CN102676651A - 快速套式pcr疟疾分子诊断试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒及检测方法，包括具有自我封闭功能的新型引物，选用疟原虫线粒体基因组内的细胞色素氧化酶基因(cox1)作靶基因，在疟原虫属、种特异位点设计双向半套式引物4个，组合成1对属特异和2个种特异引物；使试剂复杂操作繁重的传统套式/多重PCR简化为单一试剂、单管一步反应，可同时检出和鉴定恶性疟与间日疟原虫单独或混合的感染和三日疟和卵形疟的单独感染，其敏感性与特异性均超过显微镜检查法，达到可检出1个虫/每μl血的水平。是各级医院疟疾确诊和鉴别诊断的可靠手段，也为疟疾防治监测、抗疟药物试验和疟疾疫苗研究以及献血员筛选提供一个简易、经济、灵敏、准确的疟疾诊断工具。

Description

快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于医学检验领域，涉及一种快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒及其检测方法。 

背景技术

疟疾是世界上危害最严重的三大传染病(爱滋病，结核和疟疾)之一，世界卫生组织(WHO)已把控制疟疾列入本世纪行动目标。感染人的疟原虫有4种：即恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.ovale)。由于4种疟原虫的生物学和免疫学特性，致病性，对抗疟药的治疗效应各不相同，对媒介按蚊的敏感性以及它们在全球流行的区域分布各异。每年全球疟疾感染病人数以亿计，其中因恶性疟疾丧生者超过百万。及时准确地诊断和鉴别诊断各种疟疾是临床正确治疗、挽救病人生命和流行病学监测的关键、也是制订防制措施以及抗疟药和疫苗研制的迫切需要。 

疟疾诊断方法包括临床诊断、病原学诊断、血清学诊断和分子(基因)诊断。由于疟疾的主要临床表现与其他传染病相似难于鉴别，单凭临床症状极易误诊。常用的血清学方法如间接荧光抗体试验等，其阳性只反映近年曾感染疟疾，主要应用于疟疾血清流行病学调查评价；ELISA等检测抗原的方法，因其敏感性和特异性不高，难于实际应用。因此两者均不能作为疟疾病人的确诊依据。目前，已沿用50多年的镜检法仍然是疟疾病人确诊的主要依据。镜检法虽然较简单经济，但费时费力，结果判断主观性强，其灵敏性与准确性决定于镜检员的素质和经验；特别是检出低原虫血症的敏感性差，WHO疟疾专家在《疟疾诊断的新展望》报告中指出：有经验的镜检员可能检出5-10个虫/μl低原虫血症，但是一般镜检员的实际检出低限仅为100-150个虫/μl。按目前常规血检，每张血片仅检查100-200个油镜视野，甚至达不到100个视野(约占整个血膜的1/10-1/20)，低密度带虫者漏检是不可避免的。显然，基于上述固有缺陷，镜检法已不能满足现代疟疾防治与研究中检出低原虫血症的需要，特别是不适合流行病学调查监测、疫苗研制、抗疟药物试验和筛选献血员等大规模血样的检测。 

从上世纪七十年代起，研究较多的吖啶橙染色荧光显微镜检查疟原虫，其中比较成功的有我国的吖啶橙直接滴染法和国外的QBC法(毛细管定量血沉棕黄层吖啶橙染色)，能提高工作效率，检出率接近普通镜检法的水平；但是无法鉴定虫种，另与镜检法一样，以技术和经验、结果作主观性判断，并需使用价格昂贵的荧光显微镜或适当的荧光激发光源等原因难于实际应用。 

上世纪末在世界卫生组织(WHO)积极倡导和资助下，发展起来的抗原捕获快速诊断试验(RDTs)即免疫层析色谱试纸法。因免疫层析色谱试纸法操作简便、快速，且不须专业技术只 要简单培训的基层人员可以操作，适用于基层医院特别是缺乏显微镜及镜检人员的农村诊所，便能快速诊断及时对病人抗疟治疗。但是，免疫层析色谱试纸法敏感性和特异性较差且费用较高，另报告指出三种RDT(ParaSight-F；OptiMal；ICT Pf/Pv)均显示很高的假阳性和假阴性，假阳性高达29.2％(Rubio JM，et al.，Limited level of accuracy provided by available rapid diagnosis tests for malaria enhances the need for PCR-based reference laboratories.J.Clin.Microbiol，July 2001，p.2736-2737)。特别是治疗后55％的病例在10-17天内仍存在可检出的抗原，而镜检法和PCR均阴性，表明误诊、漏诊较多。因此RDT不能满足疟疾防治与研究中要求精确诊断的需要，也不能满足临床要求灵敏准确地检出各类病人的需要，不适用于要求检出低原虫血症的药物和疫苗研究、防治方案的考核评价和流行病学监测等(Metzger WG，Vivas-Martínez S，Rodriguez I，et al.，Malaria diagnosis under field conditions in the Venezuelan Amazon.Trans R Soc Trop Med Hyg.2007Oct 3；Tham，J.M.，Lee，S.H.，Tan，T.M C.，et al.，Detection and species determination of malaria parasites by PCR：comparison with microscopy and with paraSight-F and ICT malaria Pf tests in a cl inical environment.Journal of Cl inical Microbiology.199937：1269-1273)。 

近十多年分子诊断技术的研究和应用发展很快，PCR为基础的诊断试验已公认是最有前途的新疟疾诊断方法，其中套式PCR在检出低原虫血症和混合感染的敏感性超过镜检法及现有其他实验诊断方法。Zaman S，Tan L，Chen HH，et al.，The detection of Plasmodium falciparum and P.vivax in DNA-extracted blood samples using polymerase chain reaction (Trans R Soc Trop Med Hyg.200195：391-397)和Singh B，Bobogare A，Cox-Singh J，Snounou G，Abdul lah MS，Rahman HA.A genus-and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies(Am J Trop Med Hyg.1999Apr；60(4)：687-92.)在疟疾流行病学、抗疟药物试验、疫苗研究、献血员的筛选等方面已有应用报告，在有条件的临床实验室已开始用于疟疾的确诊和鉴别诊断；Johnston等(美国CDC 2006)提出应当考虑在参考实验室和一切具有分子实验基本条件的实验室采用套式PCR作为疟疾的确诊手段(Stephanie P.Johnston，Norman J.Pieniazek，Maniphet V.Xayavong，Susan B.Slemenda，Patricia P.Wilkins，and Alexandre J.da Silva PCR as a Confirmatory Technique for Laboratory Diagnosis of Malaria Journal OF Clinical Microbiology，Mar.2006，p.1087-1089)。但是，现行套式PCR疟疾诊断试验多数仍参照十多年前Snounou，G.，S.等(1993，1996)报告的传统套式PCR方法，以小亚单位核糖体RNA(SSUrRNA)基因作为靶基因，检出2种或2种以上人疟原虫，需使用1对属特异引物和2-4对种特异引物；使用属特异引物的第一轮PCR扩增的产物需移入2-4个新试剂管作为模 板，分别用2-4对种特异引物作第二轮扩增，一份血样需要做3-5管扩增，同时有2-4份扩增产物需做电泳才能得出结果；试验时间最少需要一整天以上，且试剂和实验操作复杂、步骤繁多，容易出错，也极易造成污染、以及严重的非特异扩增常影响结果判断，限制了高灵敏的套式PCR疟疾诊断试验在疟疾防治与研究领域的实际应用。 

发明内容

本发明的目的：为克服传统套式PCR疟疾诊断试验需多管两步扩增，试验时间长，且试剂操作复杂，中间需开管加样容易污染，二聚体等非特异扩增严重影响结果判断等缺陷；使试剂和操作标准化，统一配制组合试剂，把绝大部分试剂操作完成在试剂盒预制阶段，以确保试验的快速、重复性和降低检测成本，提供一种快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒及其检测方法。 

本发明的技术方案是： 

①设计具有自我封闭功能的新型引物，这种新型引物的5’端均具有特殊设计的与3端(第1、2或3核苷酸起至第5-12核苷酸)互补结构，低于其退火温度时它们的3’5’端互补退火形成自身封闭的二级结构，有效地防止引物之间或引物与其他非靶核酸链之间错配退火； 

②选用位于多拷贝、短线状(仅约6kb)的疟原虫线粒体基因组内的细胞色素氧化酶(cox1)基因作靶基因，不仅有利于提高敏感性，且在反应程序中可使用较低的解链温度，使细胞核染色体基因组DNA处于未解链(或不充分解链)状态，避免了特异引物与人或其他细胞核基因组DNA的错配； 

③在cox1基因疟原虫属、种特异位点设计双向半套式新型引物4个，通过试剂盒专用反应体系和新型引物的特殊作用，成功组合为3对引物，其中1对属特异引物，2对种特异引物； 

④革新缓冲系统：建立模板制备缓冲液与组合试剂缓冲液互相配合的缓冲系统。通过上述多项创新技术的联合作用实现单管套式/多重PCR一步完成扩增，简化试剂和操作步骤，降低成本，同时进一步提高敏感性、特异性和稳定性；研制出简单、快速、灵敏、准确而又价廉的单管一步法套式/多重PCR疟疾诊断试剂盒，使疟疾分子诊断试验能推广应用于一切有基本条件的实验室，为疟疾临床、流行病学调查研究、疟疾监测以及抗疟药和疫苗研制试验等领域提供一个常规诊断、确诊与鉴别诊断的可靠工具。 

本发明是这样实现的： 

一种快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒，包括含了样本模板DNA制备和检测疟原虫DNA的套式PCR反应所需的全套试剂，其组成包含： 

①1×模板缓冲液1.5ml×1支，可供制备20份滤纸血样模板DNA； 

②预装套式PCR单一组合加酶试剂10μl×20管，可供检测20份血样，另设置非预装管未加酶试剂盒，内含套式PCR单一组合未加酶试剂200μl×1支，同样可供检测20份血样。 

③阳性对照：间日疟原虫阳性模板DNA 10μl×1支；恶性疟原虫阳性模板DNA10μl×1支。 

自备试剂：预装管试剂盒只需自备纯水和阴性对照的正常人滤纸血样；非预装管试剂盒则需另自备Taq酶。 

以上所述的1×模板缓冲液包括下列组分： 

①20mmol/L Tris-HCl pH8.4； 

②20mmol/L KCl，10mmol/L(NH₄)₂SO₄； 

③3.2mmol/L MgCl₂。 

以上所述的预装套式PCR单一组合试剂包含模板DNA和其它反应组分： 

①具有自我封闭功能的新型引物4条； 

②缓冲系统； 

③4种核苷酸(4dNTP各200umol/L)； 

④DNA聚合酶(Taq酶0.5U)； 

⑤石蜡油15μl。 

以上所述的新型引物是根据4种疟原虫线粒体细胞色素氧化酶(cox1)基因种、属特异位点设计，包括疟原虫属特异新型引物一对，恶性疟原虫种特异新型引物一个，间日疟原虫种特异新型引物一个；在它们的5’端均具有特殊设计的与3端(第1、2或3核苷酸起至第5-12核苷酸)互补结构，当温度低于其最佳退火温度5-10℃或以下时，引物5’3’端互补退火自我封闭，从而防止了引物-引物、引物与其他非靶核酸链之间的错配退火。 

以上所述的新型引物选用位于多拷贝、短线状(约6kb)的疟原虫线粒体基因组内cox1基因作靶基因，不仅有利于提高敏感性，且在反应程序中可使用较低的解链温度，使细胞核染色体基因组DNA处于未解链或不充分解链状态，避免了特异引物与人或其他细胞核基因组DNA的错配。 

以上所述的4条新型引物的序列为： 

Umf-18685’CATGGCGCACACTTCCCTTCTCGCCATT 3’ 

Umr-28385’CTAAGAAGGTGTTATCCCCGGCGAACCTTCTTAC 3’ 

Fmr-24965’GATAATACATATCCATTAAGTAATGAAGGTATTATCA-3’ 

Vmf-25395’CGTCAGGATATAATTATAGATAACATTCCTGATAC 3’ 

以上所述的缓冲系统包括下列组分： 

①20mmol/L Tris-HCl pH 8.4； 

②20mmol/L KCl； 

③10mmol/L(NH₄)₂SO₄； 

④1％甲酰胺； 

⑤0.075％Tween-20。 

以上所述的引物是根据coxI基因内属、种特异位点设计的双向半套式引物，通过试剂盒专用反应体系和新型引物的特殊作用，组合为3对引物，其中疟原虫属特异引物Umf-1868和Umr-2838的浓度均为105nmol/L；恶性疟原虫种特异引物Fmr-2496的浓度为105nmol/L；间日疟原虫种特异引物Vmf-2539的浓度为87.5nmol/L。 

一种快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒的检测方法，包括样本模板DNA制备、PCR扩增反应和产物电泳分析鉴定；

以上所述的样本模板DNA制备，包括如下步骤： 

①采用滤纸法采集血样，自然风干后可室温邮寄；干燥条件下4℃可长期保存； 

②滤纸血样用打孔器打出6mm直径园片，放入0.5ml锥形管内，加入0.1×模板缓冲液400μl浸泡5-10分钟，离心洗脱血红蛋白，吸去全部上清； 

③重新加入1×模板缓冲液30μl，置入微量加热器，95℃加热10分钟，期间漩涡震荡30秒×2次；简短离心10秒，吸取上清作为PCR模板DNA；或放入4℃冰箱保存备用，使用前必须重新加热95℃，时间5-10分钟，漩涡震荡30秒，简短离心后，再吸取上清作PCR模板。 

以上所述的PCR扩增反应只进行一次加样操作，先从试剂盒内取出所需的冻存预装试剂PCR管，每管含单一组合试剂10μl，点动离心使试剂集中管底并置回冰盒，吸取上述制备的模板DNA 5μl加至PCR管底部，再次点动离心置回冰盒，传递至扩增室，按预编PCR程序上机连续PCR扩增反应49个循环得到扩增产物。 

以上所述的PCR扩增反应49个循环的反应条件如下： 

起始解链温度：(94/90s) 

第1-14循环：(94℃/10s，70℃/15s，67℃/15s，62℃/01s，72℃/60s)×14； 

第15-18循环：(86℃/05s，62℃/10s，58℃/10s，72℃/60s，86℃/05s；65℃/20s，72℃/40s)×4； 

第19-48循环：(86℃/05s，70℃/02s，65℃/20s，72℃/40s)×30； 

第49循环：(72℃/3’，10℃/3’)×1。 

④扩增产物鉴定：取PCR扩增产物10-15μl作2％琼脂糖凝胶电泳，在248um紫外透射分析仪或凝胶成像分析仪上观察和摄像。采用花青核酸染料染色，染色采用后染法即泡染法或 胶染法；作虫种鉴定，必须采用后染法进行扩增产物电泳分析鉴定，以便根据片段的大小正确判定虫种。 

以上所述的电泳分析鉴定，结果是疟原虫阳性有三种条带：人疟原虫属公共带971bp，恶性疟原虫特异带629bp，间日疟原虫特异带300bp；各条带之间距离300bp以上，极易鉴别；健康人血样阴性对照不出现100bp以上的任何扩增条带：只有较轻的60-70bp的二聚体积累带，不会影响结果判断。 

本发明的优点和积极效果： 

1、本发明专为快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒设计的预装套式PCR单一组合试剂反应管(简称预装管)，它包含了除模板DNA外原来2轮PCR所需的所有组分，包括新型引物(疟原虫属特异一对，恶性疟原虫和间日疟原虫种特异引物各一个)，专用的缓冲系统，4dNTP，Taq酶和石蜡油等；严格定量集合了于一个预装管内，应用时每管只需加入按照说明提取的滤纸血样模板DNA 5μl，即可上机反应，连续扩增50个循环约需1小时50分钟；从而在保证高灵敏、高特异和高度稳定性的基础上，在高度简化试剂和操作的同时，大大缩短了出结果的报告时间；适用于具备PCR仪和电泳设备的各级实验室，为疟疾临床、流行病学调查研究、疟疾监测以及抗疟药和疫苗研制试验等领域提供一个常规诊断、确诊与鉴别诊断的有力工具。 

2、本发明所述的新型引物5’端均具有独特设计的与3端(第1、2或3核苷酸起至第5-12核苷酸)互补结构，低于其退火温度时它们的3’5’端互补退火形成自身封闭的二级结构，有效地防止引物之间或引物与其他非靶核酸链之间错配退火产生的二聚体等非特异扩增产物； 

3、本发明选用位于多拷贝、短线状(仅约6kb)的疟原虫线粒体基因组内的细胞色素氧化酶基因(cox1)作靶基因，不仅有利于提高敏感性，且在反应程序中可使用较低的解链温度，使细胞核染色体基因组DNA处于未解链(或不充分解链)状态，进一步减少了特异引物与人或其他细胞核基因组DNA的错配退火引发的非特异扩增的机会。 

3、本发明提供一种简易而又高效的滤纸血样模板DNA制备方法包括特制的模板缓冲液，使滤纸血样模板DNA制备时间缩短到30分钟之内，即使仅含1个虫/μl的微量DNA血样也能提取检出。如果少数几份血样完全可能在半天内(4小时)出结果。实现单管套式/多重PCR一步完成扩增，减少了扩增产物污染机会，实现高敏感性、特异性和稳定性，不仅可同时检出并鉴定恶性疟原虫和/或间日疟原虫单独或混合感染，还能检出其他两种人疟原虫(三日疟，卵形疟)单独感染；是一种操作简易、准确而又快速的检测方法。 

4、本试剂盒适用于检测滤纸血样本，也适用于检测其他方法提取的DNA。 

5、本诊断试剂盒成本低，稳定性好，容易保存，适应工业化生产，具有较好的经济效益和社会效益。 

附图说明

图1：双向半套式引物设计示意图。 

附图1的说明：带数字的半箭头分别代表4个引物在coxI基因的种、属特异位点，横实线分别代表3个扩增片段。 

图2：应用快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒检测系列稀释恶性疟和间日疟原虫感染血样的电泳图谱。 

附图2的说明：M＝DNA标志，F＝恶性疟原虫，V＝间日疟原虫，W＝10000个虫/μl，Q＝1000个虫/μl，B＝100个虫/μl，10＝10个虫/μl，1＝1个虫/μl，0＝健康人滤纸血样模板(阴性对照)。 

图3：应用快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒检测疟疾病人和疑似疟疾病人血样的电泳图谱。 

附图3的说明：M＝DNA分子量标志；单纯恶性疟感染共9例(6368199S67151485051FQ+)均同时出现971bp和629bp的两条带；单纯间日疟感染共21例，其中11例(S4246608011115916320121217844)同时出现971bp和300bp的两条带；另10例(10317217387150153160169202VW+)只有300bp的一条带；恶性疟与间日疟混合感染1例(158)同时出现971bp、629bp和300bp的三条带；阴性7例(2672682692702712720)除有少量二聚体(＜100bp)外无任何非特异扩增。 

具体实施方式

实施例1：应用快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒检出恶性疟和间日疟原虫——敏感度检测，结果见图2。 

模拟疟原虫密度梯度感染血滤纸血样的制备：分别从静脉采集镜检确诊单纯恶性疟和单纯间日疟感染病人(原虫密度10000个虫/μl血以上)含虫全血各一份，用健康人抗凝全血按10倍系列稀释法分别稀释上述恶性疟和间日疟含虫血，获得10000/μl，1000/μl，100/μl，10/μl，1/μl梯度含虫血，用移液器定量滴制疟原虫密度梯度含虫血滤纸血样(5μl/每片6mm直径滤纸圆片)，自然风干后分装密封管4℃保存备用。 

滤纸血样DNA模板的制备：上述疟原虫密度梯度滤纸血样每片放入1个标志含虫密度的0.5ml锥形管内，加入0.1×模板缓冲液400μl浸泡5-10分钟，离心洗脱血红蛋白，吸去全部上清；重新加入1×模板缓冲液30μl，置入微量加热器，95℃加热10分钟，期间漩涡震荡30秒×2次；简短离心10秒，吸取上清作为PCR模板DNA；或放入4℃冰箱保存备用，但使用前必须重新加热95℃，加热时间5-10分钟，漩涡震荡30秒，简短离心后，再吸取上清作PCR模板。单管一步法套式PCR试验步骤：自试剂盒内取出所需的冻存预装PCR试剂管(每管含单一组合加酶试剂10μl)，用记号笔逐管标志原虫密度，点动离心使试剂集中管底并置 回冰盒，依次吸取上述制备的原虫密度梯度模板DNA 5μl加至对应标志PCR管底部，再次点动离心置回冰盒，传递至扩增室，即可按下列预编PCR程序上机连续反应49个循环。 

起始解链温度：(94/90s) 

第1-14循环：(94℃/10s，70℃/15s，67℃/15s，62℃/01s，72℃/60s)×14； 

第15-18循环：(86℃/05s，62℃/10s，58℃/10s，72℃/60s，86℃/05s；65℃/20s，72℃/40s)×4； 

第19-48循环：(86℃/05s，70℃/02s，65℃/20s，72℃/40s)×30； 

第49循环：(72℃/3’，10℃/3’)×1。 

每次试验除待检样本外，另设阳性(恶性疟和间日疟病人血样)和阴性(健康人血样)模板各1管； 

电泳鉴定：取PCR扩增产物10-15μl作2％琼脂糖凝胶电泳，在248um紫外透射分析仪上观察和摄像。 

疟原虫阳性可出现三种条带类型：人疟原虫属公共带971bp，恶性疟原虫特异带629bp，间日疟原虫特异带300bp；各条带之间距离300bp以上，极易鉴别。 

单纯恶性疟感染：可同时出现971bp和629bp两条带，或只有629bp一条带(原虫密度较低100个虫以下)； 

单纯间日疟感染：可同时出现971bp和300bp两条带，或只有300bp一条带(原虫密度较低100个虫以下)； 

恶性疟与间日疟混合感染：可同时出现971bp、629bp和300bp三条带；或629bp和300bp两条种特异带。 

单纯三日疟或卵形疟感染：仅出现971bp一条带； 

非疟疾病人或健康人血样：除少量二聚体(60-70bp)之外，不出现任何扩增条带。 

实施例2：应用快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒检出恶性疟和间日疟原虫——在疟疾监测中检测疟疾发热病人血样，结果见图3。 

血样采集：用滤纸法采集临床诊断疟疾、疑似疟疾病人血液样本，常规消毒耳垂或指端刺血均可，滤纸片中央直接接触血滴，使血液渗透滤纸达2-4cm直径，自然风干后用白纸间隔放入薄膜袋内，可室温邮寄或4℃保存；或用活页纸打孔器，打出6mm直径小圆片(约含4-5μl全血)，置0.5-1.5ml锥型管内4℃保存。 

滤纸血样DNA模板的制备：滤纸血样用打孔器打出6mm直径圆片，放入0.5ml锥形管内，加入0.1×模板缓冲液400μl浸泡5-10分钟，离心洗脱血红蛋白，吸去全部上清；重新加入1×模板缓冲液30μl，置入微量加热器，95℃加热10分钟，期间漩涡震荡30秒×2次；简短离心10秒，吸取上清作为PCR模板DNA；或放入4℃冰箱保存备用，但使用前必须重新 加热95℃，加热时间5-10分钟，漩涡震荡30秒，简短离心后，再吸取上清作PCR模板。 

单管一步法套式PCR试验步骤：批量检测大量样本时，可使用未加酶的冻存单一组合试剂，以下在冰盒上操作，根据样本数(n)×10μl吸取所需量组合试剂至另管中，加入所需Taq酶＝n X 0.5U，简短振荡混匀离心后按每管10μl分布各已标志PCR管并置回冰盒，吸取上述制备的模板DNA 5μl加至对应编号PCR管底部，再次点动离心置回冰盒，传递至扩增室，即可按下列预编PCR程序上机连续反应49个循环。 

始解链温度：(94/90s) 

第1-14循环：(94℃/10s，70℃/15s，67℃/15s，62℃/01s，72℃/60s)×14； 

第15-18循环：(86℃/05s，62℃/10s，58℃/10s，72℃/60s，86℃/05s；65℃/20s，72℃/40s)×4； 

第19-48循环：(86℃/05s，70℃/02s，65℃/20s，72℃/40s)×30； 

第49循环：(72℃/3’；10℃/3’)×1。 

每次试验除待检样本外，另设阳性(恶性疟和间日疟病人血样)和阴性(健康人血样)模板各1管； 

电泳鉴定：取PCR扩增产物10-15μl作2％琼脂糖凝胶电泳，在248um紫外透射分析仪上观察和摄像。 

疟原虫阳性可出现三种条带类型：人疟原虫属公共带971bp，恶性疟原虫特异带629bp，间日疟原虫特异带300bp；各条带之间距离300bp以上，极易鉴别。 

单纯恶性疟感染：可同时出现971bp和629bp两条带，或只有629bp一条带(原虫密度较低100个虫以下)； 

单纯间日疟感染：可同时出现971bp和300bp两条带，或只有300bp一条带(原虫密度较低100个虫以下)； 

恶性疟与间日疟混合感染：可同时出现971bp、629bp和300bp三条带；或629bp和300bp两条种特异带。 

单纯三日疟或卵形疟感染：仅出现971bp一条带； 

非疟疾病人或健康人血样：除少量二聚体(60-70bp)之外，不出现任何扩增条带。 

Claims (12)

1.一种快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒，其特征在于：试剂盒包含了样本模板DNA制备和检测疟原虫DNA的套式PCR反应所需的全套试剂，其组成包含：

① 1×模板缓冲液1.5ml×1支；

② 预装套式PCR单一组合加酶试剂10μl×20管；

③ 阳性对照：间日疟和恶性疟阳性滤纸血模板DNA 10μl各一支。

2.根据权利要求1所述的快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒，其特征在于：所述的

1×模板缓冲液包括下列组分：

① 20mmol/L Tris-HCl pH8.4；

② 20mmol/L KCl，10mmol/L(NH₄)₂SO₄；

 ③ 3.2mmol/L MgCl₂。

3.根据权利要求1所述的快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒，其特征在于：所述的预装套式PCR单一组合试剂包含模板DNA和其它反应组分：

① 具有自我封闭功能的新型引物4条；

② 缓冲系统；

③ 4种核苷酸（4dNTP各200umol/L）；

④ DNA聚合酶（Taq酶 0.5 U）；

⑤ 石蜡油 15μl。

4.根据权利要求3所述的快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒,其特征在于：所述的引物是根据4种疟原虫线粒体细胞色素氧化酶（coxI）基因内属、种特异位点设计，包括疟原虫属特异新型引物一对，恶性疟原虫种特异新型引物一个，间日疟原虫种特异新型引物一个；在它们的5’端均具有特殊设计的与3端（第1、2或3核苷酸起至第5-12核苷酸）互补结构，当温度低于其最佳退火温度5-10℃或以下时，引物5’3’端互补退火自我封闭，从而防止了引物-引物、引物与其他非靶核酸链之间的错配退火。

5.根据权利要求3或4所述的快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒,其特征在于：所述的引物序列为：

Umf-1868  5' CATGGCGCACACTTCCCTTCTCGCCATT 3'

Umr-2838  5' CTAAGAAGGTGTTATCCCCGGCGAACCTTCTTAC 3'

Fmr-2496  5' GATAATACATATCCATTAAGTAATGAAGGTATTATCA-3’      

Vmf-2539  5' CGTCAGGATATAATTATAGATAACATTCCTGATAC 3'。

6.根据权利要求3所述的快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒,其特征在于：所述的缓冲系统包括下列组分：

① 20 mmol/L Tris-HCl pH 8.4；

② 20 mmol/L KCl；

③ 10 mmol/L (NH₄)₂SO₄；

④ 1% 甲酰胺；

⑤ 0.075% Tween-20。

7.根据权利要求3、4和5任一项所述的快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒,其特征在于：所述的引物组合为3对，其中：疟原虫属特异引物Umf-1868和Umr-2838的浓度均为105 nmol/L；恶性疟原虫种特异引物 Fmr-2496的浓度为105 nmol/L；间日疟原虫种特异引物 Vmf-2539的浓度为87.5 nmol/L。

8.一种快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒的检测方法，其特征在于：包括样本模板DNA制备、PCR扩增反应和扩增产物电泳分析鉴定；

所述的样本模板DNA制备，包括如下步骤：

① 采用滤纸法采集血样，自然风干后可室温邮寄；干燥条件下4℃可长期保存；

② 滤纸血样用打孔器打出6mm直径园片，放入0.5 ml锥形管内，加入0.1×模板缓冲液400μl浸泡5-10分钟，离心洗脱血红蛋白，吸去全部上清；

③ 重新加入1×模板缓冲液30μl,置入微量加热器，95℃加热10分钟，期间漩涡震荡30秒×2 次；简短离心10秒，吸取上清作为PCR模板DNA；或放入4℃冰箱保存备用，使用前必须重新加热95℃，时间5-10分钟，漩涡震荡30秒，简短离心后，再吸取上清作PCR模板。

9.根据权利要求8所述快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增反应只进行一次加样操作，先从试剂盒内取出所需的冻存预装试剂PCR管，每管含单一组合试剂10μl，点动离心使试剂集中管底并置回冰盒，吸取上述制备的模板DNA 5μl加至PCR管底部，再次点动离心置回冰盒，传递至扩增室，按预编PCR程序上机连续PCR扩增反应49个循环得到扩增产物。

10.根据权利要求9所述的快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增反应49个循环的反应条件如下：

起始解链温度：（94/90s）

第1-14循环：(94℃/ 10s，70℃/15s，67℃/15s，62℃/01s，72℃/60s)×14；

第15-18循环：(86℃/05s，62℃/10s，58℃/10s，72℃/60s，86℃/05s；65℃/20s，72℃/40s)×4；

第19-48循环：(86℃/05s，70℃/02s，65℃/20s，72℃/40s)×30；

第49循环：（72℃/3’；10℃/3’)×1。

11.根据权利要求8所述的快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的扩增产物电泳分析鉴定，取PCR扩增产物10-15μl 作2%琼脂糖凝胶电泳, 在248um紫外透射分析仪或凝胶成像分析仪上观察和摄像；采用花青核酸染料染色，染色采用后染法即泡染法或胶染法；作虫种鉴定，必须采用后染法进行扩增产物电泳分析鉴定。

12.根据权利要求8或11所述的快速套式PCR疟疾分子诊断试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的扩增产物电泳分析鉴定，结果是疟原虫阳性有三种条带：人疟原虫属公共带971 bp,恶性疟原虫特异带629 bp,间日疟原虫特异带300 bp；健康人血样阴性对照不出现100 bp以上的任何扩增条带，只有较轻的60-70 bp的二聚体积累带。

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