JP4202750B2 - ヒト免疫不全ウイルス２（ｈｉｖ−２）を検出するための組成物および方法 - Google Patents
ヒト免疫不全ウイルス２（ｈｉｖ−２）を検出するための組成物および方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮出願第６０／２４２，６２０号、２０００年１０月２３日出願、および米国仮出願第６０／２８０，０５８号、２００１年３月３０日出願の優先権を請求する。これらの関連出願の開示は、本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、ＨＩＶ−２核酸配列を検出するための診断アッセイに関する。
【０００３】
発明の背景
ＨＩＶ／ＡＩＤＳ汎発性は、主に、ＨＩＶ−１による感染のためであるが、ＡＩＤＳの別の原因として、異なるレトロウイルスが出現してきている。このいわゆる「ＨＩＶ−２」ウイルスは、１９８６年に西アフリカでＡＩＤＳ患者から最初に単離され、そして続いて、翌年、米国で初めて、感染性病原体として検出された。１９９４年の終わりまでに、米国では１００症例未満のＨＩＶ−２が報告されてきた。このように表面上は少数であるにもかかわらず、ＨＩＶ−２は、ＨＩＶ−１感染から生じるＡＩＤＳ症例と臨床的に区別不能な、増加する数の免疫抑制疾患における原因病原体として同定されている（Ｋａｎｋｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：２３８（１９８６）；Ｋａｎｋｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８２７（１９８７）；Ｃｌａｖｅｌら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：３４３（１９８６）；Ｃｌａｖｅｌら， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１６：１１８０（１９８７））。ＨＩＶ−２は、その形態およびＣＤ４+細胞への向性によりＨＩＶ−１に関連付けられるが、明らかに別個のウイルスであり、そして単にＨＩＶ−１のエンベロープ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）ではない。
【０００４】
実際、ＨＩＶ−２は、遠くしかＨＩＶ−１に関連しておらず、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質ではおよそ５０％のアミノ酸保存であり、そしてｅｎｖ遺伝子産物では３０％未満のアミノ酸保存しかなく、その存在は、ＨＩＶ−１感染を検出するのに用いられる血清学的アッセイによって有効に検出されない（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅ ＮＴ， ＡＩＤＳ ７：１（１９９３）；Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ ＤＭ， Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １１８：２１１（１９９３））。その結果、ＨＩＶ−２ウイルス核酸を特異的に検出するのに使用可能な核酸プローブを開発する試みがなされてきている。
【０００５】
興味深いことに、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２どちらのゲノムも、異なる単離体間で、実質的な配列不均一性を示す。この不均一性の結果として、ＨＩＶ−１のすべての単離体またはＨＩＶ−２のすべての単離体間の絶対配列保存の実質的な領域を見出すことが不可能となってきている（公開欧州特許出願ＥＰ ０ ８８７ ４２７を参照されたい）。実際、これらのウイルス各々に関して、特有のポリヌクレオチド配列を持つ多くのウイルス単離体が同定されてきており、この要因は、信頼性があり、そして有効な核酸試験のためのプローブを構築するのをさらに困難にしている。
【０００６】
ＨＩＶ−１同様、ＨＩＶ−２もまた、血液および血漿を含む体液の交換を通じて伝播性であるため、感染個体において、ウイルスに対する抗体が検出可能になるか、または症状が明らかになる前に、感染した体液を検出可能であることが重要である。そうでなければＨＩＶ−２感染体液を（例えば輸血中に、全血または血漿を）、あるいは寄付された血液または血漿由来の産物を投与される可能性がある患者を保護するため、寄付された体液中のウイルスの存在を検出し、こうした方法または産物におけるその使用を防止することが特に重要である。ＨＩＶ−２の検出に用いる方法および試薬が、感染初期段階のドナーである可能性がある感染個体に存在しうる、比較的少数のウイルスコピーを検出可能であることもまた、重要である。
【０００７】
ＨＩＶ−２を検出するためのアッセイおよび試薬が、例えば米国特許第６，０２０，１２３号、第５，６８８，６３７号、第５，５４５，７２６号および第５，３１０，６５１号；欧州特許第ＥＰ ０４０４６２５ Ｂ１号および第ＥＰ ０２３９４２５ Ｂ１号；並びに公開欧州特許出願第ＥＰ １０２６２３６ Ａ２号、第ＥＰ ０８８７４２７ Ａ２号に先に開示されている。
【０００８】
発明の概要
本発明の第一の側面は、ＨＩＶ−２核酸配列を検出するための組成物に関する。該組成物は、１００ヌクレオチドまでの長さを有する、第一の増幅オリゴヌクレオチドを含む。この第一の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基の配列を含む。該組成物にやはり含まれるのは、１００ヌクレオチドまでの長さを有する、第二の増幅オリゴヌクレオチドである。この第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列由来の１９−４０の隣接する塩基の配列を含む。本発明の好ましい態様において、第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さは、１９−４０ヌクレオチドである。本発明のさらにより好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドの長さは１８−６０ヌクレオチドであり、より好ましくは１８−３４ヌクレオチドであり、そしてさらにより好ましくは１８−２５ヌクレオチドである。１８−２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する第一の増幅オリゴヌクレオチドの例を、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４に示す。別の好ましい態様において、第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１９−４０ヌクレオチドの範囲である場合、第一の増幅オリゴヌクレオチドの長さは１８−６０ヌクレオチドの範囲であり、そしてプロモーター配列を含む。本発明の別の好ましい態様にしたがって、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１００ヌクレオチドまでの長さを有する場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さは１９−２１ヌクレオチドの範囲である。別の好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドは１８−３４ヌクレオチドの長さを有し、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドは１９−２１ヌクレオチドの長さを有する。さらに別の好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１８−６０ヌクレオチドの長さを有する場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドは１９−２１ヌクレオチドの長さを有する。本発明のさらに別の好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１８−６０ヌクレオチドの長さを有し、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドが１９−４０ヌクレオチドの長さを有する場合、第一の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１５−１９のいずれか１つの配列を有するプロモーター−プライマーである。本発明のさらに別の好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１８−６０ヌクレオチドの長さを有し、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドが１９−２１ヌクレオチドの長さを有する場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２−７のいずれか１つの配列を有することが可能である。本発明のさらに別の好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１８−６０ヌクレオチドの長さを有し、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドが１９−２１ヌクレオチドの長さを有する場合、第一の増幅オリゴヌクレオチドはプロモーター配列をさらに含むことが可能である。例えば、第一の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１５−１９のいずれか１つの配列を有するプロモーター−プライマーであることが可能である。あるいは、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１８−６０ヌクレオチドの長さを有し、第二の増幅オリゴヌクレオチドが１９−２１ヌクレオチドの長さを有し、そして第一の増幅オリゴヌクレオチドがプロモーター配列をさらに含む場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号２−７のいずれか１つであることが可能である。本発明のさらに別の好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１８−６０ヌクレオチドの長さを有し、第二の増幅オリゴヌクレオチドが１９−２１ヌクレオチドの長さを有し、そして第一の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号１５−１９のいずれか１つの配列を有するプロモーター−プライマーである場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２−７のいずれか１つに提供される配列を有することが可能である。本発明の別の好ましい態様にしたがって、第一の増幅オリゴヌクレオチドの長さは１８−２５ヌクレオチドであり、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さは１９−２１ヌクレオチドである。この場合、第一の増幅オリゴヌクレオチドは、例えば配列番号１０−１４のいずれか１つである配列を有することが可能である。あるいは、第一の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１８−２５ヌクレオチドであり、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１９−２１ヌクレオチドである場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２−７のいずれか１つに提供される配列を有することが可能である。本発明のさらに別の非常に好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１８−２５ヌクレオチドであり、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１９−２１ヌクレオチドであり、そして第一の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号１０−１４のいずれか１つに提供される配列を有する場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２−７のいずれか１つであることが可能である。別の態様にしたがって、各々１００ヌクレオチドまでの長さを有する、第一および第二の増幅オリゴヌクレオチドを含む組成物は、配列番号２１またはその相補体を含む配列を有するオリゴヌクレオチド検出プローブをさらに含むことが可能である。好ましくは、検出プローブは、１８ヌクレオチドまでの長さを有し、そしてより好ましくは、配列番号２２−２７のいずれか１つの配列を有する。非常に好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１０−１９のいずれか１つであり、第二の増幅オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号２−７のいずれか１つであり、そしてオリゴヌクレオチド検出プローブの配列は、配列番号２２−２７のいずれか１つである。
【０００９】
本発明の第二の側面は、核酸を含有する生物学的試料が、ＨＩＶ−２ヌクレオチド塩基配列を含むかどうか決定する方法に関する。本発明の方法の第一の工程は、生物学的試料の核酸を、配列番号９の配列を含み、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する第一の増幅オリゴヌクレオチドを含む組成物と接触させることを伴う。この第一の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基の配列を有する。該組成物はさらに、配列番号１の配列由来の１９−４０の隣接する塩基を有し、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する第二の増幅オリゴヌクレオチドをさらに含む。第二の工程は、生物学的試料に存在する、いかなるＨＩＶ−２ヌクレオチド塩基配列も増幅して、増幅した核酸を産生することを伴う。最後に、増幅工程で産生した、増幅した核酸を検出する工程がある。本発明の方法にしたがって、増幅した核酸の陽性検出は、生物学的試料がＨＩＶ−２ヌクレオチド塩基配列を含んだことの指標となる。好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドは長さ１８−６０ヌクレオチドであり、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドは長さ１９−４０ヌクレオチドである。同じ２つのオリゴヌクレオチドを使用する、さらにより好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドはプロモーター−プライマーであり、そして増幅工程は、転写仲介増幅反応または「ＴＭＡ」によって増幅することを伴う。本発明の異なる好ましい態様にしたがって、第一および第二の増幅オリゴヌクレオチドが、それぞれ１８−６０および１９−４０ヌクレオチドの長さを有する場合、検出工程は、まず、増幅した核酸を、増幅した核酸に特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブとハイブリダイズさせ、そしてその後、増幅した核酸にハイブリダイズした、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの量を測定することを伴う。これは、例えば、標識した核酸プローブを用いることによって達成可能である。代替法において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは配列番号２１またはその相補体の配列を含み、そして３５ヌクレオチドまで、または２２ヌクレオチドまでの長さを有する。
【００１０】
本発明の第三の側面は、３５ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号２１またはその相補体の配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。特定の好ましい態様において、標識したオリゴヌクレオチドは、２２ヌクレオチドまでの長さを有する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列番号２０またはその相補体の配列内に含有される、少なくとも１６の隣接するヌクレオチドを有する。１つの態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号２０またはその相補体の配列を有する。別の好ましい態様において、配列番号２１またはその相補体の配列を含む該オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチドまでの長さを有する。例えば、オリゴヌクレオチドは、配列番号２２またはその相補体、配列番号２３またはその相補体、配列番号２４またはその相補体、配列番号２５またはその相補体、配列番号２６またはその相補体、および配列番号２７またはその相補体のいずれか１つの配列を有することが可能である。特定の標識オリゴヌクレオチドは、正確に１８ヌクレオチドの長さを有する。本発明の他の態様において、オリゴヌクレオチドが２２ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号２１またはその相補体の配列を含む場合、オリゴヌクレオチドがＤＮＡであることが可能であるが、あるいは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体（ａｎａｌｏｇ）を含むことが可能である。好ましくは、ヌクレオチド類似体は、リボース部分の２’位にメトキシ基を有する。本発明の別の好ましい態様において、配列番号２１またはその相補体の配列を含み、そして１８ヌクレオチドまでの長さを有するオリゴヌクレオチドはまた、検出可能標識も含む。有用な検出可能標識の例には、化学発光標識および放射標識が含まれる。化学発光標識の特に好ましい例は、アクリジニウムエステルである。
【００１１】
本発明の第四の側面は、生物学的試料においてＨＩＶ−２核酸の存在を検出する方法に関する。本発明の方法の第一の工程は、長さ３５ヌクレオチドまでであり、そして配列番号２１またはその相補体の配列を含むハイブリダイゼーションプローブを、生物学的試料に提供することを伴う。次に、高ストリンジェンシー条件下で、生物学的試料に存在する可能性があるいかなるＨＩＶ−２核酸も、ハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズさせて、プローブ：標的二重鎖を形成する工程がある。最後に、生物学的試料にＨＩＶ−２が存在する指標として、プローブ：標的二重鎖を検出する工程がある。本発明の方法のいくつかの態様において、生物学的試料に提供するハイブリダイゼーションプローブの長さは、２２ヌクレオチドまででなく、わずか２２ヌクレオチドまでである。本発明の別の好ましい態様において、生物学的試料は、血漿または血清いずれかである、血液産物である。より好ましい態様において、「提供」工程を行う前に、生物学的試料に存在する可能性があるいかなるＨＩＶ−２からも核酸を遊離させる工程がある。本発明のさらにより非常に好ましい態様において、「遊離」工程を行った後に、生物学的試料に存在する可能性があるいかなるＨＩＶ−２からも遊離させた核酸を、固体支持体上に捕捉するさらなる工程がある。本発明の別の態様において、方法で用いる生物学的試料は溶解物である。本発明の方法を実施するのに使用可能な、典型的な高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は：（１）０．４８Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、並びに各１ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ；並びに（２）０．６−０．９Ｍの範囲の塩濃度を含む。さらに別の態様において、本発明の方法の第一の工程において、生物学的試料に提供するハイブリダイゼーションプローブは、配列番号２２またはその相補体、配列番号２３またはその相補体、配列番号２４またはその相補体、配列番号２５またはその相補体、配列番号２６またはその相補体、および配列番号２７またはその相補体のいずれか１つであることが可能な配列を有する。本発明の方法の非常に好ましい態様において、ハイブリダイゼーションプローブは少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。より非常に好ましい態様において、ハイブリダイゼーションプローブはまた、検出可能標識も含む。例えば、検出可能標識はアクリジニウムエステルであることが可能であり、そして検出工程が、ハイブリダイゼーション工程中に形成された、プローブ：標的二重鎖のいずれも検出する発光測定を行うことを含むことが可能である。
【００１２】
本発明の第五の側面は、ＨＩＶ−２核酸を検出するためのキットに関する。一般的に、本発明にしたがったキットは、パッケージングした組み合わせ中に、上述の組成物のいずれを含むことも可能である。本発明のキットの特定の態様は、第一の増幅オリゴヌクレオチドおよび第二の増幅オリゴヌクレオチドを含む。第一の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基の配列を含み、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する。第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列由来の１９−４０の隣接する塩基の配列を含み、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する。好ましくは、該キットはまた、第一および第二の増幅オリゴヌクレオチドを用いて合成したＨＩＶ−２単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を検出するのに使用可能な、オリゴヌクレオチド検出プローブも含む。検出プローブは、好ましくは、配列番号２１またはその相補体の配列、および検出可能標識を含む。検出プローブは、３５ヌクレオチドまでの長さを有することが可能である。本発明のキットは、増幅を行う前に、他の種からＨＩＶ−２テンプレート核酸を精製するのに使用可能な捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含有することが可能である。キット中にパッケージング可能な捕捉オリゴヌクレオチドの例は、配列番号３１および配列番号３２の配列を有する。
【００１３】
本発明の第六の側面は、配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基の配列を含み、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する第一のオリゴヌクレオチドを含む組成物に関する。より好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドの長さは１８−６０ヌクレオチドである。さらにより好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドの長さは１８−３４ヌクレオチドである。さらにより好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドの長さは１８−２５ヌクレオチドである。第一のオリゴヌクレオチドの長さが１８−３４ヌクレオチドの範囲である。特定の好ましい態様において、第一のオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号９の配列内に含有される１８−３４の隣接する塩基を含むことが可能である。この場合、第一のオリゴヌクレオチドの配列は、本発明の非常に好ましい特定の態様において、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４のいずれか１つであることが可能である。本発明の他の好ましい態様において、第一のオリゴヌクレオチドが１００ヌクレオチドまでの長さ、または１８−６０ヌクレオチドの長さを有する場合、第一のオリゴヌクレオチドの配列は、プロモーターをさらに含むことが可能である。こうした場合、第一のオリゴヌクレオチドは、プロモーター−プライマーとして機能することが可能である。例えば、この状況下では、第一のオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のいずれか1つであることが可能である。本発明の異なる態様にしたがって、第一のオリゴヌクレオチドが１００ヌクレオチドまでの長さ、または１８−６０ヌクレオチドの長さを有し、そして配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基を含む配列を有する場合、第二のオリゴヌクレオチドがさらに含まれることが可能である。この第二のオリゴヌクレオチドは、３５ヌクレオチドまでの長さ、またはより好ましくは２２ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号２１を含む配列を有することが可能である。特定の例において、第二のオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号２０の配列内に含有される少なくとも１６の隣接するヌクレオチドを含むことが可能である。この場合、第二のオリゴヌクレオチドの長さが１６−１８ヌクレオチドの範囲であることが非常に好ましい。ある場合、第二のオリゴヌクレオチドがさらに検出可能標識を含むことが望ましい。本発明のさらに異なる態様にしたがって、組成物が、１００ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基を含む配列を有する第一のオリゴヌクレオチドを含み、そして２２ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号２１を含む配列を有する第二のオリゴヌクレオチドをさらに含む場合、１００ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号１の配列由来の１９−４０の隣接する塩基を含む配列を有する第三のオリゴヌクレオチドがさらに含まれる。本態様の非常に好ましい型では、第三のオリゴヌクレオチドの長さは１９−４０ヌクレオチド、またはさらにより好ましくは１９−２１ヌクレオチドである。本発明のこうした態様にしたがった、第三のオリゴヌクレオチドの配列の特定の例は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７のいずれか１つを含む。
【００１４】
定義
以下の用語は、本明細書に明らかに逆に言及しない限り、本開示の目的のため、以下の意味を有する。
【００１５】
本明細書において、「生物学的試料」は、ヒトから得た、組織またはポリヌクレオチド含有材料いずれかである。本発明にしたがった生物学的試料には、末梢血、血漿、血清、骨髄、リンパ節を含む生検試料、呼吸組織または滲出物、胃腸組織、子宮頚スワブ試料、精液または他の体液、組織または材料が含まれる。生物学的試料を処理して、組織または細胞構造を破壊し、それによって、酵素、緩衝剤、塩、界面活性剤等を含有してもよい溶液中に、細胞内構成要素を遊離させることが可能である。
【００１６】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡいずれかと共に、配列に存在することが可能であり、そして相補配列を有する第二の分子と該ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げない合成ヌクレオチド類似体または他の分子いずれかを意味する。該用語は、天然存在ヌクレオチドの類似体を含有するポリマーも含み、そして特に、リボースの２’位にメトキシ基（ＯＭｅ）を有する類似体を含む。本明細書において、「Ｔ」残基を含有するメトキシポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位にメトキシ基を有し、そしてヌクレオチドの塩基位にウラシルを有する。「ＯＭｅＴ」と特に明記する場合、ヌクレオチドの塩基位がチミン残基に占められることを意味する。
【００１７】
本明細書において、「検出可能標識」は、検出可能であるか、または検出可能反応を導くことが可能である、化学種である。本発明にしたがった検出可能標識は、直接または間接的にポリヌクレオチドプローブに連結することが可能であり、そして放射性同位体、酵素、ハプテン、色素または検出可能な色を与える粒子（例えばラテックスビーズまたは金属粒子）などの発色団、発光化合物（例えば生物発光、燐光または化学発光部分）および蛍光化合物を含む。
【００１８】
「均質検出可能標識」は、プローブ上の標識が標的配列にハイブリダイズしているかどうかを測定することによって、均質な方式で検出可能な標識を指す。すなわち、均質検出可能標識は、標識または標識化プローブの非ハイブリダイズ型からハイブリダイズ型を物理的に除去することなく、検出可能である。これらの標識は、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；およびＮｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号に詳細に記載されている。均質アッセイで用いるのが好ましい標識には、化学発光化合物（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；およびＡｒｎｏｌｄ， Ｊｒ．ら、米国特許第５，６３９，６０４号を参照されたい）が含まれる。好ましい化学発光標識はアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば標準的ＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥ）である。合成、および核酸に標識を付着させ、そして標識を検出する方法は、当該技術分野に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）， 第１０章；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号；Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号；およびＢｅｃｋｅｒら、欧州特許出願第０ ７４７ ７０６号を参照されたい）。
【００１９】
本明細書において、「増幅」は、標的核酸配列、その相補体または断片の多コピーを得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法を指す。
【００２０】
「標的核酸」または「標的」により、標的核酸配列を含有する核酸を意味する。
【００２１】
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」または「標的領域」により、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含んでなる特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列、およびそれに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。
【００２２】
「転写関連増幅」により、ＲＮＡポリメラーゼを用い、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する核酸増幅のいかなる種類も意味する。「転写仲介増幅」（ＴＭＡ）と呼ばれる転写関連増幅法の一例は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター−テンプレート相補的オリゴヌクレオチドを使用し、そして所望により、１以上の類似オリゴヌクレオチドを含むことが可能である。多様なＴＭＡが、Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号；Ｋａｃｉａｎら、ＰＣＴ第ＷＯ ９３／２２４６１号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ第ＷＯ ８８／０１３０２号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ第ＷＯ ８８／１０３１５号；Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号；Ｕｒｄｅａら、米国特許第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＰＣＴ第ＷＯ ９４／０３４７２号；およびＲｙｄｅｒら、ＰＣＴ第ＷＯ ９５／０３４３０号に詳細に開示されるように、当該技術分野に公知である。Ｋａｃｉａｎらの方法が、本明細書に開示する種類の核酸増幅法を行うのに好ましい。
【００２３】
本明細書において、「プローブ」は、核酸、好ましくは増幅した核酸の標的配列に、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、特異的にハイブリダイズして、検出可能ハイブリッドを形成する核酸オリゴヌクレオチドである。プローブは、プローブの末端に付着してもよいし、または内部であってもよい、検出可能部分を含有することが可能である。標的ポリヌクレオチドと組み合わせるプローブのヌクレオチドは、プローブの配列に関して内部である検出可能部分の場合にそうである可能性があるように、厳密に隣接していなくてもよい。検出は、直接（すなわち標的配列または増幅した核酸に直接ハイブリダイズするプローブから生じる）であっても、または間接的（すなわちプローブを標的配列または増幅した核酸に連結する中間分子構造にハイブリダイズするプローブから生じる）であってもよい。プローブの「標的」は、一般的に、標準的水素結合（すなわち塩基対形成）を用い、プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、増幅した核酸配列内に含有される配列を指す。プローブは、標的特異的配列およびプローブの三次元コンホメーションに貢献する他の配列（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号に記載されるようなもの）を含んでなることが可能である。「十分に相補的な」配列は、プローブの標的特異的配列に完全に相補的でなくても、標的配列へのプローブオリゴヌクレオチドの安定なハイブリダイゼーションを可能にする。
【００２４】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも２、一般的には約５から約１００の間の化学サブユニットのポリマー鎖であり、各サブユニットは、ヌクレオチド塩基部分、糖部分、および直鎖空間立体配置でサブユニットを連結する連結部分を含んでなる。一般的なヌクレオチド塩基部分は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）であるが、水素結合することが可能な、他のまれな、または修飾したヌクレオチド塩基が当業者に公知である。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、約１０から約６０残基の下限を有するサイズ範囲に属する。オリゴヌクレオチドは、天然存在供給源から精製することが可能であるが、好ましくは、多様な公知の酵素的または化学的方法のいずれかを用いて合成する。
【００２５】
本明細書において、「増幅プライマー」または「増幅オリゴヌクレオチド」は、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、そして核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドである。増幅プライマー、またはより簡単に「プライマー」は、所望により修飾したオリゴヌクレオチドであることが可能であり、テンプレート核酸にハイブリダイズすることが可能であり、そしてＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長することが可能な３’端を有する。
【００２６】
「実質的に相同」、「実質的に対応している」または「実質的に対応する」により、対象のオリゴヌクレオチドが、参照塩基配列に存在する少なくとも１０の隣接する塩基領域に、少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％相同、より好ましくは少なくとも９０％相同、そして最も好ましくは１００％相同である、少なくとも１０の隣接する塩基領域を含有する塩基配列を有することを意味する（ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物は除く）。当業者は、非特異的ハイブリダイゼーションの許容し得ないレベルを妨げつつ、多様な割合の相同性で、標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、ハイブリダイゼーションアッセイ条件に対して行うことが可能である修飾を、容易に認識するであろう。類似性の度合いは、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することによって決定し、そして構造的相違が相補塩基との水素結合を妨げない限り、２つの配列間に存在する可能性がある他の構造的相違を考慮に入れない。２つの配列間の相同性の度合いはまた、比較している、少なくとも１０の隣接する塩基の各組に存在する塩基ミスマッチ数に関して表すことも可能であり、これは０から２塩基相違の範囲であることが可能である。
【００２７】
「実質的に相補的」により、対象のオリゴヌクレオチドが、標的核酸配列に存在する少なくとも１０の隣接する塩基領域に、少なくとも７０％相補的、好ましくは少なくとも８０％相補的、より好ましくは少なくとも９０％相補的、そして最も好ましくは１００％相補的である、少なくとも１０の隣接する塩基領域を含有する塩基配列を有することを意味する（ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物は除く）。（当業者は、非特異的ハイブリダイゼーションの許容し得ないレベルを妨げつつ、多様な割合の相補性で、標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、ハイブリダイゼーションアッセイ条件に対して行うことが可能である修飾を、容易に認識するであろう。）相補性の度合いは、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することによって決定し、そして構造的相違が相補塩基との水素結合を妨げない限り、２つの配列間に存在する可能性がある他の構造的相違を考慮に入れない。２つの配列間の相補性の度合いはまた、比較している、少なくとも１０の隣接する塩基の各組に存在する塩基ミスマッチ数に関して表すことも可能であり、これは０から２塩基ミスマッチの範囲であることが可能である。
【００２８】
「十分に相補的」により、一連の相補塩基間の水素結合によって、別の塩基配列にハイブリダイズすることが可能な隣接する核酸塩基配列を意味する。相補塩基配列は、標準的塩基対形成（例えばＧ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ塩基対形成）を用い、オリゴヌクレオチドの塩基配列の各位で相補的であってもよいし、または標準的水素結合を用いて相補的ではない１以上の残基（無塩基性「ヌクレオチド」を含む）を含有するが、全体の相補塩基配列が、適切なハイブリダイゼーション条件において、別の塩基配列と特異的にハイブリダイズすることが可能であるものであってもよい。隣接する塩基は、オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズすることが意図される配列に、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約１００％相補的である。当業者には、適切なハイブリダイゼーション条件が公知であり、該条件は、塩基配列組成に基づき予測することが可能であり、または日常的な試験を用いることにより、実験的に決定することが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１および１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７を参照されたい）。
【００２９】
「捕捉オリゴヌクレオチド」により、塩基対ハイブリダイゼーションによって、標的配列および固定化オリゴヌクレオチドを特異的に連結するための手段を提供する、少なくとも１つの核酸オリゴヌクレオチドを意味する。捕捉オリゴヌクレオチドは、好ましくは、２つの結合領域：標的配列結合領域および固定化プローブ結合領域を、通常、同一のオリゴヌクレオチド上に隣接して含むが、捕捉オリゴヌクレオチドは、１以上のリンカーにより共に連結される、２つの異なるオリゴヌクレオチド上に存在する、標的配列結合領域および固定化プローブ結合領域を含んでもよい。例えば、固定化プローブ結合領域が第一のオリゴヌクレオチド上に存在してもよく、標的配列結合領域が第二のオリゴヌクレオチド上に存在してもよく、そして２つの異なるオリゴヌクレオチドが、第一および第二のオリゴヌクレオチドの配列に特異的にハイブリダイズする配列を含有する第三のオリゴヌクレオチドであるリンカーとの水素結合により、連結される。
【００３０】
「固定化プローブ」または「固定化核酸」により、固定された支持体に捕捉オリゴヌクレオチドを直接または間接的に連結する核酸を意味する。固定化プローブは、試料中の非結合成分からの、結合した標的配列の分離を促進する、固体支持体に連結したオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
「分離」または「精製」により、生物学的試料の１以上の構成要素を、該試料の１以上の他の構成要素から除去することを意味する。試料構成要素には、タンパク質、炭水化物、脂質および標識化プローブなどの成分もまた含む可能性がある、一般的に水性溶液相中の核酸が含まれる。好ましくは、分離または精製工程は、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９５％の、試料に存在する他の試料構成要素を除去する。
【００３２】
「ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物」により、同一の相補塩基対ハイブリダイゼーション特性を有する、ＲＮＡおよびＤＮＡ分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物は、異なる糖部分（すなわち、リボース対デオキシリボース）を有し、そしてＲＮＡにはウラシル、そしてＤＮＡにはチミンが存在する点が異なる可能性がある。ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物の間の相違は、均等物が、特定の配列に対し、同じ度合いの相補性を有するため、相同性の相違に貢献しない。
【００３３】
「本質的にからなる」により、本発明の基本的なそして新規の特性を実質的に変化させないさらなる単数または複数の構成要素、単数または複数の組成物あるいは単数または複数の方法工程が、本発明の組成物またはキットまたは方法に含まれていてもよいことを意味する。こうした特性には、生物学的試料、例えば全血または血漿において、ＨＩＶ−２核酸の約１００コピーのコピー数で、ＨＩＶ−２核酸を選択的に検出する能力が含まれる。本発明の基本的なそして新規の特性に実質的な影響を有する、いかなる単数または複数の構成要素、単数または複数の組成物あるいは単数または複数の方法工程も、この用語の外に属するであろう。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＩＶ−２の核酸を選択的に検出するための組成物および方法に関する。本明細書に開示する組成物は、ヒト血液、血清、血漿または他の体液あるいは組織などの、ウイルス核酸の存在に関して試験しようとする生物学的試料において、これらの核酸を増幅し、そして検出するのに有用である。本明細書に開示する増幅プライマーは、好適に、多重増幅反応の構成要素として使用可能であり、該反応において、プライマーおよび付属ポリヌクレオチドの複雑な一団から、いくつかの単位複製配列種を産生することが可能である。例えば、本明細書に開示するプライマーは、関連しないウイルスのポリヌクレオチドに対応する単位複製配列を合成する多重増幅反応で使用可能である。
【００３５】
本明細書に開示するプローブ、プライマーおよび方法は、診断適用において、または感染性粒子を含有する可能性がある、寄付された血液および血液産物または他の組織をスクリーニングするのに使用可能である。
【００３６】
序論および概説
一般の当業者は、核酸試験が、寄付された血液または血漿などの生物学的試料において、ウイルス特異的ポリヌクレオチドを検出する、好適でそして非常に高感度の方法に相当することを認識するであろう。ＨＩＶ−１に新たに感染した個体は、典型的には、感染後１−２ヶ月で、ウイルス抗原に反応性である抗体を検出可能なレベルで産生するため、ウイルスへの曝露後、最初の1ヶ月の間の血清学的試験は、偽陰性の結果を生じ、そしてＨＩＶ−１で汚染された試料が、血流に侵入するのを許し、壊滅的な結果を招く可能性がある。ＨＩＶ−１曝露の早期検出が、寄付される血液供給の安全性を確実にするのを補助するのと同じ方式で、ＨＩＶ−２曝露の早期検出は、同じ利点を提供することが可能である。したがって、ＨＩＶ−２を検出するための最も高感度の試験法は、感染に対する宿主免疫反応と区別されるような、ウイルス特異的核酸の検出に頼るであろう。
【００３７】
本発明は、生物学的試料においてＨＩＶ−２核酸を検出するための組成物（核酸捕捉オリゴヌクレオチド、増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ）および方法を含む。こうした使用に適したオリゴヌクレオチド配列を設計するため、類似の配列を有する領域をマッチングし、そしてその後、配列を比較することによって、サブタイプを含む既知のＨＩＶ−２ ＤＮＡ配列をまず並列して、診断アッセイの試薬として働くことが可能なＨＩＶ−２ウイルスゲノムの候補領域を同定した。これらの比較に基づいて、図１に図式的に示す捕捉オリゴヌクレオチド、プライマーおよびプローブを用い、ＨＩＶ−２ゲノムのＬＴＲ領域を検出用に選択した。比較した配列間で、比較的少ない配列変異体を含有する配列部分を、捕捉、増幅および増幅した配列の検出に使用するのに適した合成オリゴヌクレオチドを設計するための出発点として選択した。オリゴヌクレオチドを設計する際の他の考慮には、配列の相対ＧＣ含量（約３０％から約５５％の範囲）、および予測される二次構造（例えば分子内ハイブリッドを形成するヘアピンターン）の配列内の相対的な欠如を含んだ。
【００３８】
これらの解析に基づき、以下に示す、捕捉オリゴヌクレオチド、増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ配列を設計した。一般レベルの技術を有する当業者は、Ｔ７プロモーター配列を伴うまたは伴わない、ＨＩＶ−２に特異的なプライマー配列が、以下に記載する、プライマーに基づく多様なｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法で、プライマーとして使用可能であることを理解するであろう。さらに、本明細書に開示するハイブリダイゼーションプローブが増幅プライマーとして使用可能であり、そして本明細書に開示する増幅プライマーがハイブリダイゼーションプローブとして使用可能であることもまた、意図する。以下に詳細に記載する増幅および検出アッセイは、ＨＩＶ−２の少なくともサブタイプＡ、Ｂ、ＣおよびＤを検出するのに有用である。とりわけ、本明細書に開示するプローブの標的として働く、ＨＩＶ−２ゲノムの部分は、ＨＩＶ−１ゲノムに対応する配列を見出さない。したがって、プローブは、ＨＩＶ−２に特異的であり、そしてＨＩＶ−１に特異的でない。
【００３９】
有用な増幅法
本発明と組み合わせて有用な増幅法には：転写仲介増幅（ＴＭＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、並びに自己複製ポリヌクレオチド分子およびＭＤＶ−１ ＲＮＡおよびＱ−ベータ酵素のような複製酵素を用いる増幅法が含まれる。これらの多様な増幅技術を実施する方法は、それぞれ、米国特許第５，３９９，４９１号；米国特許第４，９６５，１８８号；公開欧州特許出願ＥＰ ０ ５２５ ８８２、米国特許第５，４５５，１６６号、米国特許第５，４７２，８４０号およびＬｉｚａｒｄｉら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７（１９８８）に見出すことが可能である。米国特許第５，５５４，５１６号は、標的ＲＮＡ配列の相補体とハイブリッドを形成するプライマーの非存在下で、単一のプロモーター−プライマーを用いて、標的ＲＮＡ配列を増幅する方法を記載する。核酸増幅反応をどのように行うかを記載する、これらの文書の開示は、本明細書に援用される。
【００４０】
本発明の非常に好ましい態様において、ＨＩＶ−２核酸配列は、ＴＭＡプロトコルを用いて増幅する。このプロトコルにしたがって、ＤＮＡポリメラーゼ活性を提供する逆転写酵素はまた、内因性ＲＮアーゼＨ活性も所持する。この方法に用いるプライマーの１つは、増幅しようとする標的核酸の１つの鎖に相補的な配列の上流に位置するプロモーター配列を含有する。増幅の第一の工程において、プロモーター−プライマーは、定義される部位で、ＨＩＶ−２標的ＲＮＡにハイブリダイズする。逆転写酵素は、プロモーター−プライマーの３’端からの伸長によって、標的ＲＮＡのＤＮＡコピーを生成する。生じたＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖中のＲＮＡ鎖は、所望により逆転写酵素の固有の活性であってもよい、ＲＮアーゼＨ活性によって分解される。その後、第二のプライマーがＤＮＡ鎖に結合する。ＤＮＡの第二の鎖は、逆転写酵素によって、プライマー端から合成され、それによって二本鎖ＤＮＡ分子が生成される。ＲＮＡポリメラーゼは、この二本鎖ＤＮＡテンプレート中のプロモーター配列を認識し、そして転写を開始する。新たに合成したＲＮＡ単位複製配列は各々、ＴＭＡ法に再進入し、そして新たな複製周期のテンプレートとして働き、それによって、ＲＮＡ単位複製配列の指数的拡大を導く。ＤＮＡテンプレートは各々、１００−１０００コピーのＲＮＡ単位複製配列を作成可能であるため、この拡大の結果、１時間未満で、１００億の単位複製配列を生じることが可能である。方法全体が自己触媒性であり、そして一定の温度で行われる。
【００４１】
ＨＩＶ−２単位複製配列を検出する方法は、オリゴヌクレオチドプライマー対を用いて産生した核酸増幅産物を電気泳動的に分離して染色する程度に、単純である可能性がある。以下に詳細に記載するように、好ましい検出法は、ＨＩＶ−２特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用する。
【００４２】
プライマーの構造的特徴
上に示すように、「プライマー」は、テンプレート核酸にハイブリダイズすることが可能であり、そしてＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長可能な３’端を有する、所望により修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。プライマーの５’領域は、標的核酸に非相補性であってもよい。５’非相補領域がプロモーター配列を含む場合、これを「プロモーター−プライマー」と称する。当業者は、プライマーとして作用することが可能ないかなるオリゴヌクレオチド（すなわち標的配列に特異的にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長可能な３’端を有するオリゴヌクレオチド）も、５’プロモーター配列を含むよう修飾することが可能であり、そしてしたがってプロモーター−プライマーとして機能することが可能であると認識するであろう。同様に、いかなるプロモーター−プライマーもプロモーター配列の除去によって、またはプロモーター配列を含まない合成によって、修飾することが可能であり、そしてそれでもプライマーとして機能する。
【００４３】
プライマーのヌクレオチド塩基部分は、修飾塩基部分が、Ｇ、Ａ、Ｃ、ＴまたはＵと非共有結合を形成する能力を保持し、そして少なくとも１つの修飾ヌクレオチド塩基部分を含んでなるオリゴヌクレオチドが、一本鎖核酸とハイブリダイズするのを立体的に妨げられない限り、例えばプロピン基の付加によって修飾することが可能である。プライマー主鎖を含んでなる一般的な糖部分は、リボースおよびデオキシリボースを含むが、２’−Ｏ−メチルリボース（ＯＭｅ）、ハロゲン化糖、および他の修飾糖もまた、使用可能である。通常、プライマー主鎖の連結基は、リン含有部分であり、最も一般的にはホスホジエステル連結であるが、他の連結、例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート、および「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）に見られるペプチド様連結などのリン非含有連結もまた、本明細書に開示するアッセイでの使用に意図する。
【００４４】
有用なプローブ標識系および検出可能部分
特異的核酸ハイブリダイゼーションを監視するのに使用可能な、本質的にいかなる標識および検出系を、本発明と組み合わせて使用してもよい。有用な標識のコレクションに含まれるのは、放射標識、酵素、ハプテン、連結されたオリゴヌクレオチド、化学発光分子および電気検出法に受け入れられる酸化還元活性部分である。好ましい化学発光分子には、Ａｒｎｏｌｄらによって、米国特許第５，２８３，１７４号に開示される、均質保護アッセイと関連して使用するための種類のアクリジニウムエステル、そしてＷｏｏｄｈｅａｄらによって、米国特許第５，６５６，２０７号に開示される、単一反応中で、多数の標的を定量化するアッセイと関連して使用するための種類のアクリジニウムエステルが含まれる。これらの特許文書に含まれる開示は、本明細書に援用される。好ましい電気的標識および検出アプローチは、米国特許第５，５９１，５７８号および第５，７７０，３６９号、並びに公開国際特許出願第ＷＯ ９８／５７１５８号に開示され、これらの開示は、本明細書に援用される。本発明において、標識として有用な酸化還元活性部分は、Ｃｄ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｐｄ、Ｚｎ、ＦｅおよびＲｕなどの遷移金属を含む。
【００４５】
本発明にしたがった、プローブ用の特に好ましい検出可能標識は、均質アッセイ系（すなわち混合物中で、結合した標識化プローブが、非結合標識化プローブに比較し、検出可能な変化、例えば安定性または差別的分解を示す系）で検出可能である。均質アッセイで用いるのが好ましい標識は、化学発光化合物（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；またはＡｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号に記載されるようなもの）である。特に好ましい化学発光標識には、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば標準的ＡＥまたはその誘導体、例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥが含まれる。
【００４６】
いくつかの適用において、検出前にまず、非ハイブリダイズプローブの除去を必要とすることなく、試験試料におけるプローブ：標的二重鎖の検出を容易にするため、プローブが少なくともある程度の自己相補性を示すことが望ましい。たとえば、「分子トーチ」と呼ばれる構造は、領域を連結することによってつながれ、そしてあらかじめ決定したハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、自己相補性の別個の領域を含むよう、設計される（「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」を生み出す）。変性条件に曝露された際、分子トーチの２つの相補領域（完全または部分的相補性であってもよい）が融解し、あらかじめ決定したハイブリダイゼーションアッセイ条件を回復すると、標的結合ドメインが、標的配列にハイブリダイズするのに利用可能なままとなる。分子トーチは、標的結合ドメインが、標的閉鎖ドメインより、標的配列へのハイブリダイゼーションを支持するように設計する。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸にハイブリダイズした時と対照的に、分子トーチが自己ハイブリダイズした時に、異なるシグナルを生じ、それによってそれに会合する検出可能標識を有する非ハイブリダイズプローブの存在下で、試験試料中のプローブ：標的二重鎖の検出を可能にするように配置された、相互作用する標識（例えば発光剤／消光剤）を含む。分子トーチは、国際公報第ＷＯ ００／０１８５０に完全に記載され、該公報の開示は本明細書に援用される。
【００４７】
自己相補的ハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、一般的に「分子ビーコン」と呼ばれる構造である。分子ビーコンは、標的相補配列を有する核酸分子、標的核酸配列の非存在下で、プローブを閉じたコンホメーションに保持する親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが閉じたコンホメーションにあるときに相互作用する標識対を有する核酸分子を含んでなる。標的核酸および標的相補配列のハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離し、それによって、プローブを開いたコンホメーションにシフトする。開いたコンホメーションへのシフトは、例えば発蛍光団および消光剤（例えばＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であることが可能な標識対の相互作用の減少のため、検出可能である。分子ビーコンは、米国特許第５，９２５，５１７号に完全に記載され、該特許の開示は本明細書に援用される。
【００４８】
合成技術、および標識を核酸に結合し、そして標識を検出する方法は、当該技術分野に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）， 第１０章；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号；Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；およびＫｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号を参照されたい）。
【００４９】
プローブの化学的組成
本発明にしたがったプローブは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド類似体を含んでなり、そしてそれに共有結合した検出可能標識を所持することが可能である。プローブのヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は、窒素性複素環塩基、または塩基類似体を含んでなり、該塩基または塩基類似体で、ヌクレオシドは、例えばホスホジエステル結合によって共に連結されて、ポリヌクレオチドを形成する。したがって、プローブは、慣用的なリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含んでなることが可能であるが、これらの分子の化学的類似体もまた、含んでなることが可能である。プローブの「主鎖」は、当該技術分野に知られる多様な連結で構成される可能性があり、該連結には、１以上の糖−ホスホジエステル連結、ペプチド核酸結合（ときに、Ｈｙｌｄｉｇ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９５／３２３０５号に記載されるように「ペプチド核酸」と称される）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらの組み合わせが含まれる。プローブの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースいずれか、あるいは、例えば、２’メトキシ置換（ＯＭｅ）および２’ハロゲン化物置換（例えば２’−Ｆ）などの既知の置換を有する同様の化合物であってもよい。窒素性塩基は、慣用的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その既知の類似体（例えばイノシンまたは「Ｉ」；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５−３６， Ａｄａｍｓら監修， 第１１版， １９９２を参照されたい）、プリンまたはピリミジン塩基類の既知の誘導体（例えば、Ｎ4−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン類およびデアザ−またはアザ−ピリミジン類、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基類、２、６または８位に改変されたまたは置換置換基を有するプリン塩基類、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ6−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、およびＯ4−アルキル−ピリミジン類（Ｃｏｏｋ、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９３／１３１２１号を参照されたい））および、主鎖がポリマーの１以上の残基に関し、窒素性塩基を含まない、「無塩基性（ａｂａｓｉｃ）」残基（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい）であることが可能である。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見られる慣用的な糖、塩基および連結のみを含んでなることが可能であるし、または慣用的な構成要素および置換両方（例えばメトキシ主鎖を介して連結される慣用的塩基、または慣用的塩基および１以上の塩基類似体を含む核酸）を含むことが可能である。
【００５０】
ＨＩＶ−２に特異的な増幅プライマーおよび検出プローブの選択
望ましい特性を持つ増幅プライマーおよびプローブを設計するのに有用な指針を本明細書に記載する。ＨＩＶ−２核酸を増幅し、そして探査する（ｐｒｏｂｉｎｇ）のに最適な部位は、隣接する配列の約３５０塩基内に、そして好ましくは１５０塩基内に、長さ約１５塩基より大きい、２つ、そして好ましくは３つの保存領域を含有する。プライマーまたはプロモーター−プライマー組で観察される増幅の度合いは、オリゴヌクレオチドがその相補配列にハイブリダイズする能力および酵素的に伸長される能力を含む、いくつかの要因に応じる。ハイブリダイゼーション反応の度合いおよび特異性は、いくつかの要因に影響を受けるため、これらの要因を操作すると、標的に完全に相補的であるにしろ、そうでないにしろ、特定のオリゴヌクレオチドの正確な感度および特異性が決定されるであろう。変化するアッセイ条件の影響が当業者に知られ、そしてＨｏｇａｎら，米国特許第５，８４０，４８８号に記載され、該特許の開示は本明細書に援用される。
【００５１】
標的核酸配列の長さ、そしてしたがってプライマー配列またはプローブ配列の長さが重要である可能性がある。ある場合、望ましいハイブリダイゼーション特性を有するプライマーまたはプローブを生じるであろう、位置および長さが異なる、特定の標的領域由来のいくつかの配列がある可能性がある。完全に相補的でない核酸がハイブリダイズすることは可能であるが、通常、完全に相同な塩基配列の最長の伸長が、主にハイブリッド安定性を決定するであろう。
【００５２】
増幅プライマーおよびプローブは、オリゴヌクレオチド：非標的（すなわち標的核酸に類似の配列を持つ核酸）核酸ハイブリッドの安定性を最小限にするよう配置されるべきである。増幅プライマーおよび検出プローブが、標的および非標的配列間を区別可能であることが好ましい。プライマーおよびプローブを設計する際、これらのＴｍ値の相違は、可能な限り大きくするべきである（少なくとも２℃、そして好ましくは５℃）。
【００５３】
ハイブリダイゼーションに阻害性である、強い内部構造を形成することが知られる核酸領域は、プライマーまたはプローブとしてより好ましくない。こうした構造の例には、ヘアピンループが含まれる。同様に、広範な自己相補性を持つオリゴヌクレオチドも回避すべきである。
【００５４】
非特異的伸長（プライマー二量体または非標的コピー）の度合いもまた、増幅有効性に影響を及ぼす可能性がある。このため、プライマーは、特に配列の３’端で、低い自己または交差相補性を有するよう選択する。長いホモポリマー領域および高いＧＣ含量を回避して、偽のプライマー伸長を減少させる。設計のこの側面を補助するのに、商業的に入手可能なコンピューターソフトウェアが利用可能である。入手可能なコンピュータープログラムには、ＭａｃＤＮＡＳＩＳTM２．０（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｔｄ．）およびＯＬＩＧＯ（登録商標）バージョン４．１（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれる。
【００５５】
当該技術分野の一般的なレベルを有する当業者は、ハイブリダイゼーションが、相補核酸の２つの一本鎖の会合を伴い、水素結合二本鎖を形成することを認識するであろう。２つの鎖の一方が、完全にまたは部分的にハイブリッドに関与しているならば、新たなハイブリッドの形成に、より関与しにくいであろうことが暗黙の了解である。目的の配列のかなりの部分が一本鎖であるように、プライマーおよびプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの速度および度合いを非常に増加させることが可能である。標的が、組み込まれたゲノム配列である場合、これは当然、二本鎖型を生じるであろう（ポリメラーゼ連鎖反応の産物の場合のように）。これらの二本鎖標的は、当然、プローブとのハイブリダイゼーションに阻害性であり、そしてハイブリダイゼーション工程前に、変性を要する。
【００５６】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの速度は、Ｃ0ｔ1/2を決定することによって、測定可能である。ポリヌクレオチドがその標的にハイブリダイズする速度は、標的結合領域における標的二次構造の熱安定性の測定値である。ハイブリダイゼーション速度の標準的な測定値は、リットルあたりのヌクレオチドのモル数に秒を乗じたものとして測定する、Ｃ0ｔ1/2である。したがって、これは、その濃度で最大ハイブリダイゼーションの５０％が生じる時間を乗じた、プローブ濃度である。この値は、多様な量のポリヌクレオチドを一定量の標的に、固定した時間、ハイブリダイズさせることによって、決定する。Ｃ0ｔ1/2は、一般の当業者によく知られる標準法によって、グラフ的に見出される。
【００５７】
好ましい増幅プライマー
増幅反応を行うのに有用なプライマーは、異なる長さを有することが可能である。例えば、ＨＩＶ−２標的核酸配列の一方の鎖に相補的な増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは１００塩基まで、より好ましくは１８から６０塩基、さらにより好ましくは１８から３４、またはさらにより好ましくは１８から２５塩基の長さを有し、そしてＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣ（配列番号８）に示される配列に実質的に相補的な、少なくとも９であり、そして３４までの隣接する塩基を含む。異なる用語で述べるが、同一のオリゴヌクレオチドを同定すると、これらのプライマーには、ＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡＡＣＣＴＧＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＴ（配列番号９）に実質的に対応する配列に含有される、少なくとも９であり、そして３４までの隣接する塩基が含まれる。本発明の実施可能性には本質的でないと考えられるが、表２に列挙するすべてのプライマーは、共通のコア配列ＣＧＧＧＣＧＣＣＡ（配列番号３４）を共有する。配列番号９の配列および配列番号３４の配列の下流（３’）に位置するプライマー配列間のミスマッチが許容されるという我々の発見は、配列番号９の配列のサブセットを有するプライマーが、一般的に有用であることを示す。言い換えると、配列番号９に由来し、そして本明細書に使用されるものなどの増幅条件下で、配列番号８の配列を有する標的にハイブリダイズするプライマー配列は、本明細書に記載する増幅法において、使用可能である。一般的に、配列番号９の９−３４の隣接する塩基を有するプライマーは、Ｔ７プロモーター−プライマーなどのプロモーター−プライマーとして使用するのに、非常に好ましい。もちろん、プライマーがＴ７プロモーター−プライマーである場合、プライマーの５’端に、Ｔ７プロモーター配列が含まれるであろうし、これは典型的には、プライマーの長さを約２７−３３塩基、増加させる。本発明のこの側面にしたがった、好ましい増幅プライマーの例には、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書に開示するオリゴヌクレオチド配列の１つ（配列番号１２）は、プライマーに存在する配列番号９のセグメントと比較して、１つのヌクレオチドミスマッチおよび２つのヌクレオチド欠失を有した。別のオリゴヌクレオチド配列（配列番号１３）は、オリゴヌクレオチドに存在する配列番号９の部分と比較して、単一ヌクレオチド欠失を有した。これらの配列はまた、それぞれ、配列番号１７および１８の配列を有するＴ７プロモーター−プライマーでも見出すことが可能である。欠失を考慮に入れないと、これらのプライマーは、それぞれ、オリゴヌクレオチドに存在する配列番号９の部分と比較して、総数７および５の塩基ミスマッチを有した。本明細書に開示するＴ７プロモーター−プライマーは、Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号に記載する方法を用いて、核酸増幅反応を行うのに特に有用である。これらの特許文書の開示は、本明細書に援用される。プライマーは、所望により、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むことが可能である。好ましくは、これらのプライマーを用いて合成した単位複製配列の検出は、本明細書に開示するオリゴヌクレオチド検出プローブを用いて達成する。
【００５８】
増幅反応を実行するのに、上述のプライマーのいずれかと組み合わせて使用可能な他の増幅プライマーは、ＨＩＶ−２標的核酸配列の相対する鎖に相補的である。ＨＩＶ−２標的核酸配列のこの相対する鎖に相補的な増幅プライマーは、好ましくは１００塩基までの、またはより好ましくは１９から４０塩基の、またはさらにより好ましくは１９から２１塩基の長さを有する。これらのプライマーは、非プロモータープライマーとして特に有用である。本明細書に開示するように、これらのプライマーは、ＧＴＧＴＧＴＧＴＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＴＡＧＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＴＣ（配列番号１）に実質的に対応する配列由来の、少なくとも１９の隣接する塩基を有する。これらの条件を満たす特定の増幅プライマーの例には、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００５９】
上に明記する可変長の増幅プライマーおよび検出プローブは、標的結合に関与しない可能性があり、そして増幅または検出法に実質的に影響を与えない可能性がある、外来性の（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ）配列の包含に対応すると意図するのを理解すべきである。例えば、本発明にしたがって、増幅反応を行うのに有用なプロモーター−プライマーは、ＨＩＶ−２標的核酸にハイブリダイズする、少なくとも最小の配列、および最小配列上流に位置するプロモーター配列を有する。しかし、標的結合配列およびプロモーター配列間に配列を挿入すると、増幅反応における有用性を危うくすることなく、プライマーの長さを変化させることが可能である。さらに、増幅プライマーおよび検出プローブの長さは、これらのオリゴヌクレオチド配列が、望ましい相補配列にハイブリダイズするのに必須の最小必要条件に適合する限り、選択の問題である。プローブ配列は、配列番号２１の１４量体配列またはその相補体を、共通のコアとして含むべきである。これは、ＨＩＶ−２標的配列中の、または増幅法によって合成した単位複製配列中のプローブ結合ドメインを明示する。プローブ結合ドメイン下流にハイブリダイズする増幅プライマーは、配列番号９の配列内に含有される、少なくとも９の隣接する塩基を含む配列を有するべきである。実際、本明細書に示す結果は、ＨＩＶ−２核酸に相補的である（そして配列番号１７のプロモーター−プライマー中に存在する）配列番号１２の配列が、配列番号９由来の９以下の隣接する塩基しか持たないにもかかわらず、増幅を促進するのに十分であったことを示す。最後に、プローブ結合ドメイン上流にハイブリダイズする増幅プライマーは、配列番号１の配列由来の、少なくとも１９の隣接する塩基を有するべきである。
【００６０】
以下の２つの表は、ＨＩＶ−２核酸を増幅するためのプライマーとして使用した、オリゴヌクレオチド配列の特定の例を示す。表１は、核酸の一方の鎖上のＨＩＶ−２配列に相補的な非Ｔ７プライマーの配列を示す。表２は、本発明の開発中に用いた、ＨＩＶ−２標的相補配列およびＴ７プロモーター−プライマーの全長配列両方の配列を示す。表１のオリゴヌクレオチド配列と比較して、表２のオリゴヌクレオチド配列は、相対する核酸鎖に相補的である。上に示すように、すべてのＴ７プロモーター−プライマーは、その３’端に、ＨＩＶ−２標的に相補的な配列を、そしてその５’端に、Ｔ７プロモーター配列を含んだ。
【００６１】
表１
増幅プライマーのポリヌクレオチド配列
【００６２】
【表１】
【００６３】
表２は、ＨＩＶ−２標的相補的オリゴヌクレオチド配列（配列番号１０−１４）およびそれぞれ対応するＴ７プロモーター−プライマー配列（配列番号１５−１９）を示す。
【００６４】
表２
増幅プライマーのポリヌクレオチド配列
【００６５】
【表２】
【００６６】
転写仲介増幅反応において、ＨＩＶ−２ ＬＴＲ領域を増幅するのに好ましいプライマー組には、ＨＩＶ−２ ＬＴＲ転写物にハイブリダイズする第一のプライマー（表２に列挙するプライマーの１つなど）および第一のプライマーの伸長産物の配列に相補的な第二のプライマー（表１に列挙するプライマー配列の１つなど）が含まれる。非常に好ましい態様において、第一のプライマーは、その５’端にＴ７プロモーター配列を含む、プロモーター−プライマーである。
【００６７】
特定の好ましい態様において、ＨＩＶ−２核酸を増幅するための、少なくとも２つの増幅プライマーの組が提供され、これには：（ｉ）配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４の塩基配列を有するかまたは該配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含んでなる、第一の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の塩基配列を有するかまたは該配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含んでなる、第二の増幅プライマーが含まれる。特に好ましい組み合わせでは、第一の増幅プライマーは、配列番号１０の塩基配列を有するかまたは該配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含んでなる、プロモーター−プライマーであり、そして第二の増幅プライマーは、配列番号６の塩基配列を有するかまたは該配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【００６８】
好ましい検出プローブ
本発明の１つの側面は、ＨＩＶ−２核酸を検出するハイブリダイゼーションプローブとして使用可能なオリゴヌクレオチドに関する。ＨＩＶ−２の核酸中に存在する標的核酸配列を増幅するための方法は、ＨＩＶ−２単位複製配列を検出する、さらなる工程を含むことが可能である。ＨＩＶ−２核酸（ＨＩＶ−２単位複製配列を含む）を検出するためのこの方法は：標的核酸配列またはその相補体に優先的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションアッセイプローブと試験試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させ、それによって、検出のため、安定なプローブ：標的二重鎖を形成する工程を含む。次に、試験試料中のＨＩＶ−２の存在または非存在の指標として、ハイブリッドが試験試料に存在するかどうか決定する工程がある。これは、生物学的試料におけるＨＩＶ−２の存在の指標として、プローブ：標的二重鎖を検出することを伴う可能性がある。したがって、プローブ組成物およびこれらの組成物を使用する方法は、本発明の範囲内に属する。
【００６９】
ＨＩＶ−２核酸配列を検出するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブには、ＨＩＶ−２ ＲＮＡ転写物またはコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列が含まれる。したがって、本発明のプローブは、ＨＩＶ−２標的核酸配列の一方の鎖、またはその相補体にハイブリダイズする。本発明のすべてのプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ＨＩＶ−２標的配列に安定してハイブリダイズする。これらのプローブはまた、ＨＩＶ−２核酸に相補的であってもなくてもよい、標的核酸領域外のさらなる塩基も有することが可能である。
【００７０】
好ましいプローブは、塩濃度が０．６−０．９Ｍの範囲である場合、約６０℃に対応する、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするために、標的核酸に十分に相同である。好ましい塩には、塩化リチウムが含まれるが、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムなどの他の塩もまた、ハイブリダイゼーション溶液中で使用可能である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、あるいは、０．４８Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、並びに各１ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡに、あるいは０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％ラウリル硫酸リチウム、６０ｍＭコハク酸リチウム、並びに各１０ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡによって提供される。
【００７１】
本発明の特定の態様において、プローブは、好ましくは、２２塩基までの、さらにより好ましくは１８塩基までの、そしてさらにより好ましくは１６塩基までの標的相補配列を有し；そしてＣＣＴＧＧＴＣＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＣＴＴＣＴ（配列番号２０）に実質的に対応する配列に含有される、１４から２２の間の隣接するヌクレオチドを含む。とりわけ、本明細書に開示する実施例に使用するプローブは各々、共通の１４塩基配列、ＧＴＣＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＣ（配列番号２１）を含有した。もちろん、本発明のプローブは、あるいは、前述のプローブ配列に相補的な配列を有することが可能である。すべての場合で、プローブがＨＩＶ−２核酸（ＨＩＶ−２単位複製配列を含む）に完全に相補的である場合、プローブ長は、好ましくは３５ヌクレオチドまで、より好ましくは２２ヌクレオチドまで、さらにより好ましくは１８ヌクレオチドまで、そしてさらにより好ましくは１６ヌクレオチドまでである。上に示すように、プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせ、核酸類似体で作成してもよいし、または１以上の修飾ヌクレオシド（例えばリボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシド）を含有してもよい。
【００７２】
本明細書に開示するアッセイを行うのに使用可能なプローブの特定の例には、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７に示す塩基配列、またはその相補体を有するか、またはそれらに実質的に対応するオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明にしたがったプローブが、非ヌクレオチドリンカー手段によってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含むこともまた好ましい。例えば、非常に好ましいプローブには、配列番号２６のヌクレオチド９および１０（５’から３’方向に読む）間に位置する非ヌクレオチドリンカーを通じてプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識が含まれる。
【００７３】
以下の表は、ＨＩＶ−２単位複製配列を検出するのに用いた、好ましい検出プローブの配列を示す。ＨＩＶ−２核酸配列を検出する別のプローブは、ＨＩＶ−２の相対するセンス鎖にハイブリダイズ可能であるため、本発明はまた、表３に示す配列に相補的なオリゴヌクレオチドも含む。
【００７４】
表３
ＨＩＶ−２単位複製配列検出プローブのポリヌクレオチド配列
【００７５】
【表３】
【００７６】
本発明のいくつかの態様において、増幅したＬＴＲ配列を検出するプローブ配列には、メトキシ主鎖、または核酸主鎖中の少なくとも１つのメトキシ連結が含まれる。好ましくは、検出プローブは、米国特許第５，５８５，４８１号；および米国特許第５，６３９，６０４号に実質的に記載されるように、特に後者の特許の第１０欄第６行から第１１欄第３行に、そして実施例８に記載されるように、リンカーを介してプローブ配列に付着した化学発光ＡＥ化合物で標識する。これらの特許文書に含有される開示は、本明細書に援用される。
【００７７】
捕捉オリゴヌクレオチドの選択および使用
好ましい捕捉オリゴヌクレオチドには、固体支持体上の固定用の標的として働く第二の配列（すなわち「テール」配列）に共有結合した、ＬＴＲ領域中のＨＩＶ−２配列に相補的な第一の配列（すなわちＨＩＶ−２結合配列）が含まれる。捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列を連結するいかなる主鎖も使用可能である。特定の好ましい態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは、主鎖中、少なくとも１つのメトキシ連結を含む。好ましくは捕捉オリゴヌクレオチドの３’端にあるテール配列を用いて、相補的塩基配列にハイブリダイズさせ、生物学的試料中の他の構成要素に優先して、ハイブリダイズした標的ＨＩＶ−２核酸を捕捉する手段を提供する。
【００７８】
テール配列中で、相補塩基配列にハイブリダイズするいかなる塩基配列も使用可能であるが、ハイブリダイズする配列が、約５から５０ヌクレオチド残基の長さに渡ることが好ましい。特に好ましいテール配列は、実質的にホモポリマー性であり、約１０から約４０ヌクレオチド残基、またはより好ましくは約１４から約３０残基を含有する。本発明にしたがった捕捉オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−２標的ポリヌクレオチドに特異的に結合する第一の配列、および固体支持体に固定されたオリゴ（ｄＴ）伸長に特異的に結合する第二の配列を含むことが可能である。
【００７９】
図１に例示する構成要素を用いて、生物学的試料中のＨＩＶ−２配列を検出する１つのアッセイは、捕捉オリゴヌクレオチドを用いて標的核酸を捕捉し、少なくとも２つのプライマーを用いて、捕捉した標的領域を増幅し、そしてまず増幅した核酸に含有される配列に標識化プローブをハイブリダイズさせ、そしてその後、結合した標識化プローブから生じるシグナルを検出することによって、増幅した核酸を検出する工程を含む。
【００８０】
捕捉工程は、好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドを用い、該工程では、ハイブリダイゼーション条件下で、１部分の捕捉オリゴヌクレオチドが標的核酸中の配列に特異的にハイブリダイズし、そしてテール部分が、標的領域を試料の他の構成要素から分離するのを可能にする、リガンド（例えばビオチン−アビジン結合対）などの結合対の１つの構成要素として働く。好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分は、固体支持体粒子に固定した相補配列にハイブリダイズする配列である。好ましくは、まず、捕捉オリゴヌクレオチドおよび標的核酸は、溶液相ハイブリダイゼーション動力学を利用するため、溶液中にある。ハイブリダイゼーションは、捕捉オリゴヌクレオチド：標的核酸複合体を産生し、該複合体は、相補固定化配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分のハイブリダイゼーションを通じて、固定化プローブに結合可能である。したがって、標的核酸、捕捉オリゴヌクレオチドおよび固定化プローブを含んでなる複合体が、ハイブリダイゼーション条件下で形成される。好ましくは、固定化プローブは、テール配列に相補的であり、そして固体支持体に付着する、反復配列であり、そしてより好ましくは、ホモポリマー配列（例えばポリＡ、ポリＴ、ポリＣまたはポリＧ）である。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分がポリＡ配列を含有する場合、固定化プローブはポリＴ配列を含有するであろうが、相補配列のいかなる組み合わせを用いてもよい。捕捉オリゴヌクレオチドはまた、標的にハイブリダイズする塩基配列および固定化プローブにハイブリダイズするテールの塩基配列間に位置する、１以上の塩基である、「スペーサー」残基も含有することが可能である。標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド複合体に結合するのに、いかなる固体支持体を用いてもよい。有用な支持体は、マトリックスまたは溶液中の遊離粒子（例えばニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および好ましくは磁気誘引可能粒子）いずれかであることも可能である。固体支持体に固定化プローブを付着させる方法が公知である。支持体は、好ましくは、標準法（例えば遠心分離、磁気粒子の磁気誘引など）を用いて溶液から回収可能な粒子である。好ましい支持体は常磁性単分散粒子（すなわち±約５％でサイズが均一）である。
【００８１】
標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド：固定化プローブ複合体を回収すると、（生物学的試料におけるその濃度に比較し）標的核酸が効率的に濃縮され、そして生物学的試料に存在する可能性がある増幅阻害因子から標的核酸が精製される。捕捉された標的核酸は、例えば付着した標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド：固定化プローブ複合体を含む粒子を、洗浄溶液に再懸濁し、そしてその後、上述のように、洗浄溶液から、付着した複合体を含む粒子を回収することによって、１回以上、洗浄し、標的をさらに精製することが可能である。好ましい態様において、捕捉工程は、連続的に、捕捉オリゴヌクレオチドを標的核酸とハイブリダイズさせ、そしてその後、ハイブリダイゼーション条件を調整し、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分と、固定化相補配列とのハイブリダイゼーションを可能にすることによって、行う（例えば、ＰＣＴ第ＷＯ ９８／５０５８３号に記載されるように）。捕捉工程、およびいかなるものでもよい所望による洗浄工程が完了すると、標的核酸が増幅可能である。操作工程数を制限するため、標的核酸は、所望により、捕捉オリゴヌクレオチドから遊離させることなく、増幅させることが可能である。
【００８２】
ＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列を増幅し、そして検出するのに好ましい方法
本発明の好ましい方法を、以下に示す実施例に記載し、そして例示する。図１を参照すると、ＨＩＶ−２ゲノム（太い水平な実線によって示す）の標的領域を検出するための１つの系が例示される。この系は、４つのオリゴヌクレオチド（より短い実線によって示す）：標的領域でＨＩＶ−２配列に特異的にハイブリダイズする配列、および生物学的試料に存在する標的領域を捕捉するため、固体支持体に固定された相補配列にハイブリダイズするテール（「Ｔ」）を含む、１つの捕捉オリゴヌクレオチド；標的領域でＨＩＶ−２配列に特異的にハイブリダイズする配列、および二重鎖で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの機能するプロモーターとして作用するＴ７プロモーター配列（「Ｐ」）を含む、１つのＴ７プロモーター−プライマー；Ｔ７プライマーを用いて、標的領域配列から作成される第一鎖ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする配列を含む、１つの非Ｔ７プライマー；および２つのプライマーを用いて増幅される標的領域の一部に特異的にハイブリダイズする配列を含む、１つの標識化プローブを含む。
【００８３】
上に示すように、２つのプライマーを用いる、捕捉された標的領域の増幅は、多様な既知の核酸増幅反応を用いて、達成可能である。好ましい態様において、ＴＭＡなどの転写関連増幅反応を使用する。こうした態様において、標的核酸の単一コピーから、多くの鎖の核酸を産生し、こうして、増幅した配列に結合するプローブを検出することによって、標的の検出を可能にする。好ましくは、転写関連増幅は、溶液中で、適切な塩および緩衝剤と共に、２種類のプライマー（１つはプロモーター配列を含有するため、プロモーター−プライマーと称され、図１ではＲＮＡポリメラーゼを表す「Ｐ」と示す）、２つの酵素（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）、および基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）を用い、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を生じる。
【００８４】
図１を参照すると、転写仲介増幅中、捕捉された標的核酸は、Ｔ７プロモーター−プライマーとして示される第一のプライマーにハイブリダイズする。逆転写酵素を用いて、標的ＲＮＡをテンプレートとして用い、Ｔ７プロモーター−プライマーからｃＤＮＡを合成する。非Ｔ７プライマーとして示される、第二のプライマーは、該ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズし、そして逆転写酵素の作用によって伸長されてＤＮＡ二重鎖が形成され、それにより二本鎖Ｔ７プロモーター領域が形成される。その後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、機能するＴ７プロモーターを用いることによって、多数のＲＮＡ転写物を生成する。ＴＭＡの自己触媒機構は、ｃＤＮＡ合成工程に続いて、反復ハイブリダイゼーションおよび重合工程を使用し、さらなるＲＮＡ転写物を産生して、それによって標的領域特異的核酸配列を増幅する。
【００８５】
検出工程は、上述の増幅したＲＮＡ転写物または単位複製配列に特異的に結合する、少なくとも１つの検出プローブを用いる。好ましくは、検出プローブは、均質検出系を用いて検出可能な、検出可能標識で標識される。より好ましくは、標識化プローブは、上述のような、化学発光シグナルが産生され、そして検出される、アクリジニウムエステル化合物で標識される。
【００８６】
ＨＩＶ−２核酸を検出するキット
本発明のさらに別の側面は、ＨＩＶ−２核酸テンプレートを用いたポリヌクレオチド増幅反応を行うためのキットに関する。好ましくは、本発明にしたがったキットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅反応中で、ＨＩＶ−２核酸を増幅するのに使用可能なオリゴヌクレオチドプライマー対を含有する。典型的なキットは：（１）配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基の配列を含み、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する、第一の増幅オリゴヌクレオチド；および（２）配列番号１の配列由来の１９−４０の隣接する塩基の配列を含み、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する、第二の増幅オリゴヌクレオチドを含むことが可能である。もちろん、本明細書に開示する、より短い増幅オリゴヌクレオチドもまた、キット形式内にパッケージングすることが可能である。該キットは、配列番号２１またはその相補体の配列を含む、オリゴヌクレオチド検出プローブをさらに含有することが可能である。このプローブは、長さ３５ヌクレオチドまでであることが可能であるが、あるいは、本明細書に開示するように、長さ２２ヌクレオチドまでであるか、またはより短いことが可能である。さらに、該キットは、増幅前に、他の種からＨＩＶ−２テンプレート核酸を精製するための捕捉オリゴヌクレオチドを含有することが可能である。典型的な捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号３１および配列番号３２の配列を有する。実際、ＨＩＶ−２核酸を検出する本発明の方法を実施するのに有用なキットは、互いにパッケージングした組み合わせで、本明細書に開示する、増幅オリゴヌクレオチド組成物および／または検出プローブ組成物の、本質的にいずれを含むことも可能である。
【００８７】
多重増幅反応
多数の解析物ポリヌクレオチドを検出する簡便な試験形式は、異なるプライマー組を用いて同時に増幅反応を行うことを伴い、ここで、反応中合成する単位複製配列は、ハイブリダイゼーションによって検出する。これに関して、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（カリフォルニア州サンディエゴ）は、３つの重要な工程を用いて、単一試験管多重形式でＨＩＶ−１および／またはＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）核酸を検出するＨＩＶ−１／ＨＣＶ試験を開発した。最初の試料調製法において、血漿を界面活性剤で処理してウイルスゲノムＲＮＡを遊離させ、標的特異的オリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズさせ、そして磁気微小粒子上に捕捉して、該粒子を磁場中で血漿から分離する。次に、転写に基づくポリヌクレオチド増幅系を使用して、単一反応中で、ＨＩＶ−１および／またはＨＣＶ標的ＲＮＡを増幅する。最後に、ＨＩＶ−１またはＨＣＶ単位複製配列に相補的な化学発光プローブの核酸ハイブリダイゼーションを用いて、検出を達成する。アッセイが陽性結果を生じたら、識別試験を行って、２つのウイルス間を区別する。
【００８８】
多重増幅反応において、各組のプライマーが異なる解析物ポリヌクレオチドに特異的である、異なるプライマー組の数が増加するにつれて、プライマー間、並びにプライマーおよび無関係な単位複製配列間の望ましくない相互作用の機会が増加する。本明細書に開示するプライマー配列は、好適に、ＨＩＶ−１、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来のウイルス特異的配列を増幅することもまた可能な、単一ポリヌクレオチド増幅反応における試薬として使用可能である。
【００８９】
本発明の一般的な原理は、以下の限定されない実施例を参照することによって、より完全に認識可能である。第一の実施例は有用な増幅プライマーを同定する方法を記載する。
【００９０】
ＨＩＶ−２末端反復配列（ＬＴＲ）のポリヌクレオチド配列を増幅するのに好ましいプライマーの組み合わせは、異なる数の核酸テンプレート分子を使用する一連の方法で同定した。以下に記載するように、最初の試験は、５，０００コピー／反応レベルで、合成ＨＩＶ−２テンプレートを用いて行った。続く試験は、１００または５００コピー／反応いずれかを用いて行い、アッセイ感度に関する情報を提供した。反復試験の結果を解析すると、単位複製配列産生の平均値と共に、方法の再現性に関する情報が得られた。Ｔ７プロモーター−プライマーおよび非Ｔ７プライマーは、以下に記載する溶液相法を用いて、組み合わせてスクリーニングした。以下に記載する方法は、特に、転写仲介増幅（ＴＭＡ）プロトコルを用いて実施したが、本明細書に開示するプライマーを用いて、一般の当業者によく知られるであろう代替法によって、単位複製配列を産生することが可能である。
【００９１】
実施例１は、ＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列を増幅するプライマーを同定するのに用いた方法を記載する。
【００９２】
【実施例】
実施例１
増幅プライマーの同定
ＨＩＶ−２ ＨＩＶ２ＦＧサブタイプＬＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ０３６５４）の塩基１−６４４の配列を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡは、標準的実験法にしたがって、テンプレートとして直線化プラスミドクローンを用いて調製した。その後、生じたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を、本質的にＫａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号に記載されるようなＴＭＡ反応において、プライマーの対の組を使用する増幅反応のテンプレートとして用いた。各プロモーター−プライマーは各々、５’端に、Ｔ７プロモーター配列ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号２８）またはＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡ（配列番号２９）いずれかを、そして３’端に標的相補配列を含んだ。増幅反応はまず、１００μｌの標準的反応緩衝液中、合成ＲＮＡテンプレート５，０００コピーおよび各１５ｐｍｏｌのプライマーを用いて、いくつかのプライマーの組み合わせに関して行った。標的核酸およびプライマーを６０℃に１０分間加熱して、そしてその後、４２℃に冷却し、プライマーアニーリングを促進した。その後、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（２０００単位）およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（２０００単位）を混合物に添加した。最終増幅反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３５ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、および５％（ｗ／ｖ）グリセロールを含有した。４２℃で１時間インキュベーションした後、１００μｌ増幅反応すべてを、その開示が本明細書に援用されるＡｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号に本質的に記載されるように、均質保護アッセイにおいて、アクリジニウムエステル標識化プローブを用いて、ハイブリダイゼーションによってアッセイした。配列番号２７の配列を有するプローブは、１．９４ｘ１０8ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性にＡＥで標識し、そしてその後、各ハイブリダイゼーション反応のため、１．９ｘ１０7ＲＬＵに均等の量を用いてＨＩＶ−２単位複製配列を検出した。プローブハイブリダイゼーションは、０．０５Ｍコハク酸リチウム（ｐＨ５）、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡを含有する溶液２００μｌ中、６０℃で１５分間行い、その後、３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１％ ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；コネチカット州ダンベリー）を添加した。この混合物をまず、６０℃で１０分間インキュベーションし、非ハイブリダイズプローブを不活性化し、そしてその後、室温に冷却した。各試料中に残った化学発光は、１ｍＭ硝酸および０．１％（ｖ／ｖ）過酸化水素を自動的に注入した後、１Ｎ水酸化ナトリウムを含有する溶液を注入するよう設定した、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）Ｉ発光測定装置を用いてアッセイした。化学発光反応に関して測定した結果は、相対光単位（ＲＬＵ）で表した。
【００９３】
表４は、５，０００コピーのテンプレートポリヌクレオチドを用いて行った増幅法からの結果を示す。とりわけ、配列番号１７の配列を有するプロモーター−プライマーは、ＨＩＶ−１ポリヌクレオチド配列を効率的に増幅し（データ未提示）、そしてＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２核酸が共通のプライマーを用いて同時増幅可能であるかどうか決定する、本方法に含まれた。このプライマーの配列は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が挿入／欠失によって異なる配列領域に渡る。したがって、配列番号９の配列（本発明のプロモーター−プライマー配列はこれに由来する）と比較して、プロモーター−プライマーのＨＩＶ−２標的相補部分は、配列番号９の配列において、２８位のヌクレオチドでミスマッチを、そして１９−２０位のＡＣヌクレオチド対に対応する２つのヌクレオチドの欠失を有する。表に示す結果は、増幅および検出法の４回の試験（配列番号１６の配列を有するプロモーター−プライマーに関して）または５回の試験（配列番号１５および１７の配列を有するプロモーター−プライマーに関して）の反復から得ている。表に示す陰性対照エントリーのいくつかは、異なる時点で行ったアッセイから得た。すべての陰性対照値は、いかなるＨＩＶ−２テンプレートも非存在下で行った試験から得た。アッセイの非常に再現性がある性質を考慮し、合理的に、陰性対照反応の大きさはまた、異なる実験間でも同等であろうと仮定した。入手不能なデータは、表中、「ＮＡ」と示す。
【００９４】
表４
異なるプライマーの組み合わせを用いた、ＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列の増幅
【００９５】
【表４】
【００９６】
表４に示す結果は、５，０００コピー／反応のテンプレートレベルで試験したプライマーの組み合わせが各々、陽性結果を生じることを示した。方法において、プロモーター−プライマーはすべて、容易に検出可能な増幅シグナルを生じたが、配列番号１５と同定するプロモーター−プライマーは、試験した非Ｔ７プライマー各々と組み合わせて用いた際、好適に、優れた結果を生じた。とりわけ、配列番号１５の配列を有するプロモーター−プライマーを含む増幅反応は、均質に、低い％ＣＶ値と関連し、それによって、このプライマーを含む増幅反応の高い度合いの再現性および特別の堅牢性が示された。興味深いことに、表に示す結果は、ＨＩＶ−１配列を非常に効率的な方式で増幅する配列番号１７の配列を有するプロモーター−プライマーであってもまた、この方法では、ＨＩＶ−２配列を増幅することを示した。
【００９７】
表４に示す知見に基づいて、さらなるプロモーター−プライマーおよびより低いレベルの投入テンプレートを用いて、さらなる試験を行って、有用なプロモーター−プライマーの設計およびアッセイの感度に関する柔軟性を立証した。より具体的には、上述の増幅および検出法は、各反応において、配列番号１５および１７の配列を有するプロモーター−プライマーを、非Ｔ７プライマーおよび１００または５００コピーいずれかのＨＩＶ−２テンプレートと組み合わせて用いて、反復した。その後、非Ｔ７プライマーの１つを、Ｔ７プロモーター配列を所持するＴ７プロモーター−プライマーおよび配列番号１５−１７に同定する配列を有するプロモーター−プライマーのいずれに存在するものとも異なる標的相補配列のコレクションと組み合わせて試験するために選択した。これらの方法の結果を表５−８に示す。
【００９８】
表５
異なるプライマーの組み合わせを用いた、５００コピー／反応でのＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列の増幅
【００９９】
【表５】
【０１００】
表６
異なるプライマーの組み合わせを用いた、１００コピー／反応でのＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列の増幅
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
表５および６に示す結果によって、配列番号１５に同定するプロモーター−プライマーが、投入テンプレートレベルがわずか１００コピー／反応であっても、示した非Ｔ７プライマー各々を用いて、ＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列を効率的に増幅することが確認された。配列番号１７の配列を有するプロモーター−プライマーはまた、配列番号１５の配列を有するプロモーター−プライマーに比較して、幾分減少したレベルであっても、増幅反応の構成要素として有用であった。しかし、明らかに、これらの２つのプライマーは、ＨＩＶ−２核酸増幅アッセイにおいて、プライマー結合のための標的として有用であるＬＴＲの領域を明示した。
【０１０３】
３つのさらなる非Ｔ７プライマーを合成して、そしてＨＩＶ−２増幅アッセイにおいて、配列番号１５のプロモーター−プライマーと組み合わせて試験した。これらのさらなるプライマーは、配列番号４−６に示す配列を有し、各オリゴヌクレオチドの１−４位は、２’メトキシ残基によって占められた。表７は、各反応において、合成ＨＩＶ−２テンプレートＲＮＡ １００コピーを用いて、これらのプライマー組を上述の増幅プロトコルで試験し、そして本質的に上述のように増幅産物を検出した際に得た結果を示す。
【０１０４】
表７
異なるプライマーの組み合わせを用いた、１００コピー／反応でのＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列の増幅
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
表７に示した結果は、３つのプライマーの組み合わせがすべて、増幅法において、例外的に優れた結果を生じることを示した。とりわけ、配列番号６の配列を有するプライマーおよび配列番号１５の配列を有するプロモーター−プライマーの組み合わせは、ＨＩＶ−２テンプレート配列を効率的に増幅し、そして好適に、陰性対照反応では、非常に低い読み取りを生じた。本明細書に開示するプライマーおよびプライマーの組み合わせは各々、本発明の好ましい態様に相当する。配列番号６の配列を有するプライマーおよび配列番号１５の配列を有するプロモーター−プライマーの組み合わせは、ＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列を増幅するのに、非常に好ましい組み合わせである。
【０１０７】
最後に、５００または１００コピー／反応のＨＩＶ−２テンプレートいずれかを用いて行う増幅反応において、配列番号１８および１９に同定するプロモーター−プライマーと組み合わせて、配列番号６の配列を有するプライマーを試験した。重要なことに、２つのプライマー中の標的相補配列およびＴ７プロモーター配列はどちらも、配列番号１５−１７のプロモーター−プライマーで使用するＴ７プロモーター配列とは異なった。やはり重要なことに、配列番号１８に同定するプロモーター−プライマーは、配列番号９に示す配列の１９位のＡ残基に対応する単一塩基欠失を含有する。表８に示す数値は、それぞれ、５００および１００コピー／反応のＨＩＶ−２標的を用いて行った、５および４の反復試験の結果である。
【０１０８】
表８
異なるプライマーの組み合わせを用いた、５００または１００コピー／反応でのＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列の増幅
【０１０９】
【表８】
【０１１０】
表８に示す結果は、配列番号１８−１９に同定するＴ７プロモーター−プライマーがどちらも増幅アッセイで優れた結果を生じ、陽性シグナルは、５００コピー／反応のＨＩＶ−２標的を用いて行う陰性対照反応で測定されるシグナルより、５００−１，０００倍、上の範囲であることを立証した。著しいことに、これらのプロモーター−プライマーを含む陰性対照反応で測定したプローブハイブリダイゼーションシグナルは、好適に、非常に低かった。結果はさらに、異なるＴ７プロモーター配列を増幅法で使用して、優れた結果を生じることが可能であることをさらに立証した。
【０１１１】
表３−７に示す結果を総合すると、上述の非Ｔ７プライマー各々が結合するＬＴＲ標的領域が、Ｔ７プロモーター−プライマーと組み合わせてＨＩＶ−２配列を増幅するのに使用するための、さらなるプライマーを設計するのに使用可能なドメインを明示することが示された。このドメインは、ＧＴＧＴＧＴＧＴＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＴＡＧＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＴＣ（配列番号１）に示す長さ４０ヌクレオチドの配列を含んだ。この配列に実質的に対応する配列またはそのサブセットを有するオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載する増幅反応においてプライマーとして使用可能である。さらに、表４−８の結果は、上述のＴ７プロモーター−プライマー各々が結合するＬＴＲ標的領域が、非Ｔ７プライマーと組み合わせてＨＩＶ−２配列を増幅するのに使用可能なドメインを明示することを示した。このドメインは、長さ３４ヌクレオチドの配列ＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣ（配列番号８）を含んだ。この配列に、またはこの配列に実質的に相補的な配列に、相補的なオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載する増幅反応において、プライマーとして使用可能である。
【０１１２】
実施例２は、ＨＩＶ−２単位複製配列を検出するのに有用なプローブを同定するのに使用する方法を記載する。この方法において、一連の異なるプローブ配列に相補的な単一の合成オリゴヌクレオチド標的は、プローブ結合アッセイの標的として働いた。
【０１１３】
実施例２
ＨＩＶ−２を検出するオリゴヌクレオチドプローブ
配列ＧＡＡＧＧＧＵＣＣＵＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＧＧＵＣＵＵＧＵＵＡ（配列番号３０）を有する合成アンチセンスＨＩＶ−２オリゴヌクレオチドは、標準的な実験法にしたがって、２’メトキシヌクレオチドを用いて調製した。このオリゴヌクレオチドは、モデルＲＮＡ標的として働いた。２’メトキシヌクレオチドを用いて調製し、そしてプローブとして試験した、６つの異なるオリゴヌクレオチドは、表３に示す配列を有した。
【０１１４】
ハイブリダイゼーション反応は、１ｘ１０6ＲＬＵに対応する量のＡＥ標識化プローブを含有するプローブ保護緩衝液１００μｌ体積および２ｐｍｏｌの合成ＨＩＶ−２ ＲＮＡ標的を含有する１００μｌからなった。緩衝溶液は、７５ｍＭコハク酸、１２９ｍＭラウリル硫酸リチウム、７５ｍＭ水酸化リチウム、１５ｍＭアルドリチオール−２、１．０Ｍ塩化リチウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ｖ／ｖエチルアルコールを含み、そしてｐＨを４．２に調整した。混合物は、６０℃で１５分間ハイブリダイズさせ、そしてその後、６００ｍＭホウ酸、２３５ｍＭ ＮａＯＨおよび１％ｖｏｌ／ｖｏｌ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００を含む選択試薬溶液（ｐＨ９に調整済み）２５０μｌを用いて選択し、そしてその後、室温に１０分間冷却した。陰性対照ハイブリダイゼーション反応では、アンチセンスＨＩＶ−２標的オリゴヌクレオチドを省いた。ハイブリダイズしたプローブに会合するＡＥ標識の量を反映する化学発光は、上述の方法を用いて測定した。この方法から得た結果を表９に示す。
【０１１５】
表９
プローブハイブリダイゼーションの結果
【０１１６】
【表９】
【０１１７】
表９に示す結果が示すように、該方法で試験したプローブは各々、低レベルのバックグラウンドハイブリダイゼーションを生じ、そしてＨＩＶ−２標的配列と、少なくとも中程度のレベルの陽性反応を生じた。より具体的には、陰性対照値はすべて、投入プローブレベルの０．２５％未満であり、一方、ＨＩＶ−２標的配列の存在下で行った反応はすべて、１５％より大きかった。実施例１で、配列番号２７の配列を有するプローブが、ＨＩＶ−２単位複製配列を検出するのに有用であることが示されたのと合わせると、表９の結果は、表３に示す配列がすべて、検出プローブとして有用であることを示した。
【０１１８】
上述の方法で達成した成功は、さらなる検出プローブを設計するのに使用可能なＨＩＶ−２配列ドメインを明示した。より具体的には、このドメインは、配列ＣＣＴＧＧＴＣＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＣＴＴＣＴ（配列番号２０）を有する、長さ２２ヌクレオチドの伸長に渡った。この配列に実質的に対応する配列、そのサブセット、またはその相補体を有するオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−２核酸を検出するためのプローブとして使用可能である。もちろん、有用なプローブは、このドメインの長さより長くてもよいし、そして有用なプローブのＨＩＶ−２相補部分は、分子ビーコンなどの、特定の二次構造を有するプローブに取り込んでもよい。配列番号２０の配列は、ＨＩＶ−１のゲノムに欠けているＨＩＶ−２ゲノムの部分に由来するため、これらのプローブはＨＩＶ−２に特異的であり、そしてＨＩＶ−１に特異的でない。
【０１１９】
とりわけ、配列番号２６および２５の配列を有するプローブは、この方法において、非常に優れた結果を生じた。これらのプローブのオリゴヌクレオチド配列は、上述のアッセイの検出工程で使用するのに、非常に好ましい。もちろん、いかなる検出可能標識の配置も多様であることが可能であり、そしてそれでも本発明の範囲内に属する。例えば、上述の方法を用いて、ＨＩＶ−２単位複製配列の検出用に、９および１０位の間に連結したＡＥ標識を持つ、配列番号２６の配列を有するプローブを使用するのが非常に好ましい。
【０１２０】
候補オリゴヌクレオチドが、溶液からＨＩＶ−２核酸を捕捉するのに使用可能であるかどうか決定する方法は、モデル標的として、上述のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＨＩＶ−２ ＲＮＡを用いて行った。２つの異なる候補捕捉オリゴヌクレオチドは各々、オリゴ（ｄＡ）伸長に連結したＨＩＶ−２特異的配列を含んだ。ＨＩＶ−２ ＲＮＡ標的、およびオリゴ（ｄＴ）を提示するよう修飾した磁気粒子と組み合わせると、機能する捕捉オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−２標的および粒子を架橋し、そしてＨＩＶ−２標的を固定した。溶液からの粒子性の複合体の除去は、ＨＩＶ−２テンプレートの濃縮手段に有効に相当した。以下の実施例に記載する方法において、２つの捕捉オリゴヌクレオチドを、別個に、ＨＩＶ−２ ＲＮＡおよびオリゴ（ｄＴ）で修飾した磁気粒子と接触させた。粒子を収集し、そしてその後、洗浄した後、結合したＨＩＶ−２配列は、均質保護アッセイで検出した。各場合で、捕捉オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−２ ＲＮＡ標的を磁気粒子上に固定した。
【０１２１】
以下の実施例は、ＨＩＶ−２捕捉オリゴヌクレオチドを同定するのに用いた方法を記載する。
【０１２２】
実施例３
捕捉オリゴヌクレオチドを用いたＨＩＶ−２標的配列の検出
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写したＨＩＶ−２ ＬＴＲ ＲＮＡ標的（上述）５ｘ１０11コピーは、配列番号３１および３２の配列を有する捕捉オリゴヌクレオチド、０、１．５ｐｍｏｌ、３．５ｐｍｏｌまたは５ｐｍｏｌいずれか、並びに常磁性粒子（０．７−１．０５μ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ、インディアナ州インディアナポリス）に連結した固定化ポリ（ｄＴ14）約１００μｇを含有する溶解／捕捉緩衝液４００μｌ中に分散した。溶解／捕捉緩衝液は、７９０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２３０ｍＭコハク酸、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、６８０ｍＭ水酸化リチウム一水和物を含んだ。配列番号３１の配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドは、２’−メトキシヌクレオチド類似体が占める１−２０位およびデオキシリボヌクレオチドが占める２１−５３位を有した。配列番号３２の配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドは、２’−メトキシヌクレオチド類似体が占める１−１８位およびデオキシリボヌクレオチドが占める１９−５１位を有した。配列５’−ＴＴＴ−３’に示されるスペーサーを、捕捉オリゴヌクレオチド各々に関して、ＨＩＶ−２相補配列およびポリ（Ａ）テール領域間に挿入した。Ｌｕｎｄら， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０８６１−１０８８０（１９８８）に記載されるようなカルボジイミド化学反応を用いて、ポリ（ｄＴ14）を常磁性粒子に連結した。混合物を５５−６０℃に約１５から３０分間加熱し、そしてその後、室温に冷却してハイブリダイゼーションを可能にした。Ｗａｎｇら、米国特許第４，８９５，６５０号に記載するものなどの方法を用いて、磁場を適用し、固定化捕捉オリゴヌクレオチドおよびＨＩＶ−２ ＲＮＡを含有する粒子複合体を収集した。粒子は、再懸濁および磁気分離工程の反復によって、１ｍｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６．５ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチル−パラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピル−パラベン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム）で２回洗浄した。洗浄した粒子は、１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液に懸濁し、そして配列番号２７の配列を有するプローブの代わりに、配列番号３３の配列を有するプローブを用いたことを除いて、先の実施例に記載した、プローブハイブリダイゼーションおよび検出法に、混合物を供した。各アッセイ条件に関して、偽捕捉対照は、アッセイで達成可能な最大化学発光値を示した。表１０は、捕捉オリゴヌクレオチドの各レベルに関して、２つのアッセイの反復に関する化学発光測定値を示す。
【０１２３】
表１０
標的捕捉の有効性
【０１２４】
【表１０】
【０１２５】
表１０に示す結果は、方法で試験したオリゴヌクレオチドがどちらも、溶液からＨＩＶ−２ ＲＮＡを捕捉するのに使用可能であることを確証した。
【０１２６】
実施例４は、生物学的試料において、ＨＩＶ−２核酸を検出するため、したがうことが可能な方法を記載する。この実施例は、既知の量のＨＩＶ−２核酸を含有する対照試料を記載するが、ヒトドナー血液試料から得た血漿試料で置き換えてもよいことが理解されるべきである。後者の場合の陽性ハイブリダイゼーション結果は、ドナー試料におけるＨＩＶ−２核酸の存在の指標となるであろう。
【０１２７】
実施例４
核酸増幅を用いたＨＩＶ−２核酸の検出
既知の量のＨＩＶ−２（反応試験管あたり１００コピーのＨＩＶ−２）を含有するヒト血漿の第一の試料を、実施例３に記載するように、等体積の溶解／捕捉緩衝液と混合する。ＨＩＶ−２標的ＲＮＡを捕捉するため、混合物はまた、配列番号３１の配列を有する捕捉オリゴヌクレオチド約３．５ｐｍｏｌおよび常磁性粒子（０．７−１．０５μ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ、インディアナ州インディアナポリス）に付着した固体化ポリｄＴ14プローブ約１００μｇも含有する。混合物は、５５−６０℃に約１５から３０分間加熱し、そしてその後、室温に冷却して、ハイブリダイゼーションを可能にする。その後、磁場を適用して粒子複合体を収集する。粒子は、１ｍｌの洗浄緩衝液で２回洗浄し、そしてその後、実質的に、Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号に記載されるような方法を用いた転写関連増幅のため、核酸増幅試薬溶液７５μｌ中に再懸濁する。
【０１２８】
簡潔には、付着した複合体を含む洗浄粒子を、反応混合物（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ７．５）、１７．５ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、各１ｍＭのｄＮＴＰ、各４ｍＭのｒＮＴＰ）中で、配列番号１５および６の配列を有する増幅オリゴヌクレオチド各１５ｐｍｏｌと混合し、不活性油の層で覆って蒸発を防止し、６０℃で１０分間インキュベーションし、そしてその後、４１．５−４２℃で１０分間インキュベーションする。酵素（反応あたり約３，０００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素および約３，０００単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を添加し、混合し、そして標的ＨＩＶ−２核酸を４１．５−４２℃で１時間増幅する。
【０１２９】
実質的に先に記載するように、増幅したＨＩＶ−２標的配列は、配列番号２６の配列を有するＡＥ標識化プローブとハイブリダイズさせ、そしてその後、化学発光によって検出し、そして結果を相対光単位（ＲＬＵ）で表した。各アッセイ条件に関して、陰性対照は、ＨＩＶ−２含有試料の代わりに、ＨＩＶ−２核酸を含有しない、等体積の血漿を有する。その後、これらのアッセイで検出したＲＬＵ読み取り値を比較する。
【０１３０】
これらの方法の結果は、ＨＩＶ−２核酸配列が、本発明の方法を用いて、生物学的試料において、容易に検出可能であることを示す。より具体的には、陰性対照試料は、背景シグナルのみに対応するプローブハイブリダイゼーション結果を生じる。逆に、ＨＩＶ−２核酸を含有する試料は、バックグラウンドの数倍のハイブリダイゼーションシグナルを生じる。これは、増幅および検出反応が実行可能であることを示す。
【０１３１】
本発明は、いくつかの特定の実施例およびその態様に関して記載している。もちろん、前述の詳細な説明を概観すれば、本発明のいくつかの異なる態様が、当業者に示唆されるであろう。したがって、本発明の真の範囲は、付随する請求項を参照して、決定すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＨＩＶ−２核酸内の標的領域を検出するのに使用可能な多様なポリヌクレオチドを例示する模式図である（太い水平線で示す）。以下の核酸の位置を、標的領域に相対して示す：「捕捉オリゴヌクレオチド」は、増幅前に標的核酸にハイブリダイズし、そして該核酸を捕捉するのに用いる核酸を指し、「Ｔ」は、相補配列を有する固定化オリゴヌクレオチド（示していない）にハイブリダイズするのに用いるテール配列を示す；「非Ｔ７プライマー」および「Ｔ７プロモーター−プライマー」は、ＴＭＡを行うのに用いる２つの増幅プライマーを示し、「Ｐ」は、Ｔ７プロモーター−プライマーのプロモーター配列を示し；そして「プローブ」は、増幅した核酸を検出するのに用いるプローブを指す。
【配列表】
関連出願
本出願は、米国仮出願第６０／２４２，６２０号、２０００年１０月２３日出願、および米国仮出願第６０／２８０，０５８号、２００１年３月３０日出願の優先権を請求する。これらの関連出願の開示は、本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、ＨＩＶ−２核酸配列を検出するための診断アッセイに関する。
【０００３】
発明の背景
ＨＩＶ／ＡＩＤＳ汎発性は、主に、ＨＩＶ−１による感染のためであるが、ＡＩＤＳの別の原因として、異なるレトロウイルスが出現してきている。このいわゆる「ＨＩＶ−２」ウイルスは、１９８６年に西アフリカでＡＩＤＳ患者から最初に単離され、そして続いて、翌年、米国で初めて、感染性病原体として検出された。１９９４年の終わりまでに、米国では１００症例未満のＨＩＶ−２が報告されてきた。このように表面上は少数であるにもかかわらず、ＨＩＶ−２は、ＨＩＶ−１感染から生じるＡＩＤＳ症例と臨床的に区別不能な、増加する数の免疫抑制疾患における原因病原体として同定されている（Ｋａｎｋｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：２３８（１９８６）；Ｋａｎｋｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８２７（１９８７）；Ｃｌａｖｅｌら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：３４３（１９８６）；Ｃｌａｖｅｌら， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１６：１１８０（１９８７））。ＨＩＶ−２は、その形態およびＣＤ４+細胞への向性によりＨＩＶ−１に関連付けられるが、明らかに別個のウイルスであり、そして単にＨＩＶ−１のエンベロープ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）ではない。
【０００４】
実際、ＨＩＶ−２は、遠くしかＨＩＶ−１に関連しておらず、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質ではおよそ５０％のアミノ酸保存であり、そしてｅｎｖ遺伝子産物では３０％未満のアミノ酸保存しかなく、その存在は、ＨＩＶ−１感染を検出するのに用いられる血清学的アッセイによって有効に検出されない（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅ ＮＴ， ＡＩＤＳ ７：１（１９９３）；Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ ＤＭ， Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １１８：２１１（１９９３））。その結果、ＨＩＶ−２ウイルス核酸を特異的に検出するのに使用可能な核酸プローブを開発する試みがなされてきている。
【０００５】
興味深いことに、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２どちらのゲノムも、異なる単離体間で、実質的な配列不均一性を示す。この不均一性の結果として、ＨＩＶ−１のすべての単離体またはＨＩＶ−２のすべての単離体間の絶対配列保存の実質的な領域を見出すことが不可能となってきている（公開欧州特許出願ＥＰ ０ ８８７ ４２７を参照されたい）。実際、これらのウイルス各々に関して、特有のポリヌクレオチド配列を持つ多くのウイルス単離体が同定されてきており、この要因は、信頼性があり、そして有効な核酸試験のためのプローブを構築するのをさらに困難にしている。
【０００６】
ＨＩＶ−１同様、ＨＩＶ−２もまた、血液および血漿を含む体液の交換を通じて伝播性であるため、感染個体において、ウイルスに対する抗体が検出可能になるか、または症状が明らかになる前に、感染した体液を検出可能であることが重要である。そうでなければＨＩＶ−２感染体液を（例えば輸血中に、全血または血漿を）、あるいは寄付された血液または血漿由来の産物を投与される可能性がある患者を保護するため、寄付された体液中のウイルスの存在を検出し、こうした方法または産物におけるその使用を防止することが特に重要である。ＨＩＶ−２の検出に用いる方法および試薬が、感染初期段階のドナーである可能性がある感染個体に存在しうる、比較的少数のウイルスコピーを検出可能であることもまた、重要である。
【０００７】
ＨＩＶ−２を検出するためのアッセイおよび試薬が、例えば米国特許第６，０２０，１２３号、第５，６８８，６３７号、第５，５４５，７２６号および第５，３１０，６５１号；欧州特許第ＥＰ ０４０４６２５ Ｂ１号および第ＥＰ ０２３９４２５ Ｂ１号；並びに公開欧州特許出願第ＥＰ １０２６２３６ Ａ２号、第ＥＰ ０８８７４２７ Ａ２号に先に開示されている。
【０００８】
発明の概要
本発明の第一の側面は、ＨＩＶ−２核酸配列を検出するための組成物に関する。該組成物は、１００ヌクレオチドまでの長さを有する、第一の増幅オリゴヌクレオチドを含む。この第一の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基の配列を含む。該組成物にやはり含まれるのは、１００ヌクレオチドまでの長さを有する、第二の増幅オリゴヌクレオチドである。この第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列由来の１９−４０の隣接する塩基の配列を含む。本発明の好ましい態様において、第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さは、１９−４０ヌクレオチドである。本発明のさらにより好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドの長さは１８−６０ヌクレオチドであり、より好ましくは１８−３４ヌクレオチドであり、そしてさらにより好ましくは１８−２５ヌクレオチドである。１８−２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する第一の増幅オリゴヌクレオチドの例を、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４に示す。別の好ましい態様において、第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１９−４０ヌクレオチドの範囲である場合、第一の増幅オリゴヌクレオチドの長さは１８−６０ヌクレオチドの範囲であり、そしてプロモーター配列を含む。本発明の別の好ましい態様にしたがって、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１００ヌクレオチドまでの長さを有する場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さは１９−２１ヌクレオチドの範囲である。別の好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドは１８−３４ヌクレオチドの長さを有し、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドは１９−２１ヌクレオチドの長さを有する。さらに別の好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１８−６０ヌクレオチドの長さを有する場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドは１９−２１ヌクレオチドの長さを有する。本発明のさらに別の好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１８−６０ヌクレオチドの長さを有し、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドが１９−４０ヌクレオチドの長さを有する場合、第一の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１５−１９のいずれか１つの配列を有するプロモーター−プライマーである。本発明のさらに別の好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１８−６０ヌクレオチドの長さを有し、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドが１９−２１ヌクレオチドの長さを有する場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２−７のいずれか１つの配列を有することが可能である。本発明のさらに別の好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１８−６０ヌクレオチドの長さを有し、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドが１９−２１ヌクレオチドの長さを有する場合、第一の増幅オリゴヌクレオチドはプロモーター配列をさらに含むことが可能である。例えば、第一の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１５−１９のいずれか１つの配列を有するプロモーター−プライマーであることが可能である。あるいは、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１８−６０ヌクレオチドの長さを有し、第二の増幅オリゴヌクレオチドが１９−２１ヌクレオチドの長さを有し、そして第一の増幅オリゴヌクレオチドがプロモーター配列をさらに含む場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号２−７のいずれか１つであることが可能である。本発明のさらに別の好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドが１８−６０ヌクレオチドの長さを有し、第二の増幅オリゴヌクレオチドが１９−２１ヌクレオチドの長さを有し、そして第一の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号１５−１９のいずれか１つの配列を有するプロモーター−プライマーである場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２−７のいずれか１つに提供される配列を有することが可能である。本発明の別の好ましい態様にしたがって、第一の増幅オリゴヌクレオチドの長さは１８−２５ヌクレオチドであり、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さは１９−２１ヌクレオチドである。この場合、第一の増幅オリゴヌクレオチドは、例えば配列番号１０−１４のいずれか１つである配列を有することが可能である。あるいは、第一の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１８−２５ヌクレオチドであり、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１９−２１ヌクレオチドである場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２−７のいずれか１つに提供される配列を有することが可能である。本発明のさらに別の非常に好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１８−２５ヌクレオチドであり、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１９−２１ヌクレオチドであり、そして第一の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号１０−１４のいずれか１つに提供される配列を有する場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２−７のいずれか１つであることが可能である。別の態様にしたがって、各々１００ヌクレオチドまでの長さを有する、第一および第二の増幅オリゴヌクレオチドを含む組成物は、配列番号２１またはその相補体を含む配列を有するオリゴヌクレオチド検出プローブをさらに含むことが可能である。好ましくは、検出プローブは、１８ヌクレオチドまでの長さを有し、そしてより好ましくは、配列番号２２−２７のいずれか１つの配列を有する。非常に好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１０−１９のいずれか１つであり、第二の増幅オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号２−７のいずれか１つであり、そしてオリゴヌクレオチド検出プローブの配列は、配列番号２２−２７のいずれか１つである。
【０００９】
本発明の第二の側面は、核酸を含有する生物学的試料が、ＨＩＶ−２ヌクレオチド塩基配列を含むかどうか決定する方法に関する。本発明の方法の第一の工程は、生物学的試料の核酸を、配列番号９の配列を含み、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する第一の増幅オリゴヌクレオチドを含む組成物と接触させることを伴う。この第一の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基の配列を有する。該組成物はさらに、配列番号１の配列由来の１９−４０の隣接する塩基を有し、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する第二の増幅オリゴヌクレオチドをさらに含む。第二の工程は、生物学的試料に存在する、いかなるＨＩＶ−２ヌクレオチド塩基配列も増幅して、増幅した核酸を産生することを伴う。最後に、増幅工程で産生した、増幅した核酸を検出する工程がある。本発明の方法にしたがって、増幅した核酸の陽性検出は、生物学的試料がＨＩＶ−２ヌクレオチド塩基配列を含んだことの指標となる。好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドは長さ１８−６０ヌクレオチドであり、そして第二の増幅オリゴヌクレオチドは長さ１９−４０ヌクレオチドである。同じ２つのオリゴヌクレオチドを使用する、さらにより好ましい態様において、第一の増幅オリゴヌクレオチドはプロモーター−プライマーであり、そして増幅工程は、転写仲介増幅反応または「ＴＭＡ」によって増幅することを伴う。本発明の異なる好ましい態様にしたがって、第一および第二の増幅オリゴヌクレオチドが、それぞれ１８−６０および１９−４０ヌクレオチドの長さを有する場合、検出工程は、まず、増幅した核酸を、増幅した核酸に特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブとハイブリダイズさせ、そしてその後、増幅した核酸にハイブリダイズした、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの量を測定することを伴う。これは、例えば、標識した核酸プローブを用いることによって達成可能である。代替法において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは配列番号２１またはその相補体の配列を含み、そして３５ヌクレオチドまで、または２２ヌクレオチドまでの長さを有する。
【００１０】
本発明の第三の側面は、３５ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号２１またはその相補体の配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。特定の好ましい態様において、標識したオリゴヌクレオチドは、２２ヌクレオチドまでの長さを有する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列番号２０またはその相補体の配列内に含有される、少なくとも１６の隣接するヌクレオチドを有する。１つの態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号２０またはその相補体の配列を有する。別の好ましい態様において、配列番号２１またはその相補体の配列を含む該オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチドまでの長さを有する。例えば、オリゴヌクレオチドは、配列番号２２またはその相補体、配列番号２３またはその相補体、配列番号２４またはその相補体、配列番号２５またはその相補体、配列番号２６またはその相補体、および配列番号２７またはその相補体のいずれか１つの配列を有することが可能である。特定の標識オリゴヌクレオチドは、正確に１８ヌクレオチドの長さを有する。本発明の他の態様において、オリゴヌクレオチドが２２ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号２１またはその相補体の配列を含む場合、オリゴヌクレオチドがＤＮＡであることが可能であるが、あるいは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体（ａｎａｌｏｇ）を含むことが可能である。好ましくは、ヌクレオチド類似体は、リボース部分の２’位にメトキシ基を有する。本発明の別の好ましい態様において、配列番号２１またはその相補体の配列を含み、そして１８ヌクレオチドまでの長さを有するオリゴヌクレオチドはまた、検出可能標識も含む。有用な検出可能標識の例には、化学発光標識および放射標識が含まれる。化学発光標識の特に好ましい例は、アクリジニウムエステルである。
【００１１】
本発明の第四の側面は、生物学的試料においてＨＩＶ−２核酸の存在を検出する方法に関する。本発明の方法の第一の工程は、長さ３５ヌクレオチドまでであり、そして配列番号２１またはその相補体の配列を含むハイブリダイゼーションプローブを、生物学的試料に提供することを伴う。次に、高ストリンジェンシー条件下で、生物学的試料に存在する可能性があるいかなるＨＩＶ−２核酸も、ハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズさせて、プローブ：標的二重鎖を形成する工程がある。最後に、生物学的試料にＨＩＶ−２が存在する指標として、プローブ：標的二重鎖を検出する工程がある。本発明の方法のいくつかの態様において、生物学的試料に提供するハイブリダイゼーションプローブの長さは、２２ヌクレオチドまででなく、わずか２２ヌクレオチドまでである。本発明の別の好ましい態様において、生物学的試料は、血漿または血清いずれかである、血液産物である。より好ましい態様において、「提供」工程を行う前に、生物学的試料に存在する可能性があるいかなるＨＩＶ−２からも核酸を遊離させる工程がある。本発明のさらにより非常に好ましい態様において、「遊離」工程を行った後に、生物学的試料に存在する可能性があるいかなるＨＩＶ−２からも遊離させた核酸を、固体支持体上に捕捉するさらなる工程がある。本発明の別の態様において、方法で用いる生物学的試料は溶解物である。本発明の方法を実施するのに使用可能な、典型的な高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は：（１）０．４８Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、並びに各１ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ；並びに（２）０．６−０．９Ｍの範囲の塩濃度を含む。さらに別の態様において、本発明の方法の第一の工程において、生物学的試料に提供するハイブリダイゼーションプローブは、配列番号２２またはその相補体、配列番号２３またはその相補体、配列番号２４またはその相補体、配列番号２５またはその相補体、配列番号２６またはその相補体、および配列番号２７またはその相補体のいずれか１つであることが可能な配列を有する。本発明の方法の非常に好ましい態様において、ハイブリダイゼーションプローブは少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。より非常に好ましい態様において、ハイブリダイゼーションプローブはまた、検出可能標識も含む。例えば、検出可能標識はアクリジニウムエステルであることが可能であり、そして検出工程が、ハイブリダイゼーション工程中に形成された、プローブ：標的二重鎖のいずれも検出する発光測定を行うことを含むことが可能である。
【００１２】
本発明の第五の側面は、ＨＩＶ−２核酸を検出するためのキットに関する。一般的に、本発明にしたがったキットは、パッケージングした組み合わせ中に、上述の組成物のいずれを含むことも可能である。本発明のキットの特定の態様は、第一の増幅オリゴヌクレオチドおよび第二の増幅オリゴヌクレオチドを含む。第一の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基の配列を含み、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する。第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列由来の１９−４０の隣接する塩基の配列を含み、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する。好ましくは、該キットはまた、第一および第二の増幅オリゴヌクレオチドを用いて合成したＨＩＶ−２単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を検出するのに使用可能な、オリゴヌクレオチド検出プローブも含む。検出プローブは、好ましくは、配列番号２１またはその相補体の配列、および検出可能標識を含む。検出プローブは、３５ヌクレオチドまでの長さを有することが可能である。本発明のキットは、増幅を行う前に、他の種からＨＩＶ−２テンプレート核酸を精製するのに使用可能な捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含有することが可能である。キット中にパッケージング可能な捕捉オリゴヌクレオチドの例は、配列番号３１および配列番号３２の配列を有する。
【００１３】
本発明の第六の側面は、配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基の配列を含み、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する第一のオリゴヌクレオチドを含む組成物に関する。より好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドの長さは１８−６０ヌクレオチドである。さらにより好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドの長さは１８−３４ヌクレオチドである。さらにより好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドの長さは１８−２５ヌクレオチドである。第一のオリゴヌクレオチドの長さが１８−３４ヌクレオチドの範囲である。特定の好ましい態様において、第一のオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号９の配列内に含有される１８−３４の隣接する塩基を含むことが可能である。この場合、第一のオリゴヌクレオチドの配列は、本発明の非常に好ましい特定の態様において、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４のいずれか１つであることが可能である。本発明の他の好ましい態様において、第一のオリゴヌクレオチドが１００ヌクレオチドまでの長さ、または１８−６０ヌクレオチドの長さを有する場合、第一のオリゴヌクレオチドの配列は、プロモーターをさらに含むことが可能である。こうした場合、第一のオリゴヌクレオチドは、プロモーター−プライマーとして機能することが可能である。例えば、この状況下では、第一のオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のいずれか1つであることが可能である。本発明の異なる態様にしたがって、第一のオリゴヌクレオチドが１００ヌクレオチドまでの長さ、または１８−６０ヌクレオチドの長さを有し、そして配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基を含む配列を有する場合、第二のオリゴヌクレオチドがさらに含まれることが可能である。この第二のオリゴヌクレオチドは、３５ヌクレオチドまでの長さ、またはより好ましくは２２ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号２１を含む配列を有することが可能である。特定の例において、第二のオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号２０の配列内に含有される少なくとも１６の隣接するヌクレオチドを含むことが可能である。この場合、第二のオリゴヌクレオチドの長さが１６−１８ヌクレオチドの範囲であることが非常に好ましい。ある場合、第二のオリゴヌクレオチドがさらに検出可能標識を含むことが望ましい。本発明のさらに異なる態様にしたがって、組成物が、１００ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基を含む配列を有する第一のオリゴヌクレオチドを含み、そして２２ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号２１を含む配列を有する第二のオリゴヌクレオチドをさらに含む場合、１００ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号１の配列由来の１９−４０の隣接する塩基を含む配列を有する第三のオリゴヌクレオチドがさらに含まれる。本態様の非常に好ましい型では、第三のオリゴヌクレオチドの長さは１９−４０ヌクレオチド、またはさらにより好ましくは１９−２１ヌクレオチドである。本発明のこうした態様にしたがった、第三のオリゴヌクレオチドの配列の特定の例は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７のいずれか１つを含む。
【００１４】
定義
以下の用語は、本明細書に明らかに逆に言及しない限り、本開示の目的のため、以下の意味を有する。
【００１５】
本明細書において、「生物学的試料」は、ヒトから得た、組織またはポリヌクレオチド含有材料いずれかである。本発明にしたがった生物学的試料には、末梢血、血漿、血清、骨髄、リンパ節を含む生検試料、呼吸組織または滲出物、胃腸組織、子宮頚スワブ試料、精液または他の体液、組織または材料が含まれる。生物学的試料を処理して、組織または細胞構造を破壊し、それによって、酵素、緩衝剤、塩、界面活性剤等を含有してもよい溶液中に、細胞内構成要素を遊離させることが可能である。
【００１６】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡいずれかと共に、配列に存在することが可能であり、そして相補配列を有する第二の分子と該ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げない合成ヌクレオチド類似体または他の分子いずれかを意味する。該用語は、天然存在ヌクレオチドの類似体を含有するポリマーも含み、そして特に、リボースの２’位にメトキシ基（ＯＭｅ）を有する類似体を含む。本明細書において、「Ｔ」残基を含有するメトキシポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位にメトキシ基を有し、そしてヌクレオチドの塩基位にウラシルを有する。「ＯＭｅＴ」と特に明記する場合、ヌクレオチドの塩基位がチミン残基に占められることを意味する。
【００１７】
本明細書において、「検出可能標識」は、検出可能であるか、または検出可能反応を導くことが可能である、化学種である。本発明にしたがった検出可能標識は、直接または間接的にポリヌクレオチドプローブに連結することが可能であり、そして放射性同位体、酵素、ハプテン、色素または検出可能な色を与える粒子（例えばラテックスビーズまたは金属粒子）などの発色団、発光化合物（例えば生物発光、燐光または化学発光部分）および蛍光化合物を含む。
【００１８】
「均質検出可能標識」は、プローブ上の標識が標的配列にハイブリダイズしているかどうかを測定することによって、均質な方式で検出可能な標識を指す。すなわち、均質検出可能標識は、標識または標識化プローブの非ハイブリダイズ型からハイブリダイズ型を物理的に除去することなく、検出可能である。これらの標識は、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；およびＮｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号に詳細に記載されている。均質アッセイで用いるのが好ましい標識には、化学発光化合物（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；およびＡｒｎｏｌｄ， Ｊｒ．ら、米国特許第５，６３９，６０４号を参照されたい）が含まれる。好ましい化学発光標識はアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば標準的ＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥ）である。合成、および核酸に標識を付着させ、そして標識を検出する方法は、当該技術分野に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）， 第１０章；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号；Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号；およびＢｅｃｋｅｒら、欧州特許出願第０ ７４７ ７０６号を参照されたい）。
【００１９】
本明細書において、「増幅」は、標的核酸配列、その相補体または断片の多コピーを得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法を指す。
【００２０】
「標的核酸」または「標的」により、標的核酸配列を含有する核酸を意味する。
【００２１】
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」または「標的領域」により、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含んでなる特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列、およびそれに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。
【００２２】
「転写関連増幅」により、ＲＮＡポリメラーゼを用い、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する核酸増幅のいかなる種類も意味する。「転写仲介増幅」（ＴＭＡ）と呼ばれる転写関連増幅法の一例は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター−テンプレート相補的オリゴヌクレオチドを使用し、そして所望により、１以上の類似オリゴヌクレオチドを含むことが可能である。多様なＴＭＡが、Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号；Ｋａｃｉａｎら、ＰＣＴ第ＷＯ ９３／２２４６１号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ第ＷＯ ８８／０１３０２号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ第ＷＯ ８８／１０３１５号；Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号；Ｕｒｄｅａら、米国特許第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＰＣＴ第ＷＯ ９４／０３４７２号；およびＲｙｄｅｒら、ＰＣＴ第ＷＯ ９５／０３４３０号に詳細に開示されるように、当該技術分野に公知である。Ｋａｃｉａｎらの方法が、本明細書に開示する種類の核酸増幅法を行うのに好ましい。
【００２３】
本明細書において、「プローブ」は、核酸、好ましくは増幅した核酸の標的配列に、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、特異的にハイブリダイズして、検出可能ハイブリッドを形成する核酸オリゴヌクレオチドである。プローブは、プローブの末端に付着してもよいし、または内部であってもよい、検出可能部分を含有することが可能である。標的ポリヌクレオチドと組み合わせるプローブのヌクレオチドは、プローブの配列に関して内部である検出可能部分の場合にそうである可能性があるように、厳密に隣接していなくてもよい。検出は、直接（すなわち標的配列または増幅した核酸に直接ハイブリダイズするプローブから生じる）であっても、または間接的（すなわちプローブを標的配列または増幅した核酸に連結する中間分子構造にハイブリダイズするプローブから生じる）であってもよい。プローブの「標的」は、一般的に、標準的水素結合（すなわち塩基対形成）を用い、プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、増幅した核酸配列内に含有される配列を指す。プローブは、標的特異的配列およびプローブの三次元コンホメーションに貢献する他の配列（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号に記載されるようなもの）を含んでなることが可能である。「十分に相補的な」配列は、プローブの標的特異的配列に完全に相補的でなくても、標的配列へのプローブオリゴヌクレオチドの安定なハイブリダイゼーションを可能にする。
【００２４】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも２、一般的には約５から約１００の間の化学サブユニットのポリマー鎖であり、各サブユニットは、ヌクレオチド塩基部分、糖部分、および直鎖空間立体配置でサブユニットを連結する連結部分を含んでなる。一般的なヌクレオチド塩基部分は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）であるが、水素結合することが可能な、他のまれな、または修飾したヌクレオチド塩基が当業者に公知である。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、約１０から約６０残基の下限を有するサイズ範囲に属する。オリゴヌクレオチドは、天然存在供給源から精製することが可能であるが、好ましくは、多様な公知の酵素的または化学的方法のいずれかを用いて合成する。
【００２５】
本明細書において、「増幅プライマー」または「増幅オリゴヌクレオチド」は、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、そして核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドである。増幅プライマー、またはより簡単に「プライマー」は、所望により修飾したオリゴヌクレオチドであることが可能であり、テンプレート核酸にハイブリダイズすることが可能であり、そしてＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長することが可能な３’端を有する。
【００２６】
「実質的に相同」、「実質的に対応している」または「実質的に対応する」により、対象のオリゴヌクレオチドが、参照塩基配列に存在する少なくとも１０の隣接する塩基領域に、少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％相同、より好ましくは少なくとも９０％相同、そして最も好ましくは１００％相同である、少なくとも１０の隣接する塩基領域を含有する塩基配列を有することを意味する（ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物は除く）。当業者は、非特異的ハイブリダイゼーションの許容し得ないレベルを妨げつつ、多様な割合の相同性で、標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、ハイブリダイゼーションアッセイ条件に対して行うことが可能である修飾を、容易に認識するであろう。類似性の度合いは、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することによって決定し、そして構造的相違が相補塩基との水素結合を妨げない限り、２つの配列間に存在する可能性がある他の構造的相違を考慮に入れない。２つの配列間の相同性の度合いはまた、比較している、少なくとも１０の隣接する塩基の各組に存在する塩基ミスマッチ数に関して表すことも可能であり、これは０から２塩基相違の範囲であることが可能である。
【００２７】
「実質的に相補的」により、対象のオリゴヌクレオチドが、標的核酸配列に存在する少なくとも１０の隣接する塩基領域に、少なくとも７０％相補的、好ましくは少なくとも８０％相補的、より好ましくは少なくとも９０％相補的、そして最も好ましくは１００％相補的である、少なくとも１０の隣接する塩基領域を含有する塩基配列を有することを意味する（ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物は除く）。（当業者は、非特異的ハイブリダイゼーションの許容し得ないレベルを妨げつつ、多様な割合の相補性で、標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、ハイブリダイゼーションアッセイ条件に対して行うことが可能である修飾を、容易に認識するであろう。）相補性の度合いは、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することによって決定し、そして構造的相違が相補塩基との水素結合を妨げない限り、２つの配列間に存在する可能性がある他の構造的相違を考慮に入れない。２つの配列間の相補性の度合いはまた、比較している、少なくとも１０の隣接する塩基の各組に存在する塩基ミスマッチ数に関して表すことも可能であり、これは０から２塩基ミスマッチの範囲であることが可能である。
【００２８】
「十分に相補的」により、一連の相補塩基間の水素結合によって、別の塩基配列にハイブリダイズすることが可能な隣接する核酸塩基配列を意味する。相補塩基配列は、標準的塩基対形成（例えばＧ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ塩基対形成）を用い、オリゴヌクレオチドの塩基配列の各位で相補的であってもよいし、または標準的水素結合を用いて相補的ではない１以上の残基（無塩基性「ヌクレオチド」を含む）を含有するが、全体の相補塩基配列が、適切なハイブリダイゼーション条件において、別の塩基配列と特異的にハイブリダイズすることが可能であるものであってもよい。隣接する塩基は、オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズすることが意図される配列に、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約１００％相補的である。当業者には、適切なハイブリダイゼーション条件が公知であり、該条件は、塩基配列組成に基づき予測することが可能であり、または日常的な試験を用いることにより、実験的に決定することが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１および１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７を参照されたい）。
【００２９】
「捕捉オリゴヌクレオチド」により、塩基対ハイブリダイゼーションによって、標的配列および固定化オリゴヌクレオチドを特異的に連結するための手段を提供する、少なくとも１つの核酸オリゴヌクレオチドを意味する。捕捉オリゴヌクレオチドは、好ましくは、２つの結合領域：標的配列結合領域および固定化プローブ結合領域を、通常、同一のオリゴヌクレオチド上に隣接して含むが、捕捉オリゴヌクレオチドは、１以上のリンカーにより共に連結される、２つの異なるオリゴヌクレオチド上に存在する、標的配列結合領域および固定化プローブ結合領域を含んでもよい。例えば、固定化プローブ結合領域が第一のオリゴヌクレオチド上に存在してもよく、標的配列結合領域が第二のオリゴヌクレオチド上に存在してもよく、そして２つの異なるオリゴヌクレオチドが、第一および第二のオリゴヌクレオチドの配列に特異的にハイブリダイズする配列を含有する第三のオリゴヌクレオチドであるリンカーとの水素結合により、連結される。
【００３０】
「固定化プローブ」または「固定化核酸」により、固定された支持体に捕捉オリゴヌクレオチドを直接または間接的に連結する核酸を意味する。固定化プローブは、試料中の非結合成分からの、結合した標的配列の分離を促進する、固体支持体に連結したオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
「分離」または「精製」により、生物学的試料の１以上の構成要素を、該試料の１以上の他の構成要素から除去することを意味する。試料構成要素には、タンパク質、炭水化物、脂質および標識化プローブなどの成分もまた含む可能性がある、一般的に水性溶液相中の核酸が含まれる。好ましくは、分離または精製工程は、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９５％の、試料に存在する他の試料構成要素を除去する。
【００３２】
「ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物」により、同一の相補塩基対ハイブリダイゼーション特性を有する、ＲＮＡおよびＤＮＡ分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物は、異なる糖部分（すなわち、リボース対デオキシリボース）を有し、そしてＲＮＡにはウラシル、そしてＤＮＡにはチミンが存在する点が異なる可能性がある。ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物の間の相違は、均等物が、特定の配列に対し、同じ度合いの相補性を有するため、相同性の相違に貢献しない。
【００３３】
「本質的にからなる」により、本発明の基本的なそして新規の特性を実質的に変化させないさらなる単数または複数の構成要素、単数または複数の組成物あるいは単数または複数の方法工程が、本発明の組成物またはキットまたは方法に含まれていてもよいことを意味する。こうした特性には、生物学的試料、例えば全血または血漿において、ＨＩＶ−２核酸の約１００コピーのコピー数で、ＨＩＶ−２核酸を選択的に検出する能力が含まれる。本発明の基本的なそして新規の特性に実質的な影響を有する、いかなる単数または複数の構成要素、単数または複数の組成物あるいは単数または複数の方法工程も、この用語の外に属するであろう。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＩＶ−２の核酸を選択的に検出するための組成物および方法に関する。本明細書に開示する組成物は、ヒト血液、血清、血漿または他の体液あるいは組織などの、ウイルス核酸の存在に関して試験しようとする生物学的試料において、これらの核酸を増幅し、そして検出するのに有用である。本明細書に開示する増幅プライマーは、好適に、多重増幅反応の構成要素として使用可能であり、該反応において、プライマーおよび付属ポリヌクレオチドの複雑な一団から、いくつかの単位複製配列種を産生することが可能である。例えば、本明細書に開示するプライマーは、関連しないウイルスのポリヌクレオチドに対応する単位複製配列を合成する多重増幅反応で使用可能である。
【００３５】
本明細書に開示するプローブ、プライマーおよび方法は、診断適用において、または感染性粒子を含有する可能性がある、寄付された血液および血液産物または他の組織をスクリーニングするのに使用可能である。
【００３６】
序論および概説
一般の当業者は、核酸試験が、寄付された血液または血漿などの生物学的試料において、ウイルス特異的ポリヌクレオチドを検出する、好適でそして非常に高感度の方法に相当することを認識するであろう。ＨＩＶ−１に新たに感染した個体は、典型的には、感染後１−２ヶ月で、ウイルス抗原に反応性である抗体を検出可能なレベルで産生するため、ウイルスへの曝露後、最初の1ヶ月の間の血清学的試験は、偽陰性の結果を生じ、そしてＨＩＶ−１で汚染された試料が、血流に侵入するのを許し、壊滅的な結果を招く可能性がある。ＨＩＶ−１曝露の早期検出が、寄付される血液供給の安全性を確実にするのを補助するのと同じ方式で、ＨＩＶ−２曝露の早期検出は、同じ利点を提供することが可能である。したがって、ＨＩＶ−２を検出するための最も高感度の試験法は、感染に対する宿主免疫反応と区別されるような、ウイルス特異的核酸の検出に頼るであろう。
【００３７】
本発明は、生物学的試料においてＨＩＶ−２核酸を検出するための組成物（核酸捕捉オリゴヌクレオチド、増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ）および方法を含む。こうした使用に適したオリゴヌクレオチド配列を設計するため、類似の配列を有する領域をマッチングし、そしてその後、配列を比較することによって、サブタイプを含む既知のＨＩＶ−２ ＤＮＡ配列をまず並列して、診断アッセイの試薬として働くことが可能なＨＩＶ−２ウイルスゲノムの候補領域を同定した。これらの比較に基づいて、図１に図式的に示す捕捉オリゴヌクレオチド、プライマーおよびプローブを用い、ＨＩＶ−２ゲノムのＬＴＲ領域を検出用に選択した。比較した配列間で、比較的少ない配列変異体を含有する配列部分を、捕捉、増幅および増幅した配列の検出に使用するのに適した合成オリゴヌクレオチドを設計するための出発点として選択した。オリゴヌクレオチドを設計する際の他の考慮には、配列の相対ＧＣ含量（約３０％から約５５％の範囲）、および予測される二次構造（例えば分子内ハイブリッドを形成するヘアピンターン）の配列内の相対的な欠如を含んだ。
【００３８】
これらの解析に基づき、以下に示す、捕捉オリゴヌクレオチド、増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ配列を設計した。一般レベルの技術を有する当業者は、Ｔ７プロモーター配列を伴うまたは伴わない、ＨＩＶ−２に特異的なプライマー配列が、以下に記載する、プライマーに基づく多様なｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法で、プライマーとして使用可能であることを理解するであろう。さらに、本明細書に開示するハイブリダイゼーションプローブが増幅プライマーとして使用可能であり、そして本明細書に開示する増幅プライマーがハイブリダイゼーションプローブとして使用可能であることもまた、意図する。以下に詳細に記載する増幅および検出アッセイは、ＨＩＶ−２の少なくともサブタイプＡ、Ｂ、ＣおよびＤを検出するのに有用である。とりわけ、本明細書に開示するプローブの標的として働く、ＨＩＶ−２ゲノムの部分は、ＨＩＶ−１ゲノムに対応する配列を見出さない。したがって、プローブは、ＨＩＶ−２に特異的であり、そしてＨＩＶ−１に特異的でない。
【００３９】
有用な増幅法
本発明と組み合わせて有用な増幅法には：転写仲介増幅（ＴＭＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、並びに自己複製ポリヌクレオチド分子およびＭＤＶ−１ ＲＮＡおよびＱ−ベータ酵素のような複製酵素を用いる増幅法が含まれる。これらの多様な増幅技術を実施する方法は、それぞれ、米国特許第５，３９９，４９１号；米国特許第４，９６５，１８８号；公開欧州特許出願ＥＰ ０ ５２５ ８８２、米国特許第５，４５５，１６６号、米国特許第５，４７２，８４０号およびＬｉｚａｒｄｉら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７（１９８８）に見出すことが可能である。米国特許第５，５５４，５１６号は、標的ＲＮＡ配列の相補体とハイブリッドを形成するプライマーの非存在下で、単一のプロモーター−プライマーを用いて、標的ＲＮＡ配列を増幅する方法を記載する。核酸増幅反応をどのように行うかを記載する、これらの文書の開示は、本明細書に援用される。
【００４０】
本発明の非常に好ましい態様において、ＨＩＶ−２核酸配列は、ＴＭＡプロトコルを用いて増幅する。このプロトコルにしたがって、ＤＮＡポリメラーゼ活性を提供する逆転写酵素はまた、内因性ＲＮアーゼＨ活性も所持する。この方法に用いるプライマーの１つは、増幅しようとする標的核酸の１つの鎖に相補的な配列の上流に位置するプロモーター配列を含有する。増幅の第一の工程において、プロモーター−プライマーは、定義される部位で、ＨＩＶ−２標的ＲＮＡにハイブリダイズする。逆転写酵素は、プロモーター−プライマーの３’端からの伸長によって、標的ＲＮＡのＤＮＡコピーを生成する。生じたＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖中のＲＮＡ鎖は、所望により逆転写酵素の固有の活性であってもよい、ＲＮアーゼＨ活性によって分解される。その後、第二のプライマーがＤＮＡ鎖に結合する。ＤＮＡの第二の鎖は、逆転写酵素によって、プライマー端から合成され、それによって二本鎖ＤＮＡ分子が生成される。ＲＮＡポリメラーゼは、この二本鎖ＤＮＡテンプレート中のプロモーター配列を認識し、そして転写を開始する。新たに合成したＲＮＡ単位複製配列は各々、ＴＭＡ法に再進入し、そして新たな複製周期のテンプレートとして働き、それによって、ＲＮＡ単位複製配列の指数的拡大を導く。ＤＮＡテンプレートは各々、１００−１０００コピーのＲＮＡ単位複製配列を作成可能であるため、この拡大の結果、１時間未満で、１００億の単位複製配列を生じることが可能である。方法全体が自己触媒性であり、そして一定の温度で行われる。
【００４１】
ＨＩＶ−２単位複製配列を検出する方法は、オリゴヌクレオチドプライマー対を用いて産生した核酸増幅産物を電気泳動的に分離して染色する程度に、単純である可能性がある。以下に詳細に記載するように、好ましい検出法は、ＨＩＶ−２特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用する。
【００４２】
プライマーの構造的特徴
上に示すように、「プライマー」は、テンプレート核酸にハイブリダイズすることが可能であり、そしてＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長可能な３’端を有する、所望により修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。プライマーの５’領域は、標的核酸に非相補性であってもよい。５’非相補領域がプロモーター配列を含む場合、これを「プロモーター−プライマー」と称する。当業者は、プライマーとして作用することが可能ないかなるオリゴヌクレオチド（すなわち標的配列に特異的にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長可能な３’端を有するオリゴヌクレオチド）も、５’プロモーター配列を含むよう修飾することが可能であり、そしてしたがってプロモーター−プライマーとして機能することが可能であると認識するであろう。同様に、いかなるプロモーター−プライマーもプロモーター配列の除去によって、またはプロモーター配列を含まない合成によって、修飾することが可能であり、そしてそれでもプライマーとして機能する。
【００４３】
プライマーのヌクレオチド塩基部分は、修飾塩基部分が、Ｇ、Ａ、Ｃ、ＴまたはＵと非共有結合を形成する能力を保持し、そして少なくとも１つの修飾ヌクレオチド塩基部分を含んでなるオリゴヌクレオチドが、一本鎖核酸とハイブリダイズするのを立体的に妨げられない限り、例えばプロピン基の付加によって修飾することが可能である。プライマー主鎖を含んでなる一般的な糖部分は、リボースおよびデオキシリボースを含むが、２’−Ｏ−メチルリボース（ＯＭｅ）、ハロゲン化糖、および他の修飾糖もまた、使用可能である。通常、プライマー主鎖の連結基は、リン含有部分であり、最も一般的にはホスホジエステル連結であるが、他の連結、例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート、および「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）に見られるペプチド様連結などのリン非含有連結もまた、本明細書に開示するアッセイでの使用に意図する。
【００４４】
有用なプローブ標識系および検出可能部分
特異的核酸ハイブリダイゼーションを監視するのに使用可能な、本質的にいかなる標識および検出系を、本発明と組み合わせて使用してもよい。有用な標識のコレクションに含まれるのは、放射標識、酵素、ハプテン、連結されたオリゴヌクレオチド、化学発光分子および電気検出法に受け入れられる酸化還元活性部分である。好ましい化学発光分子には、Ａｒｎｏｌｄらによって、米国特許第５，２８３，１７４号に開示される、均質保護アッセイと関連して使用するための種類のアクリジニウムエステル、そしてＷｏｏｄｈｅａｄらによって、米国特許第５，６５６，２０７号に開示される、単一反応中で、多数の標的を定量化するアッセイと関連して使用するための種類のアクリジニウムエステルが含まれる。これらの特許文書に含まれる開示は、本明細書に援用される。好ましい電気的標識および検出アプローチは、米国特許第５，５９１，５７８号および第５，７７０，３６９号、並びに公開国際特許出願第ＷＯ ９８／５７１５８号に開示され、これらの開示は、本明細書に援用される。本発明において、標識として有用な酸化還元活性部分は、Ｃｄ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｐｄ、Ｚｎ、ＦｅおよびＲｕなどの遷移金属を含む。
【００４５】
本発明にしたがった、プローブ用の特に好ましい検出可能標識は、均質アッセイ系（すなわち混合物中で、結合した標識化プローブが、非結合標識化プローブに比較し、検出可能な変化、例えば安定性または差別的分解を示す系）で検出可能である。均質アッセイで用いるのが好ましい標識は、化学発光化合物（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；またはＡｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号に記載されるようなもの）である。特に好ましい化学発光標識には、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば標準的ＡＥまたはその誘導体、例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥが含まれる。
【００４６】
いくつかの適用において、検出前にまず、非ハイブリダイズプローブの除去を必要とすることなく、試験試料におけるプローブ：標的二重鎖の検出を容易にするため、プローブが少なくともある程度の自己相補性を示すことが望ましい。たとえば、「分子トーチ」と呼ばれる構造は、領域を連結することによってつながれ、そしてあらかじめ決定したハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、自己相補性の別個の領域を含むよう、設計される（「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」を生み出す）。変性条件に曝露された際、分子トーチの２つの相補領域（完全または部分的相補性であってもよい）が融解し、あらかじめ決定したハイブリダイゼーションアッセイ条件を回復すると、標的結合ドメインが、標的配列にハイブリダイズするのに利用可能なままとなる。分子トーチは、標的結合ドメインが、標的閉鎖ドメインより、標的配列へのハイブリダイゼーションを支持するように設計する。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸にハイブリダイズした時と対照的に、分子トーチが自己ハイブリダイズした時に、異なるシグナルを生じ、それによってそれに会合する検出可能標識を有する非ハイブリダイズプローブの存在下で、試験試料中のプローブ：標的二重鎖の検出を可能にするように配置された、相互作用する標識（例えば発光剤／消光剤）を含む。分子トーチは、国際公報第ＷＯ ００／０１８５０に完全に記載され、該公報の開示は本明細書に援用される。
【００４７】
自己相補的ハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、一般的に「分子ビーコン」と呼ばれる構造である。分子ビーコンは、標的相補配列を有する核酸分子、標的核酸配列の非存在下で、プローブを閉じたコンホメーションに保持する親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが閉じたコンホメーションにあるときに相互作用する標識対を有する核酸分子を含んでなる。標的核酸および標的相補配列のハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離し、それによって、プローブを開いたコンホメーションにシフトする。開いたコンホメーションへのシフトは、例えば発蛍光団および消光剤（例えばＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であることが可能な標識対の相互作用の減少のため、検出可能である。分子ビーコンは、米国特許第５，９２５，５１７号に完全に記載され、該特許の開示は本明細書に援用される。
【００４８】
合成技術、および標識を核酸に結合し、そして標識を検出する方法は、当該技術分野に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）， 第１０章；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号；Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；およびＫｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号を参照されたい）。
【００４９】
プローブの化学的組成
本発明にしたがったプローブは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド類似体を含んでなり、そしてそれに共有結合した検出可能標識を所持することが可能である。プローブのヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は、窒素性複素環塩基、または塩基類似体を含んでなり、該塩基または塩基類似体で、ヌクレオシドは、例えばホスホジエステル結合によって共に連結されて、ポリヌクレオチドを形成する。したがって、プローブは、慣用的なリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含んでなることが可能であるが、これらの分子の化学的類似体もまた、含んでなることが可能である。プローブの「主鎖」は、当該技術分野に知られる多様な連結で構成される可能性があり、該連結には、１以上の糖−ホスホジエステル連結、ペプチド核酸結合（ときに、Ｈｙｌｄｉｇ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９５／３２３０５号に記載されるように「ペプチド核酸」と称される）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらの組み合わせが含まれる。プローブの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースいずれか、あるいは、例えば、２’メトキシ置換（ＯＭｅ）および２’ハロゲン化物置換（例えば２’−Ｆ）などの既知の置換を有する同様の化合物であってもよい。窒素性塩基は、慣用的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その既知の類似体（例えばイノシンまたは「Ｉ」；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５−３６， Ａｄａｍｓら監修， 第１１版， １９９２を参照されたい）、プリンまたはピリミジン塩基類の既知の誘導体（例えば、Ｎ4−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン類およびデアザ−またはアザ−ピリミジン類、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基類、２、６または８位に改変されたまたは置換置換基を有するプリン塩基類、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ6−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、およびＯ4−アルキル−ピリミジン類（Ｃｏｏｋ、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９３／１３１２１号を参照されたい））および、主鎖がポリマーの１以上の残基に関し、窒素性塩基を含まない、「無塩基性（ａｂａｓｉｃ）」残基（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい）であることが可能である。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見られる慣用的な糖、塩基および連結のみを含んでなることが可能であるし、または慣用的な構成要素および置換両方（例えばメトキシ主鎖を介して連結される慣用的塩基、または慣用的塩基および１以上の塩基類似体を含む核酸）を含むことが可能である。
【００５０】
ＨＩＶ−２に特異的な増幅プライマーおよび検出プローブの選択
望ましい特性を持つ増幅プライマーおよびプローブを設計するのに有用な指針を本明細書に記載する。ＨＩＶ−２核酸を増幅し、そして探査する（ｐｒｏｂｉｎｇ）のに最適な部位は、隣接する配列の約３５０塩基内に、そして好ましくは１５０塩基内に、長さ約１５塩基より大きい、２つ、そして好ましくは３つの保存領域を含有する。プライマーまたはプロモーター−プライマー組で観察される増幅の度合いは、オリゴヌクレオチドがその相補配列にハイブリダイズする能力および酵素的に伸長される能力を含む、いくつかの要因に応じる。ハイブリダイゼーション反応の度合いおよび特異性は、いくつかの要因に影響を受けるため、これらの要因を操作すると、標的に完全に相補的であるにしろ、そうでないにしろ、特定のオリゴヌクレオチドの正確な感度および特異性が決定されるであろう。変化するアッセイ条件の影響が当業者に知られ、そしてＨｏｇａｎら，米国特許第５，８４０，４８８号に記載され、該特許の開示は本明細書に援用される。
【００５１】
標的核酸配列の長さ、そしてしたがってプライマー配列またはプローブ配列の長さが重要である可能性がある。ある場合、望ましいハイブリダイゼーション特性を有するプライマーまたはプローブを生じるであろう、位置および長さが異なる、特定の標的領域由来のいくつかの配列がある可能性がある。完全に相補的でない核酸がハイブリダイズすることは可能であるが、通常、完全に相同な塩基配列の最長の伸長が、主にハイブリッド安定性を決定するであろう。
【００５２】
増幅プライマーおよびプローブは、オリゴヌクレオチド：非標的（すなわち標的核酸に類似の配列を持つ核酸）核酸ハイブリッドの安定性を最小限にするよう配置されるべきである。増幅プライマーおよび検出プローブが、標的および非標的配列間を区別可能であることが好ましい。プライマーおよびプローブを設計する際、これらのＴｍ値の相違は、可能な限り大きくするべきである（少なくとも２℃、そして好ましくは５℃）。
【００５３】
ハイブリダイゼーションに阻害性である、強い内部構造を形成することが知られる核酸領域は、プライマーまたはプローブとしてより好ましくない。こうした構造の例には、ヘアピンループが含まれる。同様に、広範な自己相補性を持つオリゴヌクレオチドも回避すべきである。
【００５４】
非特異的伸長（プライマー二量体または非標的コピー）の度合いもまた、増幅有効性に影響を及ぼす可能性がある。このため、プライマーは、特に配列の３’端で、低い自己または交差相補性を有するよう選択する。長いホモポリマー領域および高いＧＣ含量を回避して、偽のプライマー伸長を減少させる。設計のこの側面を補助するのに、商業的に入手可能なコンピューターソフトウェアが利用可能である。入手可能なコンピュータープログラムには、ＭａｃＤＮＡＳＩＳTM２．０（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｔｄ．）およびＯＬＩＧＯ（登録商標）バージョン４．１（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれる。
【００５５】
当該技術分野の一般的なレベルを有する当業者は、ハイブリダイゼーションが、相補核酸の２つの一本鎖の会合を伴い、水素結合二本鎖を形成することを認識するであろう。２つの鎖の一方が、完全にまたは部分的にハイブリッドに関与しているならば、新たなハイブリッドの形成に、より関与しにくいであろうことが暗黙の了解である。目的の配列のかなりの部分が一本鎖であるように、プライマーおよびプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの速度および度合いを非常に増加させることが可能である。標的が、組み込まれたゲノム配列である場合、これは当然、二本鎖型を生じるであろう（ポリメラーゼ連鎖反応の産物の場合のように）。これらの二本鎖標的は、当然、プローブとのハイブリダイゼーションに阻害性であり、そしてハイブリダイゼーション工程前に、変性を要する。
【００５６】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの速度は、Ｃ0ｔ1/2を決定することによって、測定可能である。ポリヌクレオチドがその標的にハイブリダイズする速度は、標的結合領域における標的二次構造の熱安定性の測定値である。ハイブリダイゼーション速度の標準的な測定値は、リットルあたりのヌクレオチドのモル数に秒を乗じたものとして測定する、Ｃ0ｔ1/2である。したがって、これは、その濃度で最大ハイブリダイゼーションの５０％が生じる時間を乗じた、プローブ濃度である。この値は、多様な量のポリヌクレオチドを一定量の標的に、固定した時間、ハイブリダイズさせることによって、決定する。Ｃ0ｔ1/2は、一般の当業者によく知られる標準法によって、グラフ的に見出される。
【００５７】
好ましい増幅プライマー
増幅反応を行うのに有用なプライマーは、異なる長さを有することが可能である。例えば、ＨＩＶ−２標的核酸配列の一方の鎖に相補的な増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは１００塩基まで、より好ましくは１８から６０塩基、さらにより好ましくは１８から３４、またはさらにより好ましくは１８から２５塩基の長さを有し、そしてＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣ（配列番号８）に示される配列に実質的に相補的な、少なくとも９であり、そして３４までの隣接する塩基を含む。異なる用語で述べるが、同一のオリゴヌクレオチドを同定すると、これらのプライマーには、ＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡＡＣＣＴＧＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＴ（配列番号９）に実質的に対応する配列に含有される、少なくとも９であり、そして３４までの隣接する塩基が含まれる。本発明の実施可能性には本質的でないと考えられるが、表２に列挙するすべてのプライマーは、共通のコア配列ＣＧＧＧＣＧＣＣＡ（配列番号３４）を共有する。配列番号９の配列および配列番号３４の配列の下流（３’）に位置するプライマー配列間のミスマッチが許容されるという我々の発見は、配列番号９の配列のサブセットを有するプライマーが、一般的に有用であることを示す。言い換えると、配列番号９に由来し、そして本明細書に使用されるものなどの増幅条件下で、配列番号８の配列を有する標的にハイブリダイズするプライマー配列は、本明細書に記載する増幅法において、使用可能である。一般的に、配列番号９の９−３４の隣接する塩基を有するプライマーは、Ｔ７プロモーター−プライマーなどのプロモーター−プライマーとして使用するのに、非常に好ましい。もちろん、プライマーがＴ７プロモーター−プライマーである場合、プライマーの５’端に、Ｔ７プロモーター配列が含まれるであろうし、これは典型的には、プライマーの長さを約２７−３３塩基、増加させる。本発明のこの側面にしたがった、好ましい増幅プライマーの例には、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書に開示するオリゴヌクレオチド配列の１つ（配列番号１２）は、プライマーに存在する配列番号９のセグメントと比較して、１つのヌクレオチドミスマッチおよび２つのヌクレオチド欠失を有した。別のオリゴヌクレオチド配列（配列番号１３）は、オリゴヌクレオチドに存在する配列番号９の部分と比較して、単一ヌクレオチド欠失を有した。これらの配列はまた、それぞれ、配列番号１７および１８の配列を有するＴ７プロモーター−プライマーでも見出すことが可能である。欠失を考慮に入れないと、これらのプライマーは、それぞれ、オリゴヌクレオチドに存在する配列番号９の部分と比較して、総数７および５の塩基ミスマッチを有した。本明細書に開示するＴ７プロモーター−プライマーは、Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号に記載する方法を用いて、核酸増幅反応を行うのに特に有用である。これらの特許文書の開示は、本明細書に援用される。プライマーは、所望により、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むことが可能である。好ましくは、これらのプライマーを用いて合成した単位複製配列の検出は、本明細書に開示するオリゴヌクレオチド検出プローブを用いて達成する。
【００５８】
増幅反応を実行するのに、上述のプライマーのいずれかと組み合わせて使用可能な他の増幅プライマーは、ＨＩＶ−２標的核酸配列の相対する鎖に相補的である。ＨＩＶ−２標的核酸配列のこの相対する鎖に相補的な増幅プライマーは、好ましくは１００塩基までの、またはより好ましくは１９から４０塩基の、またはさらにより好ましくは１９から２１塩基の長さを有する。これらのプライマーは、非プロモータープライマーとして特に有用である。本明細書に開示するように、これらのプライマーは、ＧＴＧＴＧＴＧＴＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＴＡＧＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＴＣ（配列番号１）に実質的に対応する配列由来の、少なくとも１９の隣接する塩基を有する。これらの条件を満たす特定の増幅プライマーの例には、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００５９】
上に明記する可変長の増幅プライマーおよび検出プローブは、標的結合に関与しない可能性があり、そして増幅または検出法に実質的に影響を与えない可能性がある、外来性の（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ）配列の包含に対応すると意図するのを理解すべきである。例えば、本発明にしたがって、増幅反応を行うのに有用なプロモーター−プライマーは、ＨＩＶ−２標的核酸にハイブリダイズする、少なくとも最小の配列、および最小配列上流に位置するプロモーター配列を有する。しかし、標的結合配列およびプロモーター配列間に配列を挿入すると、増幅反応における有用性を危うくすることなく、プライマーの長さを変化させることが可能である。さらに、増幅プライマーおよび検出プローブの長さは、これらのオリゴヌクレオチド配列が、望ましい相補配列にハイブリダイズするのに必須の最小必要条件に適合する限り、選択の問題である。プローブ配列は、配列番号２１の１４量体配列またはその相補体を、共通のコアとして含むべきである。これは、ＨＩＶ−２標的配列中の、または増幅法によって合成した単位複製配列中のプローブ結合ドメインを明示する。プローブ結合ドメイン下流にハイブリダイズする増幅プライマーは、配列番号９の配列内に含有される、少なくとも９の隣接する塩基を含む配列を有するべきである。実際、本明細書に示す結果は、ＨＩＶ−２核酸に相補的である（そして配列番号１７のプロモーター−プライマー中に存在する）配列番号１２の配列が、配列番号９由来の９以下の隣接する塩基しか持たないにもかかわらず、増幅を促進するのに十分であったことを示す。最後に、プローブ結合ドメイン上流にハイブリダイズする増幅プライマーは、配列番号１の配列由来の、少なくとも１９の隣接する塩基を有するべきである。
【００６０】
以下の２つの表は、ＨＩＶ−２核酸を増幅するためのプライマーとして使用した、オリゴヌクレオチド配列の特定の例を示す。表１は、核酸の一方の鎖上のＨＩＶ−２配列に相補的な非Ｔ７プライマーの配列を示す。表２は、本発明の開発中に用いた、ＨＩＶ−２標的相補配列およびＴ７プロモーター−プライマーの全長配列両方の配列を示す。表１のオリゴヌクレオチド配列と比較して、表２のオリゴヌクレオチド配列は、相対する核酸鎖に相補的である。上に示すように、すべてのＴ７プロモーター−プライマーは、その３’端に、ＨＩＶ−２標的に相補的な配列を、そしてその５’端に、Ｔ７プロモーター配列を含んだ。
【００６１】
表１
増幅プライマーのポリヌクレオチド配列
【００６２】
【表１】
表２は、ＨＩＶ−２標的相補的オリゴヌクレオチド配列（配列番号１０−１４）およびそれぞれ対応するＴ７プロモーター−プライマー配列（配列番号１５−１９）を示す。
【００６４】
表２
増幅プライマーのポリヌクレオチド配列
【００６５】
【表２】
転写仲介増幅反応において、ＨＩＶ−２ ＬＴＲ領域を増幅するのに好ましいプライマー組には、ＨＩＶ−２ ＬＴＲ転写物にハイブリダイズする第一のプライマー（表２に列挙するプライマーの１つなど）および第一のプライマーの伸長産物の配列に相補的な第二のプライマー（表１に列挙するプライマー配列の１つなど）が含まれる。非常に好ましい態様において、第一のプライマーは、その５’端にＴ７プロモーター配列を含む、プロモーター−プライマーである。
【００６７】
特定の好ましい態様において、ＨＩＶ−２核酸を増幅するための、少なくとも２つの増幅プライマーの組が提供され、これには：（ｉ）配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４の塩基配列を有するかまたは該配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含んでなる、第一の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の塩基配列を有するかまたは該配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含んでなる、第二の増幅プライマーが含まれる。特に好ましい組み合わせでは、第一の増幅プライマーは、配列番号１０の塩基配列を有するかまたは該配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含んでなる、プロモーター−プライマーであり、そして第二の増幅プライマーは、配列番号６の塩基配列を有するかまたは該配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【００６８】
好ましい検出プローブ
本発明の１つの側面は、ＨＩＶ−２核酸を検出するハイブリダイゼーションプローブとして使用可能なオリゴヌクレオチドに関する。ＨＩＶ−２の核酸中に存在する標的核酸配列を増幅するための方法は、ＨＩＶ−２単位複製配列を検出する、さらなる工程を含むことが可能である。ＨＩＶ−２核酸（ＨＩＶ−２単位複製配列を含む）を検出するためのこの方法は：標的核酸配列またはその相補体に優先的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションアッセイプローブと試験試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させ、それによって、検出のため、安定なプローブ：標的二重鎖を形成する工程を含む。次に、試験試料中のＨＩＶ−２の存在または非存在の指標として、ハイブリッドが試験試料に存在するかどうか決定する工程がある。これは、生物学的試料におけるＨＩＶ−２の存在の指標として、プローブ：標的二重鎖を検出することを伴う可能性がある。したがって、プローブ組成物およびこれらの組成物を使用する方法は、本発明の範囲内に属する。
【００６９】
ＨＩＶ−２核酸配列を検出するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブには、ＨＩＶ−２ ＲＮＡ転写物またはコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列が含まれる。したがって、本発明のプローブは、ＨＩＶ−２標的核酸配列の一方の鎖、またはその相補体にハイブリダイズする。本発明のすべてのプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ＨＩＶ−２標的配列に安定してハイブリダイズする。これらのプローブはまた、ＨＩＶ−２核酸に相補的であってもなくてもよい、標的核酸領域外のさらなる塩基も有することが可能である。
【００７０】
好ましいプローブは、塩濃度が０．６−０．９Ｍの範囲である場合、約６０℃に対応する、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするために、標的核酸に十分に相同である。好ましい塩には、塩化リチウムが含まれるが、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムなどの他の塩もまた、ハイブリダイゼーション溶液中で使用可能である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、あるいは、０．４８Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、並びに各１ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡに、あるいは０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％ラウリル硫酸リチウム、６０ｍＭコハク酸リチウム、並びに各１０ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡによって提供される。
【００７１】
本発明の特定の態様において、プローブは、好ましくは、２２塩基までの、さらにより好ましくは１８塩基までの、そしてさらにより好ましくは１６塩基までの標的相補配列を有し；そしてＣＣＴＧＧＴＣＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＣＴＴＣＴ（配列番号２０）に実質的に対応する配列に含有される、１４から２２の間の隣接するヌクレオチドを含む。とりわけ、本明細書に開示する実施例に使用するプローブは各々、共通の１４塩基配列、ＧＴＣＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＣ（配列番号２１）を含有した。もちろん、本発明のプローブは、あるいは、前述のプローブ配列に相補的な配列を有することが可能である。すべての場合で、プローブがＨＩＶ−２核酸（ＨＩＶ−２単位複製配列を含む）に完全に相補的である場合、プローブ長は、好ましくは３５ヌクレオチドまで、より好ましくは２２ヌクレオチドまで、さらにより好ましくは１８ヌクレオチドまで、そしてさらにより好ましくは１６ヌクレオチドまでである。上に示すように、プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせ、核酸類似体で作成してもよいし、または１以上の修飾ヌクレオシド（例えばリボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシド）を含有してもよい。
【００７２】
本明細書に開示するアッセイを行うのに使用可能なプローブの特定の例には、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７に示す塩基配列、またはその相補体を有するか、またはそれらに実質的に対応するオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明にしたがったプローブが、非ヌクレオチドリンカー手段によってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含むこともまた好ましい。例えば、非常に好ましいプローブには、配列番号２６のヌクレオチド９および１０（５’から３’方向に読む）間に位置する非ヌクレオチドリンカーを通じてプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識が含まれる。
【００７３】
以下の表は、ＨＩＶ−２単位複製配列を検出するのに用いた、好ましい検出プローブの配列を示す。ＨＩＶ−２核酸配列を検出する別のプローブは、ＨＩＶ−２の相対するセンス鎖にハイブリダイズ可能であるため、本発明はまた、表３に示す配列に相補的なオリゴヌクレオチドも含む。
【００７４】
表３
ＨＩＶ−２単位複製配列検出プローブのポリヌクレオチド配列
【００７５】
【表３】
本発明のいくつかの態様において、増幅したＬＴＲ配列を検出するプローブ配列には、メトキシ主鎖、または核酸主鎖中の少なくとも１つのメトキシ連結が含まれる。好ましくは、検出プローブは、米国特許第５，５８５，４８１号；および米国特許第５，６３９，６０４号に実質的に記載されるように、特に後者の特許の第１０欄第６行から第１１欄第３行に、そして実施例８に記載されるように、リンカーを介してプローブ配列に付着した化学発光ＡＥ化合物で標識する。これらの特許文書に含有される開示は、本明細書に援用される。
【００７７】
捕捉オリゴヌクレオチドの選択および使用
好ましい捕捉オリゴヌクレオチドには、固体支持体上の固定用の標的として働く第二の配列（すなわち「テール」配列）に共有結合した、ＬＴＲ領域中のＨＩＶ−２配列に相補的な第一の配列（すなわちＨＩＶ−２結合配列）が含まれる。捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列を連結するいかなる主鎖も使用可能である。特定の好ましい態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは、主鎖中、少なくとも１つのメトキシ連結を含む。好ましくは捕捉オリゴヌクレオチドの３’端にあるテール配列を用いて、相補的塩基配列にハイブリダイズさせ、生物学的試料中の他の構成要素に優先して、ハイブリダイズした標的ＨＩＶ−２核酸を捕捉する手段を提供する。
【００７８】
テール配列中で、相補塩基配列にハイブリダイズするいかなる塩基配列も使用可能であるが、ハイブリダイズする配列が、約５から５０ヌクレオチド残基の長さに渡ることが好ましい。特に好ましいテール配列は、実質的にホモポリマー性であり、約１０から約４０ヌクレオチド残基、またはより好ましくは約１４から約３０残基を含有する。本発明にしたがった捕捉オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−２標的ポリヌクレオチドに特異的に結合する第一の配列、および固体支持体に固定されたオリゴ（ｄＴ）伸長に特異的に結合する第二の配列を含むことが可能である。
【００７９】
図１に例示する構成要素を用いて、生物学的試料中のＨＩＶ−２配列を検出する１つのアッセイは、捕捉オリゴヌクレオチドを用いて標的核酸を捕捉し、少なくとも２つのプライマーを用いて、捕捉した標的領域を増幅し、そしてまず増幅した核酸に含有される配列に標識化プローブをハイブリダイズさせ、そしてその後、結合した標識化プローブから生じるシグナルを検出することによって、増幅した核酸を検出する工程を含む。
【００８０】
捕捉工程は、好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドを用い、該工程では、ハイブリダイゼーション条件下で、１部分の捕捉オリゴヌクレオチドが標的核酸中の配列に特異的にハイブリダイズし、そしてテール部分が、標的領域を試料の他の構成要素から分離するのを可能にする、リガンド（例えばビオチン−アビジン結合対）などの結合対の１つの構成要素として働く。好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分は、固体支持体粒子に固定した相補配列にハイブリダイズする配列である。好ましくは、まず、捕捉オリゴヌクレオチドおよび標的核酸は、溶液相ハイブリダイゼーション動力学を利用するため、溶液中にある。ハイブリダイゼーションは、捕捉オリゴヌクレオチド：標的核酸複合体を産生し、該複合体は、相補固定化配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分のハイブリダイゼーションを通じて、固定化プローブに結合可能である。したがって、標的核酸、捕捉オリゴヌクレオチドおよび固定化プローブを含んでなる複合体が、ハイブリダイゼーション条件下で形成される。好ましくは、固定化プローブは、テール配列に相補的であり、そして固体支持体に付着する、反復配列であり、そしてより好ましくは、ホモポリマー配列（例えばポリＡ、ポリＴ、ポリＣまたはポリＧ）である。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分がポリＡ配列を含有する場合、固定化プローブはポリＴ配列を含有するであろうが、相補配列のいかなる組み合わせを用いてもよい。捕捉オリゴヌクレオチドはまた、標的にハイブリダイズする塩基配列および固定化プローブにハイブリダイズするテールの塩基配列間に位置する、１以上の塩基である、「スペーサー」残基も含有することが可能である。標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド複合体に結合するのに、いかなる固体支持体を用いてもよい。有用な支持体は、マトリックスまたは溶液中の遊離粒子（例えばニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および好ましくは磁気誘引可能粒子）いずれかであることも可能である。固体支持体に固定化プローブを付着させる方法が公知である。支持体は、好ましくは、標準法（例えば遠心分離、磁気粒子の磁気誘引など）を用いて溶液から回収可能な粒子である。好ましい支持体は常磁性単分散粒子（すなわち±約５％でサイズが均一）である。
【００８１】
標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド：固定化プローブ複合体を回収すると、（生物学的試料におけるその濃度に比較し）標的核酸が効率的に濃縮され、そして生物学的試料に存在する可能性がある増幅阻害因子から標的核酸が精製される。捕捉された標的核酸は、例えば付着した標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド：固定化プローブ複合体を含む粒子を、洗浄溶液に再懸濁し、そしてその後、上述のように、洗浄溶液から、付着した複合体を含む粒子を回収することによって、１回以上、洗浄し、標的をさらに精製することが可能である。好ましい態様において、捕捉工程は、連続的に、捕捉オリゴヌクレオチドを標的核酸とハイブリダイズさせ、そしてその後、ハイブリダイゼーション条件を調整し、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分と、固定化相補配列とのハイブリダイゼーションを可能にすることによって、行う（例えば、ＰＣＴ第ＷＯ ９８／５０５８３号に記載されるように）。捕捉工程、およびいかなるものでもよい所望による洗浄工程が完了すると、標的核酸が増幅可能である。操作工程数を制限するため、標的核酸は、所望により、捕捉オリゴヌクレオチドから遊離させることなく、増幅させることが可能である。
【００８２】
ＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列を増幅し、そして検出するのに好ましい方法
本発明の好ましい方法を、以下に示す実施例に記載し、そして例示する。図１を参照すると、ＨＩＶ−２ゲノム（太い水平な実線によって示す）の標的領域を検出するための１つの系が例示される。この系は、４つのオリゴヌクレオチド（より短い実線によって示す）：標的領域でＨＩＶ−２配列に特異的にハイブリダイズする配列、および生物学的試料に存在する標的領域を捕捉するため、固体支持体に固定された相補配列にハイブリダイズするテール（「Ｔ」）を含む、１つの捕捉オリゴヌクレオチド；標的領域でＨＩＶ−２配列に特異的にハイブリダイズする配列、および二重鎖で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの機能するプロモーターとして作用するＴ７プロモーター配列（「Ｐ」）を含む、１つのＴ７プロモーター−プライマー；Ｔ７プライマーを用いて、標的領域配列から作成される第一鎖ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする配列を含む、１つの非Ｔ７プライマー；および２つのプライマーを用いて増幅される標的領域の一部に特異的にハイブリダイズする配列を含む、１つの標識化プローブを含む。
【００８３】
上に示すように、２つのプライマーを用いる、捕捉された標的領域の増幅は、多様な既知の核酸増幅反応を用いて、達成可能である。好ましい態様において、ＴＭＡなどの転写関連増幅反応を使用する。こうした態様において、標的核酸の単一コピーから、多くの鎖の核酸を産生し、こうして、増幅した配列に結合するプローブを検出することによって、標的の検出を可能にする。好ましくは、転写関連増幅は、溶液中で、適切な塩および緩衝剤と共に、２種類のプライマー（１つはプロモーター配列を含有するため、プロモーター−プライマーと称され、図１ではＲＮＡポリメラーゼを表す「Ｐ」と示す）、２つの酵素（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）、および基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）を用い、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を生じる。
【００８４】
図１を参照すると、転写仲介増幅中、捕捉された標的核酸は、Ｔ７プロモーター−プライマーとして示される第一のプライマーにハイブリダイズする。逆転写酵素を用いて、標的ＲＮＡをテンプレートとして用い、Ｔ７プロモーター−プライマーからｃＤＮＡを合成する。非Ｔ７プライマーとして示される、第二のプライマーは、該ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズし、そして逆転写酵素の作用によって伸長されてＤＮＡ二重鎖が形成され、それにより二本鎖Ｔ７プロモーター領域が形成される。その後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、機能するＴ７プロモーターを用いることによって、多数のＲＮＡ転写物を生成する。ＴＭＡの自己触媒機構は、ｃＤＮＡ合成工程に続いて、反復ハイブリダイゼーションおよび重合工程を使用し、さらなるＲＮＡ転写物を産生して、それによって標的領域特異的核酸配列を増幅する。
【００８５】
検出工程は、上述の増幅したＲＮＡ転写物または単位複製配列に特異的に結合する、少なくとも１つの検出プローブを用いる。好ましくは、検出プローブは、均質検出系を用いて検出可能な、検出可能標識で標識される。より好ましくは、標識化プローブは、上述のような、化学発光シグナルが産生され、そして検出される、アクリジニウムエステル化合物で標識される。
【００８６】
ＨＩＶ−２核酸を検出するキット
本発明のさらに別の側面は、ＨＩＶ−２核酸テンプレートを用いたポリヌクレオチド増幅反応を行うためのキットに関する。好ましくは、本発明にしたがったキットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅反応中で、ＨＩＶ−２核酸を増幅するのに使用可能なオリゴヌクレオチドプライマー対を含有する。典型的なキットは：（１）配列番号９の配列内に含有される９−３４の隣接する塩基の配列を含み、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する、第一の増幅オリゴヌクレオチド；および（２）配列番号１の配列由来の１９−４０の隣接する塩基の配列を含み、そして１００ヌクレオチドまでの長さを有する、第二の増幅オリゴヌクレオチドを含むことが可能である。もちろん、本明細書に開示する、より短い増幅オリゴヌクレオチドもまた、キット形式内にパッケージングすることが可能である。該キットは、配列番号２１またはその相補体の配列を含む、オリゴヌクレオチド検出プローブをさらに含有することが可能である。このプローブは、長さ３５ヌクレオチドまでであることが可能であるが、あるいは、本明細書に開示するように、長さ２２ヌクレオチドまでであるか、またはより短いことが可能である。さらに、該キットは、増幅前に、他の種からＨＩＶ−２テンプレート核酸を精製するための捕捉オリゴヌクレオチドを含有することが可能である。典型的な捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号３１および配列番号３２の配列を有する。実際、ＨＩＶ−２核酸を検出する本発明の方法を実施するのに有用なキットは、互いにパッケージングした組み合わせで、本明細書に開示する、増幅オリゴヌクレオチド組成物および／または検出プローブ組成物の、本質的にいずれを含むことも可能である。
【００８７】
多重増幅反応
多数の解析物ポリヌクレオチドを検出する簡便な試験形式は、異なるプライマー組を用いて同時に増幅反応を行うことを伴い、ここで、反応中合成する単位複製配列は、ハイブリダイゼーションによって検出する。これに関して、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（カリフォルニア州サンディエゴ）は、３つの重要な工程を用いて、単一試験管多重形式でＨＩＶ−１および／またはＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）核酸を検出するＨＩＶ−１／ＨＣＶ試験を開発した。最初の試料調製法において、血漿を界面活性剤で処理してウイルスゲノムＲＮＡを遊離させ、標的特異的オリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズさせ、そして磁気微小粒子上に捕捉して、該粒子を磁場中で血漿から分離する。次に、転写に基づくポリヌクレオチド増幅系を使用して、単一反応中で、ＨＩＶ−１および／またはＨＣＶ標的ＲＮＡを増幅する。最後に、ＨＩＶ−１またはＨＣＶ単位複製配列に相補的な化学発光プローブの核酸ハイブリダイゼーションを用いて、検出を達成する。アッセイが陽性結果を生じたら、識別試験を行って、２つのウイルス間を区別する。
【００８８】
多重増幅反応において、各組のプライマーが異なる解析物ポリヌクレオチドに特異的である、異なるプライマー組の数が増加するにつれて、プライマー間、並びにプライマーおよび無関係な単位複製配列間の望ましくない相互作用の機会が増加する。本明細書に開示するプライマー配列は、好適に、ＨＩＶ−１、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来のウイルス特異的配列を増幅することもまた可能な、単一ポリヌクレオチド増幅反応における試薬として使用可能である。
【００８９】
本発明の一般的な原理は、以下の限定されない実施例を参照することによって、より完全に認識可能である。第一の実施例は有用な増幅プライマーを同定する方法を記載する。
【００９０】
ＨＩＶ−２末端反復配列（ＬＴＲ）のポリヌクレオチド配列を増幅するのに好ましいプライマーの組み合わせは、異なる数の核酸テンプレート分子を使用する一連の方法で同定した。以下に記載するように、最初の試験は、５，０００コピー／反応レベルで、合成ＨＩＶ−２テンプレートを用いて行った。続く試験は、１００または５００コピー／反応いずれかを用いて行い、アッセイ感度に関する情報を提供した。反復試験の結果を解析すると、単位複製配列産生の平均値と共に、方法の再現性に関する情報が得られた。Ｔ７プロモーター−プライマーおよび非Ｔ７プライマーは、以下に記載する溶液相法を用いて、組み合わせてスクリーニングした。以下に記載する方法は、特に、転写仲介増幅（ＴＭＡ）プロトコルを用いて実施したが、本明細書に開示するプライマーを用いて、一般の当業者によく知られるであろう代替法によって、単位複製配列を産生することが可能である。
【００９１】
実施例１は、ＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列を増幅するプライマーを同定するのに用いた方法を記載する。
【００９２】
【実施例】
実施例１
増幅プライマーの同定
ＨＩＶ−２ ＨＩＶ２ＦＧサブタイプＬＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ０３６５４）の塩基１−６４４の配列を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡは、標準的実験法にしたがって、テンプレートとして直線化プラスミドクローンを用いて調製した。その後、生じたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を、本質的にＫａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号に記載されるようなＴＭＡ反応において、プライマーの対の組を使用する増幅反応のテンプレートとして用いた。各プロモーター−プライマーは各々、５’端に、Ｔ７プロモーター配列ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号２８）またはＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡ（配列番号２９）いずれかを、そして３’端に標的相補配列を含んだ。増幅反応はまず、１００μｌの標準的反応緩衝液中、合成ＲＮＡテンプレート５，０００コピーおよび各１５ｐｍｏｌのプライマーを用いて、いくつかのプライマーの組み合わせに関して行った。標的核酸およびプライマーを６０℃に１０分間加熱して、そしてその後、４２℃に冷却し、プライマーアニーリングを促進した。その後、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（２０００単位）およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（２０００単位）を混合物に添加した。最終増幅反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３５ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、および５％（ｗ／ｖ）グリセロールを含有した。４２℃で１時間インキュベーションした後、１００μｌ増幅反応すべてを、その開示が本明細書に援用されるＡｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号に本質的に記載されるように、均質保護アッセイにおいて、アクリジニウムエステル標識化プローブを用いて、ハイブリダイゼーションによってアッセイした。配列番号２７の配列を有するプローブは、１．９４ｘ１０8ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性にＡＥで標識し、そしてその後、各ハイブリダイゼーション反応のため、１．９ｘ１０7ＲＬＵに均等の量を用いてＨＩＶ−２単位複製配列を検出した。プローブハイブリダイゼーションは、０．０５Ｍコハク酸リチウム（ｐＨ５）、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡを含有する溶液２００μｌ中、６０℃で１５分間行い、その後、３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１％ ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；コネチカット州ダンベリー）を添加した。この混合物をまず、６０℃で１０分間インキュベーションし、非ハイブリダイズプローブを不活性化し、そしてその後、室温に冷却した。各試料中に残った化学発光は、１ｍＭ硝酸および０．１％（ｖ／ｖ）過酸化水素を自動的に注入した後、１Ｎ水酸化ナトリウムを含有する溶液を注入するよう設定した、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）Ｉ発光測定装置を用いてアッセイした。化学発光反応に関して測定した結果は、相対光単位（ＲＬＵ）で表した。
【００９３】
表４は、５，０００コピーのテンプレートポリヌクレオチドを用いて行った増幅法からの結果を示す。とりわけ、配列番号１７の配列を有するプロモーター−プライマーは、ＨＩＶ−１ポリヌクレオチド配列を効率的に増幅し（データ未提示）、そしてＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２核酸が共通のプライマーを用いて同時増幅可能であるかどうか決定する、本方法に含まれた。このプライマーの配列は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が挿入／欠失によって異なる配列領域に渡る。したがって、配列番号９の配列（本発明のプロモーター−プライマー配列はこれに由来する）と比較して、プロモーター−プライマーのＨＩＶ−２標的相補部分は、配列番号９の配列において、２８位のヌクレオチドでミスマッチを、そして１９−２０位のＡＣヌクレオチド対に対応する２つのヌクレオチドの欠失を有する。表に示す結果は、増幅および検出法の４回の試験（配列番号１６の配列を有するプロモーター−プライマーに関して）または５回の試験（配列番号１５および１７の配列を有するプロモーター−プライマーに関して）の反復から得ている。表に示す陰性対照エントリーのいくつかは、異なる時点で行ったアッセイから得た。すべての陰性対照値は、いかなるＨＩＶ−２テンプレートも非存在下で行った試験から得た。アッセイの非常に再現性がある性質を考慮し、合理的に、陰性対照反応の大きさはまた、異なる実験間でも同等であろうと仮定した。入手不能なデータは、表中、「ＮＡ」と示す。
【００９４】
表４
異なるプライマーの組み合わせを用いた、ＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列の増幅
【００９５】
【表４】
表４に示す結果は、５，０００コピー／反応のテンプレートレベルで試験したプライマーの組み合わせが各々、陽性結果を生じることを示した。方法において、プロモーター−プライマーはすべて、容易に検出可能な増幅シグナルを生じたが、配列番号１５と同定するプロモーター−プライマーは、試験した非Ｔ７プライマー各々と組み合わせて用いた際、好適に、優れた結果を生じた。とりわけ、配列番号１５の配列を有するプロモーター−プライマーを含む増幅反応は、均質に、低い％ＣＶ値と関連し、それによって、このプライマーを含む増幅反応の高い度合いの再現性および特別の堅牢性が示された。興味深いことに、表に示す結果は、ＨＩＶ−１配列を非常に効率的な方式で増幅する配列番号１７の配列を有するプロモーター−プライマーであってもまた、この方法では、ＨＩＶ−２配列を増幅することを示した。
【００９７】
表４に示す知見に基づいて、さらなるプロモーター−プライマーおよびより低いレベルの投入テンプレートを用いて、さらなる試験を行って、有用なプロモーター−プライマーの設計およびアッセイの感度に関する柔軟性を立証した。より具体的には、上述の増幅および検出法は、各反応において、配列番号１５および１７の配列を有するプロモーター−プライマーを、非Ｔ７プライマーおよび１００または５００コピーいずれかのＨＩＶ−２テンプレートと組み合わせて用いて、反復した。その後、非Ｔ７プライマーの１つを、Ｔ７プロモーター配列を所持するＴ７プロモーター−プライマーおよび配列番号１５−１７に同定する配列を有するプロモーター−プライマーのいずれに存在するものとも異なる標的相補配列のコレクションと組み合わせて試験するために選択した。これらの方法の結果を表５−８に示す。
【００９８】
表５
異なるプライマーの組み合わせを用いた、５００コピー／反応でのＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列の増幅
【００９９】
【表５】
表６
異なるプライマーの組み合わせを用いた、１００コピー／反応でのＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列の増幅
【０１０１】
【表６】
表５および６に示す結果によって、配列番号１５に同定するプロモーター−プライマーが、投入テンプレートレベルがわずか１００コピー／反応であっても、示した非Ｔ７プライマー各々を用いて、ＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列を効率的に増幅することが確認された。配列番号１７の配列を有するプロモーター−プライマーはまた、配列番号１５の配列を有するプロモーター−プライマーに比較して、幾分減少したレベルであっても、増幅反応の構成要素として有用であった。しかし、明らかに、これらの２つのプライマーは、ＨＩＶ−２核酸増幅アッセイにおいて、プライマー結合のための標的として有用であるＬＴＲの領域を明示した。
【０１０３】
３つのさらなる非Ｔ７プライマーを合成して、そしてＨＩＶ−２増幅アッセイにおいて、配列番号１５のプロモーター−プライマーと組み合わせて試験した。これらのさらなるプライマーは、配列番号４−６に示す配列を有し、各オリゴヌクレオチドの１−４位は、２’メトキシ残基によって占められた。表７は、各反応において、合成ＨＩＶ−２テンプレートＲＮＡ １００コピーを用いて、これらのプライマー組を上述の増幅プロトコルで試験し、そして本質的に上述のように増幅産物を検出した際に得た結果を示す。
【０１０４】
表７
異なるプライマーの組み合わせを用いた、１００コピー／反応でのＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列の増幅
【０１０５】
【表７】
表７に示した結果は、３つのプライマーの組み合わせがすべて、増幅法において、例外的に優れた結果を生じることを示した。とりわけ、配列番号６の配列を有するプライマーおよび配列番号１５の配列を有するプロモーター−プライマーの組み合わせは、ＨＩＶ−２テンプレート配列を効率的に増幅し、そして好適に、陰性対照反応では、非常に低い読み取りを生じた。本明細書に開示するプライマーおよびプライマーの組み合わせは各々、本発明の好ましい態様に相当する。配列番号６の配列を有するプライマーおよび配列番号１５の配列を有するプロモーター−プライマーの組み合わせは、ＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列を増幅するのに、非常に好ましい組み合わせである。
【０１０７】
最後に、５００または１００コピー／反応のＨＩＶ−２テンプレートいずれかを用いて行う増幅反応において、配列番号１８および１９に同定するプロモーター−プライマーと組み合わせて、配列番号６の配列を有するプライマーを試験した。重要なことに、２つのプライマー中の標的相補配列およびＴ７プロモーター配列はどちらも、配列番号１５−１７のプロモーター−プライマーで使用するＴ７プロモーター配列とは異なった。やはり重要なことに、配列番号１８に同定するプロモーター−プライマーは、配列番号９に示す配列の１９位のＡ残基に対応する単一塩基欠失を含有する。表８に示す数値は、それぞれ、５００および１００コピー／反応のＨＩＶ−２標的を用いて行った、５および４の反復試験の結果である。
【０１０８】
表８
異なるプライマーの組み合わせを用いた、５００または１００コピー／反応でのＨＩＶ−２ポリヌクレオチド配列の増幅
【０１０９】
【表８】
表８に示す結果は、配列番号１８−１９に同定するＴ７プロモーター−プライマーがどちらも増幅アッセイで優れた結果を生じ、陽性シグナルは、５００コピー／反応のＨＩＶ−２標的を用いて行う陰性対照反応で測定されるシグナルより、５００−１，０００倍、上の範囲であることを立証した。著しいことに、これらのプロモーター−プライマーを含む陰性対照反応で測定したプローブハイブリダイゼーションシグナルは、好適に、非常に低かった。結果はさらに、異なるＴ７プロモーター配列を増幅法で使用して、優れた結果を生じることが可能であることをさらに立証した。
【０１１１】
表３−７に示す結果を総合すると、上述の非Ｔ７プライマー各々が結合するＬＴＲ標的領域が、Ｔ７プロモーター−プライマーと組み合わせてＨＩＶ−２配列を増幅するのに使用するための、さらなるプライマーを設計するのに使用可能なドメインを明示することが示された。このドメインは、ＧＴＧＴＧＴＧＴＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＴＡＧＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＴＣ（配列番号１）に示す長さ４０ヌクレオチドの配列を含んだ。この配列に実質的に対応する配列またはそのサブセットを有するオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載する増幅反応においてプライマーとして使用可能である。さらに、表４−８の結果は、上述のＴ７プロモーター−プライマー各々が結合するＬＴＲ標的領域が、非Ｔ７プライマーと組み合わせてＨＩＶ−２配列を増幅するのに使用可能なドメインを明示することを示した。このドメインは、長さ３４ヌクレオチドの配列ＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣ（配列番号８）を含んだ。この配列に、またはこの配列に実質的に相補的な配列に、相補的なオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載する増幅反応において、プライマーとして使用可能である。
【０１１２】
実施例２は、ＨＩＶ−２単位複製配列を検出するのに有用なプローブを同定するのに使用する方法を記載する。この方法において、一連の異なるプローブ配列に相補的な単一の合成オリゴヌクレオチド標的は、プローブ結合アッセイの標的として働いた。
【０１１３】
実施例２
ＨＩＶ−２を検出するオリゴヌクレオチドプローブ
配列ＧＡＡＧＧＧＵＣＣＵＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＧＧＵＣＵＵＧＵＵＡ（配列番号３０）を有する合成アンチセンスＨＩＶ−２オリゴヌクレオチドは、標準的な実験法にしたがって、２’メトキシヌクレオチドを用いて調製した。このオリゴヌクレオチドは、モデルＲＮＡ標的として働いた。２’メトキシヌクレオチドを用いて調製し、そしてプローブとして試験した、６つの異なるオリゴヌクレオチドは、表３に示す配列を有した。
【０１１４】
ハイブリダイゼーション反応は、１ｘ１０6ＲＬＵに対応する量のＡＥ標識化プローブを含有するプローブ保護緩衝液１００μｌ体積および２ｐｍｏｌの合成ＨＩＶ−２ ＲＮＡ標的を含有する１００μｌからなった。緩衝溶液は、７５ｍＭコハク酸、１２９ｍＭラウリル硫酸リチウム、７５ｍＭ水酸化リチウム、１５ｍＭアルドリチオール−２、１．０Ｍ塩化リチウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ｖ／ｖエチルアルコールを含み、そしてｐＨを４．２に調整した。混合物は、６０℃で１５分間ハイブリダイズさせ、そしてその後、６００ｍＭホウ酸、２３５ｍＭ ＮａＯＨおよび１％ｖｏｌ／ｖｏｌ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００を含む選択試薬溶液（ｐＨ９に調整済み）２５０μｌを用いて選択し、そしてその後、室温に１０分間冷却した。陰性対照ハイブリダイゼーション反応では、アンチセンスＨＩＶ−２標的オリゴヌクレオチドを省いた。ハイブリダイズしたプローブに会合するＡＥ標識の量を反映する化学発光は、上述の方法を用いて測定した。この方法から得た結果を表９に示す。
【０１１５】
表９
プローブハイブリダイゼーションの結果
【０１１６】
【表９】
表９に示す結果が示すように、該方法で試験したプローブは各々、低レベルのバックグラウンドハイブリダイゼーションを生じ、そしてＨＩＶ−２標的配列と、少なくとも中程度のレベルの陽性反応を生じた。より具体的には、陰性対照値はすべて、投入プローブレベルの０．２５％未満であり、一方、ＨＩＶ−２標的配列の存在下で行った反応はすべて、１５％より大きかった。実施例１で、配列番号２７の配列を有するプローブが、ＨＩＶ−２単位複製配列を検出するのに有用であることが示されたのと合わせると、表９の結果は、表３に示す配列がすべて、検出プローブとして有用であることを示した。
【０１１８】
上述の方法で達成した成功は、さらなる検出プローブを設計するのに使用可能なＨＩＶ−２配列ドメインを明示した。より具体的には、このドメインは、配列ＣＣＴＧＧＴＣＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＣＴＴＣＴ（配列番号２０）を有する、長さ２２ヌクレオチドの伸長に渡った。この配列に実質的に対応する配列、そのサブセット、またはその相補体を有するオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−２核酸を検出するためのプローブとして使用可能である。もちろん、有用なプローブは、このドメインの長さより長くてもよいし、そして有用なプローブのＨＩＶ−２相補部分は、分子ビーコンなどの、特定の二次構造を有するプローブに取り込んでもよい。配列番号２０の配列は、ＨＩＶ−１のゲノムに欠けているＨＩＶ−２ゲノムの部分に由来するため、これらのプローブはＨＩＶ−２に特異的であり、そしてＨＩＶ−１に特異的でない。
【０１１９】
とりわけ、配列番号２６および２５の配列を有するプローブは、この方法において、非常に優れた結果を生じた。これらのプローブのオリゴヌクレオチド配列は、上述のアッセイの検出工程で使用するのに、非常に好ましい。もちろん、いかなる検出可能標識の配置も多様であることが可能であり、そしてそれでも本発明の範囲内に属する。例えば、上述の方法を用いて、ＨＩＶ−２単位複製配列の検出用に、９および１０位の間に連結したＡＥ標識を持つ、配列番号２６の配列を有するプローブを使用するのが非常に好ましい。
【０１２０】
候補オリゴヌクレオチドが、溶液からＨＩＶ−２核酸を捕捉するのに使用可能であるかどうか決定する方法は、モデル標的として、上述のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＨＩＶ−２ ＲＮＡを用いて行った。２つの異なる候補捕捉オリゴヌクレオチドは各々、オリゴ（ｄＡ）伸長に連結したＨＩＶ−２特異的配列を含んだ。ＨＩＶ−２ ＲＮＡ標的、およびオリゴ（ｄＴ）を提示するよう修飾した磁気粒子と組み合わせると、機能する捕捉オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−２標的および粒子を架橋し、そしてＨＩＶ−２標的を固定した。溶液からの粒子性の複合体の除去は、ＨＩＶ−２テンプレートの濃縮手段に有効に相当した。以下の実施例に記載する方法において、２つの捕捉オリゴヌクレオチドを、別個に、ＨＩＶ−２ ＲＮＡおよびオリゴ（ｄＴ）で修飾した磁気粒子と接触させた。粒子を収集し、そしてその後、洗浄した後、結合したＨＩＶ−２配列は、均質保護アッセイで検出した。各場合で、捕捉オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−２ ＲＮＡ標的を磁気粒子上に固定した。
【０１２１】
以下の実施例は、ＨＩＶ−２捕捉オリゴヌクレオチドを同定するのに用いた方法を記載する。
【０１２２】
実施例３
捕捉オリゴヌクレオチドを用いたＨＩＶ−２標的配列の検出
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写したＨＩＶ−２ ＬＴＲ ＲＮＡ標的（上述）５ｘ１０11コピーは、配列番号３１および３２の配列を有する捕捉オリゴヌクレオチド、０、１．５ｐｍｏｌ、３．５ｐｍｏｌまたは５ｐｍｏｌいずれか、並びに常磁性粒子（０．７−１．０５μ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ、インディアナ州インディアナポリス）に連結した固定化ポリ（ｄＴ14）約１００μｇを含有する溶解／捕捉緩衝液４００μｌ中に分散した。溶解／捕捉緩衝液は、７９０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２３０ｍＭコハク酸、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、６８０ｍＭ水酸化リチウム一水和物を含んだ。配列番号３１の配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドは、２’−メトキシヌクレオチド類似体が占める１−２０位およびデオキシリボヌクレオチドが占める２１−５３位を有した。配列番号３２の配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドは、２’−メトキシヌクレオチド類似体が占める１−１８位およびデオキシリボヌクレオチドが占める１９−５１位を有した。配列５’−ＴＴＴ−３’に示されるスペーサーを、捕捉オリゴヌクレオチド各々に関して、ＨＩＶ−２相補配列およびポリ（Ａ）テール領域間に挿入した。Ｌｕｎｄら， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０８６１−１０８８０（１９８８）に記載されるようなカルボジイミド化学反応を用いて、ポリ（ｄＴ14）を常磁性粒子に連結した。混合物を５５−６０℃に約１５から３０分間加熱し、そしてその後、室温に冷却してハイブリダイゼーションを可能にした。Ｗａｎｇら、米国特許第４，８９５，６５０号に記載するものなどの方法を用いて、磁場を適用し、固定化捕捉オリゴヌクレオチドおよびＨＩＶ−２ ＲＮＡを含有する粒子複合体を収集した。粒子は、再懸濁および磁気分離工程の反復によって、１ｍｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６．５ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチル−パラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピル−パラベン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム）で２回洗浄した。洗浄した粒子は、１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液に懸濁し、そして配列番号２７の配列を有するプローブの代わりに、配列番号３３の配列を有するプローブを用いたことを除いて、先の実施例に記載した、プローブハイブリダイゼーションおよび検出法に、混合物を供した。各アッセイ条件に関して、偽捕捉対照は、アッセイで達成可能な最大化学発光値を示した。表１０は、捕捉オリゴヌクレオチドの各レベルに関して、２つのアッセイの反復に関する化学発光測定値を示す。
【０１２３】
表１０
標的捕捉の有効性
【０１２４】
【表１０】
表１０に示す結果は、方法で試験したオリゴヌクレオチドがどちらも、溶液からＨＩＶ−２ ＲＮＡを捕捉するのに使用可能であることを確証した。
【０１２６】
実施例４は、生物学的試料において、ＨＩＶ−２核酸を検出するため、したがうことが可能な方法を記載する。この実施例は、既知の量のＨＩＶ−２核酸を含有する対照試料を記載するが、ヒトドナー血液試料から得た血漿試料で置き換えてもよいことが理解されるべきである。後者の場合の陽性ハイブリダイゼーション結果は、ドナー試料におけるＨＩＶ−２核酸の存在の指標となるであろう。
【０１２７】
実施例４
核酸増幅を用いたＨＩＶ−２核酸の検出
既知の量のＨＩＶ−２（反応試験管あたり１００コピーのＨＩＶ−２）を含有するヒト血漿の第一の試料を、実施例３に記載するように、等体積の溶解／捕捉緩衝液と混合する。ＨＩＶ−２標的ＲＮＡを捕捉するため、混合物はまた、配列番号３１の配列を有する捕捉オリゴヌクレオチド約３．５ｐｍｏｌおよび常磁性粒子（０．７−１．０５μ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ、インディアナ州インディアナポリス）に付着した固体化ポリｄＴ14プローブ約１００μｇも含有する。混合物は、５５−６０℃に約１５から３０分間加熱し、そしてその後、室温に冷却して、ハイブリダイゼーションを可能にする。その後、磁場を適用して粒子複合体を収集する。粒子は、１ｍｌの洗浄緩衝液で２回洗浄し、そしてその後、実質的に、Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号に記載されるような方法を用いた転写関連増幅のため、核酸増幅試薬溶液７５μｌ中に再懸濁する。
【０１２８】
簡潔には、付着した複合体を含む洗浄粒子を、反応混合物（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ７．５）、１７．５ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、各１ｍＭのｄＮＴＰ、各４ｍＭのｒＮＴＰ）中で、配列番号１５および６の配列を有する増幅オリゴヌクレオチド各１５ｐｍｏｌと混合し、不活性油の層で覆って蒸発を防止し、６０℃で１０分間インキュベーションし、そしてその後、４１．５−４２℃で１０分間インキュベーションする。酵素（反応あたり約３，０００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素および約３，０００単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を添加し、混合し、そして標的ＨＩＶ−２核酸を４１．５−４２℃で１時間増幅する。
【０１２９】
実質的に先に記載するように、増幅したＨＩＶ−２標的配列は、配列番号２６の配列を有するＡＥ標識化プローブとハイブリダイズさせ、そしてその後、化学発光によって検出し、そして結果を相対光単位（ＲＬＵ）で表した。各アッセイ条件に関して、陰性対照は、ＨＩＶ−２含有試料の代わりに、ＨＩＶ−２核酸を含有しない、等体積の血漿を有する。その後、これらのアッセイで検出したＲＬＵ読み取り値を比較する。
【０１３０】
これらの方法の結果は、ＨＩＶ−２核酸配列が、本発明の方法を用いて、生物学的試料において、容易に検出可能であることを示す。より具体的には、陰性対照試料は、背景シグナルのみに対応するプローブハイブリダイゼーション結果を生じる。逆に、ＨＩＶ−２核酸を含有する試料は、バックグラウンドの数倍のハイブリダイゼーションシグナルを生じる。これは、増幅および検出反応が実行可能であることを示す。
【０１３１】
本発明は、いくつかの特定の実施例およびその態様に関して記載している。もちろん、前述の詳細な説明を概観すれば、本発明のいくつかの異なる態様が、当業者に示唆されるであろう。したがって、本発明の真の範囲は、付随する請求項を参照して、決定すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＨＩＶ−２核酸内の標的領域を検出するのに使用可能な多様なポリヌクレオチドを例示する模式図である（太い水平線で示す）。以下の核酸の位置を、標的領域に相対して示す：「捕捉オリゴヌクレオチド」は、増幅前に標的核酸にハイブリダイズし、そして該核酸を捕捉するのに用いる核酸を指し、「Ｔ」は、相補配列を有する固定化オリゴヌクレオチド（示していない）にハイブリダイズするのに用いるテール配列を示す；「非Ｔ７プライマー」および「Ｔ７プロモーター−プライマー」は、ＴＭＡを行うのに用いる２つの増幅プライマーを示し、「Ｐ」は、Ｔ７プロモーター−プライマーのプロモーター配列を示し；そして「プローブ」は、増幅した核酸を検出するのに用いるプローブを指す。
【配列表】
Claims (22)
- （ａ）配列番号１０を含み、かつ、ＨＩＶ−２核酸に対して非相補的な５’プロモーター配列を含んでいてもよい、第一の増幅オリゴヌクレオチド；および
（ｂ）配列番号１の配列由来の１９−４０の隣接する塩基の配列を含んでなり、１００ヌクレオチドまでの長さを有する、第二の増幅オリゴヌクレオチド
を含んでなる、ＨＩＶ−２核酸を検出するためのキット。 - （ｃ）配列番号２１又はその相補体の配列、及び検出可能標識を含む、オリゴヌクレオチド検出プローブ
をさらに含む、請求項１のキット。 - 第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１９−４０ヌクレオチドである、請求項１のキット。
- 第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１９−２１ヌクレオチドである、請求項３記載のキット。
- 第一の増幅オリゴヌクレオチドの長さが６０までである、請求項３又は４記載のキット。
- 第一の増幅オリゴヌクレオチドが、前記５’プロモーター配列を含む、請求項５記載のキット。
- 第一の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号１５で示される塩基配列からなるプロモーターープライマーである、請求項６記載のキット。
- 第一のオリゴヌクレオチドが配列番号１０からなり、第二の増幅オリゴヌクレオチドの長さが１９−２１ヌクレオチドである、請求項１のキット。
- 第二の増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される塩基配列からなる、請求項５〜８のいずれか１項記載のキット。
- オリゴヌクレオチド検出プローブの長さが３５までである、請求項２記載のキット。
- オリゴヌクレオチド検出プローブの長さが２２までである、請求項１０記載のキット。
- オリゴヌクレオチド検出プローブの長さが１８までである、請求項１１記載のキット。
- オリゴヌクレオチド検出プローブの配列が、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７からなる群より選択される塩基配列からなる、請求項１２記載のキット。
- 第一の増幅オリゴヌクレオチドの配列が、配列番号１０又は配列番号１５であり、第二の増幅オリゴヌクレオチドの配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される塩基配列からなる、請求項１３記載のキット。
- オリゴヌクレオチド検出プローブが、配列番号２０又はその相補体の配列内に含有される、少なくとも１６の隣接するヌクレオチドを含む、請求項１１又は１２記載のキット。
- オリゴヌクレオチド検出プローブが、配列番号２０で示される塩基配列又はその相補体からなる、請求項１１記載のキット。
- オリゴヌクレオチド検出プローブの長さが１８ヌクレオチドである、請求項１５記載のキット。
- オリゴヌクレオチド検出プローブが、配列番号２２又はその相補体、配列番号２３又はその相補体、配列番号２４又はその相補体、配列番号２５又はその相補体、配列番号２６又はその相補体及び配列番号２７又はその相補体からなる群より選択される塩基配列である、請求項１５記載のキット。
- オリゴヌクレオチド検出プローブがＤＮＡを含む、請求項１０記載のキット。
- オリゴヌクレオチド検出プローブが、リボース部分の２’位に少なくとも１のメトキシ基を含む、請求項１０記載のキット。
- 検出可能標識が化学発光標識または放射標識である、請求項１８記載のキット。
- 検出可能標識がアクリジニウムエステルである、請求項２１記載のキット。
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