列においては、後述するリバースプライマーがアニールする任意のリバースプライマー結合領域が３’末端寄りに設定され、アンチセンス配列においては、後述するフォワードプライマーがアニールする任意のフォワードプライマー結合領域が３’末端寄りに設定される。本明細書において、リバースプライマー結合領域とフォワードプライマー結合領域を併せて「プライマー結合領域」と呼ぶ。また、センス配列及びアンチセンス配列のいずれか一方には、後述する、標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする任意のプローブ結合領域がさらに設定される。

本明細書において、用語「相補的」は必ずしも完全に相補的であることを意味しない。例えば、「ある塩基配列に相補的な塩基配列」の範囲には、ある塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の塩基配列が含まれる。ストリンジェントな条件は、特に限定されないが、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＬ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハーツ溶液、及び１０％デキストラン硫酸であってよい。

当業者に理解されるように、センス配列とは、タンパク質をコードする配列であり、すなわちタンパク質合成の鋳型となり得る塩基配列であり、例えば、プラス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ配列はセンス配列である。一方、アンチセンス配列とは、タンパク質合成の鋳型となり得ない塩基配列であり、例えば、マイナス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ配列はアンチセンス配列である。標的塩基配列を含む核酸が二本鎖ＤＮＡの場合、通常、標的塩基配列としてはセンス配列が選ばれる。

本明細書において、フォワードプライマー又はリバースプライマーの設計の基となるセンス配列中又はアンチセンス配列中の領域と、それに相補的なセンス配列中又はアンチセンス配列中の領域を、併せて「プライマー設計領域」と呼ぶ。いいかえれば、プライマー設計領域は、フォワードプライマー又はリバースプライマーに含まれる塩基配列に対応する塩基配列からなるセンス配列中又はアンチセンス配列中の領域と、それに相補的なセンス配列中又はアンチセンス配列中の領域を指す。「フォワードプライマー又はリバースプライマーに含まれる塩基配列に対応する塩基配列」とは、フォワードプライマー又はリバースプライマーに含まれる塩基配列を指し、ただし、センス配列又はアンチセンス配列中にウラシルが存在する場合は、フォワードプライマー又はリバースプライマーに含まれる塩基配列であって、チミンがウラシルに置換された塩基配列を指す。プライマー設計領域には、プライマー結合領域とそれらに相補的なセンス配列中又はアンチセンス配列中の領域が含まれるが、これらの領域以外の領域も含まれ得る。例えば、後述するＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマーは、プライマー結合領域又はそれらに相補的な領域（Ｆ２、Ｆ２ｃ、Ｂ２、及びＢ２ｃ）と、プライマー結合領域又はそれらに相補的な領域に該当しない領域（Ｆ１ｃ、Ｆ１、Ｂ１ｃ、及びＢ１）とに基づいて設計され、どちらの領域もプライマー設計領域に含まれる。また、本明細書において、プローブ結合領域とそれに相補的なセンス中配列又はアンチセンス配列中の領域とを、「プローブ設計領域」と呼ぶ。

当業者は、プライマー設計領域として適当な領域を、核酸増幅反応の種類に応じて、公知の文献等の開示に基づいて適宜選択することができる。

プローブ結合領域（すなわち、プローブ設計領域）としては、フォワードプライマー結合領域又はそれに相補的な領域と、リバースプライマー結合領域又はそれに相補的な領域との間の任意の領域が選択される。フォワードプライマー及びリバースプライマーが複数種ある場合、プローブ結合領域は、最も内側のフォワードプライマー結合領域又はそれに相補的な領域と、最も内側のリバースプライマー結合領域又はそれに相補的な領域との間に設定される。ここで、「最も内側」とは、センス配列及びアンチセンス配列の５’末端及び３’末端から最も離れた位置を指す。より厳密には、プローブ結合領域は、センス配列中に設定される場合、最も５’末端寄りのリバースプライマー結合領域と、アンチセンス配列における最も５’末端寄りのフォワードプライマー結合領域に相補的な領域との間に設定され、アンチセンス配列中に設定される場合、最も５’末端寄りのフォワードプライマー結合領域と、センス配列における最も５’末端寄りのリバースプライマー結合領域に相補的な領域との間に設定される。プローブ結合領域は、その一部においてプライマー設計領域と重なってもよいが、プローブ結合領域とプライマー設計領域は重ならないことが好ましい。プローブ結合領域からプライマー設計領域までの距離、より具体的には、プローブ結合領域の５’末端に最も近いプライマー設計領域の３’末端からプローブ結合領域の５’末端までの距離、及びプローブ結合領域の３’末端に最も近いプライマー設計領域の５’末端からプローブ結合領域の３’末端までの距離は、例えば、０～３５塩基、０～２０塩基、０～１０塩基、又は１～５塩基であってよい。

プローブ結合領域の長さ（塩基数）は、例えば、５～２００塩基、１５～１００塩基、又は２０～３０塩基であってよい。

当業者に理解されるように、フォワードプライマーとは、アンチセンス配列にアニールして、ＤＮＡポリメラーズによる５’末端から３’末端への伸長反応の起点を与えるオリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）であり、リバースプライマーとは、センス配列にアニールして、ＤＮＡポリメラーズによる５’末端から３’末端への伸長反応の起点を与えるオリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）である。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、上記プライマー設計領域に基づいて設計され、それぞれフォワードプライマー結合領域及びリバースプライマー結合領域の塩基配列に相補的な塩基配列を少なくとも含む。当業者は、核酸増幅反応の種類に応じて、公知の文献等の開示に基づいてフォワードプライマー及びリバースプライマーを適宜設計することができる。また、フォワードプライマー及びリバースプライマーの数（種類）も、核酸増幅反応の種類に応じて、当業者が適宜決定できる。例えば、１～４種、１～３種、又は１若しくは２種のフォワードプライマー又はリバースプライマーを使用することができる。

標識オリゴヌクレオチドプローブは、標的塩基配列の増幅を検出するためのオリゴヌクレオチド（より具体的にはＤＮＡ）であり、標識物質が結合している。標識オリゴヌクレオチドプローブは、上記プローブ設計領域に基づいて設計され、上記プローブ結合領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。

標識オリゴヌクレオチドプローブは、例えば蛍光プローブであってよい。蛍光プローブとしては、例えば、蛍光消光プローブ（Ｑプローブ）及び副溝結合プローブ（ＭＧＢプローブ）が挙げられる。蛍光消光プローブに用いることのできる蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）－ＦＬ、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、パシフィックブルー（登録商標）、及びフルオレセイン－４－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が挙げられる。ＭＧＢプローブに用いることのできる蛍光色素としては、例えば、ＦＡＭ（登録商標）及びＨＥＸ（登録商標）が挙げられる。ＭＧＢプローブに用いることのできるクエンチャーとしては、例えば、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）クエンチャーが挙げられる。

標識オリゴヌクレオチドプローブにおけるオリゴヌクレオチドの長さは、例えば、５～２００塩基、１５～１００塩基、又は２０～３０塩基であってよい。

競合オリゴヌクレオチドは、上記フォワード及びリバースプライマーとの結合について標的塩基配列と競合するオリゴヌクレオチドである。競合オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。競合オリゴヌクレオチドは、標的塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列であって、ただし、プローブ設計領域の塩基配列（すなわち、プローブ結合領域又はそれに相補的な領域の塩基配列）が欠損しているか他の塩基配列に置換されている、塩基配列を含む。ここで、他の塩基配列は、該他の塩基配列又はその相補的配列に標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできないように設計されている。いいかえれば、他の塩基配列は、標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできない塩基配列であって、標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできない相補的配列を有する塩基配列からなる。競合オリゴヌクレオチドの設計において、プローブ設計領域の塩基配列は欠失させることが好ましい。ある塩基配列（例えば、上記他の塩基配列又はその相補的配列）に標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできるか否かは、融解曲線解析等の公知の手法により、容易に判断することができる。

上記他の塩基配列は特に限定されず、その塩基配列又はその相補的配列に標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできなければ、いかなる塩基配列であってもよい。他の塩基配列は、例えば、連続した複数のアデニンからなるポリＡ（ポリアデニル酸）配列であってもよく、又はプローブ設計領域の塩基配列から１つ以上の塩基を欠失させて得られる塩基配列であってもよい。

競合オリゴヌクレオチドにおいて、プライマー設計領域の塩基配列に対応する塩基配列以外の塩基配列における塩基は、欠失させるか他の塩基に置換してもよい。また、標的塩基配列にウラシルが存在する場合、競合オリゴヌクレオチドにおける対応するウラシルは、チミンに置換してもよい。さらに、競合オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端には、１以上の塩基が付加されていてもよい。

核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）反応、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応、又は核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）反応であってよい。核酸増幅反応は、好ましくはＰＣＲ又はＬＡＭＰ反応である。

ここで、図１を参照しながら、核酸増幅反応がＰＣＲである場合に用いられる上記（ａ）フォワードプライマー、（ｂ）リバースプライマー（ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｄ）競合オリゴヌクレオチドについて説明する。

核酸増幅反応がＰＣＲ反応であり、かつフォワードプライマーとリバースプライマーをそれぞれ一種類ずつ用いる場合、センス配列におけるプライマー設計領域として、５’末端側から３’末端側の順に任意の領域Ｆ及びＢｃを設定することができ、アンチセンス配列におけるプライマー設計領域として、３’末端側から５’末端側の順に任意の領域Ｆｃ及びＢを設定することできる。なお、図１は、標的塩基配列がセンス配列である場合を示すが、標的塩基配列はアンチセンス配列であってもよい。

当業者は、領域Ｆ及びＢｃとして適当な領域を、公知の文献等の開示に基づいて適宜選択することができる。各領域の長さ（塩基数）は、例えば、１０～１００塩基、１０～５０塩基、又は１５～３０塩基であってよい。

領域Ｂｃはリバースプライマー結合領域であり、領域Ｆｃはフォワードプライマー結合領域である。プローブ結合領域は、領域ＦとＢｃの間又は領域ＦｃとＢの間の任意の位置に設定される。図１において、プローブ結合領域は領域ＦｃとＢの間に存在する。

ＰＣＲによる核酸増幅において、フォワードプライマーは、領域Ｆｃと相補的な塩基配列Ｆ’を有する。図１に示すように、塩基配列Ｆ’は好ましくは領域Ｆと同じ配列である。ただし、領域Ｆにウラシルが存在する場合、フォワードプライマーにおける対応するウラシルは、チミンに置換されてもよい。

ＰＣＲによる核酸増幅において、リバースプライマーは、領域Ｂｃと相補的な塩基配列Ｂ’を有する。図１に示すように、塩基配列Ｂ’は好ましくは領域Ｂと同じ配列である。ただし、領域Ｂにウラシルが存在する場合、リバースプライマーにおける対応するウラシルは、チミンに置換されてもよい。

標識オリゴヌクレオチドプローブについては、上述のとおりである。図１において、標識オリゴヌクレオチドプローブは、領域ＦｃとＢの間に存在するプローブ結合領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。

競合オリゴヌクレオチドについては、上述のとおりである。図１において、競合オリゴヌクレオチドは、標的塩基配列からプローブ結合領域に相補的な領域の塩基配列を欠失させた塩基配列であるが、競合オリゴヌクレオチドはこの態様に限定されない。

次に、図２を参照しながら、核酸増幅反応がＬＡＭＰ反応である場合に用いられる上記（ａ）フォワードプライマー、（ｂ）リバースプライマー（ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｄ）競合オリゴヌクレオチドについて説明する。

核酸増幅反応がＬＡＭＰ反応である場合、センス配列におけるプライマー設計領域は、５’末端側から３’末端側の順に、領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃと呼ばれ、アンチセンス配列におけるプライマー設計領域は、３’末端側から５’末端側の順に、領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３と呼ばれる。領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃの塩基配列は、それぞれ領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３に相補的である。なお、図２は、標的塩基配列がセンス配列である場合を示すが、標的塩基配列はアンチセンス配列であってもよい。

当業者は、領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃとして適当な領域を、公知の文献等の開示に基づいて適宜選択することができる。各領域の長さ（塩基数）は、例えば、５～１００塩基、１０～５０塩基、又は１５～２８塩基であってよい。領域Ｆ２の５’末端から領域Ｂ２ｃの３’末端までの距離は、例えば１２０～１８０塩基であってよい。領域Ｆ２と領域Ｆ３との間、及び領域Ｂ２ｃと領域Ｂ３ｃとの間の距離は、例えば、０～２０塩基であってよい。領域Ｆ２の５’末端から領域Ｆ１の５’末端までの距離、及び領域Ｂ２の５’末端から領域Ｂ１の５’末端までの距離は、例えば４０～６０塩基であってよい。領域Ｆ１から領域Ｂ１ｃの間の距離は特に限定されず、領域Ｆ１の３’末端と領域Ｂ１ｃの５’末端とは、直接結合していてもよい。

領域Ｂ２ｃ及びＢ３ｃはリバースプライマー結合領域であり、領域Ｆ３ｃ及びＦ２ｃはフォワードプライマー結合領域である。プローブ結合領域は、領域Ｆ２とＢ２ｃの間又は領域Ｆ２ｃとＢ２の間の任意の位置に設定される。プローブ結合領域は、好ましくは領域Ｆ２とＦ１の間、領域Ｂ１ｃとＢ２ｃの間、領域Ｆ２ｃとＦ１ｃの間、又は領域Ｂ１とＢ２の間に設定される。図２において、プローブ結合領域は領域Ｂ１とＢ２の間に存在する。

ＬＡＭＰ反応による核酸増幅においては、フォワードプライマーとしてＦＩＰプライマー及びＦ３プライマーが設計され、リバースプライマー（バックワードプライマーともいう）としてＢＩＰプライマー及びＢ３プライマーが設計される。これらプライマーは公知のプライマーである。

ＦＩＰプライマーは、領域Ｆ１に相補的な塩基配列Ｆ１ｃ’を５’末端に有し、かつ領域Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２’を３’末端に有する。図２に示すように、塩基配列Ｆ１ｃ’は好ましくは領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列であり、塩基配列Ｆ２’は好ましくは領域Ｆ２と同じ塩基配列である。ただし、領域Ｆ１ｃ又は領域Ｆ２にウラシルが存在する場合、ＦＩＰプライマーにおける対応するウラシルは、チミンに置換されてもよい。塩基配列Ｆ１ｃ’と、塩基配列Ｆ２’との間には、リンカーとなる１以上の塩基が存在しても存在しなくてもよい。リンカーとなる塩基は、１～５００塩基、１～１００塩基、又は１０～７０塩基であってよい。

Ｆ３プライマーは、領域Ｆ３ｃに相補的な塩基配列Ｆ３’を有する。図２に示すように、塩基配列Ｆ３’は好ましくは領域Ｆ３と同じ塩基配列である。ただし、領域Ｆ３にウラシルが存在する場合、Ｆ３プライマーにおける対応するウラシルは、チミンに置換されてもよい。

ＢＩＰプライマーは、領域Ｂ１に相補的な塩基配列Ｂ１ｃ’を５’末端に有し、かつ領域Ｂ２ｃに相補的な塩基配列Ｂ２’を３’末端に有する。図２に示すように、塩基配列Ｂ１ｃ’は好ましくは領域Ｂ１ｃと同じ塩基配列であり、塩基配列Ｂ２’は好ましくは領域Ｂ２と同じ塩基配列である。ただし、領域Ｂ１ｃ又は領域Ｂ２にウラシルが存在する場合、ＢＩＰプライマーにおける対応するウラシルは、チミンに置換されてもよい。塩基配列Ｂ１ｃ’と、塩基配列Ｂ２’との間には、リンカーとなる１以上の塩基が存在しても存在しなくてもよい。リンカーとなる塩基は、１～５００塩基、１～１００塩基、又は１０～７０塩基であってよい。

Ｂ３プライマーは、領域Ｂ３ｃに相補的な塩基配列Ｂ３’を有する。図２に示すように、塩基配列Ｂ３’は好ましくは領域Ｂ３と同じ塩基配列である。ただし、領域Ｂ３にウラシルが存在する場合、Ｂ３プライマーにおける対応するウラシルは、チミンに置換されてもよい。

標識オリゴヌクレオチドプローブについては、上述のとおりである。図２において、標識オリゴヌクレオチドプローブは、領域Ｂ１とＢ２の間に存在するプローブ結合領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。

競合オリゴヌクレオチドについては、上述のとおりである。図２において、競合オリゴヌクレオチドは、標的塩基配列からプローブ結合領域に相補的な領域の塩基配列を欠失させた塩基配列であるが、競合オリゴヌクレオチドはこの態様に限定されない。

本発明の本側面に係る試料中の標的塩基配列を検出する方法において、試料には、上記（ａ）～（ｄ）とともに、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ）等、各種核酸増幅反応を行うための公知の試薬を混合してもよい。標的塩基配列がＲＮＡの塩基配列の場合、試料には、逆転写酵素をさらに混合してもよい。各種核酸増幅反応を行うためのその他の公知の試薬としては、例えば、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液又は塩、並びにジチオトレイトール（ＤＴＴ）等の酵素又は標的核酸配列を安定化する保護剤が挙げられる。

ＤＮＡポリメラーゼは、核酸増幅反応の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｓａ ＤＮＡポリメラーゼ、又は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントであってよい。

逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する活性を有する酵素であれば特に限定されず、例えば、天然の若しくは組み換えトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する天然の若しくは組み換え逆転写酵素であってよい。ＤＮＡポリメラーゼとしてＢｃａ（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ等、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有する酵素を用いる場合、別途の逆転写酵素を用いなくてもよい。

試料を、（ａ）一種以上のフォワードプライマー、（ｂ）一種以上のリバースプライマー、（ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｄ）競合オリゴヌクレオチドと混合して核酸増幅反応を行う工程は、例えば、試料とこれら（ａ）～（ｄ）を含む反応液をインキュベートすることにより行うことができる。反応液は、核酸増幅反応を行うための上述の公知の試薬をさらに含んでよい。インキュベーションの温度は、各プライマー及び標識オリゴヌクレオチドプローブが標的塩基配列に特異的にアニール又はハイブリダイズできる温度であれば特に限定されず、インキュベーションの温度及び時間（すなわち、反応の温度及び時間）は、核酸増幅反応の種類、ＤＮＡポリメラーゼの種類、プライマーの融解温度（Ｔｍ値）に応じて適宜設定できる。例えばＬＡＭＰ反応の場合、通常６５℃以下で６０分以下である。

反応溶液中の各プライマーの濃度は、核酸増幅反応の種類に応じて適宜調整される。例えばＰＣＲの場合、反応液中のリバースプライマーの濃度及びフォワードプライマーの濃度は、通常０．１～１μＭである。ＬＡＭＰ反応の場合、反応溶液中のＦＩＰプライマーの濃度及びＢＩＰプライマーの濃度は、通常０．８～２．４μＭである。反応溶液中のＦ３プライマーの濃度及びＢ３プライマーの濃度は、通常０．１～０．３μＭである。ＦＩＰプライマーの濃度及びＢＩＰプライマーの濃度は、通常、それぞれＦ３プライマーの濃度及びＢ３プライマーの濃度の８倍以上である。

反応液中の標識オリゴヌクレオチドプローブの濃度は、例えば、０．０１～０．５μＭ、０．０２～０．２５μＭ、又は０．０４～０．１μＭであってよい。

反応液中の競合オリゴヌクレオチドの濃度は、試料の量（具体的には試料中の核酸の濃度）及び標的塩基配列の目標とする検出感度に応じて適宜調整される。競合オリゴヌクレオチドの濃度が高いほど、標的塩基配列の検出感度が低くなり、夾雑物、類縁菌等に由来する塩基配列の検出がより抑制される。

本発明の本側面に係る試料中の標的塩基配列を検出する方法は、核酸増幅反応の増幅産物を標識オリゴヌクレオチドプローブの標識物質に基づいて検出する工程をさらに含んでよい。増幅産物の存在が検出された場合、試料中に標的塩基配列が存在すると判定することができる。一方、増幅産物の存在が検出されなかった場合、試料中に標的塩基配列が存在しないと判定することができる。

増幅産物の検出は、核酸増幅反応終了後に行ってもよく、反応中にリアルタイムで行ってもよい。

標識オリゴヌクレオチドプローブが蛍光プローブである場合、核酸増幅反応の増幅産物を検出する工程では、蛍光プローブから発せられる蛍光の強度に基づいて増幅産物を検出することができる。例えば、蛍光プローブとして蛍光消光プローブを用いた場合、蛍光消光プローブから発せられる蛍光は標的塩基配列又はその相補的配列中のプローブ結合領域とハイブリダイズすることにより消光するため、蛍光の減少を測定することで増幅産物を定量又は検出できる。また、蛍光プローブとしてＭＧＢプローブを用いた場合、ＭＧＢプローブが標的塩基配列又はその相補的配列中のプローブ結合領域とハイブリダイズしてＤＮＡポリメラーゼにより切断されると、蛍光色素から蛍光が発せられるため、蛍光の上昇を測定することで増幅産物を定量又は検出できる。

本発明の本側面に係る試料中の標的塩基配列を検出する方法においては、競合オリゴヌクレオチドの存在下で核酸増幅反応を行うことで、標的塩基配列の検出感度が低下し、その結果、標的塩基配列よりも量の少ない夾雑物、類縁菌等に由来する塩基配列の増幅を抑制することができる。また、競合オリゴヌクレオチドの濃度を調整することで標的塩基配列の検出感度を調整することができるため、目標の検出感度ごとに、プライマー、プライマー以外の成分、又はそれらの濃度を変更する必要がなく、検出感度の調整が簡便に行える。

本発明の一側面は、核酸増幅反応を用いた標的塩基配列の検出において該標的塩基配列の検出感度を低下させる方法であるといえ、かかる方法は、試料を、（ａ）一種以上のフォワードプライマー、（ｂ）一種以上のリバースプライマー、（ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｄ）競合オリゴヌクレオチドと混合して核酸増幅反応を行う工程を含む。試料を上記（ａ）～（ｄ）競合オリゴヌクレオチドと混合して核酸増幅反応を行う工程の詳細は、上述のとおりである。かかる方法によれば、競合オリゴヌクレオチド濃度依存的に、標的塩基配列の検出感度を低下させることできる。

本発明の本側面に係る、核酸増幅反応を用いた標的塩基配列の検出において該標的塩基配列の検出感度を低下させる方法は、核酸増幅反応の増幅産物を標識オリゴヌクレオチドプローブの標識物質に基づいて検出する工程をさらに含んでよい。核酸増幅反応の増幅産物を検出する工程の詳細は上述のとおりである。

本発明の別の側面は、上記（ａ）一種以上のフォワードプライマー、（ｂ）一種以上のリバースプライマー、（ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｄ）競合オリゴヌクレオチドを含む、標的塩基配列を検出するためのキットである。かかるキットは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液、塩、保護剤等、核酸増幅反応を行うための上記公知の試薬さらに含んでよい。

＜実施例１＞
プレミックス１２．５μＬ、プライマーミックス２．０μＬ、Ｑプローブ０．５μＬ、及び競合オリゴヌクレオチド１μＬの混合液に、試料として配列番号１で示される標的塩基配列（ｒｅｓ１の部分配列）からなるＤＮＡ１μＬを加え、反応液量を精製水で２５μＬに調整した。試料は、反応液に添加前するにサーマルサイクラーを用いて９０℃で４分加熱した。反応液の組成を表１に示し、プライマー、Ｑプローブ、及び競合オリゴヌクレオチドの塩基配列を表２に示す。Ｑプローブの３’末端はＢＯＤＩＰＹ（登録商標） ＦＬ（ＢＰＦＬ）で標識した。

標的塩基配列（配列番号１）を図３の（Ａ）に示す。図３の（Ａ）中、プライマー設計領域を下線で示し、Ｑプローブと同じ塩基配列を四角で囲んだ。標的塩基配列及び競合オリゴヌクレオチドの塩基配列の概略を図３の（Ｂ）に示す。競合オリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ－１（配列番号７）は、標的塩基配列からＱプローブと同じ塩基配列（２６塩基）を欠失させて得られるオリゴヌクレオチドである。競合オリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ－１－ｃｏｍｐｌｅ（配列番号８）は、Ｏｌｉｇｏ－１に相補的なオリゴヌクレオチドである。

リアルタイムＰＣＲ装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（ロシュ製）を用いて、６２．５℃で６０分ＬＡＭＰ反応を行った。Ｑプローブの消光による蛍光強度の減少をモニタリングし（励起波長４６５ｎｍ、検出波長５１０ｎｍ）、所定の蛍光強度に減少するまでに要する時間（検出時間）を測定した。競合オリゴヌクレオチドとしてＯｌｉｇｏ－１を用いた場合の結果を表３に示す。競合オリゴヌクレオチドとして、Ｏｌｉｇｏ－１、Ｏｌｉｇｏ－１－ｃｏｍｐｌｅ、又はこれらの混物を用いた場合の結果を表４に示す。

本明細書中の表において、「競合オリゴ」は競合オリゴヌクレオチドを意味し、「Ｎ．Ｄ．」は不検出を意味する。表３及び４に示すように、Ｑプローブの塩基配列を有さない競合オリゴヌクレオチドを添加することで、競合オリゴヌクレオチドの濃度依存的に標的塩基配列の検出感度が低下した。

＜実施例２＞
ヒト乳癌細胞ＨＣＣ１９５４からＱｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＤＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）５μＬ、Ｆプライマー溶液０．１μＬ、Ｂプライマー溶液０．１μＬ、ＭＧＢプローブ０．１μＬ、及び競合オリゴヌクレオチド１μＬの混合液に、試料として、標的塩基配列（ＨＥＲ２遺伝子の一部）を含むＤＮＡの抽出液１μＬを加え、反応液量を精製水で１０μＬに調整した。反応液の組成を表５に示し、プライマー、ＭＧＢプローブ、及び競合オリゴヌクレオチドの塩基配列を表６に示す。ＭＧＢプローブは、５’末端にＦＡＭ（登録商標）を有し、３’末端にＥｃｌｉｐｓｅ（登録商標）クエンチャー（ＭＧＢＥＱ）を有する。

標的塩基配列を含むＨＥＲ２遺伝子の塩基配列（配列番号９）を図４の（Ａ）に示す。図４の（Ａ）中、プライマー設計領域を下線で示し、プローブと同じ塩基配列を四角で囲んだ。標的塩基配列及び競合オリゴヌクレオチドの配列の概略を図４の（Ｂ）に示す。競合オリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ－ｄｅｌｅｔｉｏｎ（配列番号１３）は、標的塩基配列からＭＧＢプローブと同じ塩基配列（２０塩基）を欠失させて得られるオリゴヌクレオチドである。競合オリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ－ＰｏｌｙＡ（配列番号１４）は、標的塩基配列におけるＭＧＢプローブと同じ塩基配列をポリＡ（２０塩基）に置換して得られるオリゴヌクレオチドである。

リアルタイムＰＣＲ解析システムＣＦＸ９６（バイオ・ラッド社製）を用いてＰＣＲを行った（９５℃で１分、次いで９５℃で１５秒と６０℃で６０秒を５０サイクル）。ＭＧＢプローブによる蛍光をモニタリングし（励起波長４５０～４９０ｎｍ、検出波長５１５～５３０ｎｍ）、所定の蛍光強度が観察されるまでに要するサイクル数（Ｃｔ値）を測定した。結果を表７に示す。

表７に示すように、ＭＧＢプローブ配列を有さない又はＭＧＢプローブ配列が別の塩基配列に置換された競合オリゴヌクレオチドを添加することで、競合オリゴヌクレオチドの濃度依存的に標的塩基配列の検出感度が低下した。

＜実施例３＞
ＤＮＡ抽出液として、ＨＥＲ２遺伝子が増幅した細胞（すなわちＨＥＲ２陽性細胞）ＨＣＣ１９５４のＤＮＡ抽出液、ＨＥＲ２遺伝子が増幅していない細胞（すなわちＨＥＲ２陰性細胞）ＭＣＦ７のＤＮＡ抽出液、又はこれらの混合液を用いて、実施例２と同様にしてＰＣＲ反応を行い、ＭＧＢプローブによる蛍光をモニタリングした。ただし、競合オリゴヌクレオチドの濃度は１０^４又は１０^５コピー／反応液に変更し、ＤＮＡの濃度は０．１ｎｇ又は１．０ｎｇ／反応液に変更し、ＰＣＲのサイクル数は４０サイクルに変更した。所定の強度以上の蛍光が検出された場合を「ＨＥＲ２陽性」（＋）と判定し、所定の強度以上の蛍光が検出されなかった場合を「ＨＥＲ２陰性」（－）と判定した。判定結果を表８に示す。

本来、ＨＥＲ２陽性細胞であるＨＣＣ１９５４のＤＮＡ抽出液は「ＨＥＲ２陽性」と判定され、ＨＥＲ２陰性細胞であるＭＣＦ７のＤＮＡ抽出液は「ＨＥＲ２陰性」と判定されるべきであるが、競合オリゴヌクレオチドを用いなかった場合、ＨＣＣ１９５４のＤＮＡ抽出液とＭＣＦ７のＤＮＡ抽出液の両方が「ＨＥＲ２陽性」と判定された。これは、ＰＣＲが高感度であり、ＭＣＦ７に存在する微量のＨＥＲ２を検出してしまうためである。一方、競合オリゴヌクレオチドを用いた場合、ＨＣＣ１９５４のＤＮＡ抽出液は「ＨＥＲ２陽性」と、ＭＣＦ７のＤＮＡ抽出液は「ＨＥＲ２陰性」と、正しく判定された。これは、競合オリゴヌクレオチドの添加により、ＨＥＲ２の検出感度が低下し、ＭＣＦ７に存在する微量のＨＥＲ２が検出されなくなったためである。

＜実施例４＞
プレミックス３．７μＬ、プライマーミックス０．４μＬ、Ｑプローブ０．２μＬ、及び競合オリゴヌクレオチド１μＬの混合液に、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）又はＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＲＮＡ抽出液１μＬを加え、反応液量を精製水で１０μＬに調整した。反応液の組成を表９に示し、プライマー、Ｑプローブ、及び競合オリゴヌクレオチドの塩基配列を表１０に示す。表中、「ｎＣＶ１９」はＳＡＲＳコロナウイルス２を表し、「ＳＡＲＳ」はＳＡＲＳコロナウイルスを表す。Ｑプローブの３’末端はＢＯＤＩＰＹ（登録商標） ＦＬ（ＢＰＦＬ）で標識した。プライマーは、ＳＡＲＳコロナウイルス２のＮ遺伝子の一部を増幅させるように設計した。

ＳＡＲＳコロナウイルス２（以下、ｎＣＶ１９という）のＮ遺伝子における標的塩基配列（配列番号１５）と、ＳＡＲＳコロナウイルス（以下、ＳＡＲＳという）のＮ遺伝子における対応する塩基配列（配列番号１６）とのアライメントを図５の（Ａ）に示す。ただし、ウラシルはチミンに置換してある。図５の（Ａ）中、プライマー設計領域を下線で示し、プローブ結合領域を四角で囲んだ。標的塩基配列及び競合オリゴヌクレオチドの塩基配列の概略を図５の（Ｂ）に示す。本実施例で用いる競合オリゴヌクレオチド（配列番号２２）は、ｎＣＶ１９のＮ遺伝子における標的塩基配列からＱプローブの結合領域（３０塩基）を欠失させて得られるオリゴヌクレオチドである。

ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩを用いて、６３℃で６０分ＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。Ｑプローブの消光による蛍光強度の減少をモニタリングし（励起波長４６５ｎｍ、検出波長５１０ｎｍ）、所定の蛍光強度に減少するまでに要する時間（検出時間）を測定した。結果を表１１に示す。

図５の（Ａ）に示すように、新型コロナウイルスであるｎＣＶ１９のＮ遺伝子はＳＡＲＳのＮ遺伝子と類似しているため、ｎＣＶ１９のＮ遺伝子に対するプライマー又はプローブは、ＳＡＲＳのＮ遺伝子との交差反応性を示す場合がある。表１１に示すよう、競合オリゴヌクレオチドを用いなかった場合、ｎＣＶ１９のＮ遺伝子中の標的塩基配列に対するプライマー及びプローブがＳＡＲＳのＮ遺伝子中の対応する塩基配列と交差反応し、ＳＡＲＳのＮ遺伝子中の上記対応する塩基配列の増幅が認められた。一方、競合オリゴヌクレオチドを用いた場合、ｎＣＶ１９のＮ遺伝子中の標的塩基配列に対するプライマー及びプローブはＳＡＲＳのＮ遺伝子中の対応する塩基配列と交差反応せず、ｎＣＶ１９の標的塩基配列のみが増幅された。

Claims (9)

1. 試料中の標的塩基配列を検出する方法であって、
   試料を、
   （ａ）一種以上のフォワードプライマー、
   （ｂ）一種以上のリバースプライマー、
   （ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び
   （ｄ）競合オリゴヌクレオチド
   と混合して核酸増幅反応を行う工程を含み、
   前記標的塩基配列とその相補的配列のうち、センス配列は、各前記リバースプライマーがアニールする任意のリバースプライマー結合領域を有し、アンチセンス配列は、各前記フォワードプライマーがアニールする任意のフォワードプライマー結合領域を有し、
   前記センス配列における最も５’末端寄りの前記リバースプライマー結合領域と、前記センス配列における領域であって、前記アンチセンス配列における最も５’末端寄りの前記フォワードプライマー結合領域に相補的な領域との間、又は前記アンチセンス配列における最も５’末端寄りの前記フォワードプライマー結合領域と、前記アンチセンス配列における領域であって、前記センス配列における最も５’末端寄りの前記リバースプライマー結合領域に相補的な領域との間には、前記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする任意のプローブ結合領域が存在し、
   前記標識オリゴヌクレオチドプローブは、前記プローブ結合領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、
   前記競合オリゴヌクレオチドは、前記標的塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列であって、ただし、
   （ｉ）前記プローブ結合領域に対応する又は相補的な塩基配列は、欠損しているか他の塩基配列に置換されており、該他の塩基配列は、該他の塩基配列又はその相補的配列に前記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできないように設計されており、
   （ｉｉ）前記一種以上のフォワードプライマー又は前記一種以上のリバースプライマーに含まれる塩基配列に対応する塩基配列及びそれらに相補的な塩基配列以外の塩基配列における塩基は、欠失されているか他の塩基に置換されていてもよく、かつ
   （ｉｉｉ）前記標的塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい
   塩基配列を含む、方法。
2. 前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応又はループ媒介等温増幅反応である、請求項１に記載の方法。
3. 前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応であり、
   前記一種以上のフォワードプライマーが一種のフォワードプライマーであり、
   前記一種以上のリバースプライマーが一種のリバースプライマーである、請求項２に記載の方法。
4. 前記核酸増幅反応がループ媒介等温増幅反応であり、
   前記一種以上のフォワードプライマーが、ＦＩＰプライマー及びＦ３プライマーであり、
   前記一種以上のリバースプライマーが、ＢＩＰプライマー及びＢ３プライマーであり、
   前記センス配列は、５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃをこの順に有し、領域Ｂ２ｃ及びＢ３ｃは前記リバースプライマー結合領域であり、
   前記アンチセンス配列は、３’末端から５’末端の方向に、前記領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃにそれぞれ相補的な領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に有し、前記領域Ｆ３ｃ及びＦ２ｃは前記フォワードプライマー結合領域であり、
   前記ＦＩＰプライマーは、前記領域Ｆ１に相補的な塩基配列を５’末端に有し、かつ前記領域Ｆ２ｃに相補的な塩基配列を３’末端に有し、
   前記Ｆ３プライマーは、前記領域Ｆ３ｃに相補的な塩基配列を有し、
   前記ＢＩＰプライマーは、前記領域Ｂ１に相補的な塩基配列を５’末端に有し、かつ前記領域Ｂ２ｃに相補的な塩基配列を３’末端に有し、
   前記Ｂ３プライマーは、前記領域Ｂ３ｃに相補的な塩基配列を有する、請求項２に記載の方法。
5. 前記プローブ結合領域が、前記領域Ｆ２とＦ１の間、前記領域Ｂ１ｃとＢ２ｃの間、前記領域Ｆ２ｃとＦ１ｃの間、又は前記領域Ｂ１とＢ２の間に存在する、請求項４に記載の方法。
6. 前記核酸増幅反応の増幅産物を、前記標識オリゴヌクレオチドプローブの標識物質に基づいて検出する工程をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記標識オリゴヌクレオチドプローブが蛍光プローブであり、前記核酸増幅反応の増幅産物を検出する前記工程において、前記蛍光プローブから発せられる蛍光の強度に基づいて前記増幅産物を検出する、請求項６に記載の方法。
8. 核酸増幅反応を用いた標的塩基配列の検出において該標的塩基配列の検出感度を低下させる方法であって、
   試料を、
   （ａ）一種以上のフォワードプライマー、
   （ｂ）一種以上のリバースプライマー、
   （ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び
   （ｄ）競合オリゴヌクレオチド
   と混合して核酸増幅反応を行う工程を含み、
   前記標的塩基配列とその相補的配列のうち、センス配列は、各前記リバースプライマーがアニールする任意のリバースプライマー結合領域を有し、アンチセンス配列は、各前記フォワードプライマーがアニールする任意のフォワードプライマー結合領域を有し、
   前記センス配列における最も５’末端寄りの前記リバースプライマー結合領域と、前記センス配列における領域であって、前記アンチセンス配列における最も５’末端寄りの前記フォワードプライマー結合領域に相補的な領域との間、又は前記アンチセンス配列における最も５’末端寄りの前記フォワードプライマー結合領域と、前記アンチセンス配列における領域であって、前記センス配列における最も５’末端寄りの前記リバースプライマー結合領域に相補的な領域との間には、前記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする任意のプローブ結合領域が存在し、
   前記標識オリゴヌクレオチドプローブは、前記プローブ結合領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、
   前記競合オリゴヌクレオチドは、前記標的塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列であって、ただし、
   （ｉ）前記プローブ結合領域に対応する又は相補的な塩基配列は、欠損しているか他の塩基配列に置換されており、該他の塩基配列は、該他の塩基配列又はその相補的配列に前記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできないように設計されており、
   （ｉｉ）前記一種以上のフォワードプライマー又は前記一種以上のリバースプライマーに含まれる塩基配列に対応する塩基配列及びそれらに相補的な塩基配列以外の塩基配列における塩基は、欠失されているか他の塩基に置換されていてもよく、かつ
   （ｉｉｉ）前記標的塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい
   塩基配列を含む、方法。
9. 標的塩基配列を検出するためのキットであって、
   （ａ）一種以上のフォワードプライマー、
   （ｂ）一種以上のリバースプライマー、
   （ｃ）標識オリゴヌクレオチドプローブ、及び
   （ｄ）競合オリゴヌクレオチド
   を含み、
   前記標的塩基配列とその相補的配列のうち、センス配列は、各前記リバースプライマーがアニールする任意のリバースプライマー結合領域を有し、アンチセンス配列は、各前記フォワードプライマーがアニールする任意のフォワードプライマー結合領域を有し、
   前記センス配列における最も５’末端寄りの前記リバースプライマー結合領域と、前記センス配列における領域であって、前記アンチセンス配列における最も５’末端寄りの前記フォワードプライマー結合領域に相補的な領域との間、又は前記アンチセンス配列における最も５’末端寄りの前記フォワードプライマー結合領域と、前記アンチセンス配列における領域であって、前記センス配列における最も５’末端寄りの前記リバースプライマー結合領域に相補的な領域との間には、前記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする任意のプローブ結合領域が存在し、
   前記標識オリゴヌクレオチドプローブは、前記プローブ結合領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、
   前記競合オリゴヌクレオチドは、前記標的塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列であって、ただし、
   （ｉ）前記プローブ結合領域に対応する又は相補的な塩基配列は、欠損しているか他の塩基配列に置換されており、該他の塩基配列は、該他の塩基配列又はその相補的配列に前記標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズできないように設計されており、
   （ｉｉ）前記一種以上のフォワードプライマー又は前記一種以上のリバースプライマーに含まれる塩基配列に対応する塩基配列及びそれらに相補的な塩基配列以外の塩基配列における塩基は、欠失されているか他の塩基に置換されていてもよく、かつ
   （ｉｉｉ）前記標的塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい
   塩基配列を含む、キット。

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