KR100924243B1 - 상온 교잡반응이 가능한 유전자칩 및 칩 제조를 위한 탐침 유전자 디자인 신기술 - Google Patents

상온 교잡반응이 가능한 유전자칩 및 칩 제조를 위한 탐침 유전자 디자인 신기술 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산증폭산물(PCR 결과물) 등의 유전자를 유전자칩 상의 탐침 유전자와 교잡반응할 때 40℃ ~ 50℃ 혹은 그 이상의 고온에서 진행하여 나타나는 용매증발 등의 문제점을 해결하기 위하여, 20℃ ~ 30℃ 사이의 상온에서 교잡반응을 진행하여 유전형 분석(genotyping)이 가능하게 설계되는 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계 방법, 및 이에 따라 설계된 유전자 및 유전자 칩에 관한 것으로서, 상기 설계 방법은 프라이머의 3'-말단부위를 기준 0 위치로 하여, 프라이머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 10 개 포함하는 -10 의 위치부터 프라이머의 3'-말단부위로부터 5 개의 염기서열이 떨어진 +5 위치 사이의 -10 ~ +5 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함한다.
아미노캘릭스아렌 유도체, 이민캘릭스아렌 유도체, 자기조립 단분자층, 상온교잡반응, 프로브 설계, 유전형 분석, 유전자 칩

Description

상온 교잡반응이 가능한 유전자칩 및 칩 제조를 위한 탐침 유전자 디자인 신기술 {NOVEL METHOD OF DESIGNING DNA PROBE CHIP FOR ROOM TEMPERATURE HYBRIDIZATION AND THE DNA PROBE CHIP}
유전자칩 제조기술은 미국의 Affymetrix 사가 포토마스크(photomask)를 이용한 표면광합성기술에 의한 유전자칩 제조기술을 발표한 뒤 알데히드 칩상에 아민작용기를 가진 탐침 유전자를 화학결합시켜 고정화 하여 유전자칩을 제조하는 일반화된 방식, 대한민국의 바이오메트릭스 테크놀로지 사가 개발한 연속된 구아닌 염기를 가진 유전자 올리고머를 자발적으로 고정화 되게 하는 초분자 단분자층을 이용한 유전자 칩 제조기술 등 다양한 유전자칩 제조기술이 발표되었으며, 현재 국내외에서 HPV(인유두종 바이러스) 유전형 분석을 위한 유전자칩, 결핵균 유전형 판별을 위한 유전자칩등 다양한 유전자 칩이 개발되고 있다.
이러한 유전자 칩의 사용을 제한하는 큰 문제 중의 하나는 고온 교잡반응에서 시작된다. 일반적으로 유전자칩상에서 유전자의 교잡반응은 40℃ ~ 50℃ 정도의 고온에서 진행하게 되는데 주된 이유는 각각 다른 유전형의 유전자와 선택적으로 교잡반응을 진행하게 설계된 수십개에서 수백개에 이르는 탐침 유전자가 동일한 좁은 공간에 고정화 되어 유전자 칩을 구성하고 있어서 각각의 탐침유전자가 PCR 결 과물이나 혹은 주형 유전자와의 교잡반응에서 특이도를 높이고 비특이적 반응을 최소화 시키기 위하여 고온에서 진행하고 있다.
현재 개발되어 사용되는 거의 모든 유전자칩은 이러한 고온에서 교잡반응이 가능한 형태로 탐침유전자를 설계하고 고정화하여 제조되는 유전자 칩에서는 유전자를 포함한 용액을 도포한 뒤 40℃ ~ 50℃ 혹은 그이상의 고온까지 온도를 올려서 약 30분 ~ 2시간 정도 교잡반응을 수행한다. 유전자 칩상에 고정화된 탐침 유전자는 교잡반응시 용액상에 존재하는 유전자의 총량이 많고 적고 보다 유전자의 농도가 높으냐 낮으냐에 따라 결합되는 유전자의 양이 변하게 된다. 하여 동일한 유전자 양을 도포할 때에는 되도록 용매양을 적게 사용해야 하나 온도를 높게 유지하는 과정에서 도포된 용액이 말라버리는 경우가 생겨서 적정량의 용매를 사용하고 있다. 동시에 교잡반응에 사용되는 고정화된 탐침이 정해진 온도에서 최적으로 유전자와 결합하게 설계되어 있어서 온도가 높아지면 결합되는 유전자의 양이 줄게 되고 온도가 낮아지면 붙지 말아야 할 탐침 유전자에 까지 유전자가 결합되는 현상이 나타나 정확한 유전형 분석을 어렵게 만드는 큰 문제요소가 되고 있다. 이러한 예들은 기존의 탐침 유전자의 설계기술 및 유전자칩을 이용한 유전형 분석을 위한 교잡반응에 사용되는 방법들이 상온보다 고온에서만 유전자 분석의 특이도를 높일 수 있기 때문에 불가결하게 온도를 고온으로 높이는 기술만 사용할 수 밖에 없었다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 특허에서는 교잡반응을 상온(20℃~30℃)에서 진행하여도 유전형간의 결합되는 차별화를 높이고(높은 특이도) 또 유전자 가 고정화된 탐침에 높은 민감도로 즉 많은 유전자가 결합될 수 있게 탐침 유전자를 설계하는 신기술을 개발하였다. 설계된 탐침 유전자를 고정화하여 제조된 유전자 칩 상에서 실제로 유전형 분석이 유전형 간의 차별화가 최대로 유지하면서 고온에서보다 높은 감도로 교잡반응에서 유전자가 칩상의 탐침유전자에 선택적으로 결합되는 것을 확인하였으며 동시에 비특이적으로 결합되는 것을 최소화 하면서 진행되는 것을 확인하였다. 이러한 탐침설계기술을 적용하여 인유두종 바이러스(HPV)의 유전형 분석(genotyping)에 사용될 탐침유전자를 상온(20℃~30℃)에서 교잡반응이 가능하게 설계하였다. 설계된 탐침유전자들을 고정화한 HPV 유전형 분석 유전자 칩을 제조하고 PCR 결과물 등의 유전자를 도포하여 유전형 분석의 민감도, 특이도 등을 확인한 결과 새롭게 설계된 탐침유전자들이 상온에서 교잡반응하여 높은 특이도로 고온보다 높은 민감도로 탐침 유전자에 결합되어 효율적으로 유전형 분석이 진행되는 것을 확인하였으며, 이러한 내용과 관련된 결과들이 제시되었다.
도면에 대한 설명
도 1 은 연속된 구아닌 염기를 인식하는 아미노캘릭스아렌 및 이민캘릭스아렌의 단분자층으로 도포된 유리 슬라이드 제조를 보여주는 모식도이다.
도 2 는 아민기가 부착된 유리기질 표면에 도 1 의 아미노캘릭스아렌 유도체 또는 이민캘릭스아렌 유도체를 단분자층으로 결합한 후, 연속된 구아닌 염기를 가진 탐침 유전자의 올리고 DNA 를 고정화 하여 유전자 칩을 제조하는 모식도이다.
도 3a 은 탐침 유전자 설계에서 가장 우수한 교잡반응 결과를 보이는 탐침은 0 위치에서 염기서열이 시작되어 총 길이가 17mer 에서 23mer 사이의 탐침이라는 것을 나타내는, HPV 16형과 HPV 18형의 HPV 표준 주형의 PCR 결과물을 이용하여 반복해서 진행한 실제 실험 결과이다.
도 3b 는 기존의 고온 교잡반응용 HPV 탐침 유전자 칩 및 상온 교잡반응용 HPV 탐침 유전자 칩상에 동일한 주형을 이용하여 얻어진 PCR 결과물을 동일한 양을 도포하여 HPV 16형과 HPV 18형에 대한 유전형 분석을 진행한 실제 실험결과이다. 두 유전형 분석에서 신호의 감도는 약 50 배로 증가되었으며 실제 신호와 비특이적 신호와의 비는 고온에서 4~5 배, 상온에서는 20 배 수준으로 나타나 비특이적 결합이 최소화되면서 신호는 증폭되는 결과를 나타낸다.
도 4 는 상온 교잡반응용 탐침 설계기술개발을 위하여 프라이머의 끝 부분 부터 0~+3 개가 떨어진 곳에서 탐침 유전자의 염기가 시작되어 특정 염기 길이를 가지게 설계하면 최적의 신호를 나타낸다는 것을 보여주는 실제 실험결과이다. 이 조건에 맞추어 각 유전형에 최적의 결과를 보이는 탐침을 Tm 값 37℃ 에서 55℃사이에서 결정한 결과가 유형별로 표 4에 나타나 있다.
도 5 는 포지티브 컨트롤을 결정하는 방법 및 결정된 포지티브 컨트롤을 보여주는 실제 실험결과이다. 각각의 유전형이 PCR된 결과물에서 프라이머 끝에서 첫번째 염기(+1)에서 시작하여 12번째 염기(+12)까지 12개의 염기와 프라이머 말단부위(0)에서 프라이머 염기와 겹치는 염기의 수를 - 로 표시하여(예를 들면, 5개가 겹치는 염기서열을 -5, 8개가 겹치는 염기서열을 -8, 11개가 겹치면 -11 등으로 표시함) 포지티브 컨트롤 표준 탐침의 염기서열을 설계하였다. 이 표준 탐침을 고정화한 유전자 칩상에 HPV 표준주형의 PCR 결과물을 도포하면 프라이머와 5mer 가 겹치게 설계된 탐침(-5)과 8mer 가 겹치게 설계된 탐침(-8)에서는 유전형이 다르면 신호가 나타나지 않으나 11mer가 겹치게 설계된 표준탐침(positive control, -11)에서는 유전자 형에 상관없이 PCR 결과물이 결합되어 형광이 나타나거나 혹은 프라이머가 결합되어 형광이 나타나는 것을 확인할 수 있다. 하여 포지티브 컨트롤은 -5~-8 사이의 염기서열을 가지는 것으로 설계하였다.
도 6 은 특이적 결합과 비특이적 결합에 의해 나타나는 신호를 구분하는 기준을 정하고 정확한 유전형 분석(gneotyping)을 진행하기 위해 포지티브 컨트롤이라는 표준탐침을 설계하고 결정하는 과정을 보여주고 있다. 여기에는 표 4의 HPV 유전형 별 탐침을 고정화 한 리얼(real)영역과 도 5에서 결정된 -8의 프라이머 와 겹치는 동일한 염기서열부분을 가지고 표4의 결정된 유전형별 탐침의 3' 위치에서 12mer를 합하여 20mer로 결정된 예비 표준탐침(표 6)을 고정화한 유전자 칩상의 포지티브 컨트롤 영역에 각각의 유전형 주형을 이용하여 증폭시킨 PCR 결과물을 도포하여 실제로 진행된 실험결과이다. 이 결과는 표 7에 정리되어 있는데 특정 HPV 유형의 PCR 결과물을 도포했을 때 더 많은 수의 유형의 PCR 결과물에서 신호를 발현하는 예비 표준탐침을 6종 선발하고 이들을 표 8과 같이 혼합하여 고정화 하여 유전자 칩상의 포지티브 컨트롤용 혼합 표준탐침을 결정하였다.
도 7 은 도 6에서 결정된 혼합형 포지티브 컨트롤 2종과 표 8의 네거티브 컨트롤(Negative control, 비특이가 나타나는 정도를 확인하는 위치) 그리고 하이브리다이제이션 컨트롤 (Hybridization control, 형광부착된 프라이머가 부착되는 위치로 PCR 결과물의 양이 일정하게 들어가는지를 확인하는 위치) 그리고 표 4의 HPV 18종의 탐침유전자를 고정화 하여 제조된 상온 교잡반응용 유전자 칩에 각 유형의 표준주형을 표 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 방법으로 증폭한 결과물을 도포하여 반복적으로 얻어진 결과이다. 상온 교잡반응용 유전자 칩에서는 HPV 유형별로 포지티브 컨트롤과 각 유형별 탐침위치에 정확하게 형광이 나타나며 동시에 하이브리다이제이션 컨트롤 위치의 형광감도를 이용하여 PCR 결과물을 도포한 양을 가늠할 수 있으며 비특이적 결합이 고온 교잡반응용 유전자칩과 비교하면 거의 제거되었음을 보여주는 결과이다.
도 8은 PCR에 사용된 그리고 PCR 결과물에 결합된 프라이머와 겹치는 유전자의 수가 8 개인 -8의 위치에서 시작하게 설계된 탐침유전자(probe)와 프라이머가 끝나는 부분부터 시작되는, 즉 프라이머와 떨어진 염기의 수가 0 개인 0 의 위치에서 시작되게 설계된 탐침유전자 그리고 프라이머와 떨어진 염기의 수가 3 개인 +3 에서 시작되게 설계된 탐침유전자를 보여주는 모식도이다. 즉, 전체적으로 프라이머 끝부분을 0 으로 하여, -8부터 +3사이에서 탐침의 염기서열이 시작되는 탐침유전자 설계를 보여주는 모식도이다. 각각의 탐침유전자는 도 1과 도 2에서 제조된 칩상에 고정화 되게 연속된 구아닌 염기를 가지게 설계되었다. 이렇게 제조된 유전자칩은 높은 특이도와 민감도로 PCR 결과물과 상온교잡반응을 진행한다는 것을 보여주는 모식도이다.
도 9는 주형의 일부분의 유전형과 일치되게 설계되어 주형 유전자에 결합될 올리고유전자와 결합된 주형유전자를 보여주는 모식도이다. 여기에 결합된 올리고유전자와 겹치는 유전자의 수가 8개 인 -8의 위치에서 시작하게 설계된 탐침유전자(probe)와 주형에 결합된 올리고유전자의 끝부분부터 즉 주형에 결합된 올리고유전자와 떨어진 염기의 수가 0개인 0 의 위치에서 시작되게 설계된 탐침유전자, 그리고 주형에 결합된 올리고유전자와 떨어진 염기의 수가 3개인 +3 에서 시작되게 설계된 탐침유전자를 보여주는 모식도이다. 각각의 탐침유전자는 도 1과 도 2에서 제조된 칩상에 고정화 되게 연속된 구아닌 염기를 가지게 설계되었다. 이렇게 제조된 유전자칩은 높은 특이도와 민감도로 주형에 결합될 올리고유전자가 결합된 주형 유전자와 상온(20℃~30℃)교잡반응을 진행하는 것을 보여주는 모식도이다.
도 10은 16 형의 주형 유전자를 형광 부착된 DNA 올리고머과 결합시킨 뒤 올리고머의 3'-말단 위치를 0으로 하여 -8mer 와 0mer 그리고 +15mer가 고정화된 칩상에 도포하여 PCR 없이 주형유전자를 직접 교잡반응하여 얻은 형광스캔 결과이다. PCR 없이 주형유전자를 직접 이용한 교잡반응 시험에서는 +15mer 는 60ng/㎕ 농도의 주형유전자가 포함된 반응용액을 도포하여도 형광감도가 나타나지 않지만 0mer 와 -8mer에서는 20ng/㎕ 농도에서도 충분히 형광감도를 분석할 수 있는 바, 교잡반응 효율이 획기적으로 증대된 것을 보여주는 실제 실험 결과이다.
발명의 개시
본 발명에서는 현재 사용되고 있는 유전자 칩에서 유전형 분석(genotyping)을 위해 고온 교잡반응을 이용하고 있는데 이러한 고온 교잡반응에서 나타나는 문제점을 줄이거나 해소하기 위하여 상온(20℃~30℃) 교잡반응을 이용하여 유전형 분석이 가능한 탐침유전자를 설계하는 신기술을 개발하고자 한다. 또, 개발된 방법에 따라 설계된 탐침 유전자 올리고머를 고정화하여 상온에서 교잡반응하여 유전형 분석을 가능하게 하는 상온 교잡반응용 유전자칩을 제조하였다. 유전자 칩은 도 1 과 도 2 의 방법에 따라 제조된 유전자 칩상에 개발된 탐침유전자에 7 개 이상, 바람직하게는 7~15 개의 구아닌 염기가 부착된 올리고머를 고정화 하여 제조하였다.
개발된 상온 교잡반응용 유전자 칩과 기존의 고온에서의 교잡반응을 이용한 유전자 칩을 실제 PCR 결과물을 이용하여 민감도와 특이도를 비교하여 상온에서의 교잡반응에서 더욱 높은 신호를 보이게 탐침을 설계하는 기술과 비특이적 결합을 최대한 제거하는 탐침설계 신기술을 개발하여 탐침 유전자 설계에 적용하였다. 도 3, 4, 5에서 나타나는 결과를 기초로 도 8 과 도 9의 방법에 따라 제조된 탐침유전자를 고정화한 유전자 칩상에는 상온에서 교잡반응을 진행할 때 비특이적 형광 발현 즉, 형광이 나타나지 않아야 하는 위치에 비특이적으로 결합되어 유전형이 있는 것처럼 보이게 하는 비특이적인 결합으로 인한 오류를 최소화한다는 도 3 과 같은 결과를 확보하였다.
최적탐침의 설계기술은 도 3 과 도 4 에서 보여지는 것처럼 다양한 위치와 다양한 길이를 이용한 탐침을 설계하여 칩상에 고정화시켜 비교실험을 통해 도 8과 도 9의 방법에 따라 민감도와 특이도를 높인 탐침 설계기술을 확보하였고 최적의 탐침설계기술과 이를 적용한 상온교잡반응용 유전자칩 제조기술을 개발하였다.
또, 개발된 신기술들이 실제 상용화되는 제품에 적용이 가능한지를 확인하기 위하여 상온에서 교잡반응이 진행되게 인유두종바이러스 (HPV)의 유전자형 분석용 탐침을 설계하고 이를 도 2의 방법에 따라 고정화하여 상온에서 유전형 분석(genotyping)이 가능한 HPV 유전자칩을 제조하였다.
제조된 HPV 유전형 분석 유전자칩에 형광 부착된 프라이머를 이용하여 유전형을 알고 있는 바이러스 주형 혹은 표준 주형을 핵산중합반응(PCR)을 이용하여 증폭된 결과물을 상온에서 도포하거나 많은 양의 표준주형 혹은 바이러스 주형을 직접 사용하여 상온에서 도포하여 사용된 유전자형과 동일한 결과가 나타나는지를 도 7과 같이 확인하였다. 이 과정을 통하여 새로운 탐침 유전자 및 탐침 유전자가 고정화된 HPV 유전자칩을 개발하였다. 도 7에서 보여지는 것은 최상급으로 설계된 탐침유전자를 고정화한 유전자 칩에서 얻어진 결과들이다.
수 십종의 탐침 유전자가 고정화된 HPV 유전형 분석용 유전자칩등의 유전자 칩에서는 거의 모든 비특이적 결합요인을 제거하여도 도포된 유전형 부분에서 강하 게 신호가 발현되어도 나타나지 않아야 할 위치에서 불규칙하게 신호가 나타나는 현상 즉 비특이적 결합을 완전하게 제거하기에 상당한 어려움이 있다. 이러한 특이적 그리고 비특이적 신호중에 어느 것이 실제 유전형이 발현된 것이고 어느 것이 비특이적으로 결합된 것인지 판단하는데 결정적으로 기여할 포지티브 컨트롤 탐침을 설계하는 신기술을 도 5와 도 6과 같은 방법을 사용하여 개발하였다. 이 기술을 적용하여 설계된 포지티브 컨트롤 탐침을 고정화하여 포지티브 컨트롤 탐침에서 나타나는 신호를 기준으로 특이적 비특이적 신호를 판정하면 특이적 신호만 판정할 수 있는 기준을 제시한다는 결과를 도 7과 같이 확보하였다.
이러한 기술들을 종합하여 도 8, 도 9와 같이 상온에서 유전형 분석이 가능한 탐침 설계 신기술, 도 2와 같이 설계된 탐침을 고정화한 유전자 칩 제조기술, 비특이적 교잡반응에 의한 신호를 최소화한 포지티브 컨트롤용 탐침 설계기술을 확보하였다. 실제로 상온에서 고정화된 탐침유전자와 결합되는 상온 교잡반응의 과정은 도 8의 모식도에서 보여주고 있다. 이러한 기술을 바탕으로 상온교잡반응으로 유전형 분석이 가능한 유전자칩 제조와 이 기술을 바이러스 형 분석에 실제로 적용하여 상온(20℃~30℃) 교잡반응에 사용될 HPV 유전형 분석용 탐침 유전자를 도 8의 방식에 따라 설계하고 이를 고정화하여 상온 교잡반응으로 HPV 유전형 분석용을 수행하는 유전자칩(상온 교잡반응용 HPV genotyping DNA chip)을 개발하였다.
발명의 구성
본 발명은 프라이머의 3'-말단부위를 기준 0 위치로 하여, 프라이머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 10 개 포함하는 -10 의 위치부터 프라이머의 3'-말단부 위로부터 5 개의 염기서열이 떨어진 +5 위치 사이의 -10~+5 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법에 관한 것이다.
바람직하게는, -8~+3 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 상기 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법이다.
한편, 본 발명은 프라이머의 3'-말단부위를 기준 0 위치로 하여, 프라이머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 10 개 포함하는 -10 의 위치부터 프라이머의 3'-말단부위로부터 5 개의 염기서열이 떨어진 +5 위치 사이의 -10~+5 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법에 따라 설계된 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩을 제공한다.
바람직하게는, 상기 탐침 유전자가 15~30mer 사이의 길이, 바람직하게는 17~23mer 사이의 길이를 갖는 것인 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩 또는 상온 교잡반응용 탐침 유전자침의 설계방법이다.
또한, 7~15개의 연속된 구아닌 염기가 상기 탐침 유전자 칩의 5'-말단에 추가로 부착되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 상기 탐침 유전자는 자기조립단분자층(Self-assembled monolayer, SAM) 상에 부착하는 것을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 자기조립단분자층은 아민-변성된 유리기판, 유리섬유, 실리콘웨이퍼 및 용융석영(fused silica) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고체기질 상에 하기 화학식 1 의 아미노캘릭스아렌 유도체가 부착되어 형성되거나,
Figure 112008067217588-pat00001
[식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, -COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타내고, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및-CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 C6H5 는 페닐기로 정의됨)], 또는
하기 화학식 2 의 이민캘릭스아렌 유도체가 부착되어 형성되는 것일 수 있다.
Figure 112008067217588-pat00002
[식 중, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, -COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타내고, 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및-CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 C6H5 는 페닐기로 정의됨)].
본 발명의 또 다른 바람직한 구현은, 주형유전자와 일치하는 염기서열을 가진 DNA 올리고머의 3'-말단부위를 기준 0 위치로 하여, 상기 올리고머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 10 개 포함하는 -10 의 위치부터 상기 올리고머의 3'-말단부위로부터 5 개의 염기서열이 떨어진 +5 위치 사이의 -10~+5 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법이다.
바람직하게는, -8~+3 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 상기 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법이다.
한편, 본 발명은 주형유전자와 일치하는 염기서열을 가진 DNA 올리고머의 3'-말단부위를 기준 0 위치로 하여, 상기 올리고머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 10 개 포함하는 -10 의 위치부터 상기 올리고머의 3'-말단부위로부터 5 개의 염기서열이 떨어진 +5 위치 사이의 -10~+5 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법에 따라 설계된 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩을 제공한다.
바람직하게는, 상기 탐침 유전자가 15~30mer 사이의 길이, 바람직하게는 17~23mer 사이의 길이를 갖는 것인 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩 또는 상온 교잡반응용 탐침 유전자침의 설계방법이다.
또한, 7~15개의 연속된 구아닌 염기가 상기 탐침 유전자 칩의 5'-말단에 추가로 부착되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 상기 탐침 유전자는 자기조립단분자층(Self-assembled monolayer, SAM) 상에 부착하는 것을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 자기조립단분자층은 아민-변성된 유리기판, 유리섬유, 실리콘웨이퍼 및 용융석영(fused silica) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고체기질 상에 상기 화학식 1 의 아미노캘릭스아렌 유도체가 부착되어 형성되거나, 또는 상기 화학식 2 의 이민캘릭스아렌 유도체가 부착되어 형성되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 프라이머의 3'-말단부위를 기준 0 위치로 하여, 프라이머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 10 개 포함하는 -10 의 위치부터 프라이머의 3'-말단부위로부터 5 개의 염기서열이 떨어진 +5 위치 사이의 -10~+5 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법에 따라 설계된, 탐침 유전자 칩에 PCR 결과물을 도포하여, 상온에서 교잡반응을 진행하여 유전형을 분석하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 자기조립단분자층을 아민-변성된 유리기판 상에 상기 화학식 1 의 아미노캘릭스아렌 유도체가 부착되어 형성되거나, 또는 상기 화학식 2 의 이민캘릭스아렌 유도체가 부착되어 형성되는 상기 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법에 따라 설계된, 탐침 유전자 칩에 PCR 결과물을 도포하여, 상온에서 교잡반응을 진행하여 유전형을 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법에 따라 탐침 유전자 칩에 주형유전자와 일치하는 염기서열을 갖는 15~30mer 의 DNA 올리고머가 결합된 주형유전자를 도포하여, 상온에서 교잡반응을 진행하여 유전형을 분석하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 프라이머의 3'-말단부위를 기준 0 위치로 하여, 프라이머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 10 개 포함하는 -10의 위치부터 프라이머의 3'-말단부위로부터 5 개의 염기서열이 떨어진 + 5 위치 사이의 -10~+5 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법에 따라 설계된, HPV 유전형 분석(genotyping)에 사용되는 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩을 제공한다.
바람직하게는, 상기 탐침 유전자가 본 명세서에 기재된 염기서열 30~47 로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 것이다.
또한, 바람직하게는 상기 탐침 유전자가 자기조립단분자층(Self-assembled monolayer, SAM) 상에 부착하는 것을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 자기조립단분자층은 아민-변성된 유리기판 상에 상기 화학식 1 의 아미노캘릭스아렌 유도체가 부착되어 형성되거나, 또는 상기 화학식 2 의 이민캘릭스아렌 유도체가 부착되어 형성되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 바람직하게는 프라이머의 3'-말단부위를 기준 0 위치로 하여, 프라이머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 10 개 포함하는 -10의 위치부터 프라이머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 3 개 포함하는 -3 의 위치 사이의 -10~-3 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계된, 포지티브 컨트롤용 탐침 유전자 또는 이들의 혼합 탐침 유전자를 제공한다. 포지티브 컨트롤의 염기서열 시작 부분은 -10~-3, 바람직하게는 -8~-5 이다.
상기 포지티브 컨트롤용 탐침 유전자는 본 명세서에 기재된 염기서열 52, 53, 56 및 60~62 로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는, HPV 유전형 분석(genotyping)에 사용되는 것인 포지티브 컨트롤용 탐침 유전자 또는 이들의 혼합 탐침 유전자일 수 있다.
또한, 상기 유전형 분석용 탐침유전자가 고정화된 유전자 칩에서, 상기 기재한 포지티브 컨트롤용 탐침 유전자 또는 이들의 혼합 탐침 유전자를 고정화하여, 유전형을 분석하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 바람직하게는, 본 발명의 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계 방법에 따라 설계된 탐침 유전자로서, 교잡반응을 상온에서 진행하여 유전형 분석(genotyping)이 가능하게 설계된 탐침 유전자 칩을 제공한다.
본 발명의 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계 방법에 따른 유전자 칩은 PCR 결과물을 도포하는 경우, 우수한 탐침 민감도를 나타낸다. 이러한 본원 발명에 따른 실제 실험 결과를 도면에 대한 설명과 함께 하기에 기재한다
상기 탐침 유전자 칩의 제조방법에 사용된 화학식 1의 아미노캘릭스아렌 유도체와 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체는 도 1의 모식도와 같이 아민변성된 유리기질 표면에 초분자를 단분자층으로 결합하여 제조되고, 도 2 와 같이 유리 슬라이드에 연속된 구아닌 염기를 가진 유전자 올리고머를 고정화 하여 본원 발명의 탐침 유전자 칩이 제조된다. 본 발명에서 사용되는 탐침 유전자의 고정화는 실시 예 3의 유전자 고정화방법에 따라 진행되었다.
탐침 유전자 설계에서 가장 우수한 교잡반응 결과를 보이는 탐침을 다양한 위치에서 비교시험 하였으며 상온에서 최적으로 사용될 탐침설계는 PCR시에 사용되는 프라이머의 끝부분에서 떨어진 염기개수가 0개(0), 3개(+3), 6개(+6) 등에서 시작되는 17~19mer의 탐침을 표 3과 같이 설계하여 고정화한 유전자 칩상에 동일한 PCR 결과물을 도포하여 각각의 탐침의 민감도를 비교하여, -10~+5, 바람직하게는 -8~+3, 특히 바람직하게는 0~+3이 최적의 민감도를 보인다는 결과를 확보하였다 (도 4, 도 8, 실시예 5).
도 3a 는 프라이머의 끝부분에서 떨어진 염기개수가 0개(0)인 탐침을 HPV 16형과 18형에 대해서 표 1과 같이 설계하여 최적의 민감도를 보이는 탐침의 길이를 결정하였다. 실시예 3,4의 결과에 따르면 길이가 17mer 에서 23mer 사이의 탐침이 최적의 민감도를 보인다는 것을 확인하였다. 본 결과는 도 8과 같이 상온에서 HPV 16형과 HPV 18형의 표준 주형을 이용한 PCR 결과물을 설계된 탐침유전자가 고정화된 칩상에 도포해서 얻어진 실제 실험 결과이다. 프라이머의 끝부분에서 떨어진 염기개수가 0개(0)인 그리고 27℃ 부터 57℃까지의 Tm(melting temperature) 값을 가진 탐침 유전자를 HPV 16형과 18형에 대하여 표 1과 같이 12종을 설계하여 실시예 3의 방법에 따라 동일한 칩상에 고정화한 유전자 칩을 제조하였다. 이 칩상에 HPV 16형과 18형의 두 주형을 이용하여 표 2의 프라이머 세트를 이용하여 얻어진 PCR 결과물을 실시예 4의 방법에 따라 동일한 양을 도포하여 상온과 50℃ 에서 30분 동안 교잡반응을 진행하였으며 실험결과는 도 3b 에 나타나 있다. 동일한 Tm값을 가진 탐침인 경우 상온에서 민감도가 약 50배로 증가되었다. 특이도를 나타내는 실제 신호와 비특이적 신호와의 비는 고온에서 4~5배, 상온에서는 20배 수준으로 나타나 특이도가 대폭 증가되면서 민감도 즉 신호는 증폭되는 결과를 보여주는 실제 실험결과이다. 도 3과 도 4의 결과에 맞추어 18종의 HPV 유전형에 최적의 민감도와 특이도를 보이는 탐침을 Tm 값 37℃ 에서 55℃사이에서 결정하였으며 유전형별 염기서열은 표 4에 나타나 있다.
도 5 는 포지티브 컨트롤을 결정하는 방법과 결정된 포지티브 컨트롤을 보여주는 실제 실험결과이다. 각각의 유전형이 PCR된 결과물에서 프라이머 끝에서 첫번째 염기(+1)에서 시작하여 12번째 염기까지의 12개의 염기와 프라이머 말단부위에서 프라이머 염기와 겹치게 설계된 염기의 수를 - 로 표시하여 5개가 겹치는 염기서열을 -5, 8개가 겹치는 염기서열을 -8, 11개가 겹치면 -11 등으로 표 5와 같이 포지티브 컨드롤용 표준탐침의 염기서열을 설계하였다. 이 표준탐침을 고정화한 유전자 칩상에 실시예 7과 같이 HPV 표준주형의 PCR 결과물을 도포하면 프라이머 와 5mer 가 겹치게 설계된 탐침(-5)과 8mer 가 겹치게 설계된 탐침(-8)에서는 유전형이 다르면 신호가 나타나지 않으나 11mer가 겹치게 설계된 표준탐침(positive control, -11)에서는 유전자 형에 상관없이 PCR 결과물이 결합되어 형광이 나타나거나 혹은 primer가 결합되어 형광이 나타나는 것을 확인할 수 있다. 하여 포지티브 컨트롤은 -5~-8사이의 염기서열로부터 시작되는 올리고머의 염기서열로 설계하였다.
도 6 은 특이적 결합과 비특이적 결합에 의해 나타나는 신호를 구분하는 기 준을 정하고 정확한 유전형 분석(gneotyping)을 진행하기 위해 포지티브 컨트롤이라는 표준탐침을 설계하고 결정하는 과정을 보여주고 있다. 여기에는 표 4의 HPV 유전형 별 탐침을 고정화한 리얼(real) 영역과 도 5에서 결정된 -8의 프라이머와 겹치는 동일한 염기서열부분을 가지고 표 4의 결정된 유전형별 탐침의 3'-위치에서 12mer를 합하여 20mer로 결정된 예비 표준탐침(표 6)을 고정화한 유전자 칩상의 포지티브 컨트롤 영역에 각각의 유전형 주형을 이용하여 증폭시킨 PCR 결과물을 도포하여 실제로 진행된 실험결과이며 실시예 8에 따라 진행되었다. 예비 포지티브 컨트롤용 탐침에서 발현되는 결과들은 표 7에 정리되어 있다. 특정 HPV 유형의 PCR 결과물을 도포했을 때 최대로 많은 수의 유형의 PCR 결과물에서 신호를 발현하는 예비 표준탐침을 6종 선발하고 이들을 표 8과 같이 혼합한 뒤 고정화하여 유전자 칩상의 포지티브 컨트롤용 혼합 표준탐침으로 사용한다.
도 7 은 도 6에서 결정된 혼합형 포지티브 컨트롤 2종과 표 8의 네거티브 컨트롤(비특이가 나타나는 정도를 확인하는 위치) 그리고 하이브리다이제이션 컨트롤(형광부착된 primer 가 부착되는 위치로 PCR 결과물의 양이 일정하게 들어가는지를 확인하는 위치) 그리고 표 4의 HPV 18종의 탐침유전자를 고정화 하여 제조된 상온 교잡반응용 HPV 유전형분석용 유전자 칩에 실시예 9에 따라 각 유형의 표준주형을 표 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 방법으로 증폭한 결과물을 도포하여 반복적으로 얻어진 결과이다. 상온 교잡반응용 유전자 칩에서는 HPV 유형별로 포지티브 컨트롤과 각 유형별 탐침위치에 정확하게 형광이 발현되며 동시에 하이브리다이제이션 컨트롤 위치의 형광감도를 이용하여 PCR 결과물을 도포한 양을 가늠할 수 있으며 비특이적 결합이 고온 교잡반응용 유전자칩과 비교하면 거의 제거되었음을 보여주는 결과를 얻었다.
본 발명에 있어서, 화학식 1의 아미노캘릭스아렌 유도체, 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체, 상기를 이용하여 제조된 자기조립 단분자층, 상기 자기조립 단분자층에 고정화된 올리고DNA 칩은 본원에 참조로 도입되는 한국특허출원 10-2005-0096322호, 10-2005-0103857호, 10-2005-0105340호 및 10-2005-0110824호에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
5,11,17,23- 테트라디벤질아미노캘릭스[4]아렌 -1,3- 헥산알데하이드 ( TDBACAHA ) 를 용액에 녹여 아민변성된 ( 기알려진 방법에 따름) 유리글라스에 변성하는 방법
Figure 112008067217588-pat00003
CHCl3 등의 유기용매에 화학식 1의 유도체 중에서 5,11,17,23-테트라디벤질아미노캘릭스[4]아렌-1,3-헥산알데하이드 (TDBACAHA) 를 0.1~5.0 mM 농도로 녹인 용액을 제조하였다. 도 1과 같이 아민작용기가 부착된 유리글라스(아민슬라이드 글라스)를 제조된 용액에 1~24 시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름, 아세톤 및 물로 각각 세척한 뒤 건조시켜 본 발명의 아미노캘릭스아렌 단분자층을 제조하였다. 동일한 방법에 따라 다른 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층도 제조되었다. 상기 아민기가 변성된 고체 기질으로서, 아민-변성된 유리기판, 아민-변성된 유리섬유, 아민-변성된 실리콘웨이퍼, 아민-변성된 용융석영(fused silica) 등을 사용할 수 있다.
실시예 2
5,11,17,23-테트라벤질이민알콕시캘릭스[4] 아렌다이헥사알데하이드 ( TBICAHA ) 를 용액에 녹여 아민변성된 (기 알려진 방법에 따름) 유리글라스에 변성하는 방법
Figure 112008067217588-pat00004
CHCl3 등의 유기용매에 화학식 2의 유도체 중에서 5,11,17,23-테트라벤질이민알콕시캘릭스[4]아렌(TBICAHA)를 0.1~5.0 mM 농도로 녹인 용액을 제조하였다. 도 1에서와 같이 아민작용기가 부착된 유리글라스 [참고문헌: Langmuir, 1997 년, Vol 13, pp 4305-4308; Langmuir, 1996년, Vol 12, pp 5338-5342 에 따라 제조됨] (아민슬라이드 글라스)를 제조된 용액에 1~24 시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름, 아세톤 및 물로 각각 세척한 뒤 건조시켜 본 발명의 이민캘릭스아렌 단분자층을 제조하였다. 동일한 방법에 따라 다른 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층을 제조하였다. 상기 아민기가 변성된 고체 기질으로, 아민-변성된 유리기판, 아민-변성된 유리섬유, 아민-변성된 실리콘웨이퍼, 아민-변성된 용융석영(fused silica) 등을 사용할 수 있다.
실시예 3
DNA 칩의 유용 교잡반응 온도 결정 시험 및 비교 시험을 위한 올리고 DNA 고정화 방법
도 2에 나타난 올리고DNA 고정화에는 제네틱스 (Genetics) 마이크로어레이 장치 (영국)를 사용하였다. DNA 칩의 유용 교잡반응의 온도를 결정하기 위해서 표 1에 나타난 12종류의 연속된 9개의 구아닌 염기를 가진 올리고DNA를 33.75 pmol/㎕ 로 BMT 스폿팅 (spotting) 용액에 녹여서 고정화 용액을 제조하였다. 상기 고정화 용액을 제네틱스 (Genetics) 마이크로어레이 장치 (영국)를 사용하여, 실시예 1또는 실시예 2와 같은 방식으로 제조된 도 1 에 제시된 형태의 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 또는 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 유리 기질 (유리 슬라이드)에 1~5 nL 씩을 도포하여, 올리고DNA를 직경이 150-180 ㎛ 인 스폿 내에 고정화시켰다. 1~4 시간 뒤에 유리 슬라이드를 500 ㎖ 의 BMT Wa-A-1 용액에서 1 분 동안 1회 세척하고, BMT Wa-A-2 용액으로 2회 세척한 후 올리고DNA가 고정화된 나머지 위치를 블록킹 (blocking)하기 위하여, 세척된 유리 슬라이드를 250 ㎖ 의 BMT 블록킹 용액에 넣고 30 분 동안 처리하였다. 그 후, 다시 500 ml의 BMT Wa-A-1 용액에서 3 분 동안 1 회 세척하고 BMT Wa-A-2 용액으로 2 회 세척한 뒤, 물기를 제거하여 건조 후 직경이 0.8~1.0 cm 인 교잡반응용 챔버를 단단히 부착하였다.
탐침명 염기서열 (5'-3') 설명
16-1 GGG GGG GGG TTA TTT TCC TAC A (염기서열 1) 13mer, 27도
16-2 GGG GGG GGG AA TTA TTT TCC TAC A (염기서열 2) 15mer, 31도
16-3 GGG GGG GGG C AAA TTA TTT TCC TAC A (염기서열 3) 17mer, 37도
16-4 GGG GGG GGG TTC AAA TTA TTT TCC TAC A (염기서열 4) 19mer, 41도
16-5 GGG GGG GGG AG TTC AAA TTA TTT TCC TAC A (염기서열 5) 21mer, 47도
16-6 GGG GGG GGG C CAG TTC AAA TTA TTT TCC TAC A (염기서열 6) 23mer, 55도
18-1 GGG GGG GGG ATT CTC CCT CT (염기서열 7) 11mer, 27도
18-2 GGG GGG GGG GT ATT CTC CCT CT (염기서열 8) 13mer, 33도
18-3 GGG GGG GGG G TGT ATT CTC CCT CT (염기서열 9) 15mer, 39도
18-4 GGG GGG GGG GTG TGT ATT CTC CCT CT (염기서열 10) 17mer, 45도
18-5 GGG GGG GGG CT GTG TGT ATT CTC CCT CT (염기서열 11) 19mer, 51도
18-6 GGG GGG GGG A GCT GTG TGT ATT CTC CCT CT (염기서열 12) 21mer, 57도
실시예 4
PCR 산물을 이용하여 DNA 칩의 유용 교잡반응 온도 결정 시험 및 비교 시험 방법
가) 합성된 PCR 프라이머에 의한 PCR 증폭 시험
한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank,KCLB)에서 구입한 SiHa 세포주(HPV 16형, KCLB 30035 , Human squamous carcinoma, cervix)와 HeLa 세포주(HPV 18형 , KCLB 21550 , Human squamous carcinoma, cervix)에서 추출 및 정제된 DNA를 주형DNA로 사용하였다. 상기에서 정제된 HPV 16형과 HPV 18형의 DNA를 주형으로하고 표 2의 프라이머를 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 ㈜바이오니아 사에 합성 의뢰하여 구입하였다. PCR 실험은 ㈜바이오니아 사로부터 구입한 PCR 완충용액(buffer) 10㎕, 1.5mM MgCl2 , 250uM dNTP , 30mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH9.0), Taq 중합효소 (1unit) 와 프라이머 1㎕ ( 10pmol/㎕), 증류수 7㎕ , 주형 DNA 1㎕로 구성된 반응액을 94℃에서 5분간 1회, 94℃ 1분, - 45℃ 45초 및 - 72℃ 1분으로 이루어진 1 cycle을 35회 반복, 72℃에서 5분간 1회의 조건으로 진행하였으며, 최종반응액 5㎕를 DNA 스탠더드 마커( size standard maker)와 함께 2% 아가로스 겔(agarose gel)에 부과하여 전기영동하였다. 이때 전기영동 겔의 염색은 0.00005% 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide) 용액으로 행하였으며 겔의 각 경로 상에서 출현한 밴드의 유효 여부는 UV 를 이용하여 확인하였다.
Primer명 염기서열 (5'-3')
Forward GATGGTGATATGGTAGATACAGGATTT (염기서열 13)
Cy5-Reverse CY5-CCTAGTGGCTCTATGGTAACCTCTGACGC (염기서열 14)
나) PCR 결과물을 이용한 교잡반응 시험 방법
상기에서 PCR 을 통해 합성된 형광부착된 표적 유전자와 교잡반응을 위하여 1.5 ㎖ 튜브에 형광이 부착된 표적 유전자 5 ㎕와 BMT hyb-mixA 55 ㎕ 비율로 혼합용액을 만들었다. 이를 100℃ 물에서 3 분 동안 가열하고, 얼음 위에서 3 분간 방치하여 냉각시킨 후, 60 ㎕의 혼합용액을 실시예 3에서 제조된 교잡반응용 챔버가 부착된 유리 슬라이드에 주입하였다. 유리 슬라이드를 시험조 하나는 습도가 유지되는 항온 오븐에서 50℃에서 30 분 동안 교잡반응시키고 다른 실험조는 상온 (20℃~30℃)에서 30분 동안 교잡반응을 시켰다. 교잡반응이 끝난 유리 슬라이드를 상온(20℃~30℃)에서 BMT Wa-B-2 (4xSSC)용액으로 2 분간씩 2 회 반복하여 세척하였다. 건조시킨 뒤 마이크로 어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. 실제 결과는 도 3a 와 도 3b 에 나타난 결과와 같다.
실시예 5
프라이머와의 거리에 따른 올리고 DNA 칩의 검출 효율 비교 실험
프라이머와의 거리에 따른 DNA 칩의 검출 효율 비교 실험을 위해서 표 3에 나타난 6종류의 연속된 9개의 구아닌 염기를 가진 올리고DNA를 33.75 pmol/㎕ 로 BMT 스폿팅 (spotting) 용액에 녹여서 고정화 용액을 제조하였다. 상기 고정화 용액을 제네틱스 (Genetics) 마이크로어레이 장치 (영국)를 사용하여, 실시예 3과 같은 방식으로 표 3의 유전자탐침들을 도 4에 제시된 형태로 스폿팅하여 칩을 제조하였다.
탐침명 염기서열 (5'-3') 설명
16+0 GGG GGG GGG T TCA AAT TAT TTT CCT ACA (염기서열 15) Split 위치에서 0mer떨어짐 0mer
16+3 GGG GGG GGG C AGT TCA AAT TAT TTT CCT (염기서열 16) Split 위치에서 3mer떨어짐 +3mer
16+6 GGG GGG GGG GCC AGT TCA AAT TAT TTT (염기서열 17) Split 위치에서 6mer떨어짐 +6mer
16+9 GGG GGG GGG TTA GCC AGT TCA AAT TAT (염기서열 18) Split 위치에서 9mer떨어짐 +9mer
16+12 GGG GGG GGG AAT TTA GCC AGT TCA AAT (염기서열 19) Split 위치에서 12mer떨어짐 +12mer
16+15 GGG GGG GGG CA AAT TTA GCC AGT TCA (염기서열 20) Split 위치에서 15mer떨어짐 +15mer
다음 실시예 4에서 사용된 것과 동일한 형광부착된 표적 유전자(HPV 타입 16)와 교잡반응을 위하여 1.5 ㎖ 튜브에 형광이 부착된 표적 유전자 5 ㎕와 BMT hyb-mixA 55 ㎕ 비율로 혼합용액을 만들었다. 이를 100℃ 물에서 3분 동안 가열하고, 얼음 위에서 3분간 방치하여 냉각시킨 후, 60 ㎕의 혼합용액을 교잡반응용 챔버가 부착된 유리 슬라이드에 주입하였다. 유리 슬라이드를 습도가 유지되는 항온 오븐에서 상온(20℃~30℃)에서 30분 동안 교잡반응을 시켰다. 교잡반응이 끝난 유리 슬라이드를 상온(20℃~30℃)에서 BMT Wa-B-2 (4xSSC)용액으로 2 분간씩 2 회 반복하여 세척하였다. 건조시킨 뒤 마이크로 어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. 실제 결과는 도4 에 나타난 결과와 같다. 각 스팟의 형광감도를 분석하면 (형광감도는 최저값 0 에서 최고값 65000으로 표현하였음) 탐침유전자의 위치가 프라이머로부터 6mer이상이 떨어지면 검출 효율이 약 1/2~1/3 수준으로 떨어지는 결과를 보여주고 있다. +3mer(52000)와 +6mer(25000)의 형광감도는 실제로 2배 이상 차이를 보이고 있다. 간략성을 위해 도면에는 표기되지 않은 +4mer(GGG GGG GGG CAG TTC AAA TTA TTT TCC)와 +5mer(GGG GGG GGG CCA GTT CAA ATT ATT TTC)의 형광감도는 각각 48000, 38000으로 +3mer(52000)와 +6mer(25000)의 중간정도의 형광감도를 보이는 것을 확인하였다. 이 결과에 따라 +5mer까지는 +6mer 이상의 프로브에 비해 높은 형광감도 즉 검출효율을 보이는 것을 알 수 있다.
실시예 6
HPV 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩 제작용 프로브 선별
가) HPV 올리고 뉴클레오티드 프로브의 설계
자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 종양원성(oncogenic) HPV DNA에 선택적으로 결합될 수 있는 유형 특이적 프로브로 사용될 수 있는 올리고 뉴클레오티드를 설계하였다. 우선 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)와 미국립 로스 알라모스 HPV 데이터베이스로부터 HPV-1a , -2a , -3 , -, -5 , -6b , -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -15, -16, -16r, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -35h, -36, -37, -38, -39, -40, -41, -42, -44, -45, -47, -48, -49, -50, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -60, -61, -63, -65, -66, -67, -68, -70, -72, -73, -74, -76, -77, -80 의 총 72가지 HPV 유형의 전 DNA 염기서열을 확보하였다. 확보한 DNA 서열을 각 그룹별 유형 특이적 염기서열을 선별한 다음, 실시예 3, 4, 5에서 확인된 결과를 토대로하여 유형별 특이도가 높은 탐침 유전자를 설계하였다.
나) 설계한 프로브의 선별 및 합성
설계과정에서 확보한 총 72가지의 다른 HPV 유형 중 국내 및 국외에서 발병률이 높은 HPV -16, -18, -31, -33, -35, -45, -51, -56, -58, - 59, -66, -68, -39 의 고위험군과 HPV -6, -11, -34, -40, -42 의 저위험군의 종양원성 HPV 유형과 특이적으로 결합할 수 있는 것에 우선순위를 두고 선택하였으며 탐침유전자의 서열번호 및 유형은 하기 표 4에 제시하였다.
염기서열(5'-3') HPV 유형
GGG GGG GGG T TCA AAT TAT TTT CCT ACA (염기서열 30) HPV-16
GGG GGG GGG GT GTG TAT TCT CCC TCT (염기서열 31) HPV-18
GGG GGG GGG AGT ACA TAC TTT CCT ACA (염기서열 32) HPV-31
GGG GGG GGG GT GCT TTT TTT CCC ACT (염기서열 33) HPV-33
GGG GGG GGG T ACT AGT TAT TTT CCT ACT (염기서열 34) HPV-35
GGG GGG GGG T GTG TAT TCC CCT TCT (염기서열 35) HPV-45
GGG GGG GGG TAT ATA TAC TCT GCT ACT (염기서열 36) HPV-51
GGG GGG GGG AGA GAA CCC CCT CCG AGT (염기서열 37) HPV-56
GGG GGG GGG GT GCA TTT TTT CCA ACT (염기서열 38) HPV-58
GGG GGG GGG CC AAC CCA GGC AGT TAT TTA (염기서열 39) HPV-59
GGG GGG GGG T CCT CCC AGT TCT GTA (염기서열 40) HPV-66
GGG GGG GGG GTG TAT GCC CCC TCG CC (염기서열 41) HPV-68
GGG GGG GGG CT GTA TAC TGC CCC TCT (염기서열 42) HPV-39
GGG GGG GGG AGG CAG TAT TTA TTA CTC CAC (염기서열 43) HPV-40
GGG GGG GGG AGT ATA TAT GTT AAC ACC (염기서열 44) HPV-6
GGG GGG GGG TCT GTA GCT ACT AGT ATT TAT GTA CAT ACA (염기서열 45) HPV-11
GGG GGG GGG GT GTG TTT TAT CCT ACT (염기서열 46) HPV-34
GGG GGG GGG CA GAC ATA ATT TAG GTA GTA GTA (염기서열 47) HPV-42
실시예 7
공통 증폭 부분을 이용한 포지티브 컨트롤 결정을 위한 염기 개수 결정 실험
각 HPV 타입의 특이도를 나타내는 프라이머부터의 +12mer(primer을 0으로하여 0로부터 5' 쪽으로 12mer)와 프라이머를 -5mer 부터 3mer씩 늘려서 29mer까지의 길이로 프라이머를 포함하는 각각의 탐침(프라이머를 포함하면서 0으로부터 3' 쪽으로 길이를 늘린 탐침유전자)을 고정화하여 HPV 타입 16과 HPV 타입 18의 PCR 결과물을 이용하여 각각 타입에 대해서 프라이머에 의해 영향을 받지 않는 특이성을 가지는 공통 증폭 부분을 이용한 포지티브 컨트롤 길이를 결정하기 위한 실험을 위해서 표5에 나타난 HPV 타입 16과 관련된 10종류의 연속된 9 개의 구아닌 염기를 가진 올리고DNA를 실시예3과 같은 방법으로 스폿팅하여 칩을 제조하였다.
탐침명 염기서열 (5'-3') 설명
16+0 GGG GGG GGG T TCA AAT TAT TTT CCT ACA (염기서열 15) Split 위치에서 0mer떨어짐 0mer
12+5 mer GGG GGG GGG TAT TTT CCT ACA CCT AG (염기서열 21) 공통시퀀스 17mer -5mer
12+8 mer GGG GGG GGG TAT TTT CCT ACA CCT AGT GG (염기서열 22) 공통시퀀스 20mer -8mer
12+11 mer GGG GGG GGG TAT TTT CCT ACA CCT AGT GGT TC (염기서열 23) 공통시퀀스 23mer -11mer
12+14 mer GGG GGG GGG TAT TTT CCT ACA CCT AGT GGT TCT AT (염기서열 24) 공통시퀀스 26mer -14mer
12+17 mer GGG GGG GGG TAT TTT CCT ACA CCT AGT GGT TCT ATG GT (염기서열 25) 공통시퀀스 29mer -17mer
12+20 mer GGG GGG GGG TAT TTT CCT ACA CCT AGT GGT TCT ATG GTT AC (염기서열 26) 공통시퀀스 32mer -20mer
12+23 mer GGG GGG GGG TAT TTT CCT ACA CCT AGT GGT TCT ATG GTT ACC TC (염기서열 27) 공통시퀀스 35mer -23mer
12+26 mer GGG GGG GGG TAT TTT CCT ACA CCT AGT GGT TCT ATG GTT ACC TCT GA (염기서열 28) 공통시퀀스 38mer -26mer
12+29 mer GGG GGG GGG TAT TTT CCT ACA CCT AGT GGT TCT ATG GTT ACC TCT GAT GC (염기서열 29) 공통시퀀스 41mer -29mer
다음 실시예 4에서 사용된 것과 동일한 형광부착된 표적 유전자(HPV 타입 16과 HPV 타입 18)와 교잡반응을 위하여 1.5 ㎖ 튜브에 형광이 부착된 표적 유전자 5 ㎕와 BMT hyb-mixA 55 ㎕ 비율로 혼합용액을 만들었다. 이를 100℃ 물에서 3 분 동안 가열하고, 얼음 위에서 3 분간 방치하여 냉각시킨 후, 60㎕의 혼합용액을 교잡반응용 챔버가 부착된 유리 슬라이드에 주입하였다. 유리 슬라이드를 습도가 유지되는 항온 오븐에서 상온 (25℃)에서 30분 동안 교잡반응을 시켰다. 교잡반응이 끝난 유리 슬라이드를 상온(25℃)에서 BMT Wa-B-2 (4xSSC)용액으로 2분간씩 2회 반복하여 세척하였다. 건조시킨 뒤 마이크로 어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. 도 5에 나타난 형광감도를 분석하면 -5mer~-29mer까지의 형광감도는 16번 관련된 프로브들이 부착된 칩에서는 모두 65000정도의 최대 형광감도를 보이고 있는데 비해 18번 관련된 프로브들이 부착된 유전자 칩에서는 -11mer 에서부터 65000정도의 감도를 보이고 -8mer 수준에서는 형광감도가 3000정도로 PCR에 사용된 프라이머 부분 혹은 PCR이 진행된 결과물에 포함된 프라이머 부분이 부착되지 않는다는 결과를 보여주고 있다. 즉 -8mer수준의 프라이머 염기서열과 같은 것을 사용하여도 서로 다른 PCR 결과물 도포에 의해 비특이적으로 형광이 나타날 가능성이 거의 없다는 것을 보여주고 있다. 이와 같은 결과에 따라 포지티브 컨트롤, 즉 PCR 진행되면 PCR 결과물이 부착되어 진행도를 나타낼 스팟은 -5mer~-8mer 길이를 포함하여 제작하게 되었고 -11mer는 형광 부착된 프라이머 혹은 프라이머의 길이가 길어진 PCR 결과물이 비특이로 결합될 가능성이 높아서 배제하였다. -8mer 보다 1mer 그리고 2mer 가 더 긴 Type 16의 -9mer (GGG GGG GGG TAT TTT CCT ACA CCT AGT GGT)와 -10mer(GGG GGG GGG TAT TTT CCT ACA CCT AGT GGT T)를 이용한 칩 실험에서도 실시예 4에서 사용된 것과 동일한 형광부착된 표적 유전자(HPV 타입 16과 HPV 타입 18)와 교잡반응을 진행했을 때 type 16인 경우 65000 수준의 형광이 나타났으며 type 18의 PCR 결과물을 도포한 경우 비특이적 형광이 각각 3000 수준으로 무시할만한 수준으로 나타나서 -10mer 까지가 비특이를 배제하고 높은 특이도로 type 16의 PCR 결과물이 부착되는 것을 확인하였다. Type 16의 PCR이 진행되지 않았다면 프라이머와 공통염기서열 길이에 따라 16과 18에서 동일한 결과가 나타날 것인데 두군데에서 다르게 나타난 결과는 type 16의 PCR이 진행된 결과물이 있어야만 -8mer 더 정확하게는 -10mer라는 프로브에 교잡반응하여 형광감도가 나타날 것이므로 -10mer 까지를 특정 유전형이 PCR 된 것을 확인하는 포지티브 컨트롤을 사용할 수 있다는 것을 보여주는 결과이다. 즉 종합하면 상기 실험은 프라이머로부터 각각의 바이러스 타입의 PCR 결과물에 대해서 특이성을 보이면서 형광이 부착된 프라이머에 의해서는 영향을 받지않으면서 각 타입에 대해서 선택적으로 발현하는 탐침의 길이를 결정하는 실험을 보여주고 있다.
실시예 8
공통 증폭 부분을 이용한 포지티브 컨트롤 결정 실험
가) 포지티브 컨트롤 결정을 위한 프로브 고정화
실시예 6에서 선별한 18종의 HPV 타입에 대해서 포지티브 컨트롤 결정을 위해 각 HPV 유형과 특이적으로 결합할 수 있는 부분으로 선택하여 표 6에 제시된 탐침유전자를 도 6의 형태로 유리슬라이드 위에 고정화하여 HPV 유형에 따라 특이적으로 발현하는 프로브를 선별하였다. 탐침유전자의 고정화는 실시예 3과 같은 방법으로 진행하였다.
탐침명 염기서열 ( 5'-3') 설명
PC16 ggg ggg ggg tat ttt cct aca cct agt gg (염기서열 48) Positive, 20mer
PC18 ggg ggg ggg tat tct ccc tct cct agt gg (염기서열 49) Positive, 20mer
PC31 ggg ggg ggg tac ttt cct aca cct agt gg (염기서열 50) Positive, 20mer
PC33 ggg ggg ggg ttt ttt ccc act cct agt gg (염기서열 51) Positive, 20mer
PC35 ggg ggg ggg tat ttt cct act cct agt gg (염기서열 52) Positive, 20mer
PC45 ggg ggg ggg tat tcc cct tct cct agt gg (염기서열 53) Positive, 20mer
PC51 ggg ggg ggg tac tct gct act cct agt gg (염기서열 54) Positive, 20mer
PC53 ggg ggg ggg tat gtt gct aca cct agt gg (염기서열 55) Positive, 20mer
PC56 ggg ggg ggg tat gtt gct acg cct agt gg (염기서열 56) Positive, 20mer
PC58 ggg ggg ggg ttt ttt cca act cct agt gg (염기서열 57) Positive, 20mer
PC59 ggg ggg ggg tat tcc cct tcc cct agt gg (염기서열 58) Positive, 20mer
PC66 ggg ggg ggg tat gtt gct act cct agt gg (염기서열 59) Positive, 20mer
PC68 ggg ggg ggg tat gcc ccc tcg cct agt gg (염기서열 60) Positive, 20mer
PC6 ggg ggg ggg tat gtt aac acc cct agt gg (염기서열 61) Positive, 20mer
PC11 ggg ggg ggg tat gta cat aca cct agt gg (염기서열 62) Positive, 20mer
PC34 ggg ggg ggg ttt tat cct act cct agt gg (염기서열 63) Positive, 20mer
PC42 ggg ggg ggg tat tat cct acc cct agt gg (염기서열 64) Positive, 20mer
PC70 ggg ggg ggg tat tcc cct tcc cct agt gg (염기서열 65) Positive, 20mer
나) 세포로부터 DNA 추출 및 PCR에 의한 HPV 유전자의 증폭
자궁경부세포 채취 솔을 이용하여 자궁경부로부터 세포를 채취하여 5ml PBS 보존액이 담겨져 있는 15ml 튜브에 넣고 2분 동안 강력하게 교반하여 솔에 붙어 있는 세포가 보존액으로 떨어져 나오도록 한다. 원심분리기에서 3,000g로 10분간 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거한다. 세포는 혈청 분리관을 사용하여 1.5ml 원심분리 튜브로 옮긴 후, 여기에 100ul 세포 용해완충용액 (10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2, 0.5% Tween20, 200ul/ul proteinase K, pH 8.3)을 첨가하여 55도 항온조에서 2시간 동안 가온한 후 95도에서 10분간 더 가온하여 프로테이나제(proteinase) K의 활성을 제거하였다. 이렇게 추출 및 정제된 DNA를 주형DNA로 사용하여 표 2 의 프라이머를 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 ㈜바이오니아 사에 합성 의뢰하여 구입하였다. PCR 실험은 ㈜바이오니아 사로부터 구입한 PCR 완충용액(buffer) 10㎕, 1.5mM MgCl2, 250uM dNTP, 30mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH9.0), Taq 중합효소 (1unit) 와 프라이머 1㎕ ( 10pmol/㎕증류수 7㎕, 주형 DNA 1㎕로 구성된 반응액을 94℃에서 5분간 1회, 94℃ 1분, - 45℃ 45 초 및 - 72℃ 1분으로 이루어진 1 cycle을 35회 반복, 72℃에서 5분간 1회의 조건으로 진행하였으며, 최종반응액 5 ㎕를 DNA 스탠더드 마커(size standard maker)와 함께 2% 아가로스 겔(agarose gel)에 부과하여 전기영동하였다. 이때 전기영동 겔의 염색은 0.00005% 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 용액으로 행하였으며 겔의 각 경로 상에서 출현한 밴드의 유효 여부는 UV 를 이용하여 확인하였다.
다) PCR 결과물을 이용한 교잡반응 시험 방법
형광부착된 표적 유전자와 교잡반응을 위하여 1.5 ㎖ 튜브에 형광이 부착된 표적 유전자 5 ㎕와 BMT hyb-mixA 55 ㎕ 비율로 혼합용액을 만들었다. 이를 100℃ 물에서 3 분 동안 가열하고, 얼음 위에서 3 분간 방치하여 냉각시킨 후, 60 ㎕의 혼합용액을 상기 실시예에서 제조된 교잡반응용 챔버가 부착된 유리 슬라이드에 주입하였다. 유리 슬라이드를 상온(20℃~30℃)에서 30분 동안 교잡반응을 시켰다. 교잡반응이 끝난 유리 슬라이드를 상온(20℃~30℃)에서 BMT Wa-B-2 (4xSSC)용액으로 2 분간씩 2 회 반복하여 세척하였다. 건조시킨 뒤 마이크로 어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. 실제 결과는 도 6에 나타내었으며, 각 HPV 유형의 PCR 결과물을 도포하였을 때 PC 프로브에서 발현되는 것은 표 7의 내용과 같다. 상기 결과는 PC35, PC45, PC56, PC68 의 4종의 프로브가 HPV -16, -18, -31, -33, -35, -45, -51, -56, -58, -59, -66, -68, -39, -40, -34, -42 에 대해서 포지티브 컨트롤으로 사용이 가능하며 PC6 과 PC11 이 HPV -6, -11 에 대해서 포지티브 컨트롤으로 가능함을 보여주는 결과로 PC35, PC45, PC56, PC68 4종의 혼합을 PC1로 하고 PC6, PC11 2종의 혼합을 PC2로 하여 18종의 HPV 유형에 대해서 두 개의 포지티브 컨트롤으로 각 HPV 유형에 대해서 PCR 이 진행됨을 확인할 수 있을 보여 주는 결과이다.
탐침명 발현 HPV 유형
PC16 16,31,35,42
PC18 18,45
PC31 16,31,35,42
PC33 33,35,58
PC35 16,31,33,35,58,66,34,42
PC45 18,45,59,70,66
PC51 31,33,35,51,56,58,66,34,53
PC53 16,31,66,53,56
PC56 51,56,66,53
PC58 33,34,35
PC59 45,59,70
PC66 35,51,5658,66,34,53
PC68 18,45,59,68,70,56
PC6 6
PC11 11
PC34 16,31,33,35,51,58,66,34,42
PC42 34,42
PC70 45,59,70
실시예 9
HPV 올리고유전자칩의 제작과 PCR 결과물을 이용한 결과확인 및 PCR 없이 주형유전자를 직접 분석하는 결과확인 실험
가) HPV 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩의 제작
실시예 6에서 선별한 18종의 HPV 유형(표 4)과 실시예 8에서 선별한 2개의 포지티브 컨트롤, 1 개의 하이브리다이제이션 컨트롤 및 1 개의 네거티브 컨트롤(표 8)을 도 7에 제시된 형태로 실시예 3과 같은 방법으로 스폿팅하여 HPV 올리고유전자칩을 제작하였다.
탐침명 염기서열 ( 5'-3') 설명
HC ggg ggg ggg ttt aca cct agt ggc tct atg gtg tcc tct Hybridization control
NC ggg ggg ggg aaa gct gct gct cgt cgt cgt cgt Negative control
PC1 PC35: PC45: PC56: PC68 각 25% 혼합 Positive control
PC2 Pc6: PC11:NC = 25%:25%:50% 로 혼합 Positive control
PC35 ggg ggg ggg tat ttt cct act cct agt gg (염기서열 52) Positive, 20mer
PC45 ggg ggg ggg tat tcc cct tct cct agt gg (염기서열 53) Positive, 20mer
PC56 ggg ggg ggg tat gtt gct acg cct agt gg (염기서열 56) Positive, 20mer
PC68 ggg ggg ggg tat gcc ccc tcg cct agt gg (염기서열 60) Positive, 20mer
PC6 ggg ggg ggg tat gtt aac acc cct agt gg (염기서열 61) Positive, 20mer
PC11 ggg ggg ggg tat gta cat aca cct agt gg (염기서열 62) Positive, 20mer
나) PCR 결과물 이용한 HPV 유형 확인 실험
자궁경부세포 채취 솔을 이용하여 자궁경부로부터 세포를 채취하여 5ml PBS 보존액이 있는 15ml 튜브에 넣고 2분 동안 강력하게 교반하여 솔에 붙어 있는 세포가 보존액으로 떨어져 나오도록 한다. 원심분리기에서 3,000g로 10분간 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거한다. 세포는 혈청 분리관을 사용하여 1.5ml 원심분리 튜브로 옮긴 후, 여기에 100ul 세포 용해완충용액 (10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2, 0.5% Tween20, 200ul/ul proteinase K, pH 8.3)을 첨가하여 55도 항온조에서 2시간 동안 가온한 후 95도에서 10분간 더 가온하여 프로테이나제 K의 활성을 제거하였다. 이렇게 추출 및 정제된 DNA를 주형DNA로 사용하여 상기 실시예 8과 같은 방법으로 칩에 도포하여 결과를 확인하였다. 도 7은 본 실시예에서 사용된 실샘플을 대상으로 본 발명에서 합성한 18조의 변형된 프로브를 사용하여 상온 교잡 반응을 실시한 사진 및 그 해석 결과이다. 각각의 도면에서 PC1과 PC2는 포지티브 컨트롤(positive control)이고 HC(hybridization control)는 교잡반응 유무를 확인하기 위한 컨트롤이다. 도면에서 분명히 알 수 있는 것과 같이 각각의 HPV 유형을 함유하고 있는 샘플에 대해서는 특이적으로 결합하는 탐침유전자가 스포팅된 영역과 PC 그리고 HC 에서만 교잡반응이 일어나며 아무런 비특이적 결합반응이 일어나지 않았음을 확인하였다.
다) PCR없이 주형유전자를 직접 확인 실험을 위한 주형 DNA 샘플 준비
자궁경부세포 채취 솔을 이용하여 자궁경부로부터 세포를 채취하여 5ml PBS 보존액이 담겨져 있는 15ml 튜브에 넣고 2분 동안 강력하게 교반하여 솔에 붙어 있는 세포가 보존액으로 떨어져 나오도록 한다. 원심분리기에서 3,000g로 10분간 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거한다. 세포는 혈청 분리관을 사용하여1.5ml 원심분리 튜브로 옮긴 후, 여기에 100ul 세포 용해완충용액 (10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2, 0.5% Tween20, 200ul/ul proteinase K, pH 8.3)을 첨가하여 55도 항온조에서 2시간 동안 가온한 후 95도에서 10분간 더 가온하여 프로테이나제 K의 활성을 제거하였다. 이후 ㈜바이오니아사의 Binding column을 이용하여 추출된 주형DNA를 정제한 후 50㎕의 Elution 용액으로 녹여 주형DNA를 준비하였다. 정제된 주형DNA는 Spectrophotometer (기기명: Nanodrop, 제조사: Nanodrop)를 이용하여 정량하였다. 아래 표 9는 정제된 DNA를 스펙트로포토미터(Spectrophotometer)로 정량한 결과이다.
HPV type 측정치 (1회)ng/ul 측정치 (2회)ng/ul 측정치 (3회)ng/ul 평균농도ng/ul
1 Type 16 80.1 79.8 83.5 81.1
스펙트로포토미터(Spectrophotometer)로 정량한 결과
라) PCR없이 주형유전자를 직접 이용한 교잡반응 시험 방법
세포로부터 추출된 주형 DNA를 직접 교잡반응하여 형광을 검출하기 위하여 1.5 ㎖ 튜브에 형광이 부착된 DNA 올리고머(Cy5-Reverse: CY5-CCTAGTGGCTCTATGGTAACCT CTGACGC)를 6pmol/ul 농도를 1㎕와 상기 실시예 9의 (다)에서 준비된 주형 DNA를 각각 농도 20ng/㎕와 60ng/㎕로 묽힌 용액 18㎕와 BMT hyb-mixA 41㎕ 비율로 혼합하여 전체 60㎕ 의 반응용액을 제조하였다. 이를 94℃에서 5분간, 45℃에서 1시간 동안 방치한 뒤 얼음 위에서 3분간 방치하여 냉각시킨 후, 60 ㎕의 혼합용액을 상기 실시예 9의 (가)에서 제조된 교잡반응용 챔버가 부착된 유리 슬라이드에 주입하였다. 유리 슬라이드를 상온(20℃~30℃)에서 1시간 동안 교잡반응을 시켰다. 교잡반응이 끝난 유리슬라이드를 상온(20℃~30℃)에서 BMT Wa-B-2 (4xSSC)용액으로 2 분간씩 2 회 반복하여 세척하였다. 건조시킨 뒤 마이크로 어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. 도 10은 PCR없이 주형 유전자를 형광부착된 DNA올리고머와 결합시킨 물질을 이용하여 형광 판독이 가능한 수준의 주형 DNA의 농도 및 탐침유전자의 설계에 따른 판독효율을 확인한 실험결과이다.
60ng/㎕ 농도의 주형유전자가 포함된 반응용액을 도포하였을 때 HC 스팟감도는 65000, type 16 프로브 위치(도 9의 B 처럼 Primer 의 끝부분(0, 3' 위치)부터 시작하는 탐침유전자 임)의 형광감도는 42000 이었고, 도면 9의 A처럼 프라이머의 끝부분(-8)부터 시작하는 탐침유전자인 PC1 스팟의 형광감도는 61000으로 발현되었으며 다른 스팟들의 경우 형광감도가 5000 이하로 나타나는 것을 확인하였다. 20ng/㎕ 농도의 주형 DNA를 도포하였을 때 HC 스팟감도는 65000, type 16 프로브 위치(+0)의 형광감도는 10000 이었고, PC1 스팟(-8)의 형광감도는 57000으로 발현되었으며 다른 위치의 스팟 형광감도는 2000 이하로 판독이 되지 않음을 확인하였다. 또한, 프라이머의 위치에서 +15 위치에서 시작되는 염기서열 20의 GGG GGG GGG CA AAT TTA GCC AGT TCA 탐침유전자가 고정화되어 있는 유전자칩 상에 60ng/㎕ 농도의 주형 DNA를 도포하였을 경우에는 형광이 전혀 발현하지 않는 것을 확인하였다. 상기결과는 프라이머의 끝부분(0~-8mer)부터 시작하는 탐침유전자의 경우에는 20ng/㎕ 농도까지 PCR 증폭없이 검출이 가능하다는 것을 보여주고 있으며 이전의 탐침설계방법과 유사하게 프라이머, 여기서는 형광부착된 DNA 올리고머로부터 멀어지면(+15) 형광감도가 놀랍게 감소한다는 것으로 보여주는 결과이다. 즉 PCR 결과물을 이용하여 교잡반응 할 때는 프라이머 여기서는 형광부착된 DNA 올리고머와 겹치거나(-8mer) 가까우면(0mer) 형광이 획기적으로 증폭되는 현상을 확인할 수 있다. 실시예 7의 결과와 비교하면 기존의 프로브에 비해 +5mer~-10mer가 형광부착된 DNA 올리고머를 이용한 주형 유전자 직접 교잡반응에서 기존의 프로브에 비해 높은 효율로 교잡반응을 진행한다고 사료된다.
실시예 3~실시예 9에서 사용된 고정화, 세척 등에 사용된 용액들의 조성은 다음과 같다.
BMT 스폿팅 용액 (4xSSC, 15% 글리세롤, 1x PBS)
BMT Wa-A-1 (2xSSC, 0.1% SDS)
BMT Wa-A-2 (0.1x SSC)
BMT 블록킹 용액 (밀크카제인 5% 수용액)
BMT hyb-mixA (4xSSC, 0.01% SDS, 25% formamide, 1x PBS)
BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)
BMT Wa-B-2 (4xSSC)
발명의 효과
본 발명으로 상온(20℃~30℃) 교잡반응에 필수적인 탐침 유전자 설계기술과 설계된 탐침 유전자를 고정화한 유전자칩, 유전형 판별기준을 확보하기 위한 포지티브 컨트롤용 탐침 설계기술 그리고 혼합 포지티브 컨트롤 탐침유전자를 이용한 유전형 판별기준 확보 그리고 이를 모두 적용하여 제조한 상온 교잡반응을 가능하게 하는 HPV 유전형 분석용 탐침설계기술 및 설계된 탐침을 고정화한 HPV 유전형 분석용 유전자칩 등의 설계 및 제조기술을 발명하였다.
세계최초로 제안된 상온 교잡반응을 이용하는 유전자 칩은 기존의 유전자 칩에서 문제시 되던 민감도와 특이도를 획기적으로 개선한 발명으로 사료된다. 또 본 발명에서 제시된 탐침 설계기술을 이용하여 새롭게 HPV 유전형 분석용 탐침 18종을 개발하였으며 설계된 탐침 유전자군과 유전자 칩상의 결과를 판단하는 기준이 될 포지티브 컨트롤용 표준탐침 설계기술을 개발하여 적용된 상온 교잡반응을 이용한 HPV 유전형 분석용 유전자 칩과 그 제조기술을 확보하여 정확하고 신속한 상온에서 진행되는 유전형 분석기술을 개발하여 세계 최초로 상온에서 작동하는 유전자 칩 설계와 제조분야에 기여할 중요한 발명으로 사료된다.
도 1 은 연속된 구아닌 염기를 인식하는 아미노캘릭스아렌 및 이민캘릭스아렌의 단분자층으로 도포된 유리 슬라이드 제조를 보여주는 모식도이다.
도 2 는 아민기가 부착된 유리기질 표면에 도 1 의 아미노캘릭스아렌 유도체 또는 이민캘릭스아렌 유도체를 단분자층으로 결합한 후, 연속된 구아닌 염기를 가진 탐침 유전자의 올리고 DNA 를 고정화 하여 유전자 칩을 제조하는 모식도이다.
도 3a 은 탐침 유전자 설계에서 가장 우수한 교잡반응 결과를 보이는 탐침은 0 위치에서 염기서열이 시작되어 총 길이가 17mer 에서 23mer 사이의 탐침이라는 것을 나타내는, HPV 16형과 HPV 18형의 HPV 표준 주형의 PCR 결과물을 이용하여 반복해서 진행한 실제 실험 결과이다.
도 3b 는 기존의 고온 교잡반응용 HPV 탐침 유전자 칩 및 상온 교잡반응용 HPV 탐침 유전자 칩상에 동일한 주형을 이용하여 얻어진 PCR 결과물을 동일한 양을 도포하여 HPV 16형과 HPV 18형에 대한 유전형 분석을 진행한 실제 실험결과이다.
도 4 는 상온 교잡반응용 탐침 설계기술개발을 위하여 프라이머의 끝 부분 부터 0~+3 개가 떨어진 곳에서 탐침 유전자의 염기가 시작되어 특정 염기 길이를 가지게 설계하면 최적의 신호를 나타낸다는 것을 보여주는 실제 실험결과이다.
도 5 는 포지티브 컨트롤을 결정하는 방법 및 결정된 포지티브 컨트롤을 보여주는 실제 실험결과이다.
도 6 은 특이적 결합과 비특이적 결합에 의해 나타나는 신호를 구분하는 기준을 정하고 정확한 유전형 분석(gneotyping)을 진행하기 위해 포지티브 컨트롤이 라는 표준탐침을 설계하고 결정하는 과정을 보여주고 있다.
도 7 은 도 6에서 결정된 혼합형 포지티브 컨트롤 2종과 표 8의 네거티브 컨트롤(Negative control, 비특이가 나타나는 정도를 확인하는 위치) 그리고 하이브리다이제이션 컨트롤 (Hybridization control, 형광부착된 프라이머가 부착되는 위치로 PCR 결과물의 양이 일정하게 들어가는지를 확인하는 위치) 그리고 표 4의 HPV 18종의 탐침유전자를 고정화 하여 제조된 상온 교잡반응용 유전자 칩에 각 유형의 표준주형을 표 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 방법으로 증폭한 결과물을 도포하여 반복적으로 얻어진 결과이다.
도 8은 PCR에 사용된 그리고 PCR 결과물에 결합된 프라이머와 겹치는 유전자의 수가 8 개인 -8의 위치에서 시작하게 설계된 탐침유전자(probe)와 프라이머가 끝나는 부분부터 시작되는, 즉 프라이머와 떨어진 염기의 수가 0 개인 0 의 위치에서 시작되게 설계된 탐침유전자 그리고 프라이머와 떨어진 염기의 수가 3 개인 +3에서 시작되게 설계된 탐침유전자를 보여주는 모식도이다.
도 9는 주형의 일부분의 유전형과 일치되게 설계되어 주형 유전자에 결합될 올리고유전자와 결합된 주형유전자를 보여주는 모식도이다.
도 10은 16 형의 주형 유전자를 형광 부착된 DNA 올리고머과 결합시킨 뒤 올리고머의 3'-말단 위치를 0으로 하여 -8mer 와 0mer 그리고 +15mer가 고정화된 칩상에 도포하여 PCR 없이 주형유전자를 직접 교잡반응하여 얻은 형광스캔 결과이다.
<110> BIOMETRIX TECHNOLOGY INC. <120> NOVEL METHOD OF DESIGNING DNA PROBE CHIP FOR ROOM TEMPERATURE HYBRIDIZATION AND THE DNA PROBE CHIP <130> Y08KP-046 <150> KR2007-0117736 <151> 2007-11-19 <160> 65 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 1 gggggggggt tattttccta ca 22 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 2 ggggggggga attattttcc taca 24 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 3 gggggggggc aaattatttt cctaca 26 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 4 gggggggggt tcaaattatt ttcctaca 28 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 5 ggggggggga gttcaaatta ttttcctaca 30 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 6 gggggggggc cagttcaaat tattttccta ca 32 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 7 ggggggggga ttctccctct 20 <210> 8 <211> 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agttcaaatt attttcct 28 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 17 gggggggggg ccagttcaaa ttatttt 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 18 gggggggggt tagccagttc aaattat 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 19 ggggggggga atttagccag ttcaaat 27 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 20 gggggggggc aaatttagcc agttca 26 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 21 gggggggggt attttcctac acctag 26 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 22 gggggggggt attttcctac acctagtgg 29 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 23 gggggggggt attttcctac acctagtggt tc 32 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 24 gggggggggt attttcctac acctagtggt tctat 35 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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29 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 51 gggggggggt tttttcccac tcctagtgg 29 <210> 52 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 52 gggggggggt attttcctac tcctagtgg 29 <210> 53 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 53 gggggggggt attccccttc tcctagtgg 29 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 54 gggggggggt actctgctac tcctagtgg 29 <210> 55 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 55 gggggggggt atgttgctac acctagtgg 29 <210> 56 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 56 gggggggggt atgttgctac gcctagtgg 29 <210> 57 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 57 gggggggggt tttttccaac tcctagtgg 29 <210> 58 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 58 gggggggggt attccccttc ccctagtgg 29 <210> 59 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 59 gggggggggt atgttgctac tcctagtgg 29 <210> 60 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 60 gggggggggt atgccccctc gcctagtgg 29 <210> 61 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 61 gggggggggt atgttaacac ccctagtgg 29 <210> 62 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 62 gggggggggt atgtacatac acctagtgg 29 <210> 63 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 63 gggggggggt tttatcctac tcctagtgg 29 <210> 64 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 64 gggggggggt attatcctac ccctagtgg 29 <210> 65 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control <400> 65 gggggggggt attccccttc ccctagtgg 29

Claims (35)

  1. 프라이머의 3'-말단부위를 기준 0 위치로 하여, 프라이머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 10 개 포함하는 -10 의 위치부터 프라이머의 3'-말단부위로부터 5 개의 염기서열이 떨어진 +5 위치 사이의 -10~+5 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법.
  2. 제 1 항에 있어서,-8~+3 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 탐침 유전자를 자기조립단분자층(Self-assembled monolayer, SAM) 상에 부착하는 것을 포함하는, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 자기조립단분자층은 아민-변성된 유리기판, 유리섬유, 실리콘웨이퍼 및 용융석영(fused silica) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고체기질 상에 하기 화학식 1 의 아미노캘릭스아렌 유도체가 부착되어 형성된 것인, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법:
    [화학식 1]
    Figure 112008067217588-pat00005
    [식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, -COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및-CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 C6H5 는 페닐기로 정의됨)].
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 자기조립단분자층은 아민-변성된 유리기판, 유리섬유, 실리콘웨이퍼 및 용융석영(fused silica) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고체기질 상에 하기 화학식 2 의 이민캘릭스아렌 유도체가 부착되어 형성된 것인, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법:
    [화학식 2]
    Figure 112008067217588-pat00006
    [식 중, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, -COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및-CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 C6H5 는 페닐기로 정의됨)].
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 탐침 유전자의 길이가 15~30 mer 인 것인 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 탐침 유전자의 길이가 17~23 mer 인 것인 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 탐침 유전자의 5'-말단에 7~15개의 연속된 구아닌 염기가 추가로 부착되어 있는 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법.
  12. 주형유전자와 일치하는 염기서열을 가진 DNA 올리고머의 3'-말단부위를 기준 0 위치로 하여, 상기 올리고머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 10 개 포함하는 -10의 위치부터 상기 올리고머의 3'-말단부위로부터 5 개의 염기서열이 떨어진 +5 위치 사이의 -10~+5 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법.
  13. 제 12 항에 있어서, -8~+3 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제 12 항에 있어서, 상기 탐침 유전자를 자기조립단분자층(Self-assembled monolayer, SAM) 상에 부착하는 것을 포함하는, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 자기조립단분자층은 아민-변성된 유리기판, 유리섬유, 실리콘웨이퍼 및 용융석영(fused silica) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고체기질 상에 하기 화학식 1 의 아미노캘릭스아렌 유도체가 부착되어 형성된 것인, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법:
    [화학식 1]
    Figure 112008067217588-pat00007
    [식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, -COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및-CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 C6H5 는 페닐기로 정의됨)].
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 자기조립단분자층은 아민-변성된 유리기판, 유리섬유, 실리콘웨이퍼 및 용융석영(fused silica) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고체기질 상에 하기 화학식 2 의 이민캘릭스아렌 유도체가 형성된 것인, 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법:
    [화학식 2]
    Figure 112008067217588-pat00008
    [식 중, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및-CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 C6H5 는 페닐기로 정의됨)].
  20. 제 12 항에 있어서, 상기 탐침 유전자의 길이가 15~30 mer 인 것인 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 탐침 유전자의 길이가 17~23 mer 인 것인 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 탐침 유전자의 5'-말단에 7~15개의 연속된 구아닌 염기가 추가로 부착되어 있는 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩의 설계방법.
  23. 제 1 항의 설계방법에 따라 설계된 탐침 유전자 칩에 PCR 결과물을 도포하 여, 상온에서 교잡반응을 진행하여 유전형을 분석하는 방법.
  24. 제 7 항 또는 제 8 항의 설계방법에 따라 설계된 탐침 유전자 칩에 PCR 결과물을 도포하여, 상온에서 교잡반응을 진행하여 유전형을 분석하는 방법.
  25. 제 12 항의 설계방법에 따라 설계된 탐침 유전자 칩에 주형유전자와 일치하는 염기서열을 갖는 15~30 mer 의 DNA 올리고머가 결합된 주형유전자를 도포하여, 상온에서 교잡반응을 진행하여 유전형을 분석하는 방법.
  26. 제 18 항 또는 제 19 항의 설계방법에 따라 설계된 탐침 유전자 칩에 주형유전자와 일치하는 염기서열을 갖는 15~30 mer 의 DNA 올리고머가 결합된 주형유전자를 도포하여, 상온에서 교잡반응을 진행하여 유전형을 분석하는 방법.
  27. 삭제
  28. 제 1 항의 설계방법에 따라 설계된 HPV 유전형 분석(genotyping)에 사용되는 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩으로서, 상기 탐침 유전자가 염기서열 30 내지 47 로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 것인 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 탐침 유전자가 자기조립단분자층(Self-assembled monolayer, SAM) 상에 부착되는 것인 상온 교잡반응용 탐침 유전자 칩.
  30. 프라이머의 3'-말단부위를 기준 0 위치로 하여, 프라이머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 10 개 포함하는 -10의 위치부터 프라이머 영역의 염기서열과 겹치는 염기를 3 개 포함하는 -3의 위치 사이의 -10~-3의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 포지티브 컨트롤용 핵산 탐침의 설계방법.
  31. 제 30 항에 있어서, -8~-5 의 염기서열에서 탐침 유전자가 시작되도록 설계하는 것을 포함하는, 포지티브 컨트롤용 핵산 탐침의 설계방법.
  32. 제 30 항의 설계방법에 따라 설계된 포지티브 컨트롤용 핵산 탐침으로서, 상기 핵산이 염기서열 52, 53, 56 및 60~62 로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 가지며, HPV 유전형 분석(genotyping)에 사용되는 것인, 포지티브 컨트롤용 핵산 탐침.
  33. 유전형 분석용 탐침유전자가 고정화된 유전자 칩에서 제 32 항의 포지티브 컨트롤용 핵산 탐침을 고정화하여 유전형을 분석하는 방법.
  34. 삭제
  35. 제 23 항 또는 제 25 항에 있어서, 고정화된 DNA 프로브를 갖는 DNA 칩 상에 RNA 또는 DNA 용액을 도포하여 얻어진 결합된 유전자의 총량을 측정한 결과를 분석하기 위한 방법이, 형광 분광법 또는 가시광선 분광법을 포함하는 분광법인 방법.
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