KR20050016563A - 신호 신장 및 데이터 통합에 의한 핵산 서열 결정 방법 - Google Patents

신호 신장 및 데이터 통합에 의한 핵산 서열 결정 방법

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KR20050016563A
KR20050016563A KR10-2004-7020468A KR20047020468A KR20050016563A KR 20050016563 A KR20050016563 A KR 20050016563A KR 20047020468 A KR20047020468 A KR 20047020468A KR 20050016563 A KR20050016563 A KR 20050016563A
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인텔 코포레이션
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Abstract

본 발명의 방법 및 장치 (100)는 DNA 서열 결정에 관한 것이다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 이러한 방법은 표지된 뉴클레오티드 (220), 예컨대 벌키 기로 표지된 뉴클레오티드 사이의 거리를 측정하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 각각 상이한 표지된 뉴클레오티드 전구체를 포함하는 4 개의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에 동일한 주형 DNA (200)를 배치하고, 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)를 합성하고, 표지된 뉴클레오티드 (220)를 검출하는 것을 더 포함할 수 있다. 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 거리를 사용하여 각각의 유형의 표지된 뉴클레오티드 (220)에 대한 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 구성 (450)하는데 사용할 수 있다. 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 정렬 (520)하여 핵산 서열 (210)을 얻을 수 있다. 중첩 데이타 분석 및 빈도 분석을 사용하여 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 구성 (450)하고, 비중첩 데이타 분석을 사용하여 거리 맵을 서열 (210)로 정렬 (520)시킬 수 있다.

Description

신호 신장 및 데이터 통합에 의한 핵산 서열 결정 방법{NUCLEIC ACID SEQUENCING BY SIGNAL STRETCHING AND DATA INTEGRATION}
기술 분야
본 발명의 방법, 조성물 및 장치는 분자 생물학 및 게놈학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 명세서에서 개시된 방법 및 장치는 핵산 서열 결정에 관한 것이다.
배경
휴먼 게놈 프로젝트의 등장은 핵산, 예컨대 DNA (데옥시리보핵산) 및 RNA (리보핵산)의 서열 결정에 대한 진보한 방법을 개발하고자 하는 것을 요구하고 있다. 다수의 일반적인 질환, 예컨대 암, 낭성 섬유증 및 겸상 적혈구성 빈혈은 부분적으로 DNA 서열에서의 변형에 기초한 것이다. 휴먼 게놈의 전체 3,000,000,000 개의 염기 서열의 결정은 이러한 질환의 유전적 기초를 규명하기 위한 기초 작업을 제공하게 된다. 그러나, 개개의 질병과 관련된 유전적 변형을 규명하기 위하여서는 상당량의 작업을 수행하여야만 하는 난제가 있다.
크기로 분리하여 온 표지된 핵산의 검출에 기초한 핵산 서열 결정에 대한 현존하는 방법은 서열 결정될 수 있는 핵산의 길이에 의하여 제한된다. 통상적으로 핵산 서열의 500∼1,000 개의 염기만이 한번에 결정될 수 있다. 이는 길이가 염기의 수만 또는 심지어 수십만이 될 수 있는 유전자로서 지칭되는 DNA의 작용 단위의 길이보다 훨씬 더 짧은 것이다. 현존하는 방법을 사용할 경우, 완전 유전자 서열의 결정은 다수의 유전자 복제가 생성되며, 중첩 분절로 절단되어 서열 결정될 것을 요구하며, 그후 중첩 DNA 서열은 완전 유전자로 어셈블링될 수 있다. 이러한 작업은 노동력이 소요되며, 비용이 많이 들고, 비효율적이며 시간이 많이 소요되는 것이다.
칩의 특정 위치에서 공지된 서열의 올리고뉴클레오티드 어레이로 하이브리드를 형성하는 것을 비롯한 핵산 서열 결정의 최근의 방법은 짧은 핵산 서열을 추론하거나 또는 샘플중의 특정의 핵산의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 그러나, 이들은 긴 핵산 서열을 구별하는데는 적절하지 않다.
도면의 간단한 설명
첨부한 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 이는 본 발명의 특정의 구체예를 추가로 예시하고자 포함하는 것이다. 이러한 구체예는 본 명세서에서 개시된 특정의 구체예의 상세한 설명과 함께 1 이상의 도면을 참조하면 더 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 4 개의 별도의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에서 랜덤 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 거리를 측정함으로써 주형 핵산 (200)의 서열 결정을 위한 예시의 장치 (100) (배율 표시하지 않음) 및 이의 방법을 예시한다.
도 2는 다수의 상보적인 핵산 스트랜드 (230, 240, 250)에서 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이에서 측정된 거리에 기초한 표지된 뉴클레오티드 (220)의 한 유형에 대한 염기 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 구성하기 위한 예시의 방법을 예시한다. 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 거리는 본 명세서에서 설명한 바와 같이 표지된 각각의 유형의 뉴클레오티드에 대한 거리 맵 (310, 320, 330, 340)으로 집계할 수 있다. 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)의 서열 (210)과 표지된 뉴클레오티드 (220)에 대한 예시의 위치를 함께 도시하였다. 동일한 뉴클레오티드가 서로에 대하여 이웃하게 위치하는 도면 부호 260으로 나타낸 바와 같이, 이는 해당 위치에서 표지되는 증가된 빈도수로서 검출될 것이다.
도 3은 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)의 서열 (210)로 4 개의 염기 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 정렬하는 예시의 방법을 도시한다. 주형 핵산 (200)은 결정한 서열 (210)의 정확한 보충분이 될 것이다.
도 4는 표지된 뉴클레오티드 (220)에 대한 450 개의 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 구성하기 위한 예시의 방법을 도시한다.
도 5는 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)의 핵산 서열 (210)을 얻기 위하여 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 정렬 (520)하기 위한 예시의 방법을 도시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 방법, 조성물 및 장치 (100)는 핵산의 신속하고 자동화된 서열 결정에 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 이러한 방법, 조성물 및 장치 (100)는 매우 긴 핵산 분자의 서열 (210)을 얻기에 적절하다. 종래의 핵산 서열 결정 방법에 대한 잇점은 단일 서열 결정 실시에서의 긴 핵산 서열 (210)을 판독하는데 있어서 서열 (210) 데이타를 얻기 위한 더 빠른 속도 (초당 3,000,000 개 이하의 염기), 서열 결정의 저렴한 비용 및 생성된 서열 (210) 데이타의 단위당 필요한 작동 시간의 양에서의 더 큰 효율성을 들 수 있다.
하기의 상세한 설명은 개시된 구체예에 대한 더욱 철저한 이해를 제공하기 위하여 다수의 특이적인 상세한 설명을 포함한다. 그러나, 본 발명의 구체예는 이러한 특이적인 상세한 설명 없이도 실시될 수 있는 것이라는 점은 당업자에게 명백할 것이다. 즉, 당업자에게 공지된 장치, 방법, 절차 및 각각의 성분을 이하에서 상세히 설명하고자 한다.
본 발명의 특정의 구체예를 도 1에 예시하였다. 도 1은 주형 핵산 (200)의 다수의 복제물을 4 개의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에 넣는 것을 포함하는 핵산 서열 결정 방법을 예시한다. 반응 챔버 (110, 120, 130, 140) 각각은 합성 제제, 예컨대 DNA 폴리머라제, 주형 분자 (200)에 상보적인 프라이머 및 뉴클레오티드 전구체를 포함한다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 프라이머 분자는 표지되어 표지된 뉴클레오티드 거리를 측정하기 위한 소정의 출발점을 검출하게 된다. 뉴클레오티드 전구체는, 각각의 반응 챔버가 각각의 뉴클레오티드 전구체의 다수의 분자를 통상적으로 포함하기는 하더라도, 데옥시아데노신-5'-트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신-5'-트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시토신-5'-트리포스페이트 (dCTP) 및 데옥시티미딘-5'-트리포스페이트 (dTTP) 또는 데옥시우리딘-5'-트리포스페이트 (dUTP)의 각각의 1 이상의 분자를 포함하여야 한다.
또한, 각각의 챔버 (110, 120, 130, 140)는 표지된 뉴클레오티드 전구체의 한 유형을 포함하게 된다. 예를 들면, 제1의 반응 챔버 (110)는 표지된 dATP를 포함할 수 있으며, 제2의 반응 챔버 (120)는 표지된 dCTP를 포함할 수 있으며, 제3의 반응 챔버 (130)는 표지된 dGTP를 포함할 수 있고, 제4의 반응 챔버 (140)는 표지된 dTTP를 포함할 수 있다. 각각의 4 개의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에서의 한 유형의 표지된 뉴클레오티드 전구체의 소량을 첨가하면 랜덤 표지된 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)를 산출하게 된다. 각각의 챔버 (110, 120, 130, 140)에서, 모든 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)는 동일한 유형의 뉴클레오티드로 표지될 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 표지된 핵산 (230, 240, 250)이 합성될 수 있으며, 동일한 챔버내에서 실시되는 합성 및 분석으로 4 개의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에서 합성 및 분석할 수 있다. 또는, 표지된 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)는 하나의 세트의 용기, 예를 들면 시험관, 소형 원심분리 시험관 또는 정밀여과 시험관에서 생성될 수 있으며, 그후 미혼입 뉴클레오티드로부터 분리하고, 이를 검출기에 작동가능하게 커플링된 일련의 챔버 (110, 120, 130, 140)에서 분석하였다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 표지된 핵산 (230, 240, 250)은 4 개의 상이한 용기중에서 별도로 합성할 수 있으며, 이들 각각은 상이한 유형의 표지된 뉴클레오티드 전구체를 포함한다. 4 가지 유형의 표지된 핵산 (230, 240, 250)을 표지된 뉴클레오티드 (220) 거리의 분석을 위하여 단일 챔버 (110, 120, 130, 140)에서 함께 혼합할 수 있다. 이는 각 유형의 표지된 뉴클레오티드 (220)가 특징적으로 표지되고 검출될 수 있을 것을 요구한다. 또다른 구체예에서, 표지된 핵산 (230, 240, 250)을 단일 챔버에서 합성한 후, 이를 표지된 뉴클레오티드 (220)의 검출을 위하여 4 개의 챔버 (110, 120, 130, 140)로 분리하며, 각각의 챔버는 단일 유형의 독특하게 표지된 뉴클레오티드 (220)를 검출하도록 조절되는 검출기를 갖는다. 또다른 구체예에서, 모든 4 가지 유형의 특징적으로 표지된 뉴클레오티드 (220)를 포함하는 상보적인 핵산 스트랜드 (230, 240, 250)는 단일의 용기내에서 합성된 후, 4 가지 유형의 표지된 뉴클레오티드 각각을 확인할 수 있는 검출기를 사용하여 단일 챔버 (110, 120, 130, 140)내에서 분석할 수 있다.
특정의 구체예에서, 4 가지의 표지된 뉴클레오티드 전구체 각각은 미표지된 뉴클레오티드와는 특징적이며, 기타의 유형의 표지된 뉴클레오티드 (220)와도 특징적인 매우 가시적인 광학적 신호를 갖는다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 표지된 뉴클레오티드 (220)는 또한 매우 특징적일 수 있는 벌키 기로 표지될 수 있다. 이러한 구체예는 발광성 또는 벌키 기 표지에 국한된 것이 아니며, 당분야에서 공지된 임의의 유형의 뉴클레오티드, 예컨대 방사성, 핵자기 공명, 전자 상자성 공명, 전자 스핀 공명 등을 개시된 방법의 실시에 사용할 수 있다.
각종의 구체예에서, 핵산 폴리머라제는 프라이머의 3' 말단에서 하나의 뉴클레오티드 전구체를 추가하게 된다. 각각의 사이클의 신장의 경우, 단일 뉴클레오티드 전구체를 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)에 혼입한다. 뉴클레오티드 전구체의 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)로의 혼입은 주형 스트랜드 (200)를 사용하여 Watson-Crick 염기쌍 상호작용에 의하여 결정된다. 그래서, 주형 스트랜드 (200)의 서열은 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)의 서열 (210)로부터 결정될 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)에서의 표지된 뉴클레오티드 (220)는 이들에 결합된 벌키 기를 포함할 것이다. 벌키 기는 당업자에게 공지된 임의의 기타의 방법에 의하여 또는 가교에 의하여 결합될 수 있다. 예를 들면, 결합된 벌키 기를 포함하는 뉴클레오티드 전구체는 합성중에 상보적인 핵산 스트랜드 (230, 240, 250)에 혼입될 수 있다. 또는, 특정의 반응성기를 포함하는 뉴클레오티드 전구체는 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)에 혼입될 수 있으며, 벌키 기는 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)가 합성된 후 가교에 의하여 부가될 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 벌키 기는 임의의 유기, 무기 또는 금속 기 또는 임의의 항체가 될 수 있다. 금속 기가 표지된 뉴클레오티드 (220)에 결합되는 본 발명의 구체예에서, 금속은 순수한 금속, 예컨대 금 또는 은 또는 합금이 될 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 금속 기는 나노입자가 될 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 크기가 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 심지어 10 ㎚ 이상인 나노입자를 사용할 수 있는 것으로 간주할 수 있기는 하나, 나노입자는 크기가 약 1 ㎚가 된다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 표지된 핵산 (230, 240, 250)을 1 이상의 나노포어 (150)에 통과시킬 수 있다. 표지된 뉴클레오티드 (220)는 나노포어 (150)를 통과할 때 검출 유닛에 의하여 검출될 수 있다. 비제한적인 예에서, 나노포어 (150)는 분자 α-헤모리신에 의하여 형성될 수 있다. α-헤모리신은 지질 이중층 공극으로 자가 어셈블링되어 단일 DNA 분자가 막히지 않은 포어를 통과하게 된다. 문헌 [Akeson et al., 1999, Biophysical J. 77:3227-323]. 표지된 DNA의 이와 같은 나노포어 (150)로의 통과는 인가된 전압 전위의 존재하에서 나노포어에서의 이온 전류에 대한 표지된 뉴클레오티드 (220)의 영향에 의하여 검출될 수 있다. 전도성 표지, 예컨대 금속 나노입자의 나노포어 (150) 통과는 전기 검출기, 예컨대 전압 측정기, 저항 측정기 또는 전도율 측정기에 의하여 검출될 수 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 형광 또는 발광 표지의 나노포어 통과는 광학 검출기에 의하여 검출될 수 있다. 또다른 구체예에서, 검출 유닛은 주사 프로브 현미경을 포함할 수 있다. 벌키 기가 뉴클레오티드에 결합되는 본 발명의 구체예에서, 이러한 벌키 기는 주사 터널링 현미경 (STM) 또는 원자력 현미경 (AFM)에 의하여 검출될 수 있다. 이러한 구체예에서 검출 유닛은 나노포어 (150)에 작동가능하게 커플링될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 또는, 벌키 기로 표지된 상보적인 핵산 (230, 240, 250)은 표면에서 정렬되고 AFM 또는 STM에 의하여 주사 처리된다. 각종의 구체예에서, 검출 유닛은 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 거리를 기록하기 위하여 정보 처리 및 제어 시스템, 예컨대 컴퓨터에 작동가능하게 커플링될 수 있다.
표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 거리에 관한 반응 챔버 (110, 120, 130, 140) 각각에 대한 데이타를 수집 및 분석할 수 있다. (도 2). 거리 맵 (310, 320, 330, 340)은 각각의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에 대하여 구성할 수 있으며 (450), 그리하여 생성된 거리 맵 (310, 320, 330, 340)은 정렬 (520)하여 핵산 서열 (210)을 생성한다. (도 3). 각각의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에 대한 거리 맵 (310, 320, 330, 340)은 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 거리의 중첩 (420), 빈도수 (430) 및 신호 (440) 분석에 의하여 구성 (450)할 수 있다 . 거리 맵 (310, 320, 330, 340)은 비중첩 데이타 분석에 의하여 서열 (210)로 정렬 (520)될 수 있다. 거리 맵 (310, 320, 330, 340)이 구성 (450)되며, 정보 처리 및 제어 시스템, 예를 들면, 컴퓨터에 의하여 정렬 (520)될 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예는 DNA의 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)의 합성에 관한 것이다. 주형 스트랜드 (200)는 RNA 또는 DNA가 될 수 있다. RNA 주형 스트랜드 (200)를 사용하여, 합성 제제는 역전사 효소가 될 수 있으며, 이러한 예는 당업자에게 공지되어 있다. 주형 스트랜드 (200)가 DNA의 분자인 구체예에서, 합성 제제는 DNA 폴리머라제가 될 수 있으며, 이러한 예는 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)는 RNA의 분자가 될 수 있다. 이는 합성 제제가 RNA 폴리머라제일 것을 요구한다. 이러한 구체예에서는 프라이머는 필요치 않다. 그러나, 주형 스트랜드 (200)는 RNA 폴리머라제를 결합시키고, RNA 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)의 전사를 개시하는데 효과적인 프로모터를 포함하여야만 한다. 프로모터의 최적화는 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 구체예는 사용된 주형 분자 (200), 합성된 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)의 유형, 또는 사용된 폴리머라제의 유형으로서 제한되지 않는다. 실질적으로 주형 스트랜드 (200)로의 서열 (210)중의 상보적인 핵산 분자 (230, 240, 250)의 합성을 지지할 수 있는 임의의 주형 (200) 및 임의의 폴리머라제를 사용할 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 주형 분자 (200)는 표면, 예컨대 작용화된 유리, 규소, PDMS (폴리디메틸 실록산), 금, 은 또는 기타의 금속 코팅된 표면, 석영, 플라스틱, PTFE (폴리테트라플루오로에틸렌), PVP (폴리비닐 피롤리돈), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드, 라텍스, 나일론, 니트로셀룰로스, 유리 비이드, 자기 비이드 또는 핵산에 결합될 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 기타의 물질에 결합될 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 핵산 분자는 후술하는 바와 같은 표면상에서 배향될 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 작용기, 예컨대 표지는 주형 스트랜드 (200), 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250) 및 폴리머라제간의 상호작용이 입체 장애 없이 발생할 수 있도록 가교제에 공유 결합될 수 있다. 또는, 핵산은 가교제를 사용하여 표면에 결합될 수 있다. 통상의 가교기의 예로는 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민 등이 있다. 결합은 공유 결합이거나 또는 비공유 결합이 될 수 있다. 핵산 분자를 표면에 결합시키는 각종의 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이를 사용할 수 있다.
정의
본 발명의 개시를 위하여, 하기와 같은 용어는 하기와 같은 의미를 갖는다. 하기에서 정의되지 않은 용어는 통상의 의미에 의하여 사용하였다.
"항체"는 폴리클로날 및 모노클로날 항체뿐 아니라, 이의 분절을 포함한다. 또한, 항체는 재조합 항체, 화학 변형된 항체 및 인간화 항체 등이 있으며, 이들 모두는 단일쇄 또는 다중쇄가 될 수 있다.
"핵산"이라는 것은 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 가닥의 DNA 또는 RNA가 될 수 있을 뿐 아니라, DNA 또는 RNA의 임의의 변형 형태 또는 유사체가 될 수 있다. "핵산"은 길이가 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1000, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 100,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 150,000, 200,000, 500,000, 1,000,000, 1,500,000, 2,000,000, 5,000,000 또는 그 이상의 염기 내지는 전장 염색체 DNA 분자까지중에서 임의의 길이를 지닐 수 있다.
"뉴클레오티드 전구체"는 핵산으로 혼입되기 이전의 뉴클레오티드를 지칭한다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 뉴클레오티드 전구체는 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트이다. 각종의 치환 또는 변형은 이들이 폴리머라제에 의하여 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)로 혼입될 수 있을 때까지 뉴클레오티드 전구체의 구조중에 형성될 수 있는 것으로 간주할 수 있다. 예를 들면, 특정의 구체예에서, 리보스 또는 데옥시리보스 부분은 기타의 펜토스 당 또는 펜토스 당 유사체로 치환될 수 있다. 기타의 구체예에서, 인산염 기는 예컨대 포스포네이트, 설페이트 또는 설포네이트로 치환될 수 있다. 기타의 구체예에서, 퓨린 또는 피리미딘 염기는, 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)로 혼입된 뉴클레오티드 전구체의 서열 (210)이 주형 스트랜드 (200)의 서열을 반영하는 한, 기타의 퓨린 또는 피리미딘 또는 이의 유사체로 변형 또는 치환될 수 있다.
"태그" 또는 "표지"는 서로 번갈아 사용할 수 있으며, 이는 표지가 결합되는 뉴클레오티드 (220)를 식별하는데 사용될 수 있는 임의의 원자, 분자, 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 본 발명의 각종의 구체예에서, 이러한 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합될 수 있다. 비제한적인 예에서, 표지는 형광, 인광, 발광, 전기발광, 화학발광 또는 임의의 벌키 기가 될 수 있거나 또는, Raman 또는 기타의 분광학적 성질을 나타낼 수 있다. 가시광, 자외선 및 적외선 분광학, Raman 분광학, 핵자기 공명, 양전자 방출 단층 촬영기, 주사 프로브 현미경 및 당업자에게 공지된 기타의 기법을 비롯한, 표지된 뉴클레오티드 (220)를 검출 및 확인할 수 있는 임의의 기법을 사용할 수 있는 것으로 판단된다. 특정의 구체예에서, 뉴클레오티드 전구체는 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)의 합성후, 그러나 표지된 뉴클레오티드 (220)의 검출 이전에 벌키 기로 2 차 표지될 수 있다.
부정관사 ("a" 또는 "an")는 1 개의 실체보다 많은 1 이상을 지칭하는 것으로 이해한다.
본 명세서에서 사용한 바와 같이, "작동가능하게 커플링된"이라는 것은 장치 (100) 및/또는 시스템의 2 이상의 유닛 사이의 작용적 상호작용이 있는 것을 의미한다. 예를 들면, 컴퓨터가 검출기에 의하여 검출된 신호에서의 데이타를 입수, 처리, 저장 및/또는 전송할 수 있을 경우, 검출기는 컴퓨터에 "작동가능하게 커플링"될 수 있다.
핵산
주형 분자 (200)는 당업자에게 공지된 임의의 기법에 의하여 생성될 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 주형 분자 (200)는 천연 DNA 또는 RNA 분자, 예를 들면, 염색체 DNA 또는 전령 RNA (mRNA)가 될 수 있다. 염색체, 미토콘드리아 또는 클로로플라스트 DNA 또는 리보좀, 전달 RNA, 불균일 핵 RNA 또는 전령 RNA와 같은 비제한적인 예를 비롯한 실질적으로 임의의 천연 핵산은 개시된 방법에 의하여 제조 및 서열 결정될 수 있다. 서열 결정된 핵산은 당업자에게 공지된 표준의 방법에 의하여 원핵 또는 진핵 공급원으로부터 얻을 수 있다.
각종 형태의 핵산의 제조 및 분리 방법은 공지되어 있다. 문헌 [Guide to Molecular Cloning Techniques, eds. Berger and Kimmel, Academic Press, New York, N.Y., 1987; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]. 당업계에서 공지된 주형 핵산 (200)의 임의의 제조 방법은 개시된 방법에 사용될 수 있다.
표지된 뉴클레오티드 전구체
각각의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)는 랜덤 표지된 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)를 생성하기 위하여 표지된 뉴클레오티드 전구체를 포함할 수 있다. 각종의 표지, 예컨대 형광 표지에 공유 결합된 뉴클레오티드 전구체는 표준의 공급처 (예, 몰레큘라 프로브, 인코포레이티드, 미국 오레건주 유진 소재)로부터 얻을 수 있다. 또는, 표지된 뉴클레오티드 전구체는 당업자에게 공지된 표준의 기법에 의하여 생성할 수 있다. 표지된 뉴클레오티드 전구체를 제조하기 위한 임의의 제조 방법을 본 발명의 보호받고자 하는 실시에 사용할 수 있다.
비제한적인 예로서, 표지된 뉴클레오티드 전구체의 비율이 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)중의 동일한 유형의 뉴클레오티드의 총량의 약 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 또는 85%인 것으로 간주할 수 있을지라도, 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에 첨가되는 표지된 뉴클레오티드 전구체의 비율은 10%이다. 예를 들면, 챔버 (110)가 표지된 아데노신 뉴클레오티드 전구체를 포함하는 경우, 챔버 (110)는 10% 표지된 아데노신 뉴클레오티드 및 90% 미표지된 아데노신 뉴클레오티드를 미표지된 시토신, 구아닌 및 티미딘 뉴클레오티드와 함께 포함할 수 있다.
낮은 비율의 표지된 뉴클레오티드 (220)의 사용에 의하여 신호 신장이 발생한다. 이웃하는 2 개의 뉴클레오티드간의 정상의 거리는 1/3 ㎚이다. 10%의 뉴클레오티드 전구체가 표지되는 경우, 상보적인 핵산 (230, 240, 250)중의 이웃한 2 개의 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 평균 거리는 약 13.6 ㎚가 된다. 이웃한 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 거리의 신장은 전도율 측정, 분광 분석, AFM 또는 STM과 같은 기법에 의하여 검출된다. 이러한 방법은 1/3 ㎚ 로 이격된 표지 사이를 식별하지는 못한다. 표지는 예컨대 분광계, 발광측정기, NMR (핵자기 공명), 질량 분광학, 화상 시스템, 하전 커플링 장치 (CCD), CCD 카메라, 광전자 증배관, 애벌런치 광다이오드, AFM 또는 STM과 같은 당업계에서 공지된 임의의 검출기를 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 각종의 구체예에서, 혼입된 반응기 및/또는 합텐을 갖는 뉴클레오티드 전구체는 2차 표지, 예컨대 항체에 결합될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 유형의 검출 가능한 표지, 예컨대 Raman 태그, 형광발색단, 발색단, 방사성 동위원소, 효소 태그, 항체, 화학발광, 전기발광, 친화도 표지 등을 사용할 수 있다. 당업자라면 상기의 표지 부분 및 본 명세서에서 언급되지 않은 기타의 공지의 표지 부분을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다는 것을 숙지하고 있을 것이다.
사용할 수 있는 표지 부분은 형광발색단, 예컨대 Alexa 350, Alexa 430, AMCA (7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산), BODIPY (5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산) 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL (플루오레세인), BODIPY-R6G (6-카르복시로다민), BODIPY-TMR (테트라메틸로다민), BODIPY-TRX (Texas Red-X), Cascade Blue, Cy2 (시아닌-2), Cy3, Cy5, 5-카르복시플루오레세인, 플루오레세인, 6-JOE (2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 5, Pacific Blue, 로다민 Green, 로다민 Red, ROX (6-카르복시-X-로다민), TAMRA (N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민), 테트라메틸로다민 및 Texas Red 등이 될 수 있다. 형광 또는 발광 표지는 표준의 공급처, 예컨대 미국 오리건주 유진에 소재하는 몰레큘라 프로브로부터 입수 가능하다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 뉴클레오티드는 벌키 기로 표지될 수 있다. 이러한 벌키 기의 비제한적인 예로는 항체, 양자점 및 금속 기 등이 있다. 항체는 검출 가능한 마커로 표지될 수 있다. 검출 가능한 마커는 효소, 상자성 물질, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 비오틴, 형광발색단, 발색단, 화학발광발색단, 중금속 및 방사성 동위원소로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
표지로서 사용되는 금속 기는 금속, 예컨대 금 또는 은, 또는 금속의 혼합물의 한 형태로 구성될 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 금속 기는 나노입자를 포함할 수 있다. 나노입자의 제조 방법은 공지되어 있다. 문헌 [미국 특허 제6,054,495호; 제6,127,120호; 제6,149,868호; Lee and Meisel, J. Phys. Chem. 86:3391-3395, 1982; Jin et al., 2001]. 또한, 나노입자는 통상의 공급처 (예, 나노프로브 인코포레이티드, 미국 뉴욕주 얍행크 소재; 폴리사이언스, 인코포레이티드, 미국 펜실베이니아주 워링턴 소재)로부터 입수할 수 있다. 특정의 구체예에서, 나노입자는 뉴클레오티드에 결합되기 이전에 서로 가교될 수 있다. 나노입자의 가교 방법은 당업계에서 공지되어 있다. 문헌 [Feldheim, "Assembly of Metal nanoparticle arrays using molecular bridges," The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, pp. 22-25]. 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 등을 포함하는 가교 결합된 나노입자를 사용하여 예를 들면 상이한 유형의 뉴클레오티드를 위한 식별 가능한 질량 표지를 제공할 수 있다. 임의의 크기를 갖는 나노입자를 고려할 수 있기는 하나, 본 발명의 특정의 구체예에서, 나노입자는 직경이 약 0.5∼5 ㎚가 될 수 있다.
또한, 벌키 기로서 사용되는 항체는 나노입자로 표지된다. 금 나노입자는 설프히드릴기를 통하여 항체, 단백질 및 펩티드에 공유 결합을 형성하는 표면상의 말레이미드 작용기와 함께 이용 가능하다. (모노말레이미도 NANOGOLD (등록상표), 인티그레이티드 DNA 테크놀로지즈, 미국 아이오와주 코랄빌 소재). 나노입자를 사용하여 항체 및/또는 뉴클레오티드를 표지시키는 기법은 공지되어 있다. 예를 들면, 항체는 온화한 환원제, 예컨대 머캅토에틸아민 염산염 (MEA)을 사용하여 힌지 부위에서의 이황화물 결합을 환원시킨 후, 금 나노입자를 사용하여 표지될 수 있다. MEA로부터 환원된 항체의 분리후, 모노말레이미도 NANOGOLD (등록상표)와 반응시킬 수 있다. 겔 배제 크로마토그래피를 사용하여 유리 금 나노입자로부터 공액 항체를 분리할 수 있다. 항체 분절은 유사한 방법으로 표지될 수 있다. 또한, 금 나노입자는 티올기를 포함하는 표지된 뉴클레오티드 전구체에 직접 결합될 수 있다.
프라이머
프라이머는 당업계에서 공지된 임의의 방법에 의하여 얻을 수 있다. 일반적으로, 프라이머는 더 긴 것을 사용할 수도 있으나, 길이가 10∼20 개 염기인 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 프라이머는 주형 핵산 분자 (200)의 공지의 부분에 정확하게 상보적이도록 설계한다. 본 발명의 한 구체예에서, 프라이머는 주형 핵산 (200)의 3' 말단에 근접하게 위치한다. 예를 들면 포스포라미디트 화학을 사용하는 자동화된 핵산 합성기를 사용한 임의의 서열을 갖는 프라이머의 합성 방법은 공지되어 있으며, 이러한 장치는 표준의 공급처, 예컨대 애플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 또는 밀리포어 코포레이션 (미국 매사츄세츠주 베드포어 소재)로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 기타의 구체예는 공지의 프라이머 결합 부위의 부재하에서 핵산의 서열 결정을 포함한다. 이러한 경우, 랜덤 프라이머, 예컨대 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 염기 또는 그 이상의 길이를 갖는 랜덤 헥사머 또는 랜덤 올리고머를 사용할 수 있으며, 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)의 중합 반응을 개시할 수 있다. 단일 주형 스트랜드 (200)상에서의 다중 중합 반응을 피하기 위하여, 부동화 표면에 대한 결합 부위 부근에서 주형 분자 (200)로 하이브리드화된 것을 제외한 프라이머는 합성 반응을 개시하기 이전에 공지의 방법에 의하여 제거할 수 있다.
반응 챔버
본 발명의 특정의 구체예에서, 4 개의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)를 사용하여 서열 결정 분석을 실시한다. "A"로 표기한 한 챔버 (110)는 표지된 dATP를 포함한다. "C"로 표기한 제2의 챔버 (120)는 표지된 dCTP를 포함한다. "G"로 표기한 제3의 챔버 (130)는 표지된 dGTP를 포함한다. "T"로 표기한 제4의 챔버 (140)는 표지된 dTTP (또는 별도로 표지된 dUTP)를 포함한다. 각각의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)는 수성 환경내에서 주형 핵산 (200), 프라이머, 폴리머라제 및 뉴클레오티드 전구체를 지지하도록 설계된다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 핵산은 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)내에서 부동화 표면에 결합될 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)는 Pelletier 부품의 포함에 의하여 또는 기타의 당업자에게 공지된 방법에 의하여 온도가 조절되도록 설계한다. 핵산 중합에 사용되는 소 부피의 액체에 대한 온도 조절 방법은 당분야에 공지되어 있다. (예, 미국 특허 제5,038,853호, 제5,919,622호, 제6,054,263호 및 제 6,180,372호).
본 발명의 특정의 구체예에서, 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)는 1 이상의 유체 채널에 작동가능하게 커플링되어 분자 디스펜서, 폐 포트, 주형 (200) 부하 포트, 또는 뉴클레오티드 공급원으로의 결합을 제공할 수 있다. 이들 모든 성분은 컴퓨터 칩 제조 또는 미세모세관 칩 제조 분야에서 공지된 바와 같은 회분식 제조법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 장치 (100)의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140) 및 기타의 성분은 단일 집적 칩으로서 생성될 수 있다. 이러한 칩은 당업계에서 공지된 기법, 예컨대 포토리토그래피 및 에칭에 의하여 생성될 수 있다. 그러나, 이러한 제조 방법에 의하여 한정되는 것은 아니며, 당업계에서 공지된 기타의 방법, 예컨대 레이저 기화 증착, 사출 성형, 주조 또는 임프린팅 기법을 사용할 수 있다. 나노전자기계 시스템의 제조 방법은 본 발명의 특정의 구체예에 사용할 수 있다. 문헌 [Craighead, Science 290:32-36, 2000]. 마이크로 칩은 공급처, 예컨대 캘리퍼 테크놀로지즈 인코포레이티드 (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재) 및 ACLARA 바이오사이언스 인코포레이티드 (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)로부터 입수 가능하다.
반응 챔버 (110, 120, 130, 140)를 포함하는 물질 및 장치 (100)의 기타의 성분은 검출 유닛에 사용되는 여기 및 방출 주파수에서 전자기 방사에 투명하도록선택할 수 있다. 유리, 규소 및, 가시 주파수 범위내에서 일반적으로 투명한 임의의 기타의 물질을 장치 (100)의 구성에 사용할 수 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 장치 (100) 및/또는 부속 장치의 일부분은 원자력 현미경 또는 주사 터널링 현미경의 선단이 표지된 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)를 주사 처리하여 벌키 기 사이의 거리를 측정하도록 설계할 수 있다.
DNA의 배향
벌키 기 (220)로 표지된 상보적인 핵산 스트랜드 (230, 240, 250)는 AFM 또는 STM에 의한 주사 이전에 표면상에서 배향될 수 있다. 표면상의 핵산 분자를 배향시키는 기법은 당분야에서 널리 알려져 있다. (예, 미국 특허 제5,840,862호; 제6,054,327호; 제6,225,055호; 제6,265,153호; 제6,303,296호; 제6,344,319호). 비제한적인 예에서, 표지된 핵산 스트랜드 (230, 240, 250)를 합성할 수 있다. 표면, 예컨대 실란화, 금 코팅된 또는 유도체화된 유리 슬라이드를 반응 챔버에 침지시킬 수 있으며, 표지된 핵산 (230, 240, 250)의 한 단부는 표면에 결합되도록 할 수 있다. 예를 들면, 사용한 프라이머는 이의 5' 단부에서 비오틴에 공유 결합될 수 있으며, 표면을 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 코팅될 수 있다. 결합 표지된 핵산 (230, 240, 250)을 포함하는 표면을 용액으로부터 서서히 꺼낸다. 공기-액체 계면의 메니스커스가 결합된 핵산 (230, 240, 250)을 통과하면 이들은 서로 평행하게 배향하게 되어 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 거리를 AFM 또는 SPM 주사에 의하여 더욱 정확하게 측정하게 된다.
나노포어
본 발명의 특정의 구체예에서, 장치 (100)는 1 이상의 나노포어 (150)를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 나노포어 (150)는 직경이 1∼10 ㎚이다. 특정의 구체예에서, 나노포어 (150)는 지질 이중층 막내에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, α-헤모리신 서브유닛은 지질 이중층내의 1.5 ㎚ 나노포어 (150)로 자동 어셈블링될 수 있다. 예를 들면, 120 볼트의 전압 전위차를 지질 이중층에 인가하여 이온이 나노포어 (150)를 통하여 유동되도록 할 수 있다. 단일 가닥 표지된 핵산 (230, 240, 250)의 나노포어의 통과는 이온 흐름을 차단하여 봉쇄 진폭 또는 봉쇄 역학을 사용하여 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 거리를 측정하게 된다. 나노포어 (150)를 통한 이온 전류의 변동을 측정하고, Axopatch 200B 기기 (액손 인스트루먼츠, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 사용하여 기록할 수 있다. 데이타는 pClamp6 소프트웨어 (액손 인스트루먼츠, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 사용하여 분석할 수 있다.
본 발명의 구체예는 나노포어 (150)의 유형에 의하여 한정되지 않는다. 당업계에서 공지된 임의의 나노포어 (150)는 개시된 방법에 사용할 수 있다. 약 2.6 ㎚ 직경을 갖는 나노포어 (150)는 이중 가닥 핵산 분자 (230, 240, 250)의 통과를 허용한다. 뉴클레오티드 (220)가 벌키 기로 표지된 본 발명의 구체예에서, 나노포어 (150)는 표지된 핵산 (230, 240, 250)의 통과를 허용하도록 더 클 수도 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 나노포어 (150)는 공지된 나노리쏘그래피 기법에 의하여 고상 매트릭스, 예컨대 규소, 산화규소, 이산화규소 또는 게르마늄 칩에 구성할 수 있으며, 이러한 기법의 비제한적인 예로는 화학 증착, 전기화학 증착, 화학 증착, 전해도금, 열 확산 및 증발, 물리적 증착, 졸-겔 증착, 집속 전자 비임, 집속 이온 비임, 분자 비임 에피탁시, 딥펜 나노리쏘그래피, 반응성 이온 비임 에칭, 화학 보조 이온 비임 에칭, 마이크로파 보조 플라즈마 에칭, 전기적 산화, 주사 프로브 기법, 화학 에칭, 레이저 기화 증착 또는 당분야에 공지된 기타의 기법 (예, 미국 특허 제6,146,227호) 등을 들 수 있다.
본 발명의 각종의 구체예에서, 나노포어 (150)는 칩내에서 1 이상의 센서 층을 투과할 수 있다. 센서 층은 규소, 이산화규소, 게르마늄, 비소화게르마늄, 및 금속계 조성물, 예컨대 금속 또는 금속 산화물을 비롯한 반도체 소재를 포함할 수 있으며, 이러한 물질에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 센서 층은 전자 비임, 이온 비임 및/또는 레이저 리쏘그래피 및 에칭에 의하여 처리한 후 에칭 처리하여 채널, 홈 또는 홀을 생성할 수 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 채널, 홀 또는 홈은 유기 또는 무기 부착물로 코팅시켜 채널, 홀 또는 홈의 직경을 감소시키거나 또는, 예컨대 친수성과 같은 특정 유형을 갖는 표면을 제공할 수 있다. 금속을 포함하는 전도성 센서 층은 주사 터널 현미경 (STM) 또는 원자력 현미경 (AFM) 선단으로부터 또는 용액으로부터 필드 증발에 의하여 반도체 표면상에 부착될 수 있다. 절연 센서 층은 반도체의 표면을 절연 조성으로 산화시켜 형성될 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 채널 또는 홈은 산화물 에칭 용액중에서 STM/AFM 선단을 사용하는 방법을 비롯한 당업계에서 공지된 각종 기법에 의하여 반도체 표면으로 에칭시킬 수 있다. 채널이 형성된 후, 2 개의 반도체를 대향시켜 반도체를 투과하는 1 이상의 나노포어 (150)를 형성할 수 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 주사 프로브, 화학 에칭 기법 및/또는 미세기계가공을 사용하여 반도체 기판중의 마이크로미터 단위 또는 나노미터 단위의 공극 (150)을 절단할 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 나노포어 (150)는 고 처리량 전자-비임 리쏘그래피 시스템 (예, http://www.mdatechnology.net/techsearch.asp?articleid=510)을 사용하여 형성할 수 있다. 전자-비임 리쏘그래피를 사용하여 실리콘 칩에 5 ㎚ 정도로 작은 특징을 기록할 수 있다. 실리콘 표면상에 코팅된 민감성 레지스트, 예컨대 폴리메틸-메타크릴레이트는 마스크를 사용하지 않고 패턴을 형성시킬 수 있다. 전자-비임 어레이는 필드 방출기 클러스터를 마이크로채널 증폭기와 조합하여 전자 비임의 안정도를 증가시킴으로써 낮은 전류에서의 작동을 가능케 한다. 본 발명의 특정의 구체예에서, SoftMask (상표명) 컴퓨터 제어 시스템을 사용하여 반도체 칩 기판상의 나노단위의 특징을 갖는 전자-비임 리쏘그래피를 제어할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 나노포어 (150)는 집속 원자 레이저를 사용하여 생성될 수 있다. 문헌 [예, Bloch et al., "Optics with an atom laser beam," Phys. Rev. Lett. 87:123-321, 2001]. 표준 레이저 또는 집속 전자 비임과 마찬가지로 집속 원자 레이저를 리쏘그래피에 사용할 수 있다. 이러한 기법은 칩에 미크론 단위 또는 심지어는 나노 단위의 구조체를 생성할 수 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 딥펜 나노리쏘그래피를 사용하여 나노포어 (150)를 형성할 수 있다, 문헌 [Ivanisevic et al., "Dip-pen Nanolithography on Semiconductor Surface," J. Am. Chem. Soc., 123: 7887-7889, 2001]. 나노포어 (150)는 정규 포토리쏘그래피 기법과 조합한 딥펜 나노리쏘그래피를 사용하여 형성될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 이온 비임 리쏘그래피를 사용하여 칩에 나노포어 (150)를 생성할 수 있다. [예, Siegel, "Ion Beam Lithography," VLSI Electronics, Microstructure Science, Vol. 16, Einspruch and Watts eds., Academic Press, New York, 1987]. 미세 집속 이온 비임은 마스크를 사용하지 않고도 레지스트층에 직접 나노 단위의 특징을 기록하는데 사용될 수 있다. 또는, 넓은 이온 비임을 마스크와 조합 사용하여 100 ㎚ 단위 정도로 작은 특징을 형성할 수 있다. 화학 에칭, 예를 들면, 불화수소산을 사용한 화학 에칭은 레지스트에 의하여 보호되지 않는 노광 처리된 실리콘 또는 기타의 칩 소재를 제거하는데 사용될 수 있다. 당업자는 상기에서 개시된 기법에 의하여 본 발명의 방법이 제한되는 것이 아니며, 나노포어 (150)는 당업계에서 공지된 임의의 방법에 의하여 형성될 수 있다는 것을 숙지하고 있을 것이다.
검출 유닛
본 발명의 구체예는 사용한 검출 장치의 유형에 의하여 제한되지 않으며, 임의의 공지의 검출 유닛은 개시된 방법 및 장치 (100)에 사용할 수 있다.
SPM 검출기
본 발명의 특정의 구체예에서, 검출 유닛은 주사 프로브 현미경 (SPM)을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 검출 유닛은 주사 터널링 현미경 (STM)을 포함할 수 있다. 정전류 방식의 STM은 벌키 기로 표지된 (220) 불규칙 표면, 예컨대 뉴클레오티드를 측정하며, 이러한 표지 (220) 사이의 거리를 측정하고 기록할 수 있다. STM은 단일 원자 포인트까지 예리해지는 좁은 금속성 선단을 사용하여 샘플을 주사 처리하며, 이는 압전 물질에 의하여 스캐너에 물리적으로 연결되어 전기 전도성 표면을 원자 단위까지 조사할 수 있도록 한다. 이는 선단과 샘플간의 작은 바이어스 전압을 인가하여 달성된다. 2 개 사이의 거리가 클 경우, 이들 사이에는 전류가 흐르지 않게 된다. 반대로, 선단이 물리적 접촉 없이 샘플에 너무 근접할 경우, 이들 사이에는 전류가 흐르게 될 것이다. 선단과 샘플 사이의 전류의 측정에 의하여 DNA 분자의 표면의 원자 정보를 맵핑 처리하여 선단 아래로 통과시 표지된 뉴클레오티드 (220)에 결합된 벌키 기 사이의 거리를 측정할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 검출 유닛은 원자력 현미경 (AFM)을 포함할 수 있다. 전도성 AFM을 사용하여 선단은 샘플과 접촉한 상태로 있게 되며, 캔틸레버 편향 신호를 사용하여 선단과 샘플 사이에 일정한 힘을 유지하도록 하여 토포그래픽 화상을 형성한다. DC 바이어스를 선단에 인가하면서, 샘플을 접지 전위로 하고, 스캐너 헤드에서의 전치 증폭기는 선단과 샘플을 통과하는 전류를 측정하여 화상을 생성한다. 이는 염기 거리 맵 (310, 320, 330, 340)이 선단 아래를 통과할 때 염기 거리 맵 (310, 320, 330, 340)이, 표지된 뉴클레오티드 (220)에 결합된 벌키 기 사이에서 측정된 거리로부터 구성하도록 한다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 검출 유닛은 기타의 SPM, 예컨대 자기력 현미경, 횡력 현미경, 힘 변조 현미경, 상 검출 현미경, 정전력 현미경, 주사 열 현미경, 근접 주사 광학 현미경, 펄스력 모드 및 마이크로열 분석을 포함할 수 있다. 이러한 검출 유닛의 사용 방법은 당분야에서 주지되어 있다.
전기 검출기
본 발명의 특정의 구체예에서, 전기 검출기는 전도층에 수직이며 이를 투과하는 1 이상의 나노포어 (150), 동력 공급 및 1 이상의 전도층에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 검출기는 전류계, 전압계, 캐패시턴스 측정기 및/또는 전도율 측정기를 포함하여 유도된 전류, 전압, 저항 등을 측정할 수 있다. 특정의 구체예에서, 기타의 전기 부품, 예컨대 저항기 또는 캐패시터는 검출기와 관련한 전기 회로에 포함될 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)는 저 전도율 수성 완충액으로 충전될 수 있다. 전기 전위를 나노포어 (150)의 측면에 배치된 전도층에 인가할 수 있다. 완충액이 단독으로 나노포어 (150)에 존재할 경우, 전도층 사이의 저항은 높다. 나노포어 (150)를 통과하는 핵산의 미표지된 부위의 존재는 나노포어 (150)를 가로질러서 전도율이 약간 증가하게 된다. 고전도성 표지, 예컨대 금속 나노입자를 사용한 표지된 뉴클레오티드 (220)의 통과에 의하여 검출기에서의 검출 가능한 신호를 생성하는 전도율이 크게 증가된다. 신호 사이의 시간차를 측정하고, 이를 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 거리를 측정하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 나노포어 (150)를 가로지르는 전류는 전압으로 변환되며, 이는 Axopatch 200A (액손 인스트루먼츠, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 또는 Dagan 3900A 팻치 클램프 증폭기 (데이간 인스트루먼츠, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용하여 증폭될 수 있다. 신호는 프리퀀시 디바이시즈 (미국 매사츄세츠즈 헤이버힐 소재)의 저 통과 Bessel 필터를 사용하여 필터링하였다. 데이타는 내셔날 인스트루먼츠 (미국 텍사스주 오스틴 소재)의 AT-MIO-16-X 16-비트 보드 및 LAB WINDOWS/CVI 프로그램을 사용하여 디지탈화하였다. 칩은 뮤-금속 박스 (애뮤니얼, 미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재)를 사용하여 전기 및 자기 노이즈 원으로부터 차폐시킬 수 있다.
분광 검출기
본 발명의 또다른 구체예에서, 발광성 표지에 연결된 표지된 뉴클레오티드 (220)를 광원 및 광검출기, 예컨대 다이오드-레이져 조사기 및 광섬유 또는 광트랜지스터 검출기를 사용하여 검출할 수 있다. 문헌 [Sepaniak et al., J. Microcol. Separations 1:155-157, 1981; Foret et al., Electrophoresis 7:430-432, 1986; Horokawa et al., J. Chromatog. 463:39-49 1989; 미국 특허 제5,302,272호]. 기타의 예시적인 광원의 예로는 수직 공동 표면 방출 레이저, 측면 발광 레이저, 표면 발광 레이저 및 양자 공동 레이저, 예를 들면 콘티넘 코포레이션 Nd-YAG 펑핑 처리한 Ti:사파이어 턴테이블 고상 레이저 및 Lambda Physik 엑시머 펑핑 처리한 염료 레이저 등이 있다. 기타의 예시적인 광검출기의 예로는 광다이오드, 애벌런치 광다이오드, 광전자 증배관, 멀티애노드관, 광트랜지스터, 진공 광다이오드, 실리콘 광다이오드 및 전하 결합 소자 (CCD) 등이 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 광검출기, 광원 및 나노포어 (150)는 공지의 N-웰 상보적인 금속 산화물 반도체 (CMOS) 프로세스 (오빗 세미컨덕터, 미국 캘리포니아주 써니베일 소재)를 사용하여 반도체 칩으로 제작할 수 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 검출기, 광원 및 나노포어 (150)는 실리콘 온 인슐레이터 CMOS 프로세스 (예, 미국 특허 제6,117,643호)로 제작될 수 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 다이오드-레이저 조사기 및 CCD 검출기의 어레이를 반도체 칩에 배치할 수 있다. 문헌 [미국 특허 제4,874,492호 및 제5,061,067호; Eggers et al., BioTechniques 17: 516-524, 1994].
본 발명의 특정의 구체예에서, 고 민감성 냉각된 CCD 검출기를 사용할 수 있다. 냉각된 CCD 검출기는 80% 이하의 단일 광자 검출 가능성, 높은 공간 해상도의 픽셀 사이즈 (5 미크론) 및 근적외선 스펙트럼을 통한 가시광선에서의 감도를 갖는다. 문헌 [Sheppard, Confocal Microscopy: Basic Principles and System Performance in: Multidimensional Microscopy, P.C. Cheng et al. eds., Springer-Verlag, New York, N.Y. pp. 1-51, 1994]. 본 발명의 또다른 구체예에서, 코일 화상 강화된 커필링 소자 (ICCD)는 단일 광자 계수 레벨에 근접하는 광검출기로서 사용할 수 있다. (미국 특허 제6,147,198호). 작은 수의 광자는 형광면상에 충돌하는 전자의 애벌런치를 야기하여 발광된 화상을 생성한다. 이러한 형광면은 광 커플러를 통한 증폭기에 연결된 CCD 칩 부위에 의하여 감작화된다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 칩상의 CCD 검출기는 자외선, 가시광선 및/또는 적외선 스펙트럼광에 민감해질 수 있다. (미국 특허 제5,846,708).
본 발명의 특정의 구체예에서, 나노포어 (150)는 반도체 칩상의 검출기 및 광원에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 검출기는 백그라운드광을 최소화하기 위하여 광원에 수직으로 배치될 수 있다. 발광 표지의 여기에 의하여 생성된 광자는 광 섬유에 의하여 수집될 수 있다. 수집된 광자는 CCD 검출기에 전달되며, 광을 검출하고 정량화할 수 있다. 표지된 뉴클레오티드 (220)가 검출되는 시간을 기록하고, 뉴클레오티드 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 구성할 수 있다. CCD 검출기와 작동 가능하게 접촉되는 반도체 칩상의 광 섬유의 배치 방법은 공지되어 있다. (미국 특허 제6,274,320호).
본 발명의 특정의 구체예에서, 애벌런치 광다이오드 (APD)는 낮은 광 레벨을 검출하도록 생성될 수 있다. APD 기법은 전자 증폭 효과를 위한 광다이오드 어레이를 사용한다. (미국 특허 제6,197,503호). 본 발명의 또다른 구체예에서, 광원, 예컨대 발광 다이오드 (LED) 및/또는 반도체 레이저는 반도체 칩에 통합될 수 있다. (미국 특허 제6,197,503호). 레이저 또는 다이오드 광 비임을 형성하는 회절 광학 소자를 칩에 통합시킬 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 광원은 핵산에 연결된 감광성 표지, 예컨대 플루오레세인을 여기시키는 전자기 방사를 생성한다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 공기 냉각된 아르곤 레이저는 488 ㎚에서 플루오레세인-표지된 핵산 분자 (230, 240, 250)를 여기시킨다. 발광된 광은 광섬유, 렌즈, 화상 분광계 및 0℃ 열전기 냉각된 CCD 카메라를 포함하는 집진 장치 시스템에 의하여 수집될 수 있다. 형광 검출기의 또다른 예는 당분야에 공지되어 있다. (예, 미국 특허 제5,143,8545호).
핵산 서열 측정
본 발명의 특정의 구체예에서, 상보적인 핵산 (230, 240, 250)의 서열 (210) 결정은 각각의 유형의 표지된 뉴클레오티드 (220)에 대한 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 구성 (450)하고, 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 정렬 (520)하여 완전 서열 (210)을 생성한다 (도 4 및 도 5). 주형 핵산 (200)의 서열은 결정된 서열 (210)에 정확히 상보적이다. 예시의 구체예에서, 각각의 유형의 표지된 뉴클레오티드 (220)에 대한 거리 맵 (310, 320, 330, 340)은 도 4의 방법에 의하여 구성 (450)한다. 표지된 뉴클레오티드 (220)의 랜덤 표지 및 검출을 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)상에서 실시하여 각각의 스트랜드 (230, 240, 250)에서의 뉴클레오티드가 표지되는 (220) 비율을 얻는다. 표지된 뉴클레오티드 (220)의 비율은 사용된 표지화 및 검출 절차에 따라 달라질 수 있다. 한 구체예에서, 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 용이한 검출 가능한 거리를 얻기 위하여, 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)상의 동일한 유형을 갖는 뉴클레오티드의 약 10%가 표지 (220)된다. 표지된 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)의 합성후, 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 거리를 얻는다 (410). (도 2). 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이에서 얻은 거리 (410)는 도 2에 도시되어 있다. 얻은 거리 (410)를 사용하여 각각의 유형의 표지된 뉴클레오티드 (220)에 대한 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 구성 (450)할 수 있다.
본 발명의 각종의 구체예에서, 얻은 거리에 대하여 중첩 분석을 실시 (420)하였다. 이는 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)가 동일한 부위에서 개시 및 종료되도록 고리를 정렬하도록 한다. 한 구체예에서, 중첩 분석 (420)은 위치 중첩을 최대화 하는 것을 포함한다. 다수의 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)를 사용하기 때문에, 서열 (210)에서의 각각의 뉴클레오티드는 상이한 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)를 다수회 표지하게 된다. 그러므로, 중첩을 최대화하는 것은 각각의 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)상의 표지된 뉴클레오티드 (220)의 위치에 해당하도록 상기에서 얻은 거리를 정렬 (420)한다. 또다른 방법, 예컨대 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)의 개시 또는 종료의 단독 표지는, 상기에서 얻은 거리를 정렬 (420)하기 위하여 중첩 분석 대신에 또는 이외에 사용할 수 있다. 얻은 거리를 정렬 (420)하고, 빈도 분석을 수행 (430)하여 각각의 표지된 위치 주위에서의 표지된 뉴클레오티드 (220)의 갯수를 결정한다. 한 구체예에서, 표지 및 검출 방법의 독립적이고 균일한 성질 및 다수의 법칙을 사용함으로써, 단일 가닥에 표지될 가능성으로서, 표지된 뉴클레오티드 (220)가 각각의 위치에서 대략적으로 각각의 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)의 동일한 가능성으로 표지화되는 것으로 추정할 수 있다. 그래서, 10% 표지된 뉴클레오티드 (220)를 사용한 예에서, 1,000 개의 스트랜드 (230, 240, 250)를 사용할 경우, 단일 위치에서 뉴클레오티드가 표지 (220)되는 시간의 횟수는 1,000의 10% 또는 100 배가 되어야만 한다.
이러한 고찰을 이용하면, 독립 검출에 너무 근접하게 되는 표지된 뉴클레오티드 (220)의 갯수를 결정할 수 있다. 예를 들면, 10% 표지 가능성 및 1,000 개의 표지된 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)를 사용하면, 102 개의 스트랜드 (230, 240, 250)가 소정의 위치에서 표지된 뉴클레오티드 (220)를 나타낼 경우, 상기 위치는 하나의 표지된 뉴클레오티드 (220)에 의하여 점유되며, 기타의 표지된 뉴클레오티드 (220)가 없으며, 이는 매우 근접하게 되어 검출 에러가 발생할 수 있다는 것을 추론할 수 있다. 반대로, 197개의 스트랜드 (230, 240, 250)가 소정의 위치에서 표지된 뉴클레오티드 (220)를 나타낼 경우, 이는 2 개의 표지된 뉴클레오티드 (220)가 존재하게 되며, 이중 하나는 소정의 위치에서 그리고 다른 하나는 너무 근접하여 정확한 측정이 불가하다는 것을 추론할 수 있다. 동일한 유형의 표지된 뉴클레오티드 (220)는 서로 인접할 수 있거나 또는, 상이한 유형을 갖는 1 이상의 뉴클레오티드에 의하여 이격될 수 있다. 동일한 분석을 동일한 유형의 2 이상의 뉴클레오티드가 인접하게 위치하는 것에 적용한다. 2 개의 이웃한 뉴클레오티드가 동일할 경우, 위치는 약 2 배로 표지될 것이며, 3 개의 이웃하는 동일한 뉴클레오티드는 약 3 배로 표지될 것이다.
2 이상의 표지된 뉴클레오티드 (220)가 독립 측정에 대하여 서로 너무 인접하게 위치할 경우, 신호 분석은 공간 관계를 결정하기 위하여 실시 (440)할 수 있다. 예를 들면, 하나의 다른 뉴클레오티드에 의하여 분리된 2 개의 표지된 뉴클레오티드 (220)에 의하여 생성된 신호는 2 개의 인접한 표지된 뉴클레오티드 (220) 또는, 2 개의 다른 뉴클레오티드에 의하여 분리된 2 개의 표지된 뉴클레오티드 (220)에 의하여 생성된 신호와는 상이할 수 있다. 또한, 인접하게 이격된 동일한 뉴클레오티드 사이의 공간 관계를 규명하기 위하여 기타의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 표지된 뉴클레오티드 (220)의 상대적 위치를 결정하기 위하여, 빈도 분석을 실시 (430)한다. 예를 들면, 하나의 다른 뉴클레오티드에 의하여 분리된 3 개의 연속하는 표지된 뉴클레오티드 (220)와 2 개의 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이를 규명하기 위하여, 하나의 신호는 다른 신호의 2/3 정도로만 발생하여야만 한다. 빈도 및 신호 분석은 청구의 범위의 방법에서 임의의 순서로 실시할 수 있다.
도 4 및 도 5에 도시한 바와 같이, 각각의 유형의 표지된 뉴클레오티드 (220)에 대한 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 구성 (450)할 수 있다. 총 4 가지 유형의 뉴클레오티드를 표지 (220)하고, 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 구성 (450)할지라도, 본 발명의 또다른 구체예에서, 총 4 가지 유형의 뉴클레오티드중 단 3 가지만이 표지 (220) 및 분석될 수 있다. 이러한 구체예에서, 4 가지 유형의 뉴클레오티드의 위치는 뉴클레오티드의 다른 3 가지의 유형의 정렬 (520)된 거리 맵 (310, 320, 330, 340)에서의 간극이 될 것으로 추론할 수 있다. 완전 핵산 서열 (210)은 상이한 유형의 표지된 뉴클레오티드 (220)에 대한 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 정렬 (520)하여 결정할 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 거리 맵 (310, 320, 330, 340)은 비중첩 규칙을 사용하여 정렬 (520)할 수 있다. 이러한 규칙에 의하면, 2 개의 상이한 뉴클레오티드는 서열 (210)에서 동일한 위치를 점유할 수 없다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 거리 맵 (310, 320, 330, 340)은 한번에 하나씩 정렬 (520)되며, 최대수의 표지된 뉴클레오티드 (220)를 갖는 거리 맵 (310, 320, 330, 340)으로 개시된다. 1 초과의 가능한 정렬이 발견될 경우, 최단의 서열 (210)을 생성하는 정렬은 최소 서열 (210) 길이의 규칙에 의하여 선택된다. 추가의 거리 맵 (310, 320, 330, 340)이 중첩 없이 정렬 (520)될 수 없을 경우, 중첩 없는 정렬이 얻어질 때까지 정렬을 반복적으로 재평가 할 수 있다. 거리 맵 (310, 320, 330, 340)의 정렬이 존재하지 않을 경우, 비중첩 규칙을 완전히 준수하도록 한 후, 비중첩 서열 (210)이 얻어질 때까지 거리 맵 (310, 320, 330, 340)의 대체 구성 (450)을 반복적으로 재평가할 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 서열 결정 방법은 중첩이 발생하거나 또는 서열 (210)이 모호한 1 이상의 단분절을 사용하여 대부분의 핵산에 대하여 완전하게 정렬된 서열 (210)을 생성할 수 있다. 작동자는 분석의 임의의 시점에서 데이터를 검토할 수 있으며, 전체 핵산을 재서열 측정하여야 한다거나 또는, 주형 핵산 (200)의 짧은 부위만을 재서열 측정하여야 하는 것에 대한 결론을 내리게 된다. 이러한 서열 (210) 분석 결과의 평가는 핵산 서열 결정의 현존하는 방법과 함께 알려진 바와 같이 당업자에게 주지되어 있다. 이러한 결정은 데이타의 통계적 분석에 기초한 컴퓨터에 의하여 또는 사람 유저에 의하여 자동적으로 생성될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 거리 맵 (310, 320, 330, 340)이 서열 (210)과 관련되어 있기 때문에 이러한 거리 맵 (310, 320, 330, 340)의 개시 및 종료는 알려질 수 있다. 이러한 경우, 정렬 (520)은 거리 맵 (310, 320, 330, 340)의 공지의 종료를 일렬로 만드는 것을 포함할 수 있다.
정보 처리 및 제어 시스템 및 데이타 분석
본 발명의 특정의 구체예에서, 서열 결정 장치 (100)는 정보 처리 및 제어 시스템을 포함할 수 있다. 구체예는 사용된 정보 처리 및 제어 시스템의 유형을 제한하지 않는다. 이러한 예시의 정보 처리 및 제어 시스템은 정보 통신용 부스 및 정보 처리용 프로세서를 포함하는 컴퓨터를 통합할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 프로세서는 미국 캘리포니아주 산타 클라라에 소재하는 인텔 코포레이션으로부터 입수 가능한 프로세서의 Pentium (등록상표) II 패밀리, Pentium (등록상표) III 패밀리 및 Pentium (등록상표) 4 패밀리를 비롯한 프로세서의 Pentium (등록상표) 패밀리로부터 선택되나, 이에 제한된 것은 아니다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 프로세서는 Celeron (등록상표), Itanium (등록상표), Pentium Xeon (등록상표) 또는 X-등급 프로세서 (인텔 코포레이션, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재) 등이 될 수 있다. 본 발명의 각종의 기타의 구체예에서, 프로세서는 Intel (등록상표) 아키텍쳐, 예컨대 Intel (등록상표) IA-32 또는 Intel (등록상표) IA-64 아키텍쳐를 기반으로 할 수 있다. 또는, 기타의 프로세서를 사용할 수도 있다.
컴퓨터는 랜덤 액세스 메모리 (RAM) 또는 기타의 동적 저장 장치, 리드 온리 메모리 (ROM) 및/또는 기타의 정적 저장 및 데이타 저장 장치, 예컨대 자기 디스크 또는 광 디스크 및 이의 해당 드라이브를 더 포함할 수 있다. 또한, 정보 처리 및 제어 시스템은 당분야에서 공지된 기타의 주변 장치, 예컨대 디스플레이 장치 (예, 음극선관 또는 액정 디스플레이), 알파뉴메릭 입력 장치 (예, 키보드), 커서 제어 장치 (예, 마우스, 트랙볼 또는 커서 방향키) 및 통신 장치 [예, 모뎀, 네트워크 인터페이스 카드, 또는 이더넷 (Ethernet)에 커플링시키는데 사용되는 인터페이스 장비, 토큰 링 또는 기타 유형의 네트워크] 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 또한, 검출 유닛은 부스에 연결될 수 있다. 검출 유닛으로부터의 데이타는 주 메모리에 저장된 데이타 및 프로세서에 의하여 처리할 수 있다. 프로세서는 표지된 뉴클레오티드 (220)의 검출 사이의 시간 간격을 기반으로 하여 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 거리를 연산할 수 있다. 뉴클레오티드 거리는 주 메모리에 저장될 수 있으며, 프로세서를 사용하여 각각의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)를 위한 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 구성 (450)한다. 또한, 프로세서는 주형 핵산 서열 (200)이 유도될 수 있는 상보적인 핵산 서열 (210)을 생성하기 위하여 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 정렬 (520)할 수 있다.
전술한 실시예와는 다르게 장착된 정보 처리 및 제어 시스템은 특정의 실현에 사용할 수 있다. 그러므로, 시스템의 구성은 본 발명의 상이한 구체예에서 달라질 수 있다. 또한, 본 명세서에서 설명한 방법이 프로그램 프로세서의 제어하에서 실행될 수 있으나, 본 발명의 또다른 구체예에서, 프로세스는 임의의 프로그램되거나 또는 하드코드된 로직, 예컨대 Field Programmable Gate Arrays (FPGA), TTL 로직, 또는 Application Specific Integrated Circuits (ASIC)에 의하여 완전히 또는 부분적으로 실행될 수 있다는 것에 유의한다. 또한, 예를 들면 이러한 방법은 프로그램화된 범용 컴퓨터 부품 및/또는 커스텀 하드웨어 부품의 임의의 조합에 의하여 실시될 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 커스텀 디자인 소프트웨어 팩키지를 사용하여 검출 유닛으로부터 얻은 데이타를 분석할 수 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 데이타 분석은 정보 처리 및 제어 시스템 및 공개 이용 가능한 팩키지를 사용하여 실행할 수 있다. DNA 서열 (210) 분석에 사용 가능한 소프트웨어의 비제한적인 예로는 PRISM(상표명) DNA Sequencing Analysis Software (애플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재), Sequencher(상표명) 팩키지 (진 코드, 미국 미시간주 앤 아버 소재), 및 웹사이트 www.nbif.org/links/1.4.1.php의 내셔날 바이오테크놀로지 인포메이션 퍼실리티 (National Biotechnology Information Facility)를 통하여 입수 가능한 각종의 소프트웨어 팩키지 등이 있다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 특정의 구체예를 예시하기 위한 것이다. 그러나, 당업자라면 본 발명의 명세서로부터 개시된 상세한 설명의 범위내에서 다수의 수정예가 이루어질 수 있으며, 또한, 청구의 범위의 범위로부터 벗어나지 않으면서 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
실시예 1
DNA 서열 결정
해당 분절을 분리할 수 있는 제한 효소를 사용하여 1.2 ㎍의 게놈 DNA를 절단하였다. 해당 분절의 약 400,000 개의 복제물이 될 수 있다. 절단시키고자 하는 게놈 DNA의 양을 증가시켜 400,000 복제물 정도로 하였다. A,G,T 및 C로 표시한 4 개의 서브샘플로 상기 분리한 분절을 나누었다. 각각의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에는 해당 분절의 약 100,000 개의 복제물이 존재할 수 있다. 각각의 DNA 서브샘플을 변성시킨 후, 프라이머의 5' 말단에서의 비오틴을 사용하여 특이성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 어닐링 처리하였다. 200 μM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 DNA 폴리머라제를 각각의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에 첨가하였다. 또한, 20 μM의 티올-유도체화 뉴클레오티드 전구체를 각각의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에 첨가하였다. 예를 들면, 제1의 챔버 (110)는 20 μM의 티올-dATP를 포함하며, 제2의 챔버 (120)는 20 μM의 티올-dCTP를 포함하며, 제3의 챔버 (130)는 20 μM의 티올-dGTP를 포함하며, 그리고 제4의 챔버 (140)는 20 μM의 티올-dTTP를 포함한다. 유도체화 뉴클레오티드 전구체를 혼입한 DNA의 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)를 생성하였다. 1 ㎚ 금 입자를 유도체화 뉴클레오티드에 가교시키고, 세척에 의하여 표지된 뉴클레오티드 (220)에 가교된 금 입자로부터 유리 금 입자를 분리하였다.
평편한 표면의 한면에 부동화된 스트렙타비딘에 DNA 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)가 결합되도록 하였다. "분자 조합"에 의하여 분자를 배향시키고, 평편한 표면상의 고정된 DNA 분자를 부동화시킨다. 문헌 [미국 특허 제5,840,862호; 제6,054,327호; 제6,225,055호; 제6,265,153호; 제6,303,296호; 제6,344,319호].
STM 또는 AFM에 의하여 금 입자에 대한 DNA의 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)를 주사 처리하고, 표지된 뉴클레오티드 (220)상의 금 입자 사이의 거리를 기록하였다. 각각의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에서 표지된 뉴클레오티드 (220) 거리의 중첩 세트를 얻기 위한 다중 표지된 핵산 (230, 240, 250)에 대한 주사 절차를 반복하였다. 표지된 뉴클레오티드 (220) 거리 세트 각각은 단일 표지된 핵산 (230, 240, 250)에 대한 거리 측정치를 나타낸다.
상기의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)중의 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)로부터 표지된 뉴클레오티드 (220) 사이의 측정 거리를 모두 합하여 각각의 반응 챔버 (110, 120, 130, 140)에 대한 염기 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 구성 (450)한다. 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 구성 (450)하기 위하여 신호 및 신호 분석 (440)의 빈도 (430), 모든 측정 거리간의 중첩 (420)을 평가하는 알고리즘을 사용한다. 컴퓨터 프로그램은 DNA의 모든 주사 처리한 상보적인 스트랜드 (230, 240, 250)중에서 최대 그리고 가장 균일한 중첩을 찾기 위하여 조사하여야만 한다.
4 개의 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 정렬 (420)하고, 중첩을 제거하여 DNA 서열 (210)을 어셈블링한다. 컴퓨터 프로그램을 사용하여 이러한 기능을 완료한다. 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 정렬 (520)할 경우, 최대수의 염기를 갖는 거리 맵 (310, 320, 330, 340) 그리고, 제2의 최고 수의 염기를 갖는 맵 (310, 320, 330, 340)을 찾고, 이들을 정렬 (520)시키는데 유용하다. 맵 (310, 320, 330, 340)을 정렬 (520)하는 경우, 비중첩 규칙 및 최소 서열 (210) 길이의 규칙을 사용하여야만 한다. 컴퓨터는 유일한 하나의 가능한 부합을 찾아야만 한다. 그 다음, 제3의 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 정렬 (520)시킨다. 이러한 거리 맵 (310, 320, 330, 340)을 이전에 통합한 맵 (310, 320, 330, 340)에 통합시키기 위한 최소의 서열 (210) 길이의 규칙 및 비중첩 규칙을 사용한다. 완전 핵산 서열 (210)을 생성하기 위하여, 제4의 거리 맵 (310, 320, 330, 340)에도 동일한 처리를 실시한다. 정렬된 거리 맵 (310, 320, 330, 340)이 서열 (210)의 동일한 위치에 배치된 2 이상의 상이한 유형의 뉴클레오티드를 생성하면, 상이한 정렬을 사용하여 정렬 과정을 반복한다. 중첩 염기가 없고, 서열 (210)에서의 갭이 없는 서열 (210)이 생성되면 이러한 데이타 분석을 종료한다.
본 명세서 및 청구의 범위에 기재된 모든 조성물, 방법 및 장치 (100)가 형성될 수 있으며, 본 발명의 명세서를 토대로 하여 과도한 실험을 실시하지 않고도 실시할 수 있다. 개시된 조성물, 방법 및 장치 (100)가 본 발명의 특정의 구체예에서 설명되어 있기는 하나, 이는 특허청구범위의 개념, 정신 및 범위에서 벗어남이 없이 변형예를 적용할 수 있다는 것은 당업자에게는 명백할 것이다. 보다 상세하게는, 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있으면서 본 명세서에 기재된 제제 대신에, 화학적 그리고 생리학적으로 관련된 특정의 제제를 사용할 수 있는 것이 명백하다. 이와 같은 당업자에게 명백한 모든 유사한 치환예 및 변형예는 이하의 청구의 범위에서 정의된 바와 같은 발명의 요체내에 포함되는 것으로 간주할 수 있을 것이다.

Claims (30)

  1. (a) 주형 핵산을 상이한 유형의 표지된 뉴클레오티드를 함유하는 4개의 샘플로 분리하는 단계;
    (b) 주형 핵산에 서열 상보적인 표지된 핵산 스트랜드를 합성하는 단계;
    (c) 표지된 뉴클레오티드 사이의 거리를 측정하는 단계;
    (d) 각 샘플에서 표지된 핵산 스트랜드에 대한 거리 맵을 구성하는 단계; 및
    (e) 상보적인 스트랜드의 핵산 서열로 거리 맵을 어셈블링하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 거리 맵을 구성하기 위해 중첩 데이타 분석 및 빈도 분석에 의해 상기 측정된 거리를 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 거리 맵은 비중첩 데이타 분석에 의해 서열로 어셈블링하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, (i) 표지된 핵산 스트랜드를 표면에 부착시키는 단계; 및 (ii) 표지된 핵산 스트랜드를 서로 병렬 배향하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 벌키 기로 표지된 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 벌키 기는 상보적인 핵산 스트랜드의 합성 전 또는 후에 뉴클레오티드에 부착하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 벌키 기는 유기 기, 양자점, 항체 및 금속 기로 구성되는 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 금속 기는 나노입자인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 나노입자는 금 또는 은이고, 상기 나노입자의 크기는 약 0.5∼5.0 나노미터(㎚)인 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 벌키 기 사이의 거리는 주사 프로브 현미경으로 측정하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 벌키 기의 거리는 원자력 현미경 또는 주사 터널링 현미경으로 측정하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 표지된 핵산 스트랜드의 한 단부는 비오틴에 부착시키고, 비오틴은 스트렙타비딘 및/또는 아비딘을 포함하는 표면에 결합시키는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 각각의 샘플은 주형 핵산의 약 100,000개의 복제물을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 5' 단부가 비오틴에 부착되어 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 상기 주형 핵산에 하이브리드화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 표지된 핵산 스트랜드는 폴리머라제에 의해 합성하는 것인 방법.
  16. (a) 주형 핵산을 상이한 유형의 표지된 뉴클레오티드를 함유하는 4개의 챔버로 분리하는 단계;
    (b) 주형 핵산에 서열 상보적인 표지된 핵산 스트랜드를 합성하는 단계;
    (c) 나노포어를 통해 표지된 핵산 스트랜드를 이동시키는 단계;
    (d) 표지된 뉴클레오티드 사이의 거리를 측정하는 단계;
    (e) 각 챔버내의 표지된 핵산 스트랜드에 대한 거리 맵을 구성하는 단계; 및
    (f) 거리 맵을 상보적인 핵산 스트랜드에 대한 서열로 어셈블링하는 단계
    를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 거리 맵을 구성하기 위해 중첩 데이타 분석 및 빈도 분석에 의해 측정된 거리를 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 거리 맵은 비중첩 데이타 분석에 의해 서열로 어셈블링하는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 나노포어는 직경이 1∼50 ㎚인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 나노포어는 직경이 3∼10 ㎚인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 나노포어의 직경은 한번에 하나의 나노포어를 통해 하나의 표지된 핵산 스트랜드가 통과할 수 있도록 선택하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 표지된 핵산 스트랜드는 주형 핵산에 하이브리드화시키는 것인 방법.
  23. 제16항에 있어서, 각각의 핵산 스트랜드의 하나 이상의 단부는 식별가능한 표지에 부착시키는 것인 방법.
  24. 제16항에 있어서, 각각의 나노포어는 검출기에 작동가능하게 커플링시키는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 검출기는 이온 채널 지질 이중층 센서, 광검출기, 전기 검출기 및 질량 검출기로 구성되는 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  26. (a) 상이한 표지된 뉴클레오티드를 함유하는 4개 이상의 반응 챔버;
    (b) 각각의 반응 챔버 내의 다수의 나노포어; 및
    (c) 각각의 나노포어에 작동가능하게 커플링된 검출기
    를 포함하는 장치.
  27. 제26항에 있어서, (i) 정보 처리 시스템; 및 (ii) 데이타베이스를 더 포함하는 것인 장치.
  28. 제26항에 있어서, 상기 검출기는 표지된 핵산 스트랜드에 부착된 금속 나노입자를 검출할 수 있는 것인 장치.
  29. 제26항에 있어서, 상기 반응 챔버 및 나노포어는 집적 칩의 일부분인 장치.
  30. 제26항에 있어서, 상기 검출기는 이온 채널 지질 이중층 센서, 광검출기, 전기 검출기 및 질량 검출기로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 장치.
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