KR100883763B1 - 아미노캘릭스아렌 유도체와 이민캘릭스아렌 유도체의단분자층으로 변성된 유리섬유 및 그의 제조방법과, 변성된유리섬유에 유전자를 고정화한 유리섬유 및 그의제조방법, 그리고 유전자 고정화된 유리섬유를 이용한유전자 형분석용 스트립 제조방법 - Google Patents

아미노캘릭스아렌 유도체와 이민캘릭스아렌 유도체의단분자층으로 변성된 유리섬유 및 그의 제조방법과, 변성된유리섬유에 유전자를 고정화한 유리섬유 및 그의제조방법, 그리고 유전자 고정화된 유리섬유를 이용한유전자 형분석용 스트립 제조방법 Download PDF

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KR100883763B1 KR1020080022048A KR20080022048A KR100883763B1 KR 100883763 B1 KR100883763 B1 KR 100883763B1 KR 1020080022048 A KR1020080022048 A KR 1020080022048A KR 20080022048 A KR20080022048 A KR 20080022048A KR 100883763 B1 KR100883763 B1 KR 100883763B1
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    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 아미노캘릭스아렌 유도체나 및 하기 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체를 이용하여 도 1 및 2와 같이 유리섬유 표면에 단분자층으로 결합시켜 제조한 유리섬유 제조방법, 상기 방법으로 제조된 유리섬유에 도 4와 같이 연속된 구아닌 염기를 가진 올리고유전자를 고정화 하여 제조된 올리고유전자가 고정화된 유리섬유 제조방법, 및 이 방법에 따라 제조된 다양한 올리고유전자가 고정화된 유리섬유 상에서 다양한 유전형 분석을 가능하게 하는 속성 유전형 키트 제조기술에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112008075518468-pat00001
[상기 식 중에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 -C6H5 는 페닐기로 정의됨)].
[화학식 2]
Figure 112008075518468-pat00002
[상기 식 중에서, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 -C6H5 는 페닐기로 정의됨)].
아미노캘릭스아렌 유도체, 이민캘릭스아렌 유도체, 자기조립 단분자층, 올리고유전자 고정화, 유리섬유 변성

Description

아미노캘릭스아렌 유도체와 이민캘릭스아렌 유도체의 단분자층으로 변성된 유리섬유 및 그의 제조방법과, 변성된 유리섬유에 유전자를 고정화한 유리섬유 및 그의 제조방법, 그리고 유전자 고정화된 유리섬유를 이용한 유전자 형분석용 스트립 제조방법 {MODIFIED GLASS FIBERS WITH MONOLAYERS OF AMINOCALIXARENE DERIVATIVES AND IMINECALIXARENE DERIVATIVES, AND OLIGO-DNA MODIFIED GLASS FIBERS BY FIXING OLIGO-DNA'S TO THE MONOLAYERS, AND THE PREPARATION METHOD OF GENOTYPING STRIPS USING THE OLIGO-DNA MODIFIED GLASS FIBERS}
본 발명은 아미노캘릭스아렌 유도체나 및 이민캘릭스아렌 유도체를 이용하여 유리섬유 표면에 단분자층으로 결합시켜 제조한 유리섬유 제조방법, 상기 방법으로 제조된 유리섬유에 연속된 구아닌 염기를 가진 올리고유전자를 고정화 하여 제조된 올리고유전자가 고정화된 유리섬유 제조방법, 및 이 방법에 따라 제조된 다양한 올리고유전자가 고정화된 유리섬유 상에서 다양한 유전형 분석을 가능하게 하는 속성 유전형 키트 제조기술에 관한 것이다.
인간게놈 연구팀과 셀레라사에 의해 경쟁적으로 진행되던 인간 게놈 프로젝트 (Human Genome Project)가 2000년에 그 유전자 정보지도가 완성되면서, 유전자 의 기능연구와 변이 유전자 검색 및 이 정보를 이용하여 제조된 다양한 유전형 분석이 가능한 유전자 올리고머가 결합되어 고정화된 올리고DNA 칩 개발이 전세계적으로 진행되고 있다.
특히 올리고유전자 칩은 바이러스 형분석(genotyping) 결과를 제공하기 때문에 정확한 바이러스 감염경로 분석 및 유/무해 파악, 암 유발 바이러스군 타이핑을 이용한 암 발병예측용 유전자 칩 등 다수의 올리고유전자를 하나의 유전자칩 기판에 고정화한 올리고유전자 칩에 대한 연구가 세계적으로 진행되고 있다.
최근에 개발되어 주목받고 있는 HPV 바이러스 형분석을 위한 유전자칩은 실제로 수십종의인유두종 바이러스 (HPV; human papiloma virus)의 유전형 분석이 가능한 유전자칩으로 개발되고 있으며 특정 유전형의 바이러스가 존재하면 미래에 자궁경부암이 거의 90% 이상의 확률로 발병한다고 알려져 있어서 발병가능성을 예측해주는 예방의학적 바이오칩으로서 중요성을 인정받아 국내에서 세계최초로 식약청에서 정식허가가 부여되고 있다.
하지만 다종의 유전자가 다양한 물리 화학적 방법에 의해 고정화된 유리 슬라이드를 변성하여 제조된 유전자 칩은 사람의 손에 의해 loading, 교잡반응, 세척과정등의 전체 과정을 거치게 되는데 많은 수의 샘플들이 처리되고 난 뒤 시급한 해결이 필요한 아래와 같은 문제점들이 나타나고 있다.
1)사람의 손은 균일하게 작동하지 않아서 세척과정 등에서 약간의 세척시간 차이에 의한 혹은 세척을 위한 수용액 분주속도 등의 미세한 차이에서도 상당한 오차가 나타나 유전자 칩을 다루는 사람의 수준에 따라 결과가 불규칙적으로 나타나고 있다.
2) 50도 정도의 고온에서 30분-2시간 정도의 장시간에 걸쳐 진행되는 교잡반응에서 용매가 증발되면 용액상에 존재하는 결합 즉 교잡반응에 참여할 유전자의 농도가 급격히 증가하여 결과로 나타나는 신호의 차이가 때로 수배에 달하여 양성 음성 판정을 어렵게 하고 있다.
3) 특히 나타나지 않아야 할 유전자 고정화된 위치에 형광 즉 신호가 나타나서 그러한 유전형이 존재한다고 잘못된 정보를 주는 비특이적 유전자 발현이 나타나서 정확한 유전형 판독을 어렵게 하고 있다.
4) 유전자칩은 4-8개 샘플을 하나의 유전자칩에서 진행하게 되어 다수의 도포한 용액이 서로 섞이는 현상이 나타나는 경우가 있으며 이때 음성판정 되어야 할 샘플이 양성으로 나타나는 문제점이 상당하여 개개의 샘플을 따로 loading 하고 분석할 수 있게하는 새로운 형태의 유전자 형분석용 기술개발이 필요하게 되었다.
5) 특히 유리 슬라이드에 기반한 유전자칩은 사용이 간편한 형태로 가공이 어려워 가공성이 뛰어난 재질로 유전자칩의 성능을 그대로 구현해줄 제품제조에 필요한 기술개발이 필요하게 되었다.
6) 또 올리고 유전자칩의 확산을 방해하는 큰 요인중의 하나로 고가의 스캐 너를 사용하여 최종 분석결과를 확인해야 하는 과정을 거쳐야 하는데 있다. 현재의 스캐너는 대부분 수천만원대에 달하여 유전자 칩을 이용하여 결과를 확인하고 싶어도 고가의 스캐너 때문에 유전자칩을 이용한 다양한 바이러스 형분석 등의 유전형 분석이 가능한 유전자칩 개발과 사용이 제한되고 있다. 이 문제의 해결하기 위하여 수십에서 수백만원정도의 쉽게 구매가 가능한 저가의 분석기를 이용하여 형분석이 가능한 유전형 분석용 스트립개발과 이러한 스트립제조에 필수적인 유전자 고정화가 가능하면서 가공성이 뛰어난 유리섬유의 변성기술 개발과 변성된 유리섬유에 다양한 유전자를 고정화 하여 다종 유전자 분석 즉 유전형 분석을 가능하게 하는 유리섬유 변성기술 및 유전자 고정화 기술의 확보가 필수적이다.
본 발명에서는 현재의 유리슬라이드에 유전자 올리고머를 물리 화학적인 방법으로 고정화하여 제조된 유전자칩에서 나타나는 문제점을 다음과 같은 방식으로 해결하고자 한다. 본 연구진에서는 7-15개의 연속된 구아닌 염기를 가진 유전자 올리고머가 자발적으로 고정화 되는 유리슬라이드 제조기술을 확보하고 있다. 이러한 유리슬라이드는 화학식 1과 2의 아미노캘릭스아렌 유도체와 이민캘릭스아렌 유도체를 이용하여 아민으로 변성된 유리 슬라이드에 각각 아미노캘릭스아렌 단분자층과 이민캘릭스아렌 단분자층으로 변성된 유리 슬라이드를 제조할 수 있고 이 유리슬라이드는 연속된 구아닌 염기를 가진 유전자 올리고머를 용액상태로 도포하면 다종의 유전자 올리고머가 자발적으로 고정화 되어 유전자 칩을 쉽게 재현성 있게 제조하는데 사용되고 있다.
유리섬유에 이와 같이 다수의 유전자가 고정화 시킬려면 유리섬유의 표면이 유리와 특성 동일하다는 성질을 이용하여 알려진 방법(Langmuir, 1996년, Vol 12, pp 5338-5342)에 따라 유리섬유 표면을 아민으로 변성하고 여기에 화학식 1의 아미노캘릭스아렌 유도체와 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체를 이용하여 아민으로 변성된 유리섬유에 각각 아미노캘릭스아렌 단분자층과 이민캘릭스아렌 단분자층으로 변성된 유리섬유를 제조할 수 있고 여기에 유리슬라이드에서와 동일하게 유전자를 용액상으로 도포하여 유전자를 고정화한 유리섬유를 제조할 수 있다. 즉 유전자 고 정화가 가능한 유리섬유 및 다수의 유전자가 고정화된 유리섬유 제조기술 및 이를 이용한 유전자 형분석용 스트립 제조방법을 확립하려 한다. 특히 본 발명에서는 하나 혹은 다수의 유전자가 포함된 용액 혹은 핵산증폭반응(PCR)을 거친 결과물을 유리섬유에 결합된 프로브 유전자와 결합되어 유전형을 확인할 수 있는 유전형 확인용 스트립제조와 관련된 모든 기술을 확보하였다.
본 발명은 하기 화학식 1의 아미노캘릭스아렌 유도체와 하기 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체를 이용하여 도 1 및 2의 방법에 따라 아민변성된 유리섬유 표면에 단분자층으로 결합함으로써 제조되는 표면변성된 유리섬유의 제조방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112008017287535-pat00003
[상기 식 중에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 -C6H5 는 페닐기로 정의됨)].
[화학식 2]
Figure 112008017287535-pat00004
[상기 식 중에서, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 -C6H5 는 페닐기로 정의됨)].
화학식 1의 아미노캘릭스아렌 유도체 및 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체는 본원에 참조로 도입되는 한국특허출원 10-2005-0096322호, 10-2005-0103857호, 10-2005-0105340호 및 10-2005-0110824호에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
유리섬유에 단분자층을 결합하는 방법에 있어서, 도 3의 도면설명에서 제시된 것처럼, 유리섬유는 수십nm에서 수백μm 두께를 가지며 실라놀(-SiOH) 작용기가 표면에 풍부한 유리섬유의 표면에 화학반응을 통하여 아민 말단기를 가진 유리섬유 형태로 제조된다 [Langmuir, 1997 년, Vol 13, pp 4305-4308; Langmuir, 1996년, Vol 12, pp 5338-5342]. 그 다음 아민 작용기가 부착된 유리섬유를, CHCl3 등의 유기용매에 화학식 1이나 2의 화합물을 0.1~5.0 mM 의 농도로 녹인 용액에 1~24시간 정도 담군뒤 동일 용매로 세척하고 건조하여 아미노캘릭스아렌 또는 이민캘릭스아렌 단분자층이 형성된 표면-변성된 유리섬유를 얻을 수 있다.
이와 같은 방법에 의해, 유리섬유에 화학식 1의 아미노캘릭스아렌 유도체 또는 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체가 이민결합, 이를 환원한 아민결합, 티올결합, 에스테르, 에테르 또는 아미드결합 등과 같은 화학결합을 통해 유리섬유에 부착된 자기조립 단분자층 유리섬유를 제공한다.
도 4와 도 5에서 실시된 변성 유리섬유에 유전자를 고정화 하는 방법에 있어서, 60-600mM 의 이온이 존재하는 고정화 용액에서 연속된 구아닌 염기를 가진 유전자 올리고머가 자발적으로 고정화되어 유전자가 고정화된 유리섬유를 제조한다. 즉, 유전자의 고정화 방법은 연속된 구아닌 염기, 예컨대 9 개의 구아닌 염기를 가진 올리고DNA를 BMT 분주용액(600mM 암모늄 이온용액) 에 녹여서 고정화 용액을 제조하는 단계, 상기 고정화 용액을 분주하여 상기 아미노캘릭스아렌 또는 이민캘릭스아렌 단분자층으로 변성된 유리섬유에 도포하는 단계 및 올리고DNA를 고정화시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 임의로, 상기 유리섬유를 세척하는 단계 및 올리고DNA가 고정화된 나머지 위치를 블록킹(blocking)하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법에서, 고정화 단계는 바람직하게 상온에서 1-4시간 동안 실시할 수 있다. 블록킹 단계는 바람직하게 세척된 유리섬유를 블록킹 용액(1x~4xSSC, 0.1-5.0% 카제인)에 넣고 10-30분 동안 처리하는 것을 포함할 수 있다.
이렇게 제조된 유리섬유의 고정화된 유전자의 밀도와 도 9의 방법에 따라 이론적최대치의 고정화 양과 비교하여 약 1/2~1/3 수준까지 유전자가 결합되어 거의 이론적 최대치에 가까운 유전자 고정화가 가능한 유리섬유 제조기술을 확보하였다. 다종의 유전자를 고정화하여 염기일치도에 따른 유전자 교잡반응의 결과가 도 5와 도 6에 나타나 있다. 유전자를 일자형으로 고정화 하는 것은 1.4cm 정도의 좁은 공간에 8개의 일자형 선을 그어 각각의 위치를 형광부착된 유전자를 도포하여 교잡반 응을 통하여 각각의 고정화된 위치가 단독으로 형광감도를 결정할 수 있을 만큼 고정화된 유전자들이 분리된 상태를 유지하면서 용액이 전개되는 동안에도 위치를 전혀 변하지 않을 만큼 견고하게 고정화 되어 있는 유리섬유의 제조가 가능하다는 결과를 세계최초로 확보하였으며 도 5에 그 실제 결과가 나타나 있으며 실시예 3에 유전자 고정화 방법이 나타나 있으며 실시예 4에 형광부착된 유전자를 도포하는 과정이 나타나 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 특정 염기서열을 가진 유전자의 존재유무를 확인할 수 있는 유전형 분석 방법을 제공한다:
본원에 따른 유리섬유에 형광부착된 핵산-증폭 유전자가 포함된 용액이 유리섬유를 통해 전개되는 단계; 및
고정화된 탐침 유전자에 대응하는 특정 염기서열을 가진 유전자, 예컨대 바이러스의 유전형이 결합되는 단계.
도 6은 실제 유전형 분석을 위하여 가장 중요한 유전자 일치도에 따른 교잡반응 결과를 보여주고 있다. 이를 위해 유전형이 일치하지 않는 다종의 유전자를 고정화하고 한가지 유전형을 가진 형광부착된 유전자를 도포하는 실험은 실시예 5에 따라 진행되었으며 실제 실험결과 및 결과분석은 도 6에 제시되어 있다. 이 결과에 따르면 유전형이 일치되지 않는 부분에는 형광이 전혀 발현되지 않으면서 일치되는 위치에는 강하게 발현되어 그 차이가 약 10배에서 40배 수준에 달한다.
본 발명에 따른 유전형 분석 방법은 4℃ 내지 20℃의 저온, 20℃ 내지 30℃의 상온 및 30℃ 내지 60℃의 고온에서 수행될 수 있다. 일반적으로 핵산증폭된 유전자의 교잡반응은 1971년에 핵산증폭방법(K. Kleppe 와 G,Khorana 발표, journal of molecular biology, vol. 56, pp341-361)이 발표된 이후 선택성을 높이기 위해 40-60도 정도의 고온에서 진행되었으며, 본 특허에서 진행되는 것처럼 상온에서 진행되는 결과는 발표된 적이 없다. 일반적으로 실험실 내의 온도는 22-25도 정도로 유지되며 이러한 온도를 포함하는 상온과, oven 등의 기기를 이용하여 온도를 올려주어야 교잡반응이 가능한 고온에서의 교잡반응(30℃ 내지 60℃), 그리고 chiller 등의 온도를 낮추는 기기를 이용하여 진행하는 저온에서의 교잡반응(4℃ 내지 20℃) 등으로 부수적인 기기의 필요성에 따라 온도를 분류하여 교잡반응이 진행된다.
본 발명에서는 연속된 구아닌 염기가 부착된 탐침유전자(프로브유전자)를 이용하여 유전자가 고정화 될수 있게 유리섬유를 초분자로 변성하였으며, 연속된 구아닌 염기에 의해 프로브유전자 간에 적절한 간격을 유지할 수 있어서, 상온 및 상온 이하의 저온에서도 교잡반응이 진행되는 것이 가능하다. 변성 유리섬유에 고정화된 프로브 유전자가 일반적인 인식과 다르게 상온 혹은 그 이하의 온도에서 변성된 유리섬유에서 교잡반응을 진행하면서 고온에서 진행한 것과 동일한 혹은 그 이상의 교잡반응 결과를 나타내주는 형광감도를 얻었으며 그중 사용이 용이한 상온에서 진행된 결과가 도 6과 도 9에 제시되어 있다.
또한, 본 발명은 기존의 유리슬라이드에 기초한 유전자 칩에서 얻어낸 결과와 비교하여 획기적으로 선택성이 뛰어나고 비특이도를 감소시킨 변성 유리섬유 및 이를 이용한 속성 형분석(genotyping), 예를 들어 바이러스의 유전형 분석을 위한 스트립 제조 및 이용기술을제공한다. 상기 유전형 분석용 스트립은 연속된 구아닌 염기를 갖는 유전자 올리고머를 한 종류 이상 포함하는 유리섬유를 포함하고, 유전자 올리고머가 고정화되지 않은 유리섬유 부분에 샘플 주입구가 형성될 수 있다. 유전형 분석용 스트립은 래피드 스트립 형태로 제조될 수 있으며, 이를 포함하는 유전형 분석용 키트로서 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 특정 염기서열을 가진 유전자의 존재유무를 확인할 수 있는 유전형 분석 방법을 제공한다:
본원에 따른 유전형 분석용 스트립의 샘플 주입구를 통해 형광부착된 핵산-증폭 유전자가 포함된 용액을 주입하는 단계;
상기 용액이 유리섬유를 통해 전개되는 단계; 및
고정화된 탐침 유전자에 대응하는 특정 염기서열을 가진 유전자가 결합되는 단계.
또한, 본 발명은 본원에 따른 유리섬유에 특정 염기서열을 가진 RNA, DNA 등의 유전자가 포함된 용액을 도포하고, 유리섬유에 고정화 되어 있는 연속된 구아닌 염기를 가진 유전자 올리고머와 특정 염기서열을 가진 유전자와 결합시키고, 형광, 가시광선 등의 다양한 광학적 분석법을 이용하여 결합된 유전자의 총량을 판독하는 방법을 제공한다.
이러한 결과를 종합하면 본 발명은 초분자를 이용하여 제조된 변성된 유리섬유에 유전자를 고정화한 유리섬유 및 그의 제조방법, 그리고 유전자 고정화된 유리섬유를 이용한 유전자 형분석용 스트립 제조방법 등을 제공한다. 또한, 유전자 고정화된 유리섬유 표면 변성기술과 사용기술을 세계 최초로 확보하여 고가의 스캐너를 문제로 유전자칩의 사용이 활성화 되지 못하고 사용자에 따른 결과의 편차로 인한 재현성 문제 그리고 사용상의 복잡함을 한꺼번에 제거할 수 있을 뿐만 아니라 사용상의 간편성과 조작이 거의 없는 유전형 분석용 스트립 제조기술 등을 확보함으로써 기존의 유리슬라이드에 기반한 유전자칩에서 나타나고 많은 사용자들이 지적한 사용상의 많은 문제점을 획기적으로 개선할 수 있다. 특히 유리섬유는 래피드 키트에서 사용되는 NC 멤버레인처럼 용액이 특정 속도로 일정하게 전개되는 특성을 가지는데 유리섬유의 표면에 유전자가 고정화 되어 있으면 특정한 속도로 전개되는 용액에 포함된 유전자가 일관되게 고정화된 유전자사이를 일정한 속도로 지나가면서 교잡반응이 진행되어 사용자에 의한 조작과정이 용액상태의 샘플주입 외에는 없는 스트립형태의 제품제조가 가능해져서 사용자에 의한 조작을 완전히 배제하여 결과의 재현성을 획기적으로 높이고 편리성을 증진시킬수 있어, 본 발명자들은 유리섬유 표면에 유전자가 고정화 되게 표면변성하는 기술을 개발하였다.
따라서, 본 발명은 기존에 확보된 유리슬라이드 변성기술을 적용하여 유전자가 고밀도로 고정화 되어 사용자의 조작을 완전히 배제할 수 있는 유전형 분석용 스트립 제작을 가능하게 하는 유리섬유 제조기술을 세계 최초로 제공한다. 또 유전자가 고정화된 유리섬유를 이용하여 유전자 형 분석용 스트립의 제조기술을 확보하였으며, 이 기술이 적용된 스트립은 기존의 올리고유전자 칩 제조 및 사용상에서 나타나던 결과재현성 확보 미흡, 사용자에 따른 결과변화의 문제점을 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 수천만원대의 고가의 분석기를 사용하지 않고 저가의 분석기 만으로 유전형 확인이 가능한 유리섬유에 기반한 스트립 형태의 유전자 칩 제조기술을 제공할 수 있어, 기존의 유리슬라이드에 기반한 유전자칩 제조 및 사용상에서 나타나던 모든 문제점을 대부분 해결할 수 있다. 이렇게 제조된 스트립에서의 결과확인은 linear motor 가 장착된 수십에서 수백만원대의 저가의 스캐너에서 할 수 있으며, 도 5는 저가 스캐너로 데이터 포인트로 얻어진 결과를 그래프화한 실제 실험결과를 보여주고 있다. 본원 발명은 기존의 유전자칩의 사용상 문제점을 해결할 수 있어, 다양한 형태의 유전형 분석을 이용한 진단을 가능하게 할 수 있다는 점에서 중요한 발명이라고 할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
5,11,17,23- 테트라디벤질아미노캘릭스[4]아렌 -1,3- 헥산알데하이드 ( TDBACAHA ) 를 용액에 녹여 아민변성된 유리섬유에 단분자층을 형성하는 방법
Figure 112008017287535-pat00005
(여기서, X는 화학식 1의 알데히드 말단기를 가진 연결부위를 표시하는 작용기군과 동일함)
TDBACAHA
CHCl3 등의 유기용매에 화학식 1의 유도체 중에서 5,11,17,23-테트라디벤질아미노캘릭스[4]아렌-1,3-헥산알데하이드 (TDBACAHA) 를 0.1~5.0 mM 농도로 녹인 용액을 제조하였다. 도 1과 같이 아민작용기가 부착된 유리섬유 (아민유리섬유기질)를 제조된 용액에 1-24 시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름, 아세톤 및 물로 각각 세척한 뒤 건조시켜 본 발명의 아미노캘릭스아렌 단분자층을 제조하였다. 동일한 방법에 따라 다른 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층을 제조하였다.
실시예 2
5,11,17,23-테트라벤질이민알콕시캘릭스[4] 아렌 ( TBICOCA )를 용액에 녹여 아민변성 된 (기 알려진 방법에 따름) 유리섬유에 변성하는 방법
Figure 112008017287535-pat00006
TBICOCA
CHCl3 등의 유기용매에 화학식 2의 유도체 중에서 5,11,17,23-테트라벤질이민알콕시캘릭스[4]아렌(TBICOCA)를 0.1~5.0 mM 농도로 녹인 용액을 제조하였다. 도 2에서와 같이 아민작용기가 부착된 유리섬유 (아민유리섬유기질)를 제조된 용액에 1-24 시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름, 아세톤 및 물로 각각 세척한 뒤 건조시켜 본 발명의 이민캘릭스아렌 단분자층을 제조하였다. 동일한 방법에 따라 다른 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층을 제조하였다.
실시예 3
변성된 유리섬유을 이용한 다종 유전자 분석을 위한 유전자 고정화 방법
도 5에 나타난 올리고DNA 고정화에는 바이오닷 (Biodot) 분주기 장치 (모델명 XYZ 3050, 미국)를 사용하였다. 다종 유전자 분석을 위하여 표 1에 명기된 것과 같이 염기서열이 완전히 일치하는 프로브를 도 5처럼 고정화하였다. 즉 연속된 9 개의 구아닌 염기를 가진 올리고DNA를 3-30 pmol/㎕ 로 각각을 BMT 분주용액 (600mM 암모늄 이온용액) 에 녹여서 고정화 용액(600mM 암모늄 이온용액; 제품명 BMT spotting solution-9G, ㈜바이오메트릭스테크놀로지 사제, 한국)을 8개로 제조하였다. 상기 고정화 용액을 분주노즐을 이용하여 5-50 mm/sec의 속도로 분주하였으며, 실시예 1과 실시예 2와 같은 방식으로 제조된 도 4에 제시된 형태로 제조된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 또는 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층으로 변성된 유리 기질(유리 섬유)에 도포하여, 올리고DNA를 두께 0.5-5mm인 일자형 선으로 고정화시킨다. 상온에서 1-4 시간동안 고정화한 후 올리고DNA가 고정화된 나머지 위치를 블록킹 (blocking)하기 위하여, 세척된 유리섬유를 250 ㎖ 의 BMT 블록킹 용액(1x~4xSSC, 0.1-5.0% 카제인; 제품명 BMT Blocking solution-9G, ㈜바이오메트릭스테크놀로지 사제, 한국)에 넣고 10-30분 동안 처리하여 제조하였다.
탐침명 염기서열 (5'-3') 설명
9G GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA 염기서열 일치하는 탐침
Cy5-DNA Cy5-GTG CAG CTG TGG GTT GAT T-3 형광이 부착된 표적DNA
실시예 4
형광이 부착된 표적유전자와 교잡반응을 통한 유전자 검출방법
형광부착된 표적 유전자와 교잡반응을 위하여, 1.5 ㎖ 튜브에 표 1에 명기된 형광이 부착된 표적 유전자 5 ㎕와 BMT hyb-mixA (6xSSC, 20% formamide , 0.05% triton X-100, 제품명 BMT Hyb-solution-9G, ㈜바이오메트릭스테크놀로지 사제, 한국) 75 ㎕ 비율로 80 ㎕의 혼합용액을 조립된 스트립의 시료주입구에 주입하였다. 스트립을 상온(20±5℃)에서 5-50분 동안 교잡반응시켰다. 교잡반응이 끝난 스트립에 0.1x~4x SSC용액을 100~300㎕ 투입한 후 스트립을 분리하여 반응이 끝난 유리섬유를 슬라이드에 부착하여 마이크로 어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국) 혹은 linear scanner를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. Linear scanner 를 이용하여 얻어진 실제 결과는 도 5에 제시되어 있다. 상기 결과는 표면변성된 유리섬유 위에 다종의 유전자를 선형으로 도포한 후 용액의 흐름을 이용하여 형광이 부착된 표적유전자를 포함한 용액을 흘렸을 때 용액상 유전자와 다종의 고정화된 유전자간의 결합에 의해 용액상 유전자의 존재를 확인가능한 올리고 DNA 가 고정화된 유리섬유가 제조되었음을 보여준다.
실시예 5
표면변성된 유리섬유를 이용한 특정 유전자 검출 시험
도 6에 나타난 올리고DNA 고정화에는 바이오닷(Biodot) 분주기 장치(모델명 XYZ 3050, 미국)를 사용하였다. 비특이적 형광 발현을 동시에 확인하기 위하여 표 2에 명기된 것과 같이 염기서열이 완전히 일치하는 프로브와 일치하지 않는 프로브를 도 4의 방법에 따라 도 6의 형태로 고정화하였다. 고정화 용액의 조성과 분주는 실시예 3에서 사용된 방법과 동일하게 사용하여 유전자 고정화된 유리섬유를 제조하였다.
탐침명 염기서열 ( 5'-3') 설명
9G GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA 염기서열 일치하는 탐침
M GGGGGGGGGAGTTCAAATTATTTTCCTA 염기서열이 일치하지 않는 탐침
Cy5-DNA Cy5-GTG CAG CTG TGG GTT GAT T-3 형광이 부착된 표적DNA
형광이 부착된 프라이머 혹은 PCR 산물을 도포하여 유리섬유에 고정화된 유전자와 결합하여 고정화된 유전자의 고정화 유무를 확인하기 위하여 상기에서 제조된 유리섬유 기질을 도 10과 같은 형태의 스트립으로 조립하였다. 교잡반응을 위하여 1.5 ㎖ 튜브에 형광이 부착된 표적 유전자 5 ㎕와 BMT hyb-mixA 75 ㎕ 비율로 80 ㎕의 혼합용액을 조립된 스트립의 시료주입구에 주입하였다. 스트립을 상온(20±5℃)에서 5-50분 동안 교잡반응시켰다. 교잡반응이 끝난 스트립에 0.1x~4x SSC용액을 100~300㎕ 투입한 후 스트립을 분리하여 반응이 끝난 유리섬유를 슬라이드에 부착하여 마이크로 어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. 실제 결과는 도 6에 제시된 바와 같다. 상기 결과는 염기서열이 맞는 선에서만 형광이 발현하게 되며, 유리섬유 상에서 모세관현상(capillary action), microfludics (미세유체역학적 흐름) lateral flow(측방유동흐름) 등의 방식에 따라 유전자를 흘려보냈을 때 상보적인 염기서열을 가진 표적유전자를 특이적으로 검출할 수 있음을 보여준다.
실시예 6
표면에 최대고정화되는 유전자의 이론적인 수치와의 비교 실험
표면에 최대고정화되는 유전자의 이론적인 수치와의 비교 실험을 위하여 실시예 3와 같은 방법으로 염기서열이 일치하는 연속된 구아닌 염기를 가지는 탐침유전자를 제조하여 5회 반복하여 변성된 유리섬유 상에 도포하여 동일한 순서에 따라 제조하였다. 형광이 부착된 프라이머 혹은 PCR 산물을 도포하여 유리섬유에 고정화된 유전자와 결합하여 고정화된 유전자의 고정화 유무를 확인하기 위하여 상기에서 제조된 유리섬유 기질을 도 7의 모식도나 도 10의 사진과 유사한 형태의 스트립으로 조립하였다. 교잡반응을 실시예 4와 동일하게 진행한 다음 반응이 끝난 유리섬유 부분을 스트립에서 탈착하여 마이크로 어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하여 실험적인 비교치를 얻었다. 또한 표면에 최대고정화되는 유전자의 이론적인 수치를 비교하기 위하여 형광물질이 부착된 유전자를 표면에 최대고정화되는 이론치인 1x 의 농도로 제조하였다. 상기 용액을 1/3씩 희석하여 1/3, 1/9, 1/27, 1/81 배로 희석된 용액을 제조하여 각각을 분주기를 이용하여 유리섬유 상에 선형으로 도포한 후 건조시켜 형광 검출기를 이용하여 결과를 판독하였다. 실제 결과는 도 9와 같다.
실시예 7
상기 변성 유리섬유상 멤브레인 상에서 탐침 유전자( probe DNA )와 핵산중합반응물이 핵산교잡반응하여 나타난 선을 형광으로 검출하는 방법
가) 표준물질을 이용한 핵산중합반응 결과물로 DNA 유형 확인 실험
본 실시예에서 사용된 표준물질은 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였으며 다음과 같다.
Probe-1 (ATCC 45150)
Probe-2 (ATCC 45151)
Probe-3 (ATCC 45152)
Probe-4 (ATCC 45113)
상기에서 plasmid DNA를 주형으로하고 표 3의 primer를 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 primer는 ㈜바이오니아 사에 합성 의뢰하여 구입하였다. PCR 실험은 ㈜바이오니아 사로부터 구입한 PCR buffer 10㎕, 1.5mM MgCl2, 250uM dNTP, 30mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH9.0), Taq 중합효소 (1unit) 와 primer 1㎕ (10pmol/㎕), 증류수 7㎕, 주형 DNA 1㎕로 구성된 반응액을 94℃에서 5분간 1회, 94℃ 1분 - 45℃ 45초 - 72℃ 1분의 35회 반복, 72℃에서 5분간 1회의 조건으로 진행하였으며, 최종반응액 5㎕를 DNA 스탠더드 마커(size standard maker)와 함께 2% 아가로스 겔(agarose gel)에 부과하여 전기영동하였다. 이때 전기영동 겔의 염색은 0.00005% 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide) 용액으로 행하였으며 겔의 각 경로 상에서 출현한 밴드의 유효 여부는 UV 를 이용하여 확인하였다.
프라이머명 염기서열 (5'-3')
Forward GATGGTGATATGGTAGATACAGGATTT
Cy5-Reverse* CY5-CCTAGTGGCTCTATGGTAACCTCTGACGC
*Cy-5는 미국의 텔레켐 사에서 판매하는 형광활성을 가진 화합물의 브랜드 이름을 나타냄
나) 형광부착된 핵산중합반응 결과물을 도포하여 유리섬유에 고정화된 유전자와 결합하여 형광을 이용한 물질분석방법
도 4에 나타난 프로브유전자 고정화에는 바이오닷 (Biodot) 분주기 장치 (모델명 XYZ 3050, 미국)를 사용하였다. 표 4에 명기되어있는 probe 1, probe 2, probe 3, probe 4, HC(Hybridization control) 을 포함하여 연속된 9 개의 구아닌 염기를 가진 프로브유전자를 7-30 pmol/㎕ 로 BMT 분주용액(100mM 암모늄 이온용액)에 녹여서 고정화 용액을 제조하였다. 상기 고정화 용액을 분주노즐을 이용하여 20 mm/sec(0.7ul/Cm)의 속도로 분주하였으며, ㈜바이오메트릭스 테크놀로지사에서 제조한 변성된 유리 섬유에 도포하여, 프로브유전자를 두께 0.2-3.0mm인 선형 밴드로 도포하여 자발적으로 고정화시켰다. 상온에서 1-24 시간동안 고정화한 후 올리고DNA가 고정화된 나머지 위치를 블록킹(blocking)하기 위하여, 세척된 유리섬유를 250 ㎖ 의 BMT 블록킹 용액(4xSSC, 1% 카제인, 0.5% Poly Ethylene Glycol 포함)에 넣고 10 -30분 동안 처리하여 40-50℃ incubator에서 30분-4시간동안 건조하여 도 10에서 보여지는 스트립을 제조하였다.
탐침명 염기서열 (5'-3) 설 명
Probe-1 GGG GGG GGG TCT GTA GCT ACT AGT ATT TAT GTA CAT ACA Probe DNA
Probe-2 GGG GGG GGG AGT ATA TAT GTT AAC ACC Probe DNA
Probe-3 GGG GGG GGG GT GTG TAT TCT CCC TCT Probe DNA
Probe-4 GGG GGG GGG T TCA AAT TAT TTT CCT ACA Probe DNA
HC GGG GGG GGG TTT ACA CCT AGT GGC TCT ATG GTG TCC TCT Hybridization control
다) 형광부착된 핵산중합반응 결과물을 도포하여 유리섬유에 고정화된 유전자와 결합하여 형광을 이용한 물질분석방법
형광이 부착된 프라이머 혹은 PCR 산물을 도포하여 유리섬유에 고정화된 유전자와 결합하여 고정화된 유전자의 고정화 유무를 확인하기 위하여 실시예 2 에서 제조된 유리섬유 기질을 실시예 7-나) 와 같은 방법으로 프로브유전자등이 고정화된 유리섬유 혹은 스트립을 도 10과 같은 형태의 케이스에 조립하여 핵산증폭산물을 전개시켜 특정 유전자의 존재 유무를 확인하였다. 전개용액의 제조를 위하여 1.5 ㎖ 튜브에 실시예 7-가) 에서 제조된 핵산 중합반응 결과물 5 ㎕와 BMT hyb-mix A 75 ㎕ 비율로 혼합용액을 제조하였다. 이를 100℃ 물에서 3 분 동안 가열하고 얼음 위에서 3 분간 방치하여 냉각시킨 후, 80 ㎕의 혼합용액을 조립된 스트립의 시료주입구에 주입하였다. 주입후 스트립을 상온(20~30℃)에서 3-120분 동안 방치하여 용액이 전개되어 교잡반응이 진행되게 한 뒤 BMT Wa-B-2 (4xSSC)용액을 100 ㎕ 투입하고 5분 후 스트립을 분리하여 반응이 끝난 유리섬유(스트립)를 슬라이드에 부착하여 마이크로 어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. 분석한 결과는 도 11 내지 도 16의 위쪽 부분에 스트립 형태로 나타나 있다. 도 11 내지 도 16의 아래부분의 그래프는 BMT에서 스트립 분석용으로 사용되는 BMT HPV strip reader type-1을 이용하여 분석한 결과이다. 도면에서 분명히 알 수 있는 것과 같이, 각각의 핵산중합반응에 의해 증폭된 유전자 유형을 함유하고 있는 샘플에 대해서는, 프로브유전자가 고정화된 밴드(선)에서 특이적으로 결합하는 결과를 보여주며, 동시에 HC 영역에서도 교잡반응이 진행되어 샘플의 분주 유무를 확인시켜주고 있으며, 다른 브로브유전자의 위치에서는 아무런 교차반응이 일어나지 않는 높은 선택성과, 낮은 비특이적 결합도로 핵산중합반응에 의해 증폭된 유전자를 분석 가능하게 하는 스트립형 유전자칩이 개발되어 작동되는 결과를 보여준다.
본 발명은 화학식 1의 아미노캘릭스아렌 유도체와 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체를 이용하여 단분자층으로 변성된 유리섬유 및 유리섬유 제조방법과, 변성된 유리섬유에 유전자를 고정화한 유리섬유 및 그의 제조방법, 그리고 유전자 고정화된 유리섬유를 이용한 유전자 형분석용 스트립 제조방법등의 유전자 고정화된 유리섬유 표면 변성기술을 세계 최초로 확보하여 기존의 고가의 스캐너를 사용하던 비용문제와 사용상의 복잡함을 제거할 수 있는 간편성 그리고 용액의 균일한 전개로 인한 결과의 재현성 확보 등의 기존 기술을 획기적으로 개선한 신기술이다.
특히 유리섬유는 래피드 키트에서 사용되는 NC 멤버레인처럼 용액이 특정 속도로 일정하게 전개되는 특성을 가지는데 유리섬유의 표면에 유전자가 고정화 되어 있으면 특정한 속도로 전개되는 용액에 포함된 유전자가 일관되게 고정화된 유전자사이를 일정한 속도로 지나가면서 교잡반응이 진행되어 사용자에 의한 조작과정이 loading 외에는 없는 스트립형태의 제품제조가 가능해져서 사용자에 따른 결과의 재현성을 획기적으로 높이고 편리성을 증진시킬수 있어, 본 발명자들은 유리섬유 표면에 유전자가 고정화 되게 표면변성하는 기술을 개발하였다. 본 발명은 기존에 확보된 유리슬라이드 변성기술을 적용하여 유전자가 고밀도로 고정화 되는 유리섬유 제조기술을 세계 최초로 확보하였다. 또 유전자가 고정화된 유리섬유를 이용하여 유전자 형 분석용 스트립의 제조기술을 확보하였으며, 이 기술이 적용된 스트립은 기존의 올리고유전자 칩 제조 및 사용상에서 나타나던 결과재현성 확보 미흡, 사용자에 따른 결과변화의 문제점을 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 수천만원대의 고가의 분석기를 사용하지 않고 저가의 분석기 만으로 유전형 확인이 가능한 유리섬유에 기반한 스트립 형태의 유전자 칩 제조기술을 제공할 수 있어, 기존의 유리슬라이드에 기반한 유전자칩 제조 및 사용상에서 나타나던 모든 문제점을 대부분 해결할 수 있다. 본원 발명은 기존의 유전자칩의 사용상 문제점을 해결할 수 있어, 다양한 형태의 유전형 분석을 이용한 진단을 가능하게 할 수 있다는 점에서 중요한 발명이라고 할 수 있다.
도 1 및 2는 논문(Langmuir, 1996년, Vol 12, pp 5338-5342)에 발표된 방법에 따라 유리섬유 표면을 아민으로 변성한 모식도와 이에 화학식 1, 2의 유도체와 결합하여 초분자 단분자층을 제조하는 모식도이다.
도 3은 실제 제조에 사용된 유리섬유 사진과 확대사진 그리고 모식도이다. 퓨전5 (wattman사, 영국)본 특허에 사용된 유리섬유(영국 wattman사 제품 및 미국 water 제품과 millipore 사 제품등)는 유리재질을 수십nm에서 수백μm에 이르는 직경을 가진 가는 유리선으로 뽑은 뒤 멤버레인 형태로 직조하여 일반섬유나 멤버레인처럼 한쪽에 도포된 용매가 중력에 의해 혹은 모세관 현상이나 microfluidics 등의 특성이 하나 혹은 두개 이상의 힘이 합하여 전개되는 특성을 가지고 있으며 본 특허에서는 그러한 특성을 이용하고자 한다.
도 4는 초분자 단분자층으로 변성된 유리섬유에 연속된 구아닌 염기를 가진 올리고유전자가 녹아있는 용매를 변성된 유리섬유위에 분주기 등을 이용하여 선형으로 정해진 두께로 분주하여 올리고유전자가 고정화된 유리섬유 제조과정을 나타내는 모식도이다.
도 5는 연속된 구아닌 염기를 가진 유전자 올리고머가 일자형으로 도포되어 다수의 유전자가 다수의 일자형으로 고정화된 유리섬유에 실제로 형광이 부착되어 있는 핵산중합반응(PCR)의 결과물등의 유전자를 포함한 용액을 도포하면 용액이 자발적으로 전개되어 고정화된 탐침 유전자와 일치하는 유전형을 가진 유전자가 결합되는 실제 실험 결과이다. 이 실험에서는 형광분석을 위하여 형광이 결합된 유전자를 사용하여 형광농도로 교잡반응이 일어난 것을 확인하였다.
도 6은 다수의 유전자가 일자형으로 도포되어 고정화된 유리섬유에 형광이 부착된 유전자를 용액으로 흘려준 뒤 형광스캐너를 이용하여 분석한 실제 실험결과이다. 염기서열이 일치하는 곳에서는 형광이 강하게 발현하고 그렇지 않은 곳에는 형광발현이 전혀 나타나지 않아 염기서열이 일치하는 곳에서만 형광부착된 유전자가 결합되었음을 나타내는 실제 실험결과이다.
도 7은 다수의 유전자가 일자형으로 고정화 되어 있는 유리섬유를 스트립 내에 위치시킨 뒤에 뚜껑을 덮은 상태의 유리섬유를 이용하여 제조된 스트립의 모식도이다. 이 스트립의 샘플 주입구에 핵산증폭산물(PCR 결과물)등의 유전자가 포함된 용액을 주입시켜 도 5 및 6과 같은 유전자가 결합된 결과를 얻을 수 있으며 결과확인은 주로 분광분석으로 얻는다.
도 8은 도 7에서 용액이 전개된 뒤 분광분석으로 결과를 확인하는 방법을 나타낸 모식도이다. 도 7과 같이 다종의 유전자가 일자형으로 고정화된 유리섬유를 스트립 내부에 위치시키고 샘플주입구를 통해 다양한 유전자가 포함된 용액을 주입 하고 일정시간이 지나서 눈으로 혹은 광학기기등의 기기를 이용하여 각 일자형 선에 부착된 유전자의 양을 신호의 크기로 나타내는 것을 보여주는 모식도이다. 이러한 신호의 크기차이를 이용하여 용액상의 존재하던 유전자 혹은 유전자들의 유전형을 판별할 수 있다. 형광을 이용하여 나타나는 실제 실험결과는 도 6에 제시되어 있으며 일치하는 유전형일때에만 중요한 수준의 신호가 나타나는 것을 확인할 수 있다.
도 9는 일자형으로 유전자를 고정화 할 때 유리섬유 표면적에 최대한 고정화가 가능한 연속된 구아닌 염기를 가진 유전자 올리고머의 양을 계산하여 여기에 1:1 비율로 형광부착된 유전자가 고정화된 유전자에 교잡반응을 한다고 가정하에 계산하여 형광부착된 유전자양(이론적 최대치 즉 1x 형광감소를 확인하기 위해 1/3x, 1/9x 등으로 감소된 농도를 사용하여 줄어드는 형광감도를 확인하였음)을 일자형으로 도포한뒤 건조시켜 얻어지는 형광의 세기와 실제 고정화된 유전자에 교잡반응으로 얻어진 형광의 세기를 비교한 실제 실험결과이다. 고정화된 유전자에 형광이 부착되는 실험은 5번의 일자형 선으로 반복하여 확인하였으며 결과는 이론적 최대치 형광의 1/3 수준으로서 대단히 우수한 유전자 고정화와 교잡반응 결과를 보여주고 있다.
도 10은 도 7과 도 8에서 제시된 모식도에서 사용된 조립되어 있는 샘플주입구를 가진 스트립의 형태중 하나를 보여주는 사진자료이다.
도 11 내지 도 16은 실시예 7과 같이 서로다른 유전형의 프로브유전자가 고정화 되어 있는 변성 유리섬유를 도 10과 같은 스트립에 조립하고 형광물질이 부착된 핵산증폭산물을 전개하여 얻어낸 결과를 형광 스캐너로 판독한 결과이다. 도 11 내지 14는 하나의 프로브유전형과 일치하는 핵산증폭산물을 도포하여 나타나는 결과를 보여주고 있으며, 도 15 및 16은 두가지 이상의 프로브유전형과 일치하는 핵산증폭산물을 도포하여 동일한 방법으로 얻어진 실제실험 결과를 보여주고 있다. 모든 결과에서 변성유리섬유를 이용한 유전형 분석이 비특이적 결합없이 선택적으로 결합된다는 결과를 나타낸다.
<110> BIOMETRIX TECHNOLOGY INC. <120> MODIFIED GLASS FIBERS WITH MONOLAYERS OF AMINOCALIXARENE DERIVATIVES AND IMINECALIXARENE DERIVATIVES, AND OLIGO-DNA MODIFIED GLASS FIBERS BY FIXING OLIGO-DNA'S TO THE MONOLAYERS, AND THE PREPARATION METHOD OF GENOTYPING STRIPS USING THE OLIGO-DNA MODIFIED GLASS FIBERS <130> Y08KP-015 <140> 10-2008-0022048 <141> 2008-03-10 <150> KR2007-0116371 <151> 2007-11-15 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9G DNA <400> 1 ggggggggga aatcaaccca cagctgca 28 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cy-5 DNA <400> 2 gtgcagctgt gggttgatt 19 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M DNA <400> 3 ggggggggga gttcaaatta ttttccta 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 4 gatggtgata tggtagatac aggattt 27 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cy-5 reverse primer <400> 5 cctagtggct ctatggtaac ctctgacgc 29 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe-1 <400> 6 gggggggggt ctgtagctac tagtatttat gtacataca 39 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe-2 <400> 7 ggggggggga gtatatatgt taacacc 27 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe-3 <400> 8 gggggggggg tgtgtattct ccctct 26 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe-4 <400> 9 gggggggggt tcaaattatt ttcctaca 28 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybridization control <400> 10 gggggggggt ttacacctag tggctctatg gtgtcctct 39

Claims (28)

  1. 하기 화학식 1의 아미노캘릭스아렌 유도체가, 멤버레인 형태로 직조되고 아민변성된 유리섬유 표면에 단분자층으로 결합됨으로써 표면-변성된 유리섬유:
    [화학식 1]
    Figure 112008075518468-pat00007
    [상기 식 중에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 -C6H5 는 페닐기로 정의됨)].
  2. 하기 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체가, 멤버레인 형태로 직조되고 아민변성된 유리섬유 표면에 단분자층으로 결합됨으로써 표면-변성된 유리섬유:
    [화학식 2]
    Figure 112008075518468-pat00008
    (상기 식 중에서, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 -C6H5 는 페닐기로 정의됨)).
  3. 멤버레인 형태로 직조되고 아민 작용기가 부착된 유리섬유를, 유기용매에 제 1 항에 기재된 화학식 1의 화합물을 녹인 용액에 담근뒤 동일 용매로 세척하고 건조하여 아미노캘릭스아렌 단분자층을 형성하는 것을 특징으로 하는 유리섬유의 표면-변성 방법.
  4. 멤버레인 형태로 직조되고 아민 작용기가 부착된 유리섬유를, 유기용매에 제 2 항에 기재된 화학식 2의 화합물을 녹인 용액에 담근뒤 동일 용매로 세척하고 건조하여 이민캘릭스아렌 단분자층을 형성하는 것을 특징으로 하는 유리섬유의 표면-변성 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 연속된 구아닌 염기를 가진 유전자 올리고머가 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 상에 결합된 유리섬유.
  6. 제 2 항에 있어서, 연속된 구아닌 염기를 가진 유전자 올리고머가 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 상에 결합된 유리섬유.
  7. 하기 단계를 포함하는, 유리섬유의 제조방법:
    연속된 구아닌 염기를 가진 올리고DNA를 분주용액에 녹여서 고정화 용액을 제조하는 단계;
    상기 고정화 용액을 분주하여 제 1 항에 따른 아미노캘릭스아렌 단분자층으로 표면-변성된 유리섬유에 도포하는 단계; 및
    올리고DNA를 고정화시키는 단계.
  8. 하기 단계를 포함하는, 유리섬유의 제조방법:
    연속된 구아닌 염기를 가진 올리고DNA를 분주용액에 녹여서 고정화 용액을 제조하는 단계;
    상기 고정화 용액을 분주하여 제 2 항에 따른 이민캘릭스아렌 단분자층으로 표면-변성된 유리섬유에 도포하는 단계; 및
    올리고DNA를 고정화시키는 단계.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 유전자 올리고머는 형광부착된 핵산-증폭 유전자가 포함된 용액을 전개시켜 특정 염기서열을 가진 유전자의 존재유무를 확인할 수 있 는 유전자 올리고머인 유리섬유.
  10. 제 6 항에 있어서, 상기 유전자 올리고머는 형광부착된 핵산-증폭 유전자가 포함된 용액을 전개시켜 특정 염기서열을 가진 유전자의 존재유무를 확인할 수 있는 유전자 올리고머인 유리섬유.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 특정 염기서열은 바이러스의 유전형인 유리섬유.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 특정 염기서열은 바이러스의 유전형인 유리섬유.
  13. 하기 단계를 포함하는, 특정 염기서열을 가진 유전자의 존재유무를 확인할 수 있는 유전형 분석 방법:
    제 5 항에 따른 유리섬유에 형광부착된 핵산-증폭 유전자가 포함된 용액을 유리섬유를 통해 전개하는 단계; 및
    고정화된 탐침 유전자에 대응하는 특정 염기서열을 가진 유전자를 결합하는 단계.
  14. 하기 단계를 포함하는, 특정 염기서열을 가진 유전자의 존재유무를 확인할 수 있는 유전형 분석 방법:
    제 6 항에 따른 유리섬유에 형광부착된 핵산-증폭 유전자가 포함된 용액을 유리섬유를 통해 전개하는 단계; 및
    고정화된 탐침 유전자에 대응하는 특정 염기서열을 가진 유전자를 결합하는 단계.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 특정 염기서열을 가진 유전자는 바이러스의 유전형인 분석 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 특정 염기서열을 가진 유전자는 바이러스의 유전형인 분석 방법.
  17. 제 13 항에 있어서, 특정 염기서열을 가진 유전자가 4℃ 내지 60℃의 온도에서 교잡반응을 통해 결합되는 분석 방법.
  18. 제 14 항에 있어서, 특정 염기서열을 가진 유전자가 4℃ 내지 60℃의 온도에서 교잡반응을 통해 결합되는 분석 방법.
  19. 연속된 구아닌 염기를 갖는 유전자 올리고머를 한 종류 이상 포함하는 제 5 항에 따른 유리섬유를 포함하고, 유전자 올리고머가 고정화되지 않은 유리섬유 부분에 샘플 주입구가 형성된, 유전형 분석용 스트립.
  20. 연속된 구아닌 염기를 갖는 유전자 올리고머를 한 종류 이상 포함하는 제 6 항에 따른 유리섬유를 포함하고, 유전자 올리고머가 고정화되지 않은 유리섬유 부분에 샘플 주입구가 형성된, 유전형 분석용 스트립.
  21. 제 19 항에 따른 유전형 분석용 스트립을 래피드 스트립 형태로 포함하는, 유전형 분석용 키트.
  22. 제 20 항에 따른 유전형 분석용 스트립을 래피드 스트립 형태로 포함하는, 유전형 분석용 키트.
  23. 하기 단계를 포함하는, 특정 염기서열을 가진 유전자의 존재유무를 확인할 수 있는 유전형 분석 방법:
    제 19 항에 따른 유전형 분석용 스트립의 샘플 주입구를 통해 형광부착된 핵산-증폭 유전자가 포함된 용액을 주입하는 단계;
    상기 용액을 유리섬유를 통해 전개하는 단계; 및
    고정화된 탐침 유전자에 대응하는 특정 염기서열을 가진 유전자를 결합하는 단계.
  24. 하기 단계를 포함하는, 특정 염기서열을 가진 유전자의 존재유무를 확인할 수 있는 유전형 분석 방법:
    제 20 항에 따른 유전형 분석용 스트립의 샘플 주입구를 통해 형광부착된 핵산-증폭 유전자가 포함된 용액을 주입하는 단계;
    상기 용액을 유리섬유를 통해 전개하는 단계; 및
    고정화된 탐침 유전자에 대응하는 특정 염기서열을 가진 유전자를 결합하는 단계.
  25. 제 23 항에 있어서, 특정 염기서열을 가진 유전자가 4℃ 내지 60℃의 온도에서 교잡반응을 통해 결합되는 분석 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 특정 염기서열을 가진 유전자가 4℃ 내지 60℃의 온도에서 교잡반응을 통해 결합되는 분석 방법.
  27. 제 13 항에 있어서, 광학적 분석법을 이용하여 결합된 특정 염기서열을 가진 유전자의 총량을 측정하는 단계를 포함하는 분석 방법.
  28. 제 14 항에 있어서, 광학적 분석법을 이용하여 결합된 특정 염기서열을 가진 유전자의 총량을 측정하는 단계를 포함하는 분석 방법.
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