JP4699384B2 - Ｈｉｖ−１およびｈｉｖ−２の核酸を検出するための組成物、方法およびキット - Google Patents

Description

（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願第６０／５３１，１８３号（２００３年１２月１９日出願）および同第６０／５８４，７０６号（２００４年６月３０日出願）の利益を主張する。これらの先願の開示全体は、本明細書に参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２の核酸またはＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の組み合わせの核酸を検出することができる個々のアッセイに関する。本発明はさらに、２種類の分析物と交差反応するプローブおよび／またはプライマーを用いて、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２両方の核酸を検出することができる多重アッセイに関する。

（政府の発明の権利）
本明細書に開示される本発明の特定の局面は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのＮａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅとの契約Ｎ０１−ＨＢ−６７１３０およびＮ０１−ＨＢ−０７１４８の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明のこれらの局面において一定の権利を有する。

（発明の背景）
ＨＩＶ／ＡＩＤＳの汎発流行は、主にＨＩＶ−１の感染に起因するが、異なるレトロウイルスが、ＡＩＤＳの別の原因として明らかになった。このいわゆる「ＨＩＶ−２」ウイルスは、１９８６年に西アフリカのＡＩＤＳ患者から初めて単離され、その翌年、米国で初めて感染因子として検出された。１９９４年の終わりまで、米国では、１００症例未満のＨＩＶ−２が報告された。このように表面上は数が少ないにも拘わらず、ＨＩＶ−２は、数が増加しつつある免疫抑制性疾患における病因因子として同定されており、この免疫抑制性疾患は、ＨＩＶ−１感染から生じるＡＩＤＳ症例とは臨床的に区別不能である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。ＨＩＶ−２は、その形態およびＣＤ４^＋細胞に対する親和性がＨＩＶ−１に関連するものの、明らかに異なるウイルスであり、単なるＨＩＶ−１のエンベロープ改変体ではない。

実際に、ＨＩＶ−２は、ＨＩＶ−１とは関連性が全く遠く、ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質においては約５０％のアミノ酸保存であり、ｅｎｖ遺伝子産物においては、３０％未満の保存でしかないので、その存在は、ＨＩＶ−１感染を検出するために使用されている血清学的アッセイによって効率的に検出されない（非特許文献５；非特許文献６）。結果として、ＨＩＶ−２ウイルス核酸を特異的に検出するために使用され得る核酸プローブを開発しようとする試みがなされてきた。

興味深いことに、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２両方のゲノムは、異なる分離株（ｉｓｏｌａｔｅ）の中で実質的な配列不均一性を示す。この不均一性の結果として、ＨＩＶ−１の全ての分離株またはＨＩＶ−２の全ての分離株の間での絶対的な配列保存の実質的な領域を見出すことは不可能であった（特許文献１を参照のこと）。実際に、独特のポリヌクレオチド配列を有する多くのウイルス分離株が、これらのウイルスの各々について同定されており、信頼性がありかつ効率的な核酸試験のためのプローブの構築をさらに複雑にしている要因である。

ＨＩＶ−１と同様に、ＨＩＶ−２もまた、体液（血液および血漿が挙げられる）の交換を介して伝播するので、ウイルスに対する抗体が検出できるようになるかまたは、感染個体で症状が明らかになる前に、感染した体液を検出できることは重要である。ＨＩＶ−２感染体液（例えば、輸血の間の全血または血漿）または提供された血液または血漿に由来する製剤を他の方法で受容し得る患者を保護するために、献血された体液中のウイルスの存在を検出して、このような手順または製剤におけるその使用を防止することが特に重要である。ＨＩＶ−２を検出するために使用される手順および試薬は、感染の初期段階の間に、提供者であるかもしれない感染個体に存在し得る比較的少数のウイルスコピーを検出することができることもまた重要である。

ＨＩＶ−２を検出するためのアッセイおよび試薬は、例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５；特許文献６および特許文献７；ならびに特許文献８、特許文献１に以前に開示された。
欧州特許出願公開第０ ８８７ ４２７号明細書 米国特許第６，０２０，１２３号明細書 米国特許第５，６８８，６３７号明細書 米国特許第５，５４５，７２６号明細書 米国特許第５，３１０，６５１号明細書 欧州特許第０４０４６２５号明細書 欧州特許第０２３９４２５号明細書 欧州特許出願公開第１０２６２３６号明細書 Ｋａｎｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８６）２３２：２３８ Ｋａｎｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８７）２３６：８２７ Ｃｌａｖｅｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８６）２３３：３４３ Ｃｌａｖｅｌら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８７）３１６：１１８０ Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅ ＮＴ，ＡＩＤＳ （１９９３）７：１ Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ ＤＭ，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．（１９９３）１１８：２１１

（発明の要旨）
本発明の第１の局面は、試験サンプルが、ＨＩＶ−１分析物核酸またはＨＩＶ−２分析物核酸を含むかどうかを決定するための方法に関する。本発明の方法は、試験サンプルを、一対の交差反応性プライマーと合わせるための第１の工程を包含する。続いて、試験サンプル中に存在し得るＨＩＶ−１分析物核酸の任意の第１の配列、および試験サンプル中に存在し得るＨＩＶ−２分析物核酸の任意の第１の配列を、インビトロ核酸増幅反応において増幅するための工程が存在する。この核酸増幅反応は、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸を同時に増幅し得る、一対の交差反応性プライマーを使用する。この反応産物は、第１のＨＩＶ−１アンプリコンおよび第１のＨＩＶ−２アンプリコンを含み得る。続いて、増幅工程において合成され得る、任意の第１のＨＩＶ−１アンプリコンおよび任意の第１のＨＩＶ−２アンプリコンを、単回のハイブリダイゼーション反応において検出するための工程が存在する。ハイブリダイゼーション反応における陽性の結果は、この試験サンプルが、ＨＩＶ−１分析物核酸またはＨＩＶ−２分析物核酸の少なくともいずれか一方を含んだことを示す。好ましい実施形態において、増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、ＴＭＡ反応、ＮＡＳＢＡ反応またはＰＣＲ反応のいずれかである。別の好ましい実施形態において、検出工程における単回のハイブリダイゼーション反応は、第１のＨＩＶ−１アンプリコンまたは第１のＨＩＶ−２アンプリコンのいずれかにハイブリダイズし得る交差反応プローブの使用を包含する。

より好ましくは、検出工程におけるハイブリダイゼーション反応は、さらに、第１のＨＩＶ−１アンプリコンにのみハイブリダイズし、第１のＨＩＶ−２アンプリコンにはハイブリダイズしないＨＩＶ−１特異的プローブを含む。この場合、交差反応性プローブのハイブリダイゼーションを示す陽性シグナルがあり、かつ、ＨＩＶ−１特異的プローブのハイブリダイゼーションを示す陽性シグナルがないと、試験サンプルはＨＩＶ−２分析物核酸を含み、ＨＩＶ−１分析物核酸を含まないことを示す。代替的な好ましい実施形態において、ＨＩＶ−１特異的プローブを含むハイブリダイゼーション反応において、第１のＨＩＶ−１アンプリコンのみを検出し、第１のＨＩＶ−２アンプリコンを検出しない、さらなる工程が存在する。この場合、ＨＩＶ−１特異的プローブは、第１のＨＩＶ−１アンプリコンにのみハイブリダイズし、第１のＨＩＶ−２アンプリコンにはハイブリダイズしない。この場合、交差反応性プローブのハイブリダイゼーションを示す陽性シグナルがあり、かつ、ＨＩＶ−１特異的プローブのハイブリダイゼーションを示す陽性シグナルがないと、試験サンプルが、ＨＩＶ−２分析物核酸を含み、ＨＩＶ−１分析物核酸を含まないことを示す。別の好ましい実施形態によれば、検出工程において使用される交差反応性プローブは、均質な検出可能な標識で標識される。この均質な検出可能な標識は、例えば、化学発光標識であり得る。非常に好ましい実施形態において、化学発光標識が使用される場合、検出工程は、ルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて検出する工程、またはルミノメトリー（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）を実施する工程を包含する。本発明の方法の特定の他の実施形態において、増幅工程において実施されるインビトロ核酸増幅反応は、ＨＩＶ−２分析物核酸の第１の配列を増幅し、そしてまた、ＨＩＶ−１分析物核酸の第１の配列を増幅し得ることのない、分析物特異的なプライマー対を含まない。なお他の実施形態において、検出工程におけるプローブのハイブリダイゼーションを示す陽性の結果は、第１のＨＩＶ−１アンプリコンと第１のＨＩＶ−２アンプリコンの存在を区別しない。言い換えると、増幅反応において合成された相補的な標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションは、どちらが存在するかを識別せずに、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸が試験サンプル中に存在することのみを示す。なお他の実施形態において、増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、さらに、ＨＩＶ−１ともＨＩＶ−２とも異なる、少なくとも１つの分析物核酸の第１の配列の少なくとも１つを増幅し得る。この場合、この増幅反応は、「多重」増幅反応である。本発明の応報の特に好ましい実施形態において、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスのうち少なくとも一方の核酸が、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸に加えて、増幅反応において増幅され得る。

本発明の第２の局面は、試験サンプルがＨＩＶ−１分析物核酸を含むかどうかを具体的に決定するための方法に関する。本発明の方法は、試験サンプルを、一対の交差反応性プライマーと合わせるための第１の工程を包含する。続いて、試験サンプル中に存在し得る任意のＨＩＶ−１分析物核酸の第１の配列、および試験サンプル中に存在し得る任意のＨＩＶ−２分析物核酸の第１の配列を、インビトロ核酸増幅反応において増幅するための工程が存在する。この増幅反応は、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸を同時に増幅し得る、一対の交差反応性プライマーを使用して行なわれる。増幅反応産物は、第１のＨＩＶ−１アンプリコンおよび第１のＨＩＶ−２アンプリコンを含み得る。続いて、任意の第１のＨＩＶ−２アンプリコンを検出することなく、増幅工程において合成され得る任意の第１のＨＩＶ−１アンプリコンを検出するための工程が存在する。ハイブリダイゼーション反応における陽性反応は、試験サンプルがＨＩＶ−１分析物核酸（ａｎａｌｙｔｅ ｎｕｃｌｅｉｃ）を含んだことを示す。好ましい実施形態において、増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、ＴＭＡ反応、ＮＡＳＢＡ反応、またはＰＣＲ反応のいずれかである。これらの増幅反応のうちの１つが採用される場合、検出工程は、好ましくは、均質な検出可能な標識で標識されるＨＩＶ−１特異的なハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイズする工程を包含する。このような標識は、有利なことに、特定のプローブ：標的二量体がハイブリダイゼーション反応において形成されたことを決定するために、このような二量体からの、ハイブリダイズしていない遊離プローブの物理的な分離を必要としない。特定の好ましい実施形態において、均質な検出可能な標識は、化学発光標識である。この場合、検出工程は、ルミノメーターで検出する工程、またはルミノメトリーを実施する工程を包含し得る。なお別の実施形態において、増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、またＨＩＶ−１分析物核酸の第１の配列を増幅し得ることのない、ＨＩＶ−２分析物核酸の第１の配列を増幅する分析物特異的なプライマー対を含まない。なお他の実施形態において、増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、さらに、ＨＩＶ−１とのＨＩＶ−２とも異なる少なくとも１つの分析物核酸の少なくとも第１の配列の１つを増幅し得る。この場合、増幅反応は、「多重」増幅反応である。例えば、本発明の特に好ましい実施形態において、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスのうち少なくとも一方の核酸が、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸に加えて、増幅反応において増幅され得る。

本発明の第３の局面は、試験サンプルが、ＨＩＶ−２分析物核酸を含むかどうかを具体的に決定するための方法に関する。本発明の方法は、試験サンプルを一対の交差反応性プライマーと合わせるための第１の工程を包含する。続いて、試験サンプル中に存在し得るＨＩＶ−１分析物核酸の任意の第１の配列、および試験サンプル中に存在し得るＨＩＶ−２分析物核酸の任意の第１の配列、をインビトロ核酸増幅反応において増幅するための工程が存在する。この増幅反応は、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸を同時に増幅し得る、一対の交差反応性プライマーを使用して行なわれる。増幅反応産物は、第１のＨＩＶ−１アンプリコンおよび第１のＨＩＶ−２アンプリコンを含み得る。続いて、任意の第１のＨＩＶ−１アンプリコンを検出することなく、増幅工程において合成され得る任意の第１のＨＩＶ−２アンプリコンを検出するための工程が存在する。ハイブリダイゼーション反応における陽性の結果は、試験サンプルがＨＩＶ−２分析物核酸を含んだことを示す。好ましい実施形態において、増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、ＴＭＡ反応、ＮＡＳＢＡ反応、またはＰＣＲ反応のいずれかである。これらの増幅反応のうちの１つが採用される場合、検出工程は、好ましくは、均質な検出可能な標識で標識されるＨＩＶ−２特異的なハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイズする工程を包含する。このような標識は、有利なことに、特定のプローブ：標的二量体がハイブリダイゼーション反応において形成されたことを決定するために、このような二量体からの、ハイブリダイズしていない遊離プローブの物理的な分離を必要としない。特定の好ましい実施形態において、均質な検出可能な標識は、化学発光標識である。この場合、検出工程は、ルミノメーターで検出する工程、またはルミノメトリーを実施する工程を包含し得る。なお別の実施形態において、増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、またＨＩＶ−１分析物核酸の第１の配列を増幅し得ることのない、ＨＩＶ−２分析物核酸の第１の配列を増幅する分析物特異的なプライマー対を含まない。なお他の実施形態において、増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、さらに、ＨＩＶ−１ともＨＩＶ−２とも異なる少なくとも１つの分析物核酸の第１の配列の少なくとも１つを増幅し得る。この場合、増幅反応は、「多重の」増幅反応である。例えば、本発明の特に好ましい実施形態において、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの少なくとも一方の核酸が、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸に加えて、増幅反応において増幅され得る。

本発明の第４の局面は、試験サンプルがＨＩＶ−１分析物核酸を含むかどうかを決定する方法に関する。本発明の方法は、まず、第１のインビトロ核酸増幅反応において、試験サンプル中に存在し得る任意のＨＩＶ−１分析物核酸の第１の配列、および試験サンプル中に存在し得るＨＩＶ−２分析物核酸の第１の配列を増幅する工程を包含する。第１の増幅反応は、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸を同時に増幅し得る、一対の交差反応性プライマーを使用する。第１の増幅反応の産物は、第１のＨＩＶ−１アンプリコンおよび第１のＨＩＶ−２アンプリコンを含み得る。続いて、単回のハイブリダイゼーション反応において、第１の増幅反応において合成され得る任意の第１のＨＩＶ−１アンプリコン、および任意の第１のＨＩＶ−２のアンプリコンを検出するための工程が存在する。アンプリコン種の一方の検出は、試験サンプルが、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のいずれかの核酸を含むことを確認する。続いて、第２のインビトロ核酸増幅反応において、試験サンプル中に存在し得る任意のＨＩＶ−１分析物核酸の第２の配列を増幅し、それによって、第２のＨＩＶ−１アンプリコンの合成をもたらすための工程が存在する。最後に、第２のＨＩＶ−１アンプリコンにはハイブリダイズするが、第２の増幅工程において合成され得る任意のＨＩＶ−２アンプリコンにはハイブリダイズしないプローブを使用して、第２のＨＩＶ−１アンプリコンを検出するための工程が存在する。第２のＨＩＶ−１アンプリコンの検出は、試験サンプルがＨＩＶ−１分析物核酸を含むことを確認する。好ましい実施形態において、第１の増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、ＴＭＡ反応、ＮＡＳＢＡ反応またはＰＣＲ反応のいずれかである。この場合、第２の増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応はまた、ＴＭＡ反応、ＮＡＳＢＡ反応またはＰＣＲ反応のいずれかであり得る。代替的な実施形態において、第２の増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、第１の増幅工程において用いられる増幅反応の型にかかわらず、ＴＭＡ反応、ＮＡＳＢＡ反応またはＰＣＲ反応のいずれかである。異なる好ましい実施形態によれば、第１のインビトロ核酸増幅反応および第２のインビトロ核酸増幅反応は、第１のＨＩＶ−１アンプリコンおよび第２のＨＩＶ−１アンプリコンを合成するために、異なるプライマーを用いる。なお別の好ましい実施形態によれば、第１および第２の検出工程は、同一のプローブを用いない。しかし、第１の増幅工程の単回のハイブリダイゼーション反応には、第１のＨＩＶ−１アンプリコンまたは第１のＨＩＶ−２アンプリコンのいずれかに対してハイブリダイズし得る交差反応性プローブを含めることが好ましい。なおより好ましくは、交差反応性プローブは、均質な検出可能な標識で標識される。特定の実施形態において、均質な検出可能な標識は、例えば、化学発光標識である。

本発明の第５の局面は、試験サンプル中に存在し得る、ＨＩＶ−１分析物核酸およびＨＩＶ−２分析物核酸を増幅する方法に関する。本発明の方法は、試験サンプルを一対の交差反応性プライマーと合わせるための工程から開始する。これらのプライマーは、試験サンプル中に存在する場合、任意のＨＩＶ−１分析物核酸の第１鎖および任意のＨＩＶ−２分析物核酸の第１鎖に独立してハイブリダイズする、交差反応性の第１プライマーを含む。また、一対の交差反応性プライマーに含まれるのは、試験サンプル中に存在する場合、任意のＨＩＶ−１分析物核酸の第２鎖、および任意のＨＩＶ−２分析物核酸の第２鎖に独立してハイブリダイズする、交差反応性の第２プライマーである。これらのプライマーは、ＨＩＶ−１分析物核酸の第１鎖またはＨＩＶ−２分析物核酸の第１鎖のいずれかを鋳型として使用して、交差反応性の第１プライマーの伸長産物が、交差反応性の第２プライマーにハイブリダイズするような配列を有する。次に、一対の交差反応性プライマーを使用して、試験サンプル中に存在し得る任意のＨＩＶ−１分析物核酸の第１の配列、および試験サンプル中に存在し得る任意のＨＩＶ−２分析物核酸の第１の配列を増幅するための工程が存在する。この結果、試験サンプルがＨＩＶ−１分析物核酸を含む場合に、第１のＨＩＶ−１アンプリコンが合成され、そして、試験サンプルがＨＩＶ−２分析物核酸を含む場合に、第１のＨＩＶ−２アンプリコンが合成される。１つの実施形態において、本発明の方法は、さらに、第１のＨＩＶ−１アンプリコンおよび第１のＨＩＶ−２アンプリコンのうち少なくとも一方を検出するための工程を包含する。好ましい実施形態において、この検出工程は、第１のＨＩＶ−１アンプリコンおよび第１のＨＩＶ−２アンプリコンの両方を検出する工程を包含する。より好ましくは、この検出工程は、増幅工程において増幅された、任意の第１のＨＩＶ−１アンプリコンおよび任意の第１のＨＩＶ−２アンプリコンに独立してハイブリダイズする交差反応性プローブを含む、ハイブリダイゼーション反応を実施する工程を包含する。別の好ましい実施形態において、この検出工程は、第１のＨＩＶ−１アンプリコンのみを検出し、第１のＨＩＶ−２アンプリコンを検出しない工程を包含する。なお別の好ましい実施形態において、この検出工程は、第１のＨＩＶ−２アンプリコンのみを検出し、第１のＨＩＶ−１アンプリコンを検出しない工程を包含する。別の好ましい実施形態によれば、本発明の方法が、さらに、第１のＨＩＶ−１アンプリコンおよび第１のＨＩＶ−２アンプリコンのうち少なくとも一方を検出するための工程を包含する場合、（ａ）ＨＩＶ−１分析物核酸の第１の配列が、ＨＩＶ−１ ｐ３１インテグラーゼ遺伝子内に含まれ、かつＨＩＶ−２分析物核酸の第１の配列が、ＨＩＶ−２ ｐ３１インテグラーゼ遺伝子内に含まれる、または（ｂ）ＨＩＶ−１分析物核酸の第１の配列が、ＨＩＶ−１ ｐ５１逆転写酵素遺伝子内に含まれ、かつＨＩＶ−２分析物核酸の第１の配列が、ＨＩＶ−２ ｐ５１逆転写酵素遺伝子内に含まれる、のいずれかが好ましい。

本発明の第６の局面は、生物学的サンプル中に存在し得る、任意のＨＩＶ−１分析物核酸または任意のＨＩＶ−２分析物核酸を増幅するための組成物に関する。本発明の組成物は、生物学的サンプル中に存在する場合、ＨＩＶ−１分析物核酸の任意の第１鎖またはＨＩＶ−２分析物核酸の任意の第１鎖に独立してハイブリダイズする、交差反応性の第１プライマーを含む。本発明の組成物には、生物学的サンプル中に存在する場合、ＨＩＶ−１分析物核酸の任意の第２鎖、およびＨＩＶ−２分析物核酸の任意の第２鎖に独立してハイブリダイズする、交差反応性の第２プライマーもまた含まれる。これらのプライマーの交差反応性の性質とは、交差反応性の第１プライマーの伸長産物が、ＨＩＶ−１分析物核酸もしくはＨＩＶ−２分析物核酸のいずれかの第１鎖を鋳型として使用して、温度依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性により媒介され得るように、交差反応性の第２プライマーにハイブリダイズし得ることを意味する。好ましい実施形態において、交差反応性の第１プライマーおよび第２プライマーにより増幅され得るＨＩＶ−１分析物核酸およびＨＩＶ−２分析物核酸は、ウイルスｐ３１インテグラーゼまたはウイルスｐ５１逆転写酵素のいずれかをコードする。本発明の組成物の特定のより好ましい実施形態は、ＨＩＶ−１分析物核酸もまた増幅し得ることなく、ＨＩＶ−２分析物核酸のみを増幅するための一対のＨＩＶ−２特異的プライマーを含まないが、ＨＩＶ−２分析物核酸もまた増幅し得ることなく、ＨＩＶ−１分析物核酸のみを増幅するための一対のＨＩＶ−１特異的プライマーを含み得る。なお別の実施形態によれば、交差反応性の第１プライマーおよび第２プライマーが、ｐ３１インテグラーゼまたはｐ５１逆転写酵素をコードする核酸を増幅するのに有用であるかに関わらず、本発明の組成物は、さらに、ＨＩＶ−２分析物核酸もまた増幅することなく、ＨＩＶ−１分析物核酸のみを増幅するための、一対のＨＩＶ−１特異的プライマーを含み得る。一般に、交差反応性の第１プライマーおよび第２プライマーが、ｐ５１逆転写酵素をコードする核酸を増幅するのに有用である場合、交差反応性の第１プライマーは、３’末端標的相補配列、そして必要に応じて、増幅されるべき分析物核酸配列に相補的でない交差反応性の第１プライマーの上流配列を含む。交差反応性の第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号６０内に含まれる２２〜２８個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡの等価な塩基およびヌクレオチドアナログの存在が可能である。本発明の組成物は、さらに、３’末端標的相補配列、そして必要に応じて、増幅されるべき標的核酸配列に相補的でない交差反応性の第２プライマーの上流配列を含む、交差反応性の第２プライマーを含む。交差反応性の第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号６１を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡの等価な塩基およびヌクレオチドアナログの存在が可能である。より好ましくは、交差反応性の第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号６０内に含まれる２２〜２８個の連続する塩基から構成されて、ＲＮＡおよびＤＮＡの等価な塩基およびヌクレオチドアナログの存在が可能であり、そして、交差反応性の第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号６１から構成され、ＲＮＡおよびＤＮＡの等価な塩基およびヌクレオチドアナログの存在が可能である。特定の好ましい実施形態において、第１プライマーおよび第２プライマーは、各々、６０塩基長までである。特定の他の好ましい実施形態において、第１プライマーは、任意の第１プライマーの上流配列を含まず、第１プライマーは、２８塩基長までであり、そして、第２プライマーは、６０塩基長までである。なお他の好ましい実施形態において、第１プライマーは、６０塩基長までであり、そして、第２プライマーは、任意の第２プライマーの上流配列を含まず、第２プライマーは、２６塩基長である。なおさらなる他の好ましい実施形態において、第１プライマーは、任意の第１プライマーの上流配列を含まず、第１プライマーは、２８塩基長までであり、そして、第２プライマーは、任意の第２プライマーの上流配列を含まず、第２プライマーは２６塩基長である。この場合、第１プライマーが２８塩基長までであり、かつ第２プライマーが２６塩基長であるとは、本発明の組み合わせにおいて使用され得る特定の好ましいプライマーの組み合わせが存在することを意味する。第１の好ましい組み合わせにおいて、第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号５１であり、そして、第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５０のいずれかである。第２の好ましい組み合わせにおいて、第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号５２であり、そして、第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号４８である。第３の好ましい組み合わせにおいて、第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号５３であり、そして、第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５０のいずれかである。第４の好ましい組み合わせにおいて、第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号５４であり、そして、第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号４８である。異なる実施形態において、第１プライマーおよび第２プライマーが各々６０塩基長までである場合、第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号５１〜５４のいずれかである。より好ましくは、第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号４７〜５０のいずれかである。なお異なる好ましい実施形態において、第１プライマーが６０塩基長までである場合であって、かつ、第２プライマーが、任意の第２プライマーの上流配列を含まない場合、第２プライマーは２６塩基長であり、第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号４７〜５０のいずれかである。より好ましくは、第１プライマーは、任意の第１プライマーの上流配列を含み、そして、第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号５１〜５４のいずれかである。この場合、本発明の組み合わせにおいて使用され得る特定の好ましいプライマーの組み合わせが存在する。第１の好ましい組み合わせにおいて、第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号５１であり、そして、第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５０のいずれかである。第２の好ましい組み合わせにおいて、第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号５２であり、そして、第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号４８である。第３の好ましい組み合わせにおいて、第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号５３であり、そして、第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５０のいずれかである。第４の好ましい組み合わせにおいて、第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号５４であり、そして、第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号４８である。ここでも、一般に、交差反応性の第１プライマーおよび第２プライマーが、ｐ３１インテグラーゼをコードする核酸を増幅するのに有用である場合、交差反応性の第１プライマーは、３’末端標的相補配列、そして、必要に応じて、増幅されるべき分析物核酸配列に相補的でない、交差反応性の第１プライマーの上流配列を含む。交差反応性の第１プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号１３〜１５のいずれかから構成される。本発明の組成物は、さらに、３’末端標的相補配列、そして、必要に応じて、増幅されるべき標的核酸配列に相補的でない交差反応性の第２プライマーの上流配列を含む、交差反応性の第２プライマーを含む。交差反応性の第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列ＡＣＡＲＹＡＧＴＡＣＷＡＡＴＧＧＣ（配列番号１０）を含み、２つまでの塩基アナログの置換が可能である。好ましい実施形態において、交差反応性の第１プライマーおよび交差反応性の第２プライマーは、７５塩基長までである。より好ましくは、交差反応性の第２プライマーの３’末端標的相補配列は、配列番号２、配列番号７、配列番号８および配列番号９のいずれかである。なおより好ましくは、交差反応性の第１プライマーは、配列番号１４であり、そして、交差反応性の第２プライマーは、配列番号２、配列番号７、配列番号８および配列番号９のいずれかである。なおより好ましい実施形態によれば、交差反応性の第１プライマーが配列番号１４であり、かつ交差反応性の第２プライマーが配列番号７であるか、または、交差反応性の第１プライマーが配列番号１４であり、かつ交差反応性の第２プライマーが配列番号２であるかのいずれかである。

本発明の第７の局面は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸を検出するためのプローブに関する。本発明のプローブは、塩基の標的相補配列、そして、必要に応じて、検出されるべき核酸に相補的でない１つ以上の塩基配列から構成されるプローブ配列を含む。塩基の標的相補配列は、以下のうちのいずれかであり得る：（ａ）ＲＮＡおよびＤＮＡの等価な塩基の存在を可能にする、配列番号４２またはその相補体；（ｂ）ＲＮＡおよびＤＮＡの等価な塩基の存在を可能にする、配列番号４３またはその相補体；あるいは（ｃ）ＲＮＡおよびＤＮＡの等価な塩基の存在を可能にする、配列番号４４またはその相補体。全ての場合において、ハイブリダイゼーションプローブは、６０塩基までの長さを有する。好ましい実施形態において、プローブはさらに、検出可能な標識を含む。例えば、検出可能な標識は、化学発光標識であり得る。異なる実施形態によれば、ハイブリダイゼーションプローブの長さは、２６塩基までである。なお異なる実施形態によれば、プローブは、検出されるべき核酸に相補的でない任意の１つ以上の塩基配列を含まず、そして、プローブ配列は、配列番号４２またはその相補体、配列番号４３またはその相補体、および配列番号４４またはその相補体のいずれかである。

本発明の第８の局面は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸を検出するための別のプローブに関する。本発明のプローブは、塩基の標的相補配列、および必要に応じて、検出されるべき核酸に相補的でない１つ以上の塩基配列から構成されるプローブ配列を含む。塩基の標的相補配列は、配列番号２３〜３６のいずれかであり得る。

（定義）
以下の用語は、本明細書中でそうでないと明確に記載されない限り、本開示の目的のために、以下の意味を有する。

本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、ヒト、動物または環境のサンプルから得られた任意の組織またはポリヌクレオチド含有物質である。本発明に従う生物学的サンプルとしては、末梢血、血漿、血清もしくは他の体液、骨髄、または他の器官、生検組織、または、生物学的起源の他の物質が挙げられる。生物学的サンプルは、組織または細胞の構造を破壊するように処理されて、それにより、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤などを含み得る溶液内に細胞内成分を放出し得る。

本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、ならびに、配列中に存在し得、そして、相補配列を有するもう一つの分子とのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げない、任意の合成ヌクレオチドアナログもしくは他の分子のいずれかを意味する。

本明細書中で使用される場合、「検出可能な標識」は、検出され得るか、または、検出可能な応答をもたらし得る、化学種である。本発明に従う、検出可能な標識は、直接的もしくは間接的のいずれかでポリヌクレオチドに結合され得、そして、放射性同位元素、酵素、ハプテン、発色団（例えば、色素または検出可能な色を与える粒子（例えば、ラテックスビーズまたは金属粒子））、発光化合物（例えば、生物発光部分、リン光部分、または化学発光部分）、および蛍光化合物が挙げられる。

「均質な検出可能な標識」とは、標識が、標的配列にハイブリダイズしたプローブ上にあるかどうかを決定することによって、均質な様式で検出され得る標識をいう。すなわち、均質な検出可能な標識は、標識、または標識されたプローブの非ハイブリダイズ形態から、ハイブリダイズ形態を物理的に除くことなく検出され得る。ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかを検出するために標識されたプローブを使用する場合、均質な検出可能な標識が好ましい。均質な標識の例としては、蛍光標識（例えば、分子ビーコンに結合したもの）および化学発光標識（例えば、Ａｒｎｏｌｄら，米国特許第５，２８３，１７４号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら，米国特許第５，６５６，２０７号；およびＮｅｌｓｏｎら，米国特許第５，６５８，７３７号により記載されたもの）が挙げられる。均質なアッセイにおいて使用するための好ましい標識としては、化学発光化合物（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄら，米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら，米国特許第５，６５８，７３７号；およびＡｒｎｏｌｄ，Ｊｒ．，ら，米国特許第５，６３９，６０４号を参照のこと）。好ましい化学発光標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物（例えば、標準的なＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥ））である。

「均質なアッセイ」とは、特異的なプローブハイブリダイゼーションの程度を決定する前に、ハイブリダイズしていないプローブからのハイブリダイズしたプローブの物理的な分離を必要としない検出手順をいう。本明細書中に記載されるような、例示的な均質なアッセイは、適切な標的（ハイブリッド二重鎖中に存在する限りは、化学的手段によって選択的に破壊され得る化学発光アクリジニウムエステル標識、および当業者に周知の他の均質な検出可能な標識）にハイブリダイズする場合、蛍光シグナルを放射する、分子ビーコンまたは他の自己レポーティングプローブ（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）を使用し得る。

本明細書中で使用される場合、「増幅」とは、複数コピーの標的核酸配列、その相補体またはそのフラグメントを得るためのインビトロ手順をいう。

「標的核酸」または「標的」とは、標的核酸配列を含む核酸を意味する。一般に、増幅されるべき標的核酸配列は、２つの対向して配置されたプライマー間に位置し、そして、プライマーの各々に完全に相補的な標的核酸の部分を含む。

「標的核酸配列」または「標的配列」または「標的領域」とは、単鎖核酸分子のヌクレオチド配列、およびそれに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列の全てまたは一部を含む、特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。

「転写関連増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、核酸鋳型から複数のＲＮＡ転写物を生成するためにＲＮＡポリメラーゼを使用する、任意の型の核酸増幅を意味する。「転写媒介増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（ＴＭＡ）と呼ばれる、転写関連増幅法の１つの例は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター−鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドを用い、そして、必要に応じて、１つ以上の類似のオリゴヌクレオチドを含み得る。Ｂｕｒｇら，米国特許第５，４３７，９９０号；Ｋａｃｉａｎら，米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号；Ｋａｃｉａｎら，国際公開第９３／２２４６１号パンフレット；Ｇｉｎｇｅｒａｓら，国際公開第８８／０１３０２号パンフレット；Ｇｉｎｇｅｒａｓら，国際公開第８８／１０３１５号パンフレット；Ｍａｌｅｋら，米国特許第５，１３０，２３８号；Ｕｒｄｅａら，米国特許第４，８６８，１０５号および同第５，１２４，２４６号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら，国際公開第９４／０３４７２号パンフレット；ならびにＲｙｄｅｒら，国際公開第９５／０３４３０号パンフレットに詳細に開示されるように、種々のＴＭＡが周知である。本明細書中に開示される型の核酸増幅手順を実施するためには、Ｋａｃｉａｎらの方法が好ましい。

本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」とは、少なくとも２つ、一般には、約５と約１００との間の、化学的サブユニットのポリマー鎖であり、各サブユニットは、ヌクレオチド塩基部分、糖部分、および直線状の空間的配置にこれらのサブユニットを連結する連結部分を含む。一般的なヌクレオチド塩基部分は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）であるが、水素結合し得る、他の希少もしくは修飾されたヌクレオチド塩基が、当業者に周知である。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、糖部分、塩基部分、および骨格の構成成分のいずれかのアナログを含み得る。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、約１０〜約１００残基の大きさの範囲に入る。オリゴヌクレオチドは、天然に存在する供給源から精製され得るが、好ましくは、種々の周知の酵素的方法もしくは化学的方法のいずれかを使用して合成される。

本明細書中で使用される場合、「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸中（好ましくは、増幅された核酸中）の標的配列に特異的にハイブリダイズして検出可能なハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドである。プローブは、必要に応じて、プローブの末端に結合し得るか、または、内在的であり得るかのいずれかの、検出可能な部分を含み得る。標的ポリヌクレオチドと合わさったプローブのヌクレオチドは、プローブの配列に対して内在性である、検出可能な部分を有する場合、厳密には連続的である必要はない。検出は、直接的（すなわち、標的配列または増幅された核酸に直接ハイブリダイズするプローブから生じる）、または、間接的（すなわち、標的配列または増幅された核酸にプローブを連結する、中間の分子構造にハイブリダイズするプローブから生じる）のいずれかであり得る。プローブの「標的」は、一般に、標準的な水素結合（すなわち、塩基対形成）を用いて、プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする、増幅された核酸配列内に含まれる配列をいう。プローブは、標的特異的な配列、および、必要に応じて、検出されるべき標的配列に相補的でない他の配列を含み得る。これらの相補的でない配列は、プロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、または、プローブの三次元構造に寄与する配列（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら，米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号に記載されているようなもの）を含み得る。「十分に相補的」な配列は、プローブの標的特異的な配列に完全には相補的でない標的配列に対するプローブオリゴヌクレオチドの安定なハイブリダイゼーションを可能にする。

本明細書中で使用される場合、「増幅プライマー」は、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、核酸の増幅反応に関与する。例えば、増幅プライマー、またはより単純には「プライマー」は、鋳型核酸にハイブリダイズし得る、必要に応じて修飾されたオリゴヌクレオチドであり得、そして、ＤＮＡポリメラーゼ活性により伸長され得る３’末端を有し得る。一般に、プライマーは、標的核酸にハイブリダイズし得る下流配列を有し、そして、必要に応じて、標的核酸に相補的でない上流配列を有する。任意の上流配列は、例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能し得るか、または、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含み得る。

オリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを参照して本明細書中で使用される場合、用語「交差反応する」もしくは「交差反応性」またはその変形は、プローブまたはプライマーが、単一の種の標的ポリヌクレオチドに厳密には特異的でないことを意味する。ＨＩＶ−１核酸にハイブリダイズするが、ＨＩＶ−２核酸にはハイブリダイズしないプローブは、交差反応性であるということはできない。逆に、ＨＩＶ−１標的核酸およびＨＩＶ−２標的核酸の両方にハイブリダイズして、検出可能なハイブリダイゼーション複合体を形成し得るプローブは、「交差反応性」とみなされる。同様に、交差反応性プライマーは、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかを鋳型として使用する核酸増幅反応に関与して、ＨＩＶ−１アンプリコンおよびＨＩＶ−２アンプリコンの合成をもたらし得る。

「実質的に相同」、「実質的に対応」、または「実質的に対応する」とは、対象となるオリゴヌクレオチドが、参照塩基配列（ＲＮＡおよびＤＮＡの等価物を除く）中に存在する少なくとも１０個の連続する塩基領域に対して、少なくとも７０％相同、好ましくは、少なくとも８０％相同、より好ましくは、少なくとも９０％相同、そして最も好ましくは、１００％相同な少なくとも１０個の連続する塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。当業者は、種々の割合の相同性において、ハイブリダイゼーションアッセイ条件に対して、容認できないレベルの非特異的なハイブリダイゼーションを回避しながら、オリゴヌクレオチドの標的配列に対するハイブリダイゼーションを可能にする、改変を容易に理解する。類似性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順列を比較することによって決定され、２つの配列間に存在し得る他の構造的な相違は（その構造的な相違が相補的な塩基との水素結合を妨害しないという条件で）考慮されない。２つの配列間の類似性の程度はまた、比較される少なくとも１０個の連続する塩基の各セットに存在する、塩基ミスマッチの数の観点から表され得、このミスマッチは、０〜２個の塩基の相違の範囲であり得る。

「実質的に相補的」とは、対象となるオリゴヌクレオチドが、標的核酸配列（ＲＮＡおよびＤＮＡの等価物を除く）中に存在する少なくとも１０個の連続する塩基領域に対して、少なくとも７０％相補的、好ましくは、少なくとも８０％相補的、より好ましくは、少なくとも９０％相補的、そして最も好ましくは、１００％相補的な、少なくとも１０個の連続する塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。（当業者は、種々の割合の相補性において、ハイブリダイゼーションアッセイ条件に対して、容認できないレベルの非特異的なハイブリダイゼーションを回避しながら、オリゴヌクレオチドの標的配列に対するハイブリダイゼーションを可能にする、改変を容易に理解する。）相補性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順列を比較することによって決定され、２つの配列間に存在し得る他の構造的な相違は（その構造的な相違が相補的な塩基との水素結合を妨害しないという条件で）考慮されない。２つの配列間の相補性の程度はまた、比較される少なくとも１０個の連続する塩基の各セットに存在する、塩基ミスマッチの数の観点から表され得、このミスマッチは、０〜２個の塩基ミスマッチの範囲であり得る。

「十分に相補性」とは、一連の相補的な塩基の間の水素結合により、もう一方の塩基配列にハイブリダイズし得る連続的な核酸塩基配列を意味する。相補的な塩基配列は、標準的な塩基対形成（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕの対形成）によって、オリゴヌクレオチドの塩基配列内の各位置において相補的であっても、標準的な水素結合によって、相補的ではない１つ以上の残基（無塩基性の「ヌクレオチド」を含む）を含んでもよいが、この相補的な塩基配列全体は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、別の塩基配列と特異的にハイブリダイズし得る。連続的な塩基は、オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズすることが意図される配列に対して、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約１００％相補的である。適切なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で周知であり、塩基配列の組成に基づいて容易に予測され得るか、または、慣用的な試験を使用して、経験的に決定され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）の§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１および１１．４７−１１．５７（特に、§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７）を参照のこと）。

「捕捉オリゴヌクレオチド」とは、塩基対ハイブリダイゼーションに起因して、標的配列と固定化されたオリゴヌクレオチドとを特異的に連結するための手段を提供する、少なくとも１つの核酸オリゴヌクレオチドを意味する。捕捉オリゴヌクレオチドは、好ましくは、２つの結合領域：標的配列−結合領域および固定化プローブ−結合領域（通常は、同じオリゴヌクレオチド上で連続している）を含むが、捕捉オリゴヌクレオチドは、１つ以上のリンカーにより互いに連結された、２つの異なるオリゴヌクレオチド上に存在する、標的配列−結合領域および固定化プローブ−結合領域を含み得る。例えば、固定化プローブ−結合領域が第１のオリゴヌクレオチド上に存在し得、標的配列−結合領域が、第２のオリゴヌクレオチド上に存在し得、かつ、２つの異なるオリゴヌクレオチドが、リンカー（第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む第３のオリゴヌクレオチド）との水素結合により連結される。

「固定化プローブ」または「固定化核酸」とは、捕捉オリゴヌクレオチドを、固定化支持体に、直接的または間接的に連結する核酸を意味する。固定化プローブは、サンプル中の結合していない物質からの結合した標的配列の分離を促進する固体支持体に連結されたオリゴヌクレオチドである。

「分離する」または「精製する」とは、サンプルの１つ以上の他の成分が、サンプルの１つ以上の他の成分から取り除かれることを意味する。サンプルの成分は、タンパク質、炭化水素、脂質、および標識されたプローブのような物質もまた含み得る、ほぼ水性の溶液相中に、核酸を含む。好ましくは、分離工程または精製工程は、サンプル中に存在する他の成分の、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして、なおより好ましくは、少なくとも約９５％を取り除く。

「ＲＮＡおよびＤＮＡの等価物」または「ＲＮＡおよびＤＮＡの等価な塩基」とは、同じ相補的な塩基対ハイブリダイゼーション特性を有する、ＲＮＡおよびＤＮＡのような分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡの等価物は、異なる糖部分（すなわち、リボース対デオキシリボース）を有し、そして、ＲＮＡにおけるウラシルの存在、およびＤＮＡにおけるチミンの存在により異なり得る。ＲＮＡおよびＤＮＡの等価物間の相違は、相同性の相違に寄与しない。なぜならば、等価物は、特定の配列に対して同じ程度の相補性を有するからである。

「〜から本質的になる」とは、本発明の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない、さらなる成分、組成物または方法が、本発明の組成物またはキットまたは方法に包含され得ることを意味する。このような特徴としては、生物学的サンプル（例えば、全血または血漿）中のＨＩＶ−１核酸、ＨＩＶ−２核酸、またはＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸の組み合わせを選択的に検出する能力が挙げられる。本発明の基本的かつ新規な特徴に実質的な効果を及ぼす、任意の成分、組成または方法は、この用語の枠に入らない。

（発明の詳細な説明）
本明細書中に開示されるのは、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、血漿、または他の体液もしくは組織）においてＨＩＶ−１の核酸、ＨＩＶ−２の核酸、またはＨＩＶ−１とＨＩＶ−２との組み合わせの核酸を検出するための、組成物、方法、およびキットである。本発明のプローブ、プライマー、および方法が、診断適用において、または感染性粒子を含み得る献血された血液および血液製剤または他の組織をスクリーニングするために、使用され得る。

（序論および概説）
本発明は、生物学的サンプルにおいてＨＩＶ−１の核酸、ＨＩＶ−２の核酸、またはＨＩＶ−１とＨＩＶ−２との組み合わせの核酸を検出するために特に有用である、組成物（すなわち、増幅オリゴヌクレオチドまたは増幅プライマー、およびプローブ）、方法、ならびにキットを包含する。そのような用途のために適切なオリゴヌクレオチド配列を設計するために、公知のＨＩＶ−１核酸配列と、公知のＨＩＶ−２核酸配列とが、まず、診断アッセイにおいて試薬として役立ち得るウイルスゲノムの候補領域を同定するために比較された。これらの比較の結果として、特定の配列が選択され、そして図１において模式的に示される捕捉オリゴヌクレオチド、プライマーおよびプローブを用いる検出のための標的として試験された。比較的少数の改変体を含む配列の部分が、増幅された配列の捕捉、増幅、および検出において使用するために適切な合成オリゴヌクレオチドを設計するための開始点として選択された。

これらの分析に基づいて、下記に示される増幅プライマー配列およびプローブ配列が、設計された。ＨＩＶ−１標的に対して特異的な任意のプライマー配列、ＨＩＶ−２標的に対して特異的な任意のプライマー配列、またはＨＩＶ−１標的とＨＩＶ−２標的との組み合わせに対して特異的な任意のプライマー配列（それぞれ、Ｔ７プロモーター配列を含むもの、または含まないもの）が、以下に記載されるインビトロでのプライマーベースの種々の増幅方法におけるプライマーとして使用され得ることを、当業者は認識する。本明細書中に開示される配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−１核酸および／またはＨＩＶ−２核酸を検出するためのアッセイにおいて代替的機能を提供し得ることもまた、企図される。例えば、本明細書中に開示される捕捉オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして役立ち得、本明細書中で開示されるハイブリダイゼーションプローブは、増幅プライマーとして使用され得、本明細書中に開示される増幅プライマーは、代替的検出アッセイにおいてハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。

本明細書中に開示される増幅プライマーは、いくつかのアンプリコン種が一団の標的特異的プライマーから生成され得る多重増幅反応の成分として、特に企図される。例えば、本明細書中に開示される特定の好ましいプライマーは、上記アッセイの感度を実質的には損なうことなく、無関係なウイルスのポリヌクレオチドを増幅することが可能な多重増幅反応において使用され得ることが、企図される。これらの無関係なウイルスの特定の例としては、ＨＣＶおよびＨＢＶが挙げられる。

（有用な増幅方法）
本発明に関連して有用である増幅方法としては、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ならびに自己複製ポリヌクレオチド分子を使用する増幅方法および複製酵素（例えば、ＭＤＶ−１ ＲＮＡおよびＱ−β酵素）を使用する増幅方法が、挙げられる。これらの種々の増幅技術を実行するための方法は、それぞれ、米国特許第５，３９９，４９１号、欧州特許出願公開第０ ５２５ ８８２号、米国特許第４，９６５，１８８号、米国特許第５，４５５，１６６号、米国特許第５，４７２，８４０号、およびＬｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７（１９８８）において見出され得る。核酸増幅反応を実施する方法を記載するこれらの文献の開示は、本明細書中に参考として援用される。

本発明の非常に好ましい実施形態において、分析物核酸配列が、ＴＭＡプロトコルを使用して増幅される。このプロトコルに従って、ＤＮＡポリメラーゼ活性を提供する逆転写酵素はまた、内因性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を保有する。この手順において使用されるプライマーのうちの１つは、増幅されるべき標的核酸の一方の鎖に対して相補的な配列の上流に位置するプロモーター配列を含む。この増幅の最初の段階において、プロモーター−プライマーが、規定された部位において標的ＲＮＡにハイブリダイズする。逆転写酵素が、上記プロモーター−プライマーの３’末端からの伸長によって、上記標的ＲＮＡの相補的ＤＮＡコピーを生成する。もう一方の鎖のプライマーと新たに合成されるＤＮＡ鎖との相互作用の後に、第２鎖ＤＮＡが、逆転写酵素によって上記プライマーの末端から合成され、それによって、二本鎖ＤＮＡ分子が生成される。ＲＮＡポリメラーゼが、この二本鎖ＤＮＡテンプレート中のプロモーター配列を認識し、そして転写を開始する。新たに合成されたＲＮＡアンプリコンの各々が、このＴＭＡプロセスに再度加わり、新しい回の複製のためのテンプレートとして役立ち、それによって、上記ＲＮＡアンプリコンの指数関数的増大をもたらす。上記ＤＮＡテンプレートの各々は、１００コピー〜１０００コピーのＲＮＡアンプリコンを生成し得るので、この増大は、１時間未満に１，０００億個のアンプリコンの生成をもたらし得る。このプロセス全体は、自己触媒性であり、一定温度にて実施される。

（プライマーの構造的特徴）
上記のように、「プライマー」とは、核酸増幅反応に関与することが可能な、必要に応じて改変されたオリゴヌクレオチドを指す。非常に好ましいプライマーは、テンプレート核酸に対してハイブリダイズ可能であり、そしてそのプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長され得る３’末端を有する。そのプライマーの５’領域は、その標的拡散に対して非相補的であり得る。その５’非相補的領域がプロモーター配列を含む場合、そのプライマーは、「プロモーター−プライマー」と呼ばれる。プライマーとして機能し得る任意のオリゴヌクレオチド（すなわち、標的配列に対して特異的にハイブリダイズし、かつＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長可能な３’末端を有する、オリゴヌクレオチド）は、５’プロモーター配列を含むように改変され得、従って、プロモーター−プライマーとして機能し得ることを、当業者は認識する。同様に、任意のプロモーター−プライマーが、プロモーター配列の除去またはプロモーター配列を含まない合成によって改変され得、なおかつプライマーとして機能し得る。

プライマーのヌクレオチド塩基部分は、（例えば、プロピン基の付加によって）改変され得、但し、この改変は、改変された塩基部分が、Ｇ、Ａ、Ｃ、ＴまたはＵと非共有結合を形成する能力を保持する限り、そして少なくとも１つの改変型ヌクレオチド塩基部分または改変型アナログを含むオリゴヌクレオチドが、一本鎖核酸とハイブリダイズするのを立体的に妨害されない限り、なされる。有用なプローブの化学組成に関して下記に示されるように、本発明に従うプライマーの窒素塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その公知のアナログ（例えば、その塩基部分としてヒポキサンチンを有するイノシン、すなわち「Ｉ」；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５〜３６，Ａｄａｍｓら編、第１１版、１９９２）、プリン塩基もしくはピリミジン塩基の公知の誘導体（例えば、Ｎ^４−メチルデオキシグアノシン、デアザプリンもしくはアザプリン、デアザピリミジンもしくはアザピリミジン、５位もしくは６位に置換基を有するピリミジン塩基、２位か６位かもしくは８位に改変型置換基もしくは置換基を有するプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ^６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ^４−アルキル−ピリミジン（Ｃｏｏｋ、ＰＣＴ国際公開番号９３／１３１２１を参照のこと）、ならびにポリマーの１つ以上の残基についてその骨格が窒素塩基を含まない「無塩基」残基であり得る（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号を参照のこと）。プライマー骨格を含む一般的な糖部分としては、リボースおよびデオキシリボースが挙げられるが、２’−Ｏ−メチルリボース（ＯＭｅ）、ハロゲン化糖、および他の改変型糖部分もまた、使用され得る。通常は、そのプライマー骨格の連結基は、リン含有部分（最も一般的には、ホスホジエステル結合）であるが、他の結合（例えば、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、および非リン含有結合（例えば、「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）において見出されるペプチド様結合））もまた、本明細書中に開示されるアッセイにおける使用について意図される。

（有用なプローブ標識系および検出可能な部分）
特異的核酸ハイブリダイゼーションをモニターするために使用され得る基本的にあらゆる標識および検出の系が、本発明に関連して使用され得る。有用な標識の集合に含まれるのは、放射性標識、酵素、ハプテン、連結されたオリゴヌクレオチド、化学発光分子、蛍光部分（単独であるか、または「消光剤」部分と組み合わせる）、および電子的検出方法に従う酸化還元活性分子である。好ましい化学発光分子としては、均質保護アッセイに関連する使用についてＡｒｎｏｌｄらによって米国特許第５，２８３，１７４号において開示される型のアクリジニウムエステル、および１つの反応において複数の標的を定量するアッセイに関連する使用についてＷｏｏｄｈｅａｄらによって米国特許第５，６５６，２０７号において開示される型のアクリジニウムエステルが、挙げられる。これらの特許文献中に含まれる開示は、本明細書によって参考として援用される。好ましい電子的標識アプローチおよび電子的検出アプローチが、米国特許第５，５９１，５７８号および同第５，７７０，３６９号ならびに国際特許公開第９８／５７１５８号（これらの開示は、本明細書によって参考として援用される）において開示される。本発明における標識として有用な酸化還元活性部分としては、遷移金属（例えば、Ｃｄ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｆｅ、およびＲｕ）が挙げられる。

本発明に従うプローブについての特に好ましい標識は、均質アッセイ系において検出可能である（すなわち、混合物中で、結合型標識プローブが、非結合型標識プローブと比較して検出可能な変化（例えば、安定性または差次的分解）を示す）。他の均一の検出可能な標識（例えば、蛍光標識および電子的に検出可能な標識）が、本発明の実施における使用のために意図されるが、均一アッセイにおいて使用するために好ましい標識は、化学発光化合物（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄらによって米国特許第５，６５６，２０７号において記載される化学発光化合物；Ｎｅｌｓｏｎらによって米国特許第５，６５８，７３７号において記載される化学発光化合物；またはＡｒｎｏｌｄらによって米国特許第５，６３９，６０４号において記載される化学発光化合物）である。特に好ましい化学発光標識としては、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物（例えば、標準的なＡＲまたはその誘導体（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−メチル−ＡＥ、３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、ならびに２−メチル−ＡＥ））が挙げられる。

いくつかの適用において、少なくとも一定程度の自己相補性を示すプローブが、試験サンプルにおけるプローブ：標的二重鎖の検出を、検出前に非ハイブリダイズプローブの除去を最初に必要とすることなく容易にするために、望ましい。例として、「分子トーチ（ｔｏｒｃｈ）」と呼ばれる構造が、結合領域によって接続されかつ所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、別個の自己相補性領域（作製した「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン（ｔａｒｇｅｔ ｃｌｏｓｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」）を含むように設計される。変性条件に曝された場合、その分子トーチの２つの相補性領域（これらは、完全に相補性であっても、部分的に相補性であってもよい）が融解し、それにより、その所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件に回復された場合にその標的結合ドメインが標的配列に対するハイブリダイゼーションのために利用可能になる。分子トーチは、その標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインでの標的配列に対するハイブリダイゼーションを支持するように、設計される。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、その分子トーチが標的核酸にハイブリダイズした場合とは異なって自己ハイブリダイズした場合には異なるシグナルが生成されるように位置し、それによって結合している標識を有する実現可能な非ハイブリダイズプローブの存在下で試験サンプル中のプローブ：標的二重鎖の検出を可能にする、相互作用する標識（例えば、蛍光剤／消光剤）が、挙げられる。分子トーチは、米国特許第６，３６１，９４５号（その開示は、本明細書によって参考として援用される）において完全に記載される。

本発明に関連して使用され得る自己相補性ハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、「分子ビーコン」と一般的に呼ばれる構造である。分子ビーコンは、標的相補配列を有する核酸分子、標的核酸配列の非存在下でプローブを閉鎖構造の状態で保持する親和性対（または核酸アーム）、およびそのプローブが第二構造の状態である場合に相互作用する標識対を含む。その標的核酸と標的相補配列とのハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離させ、それによって、そのプローブを解放構造へと変換させる。この開放構造への変換は、上記標識対の相互作用減少に起因して検出可能である。この標識対は、例えば、発蛍光団と消光剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬとＥＤＡＮＳ）であり得る。分子ビーコンは、米国特許第５，９２５，５１７号（その開示は、本明細書によって参考として援用される）において完全に記載される。特定の核酸配列を検出するために有用な分子ビーコンは、本明細書中に開示されるプローブ配列のうちの１つのいずれかの末端に、発蛍光団を含む第一核酸アームと、消光部分を含む第二核酸アームとを結合することによって、作製され得る。この構成において、本明細書中に開示されるプローブ配列は、生じる分子ビーコンの標的相補的「ループ」部分として作用する。

分子ビーコンは、好ましくは、相互作用する検出可能標識対で標識される。相互作用する標識対のメンバーとして好ましい検出可能な標識の例は、ＦＲＥＴエネルギー移動機構または非ＦＲＥＴエネルギー移動機構によって互いと相互作用する。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、発色団間の共鳴相互作用による、原子間距離よりもかなり大きな距離にわたる、熱エネルギーへの変換を伴うことも、ドナーおよびアクセプターが動力学的衝突することもない、分子中の吸収部位からその利用部位へのエネルギー量子の無放射遷移を含む。この「ドナー」とは、エネルギーをまず吸収する部分であり、「アクセプター」とは、そのエネルギーがその後移動する先の部分である。ＦＲＥＴに加えて、励起エネルギーがドナー分子からアクセプター分子へと移動され得る、少なくとも３種の他の「非ＦＲＥＴ」エネルギー移動プロセスが、存在する。

２つの標識が、一方の標識によって放射されるエネルギーが、ＦＲＥＴ機構によってであろうと、または非ＦＲＥＴ機構によってであろうと、第二の標識によって受容または吸収され得るのに充分に近接した状態である場合、その２つの標識は、互いと「エネルギー移動関係」にあると言われる。例えば、分子ビーコンが、ステム二重鎖の形成によって閉鎖状態で維持され、そのプローブの一方のアームに結合した発蛍光団からの蛍光発光が、もう一方のアーム上の消光部分によって消光される場合に、このことは、当てはまる。

分子ビーコンについての非常に好ましい標識部分としては、発蛍光団、および蛍光消光特性を有する第二部分（すなわち、「消光剤」）が挙げられる。この実施形態において、特徴的シグナルは、起こり得る特定の波長の蛍光であるが、あるいは、可視光シグナルであり得る。蛍光が関与する場合、発光の変化は、好ましくは、ＦＲＥＴに起因するか、または放射性エネルギー移動もしくは非ＦＲＥＴ様式に起因する。閉鎖状態で一対の相互作用標識を有する分子ビーコンが、適切な振動数の光によって刺激される場合、蛍光シグナルが第一レベルで生成される。この第一レベルは、非常に低いものであり得る。この同じプローブが開放状態にあり、そして適切な振動数の光によって刺激される場合、その発蛍光団と消光部分とは、それらの間でのエネルギー移動が実質的に排除されるように充分に互いから分離されている。その状態下では、消光部分は、発蛍光団部分からの蛍光を消光不可能である。その発蛍光団が、適切な波長の光エネルギーによって刺激される場合、上記第一レベルよりも高い第二レベルの蛍光シグナルが、生成される。その２つの蛍光レベルの差は、検出可能でありかつ測定可能である。この様式で発蛍光団部分および消光部分を使用すると、その分子ビーコンは、「開放」構造の状態でのみ「オン」であり、分子ビーコンは、容易に検出可能なシグナルを放射することによって、そのプローブが標的に結合されていることを示す。そのプローブの構造状態は、標識部分間の相互作用を調節することによって、そのプローブから生成されるシグナルを変化させる。

本発明に関連して、使用され得るドナー／アクセプター標識対の例としては、ＦＲＥＴ対を非ＦＲＥＴ対から区別することは企図せずに、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリトロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が挙げられる。ドナー色素およびアクセプター色素が異なる場合に、エネルギー移動が、そのアクセプターの増感蛍光の出現によってか、またはドナー蛍光の消光によって、検出され得ることを、当業者は理解する。そのドナー種とアクセプター種とが同じである場合、エネルギーは、生じる蛍光偏向解消によって、検出され得る。非蛍光性アクセプター（例えば、ＤＡＢＣＹＬ色素およびＱＳＹ ７色素）は、有利なことに、直接的（すなわち、非増感）アクセプター励起から生じるバックグラウンド蛍光という潜在的問題を解消する。ドナー−アクセプター対の一メンバーとして使用され得る好ましい発蛍光団部分としては、フルオレセイン、ＲＯＸ、およびＣＹ色素（例えば、ＣＹ５）が挙げられる。ドナー−アクセプター対の別のメンバーとして使用され得る非常に好ましい消光部分としては、ＤＡＢＣＹＬおよびＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ部分（これは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）から入手可能である）が挙げられる。

核酸に標識を結合して標識を検出するための合成技術および方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９），Ｃｈａｐｔｅｒ １０；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号；Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号；およびＢｅｃｋｅｒら、欧州特許出願第０ ７４７ ７０６号を参照のこと）。

（プローブの化学的組成）
本発明に従うプローブは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを含み、そして必要に応じて、そのプローブに共有結合している検出可能な標識を保有し得る。そのプローブのヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログは、窒素複素環式塩基または窒素複素環式塩基アナログを含み、そのヌクレオシドは、例えば、ホスホジエステル結合によって一緒に連結されてポリヌクレオシドを形成している。従って、プローブは、従来のリボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み得るがまた、これらの分子の化学的アナログを含み得る。プローブの「骨格」は、当該分野で公知の種々の結合から構成され得る。その結合としては、１つ以上の糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（時には、Ｈｙｌｄｉｇ−ＮｉｅｌｓｅｎらのＰＣＴ国際公開第９５／３２３０５号によって記載されるように「ペプチド核酸」と呼ばれる）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせが挙げられる。そのプローブ糖部分は、リボースもしくはデオキシリボース、または公知の置換基を有する類似の化合物（例えば、２’−Ｏ−メチルリボース）および２’ハライド置換基（例えば、２’−Ｆ）を有する類似の化合物のいずれかであり得る。その窒素塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その公知のアナログ（例えば、イノシン、すなわち「Ｉ」；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５〜３６，Ａｄａｍｓら編、第１１版、１９９２を参照のこと）、プリン塩基もしくはピリミジン塩基の公知の誘導体（例えば、Ｎ^４−メチルデオキシグアノシン、デアザプリンもしくはアザプリン、デアザピリミジンもしくはアザピリミジン、５位もしくは６位に置換基を有するピリミジン塩基、２位か６位かもしくは８位に改変型置換基もしくは置換基を有するプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ^６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ^４−アルキル−ピリミジン（Ｃｏｏｋ、ＰＣＴ国際公開第９３／１３１２１号を参照のこと）、ならびにポリマーの１つ以上の残基についてその骨格が窒素塩基を含まない「無塩基」残基であり得る（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号を参照のこと）。プローブは、ＲＮＡおよびＤＮＡにおいて見出される従来の糖、塩基、および結合のみを含み得るか、または従来成分および従来の置換基（例えば、メトキシ骨格を介して連結された従来の塩基、または従来の塩基と１つ以上の塩基アナログとを含む核酸）の両方を含み得る。

種々の長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブが、ＨＩＶ−１の核酸、ＨＩＶ−２の核酸、またはＨＩＶ−１とＨＩＶ−２との組み合わせの核酸を検出するために使用され得るが、本発明のおいて好ましいプローブは、１００ヌクレオチドまでの長さを有し、より好ましくは、６０ヌクレオチドまでの長さを有する。本発明のオリゴヌクレオチドについての好ましい長さ範囲は、１０塩基長〜１００塩基長であるか、またはより好ましくは１５塩基長と５０塩基長との間であるか、またはなおより好ましくは１５塩基長と３０塩基長との間である。しかし、下記の特定のプローブ配列もまた、核酸クローニングベクターもしくは転写物またはより長い他の核酸中にて提供され得、依然として、標的核酸を検出するために使用され得る。従って、本発明に従う有用なプローブは、限定された長さである標的相補的塩基配列と、標的配列とは相補的ではない検出されるべきではない１つ以上の付属配列とを含み得る。例えば、分子ビーコンは、検出されるべき標的とは相補的ではない「アーム」配列により挟まれた標的相補的ループ配列を含む。

（増幅プライマーおよび検出プローブの選択）
望ましい特徴を備える増幅プライマーおよびプローブを設計するための有用な指針が、本明細書中に記載される。ＨＩＶ−１核酸および／またはＨＩＶ−２核酸を増幅およびプロービングするための最適な部位は、２つ、好ましくは３つの、保存領域を含み、その保存領域は、各々が、約１０塩基長〜約１５塩基長よりも長く、約２００塩基〜約３００塩基内の連続配列である。１組のプライマーまたはプロモーター−プライマーを用いて観察される増幅の程度は、いくつかの要因（そのオリゴヌクレオチドがその相補配列とハイブリダイズする能力、およびそのオリゴヌクレオチドが酵素により伸長される能力が挙げられる）に依存する。ハイブリダイゼーション反応の程度および特異性は、多数の要因によって影響を受けるので、それらの要因を操作することによって、特定のオリゴヌクレオチドの正確な感受性および特異性が、そのオリゴヌクレオチドがその標的に対して完全に相補的であろうとなかろうと、決定される。種々のアッセイ条件の影響は、当業者にとって公知であり、そしてＨｏｇａｎらによって米国特許第５，８４０，４８８号（その開示は、本明細書によって参考として援用される）に記載される。

標的核酸配列の長さ、従って、プライマー配列またはプローブ配列の長さは、重要で得あり得る。ある場合には、望ましいハイブリダイゼーション特徴を有するプライマーまたはプローブを生じる、種々の位置および長さの、特定の標的領域由来のいくつかの配列が、存在し得る。完全に相補的ではない核酸がハイブリダイズすることは可能であるが、完全に相同な最も長い塩基配列が、通常は主に、ハイブリッドの安定性を決定する。

増幅プライマーおよびプローブは、オリゴヌクレオチド：非標的（すなわち、標的核酸に対して類似する配列を有する核酸）核酸ハイブリッドの安定性を最小にするように配置されるべきである。増幅プライマーおよび検出プローブは、標的配列と非標的配列とを区別可能であることが、好ましい。プライマーおよびプローブを設計する際には、これらのＴｍ値の差は、可能な限り大きい（例えば、少なくとも２℃、好ましくは５℃）ものであるべきである。

非特異的伸長（プライマー−ダイマーまたは非標的コピーの形成）の程度はまた、増幅効率に影響を与え得る。この理由が原因で、プライマーは、特にその配列の３’末端に、低い自己相補性または交差相補性を有するように選択される。長いホモポリマー領域および高ＧＣ含量は、偽プライマー伸長を減少するために回避される。市販のコンピューターソフトウェアは、その設計のこの局面を補助し得る。利用可能なコンピュータープログラムとしては、ＭａｃＤＮＡＳＩＳ^ＴＭ ２．０（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｔｄ．）およびＯＬＩＧＯ ｖｅｒ．６．６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ；Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）が挙げられる。

当業者は、ハイブリダイゼーションとは、相補的核酸の２つの一本鎖が会合して水素
結合した二本鎖を形成することであることを認識する。その２つの鎖のうちの１つが完全にかまたは部分的にハイブリッドに関与する場合には、その鎖は、新しいハイブリッドの形成に関与する可能性が低いことが、暗黙のことである。対象とする配列のかなり部分が一本鎖であるようにプライマーおよびプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの速度および程度が、大いに増大され得る。その標的が統合されたゲノム配列である場合、その標的は、（ポリメラーゼ連鎖反応の産物と同様に）自然に二本鎖形態で存在する。これらの二本鎖標的は、プローブとのハイブリダイゼーションに対して本来阻害的であり、ハイブリダイゼーション工程の前に変性を必要とする。

ポリヌクレオチドがその標的にハイブリダイズする速度は、標的結合領域中の標的二次構造の熱安定性の尺度である。ハイブリダイゼーション速度の標準的尺度は、（ヌクレオチドのモル／リットル）×秒として測定されるＣ_０ｔ_１／２である。従って、これは、（プローブの濃度）×（最大のハイブリダイゼーションのうちの５０％がその濃度で生じる時間）である。この値は、種々の量のポリヌクレオチドを、一定時間の間に一定量の標的にハイブリダイズさせることによって、決定される。Ｃ_０ｔ_１／２は、当業者が精通している標準的手順によってグラフで見出される。

（好ましい増幅プライマー）
増幅反応を実施するために有用なプライマーは、標的結合に関与せずそして増幅手順にも検出手順にも実質的には影響を与えないかもしれない、無関係な配列の存在を受容するための種々の長さを有し得る。例えば、本発明に従う増幅反応を実施するために有用なプロモーター−プライマーは、標的核酸にハイブリダイズする最小限の配列と、その最小限の配列の上流に位置するプロモーター配列とを、有する。しかし、その標的結合配列とそのプロモーター配列との間に配列を挿入すると、増幅反応におけるプライマーの有用性を損なうことなく、そのプライマーの長さを変化させ得る。さらに、その増幅プライマーおよび検出プローブの長さは、これらのオリゴヌクレオチドの配列が、望ましい相補的配列をハイブリダイズするための最低限の必要要件に適合する限りは、選択事項である。

表１および表２は、ｐ３１インテグラーゼをコードする領域において、ＨＩＶ−１核酸、ＨＩＶ−２核酸、またはＨＩＶ−１核酸とＨＩＶ−２核酸との組み合わせを増幅するためのプライマーとして使用されたオリゴヌクレオチド配列の具体的な例を示す。表１は、様々な核酸標的の一本の鎖と実質的に相補的なプライマーの配列を示す。表１において示される例示的プライマーは、１７マーのコア配列ＡＣＡＲＹＡＧＴＡＣＷＡＡＴＧＧＣ（配列番号１０）（「Ｒ」は、Ａ／Ｇを示し、「Ｗ」は、ＡまたはＴ／Ｕを示す）を含む標的相補的配列を有し、それによって、１個まで、または２個までの塩基アナログの置換を可能にする。イノシンは、この目的のために使用され得る非常に好ましい塩基アナログの例であり、上記コア配列の５位および／または１１位が、この塩基アナログで置換されて非常に良好な結果を提供し得る。上記増幅手順において使用されるプライマーのうちの１つが、この１７マーコアを含む標的相補的配列を有することは、好ましい。このプライマーは、コア配列の上流末端に付加された数個のヌクレオチドをさらに含み得、そしてコア配列の下流末端に付加された少数のヌクレオチドを含み得る。例えば、その上流末端に付加された１つ、２つ、または３つのヌクレオチドを含むことが、好都合である。表２は、本発明の開発の間に使用された標的相補的プライマーの配列と、プロモーター−プライマーの完全配列とを示す。特に、表１および表２におけるオリゴヌクレオチド配列は、増幅されるべき標的核酸の対抗する鎖に対して実質的に相補的である。

ＨＩＶ−１核酸標的および／またはＨＩＶ−２核酸標的を増幅するために有用なプライマーは、ヌクレオチドアナログを含み得る。例えば、配列番号５の基本プライマー配列と比較した場合、配列番号６を有するプライマー、配列番号７を有するプライマー、および配列番号９を有するプライマーは、それぞれ、１６位の単一イノシン残基の存在、１０位のＣをＴ残基にする置換および１６位におけるイノシン残基、または１０位および１６位におけるイノシン置換によって、異なる。本明細書中で示される実験的知見によって確認されるように、これらの塩基の差異は、本明細書中に記載される発見より前には予測され得なかった有益な特性を付与した。より具体的には、これらの結果は、これらの変異体プライマーのうちの１つは、一本のもう一方の鎖のプライマーと対合した場合に、ＨＩＶ−１テンプレートについての特異性を失い、そしてＨＩＶ−１テンプレートおよびＨＩＶ−２テンプレートの両方を実質的に等しい効率で増幅する能力を獲得したことを示した。このことは、上記プライマー中の特定の位置が改変型塩基または改変型塩基アナログによって置換され得る。

表２は、ＨＩＶ−１核酸配列およびＨＩＶ−２核酸配列を増幅するために使用された、標的相補的オリゴヌクレオチド配列および対応するプロモーター−プライマー配列を示す。上記のように、すべてのプロモーター−プライマーは、その３’末端に標的配列に対して実質的に相補的な（これは、標的配列に対してハイブリダイズ可能であることを意味する）配列を含み、その５’末端にＴ７プロモーター配列を含んだ。表２において配列番号１７〜配列番号２２により同定されるプライマーは、それぞれ、配列番号１１〜配列番号１６として同定されるプライマーに対応するプロモーター−プライマーである。表において、Ｔ７プロモーター配列に対応する塩基には、下線を付している。

ｐ３１インテグラーゼをコードする領域においてＨＩＶ−１配列、ＨＩＶ−２配列、またはＨＩＶ−１配列とＨＩＶ−２配列との組み合わせを増幅するための好ましいプライマーセットは、増幅されるべき標的核酸とハイブリダイズする第１プライマー（例えば、表２中に列挙されるプライマーのうちの１つ）と、その第１プライマーの伸長産物の配列に対して相補的である第２プライマー（例えば、表１において列挙されるプライマー配列のうちの１つ）とを、含んだ。非常に好ましい実施形態において、上記第１プライマーは、その５’末端にＴ７プロモーター配列を含むプロモーター−プライマーである。

（好ましい検出プローブ）
本発明の別の局面は、ＨＩＶ−１核酸、ＨＩＶ−２核酸、またはＨＩＶ−１核酸とＨＩＶ−２核酸との組み合わせを検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得るオリゴヌクレオチドに関する。実際、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸において存在する標的配列を増幅するための方法は、アンプリコンを検出するための必要に応じたさらなる工程を含み得る。ＨＩＶ−１核酸および／またはＨＩＶ−２核酸を検出するためのこの手順は、試験サンプルを、標的核酸配列にハイブリダイズするかまたはその相補体とハイブリダイズするハイブリダイゼーションアッセイプローブと、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で接触させ、それによって、検出するための安定なプローブ：標的二重鎖を形成する工程を包含する。次に、そのハイブリッドが、試験サンプル中のＨＩＶ−１核酸標的もしくはＨＩＶ−２核酸標的の有無の指標として試験サンプル中に存在するか否かを決定するための工程が、存在する。これは、上記プローブ：標的二重鎖を検出する工程を包含し得、好ましくは、均一アッセイ系を含み得る。

ＨＩＶ−１核酸、ＨＩＶ−２核酸、またはＨＩＶ−１核酸とＨＩＶ−２核酸との組み合わせを検出するために有用なハイブリダイゼーションアッセイは、これらの標的核酸配列に対して実質的に相補的な塩基配列を含む。従って、本発明のプローブは、標的核酸配列のうちの一方の鎖またはその相補体にハイブリダイズする。これらのプローブは、必要に応じて、検出されるべき標的核酸に対して相補的であっても相補的ではなくてもよい標的核酸領域の外側に、さらなる塩基を有し得る。

好ましいプローブは、塩濃度が０．６Ｍ〜０．９Ｍの範囲にある場合の約６０℃に対応するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするのに充分な程度に、標的核酸に対して相同である。好ましい塩としては、塩化リチウムが挙げられるが、他の塩（例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム）はまた、ハイブリダイゼーション溶液中で使用され得る。例示的な高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、あるいは、０．４８Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＥＧＴＡによってか、または０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％ラウリル硫酸リチウム、６０ｍＭコハク酸リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ ＥＧＴＡによって、提供される。

本発明に従うプローブは、ＨＩＶ−１ゲノムおよびＨＩＶ−２ゲノムの部分に対して実質的に相補的な配列またはその部分に対して実質的に対応する配列を有する。ＨＩＶ−１核酸配列、ＨＩＶ−２核酸配列、またはＨＩＶ−１核酸配列とＨＩＶ−２核酸配列との組み合わせを検出するために好ましい特定のプローブは、標的相補的な塩基配列を含むプローブ配列を含み、検出されるべき核酸に対して相補的ではない１つ以上の塩基配列を必要に応じて含む。その標的相補的塩基配列は、好ましくは、１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さ範囲にあり、この配列は、増幅された核酸に対してハイブリダイズ可能である。ＨＩＶ−１核酸配列、ＨＩＶ−２核酸配列、またはＨＩＶ−１核酸配列とＨＩＶ−２核酸配列との組み合わせを検出可能な特定の好ましいプローブは、１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、１５ヌクレオチド〜６０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド〜４５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さ範囲にある標的相補的配列を有する。当然、これらの標的相補的配列は、直鎖状配列であり得るか、またはこれらの標的相補的配列は、検出されるべき標的配列に対して非相補的である１つ以上の必要に応じた核酸配列を有する、分子ビーコンの構造、分子トーチの構造、または他の構築物の構造中に含まれ得る。上記のように、プローブは、ＤＮＡから構成され得るか、ＲＮＡから構成され得るか、ＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせから構成され得るか、核酸アナログから構成され得るか、または１つ以上の改変型ヌクレオシド（例えば、リボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシド）を含み得る。

本発明に従う特定のプローブは、検出可能な標識を含む。一実施形態において、この標識は、非ヌクレオチドリンカーによって上記プローブに結合される。例えば、検出プローブは、米国特許第５，５８５，４８１号および米国特許第５，６３９，６０４号（特に、第１０欄第６行〜第１１欄第３行および実施例８に記載される）において実質的に記載されるような、リンカーを介して結合された化学発光アクリジニウムエステル化合物で標識され得る。

表３は、ＨＩＶ−１標的配列、ＨＩＶ−２標的配列、またはＨＩＶ−１標的配列とＨＩＶ−２標的配列との両方を検出するために使用された、ハイブリダイゼーションプローブのうちのいくつかの塩基配列を示す。これらの標的核酸を検出するための代替的プローブは、もう一方のセンス鎖にハイブリダイズし得るので、本発明はまた、この表において示される配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む。

上記のように、多数の様々な骨格構造が、本発明のハイブリダイゼーションプローブの塩基配列についての足場として使用され得る。特定の非常に好ましい実施形態において、このプローブは、メトキシ骨格を含むか、またはその核酸骨格中に少なくとも１つのメトキシ結合を含む。

（捕捉オリゴヌクレオチドの選択および使用）
好ましい捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体上での固定のための標的として作用する第二配列（すなわち、「テール」配列）に共有結合している、標的配列と実質的に相補的な第一配列（すなわち、「標的相補的」配列）を含む。捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列を連結するための任意の骨格が、使用され得る。特定の好ましい実施形態において、この捕捉オリゴヌクレオチドは、この骨格において少なくとも１つのメトキシ結合を含む。このテール配列（これは、好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端にある）は、相補的塩基配列にハイブリダイズし、それにより、ハイブリダイズした標的核酸を、生物学的サンプル中にある他の成分よりも優先して捕捉するための手段を提供するために使用される。

相補的塩基配列にハイブリダイズする任意の塩基配列が、上記テール配列において使用され得るが、そのハイブリダイズする配列は、約５ヌクレオチド残基〜約５０ヌクレオチド残基に及ぶことが、好ましい。特に好ましいテール配列は、実質的にホモポリマーであり、約１０ヌクレオチド残基〜約４０ヌクレオチド残基またはより好ましくは約１４残基〜約３０残基を含む。本発明に従う捕捉オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする第一配列と、固体支持体に固定されたオリゴ（ｄＴ）ストレッチにハイブリダイズする第二配列とを、含み得る。

図１に示される化合物を使用して、生物学的サンプルにおいて、ＨＩＶ−１配列、ＨＩＶ−２配列、ＨＩＶ−１配列とＨＩＶ−２配列との組み合わせを検出するためのアッセイの１つは、捕捉オリゴヌクレオチドを使用して標的核酸を捕捉する工程；少なくとも２つのプライマーを使用して、捕捉された標的領域を増幅する工程；ならびに増幅された核酸中に含まれる配列に標識プローブをまずハイブリダイズさせ、その後、結合した標識プローブから生じるシグナルを検出することによって、増幅した核酸を検出する工程；を包含する。

上記の捕捉する工程は、好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドを使用し、この捕捉オリゴヌクレオチドにおいて、この捕捉オリゴヌクレオチドの一部は、ハイブリダイズする条件下で、標的核酸中の配列に特異的にハイブリダイズし、そしてテール部分が、例えば、標的領域がサンプルの他の成分から分離されるのを可能にする結合対（例えば、ビオチン−アビジン結合対）の一成分（例えば、リガンド）として作用する。好ましくは、この捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分は、固体支持体粒子に固定された相補的配列にハイブリダイズする配列である。好ましくは、第一に、上記捕捉オリゴヌクレオチドおよび標的核酸は、溶液相ハイブリダイゼーション動力学を利用するために、溶液中に存在する。ハイブリダイゼーションは、捕捉オリゴヌクレオチド：標的核酸複合体を生じる。この複合体は、この捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分と、固定された相補的配列とのハイブリダイゼーションを介して、固定されたプローブに結合し得る。従って、標的核酸と、捕捉オリゴヌクレオチドと、固定されたプローブとを含む、複合体が、ハイブリダイゼーション条件下で形成される。好ましくは、固定されたプローブが、繰り返し配列であり、より好ましくは、ホモポリマー配列（例えば、ポリＡ、ポリＴ、ポリＣ、またはポリＧ）であり、これらの配列は、テール配列に対して相補的でありかつ固体支持体に結合されている。例えば、上記捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分がポリＡ配列を含む場合、固定されたプローブは、ポリＴ配列を含むが、相補的配列の任意の組み合わせが、使用され得る。上記捕捉オリゴヌクレオチドはまた、「スペーサー」残基を含み得、この「スペーサー」残基は、標的にハイブリダイズする塩基配列と、固定されたプローブにハイブリダイズするテールの塩基配列との間に位置する１つ以上の塩基である。任意の固体支持体が、標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド複合体に結合するために使用され得る。有用な支持体は、溶液中で遊離しているマトリックスまたは粒子（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、そして好ましくは、磁気的に結合可能な粒子）であり得る。固定されたプローブを固体支持体に結合させる方法は、周知である。支持体は、好ましくは、標準的な方法（例えば、遠心分離、磁性粒子の磁力など）を用いて溶液から回収される、粒子である。好ましい支持体は、常磁性単分散粒子（すなわち、±約５％の大きさで均一である）である。

標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド：固定されたプローブの複合体を回収する工程は、標的核酸を（生物学的サンプル中のその標的核酸の濃度と比較して）有効に濃縮し、そして生物学的サンプル中に存在し得る増幅インヒビターからその標的核酸を精製する。その捕捉された標的核酸は、１回以上洗浄され得、例えば、標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド：固定されたプローブの複合体が結合している粒子を、洗浄溶液中に再懸濁し、その後、複合体が結合した粒子を上記のようにその洗浄溶液から回収することによって、標的をさらに精製する。好ましい実施形態において、上記の捕捉する工程は、捕捉オリゴヌクレオチドに標的核酸を連続的にハイブリダイズさせ、その後、そのハイブリダイゼーション条件を調整して、その捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分と固定された相補的配列とのハイブリダイゼーションを可能にする（例えば、ＰＣＴ番号 ＷＯ９８／５０５８３に記載されるようにする）ことによって、行われる。その捕捉する工程と、必要に応じた任意の洗浄する工程とが完了した後で、その標的核酸は、必要に応じて、その標的核酸が捕捉オリゴヌクレオチドから遊離することなく増幅され得る。

有用な捕捉オリゴヌクレオチドはまた、増幅されるべき核酸分子の配列に対するミスマッチを含み得る。首尾よい標的核酸および核酸増幅は、ミスマッチしている配列が、増幅されるべき配列を含む核酸分子にハイブリダイズする限りは、達成され得る。実際には、ＷＯ０３／１０６７１４により同定される国際特許出願公開において記載されるような、ＨＩＶ−１核酸の捕捉のためのオリゴヌクレオチドが、本明細書中に開示される方法（ＨＩＶ−２を検出する方法を含む）を実施するために使用された。

（標的ポリヌクレオチド配列を増幅および検出するための好ましい方法）
本発明の好ましい方法は、下記に示される実施例において記載され示されている。図１は、ウイルスゲノムの標的領域（太い水平実線によって表される）を検出するために使用され得る１つの系を模式的に示す。この基本的系は、以下の４種のオリゴヌクレオチド（より短い実線によって表される）を含む：標的領域中の配列とハイブリダイズする配列と、生物学的サンプル中に存在する標的領域を捕捉するために、固体支持体上に固定された相補的配列にハイブリダイズするテール（「Ｔ」）とを含む１つの捕捉オリゴヌクレオチド；標的領域中のＨＩＶ−１配列またはＨＩＶ−２配列に特異的にハイブリダイズする配列と、二本鎖である場合にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの機能的プロモーターとして作用するＴ７プロモーター配列（「Ｐ」）とを含む、１つのＴ７プロモーター−プライマー；上記Ｔ７プロモーター−プライマーを使用して標的領域配列から作製される第一鎖ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする配列を含む、１つの非Ｔ７プライマー；および上記の２つのプライマーを使用して増幅される標的領域の部分に特異的にハイブリダイズする配列を含む、１つの標識プローブ。

上記のように、捕捉された標的領域を、上記の２つのプライマーを使用して増幅することは、当業者が精通している種々の公知の核酸増幅反応のうちのいずれかによって達成され得る。好ましい実施形態において、転写関連増幅反応（例えば、ＴＭＡ）が、使用される。そのような実施形態において、多くの核酸鎖が、１コピーの標的核酸から作製され、それによって、増幅された配列に結合しているプローブを検出することによって標的の検出が可能になる。好ましくは、転写関連増幅は、２つの型のプライマー（１つは、ＲＮＡポリメラーゼについてプロモーター配列（図１において「Ｐ」と表示されている）を含むので、プロモーター−プライマーと呼ばれる）、２つの酵素（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）、および基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）を、核酸テンプレートから複数のＲＮＡ転写物を生じるための適切な塩および緩衝液を使用する。

図１を参照すると、転写媒介性増幅の間に、捕捉された標的核酸が、第１プライマー（Ｔ７プロモーター−プライマーとして示される）にハイブリダイズされる。逆転写酵素を使用して、相補的ＤＮＡ鎖が、標的ＲＮＡをテンプレートとして使用してＴ７プロモーター−プライマーから合成される。第２プライマー（非Ｔ７プライマーとして示される）は、新たに合成されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズし、この第２プライマーは、逆転写酵素の作用によって伸長されてＤＮＡ二重鎖を形成し、それによって、二本鎖Ｔ７プロモーター領域を形成する。その後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、この機能的Ｔ７プロモーターを使用することによって、複数のＲＮＡ転写物を生じる。ＴＭＡの自己触媒機構は、そのＲＮＡ転写物をテンプレートとして使用してさらなる転写物を形成するｃＤＮＡ合成工程の後に、反復的ハイブリダイゼーション工程およびポリマー化工程を使用し、それによって、標的領域特異的核酸配列を増幅する。

上記検出する工程は、上記の増幅されたＲＮＡ転写物またはアンプリコンに対して特異的に結合する、少なくとも１つの検出プローブを使用する。好ましくは、その検出プローブは、均一検出系を使用して検出され得る標識で標識される。例えば、その標識プローブは、上記のように、化学発光シグナルが生成され得そして検出され得るアクリジニウムエステル化合物で標識され得る。あるいは、標識プローブは、発蛍光団を含み得るか、または対となっている発蛍光団と消光部分とのセットを含み得る。分子ビーコンは、均一検出系において使用され得るそのような標識プローブの一実施形態である。

（ＨＩＶ−１核酸および／またはＨＩＶ−２核酸を検出する方法）
多重アッセイにおいてＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸を検出する３つの異なる方法もまた、発明された。各方法は、交差反応性または分析物特異性であるプライマーの使用によって、そしてまた交差反応性または分析物特異性であるプローブの使用によって、他の方法と区別される。

第１発明の方法では、分析物特異的プライマーの独立したセット（ＨＩＶ−１核酸に特異的な（しかしＨＩＶ−２核酸には特異的ではない）プライマーの第１セットおよびＨＩＶ−２核酸に特異的な（しかしＨＩＶ−１核酸には特異的ではない）プライマーの第２セットを意味する）が、１回の増幅反応においてアンプリコンを合成するために用いられる。合成されたアンプリコンは、その後、ＨＩＶ−１アンプリコンおよびＨＩＶ−２アンプリコンの両方を検出し得る交差反応性プローブを用いて検出される。この方法を用いて得られる陽性のハイブリダイゼーションの結果は、２つの分析物の間を区別することなく、増幅のための核酸テンプレートを提供した試験サンプルが、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のいずれかを含むことを示す。

第２発明の方法では、交差反応性プライマーのセットが、１回の増幅反応においてＨＩＶ−１アンプリコンおよび／またはＨＩＶ−２アンプリコンを合成するために用いられる。合成されたアンプリコンは、その後、別個の分析物特異的プローブを用いて検出される。プローブのうちの一方は、ＨＩＶ−１アンプリコンに特異的であり（しかしＨＩＶ−２アンプリコンには特異的ではない）、一方、プローブのうちの他方は、ＨＩＶ−２アンプリコンに特異的である（しかし、ＨＩＶ−１アンプリコンには特異的でない）。交差反応性プライマーを用いて合成したアンプリコンを検出するための工程は、１回のハイブリダイゼーション反応において分析物特異的プローブを合わせること、または分析物特異的プローブの各々をその増幅反応の産物を含むアリコートと別々にハイブリダイズすることのいずれかを含み得る。プローブが１回のハイブリダイゼーション反応において合わされるならば、陽性の結果は、２つの分析物の間を区別することなく、試験サンプルがＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のいずれかを含むことを示す。あるいは、これらのプローブが、この増幅反応物の独立したアリコートと別々にハイブリダイズされるならば、ハイブリダイゼーション反応の１つにおける陽性の結果は、その反応に含まれるプローブに相補的な分析物が、増幅のための核酸テンプレートを提供した試験サンプル中に存在したことを示す。

第３発明の方法では、交差反応性プライマーのセットが、１回の増幅反応においてＨＩＶ−１アンプリコンおよび／またはＨＩＶ−２アンプリコンを合成するために用いられる。合成されたアンプリコンは、その後、ＨＩＶ−１アンプリコンおよびＨＩＶ−２アンプリコンの両方を検出し得る交差反応性プローブを用いて検出される。この方法を用いて得られる陽性のハイブリダイゼーション結果は、２つの分析物の間を区別することなく、増幅のための核酸テンプレートを提供した試験サンプルがＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のいずれかを含むことを示す。

発明された交差反応性プライマーは、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２を増幅するための多重反応において特に有用である。従来の多重反応は、代表的に、各プライマーセットが、試験されるサンプル中に存在し得る異なる分析物核酸を増幅し得る、少数の（またはさらには数セットの）独立したプライマーセットの使用を含む。プライマーの数が閾値に達した場合、望ましくないプライマー−プライマー相互作用が生じる可能性がある。その場合には、これらのプライマーは、望ましくない伸長産物の産生において消費され得、それにより、分析物特異的アンプリコンの効率的な合成を阻害し得る。この問題の解決策は、複数の分析物の増幅を許容する交差反応性プライマーを使用することであり、それにより、反応物中に含まれねばならないプライマー種の数が減少する。

発明された交差反応性プライマーおよび交差反応性プローブの別の利点もまた、多重増幅反応に関係する。より詳細には、多重増幅反応における少なくとも１つの交差反応性プライマーの好ましい使用（より好ましくは２つの交差反応性プライマーの少なくとも１セットの好ましい使用）により、対象分析物の少なくとも１つの検出における重複性が得られる。この重複した検出は、分析物のうちの１つが変異する傾向があるかまたは１セットの増幅プライマーの使用によって見逃され得る選択的形態で存在する場合、非常に有利である。例えば、多重増幅反応が、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を検出し得る場合、本発明に従って、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の両方を増幅し得る少なくとも１セットのプライマーを用いて増幅反応を実施することが望ましい。その場合、交差反応性プライマーは、ＨＩＶ−１分析物ポリヌクレオチドを増幅するための重複した手段を提供する。同様に、ＨＩＶ−１アンプリコンおよびＨＩＶ−２アンプリコンとハイブリダイズし得る交差反応性プローブは、ＨＩＶ−１に特異的であってＨＩＶ−２には特異的ではないプローブを含むハイブリダイゼーション反応物においてＨＩＶ−１分析物ポリヌクレオチドを検出するための重複した手段を提供する。

明らかなことに、２種類より多くの分析物ポリヌクレオチドの一部を増幅し得る多重アッセイのプライマーの中で所望のレベルの交差反応性は、制限される。例えば、多重反応が３種類の異なる分析物ポリヌクレオチドの一部を増幅し得る場合、本発明による交差反応性プライマーのセットは、３種類のうちの２種類のみの分析物の一部を増幅し得るはずである。多重反応が４種類の異なる分析物ポリヌクレオチドの一部を増幅し得る場合、本発明による交差反応性プライマーのセットは、４種類のうちの２種類のみの分析物または４種類のうちの３種類の分析物のいずれかの一部を増幅し得るはずである。一般的に言って、本発明による交差反応性プライマーのセットは、多重反応において増幅され得る分析物ポリヌクレオチドの合計数よりも少ない種類の分析物ポリヌクレオチドの一部を増幅し得るはずである。このことは、反応におけるプライマーのうちの１種がオリゴｄＴプライマーである場合にそうであり得るように、多重反応の全てのポリヌクレオチド分析物が増幅される状況とは明らかに区別される。

（ＨＩＶ−１核酸、ＨＩＶ−２核酸またはＨＩＶ−１核酸とＨＩＶ−２核酸との組合せを検出するためのキット）
本発明はまた、ウイルス核酸テンプレートを用いてポリヌクレオチド増幅反応を実施するためのキットを包含する。特定の好ましいキットは、標的相補的配列の塩基を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを備え、そして必要に応じて、このハイブリダイゼーションアッセイプローブによって検出されるべき標的を増幅するための、プライマーまたは他の補助的な（ａｎｃｉｌａｒｙ）オリゴヌクレオチドを備える。他の好ましいキットは、インビトロでの増幅反応において標的核酸を増幅するために用いられ得る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを備える。例示的なキットは、増幅されるべき標的核酸配列の対向鎖に相補的である、第１増幅オリゴヌクレオチドおよび第２増幅オリゴヌクレオチドまたは第１増幅プライマーおよび第２増幅プライマーを備える。このキットは、このキットに含まれるプライマーの作用によって合成される増幅産物を検出するための１以上のプローブをさらに含み得る。本発明によるさらに他のキットは、テンプレート核酸を増幅前に他種から精製するための捕捉オリゴヌクレオチドをさらに備え得る。

本発明の一般的原理は、以下の非限定的な実施例を参照して、より十分に理解され得る。

実施例１は、ハイブリダイゼーションプローブのうちのいくつかを同定した手順を記載する。その後、これらのプローブは、ＨＩＶ−１核酸、ＨＩＶ−２核酸またはＨＩＶ−１核酸とＨＩＶ−２核酸との組合せを検出するためのアッセイにおいて用いられた。より詳細には、以下の手順は、合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブについての標的として用いた。以下に示すように、この手順において試験されたプローブのうちの１種は、その後、ＨＩＶ−１標的およびＨＩＶ−２標的についての等しい特異性を示した。

（実施例１：ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ）
合成標的オリゴヌクレオチドを、ＲＮＡ構造を模倣するための２’−ＯＭｅヌクレオチドアナログを用いて、標準的な実験室手順に従って調製した。モデルＨＩＶ−１標的は、配列ＴＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧＡＴＧＡ（配列番号３７）を有し、モデルＨＩＶ−２標的は、配列ＴＴＣＣＴＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＡＴ（配列番号３８）を有した。これらの合成標的にハイブリダイズするためのプローブは、表３に示す配列を有し、これらもまた、２’−ＯＭｅヌクレオチドアナログを用いて調製した。

ハイブリダイゼーション反応物は、約１〜７×１０^８ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性を有する約２×１０^６ＲＬＵのＡＥ標識プローブ、および約０．５ｐｍｏｌの合成標的オリゴヌクレオチドを含んでいた。ネイティブコントロール反応物は、標的オリゴヌクレオチドを省いた。表３に列挙したプローブを、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，６３９，６０４号に記載される手順に従って内部に配置された非ヌクレオチドリンカーによってオリゴヌクレオチド構造体に連結されたＡＥ部分で各々標識した。これらの特許の開示は、本明細書中上記に参考として援用される。配列番号２３のプローブ、配列番号３０のプローブ、配列番号２７のプローブ、配列番号２８のプローブおよび配列番号２９のプローブにおけるリンカーを、７位と８位との間に配置した。配列番号２４のプローブおよび配列番号２５のプローブにおけるリンカーを、１３位と１４位との間に配置した。配列番号２６のプローブにおけるリンカーを、１２位と１３位との間に配置した。配列番号３１のプローブおよび配列番号３２のプローブにおけるリンカーを、１７位と１８位との間に配置した。配列番号３３のプローブにおけるリンカーを２６位と２７位との間に配置した。配列番号３４のプローブにおけるリンカーを９位と１０位との間に配置した。配列番号３５のプローブにおけるリンカーを８位と９位との間に配置した。配列番号３６のプローブにおけるリンカーを１１位と１２位との間に配置した。これらの異なるリンカー位置を全て使用することにより、この標識技術の汎用性を確認した。プローブハイブリダイゼーションを、実施例２に記載される増幅反応に用いられる試薬を含む体積５０μｌのＴｒｉｓ緩衝化溶液中で、６０℃にて１５分間実施した。ハイブリダイゼーション反応の後、０．１５Ｍ 四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）および１％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）のアリコートを添加した。これらの混合物を最初に６０℃にて１０分間インキュベートして、ハイブリダイズしていないプローブに連結した化学発光標識を不活化し、４℃まで短時間冷却し、その後、ハイブリダイゼーションシグナルを読み取った。各サンプル中のハイブリダイズしたプローブに起因した化学発光を、１ｍＭ硝酸および０．１％（ｖ／ｖ）過酸化水素の自動注入、その後の１Ｎ水酸化ナトリウム含有溶液の注入のために構成されたＬＵＭＩＳＴＡＲ ＧＡＬＡＸＹ発光マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．；Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を用いてアッセイした。化学発光反応についての結果を、相対光単位（ＲＬＵ）で測定した。この手順からの代表的な結果を、３つの異なる標的領域の各々について、表４にまとめる。この手順では、シグナル／ノイズ値は、標的核酸の非存在下で測定したバックグラウンドシグナルによって除算した、特異的にハイブリダイズしたプローブに結合した標識によって生成された（ＲＬＵで測定した）化学発光シグナルに対応した。各値は、５回の反復物の平均を表す。

表４に表した結果は、この手順において試験したプローブのうちのいくつかが、標的配列の一方または両方との相互作用後に強いハイブリダイゼーションシグナルを生じることを示した。この手順において用いたプローブのいくつかのみが、合成標的のうちの少なくとも１つとハイブリダイズした場合に、１０よりも実質的に大きいＳ／Ｎ値を生じた。

興味深いことに、非常にわずかな相違が、有用なプローブ配列を互いに区別した。例えば、配列番号２４の配列を有するプローブと比較した場合、配列番号２６のプローブは、２４個のヌクレオチド位置のうちの２つのみが異なっており、ＨＩＶ−２標的についての強い特異性を保持していた。他方、配列番号２５の配列を有するプローブは、これらの２つの異なるヌクレオチド位置のうちの１つのみが配列番号２４のプローブと異なっており、ＨＩＶ−２標的への特異性を示さなかった。実際、配列番号２５のプローブは、これらの２つの標的のうちのいずれに対しても実質的特異性も示すことができず、ＨＩＶ−１標的およびＨＩＶ−２標的に対して実質的に等しい特異性でハイブリダイズし得ることが見出された。これらの３つの場合、これらのプローブは、単一のイノシン塩基を含んでおり、それゆえ、天然に存在するどのＨＩＶ−１核酸配列にも、天然に存在するどのＨＩＶ−２核酸配列にも、対応しなかった。

配列番号２５の配列を有するプローブの普通でないハイブリダイゼーション特性により、このプローブは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のいずれかを検出するために非常に有用になった。ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のいずれかを増幅し得る多重反応の産物に対するこのプローブのハイブリダイゼーションを示す陽性の結果は、増幅のための核酸テンプレートを提供した試験サンプルが、これらの２つの分析物のうちの少なくとも１つを含んでいたことを示す。ＨＩＶ−１に特異的な（しかし、ＨＩＶ−２には特異的でない）別個のプローブを含むハイブリダイゼーションプローブ試薬中の成分としての、配列番号２５の交差反応性プローブの使用は、ＨＩＶ−２分析物を検出するための手段を同時に提供しながらも、ＨＩＶ−１分析物を重複して検出するための手段を有利に提供する。シグナル回収率の低下（表４を参照のこと）に起因して幾分好ましくないが、配列番号３１の配列を有するプローブは、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸とハイブリダイズし得るプローブを用いることが望ましい適用において配列番号２５のプローブの代わりに用いられ得る。

本発明の非常に好ましい実施形態は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかの検出のために、配列番号２５の交差反応性プローブを用いる。例えば、キットは、パッケージングされた以下の組合せを含み得る：配列番号２５のプローブ、ならびにＨＩＶ−１に特異的である（しかしＨＩＶ−２には特異的ではない）オリゴヌクレオチドプライマーセットおよびＨＩＶ−２に特異的である（しかしＨＩＶ−１には特異的ではない）オリゴヌクレオチドプライマーセット。代替的キットは、パッケージングされた以下の組合せを含み得る：配列番号２５のプローブ、ならびにＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２と交差反応性である（これは、これらのプライマーが、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸の両方を増幅し得ることを意味する）オリゴヌクレオチドプライマーセット。

ＨＩＶ−２核酸を検出するために有用であったがＨＩＶ−１核酸を検出するためには有用でなかったプローブとしては、以下が挙げられた：配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３５、および配列番号３６。

ＨＩＶ−１核酸、ＨＩＶ−２核酸、またはＨＩＶ−１核酸とＨＩＶ−２核酸との組合せを増幅するための好ましいプライマー組合せは、核酸テンプレートの供給源としてビリオンを用いる一連の手順において同定された。プロモーター−プライマーおよび対向鎖プライマーを、以下に記載の方法を用いて、組み合わせてスクリーニングした。これらの手順は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）プロトコルを用いて具体的に実施したが、本明細書中に開示されるプライマーを用いて、当業者が精通する代替的インビトロ核酸増幅方法によって、アンプリコンを生成し得る。

実施例２は、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２のｐ３１インテグラーゼ領域を増幅するために有用なプライマーを同定した方法を記載する。

（実施例２：増幅プライマーの同定）
ＨＩＶ−２ Ｂ６ウイルス粒子を含む高力価の細胞溶解産物は、対のプライマーセットを用いた増幅反応において、ＨＩＶ−２テンプレート配列の供給源として役立った。ウイルス陰性の血清を用いて、１００コピー／ｍｌのＨＩＶ−１核酸テンプレートまたは３００コピー／ｍｌのＨＩＶ−２核酸テンプレートのいずれかを含む希釈したストックを調製した。一例では、１００コピー／ｍｌのＨＩＶ−２核酸テンプレートを含むストックを調製した。核酸は、増幅前に、ＨＩＶ−１核酸の捕捉に関して、ＷＯ ０３／１０６７１４によって同定される公開された国際特許出願に記載されるオリゴヌクレオチドを用いてテンプレートを捕捉したこと以外は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／１８６８５号に開示される手順に本質的に従って標本処理および標的捕捉を受けた。明らかなことに、捕捉オリゴヌクレオチドは、アッセイの増幅工程にも検出工程にも関与しない。０．５ｍｌの体積を有するウイルス含有サンプルを、標的捕捉試薬と合わせて、核酸放出および磁性ビーズ上に配置された捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを促進した。ＴＭＡ反応を、本質的にＫａｃｉａｎら（米国特許第５，３９９，４９１号によって記載される通りに実施した。この米国特許の開示は、本明細書中上記で参考として援用されている。プロモーター−プライマーは、標的相補配列の上流のＴ７プロモーター配列ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号３９）を含んでいた。増幅反応を、１００μｌの反応緩衝液中、各々１５ｐｍｏｌのプライマーを用いて種々のプライマーの組合せについて実施した。単離した標的核酸を、標準的な核酸増幅緩衝液においてプライマーと合わせ、６０℃まで１０分間加熱し、次いで４２℃まで冷却して、プライマーのアニーリングを促進した。次いで、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（５，６００単位／反応）およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（３，５００単位／反応）を混合物に添加した。増幅反応を、当業者が精通するように、ＫＣｌ、デオキシリボヌクレオシド５’三リン酸、リボヌクレオシド、５’三リン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、および５％（ｗ／ｖ）グリセロールを含むＴｒｉｓ緩衝化溶液（ｐＨ８．２〜ｐＨ８．５）において実施した。４２℃にて１時間のインキュベーション後、１００μｌの増幅反応物全体を、ＨＩＶ−２と交差反応しなかった非依存性ＨＩＶ−１特異的プローブおよびＨＩＶ−１と交差反応しなかった配列番号２３のＨＩＶ−２特異的プローブを用いて、本質的に実施例１に記載された通りのハイブリダイゼーションアッセイに供した。これらのプローブを、約１〜７×１０^８ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性になるようにアクリジニウムエステルで標識し、次いで各ハイブリダイゼーション反応について２×１０^６ＲＬＵに等しい量で用いた。特異的にハイブリダイズされたプローブを、本質的に実施例１に記載された通りの、均質アッセイにおけるハイブリダイズしていないプローブに結合した化学発光標識の化学的不活化に従って定量した。１０個の反復物を用いて、施行を行った。陽性の結果と判断されるためには、プローブのハイブリダイゼーションを示す化学発光シグナルは、アッセイにおいて５０，０００ＲＬＵを超えなければならない。

表５は、増幅プライマーの異なる組合せを用いて実施された増幅手順からの結果を表す。表に現れる数値は、陽性の施行の百分率を表す。

表５に表す結果は、プライマー組合せのいくつかが、１反応あたり５０コピーのウイルステンプレートという低いレベルでさえも、非常に高レベルのＨＩＶ−１検出能力およびＨＩＶ−２検出能力を与えることを示した。より詳細には、配列番号２の標的相補配列を有するプライマーを、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６のいずれかの標的相補配列を有するプライマーと組み合わせて用いて、優れた結果が得られた。配列番号１４の標的相補配列を有するプライマーを、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のいずれかの標的相補配列を有するプライマーと組合せて用いて、優れた結果がまた達成された。これらの後者の３つのプライマーの標的相補部分は全て、コンセンサス配列ＴＡＧＡＧＡＣＡＧＮＡＧＴＡＣＮＡＡＴＧＧＣ（配列番号４０）に一致し、ここで１０位は、Ｃ、ＴまたはＩによって占められ、１６位はＴまたはＩによって占められる。このコンセンサスに一致するプライマーは、ＨＩＶ−１標的核酸またはＨＩＶ−２標的核酸を増幅するために好ましい。配列番号１４の標的相補配列を有するプライマーと配列番号７の標的相補配列を有するプライマーとの組合せは、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の最大数の遺伝的改変体を有利に増幅し得る。明らかなことに、偽陽性反応は、これらの手順において観察されなかった。上記の実施例は、ＨＩＶ−１に特異的である（しかしＨＩＶ−２には特異的ではない）独立したプローブおよびＨＩＶ−２に特異的である（しかしＨＩＶ−１には特異的ではない）独立したプローブを用いて実施されたアッセイを記載するが、本発明はまた、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に交差反応性であるプローブを用いる、組成物、キットおよび方法を包含する。上記のプライマー組合せのいずれかと組み合わせて用いられ得る交差反応性プローブの特定の例は、配列番号２５の配列および配列番号３１の配列を有する。

オリゴヌクレオチドの選択されたセットが種々の異なるＨＩＶ−２単離体を増幅して検出する能力を次に実証した。

実施例３は、発明したプライマーおよびプローブが、広範囲のＨＩＶ−２単離体を検出するために有用であることを実証した手順を記載する。

（実施例３：ＨＩＶ−２についての広範囲の検出能力）
配列番号７の標的相補配列を有するプライマーおよび配列番号１４の標的相補配列を有するプライマーを、高力価溶解産物として入手可能であった７つの異なるＨＩＶ−２株からＨＩＶ−２テンプレート核酸を増幅するために組み合わせて用いた。これらの標本を、ウイルス陰性血清中に希釈して、３００コピー／ｍｌのウイルステンプレート濃度を有するストックを生成した。先の実施例においてと同様に、０．５ｍｌの体積を有するウイルス含有サンプルを、標的捕捉試薬と合わせて、核酸放出および磁性ビーズ上に配置された捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを促進した。増幅反応を、先の実施例に記載される通りに実施した。アンプリコンを、配列番号２３の配列を有する、ＡＥ標識したＨＩＶ−２特異的プローブを用い、ＬＥＡＤＥＲ ＨＣ＋ルミノメーター（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＣＡ）を用いて検出工程を実施したこと以外は、本質的に実施例１に記載された通りに検出した。少なくとも５０，０００ＲＬＵの特異的ハイブリダイゼーションシグナルを生じるアッセイを、陽性と判断した。全てのアッセイを、１０回の反復物で実施した。これらの手順による結果を、表６に表す。

表６に表される結果は、配列番号７の標的相補配列を有する交差反応性プライマーおよび配列番号１４の標的相補配列を有する交差反応性プライマーが、ＨＩＶ−２の種々の異なる株由来の核酸を増幅し得ること、ならびに、同様に、配列番号２３の配列を有するＨＩＶ−２特異的プローブが、種々の異なるＨＩＶ−２株由来の核酸を検出し得ることを示した。これらのプライマーおよびこのプローブは、本発明の好ましい実施形態を表す。

上記の実施例は、組み合わせた交差反応性プライマーおよび分析物特異的プローブに基づくアッセイを例示したが、本発明はまた、交差反応性プライマーが、これまた交差反応性であるプローブと組み合わせて用いられるかまたは交差反応性であるプローブとともにキット中にパッケージングされる（このプローブが、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の核酸またはアンプリコンに独立してハイブリダイズし得ることを意味する）実施形態を包含する。交差反応性プライマーおよび交差反応性プローブの特定の例は、本明細書中に開示される。例えば、本実施例において用いられた例示的なＨＩＶ−２特異的プローブは、配列番号２５または配列番号３１によって同定される交差反応性プローブのうちの１つによって置換され得る。

以下の実施例は、２つの異なるプライマー組合せが、１５０コピー／反応に等しい量において、ＨＩＶ−２テンプレート核酸を増幅し得たことを実証する。重要なことには、これらの増幅および検出の手順は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＢＶおよびＨＣＶの多重増幅をし得る反応混合物において実施された。これらの結果は、無関係な標的に特異的なプライマーの存在がＨＩＶ−２の検出に悪影響を与えないことを示した。

実施例４は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＢＶおよびＨＣＶを検出し得る多重核酸増幅反応において、発明したプライマーをどのように合わせ得るかを実証した手順を記載する。

（実施例４：多重アッセイにおけるＨＩＶ−２核酸の増幅）
配列番号２０の配列（配列番号１４の標的相補配列）を有するプライマーおよび配列番号２または配列番号７のいずれかの配列を有するプライマーを、反応処方物に添加した。この反応処方物は、ＨＩＶ−１、ＨＢＶおよびＨＣＶを含む分析物を増幅し得るプライマーを含んでいた。標的捕捉、増幅およびこれらの標的のプローブベースの検出を実施するための多重アッセイ処方物は、ＷＯ ０３／１０６７１４によって同定される公開された国際特許出願において開示される。ＷＯ ０３／１０６７１４の開示は、参考として援用される。実施例２においてのように、ＨＩＶ−１ビリオンまたはＨＩＶ−２ビリオンを含むサンプルを、高力価のストックをウイルス陰性血清で希釈することによって調製した。標的捕捉および核酸増幅反応を、本明細書中に記載された通りに０．５ｍｌの希釈したウイルスサンプルを用いて実施した。上記の手順によるＨＩＶ−２アンプリコンの検出を、配列番号２３のＨＩＶ−２特異的プローブを、ＨＩＶ−１アンプリコン、ＨＢＶアンプリコンおよびＨＣＶアンプリコンを検出するために特異的なプローブと一緒に用いて実施した。少なくとも５０，０００ＲＬＵの特異的ハイブリダイゼーションシグナルを生じるアッセイを、陽性と判断した。これらの手順からの結果を、表７に表す。

表７において表される結果により、発明したプライマーの異なる組合せが、ＨＩＶ−１、ＨＢＶおよびＨＣＶをもまた増幅および検出し得る多重反応においてＨＩＶ−２標的核酸を効率的に検出し得ることが確認された。

ｐ３１インテグラーゼをコードする領域におけるＨＩＶ−１配列およびＨＩＶ−２配列を検出する上記のアッセイに加えて、ｐ５１逆転写酵素（ＲＴ）をコードする遺伝子内に位置する第２の標的領域もまた、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸を検出するために有用であることが見出された。この第２の実証を行うために用いた方法は、本質的に上記の通りであった。ｐ５１ ＲＴ標的領域中の交差反応性プローブを同定するための手順において用いられたオリゴヌクレオチドプローブは、表８に提示する配列を有した。

実施例５は、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸のｐ５１ ＲＴ領域にハイブリダイズした候補交差反応性プローブを同定するために用いた手順を記載する。

（実施例５：ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ）
合成標的オリゴヌクレオチドを、標準的な実験室手順に従って調製した。モデルＨＩＶ−１標的は、配列ＣＵＡＧＧＵＡＵＧＧＵＡＡＡＵＧＣＡＧＵＡＵＡＣＵＵＣ（配列番号４５）を有し、一方、モデルＨＩＶ−２標的は、配列ＧＡＵＧＧＵＡＧＧＧＵＡＡＡＵＧＣＡＧＵＡＵＡＣＵ（配列番号４６）を有した。ＨＩＶ−１標的およびＨＩＶ−２標的の両方を、ＲＮＡ前駆体を用いて合成した。これらの合成標的をハイブリダイズするためのプローブは、表８に示す配列を有し、そしてこのプローブを、２’−ＯＭｅヌクレオチドアナログを用いて調製した。

ハイブリダイゼーション反応物は、約１〜７×１０^８ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性を有する約２×１０^６ＲＬＵのＡＥ標識プローブ、および約０．５ｐｍｏｌの合成標的オリゴヌクレオチドを含んでいた。ネガティブコントロール反応は、標的オリゴヌクレオチドを省いた。表８に列挙したプローブを、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，６３９，６０４号に記載される手順に従って、内部に配置された非ヌクレオチドリンカーによってオリゴヌクレオチド構造体に連結したＡＥ部分で各々標識した。これらの特許の開示は、本明細書中上記で参考として援用されている。あるいは、配列番号４２のプローブにおけるリンカーは、ヌクレオチド７とヌクレオチド８との間、ヌクレオチド１１とヌクレオチド１２との間、またはヌクレオチド１２とヌクレオチド１３との間に位置した。配列番号４１のプローブ、配列番号４３のプローブおよび配列番号４４のプローブにおけるリンカーは全て、ヌクレオチド１２とヌクレオチド１３との間に位置した。これらの異なるリンカー位置を使用することにより、この標識技術の汎用性を確認した。プローブハイブリダイゼーションを、実施例２に記載される増幅反応に用いられる試薬を含む体積５０μｌのＴｒｉｓ緩衝化溶液中で、６０℃にて１５分間実施した。ハイブリダイゼーション反応の後、０．１５Ｍ 四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）および１％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）のアリコートを添加した。これらの混合物を最初に６０℃にて１０分間インキュベートして、ハイブリダイズしていないプローブに連結した化学発光標識を不活化し、４℃まで短時間冷却し、その後、ハイブリダイゼーションシグナルを読み取った。各サンプル中のハイブリダイズしたプローブに起因した化学発光を、１ｍＭ硝酸および０．１％（ｖ／ｖ）過酸化水素の自動注入、その後の１Ｎ水酸化ナトリウム含有溶液の注入のために構成されたＬＵＭＩＳＴＡＲ ＧＡＬＡＸＹ発光マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．；Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を用いてアッセイした。化学発光反応についての結果を、相対光単位（ＲＬＵ）で測定した。この手順からの代表的な結果を、３つの異なるプローブ配列の各々について、表９にまとめる。この手順では、シグナル／ノイズ値は、標的核酸の非存在下で測定したバックグラウンドシグナルによって除算した、特異的にハイブリダイズしたプローブに結合した標識によって生成された（ＲＬＵで測定した）化学発光シグナルに対応した。各値は、５回の反復物の平均を表す。

表９に表した結果は、この手順において試験したプローブの大部分が、異なる標的配列の各々との相互作用後に強いハイブリダイゼーションシグナルおよびシグナル／ノイズ比を生じることを示した。明らかなことに、配列番号４２のプローブについて表した結果を、標識がヌクレオチド１２とヌクレオチド１３との間に位置するプローブを用いて得た。しかし、優れた結果がまた、別の配置の標識を有する同じプローブ配列を用いて達成された。より詳細には、配列番号４２の３つのプローブのコレクションについてのシグナル／ノイズ値は、ＨＩＶ−１標的については約２１８〜約２９６の範囲に及び、ＨＩＶ−２標的については約２２０〜約２８２の範囲に及んだ。配列番号４２の配列を有するプローブに加えて、配列番号４３のプローブおよび配列番号４４のプローブもまた、ＨＩＶ−１標的核酸およびＨＩＶ−２標的核酸のいずれかまたは両方の検出のためには非常に好ましい。もちろん、これらの配列の相補体もまた、好ましい代替物である。

興味深いことに、上記のアッセイにおいて良好に機能したプローブはすべて、ＲＮＡおよびＤＮＡの等価な塩基を許容する、ＡＧＧＡＡＧＴＡＴＡＣＴＧＣＡＴＴＴＡＣＣＮＴＡＣＣ（配列番号６２）（ここで、「Ｎ」は、Ａ、ＣまたはＩのいずれかである）によって示されるコンセンサス配列内に含まれる、２１〜２６連続した塩基の標的相補配列を含んでいた。配列番号４１の２６マープローブは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて良好に機能しなかった（表９を参照のこと）。そしてこのプローブは、コンセンサスと適合しない。明らかなことに、この機能の乏しいプローブは、配列番号４３の交差反応性プローブ（これは、このアッセイにおいて良好に機能した）と、ほんの１塩基の変異によって異なっていた。このことは、上記の有利に交差反応性のプローブの非凡でかつ予想外の性質を例示する。

本発明の非常に好ましい実施形態は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかの検出のために、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４４の１以上の交差反応性プローブを用いる。しかし、本発明に従うキットは、パッケージングされた以下の組合せを含み得る：配列番号４２、配列番号４３または配列番号４４の配列を有する任意のプローブ、ならびにＨＩＶ−１に特異的である（しかしＨＩＶ−２には特異的でない）オリゴヌクレオチドプライマーセットおよび／または ＨＩＶ−２に特異的である（しかしＨＩＶ−１には特異的でない）オリゴヌクレオチドプライマーセット。代替的キットは、パッケージングされた以下の組合せを含み得る：配列番号４２、配列番号４３または配列番号４４の配列を有する任意のプローブ、ならびにＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２と交差反応性である（これは、これらのプライマーが、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸の両方を増幅し得ることを意味する）オリゴヌクレオチドプライマーセット。これらの交差反応性プローブ試薬は、以下の実施例において記載された交差反応性増幅プライマーを用いて合成されたＨＩＶ−１アンプリコンまたはＨＩＶ−２アンプリコンが検出される方法における使用に特に好ましい。

明らかなことに、特定の実施形態では、標的相補プローブ配列の５’末端または３’末端に配列（この配列は、ＨＩＶ−１アンプリコンにもＨＩＶ−２アンプリコンにも相補的ではなく、このことは、この配列がＨＩＶ−１アンプリコンともＨＩＶ−２アンプリコンともハイブリダイズしないことを意味する）が付属したプローブを用いることが望ましい。これらの例では、プローブ核酸の全長が塩基長で６０まで、より好ましくは２６までであることが好ましい。ＨＩＶ−１アンプリコンにもＨＩＶ−２アンプリコンにも相補的でない付属配列の例としては、分子ビーコンの「ステム」部分を含む「アーム」配列が挙げられる。

ＨＩＶ−１核酸もしくはＨＩＶ−２核酸、またはＨＩＶ−１核酸とＨＩＶ−２核酸との組合せを増幅するための好ましいプライマー組合せを、核酸テンプレートの供給源としてビリオンを用いる一連の手順において同定した。プロモーター−プライマーおよび対向鎖プライマーを、下記の方法を用いて組み合わせてスクリーニングした。これらの手順を、転写媒介増幅（ＴＭＡ）プロトコルを用いて特に実施したが、本明細書中に開示されるプライマーを用いて、当業者が精通している代替的インビトロ核酸増幅方法によって、アンプリコンを生成し得る。表１０および表１１は、実施例６に記載した手順において用いた増幅プライマーの配列を表す。明らかなことに、配列番号５１〜配列番号５４のプライマーは、それぞれ、配列番号５５〜は５８のプライマーに対応するが、ＨＩＶ−１標的およびＨＩＶ−２標的に相補的ではない上流プロモーター配列をさらに含む。

実施例６は、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２のｐ５１ ＲＴ領域を増幅するために有用なプライマーを同定した方法を記載する。

（実施例６：増幅プライマーの同定）
組織培養由来ＨＩＶ−２ Ｂ６ウイルス粒子を、対になったプライマーセットを用いた増幅反応において、ＨＩＶ−２テンプレート配列の供給源として役立てた。ウイルス陰性血清を用いて、１００コピー／ｍｌのＨＩＶ−１核酸テンプレートまたは３００コピー／ｍｌのＨＩＶ−２核酸テンプレートのいずれかを含む、希釈したストックを調製した。ＨＩＶ−１核酸の捕捉について、公開された国際特許出願第ＷＯ ０３／１０６，７１４号によって記載されるオリゴヌクレオチドを用いてテンプレートを捕捉したこと以外は、公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／１８６８５号に開示される手順に本質的に従って、増幅前に核酸の標本処理および標的捕捉を行った。明らかなことに、捕捉オリゴヌクレオチドは、アッセイの増幅工程にも検出工程にも関与しない。０．５ｍｌの体積を有するウイルス含有サンプルを、標的捕捉試薬と合わせて、核酸放出および磁性ビーズに配置された捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを促進した。ＴＭＡ反応を、本質的にＫａｃｉａｎら（米国特許第５，３９９，４９１号）によって記載されたとおりに実施した。この米国特許の開示は、本明細書中上記で参考として援用されている。プロモーター−プライマーは、配列番号３９によって示されるＴ７プロモーター配列を、標的相補配列の上流に含んでいた。増幅反応を、種々のプライマー組合せについて実施した。増幅反応を、種々のプライマー組合せについて、１００μｌの反応緩衝液中１５ｐｍｏｌの各プライマーを用いて実施した。単離した標的核酸を、標準核酸増幅緩衝液中のプライマーと合わせ、６０℃まで１０分間加熱し、次いで４２℃まで冷却して、プライマーのアニーリングを促進した。次いで、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（５，６００単位／反応）およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（３，５００単位／反応）をこの混合物に添加した。増幅反応を、当業者が精通する通りに、ＫＣｌ、デオキシリボヌクレオシド５’三リン酸、リボヌクレオシド５’三リン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、および５％（ｗ／ｖ）グリセロールを含むＴｒｉｓ緩衝化溶液（ｐＨ８．２〜８．５）中で実施した。４２℃にて１時間のインキュベーション後、１００μｌの増幅反応物全体を、配列番号４２の配列を有する上記のプローブの混合物を用いて、本質的に実施例１に記載される通りにハイブリダイゼーションアッセイに供した。この実証の目的のために、ヌクレオチド７とヌクレオチド８との間との間に標識が配置された配列番号４２の配列を有するプローブ、ヌクレオチド１１とヌクレオチド１２との間との間に標識が配置された配列番号４２の配列を有するプローブ、およびヌクレオチド１２とヌクレオチド１３との間に標識が配置された配列番号４２の配列を有するプローブの混合物を、それぞれ、２：１：１の比で用いた。これらのプローブを、約１〜７×１０^８ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性になるようにアクリジニウムエステルで標識し、次いで各ハイブリダイゼーション反応について約２×１０^６ＲＬＵに等しい量で用いた。特異的にハイブリダイズしたプローブを、本質的に実施例１に記載の通り、均質アッセイにおけるハイブリダイズしていないプローブに結合した化学発光標識の化学的不活化に従って定量した。施行を、１０回の反復物を用いて行った。陽性の結果と判断するためには、プローブハイブリダイゼーションを示す化学発光シグナルは、アッセイにおいて、５０，０００ＲＬＵを超えなければならない。

表１２は、増幅プライマーの異なる組合せを用いて実施した増幅手順からの結果を表す。この表に現れる数値は、陽性の施行の百分率を表す。

表１２に表す結果は、選択したプライマー組合せの全てがＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の検出に有用であることを示した。増幅されるべき標的の一方の鎖に相補的な有用なプライマーの標的相補部分は、コンセンサスＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＣＹＴＴＣＣＡＴＣＣ（配列番号５９）に適合する配列を含んでいた。ここで、１４位は、ＣまたはＴによって占められており、そして２８塩基までの長さを有した。好ましい実施形態では、このプライマーは、コンセンサス配列ＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＣＹＴＴＣＣＡＴＣＣＹＴＧＴＧＧ（配列番号６０）に適合した。ここで、１４位および２３位は、独立してＣまたはＴによって占められる。これらの好ましいプライマーは、増幅されるべきＨＩＶ−１標的にもＨＩＶ−２標的にも相補的ではない、任意の５’配列をさらに含み得る。有用な対向鎖プライマーの標的相補部分は、コンセンサス配列ＣＴＴＡＧＡＴＡＡＡＧＡＮＴＴＹＡＧＧＮＡＧＴＡＴＡ（配列番号６１）に適合した。ここで、１３位は、ＴまたはＩによって占められ、１６位はＣまたはＴによって占められ、そして２０位はＡ、ＣまたはＩによって占められる。このコンセンサスに適合するプライマーはまた、ＨＩＶ−１標的核酸またはＨＩＶ−２標的核酸を増幅するために好ましく、そして増幅されるべきＨＩＶ−１標的またはＨＩＶ−２標的に相補的ではない、任意の５’配列をさらに含み得る。明白なことに、偽陽性反応は、上記の手順において観察されなかった。

上記の実施例は、交差反応性プライマーおよび交差反応性プローブの組合せた使用に基づくアッセイを例示したが、本発明はまた、交差反応性プライマーを組み合わせて用いる実施形態、または独立した分析物特異的ＨＩＶ−１プローブおよびＨＩＶ−２プローブを用いる、キットにおいてパッケージングされる実施形態を包含する。

以下の実施例は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＢＶおよびＨＣＶを多重増幅し得る反応混合物においてこの手順を実施した場合においてさえも、本明細書中に開示された交差反応性ｐ５１ ＲＴ領域のプライマーが、ＨＩＶ−１テンプレートおよびＨＩＶ−２テンプレートを増幅し得たことを実証する。これらの結果は、関係のない標的について特異的なプライマーの存在が、ＨＩＶ−２の検出に悪影響を与えないことを示した。

実施例７は、どのようにして発明のプライマーを、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２，ＨＢＶおよびＨＣＶを検出し得る多重核酸増幅反応において合わせ得るかを実証した手順を記載する。

（実施例７：多重アッセイにおけるＨＩＶ−２核酸の増幅）
配列番号５７の配列（配列番号５３の標的相補配列）を有するプライマーおよび配列番号４９の配列を有するプライマーを、反応処方物に添加した。この反応処方物は、ＨＢＶおよびＨＣＶの組合せ、またはＨＩＶ−１、ＨＢＶおよびＨＣＶの組合せのいずれかを含む分析物を増幅し得るプライマーを含んでいた。これらの標的の標的捕捉、増幅およびプローブベースの検出を実施するための多重アッセイ処方物は、ＷＯ ０３／１０６７１４によって同定される公開された国際特許出願に開示される。ＷＯ ０３／１０６７１４の開示は、参考として援用される。実施例２においてと同様に、ＨＩＶ−１ビリオンまたはＨＩＶ−２ビリオンを含むサンプルを、高力価ストックをウイルス陰性血清で希釈することにより調製した。標的捕捉および核酸増幅反応を、本明細書中に記載される通り、０．５ｍｌの希釈したウイルスサンプルを用いて実施した。ＨＩＶ−２アンプリコンの検出を、先の実施例に記載したプローブ試薬を用いて実施した。ＨＢＶアンプリコンおよびＨＣＶアンプリコンの検出を、これらの標的に特異的な標識したハイブリダイゼーションプローブを用いて実施した。少なくとも５０，０００ＲＬＵの特異的ハイブリダイゼーションシグナルを生じるアッセイを陽性と判断した。これらの手順からの結果を、表１３に表す。

表１３に表す結果は、発明のプライマーが、他のウイルス標的をもまた増幅および検出し得る多重反応においてＨＩＶ−１標的核酸およびＨＩＶ−２標的核酸を効率的に増幅し得ることを確認した。この表にまた示されるように、低レベルのＨＢＶ（１５ＩＵ／ｍｌ）およびＨＣＶサブタイプ２ｂ（６０コピー／ｍｌ）は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を増幅し得る多重反応において効率的に検出された。重要なことに、ＨＩＶ−１特異的増幅プライマーを含む反応条件またはＨＩＶ−１特異的増幅プライマーを省いた反応条件を用いて同一の結果が得られた。従って、開示されたＨＩＶ−１／−２交差反応性プライマーは、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を効率的に検出し、多重反応における残りのウイルス標的の増幅および検出を妨害しなかった。

本発明は、多数の特定の例およびそれらの実施形態を参照して記載されている。もちろん、本発明の多数の異なる実施形態は、上記に詳述した記載を検討した当業者にそれら自体を示唆する。従って、本発明の真の範囲は、添付の請求の範囲を参照して決定されるべきである。

図１は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の核酸（太い水平実線で表される）内の標的領域を検出するために使用され得る、種々のポリヌクレオチドを例示する模式図である。以下の核酸の位置が、標的領域に関して示される：「捕捉オリゴヌクレオチド」は、増幅前に、標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸を捕捉するために使用される核酸を指す、ここで、「Ｔ」は、相補配列を有する固定化オリゴヌクレオチド（示さず）にハイブリダイズするために使用されるテール配列を指す；「非Ｔ７プライマー」および「Ｔ７プロモーター−プライマー」は、ＴＭＡを行なうために使用される２つの増幅プライマーを表し、ここで、「Ｐ」は、Ｔ７プロモーター−プライマーのプロモーター配列を示す；そして「プローブ」は、増幅された核酸を検出するために使用されるプローブを指す。

Claims (52)

1. 試験サンプルが、ＨＩＶ−１分析物核酸およびＨＩＶ−２分析物核酸のうちの少なくとも一方を含むか否かを決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
   （ａ）該試験サンプルと、一対の交差反応性プライマーとを合わせて、反応混合物を形成する工程であって、該一対の交差反応性プライマーは、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸を同時に増幅することができ、第１のプライマー配列および第２のプライマー配列を含み、該第１のプライマー配列は、配列番号１４からなり、必要に応じてＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列を含み、該第２のプライマーは、配列番号２または７のいずれかからなり、必要に応じてＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列を含む、工程；
   （ｂ）インビトロ核酸増幅反応において、工程（ａ）の該反応混合物中に存在する核酸を増幅する工程、および
   （ｃ）ハイブリダイゼーション反応において、工程（ｂ）において合成されたＨＩＶ−１アンプリコン、ＨＩＶ−２アンプリコン、またはその双方のアンプリコンの組み合わせを検出し、それによって、該試験サンプルがＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸の少なくとも１つを含むことを決定する、工程
   を包含する、方法。
2. 前記第１のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第２のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１のプライマー配列および第２のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、ＴＭＡ反応、ＮＡＳＢＡ反応およびＰＣＲ反応からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
6. 前記検出工程におけるハイブリダイゼーション反応は、前記ＨＩＶ−１アンプリコンおよび前記ＨＩＶ−２アンプリコンに独立してハイブリダイズする交差反応性プローブを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記検出工程におけるハイブリダイゼーション反応は、前記第１のＨＩＶ−１アンプリコンにのみハイブリダイズし、前記第１のＨＩＶ−２アンプリコンにはハイブリダイズしないＨＩＶ−１特異的プローブをさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記交差反応性プローブのハイブリダイゼーションを示す陽性シグナルは、前記ＨＩＶ−１特異的プローブのハイブリダイゼーションを示す陽性シグナルがないことと一緒になって、前記試験サンプルが前記ＨＩＶ−２分析物核酸を含みかつ前記ＨＩＶ−１分析物核酸を含まないことを示す、請求項７に記載の方法。
9. ＨＩＶ−１特異的プローブのみを含むハイブリダイゼーション反応において、前記第１のＨＩＶ−１アンプリコンを検出するが、前記第１のＨＩＶ−２アンプリコンを検出しない工程をさらに包含し、該ＨＩＶ−１特異的プローブは、該第１のＨＩＶ−１アンプリコンにのみハイブリダイズし、かつ該第１のＨＩＶ−２アンプリコンにはハイブリダイズしない、請求項６に記載の方法。
10. 前記交差反応性プローブのハイブリダイゼーションを示す陽性シグナルは、ＨＩＶ−１特異的プローブのハイブリダイゼーションを示す陽性シグナルがないことと一緒になって、前記試験サンプルが前記ＨＩＶ−２分析物核酸を含むが、前記ＨＩＶ−１分析物核酸を含まないことを示す、請求項９に記載の方法。
11. 前記交差反応性プローブは、均質な検出可能な標識で標識されている、請求項６に記載の方法。
12. 前記均質な検出可能な標識は、化学発光標識である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記検出する工程は、ルミノメーターで検出する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記検出工程において得られた陽性の結果は、前記第１のＨＩＶ−１アンプリコンの存在と前記第１のＨＩＶ−２アンプリコンの存在との間を区別しない、請求項１に記載の方法。
15. 前記増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２とは異なる少なくとも１つの分析物核酸の少なくとも第１の配列をさらに増幅することができる多重増幅反応である、請求項１に記載の方法。
16. 前記ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２とは異なる少なくとも１つの分析物核酸は、ＨＢＶおよびＨＣＶからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 試験サンプルがＨＩＶ−１分析物核酸を含むか否かを決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）該試験サンプルと、一対の交差反応性プライマーとを合わせて、反応混合物を形成する工程であって、該一対の交差反応性プライマーは、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸を同時に増幅することができ、第１のプライマー配列および第２のプライマー配列を含み、該第１のプライマー配列は、配列番号１４からなり、必要に応じてＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列を含み、該第２のプライマーは、配列番号２または７のいずれかからなり、必要に応じてＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列を含む、工程；
    （ｂ）インビトロ核酸増幅反応において、工程（ａ）の該反応混合物中に存在する核酸を増幅する工程、および
    （ｃ）ハイブリダイゼーション反応において、工程（ｂ）において合成されたＨＩＶ−１アンプリコンを検出し、それによって、該試験サンプルがＨＩＶ−１核酸を含むことを決定する、工程
    を包含する、方法。
18. 前記第１のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記第２のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
20. 前記第１のプライマー配列および第２のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
21. 前記増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、ＴＭＡ反応、ＮＡＳＢＡ反応およびＰＣＲ反応からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
22. 前記検出工程は、均質な検出可能な標識で標識されているＨＩＶ−１特異的ハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
23. 前記均質な検出可能な標識は、化学発光標識である、請求項１７に記載の方法。
24. 前記検出工程は、ルミノメーターで検出する工程を包含する、請求項２３に記載の方法。
25. 前記増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２とは異なる分析物核酸の少なくとも第１の配列をさらに増幅することができる多重増幅反応である、請求項１７に記載の方法。
26. 前記ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２とは異なる少なくとも１つの分析物核酸は、ＨＢＶおよびＨＣＶからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
27. 試験サンプルがＨＩＶ−２分析物核酸を含むか否かを決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）該試験サンプルと、一対の交差反応性プライマーとを合わせて、反応混合物を形成する工程であって、該一対の交差反応性プライマーは、ＨＩＶ−１核酸およびＨＩＶ−２核酸を同時に増幅することができ、第１のプライマー配列および第２のプライマー配列を含み、該第１のプライマー配列は、配列番号１４からなり、必要に応じてＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列を含み、該第２のプライマーは、配列番号２または７のいずれかからなり、必要に応じてＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列を含む、工程；
    （ｂ）インビトロ核酸増幅反応において、工程（ａ）の該反応混合物中に存在する核酸を増幅する工程、および
    （ｃ）ハイブリダイゼーション反応において、工程（ｂ）において合成されたＨＩＶ−２アンプリコンを検出し、それによって、該試験サンプルがＨＩＶ−２核酸を含むことを決定する、工程
    を包含する、方法。
28. 前記第１のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記第２のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
30. 前記第１のプライマー配列および第２のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
31. 前記増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、ＴＭＡ反応、ＮＡＳＢＡ反応およびＰＣＲ反応からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
32. 前記検出工程は、均質な検出可能な標識で標識されているＨＩＶ−２特異的ハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
33. 前記均質な検出可能な標識は、化学発光標識である、請求項２７に記載の方法。
34. 前記検出工程は、ルミノメーターで検出する工程を包含する、請求項３３に記載の方法。
35. 前記増幅工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２とは異なる少なくとも１つの分析物核酸の少なくとも第１の配列をさらに増幅することができる多重増幅反応である、請求項２７に記載の方法。
36. 前記ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２とは異なる少なくとも１つの分析物核酸は、ＨＢＶおよびＨＣＶからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
37. 生物学的サンプル中に存在し得る任意のＨＩＶ−１分析物核酸および任意のＨＩＶ−２分析物核酸を増幅するための組成物であって、以下：
    （ａ）配列番号１４からなり、必要に応じてＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列を含む、第１のプライマー；および
    （ｂ）配列番号２または７のいずれかからなり、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列を含む、第２のプライマー
    を含む、組成物。
38. 前記第１のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項３７に記載の組成物。
39. 前記第２のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項３７に記載の組成物。
40. 前記第１のプライマー配列および第２のプライマー配列が、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項３７に記載の組成物。
41. 前記第１のプライマーは７５塩基までの長さであり、前記第２のプライマーは配列番号２からなる、請求項３７に記載の組成物。
42. 前記第１のプライマーは７５塩基までの長さであり、前記第２のプライマーは配列番号７からなる、請求項３７に記載の組成物。
43. 生物学的サンプル中に存在し得る任意のＨＩＶ−１分析物核酸および任意のＨＩＶ−２分析物核酸を増幅するための組成物であって、以下：
    （ａ）配列番号１３、１４または１５のいずれかからなり、必要に応じてＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列を含む、第１のプライマー；および
    （ｂ）配列番号２からなり、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列を含む、第２のプライマー
    を含む、組成物。
44. 前記第１のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項４３に記載の組成物。
45. 前記第２のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項４３に記載の組成物。
46. 前記第１のプライマー配列および第２のプライマー配列が、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項４３に記載の組成物。
47. 前記第１のプライマーおよび第２のプライマーは各々７５塩基までの長さであり、該第１のプライマーは配列番号１３からなる、請求項４３に記載の組成物。
48. 前記第１のプライマーは、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項４７に記載の組成物。
49. 前記第１のプライマーおよび第２のプライマーは各々７５塩基までの長さであり、該第１のプライマーは配列番号１４からなる、請求項４３に記載の組成物。
50. 前記第１のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項４９に記載の組成物。
51. 前記第１のプライマーおよび第２のプライマーは各々７５塩基までの長さであり、該第１のプライマーは配列番号１５からなる、請求項４３に記載の組成物。
52. 前記第１のプライマー配列は、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸のいずれかに相補的でない上流配列をさらに含む、請求項４１に記載の組成物。

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