CN110527713B - 一种折叠引物的pcr扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种折叠引物的PCR扩增方法，所述PCR扩增有预退火PCR扩增和直接分级退火PCR扩增两种扩增方法。本发明能避免引物之间的竞争，实现在一个试管内互不干扰地进行多重反应；尤其是预退火PCR在无酶环境下先行反复分级退火，使所有靶序列都与对应引物充分退火，在反复中错配的引物可重新选择与靶序列退火；后续PCR保证靶序列的特异扩增始终占据绝对优势，有效地解决传统PCR极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病，提高了检出SNP等单碱基变异，同时检出多种靶核酸，特别是低拷贝靶核酸的特异性和敏感性，具有超灵敏、高特异、高通量的优点。

Description

一种折叠引物的PCR扩增方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种折叠引物的PCR扩增方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR Mullis.k 1985)问世30多年以来已经成为分子生物学三大关键技术(PCR、分子克隆、核酸序列分析-测序)之一。广泛应用于生命科学的各个领域；目前核酸扩增技术已成为几乎所有涉及生物的研究与应用领域(包括生物与遗传工程，临床与预防医学，农、林、牧、渔以及食品、药品等生物相关产业)的分子生物学的常规技术。使用PCR核酸扩增技术从各种样本中扩增、获取、检出感兴趣的核酸序列，为各种核酸(基因)的进一步分析、研究和应用提供快捷可靠而又经济的手段。

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是现有各种核酸扩增方法中效率最高、应用最广的基本核酸扩增方法。其基本原理是：是引物与目标(靶)核酸的互补退火与新生互补链的合成(延伸)：在适宜核酸合成的溶液(生化)环境中(含有必需的DNA聚合酶、至少一对寡核苷酸引物、靶DNA(模板)、Mg⁺、4dNTP以及适当且稳定pH的缓冲系统等)，在设定为核酸变性、退火和延伸3个温度循环变化的条件下，当温度上升到变性温度时模板靶DNA变性(解链)，降至退火温度时引物与互补的靶DNA结合退火，在延伸温度期间，通过DNA聚合酶催化作用，引物以靶DNA为模板，自其3端开始沿着5′—3′方向延伸，合成一条与靶DNA完全互补的新核苷酸链；第二个循环时，新合成的链作为反向引物的模板从另一个方向延伸，合成新链到前一个引物起始为止，从而限定了新链的设计长度，每个循环扩增产物以指数倍增，如此循环往复经过30个循环之后，完全同一的扩增产物可达到数十万到100万倍。每个循环都由引物与靶序列的特异退火引发新生链的合成延伸，可见引物与靶序列的退火是核酸扩增反应中最关键的一步。

PCR技术虽然具备上述极大的优势，但传统PCR也存在着固有的极易产生二聚体等非特异扩增、扩增产物极易污染以及多重反应时优势扩增掩盖低拷贝靶序列扩增三大缺陷，严重影响分析的准确性。在各种生物实验室里，它以最方便和高效的方式为我们获取无数有意义的核酸，同时也产生大量足以破坏试验结果的错误产物。尤其是在多重反应中，在同一反应体系内引物效率参差不齐，模板丰度高低悬殊的情况经常发生的条件下，不可避免的竞争和频发错配导致传统PCR的多重反应往往以失败告终。

到目前为止，为适应分子生物学、生命科学和生物工程等多方面的需要，已经发展了数十种PCR扩增方法，包括以DNA为模板和以RNA为模板两大部分；其中以RNA为模板多数与反转录PCR有关，主要应用于基础研究方面：如扩增目的基因、克隆基因、基因组测序、基因功能和表达调控和致突变研究等；也用于部分病毒(RNA病毒)病原的检出、诊断和研究。以DNA为模板的PCR大量应用于生物属、种(群)、型(基因型)包括突变基因、转基因种、型的检出、鉴定和研究；医学(临床和预防)、环境传染病病原微生物(病毒、细菌、寄生虫)的检出、鉴定和研究；遗传病病变(突变)基因的检出、鉴定和研究；以及法医学方面的应用和研究。但是，所有这些PCR方法其PCR扩增部分：包括引物设计，试剂组合，试验步骤，扩增方式都仍旧是传统PCR的模式；所以都存在错配与竞争的干扰，尤其是多重反应中，无法克服竞争、非特异扩增和难于扩增低拷贝靶序列的弊病。

近20多年来为解决传统PCR存在的上述难题，也发展了一些改进的PCR扩增技术；例如技术文献为《Annealing control primer and its uses》的公开了一种退火控制引物是在引物3′端和5′端之间插入2-15个通用碱基(脱氧肌苷等)组成一个调节器用于控制引物的退火，据称可适用于核酸扩增的所有领域，能有效地抑制非特异扩增和提高扩增和检出靶核酸的特异性；但未提及排除竞争和检出超微量靶核酸，特别是未提到在多重反应中检出低拷贝靶核酸的能力。

目前，也有文献公开了PCR扩增技术，例如：

1、专利申请CN201811475873.2，公开了一种PCR扩增方法，包括如下步骤：样品分类标记、反应表制作、样品反应、样品数据处理等步骤；但是该专利申请并不能让引物实行分级退火，错配非靶序列的引物没有机会重新选择靶序列，不能有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病，不能让引物准确、稳定的进行多重反应。

2、专利申请CN201711011855.4，公开了一种PCR扩增方法，其中所述的引物为巯基化修饰的引物，该发明的PCR扩增方法产率高、灵敏度显著增强；但是，该专利申请并不能让引物实行分级退火，错配非靶序列的引物没有机会重新选择靶序列，不能有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病。

3、专利申请CN201510044665.7，这是我们在2015年公开的一种折叠引物及其PCR扩增方法，采用镁、酶分离的单一组合试剂的扩增方法，通过设定每条(对)折叠引物不同的退火和折叠温度，当低于其折叠温度时引物的3’5’端互补退火自我封闭；阻止引物与非靶序列之间的错配退火，有效排除引物之间的竞争，实现在一个试管内多对引物互不干扰地先后退火，一次扩增同时检出和鉴定4种疟原虫。在其后的实践中，我们逐渐发现镁、酶分离单一组合试剂及其传统的扩增方法没能充分发挥折叠引物的优越性能，单一组合试剂模式也不利于保存使用，折叠引物的结构设计方面也存在一些缺陷，影响到其扩增效果没有达到最佳状态！针对上述问题我们对折叠引物PCR进行一系列创新设计和优化改进试验，终于研发出更灵敏、更特异、更稳定的新一代折叠引物PCR。

发明内容

本发明为解决上述技术问题，提供了一种折叠引物的PCR扩增方法。所用折叠引物具有三重退火温度和温控开关功能，并将该折叠引物应用于聚合酶链式反应(即折叠引物PCR，但不限于此)的两种PCR扩增方法：预退火PCR和直接分级退火PCR扩增方法。通过设定每条(对)折叠引物不同的退火和折叠温度，利用退火温度变化控制引物折叠自身封闭或解链开放进行分级退火，避免引物之间的竞争，实现在一个试管内多对引物互不干扰地进行多重反应。尤其是独创的预退火PCR扩增方法，在特设无酶环境下先行反复分级退火，不仅所有靶序列即使单拷贝靶序列都有充分机会与对应引物互补退火；而错配的引物在反复中也容易脱链重新选择与靶序列退火；当靶序列不存在时，引物3’5’端互补退火自身折叠而封闭，从根本上阻止引物与任何非靶序列之间的错配；预退火结束时反应混合液内除了保持与靶序列特异退火状态的引物外，所有游离引物已自身退火折叠静止。此时加入1号试剂(含Taq酶)，从室温升温至延伸温度开始PCR反应，只有与靶序列特异退火的引物在延伸，扩增的第一链只能是靶序列的互补链；后续PCR采用扩增子解链循环限定扩增子作为扩增的模板，进一步巩固预退火特异扩增成果，从而保证靶序列的特异扩增始终占据绝对优势地位。有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列以及扩增产物极易污染等弊病；因此大大增强了检出SNP等单碱基变异的特异性和敏感性，有利于扩增和检出样本中微量病原DNA，特别有利于检出混合感染样本中低拷贝数的靶核酸。

为了能够达到上述所述目的，本发明采用以下技术方案：

一种折叠引物的PCR扩增方法，所述折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和温控开关功能；所述折叠引物的PCR扩增方法有预退火PCR和直接分级退火PCR两种扩增方法，两种扩增方法均采用引物、酶分离组合试剂模式，分别配制1号组合试剂和2号组合试剂，用模板缓冲液制备DNA模板。

进一步地，所述预退火PCR扩增方法包括以下步骤：

①在一个PCR管内加入5μL的2号组合试剂和5μL的模板DNA，离心后上机按预退火程序先行分级退火反复2～5次，耗时5～10min；

②预退火结束，将反应管移至室温，加入1号试剂5μL形成完整反应体系，上机按预设预退火PCR程序连续反应55～65个循环，耗时45～50min后结束反应，获得扩增产物。

进一步地，在步骤①，所述预退火程序为：1个基因组解链温度(86～95℃/60～90s)，≥2个引物初始退火温度为(70～50℃/5～10s)，1～2个引物折叠温度为(45～65℃/5～10s)；所述的反复是指从≥最高退火温度起至最低折叠温度间反复；第一反复从短时基因组解链温度开始，以后每次反复开始温度从最高退火温度依次递减，直到最低退火温度和最低折叠温度。

进一步地，在步骤②，所述预退火PCR程序为：无解链温度的第1循环：从≤最低折叠温度(如45℃)开始，1～2个退火温度过渡到第一链延伸温度72～75℃；后续为0～2个分级退火循环组，共0～20个循环；和1个高温退火循环组，共40～60个循环；所述分级退火循环由扩增子解链温度，≥1个初始退火温度，和延伸温度组成；所述高温退火循环由扩增子或基因组解链温度、高温退火温度和延伸温度组成。

进一步地，所述折叠引物的3′端常规引物部分，必要时其3′末端第2-4位特设1-2个脱氧肌苷和/或错配碱基/或简并碱基；所述折叠引物的5′端特殊设计引物部分，由添加与其3′端互补的碱基组成，必要时在5′末端第3-9位特设1-2个脱氧肌苷取代互补碱基，以避免连续≥3个CG互补碱基。

进一步地，所述1号组合试剂主要组分为MgCl₂、Taq酶、KCl和Tris-HCl.

进一步地，所述2号组合试剂主要组分为NH₂SO₄、4dNTP、Tris-HCl和至少1对折叠引物。

进一步地，所述模板缓冲液为20mMTris-HCl(即1.0XTBF)；使用1.0XTBF制备滤纸血样模板DNA时直接加入2号试剂，如果用试剂盒提取的模板DNA则先加等量2.0XTBF混匀后再加入2号试剂。

进一步地，所述直接分级退火PCR扩增方法包括以下步骤：

(一)在一个PCR管内加入5μL的2号组合试剂和5μL的模板DNA；

(二)加入5μL的1号试剂，简短离心后上机，按直接分级退火PCR程序，连续反应55～65个循环耗时45～50min，结束反应，获得扩增产物。

进一步地，所述直接分级退火PCR程序为：预变性(基因组解链84～95℃/60～90s)，1～3个基因组解链分级退火循环组共2～12个循环，0～2个扩增子解链分级退火循环组共0～8个循环，1个高温退火循环组共40～58个循环；所述基因组解链分级退火循环组由基因组解链温度(84～95℃/05s)、≥1个初始退火温度(55～70℃/5～10s)和延伸温度(72～75℃/5～10s)组成；所述扩增子解链分级退火循环组由扩增子解链温度(82～90℃/05s)、1～2个初始退火温度(55～70℃/5～10s)和延伸温度(72～75℃/5～10s)组成；所述高温退火循环组由扩增子或基因组解链温度(82～95℃/05s)、高温退火温度(60～72℃/10～20s)和延伸温度(72～75℃/5～10s)组成。

进一步地，所述扩增产物的分析鉴定可采用琼脂糖凝胶电泳分离根据扩增片段大小鉴定；或采用高效质谱检验(HPMS)测定扩增片段的分子量对比数据库储存的同类或类似种群数据进行鉴定；可以采用微阵列或低密度芯片鉴定；也可以核酸序列测定技术鉴定扩增片段段。

本申请所述折叠引物为发明人2015年申请的专利(专利名称：一种折叠引物及其PCR扩增方法，申请号：CN201510044665.7)中提到的折叠引物，所述折叠引物序列为：5’CCGTGATGTGGAGAATGTTTTGCATCACIT 3’。

本申请中，所述循环为解链、退火、延伸三步骤的循环，退火步可含有多个退火温度；退火分为初始退火、高温退火；所述的初始退火温度可在循环(组)内或循环(组)间按照递增或者递减的顺序进行分级退火处理，或者在循环(组)内或循环(组)间按照交替递增或递减的顺序进行分级退火处理，每个退火温度处理的时间为1～15s；所述的初始退火温度在45～70℃；在多重PCR扩增过程中，各对引物之间的初始退火温度相差至少3～5℃；所述的折叠引物，其折叠温度为43～68℃，并在循环过程中，各对引物的折叠温度低于初始退火温度至少1～2℃；所述折叠引物在PCR扩增过程中，其高温退火温度为60～72℃，退火的时间为5～20s；所述延伸温度为72～75℃，延伸时间为5～20s。

所述的高温退火可以采用单一高温进行退火处理，也可以采用2～3个高温退火温度进行递增分级退火处理。

所述折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和温控闭锁或解链开放功能，包括3′端常规引物部分和5′端特殊设计引物部分；所述折叠引物的3′端常规引物部分为根据需要检出和/或鉴定的特异位点设计与靶基因互补的一段核苷酸序列，其组成和长度决定引物与靶序列退火温度的上限，称为引物的初始退火或低温退火温度，必要时其3′末端第2～4位特设1～2个脱氧肌苷和/或错配碱基/或简并碱基；所述折叠引物的5′端特殊设计引物部分主要由常规引物部分的5′端添加与其3′端互补的碱基组成，特殊设计引物部分与3′端互补序列是从第2～4碱基起至第8～20碱基添加7～19个与3′端互补碱基，所述互补碱基的组成和长度决定引物折叠自身退火的温度，该引物自身退火达100％的温度称为折叠温度，决定初始退火温度的下限；必要时在5′末端第3～9位特设1～2个脱氧肌苷取代互补碱基，而5′末端第1位则特设为与3′末端第1位错配碱基；所述错配碱基为C或G中的一种；所述折叠引物PCR反应经过至少2个循环后，扩增子的5′端已生成折叠引物全长的互补序列；此后的引物延伸扩增主要以扩增子为模板，此时折叠引物全长与扩增子互补退火，而不只是常规引物部分，折叠引物的退火温度将自动升高≥5℃，称为高温退火温度；所述扩增子的解链温度为82～90℃。

所述折叠引物的基本原理是通过温度调控引物3′5′端互补退火折叠或重叠(自身或互相封闭)或解链(开放)来控制引物与模板靶序列的退火，各条(对、组)引物设置不同的退火温度和折叠温度，在反应中实行分级退火，尤其是创新的预退火PCR扩增方法中，在无酶环境下反复分级退火，不仅可排除引物间的竞争，同时对抗传统聚合酶链式反应(PCR)经常导致非特异扩增的引物与引物或探针之间、和/或引物与非靶序列之间错配退火；使所有靶序列即使单拷贝靶序列都有机会与对应引物充分退火；偶然错配的引物在反复中也极易掉链重新选择靶序列特异退火；能有效地克服传统PCR极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病，从而大大提高PCR的特异性，稳定性和扩增效率。因此，本发明可直接用于完善套式PCR，多重PCR，等位特异PCR，荧光定量PCR以及RNA的聚合酶链反应诸如RNA-PCR和反转录PCR、cDNA末端快速扩增(RACE)、差异显示PCR(DD-PCR)等各种基于PCR的核酸试验，能够有效地克服上述传统PCR固有的缺陷，提高特异性和扩增效率；折叠引物配合引物、酶分离组合试剂反应体系，可用于研制高特异高敏感能够同时检出多种病原/病变/变异基因或SNP的新型预装管PCR分子诊断试剂盒；还可以应用于核酸延伸、杂交相关技术(例如微阵列中折叠靶标探针的设计)有效地克服非特异杂交和增强延伸的特异性，此外，在芯片和高效液相色谱(HPLC)检测核酸突变和SNP等核酸分析系统中，折叠引物PCR将提供高效、快速和高质量的样本制备。

本发明改进的核酸扩增方法(折叠引物PCR)依靠每条折叠引物的三重退火温度，根据需要灵活安排每个PCR试验进行分级变性、退火、延伸反应。可以在重复的循环内(组内)分级退火延伸，也可以在不同的循环间(组间)分级变性、退火和延伸；更多时候是两者相配合以获得最佳扩增效果。

由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：

(1)本发明是发明人2015年公开的折叠引物(专利号：CN201510044665.7，)的基础上进一步研发、完善后推出的新一代折叠引物及其PCR扩增方法。除具备可自主设计三重退火温度和温控开关功能等折叠引物所有优点外，排除了折叠引物原设计上的缺陷，新一代折叠引物更能适应3’端特异引物各种不同碱基组成的复杂情况，即使3’端出现连续≥3个C或G，折叠引物也能保持温控开关自如的优越性能，特别是在多重反应中更好地发挥排除竞争、防止错配的作用，进一步提高了折叠引物PCR的敏感性和特异性。

(2)本发明创新采用具有三重退火温度和温控开关功能的折叠引物和预退火PCR扩增方法，通过设定每条(对)折叠引物不同的退火和折叠温度，两种方法都实行分级退火，避免了引物之间的竞争，实现在一个试管内互不干扰地进行多重反应；尤其是预退火PCR在无酶环境下先行反复分级退火，使所有靶序列都与对应引物充分退火，在反复中错配的引物可重新选择与靶序列退火；采用引物、酶分离的组合试剂模式，在无酶的环境下，折叠引物与模板DNA靶序列先行反复充分退火，有利于增加低拷贝靶序列与对应引物退火机会，同时使错配非靶序列的引物有机会重新选择靶序列，从根本上阻止引物与任何非靶序列之间的错配退火；后续PCR用扩增子解链循环巩固预退火的成果，保证使靶序列的特异扩增始终占据优势地位，有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病；因此大大增强了检出SNP等单碱基变异的特异性和敏感性，同时检出多种靶核酸，特别是低拷贝靶核酸的特异性和敏感性，有利于扩增和检出样本中微量病原DNA。

(3)本发明创新的预退火PCR扩增方法，通过设定每条(对)折叠引物不同的退火和折叠温度，当低于其折叠温度时引物3’5’端互补退火而自我封闭，在无酶环境下实行反复的分级退火，不仅排除了引物之间的竞争，而且使每对引物都有机会与靶序列充分退火，特别有利于在一个试管内互不干扰地进行多重反应，使多重PCR能够同时检出和鉴定模板丰度相差悬殊的所有靶序列。

(4)本发明创新的预退火PCR扩增方法，由于采用引物、酶分离的组合试剂模式，在无酶的环境下，折叠引物与模板DNA靶序列先行反复充分退火，后续的PCR反应是从折叠温度开始，不用传统的热启动方式，也无需使用比较昂贵的热启动Taq酶。此外，创新的引物、酶分离组合试剂模式，其中的1号试剂实际上是一种高效的通用试剂；有利于研制超灵敏、高特异、高通量、低成本而又简便快捷地检测各种不同病原的折叠引物多重PCR分子诊断试剂盒，这将是真正价廉物美快捷实用的试剂盒。

(5)本发明新一代折叠引物PCR超越传统PCR的又一个特色是折叠引物的设计和折叠引物PCR扩增反应具有宽广可调控性。传统的普通引物在靶序列上的位点和长度确定之后，它的最佳退火温度也大致定了只有一种选择；而每条折叠引物的三重退火温度完全可以根据需要自主设计，在同一个位点上可有多种选择。普通1对引物简单PCR或多对引物的复杂PCR,一旦引物设定合成，其适宜的温度循环扩增程序也就确定了，只有一种选择；而折叠引物合成之后不论简单或多重PCR,可以通过设置预退火程序和后续的PCR扩增程序，调节各个退火温度的先后次序，时间长短以及各个循环组的循环数，控制各对引物的扩增强度，达到最佳效果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。

实施例1

一种折叠引物的PCR扩增方法，所述折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和温控开关功能；所述折叠引物的PCR扩增方法有预退火PCR和直接分级退火PCR两种扩增方法，两种扩增方法均采用引物、酶分离组合试剂模式，分别配制1号组合试剂和2号组合试剂，用模板缓冲液制备DNA模板。

进一步地，所述折叠引物的3′端常规引物部分，必要时其3′末端第2-4位特设1-2个脱氧肌苷和/或错配碱基/或简并碱基；所述折叠引物的5′端特殊设计引物部分，由添加与其3′端互补的碱基组成，必要时在5′末端第3-9位特设1-2个脱氧肌苷取代互补碱基，以避免连续≥3个CG互补碱基。

进一步地，所述预退火PCR扩增方法包括以下步骤：

①在一个PCR管内加入5μL的2号组合试剂和5μL的模板DNA，离心后上机按预退火程序先行分级退火反复2～5次，耗时5～10min；所述2号组合试剂主要组分为NH₂SO₄、4dNTP、Tris-HCl和至少1对折叠引物；所述折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和温控开关功能；所述预退火程序为：1个基因组解链温度(86～95℃/60～90s)，≥2个引物初始退火温度为(70～50℃/5～10s)，1～2个引物折叠温度为(45～65℃/5～10s)；所述反复是指从≥最高退火温度起至最低折叠温度间反复；第一反复从短时基因组解链温度开始，以后每次反复开始温度从最高退火温度依次递减，直到最低退火温度和最低折叠温度；

②预退火结束，将反应管移至室温，加入1号试剂5μL形成完整反应体系，上机按预设预退火PCR程序连续反应55～65个循环，耗时45～50min后结束反应，获得扩增产物；所述1号组合试剂主要组分为MgCl₂、Taq酶、KCl和Tris-HCl；所述预退火PCR程序为：无解链温度的第1循环：从≤最低折叠温度(如45℃)开始，1～2个退火温度过渡到第一链延伸温度72～75℃；后续为0～2个分级退火循环组，共0～20个循环；和1个高温退火循环组，共40～60个循环；所述分级退火循环由扩增子解链温度，≥1个初始退火温度，和延伸温度组成；所述高温退火循环由扩增子或基因组解链温度、高温退火温度和延伸温度组成；所述模板DNA为用模板缓冲液制得，所述模板缓冲液为20mMTris-HCl(即1.0XTBF)；使用1.0XTBF制备滤纸血样模板DNA时直接加入2号试剂，如果用试剂盒提取的模板DNA则先加等量2.0XTBF混匀后再加入2号试剂。

进一步地，所述直接分级退火PCR扩增方法包括以下步骤：

(一)在一个PCR管内加入5μL的2号组合试剂和5μL的模板DNA；

(二)加入5μL的1号试剂，简短离心后上机，按直接分级退火PCR程序，连续反应55～65个循环耗时45～50min，结束反应，获得扩增产物；所述直接分级退火PCR程序为：预变性(基因组解链84～95℃/60～90s)，1～3个基因组解链分级退火循环组共2～12个循环，0～2个扩增子解链分级退火循环组共0～8个循环，1个高温退火循环组共40～58个循环；所述基因组解链分级退火循环组由基因组解链温度(84～95℃/05s)、≥1个初始退火温度(55～70℃/5～10s)和延伸温度(72～75℃/5～10s)组成；所述扩增子解链分级退火循环组由扩增子解链温度(82～90℃/05s)、1～2个初始退火温度(55～70℃/5～10s)和延伸温度(72～75℃/5～10s)组成；所述高温退火循环组由扩增子或基因组解链温度(82～95℃/05s)、高温退火温度(60～72℃/10～20s)和延伸温度(72～75℃/5～10s)组成；所述模板DNA是用1.0XTBF制备的滤纸血样模板，如用其他方法提取的DNA则加等量2.0XTBF混匀配成。

进一步地，所述扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳分离根据扩增片段大小鉴定；或采用高效质谱捡验(HPMS)测定扩增片段的分子量对比数据库储存的同类或类似种群数据进行鉴定；可以采用微阵列或低密度芯片鉴定；也可以核酸序列测定技术鉴定扩增片段。

实施例2

与实施例1不同之处在于：在PCR扩增时采用预退火PCR扩增方法，不进行直接分级退火PCR扩增，其他条件不变。

实施例3

与实施例1不同之处在于：在PCR扩增时采用直接分级退火PCR扩增方法，不进行预退火PCR扩增，其他条件不变。

实施例4

与实施例1不同之处在于：预退火PCR扩增和直接分级退火PCR扩增均使用1.0XTBF制备滤纸血样模板DNA，其他条件不变。

实施例5

与实施例1不同之处在于：预退火PCR扩增使用试剂盒提取的模板DNA，直接分级退火PCR扩增所述模板DNA用其他方法提取的DNA，其他条件不变。

对比例1

按照专利申请CN201510044665.7中的方法进行PCR扩增。

对比例2

按照专利申请CN201711011855.4中的方法进行PCR扩增。

对比例3

按照专利申请CN201811475873.2中的方法进行PCR扩增。

在实践中发现，对比例1没能充分发挥折叠引物的优越性能，单一组合试剂模式也不利于保存使用，折叠引物的结构设计方面也存在一些缺陷，影响到其扩增效果没有达到最佳状态。对比例2的方法不能让引物实行分级退火，错配非靶序列的引物没有机会重新选择靶序列，不能有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病。对比例3方法不能让引物实行分级退火，错配非靶序列的引物没有机会重新选择靶序列，不能有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病，不能让引物准确、稳定的进行多重反应。但是，本申请扩增方法均未出现以上技术问题，在进行折叠引物PCR扩增是具有更灵敏、更特异、更稳定的优点。

综上所述，本发明创新采用具有三重退火温度和温控开关功能的折叠引物和预退火PCR扩增方法，在无酶的环境下，折叠引物与模板DNA靶序列先行反复充分退火，无需使用比较昂贵的热启动Taq酶，有利于增加低拷贝靶序列与对应引物退火机会，同时使错配非靶序列的引物有机会重新选择靶序列，从根本上阻止引物与任何非靶序列之间的错配退火；有利于研制超灵敏、高特异、高通量、低成本而又简便快捷地检测；后续PCR用扩增子解链循环巩固预退火的成果，保证使靶序列的特异扩增始终占据优势地位，有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病；大大增强了检出SNP等单碱基变异的特异性和敏感性，同时检出多种靶核酸，特别是低拷贝靶核酸的特异性和敏感性，有利于扩增和检出样本中微量病原DNA。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同腰间的含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种折叠引物的PCR扩增方法，其特征在于：所述折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和温控开关功能；所述折叠引物的PCR扩增方法有预退火PCR和直接分级退火PCR两种扩增方法，两种扩增方法均采用引物、酶分离组合试剂模式，分别配制1号组合试剂和2号组合试剂，用模板缓冲液制备DNA模板，所述1号组合试剂主要组分为MgCl₂、Taq酶、KCl和Tris-HCl；所述2号组合试剂主要组分为(NH₄)₂SO₄、4dNTP、Tris-HCl和至少1对折叠引物；

所述预退火PCR扩增方法包括以下步骤：

①在一个PCR管内加入5μL的2号组合试剂和5μL的模板DNA，离心后上机按预退火程序先行分级退火反复2～5次，耗时5～10min；所述预退火程序为：1个基因组解链温度86～95℃，时间60～90s，≥2个引物初始退火温度为70～50℃，时间为5～10s，1～2个引物折叠温度为45～65℃，时间为5～10s；所述的反复是指从≥最高退火温度起至最低折叠温度间反复；第一反复从短时基因组解链温度开始，以后每次反复开始温度从最高退火温度依次递减，直到最低退火温度和最低折叠温度；

②预退火结束，将反应管移至室温，加入1号试剂5μL形成完整反应体系，上机按预设预退火PCR程序连续反应55～65个循环，耗时45～50min后结束反应，获得扩增产物；所述预退火PCR程序为：无解链温度的第1循环：从≤最低折叠温度开始，1～2个退火温度过渡到第一链延伸温度72～75℃；后续为0～2个分级退火循环组，共0～20个循环；和1个高温退火循环组，共40～60个循环；所述分级退火循环由扩增子解链温度，≥1个初始退火温度，和延伸温度组成；所述高温退火循环由扩增子或基因组解链温度、高温退火温度和延伸温度组成；

所述直接分级退火PCR扩增方法包括以下步骤：

(一)在一个PCR管内加入5μL的2号组合试剂和5μL的模板DNA；

(二)加入5μL的1号试剂，简短离心后上机，按直接分级退火PCR程序，连续反应55～65个循环耗时45～50min，结束反应，获得扩增产物；

所述直接分级退火PCR程序为：预变性基因组解链温度84～95℃，时间60～90s，1～3个基因组解链分级退火循环组共2～12个循环，0～2个扩增子解链分级退火循环组共0～8个循环，1个高温退火循环组共40～58个循环；所述基因组解链分级退火循环组由基因组解链温度84～95℃，时间0～5s，≥1个初始退火温度55～70℃，时间5～10s和延伸温度72～75℃，时间5～10s组成；所述扩增子解链分级退火循环组由扩增子解链温度82～90℃，时间0～5s，1～2个初始退火温度55～70℃，时间5～10s和延伸温度72～75℃，时间5～10s组成；所述高温退火循环组由扩增子或基因组解链温度82～95℃，时间0～5s，高温退火温度60～72℃，时间10～20s和延伸温度72～75℃，时间5～10s组成。

2.根据权利要求1所述的一种折叠引物的PCR扩增方法，其特征在于：所述折叠引物的3′端为常规引物部分，其3′末端第2-4位特设1-2个脱氧肌苷和/或错配碱基或简并碱基；所述折叠引物的5′端为特殊设计引物部分，由添加与其3′端互补的碱基组成，在5′末端第3-9位特设1-2个脱氧肌苷取代互补碱基，以避免连续≥3个CG互补碱基。

3.根据权利要求1所述的一种折叠引物的PCR扩增方法，其特征在于：所述模板缓冲液为20mMTris-HCl即1.0×TBF；使用1.0×TBF制备滤纸血样模板DNA时直接加入2号试剂，如果用试剂盒提取的模板DNA则先加等量2.0×TBF混匀后再加入2号试剂。