CN107302915A - 一种农作物杂草防治方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种农作物杂草防治方法，所述方法为：在农作物长至4‑5叶期，喷施第一类除草剂和/或第二类除草剂，喷施量为1～100g/亩，进行杂草防治；所述第一类除草剂为草甘膦异丙胺盐；第二类除草剂为2,4‑D、麦草畏、硝磺草酮、莠去津、苯达松、烟嘧磺隆、啶嘧磺隆或五氟磺草胺中的一种或多种的混合；利用本发明方法可以提高杂草防治效率、降低除草剂对作物产生药害的风险，有效防止抗性杂草的产生。与传统转基因抗除草剂植物的杂草防治方法相比，该方法能够有效降低除草剂的使用剂量，减少转基因植物的杂草防治成本，减少除草剂对农业生态环境的污染。

Description

一种农作物杂草防治方法
(一)技术领域
本发明涉及杂草控制领域，更具体而言本发明涉及利用多种除草剂对广谱抗除草剂转基因作物进行田间杂草控制。
(二)背景技术
杂草防治是作物栽培过程中的主要工作，利用化学除草剂除草是最为经济有效的杂草防治方法。选择性除草剂被广泛应用于作物苗后除草，在严格控制使用条件和用量范围时，选择性除草剂能够有效防治杂草，而不伤害作物。选择性除草剂对适用作物而言，其安全性是有比较严格的条件，在生产应用中经常因为除草剂使用剂量不准确、使用条件控制不严格等问题，造成选择性除草剂对适用作物造成药害，从而影响作物的生长和产量。为了提高杂草防治效率、简化防治措施、降低防治成本和防治风险，生物技术方法被应用于培育具有高抗除草剂的转基因作物。如抗草甘膦转基因作物的产生和推广就大大简化了杂草防治措施，降低杂草防治成本，提高了作物苗后杂草的安全性。因此，从抗草甘膦转基因作物被批准商业化种植以来，抗草甘膦转基因作物被大量种植，草甘膦作为单一除草剂也因此被长时间、大范围使用，从而产生了多种抗性杂草。在抗草甘膦作物种植区，抗草甘膦杂草已经成为杂草防治的新难题。
使用多种不同作用机理的选择性除草剂进行轮用或混用是延缓和防止除草剂抗性杂草产生的有效方法。但是应用这种方法对现有的农作物进行苗后杂草防治时需要准确掌握除草剂使用量和使用条件，可供选择的除草剂种类非常有限，在不同作物上可使用的除草剂类型差别也很大，使用效果也各不相同，很难达到高效安全除草的目的。因此抗多种除草剂是新一代的抗除草剂转基因作物的发展方向。目前国际上报道和使用的抗多种除草剂的转基因作物主要以抗2-3种除草剂为主，如抗草甘膦抗2,4-D转基因大豆、抗草甘膦抗草铵膦作物、抗草甘膦草铵膦耐2,4-D作物和抗草铵膦草甘膦耐麦草畏棉花等，这类转基因作物的使用，可以提高对草甘膦抗性杂草的控制效率。但是因为可供选择用来混用或者轮用的除草剂种类有限，特别是2,4-D和麦草畏都是已经使用过几十年的除草剂，在自然界中已经有抗性杂草存在，因此发展广谱抗除草剂的转基因作物，扩大除草剂的使用类型和使用方式，建立新型的田间杂草控制体系对有效防治田间杂草，降低除草剂抗性杂草的产生具有重要的生产实际价值。
本发明提供了一种作物杂草控制新技术。该技术涉及两个方面，一是提供了具有广谱抗除草剂的转基因作物，这种作物除了抗灭生性除草剂外，还可以同时抗2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、麦草畏、烟嘧磺隆、磺酰脲类除草剂、硝磺草酮和苯达松等多种具有不同作用机理的除草剂，二是提供了用于这类转基因作物杂草防治的混合除草剂，利用混合除草剂或者交替使用不同作用机理的除草剂可以实现对该类转基因作物进行高效的杂草防治。
(三)发明内容
本发明要解决的技术问题是提供能有效控制田间杂草，防止抗性杂草产生的杂草防治方法。
为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种农作物杂草防治方法，所述方法为：在农作物长至4-5叶期，喷施第一类除草剂和/或第二类除草剂，喷施量为1～100g/亩，进行杂草防治；所述第一类除草剂为草甘膦异丙胺盐；第二类除草剂为2,4-D、麦草畏、硝磺草酮、莠去津、苯达松、烟嘧磺隆、啶嘧磺隆或五氟磺草胺中的一种或多种的混合。
进一步，所述第一类除草剂和第二类除草剂共同使用，更优选所述除草剂按下列方法之一喷施：(1)第一类除草剂与第二类除草剂混合，进行一次或多次喷施；(2)第一类除草剂与第二类除草剂交替使用进行喷施；(3)第一类除草剂与第二类除草剂在不同种植季节间混合或交替使用。
进一步，草甘膦异丙胺盐用量为40-80g/亩，2,4-二氯苯氧乙酸用量为10-20g/亩，麦草畏用量为5-15g/亩，硝磺草酮用量为2-10g/亩，莠去津用量为30-100g/亩，苯达松用量为50-100g/亩，烟嘧磺隆用量为4g/亩，啶嘧磺隆用量为1-6g/亩，五氟磺草胺用量为1-2g/亩。
进一步，所述除草剂喷施方法为下列之一：
1)草甘膦异丙胺盐(40-80g/亩)+2,4-D18g/亩；
2)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+烟嘧磺隆(1.2-2.4g/亩)；
3)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+硝磺草酮(2.5-10g/亩)；
4)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+啶嘧磺隆(1.5g/亩)；
5)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+麦草畏(5g/亩)；
6)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+苯达松(75g/亩)；
7)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+五氟磺草胺(1.5g/亩)；
8)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+烟嘧磺隆(1.2-1.5g/亩)+硝磺草酮(2-2.5g/亩)；
9)草甘膦异丙胺盐(40-80g/亩)施用30天后喷施麦草畏(5g/亩)+硝磺草酮(2.5-5g/亩)；
10)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施2,4-D(18g/亩)+苯达松(75g/亩)；
11)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施五氟磺草胺(1.5g/亩)+麦草畏(5g/亩)；
12)莠去津(30g/亩)+硝磺草酮(2.5-5g/亩)施用30天后喷施草甘膦异丙胺盐(80g/亩)；
13)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)；
14)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施硝磺草酮(10g/亩)；
15)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施2,4-D(18g/亩)。
进一步，所述农作物含抗草甘膦基因和细胞色素氧化酶基因。
进一步，所述抗草甘膦基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述细胞色素氧化酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7之一所示。
进一步，所述农作物为玉米、大豆、棉花、水稻、油菜或小麦。
本发明使用一种灭生性除草剂抗性基因(如草甘膦或草铵膦)表达框叠加具有代谢多种除草剂功能的细胞色素氧化酶(P450)基因表达框，将叠加后的基因表达框转入植物，获得的转基因植物具有抗两类除草剂。其中灭生性除草剂抗性基因赋予转基因植物具有抗第一类除草剂的能力，所述第一类除草剂为草甘膦或者草铵膦。细胞色素氧化酶赋予转基因植物能够同时抗所有第二类除草剂，所述第二类除草剂为2,4-D、麦草畏、硝磺草酮、莠去津、苯达松和磺酰脲类除草剂(如烟嘧磺隆、啶嘧磺隆、五氟磺草胺)等多种不同作用机理的除草剂。因此本发明提供的抗除草剂转基因植物具有特别广谱的抗除草剂能力，这是目前转基因植物中所没有的。可以使用多种除草剂分开或混合使用对本发明所述转基因植物进行杂草防治。
本发明所述广谱抗除草剂转基因植物外源T-DNA包含两个抗除草剂表达框，一个是灭生性除草剂抗性基因表达框，包括但不限于草甘膦或草铵膦抗性基因表达框，在本发明的实施例中使用的是草甘膦抗性基因，赋予转基因植物具有草甘膦抗性，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。另一个抗除草剂表达框是一类具有代谢除草剂化合物的细胞色素氧化酶基因，该类基因赋予转基因植物同时对2,4-D、麦草畏、硝磺草酮、莠去津、苯达松和磺酰脲类除草剂(如烟嘧磺隆、啶嘧磺隆、五氟磺草胺)等多种不同作用机理的除草剂产生抗性，在本发明的实施例中使用的除草剂代谢基因为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7。
本发明所述杂草防治方法可以是通过分开、混合或者轮流使用多种不同作用机理的除草剂对本发明提供的抗除草剂转基因植物进行杂草防治，具体可以是如下几种方式中的一种：
方式一：种植本发明提供的转基因作物，在转基因作物种植期间使用第一类除草剂与第二类除草剂中的一种或多种混合使用，通过一次使用或多次使用来实现对转基因作物田间杂草的有效防治。在具体实施例中，使用的第一类除草剂是草甘膦，第二类除草剂为2,4-D、麦草畏、硝磺草酮、莠去津、苯达松和磺酰脲类除草剂中的一种或多种。
方式二：第二类除草剂中的两种或多种混合，形成混合除草剂，在种植本发明提供的转基因作物期间，利用第二类除草剂与第一类除草剂轮换使用，实现对本发明提供的转基因植物的杂草防治。
方式三：在本发明提供的转基因植物的不同种植季节间混合或交替使用本发明提供的第一类和第二类除草剂进行杂草防治。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：利用本发明方法可以提高杂草防治效率、降低除草剂对作物产生药害的风险，有效防止抗性杂草的产生。与传统转基因抗除草剂植物的杂草防治方法相比，该方法能够有效降低除草剂的使用剂量，减少转基因植物的杂草防治成本，减少除草剂对农业生态环境的污染。
(四)附图说明
图1.实施例1含目的基因的质粒结构图，LB和RB：T-DNA的边界序列；35Spromoter：抗除草剂基因(X1、X2或X3)启动子；35S terminator：抗除草剂基因终止子；CaMV35S：抗草甘膦基因启动子；G：抗草甘膦基因玉米；CaMV 3’UTR：抗草甘膦基因终止子。
(五)具体实施方式
实施例1：抗除草剂转基因植物的获得
1.含有外源基因的质粒载体的获得
委托上海生物工程有限公司合成第一类抗除草剂基因-草甘膦基因G，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；委托上海生物工程有限公司合成三个含有35S终止子的第二类抗除草剂细胞色素氧化酶基因X1，X2和X3，基因两端分别带有BamHⅠ和KpnⅠ的酶切位点。X1的核苷酸序列为SEQ ID NO.3对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，X2的核苷酸序列为SEQ ID NO.5对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，X3的核苷酸序列为SEQ ID NO.7对应氨基酸序列为SEQ ID NO.8。从载体pCambia1300(Cambia，AU)扩增CMV35S启动子，作为细胞色素氧化酶基因的启动子，启动子两端分别带上HindⅢ和BamHⅠ，扩增获得的CMV35S启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.9。PCR扩增引物为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11。
利用pCambia1300为植物转化载体框架，用内切酶XhoⅠ将载体中潮霉素基因用内切酶切除，替代成本发明使用的抗草甘膦基因G，获得中间载体1300-G。利用内切酶HindⅢ和KpnⅠ双酶切中间载体1300-G，回收载体分别与细胞色素氧化酶基因X1、X2或X3及其启动子连接，分别得到植物转化载体1300-GX1、1300-GX2和1300-GX3，载体图谱如图1所示。利用电击法(2500V)将获得的植物转化质粒导入农杆菌LBA4404中，获得含有植物转化载体的农杆菌。
2.抗除草剂转基因玉米的获得
本发明中获得转基因玉米所用的方法是农杆菌介导方法，根据Frame等报道的方法和培养基配方(Plant Physiol,2002,129:13-22)进行转化，使用草甘膦为筛选试剂，具体步骤如下：
(1)取授粉后8～10天的亲本玉米穗，收集大小为1.0-1.5mm未成熟胚。分别将含有转化载体的农杆菌与未成熟胚在22℃共培养2-3天。
(2)将步骤(1)培养后的未成熟胚转移到含有终浓度200mg/L特美汀抗生素(葛兰素史克，美国)的愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10-14天杀灭农杆菌。
(3)将步骤(2)诱导培养后的所有愈伤组织转到含有终浓度2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。
(4)转移步骤(3)所有的愈伤组织到新鲜的含有(2mM)草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。
(5)然后，转移步骤(4)成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。
(6)转移步骤(5)胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。
(7)转移步骤(6)所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，将生根后的再生苗移植到温室中生长繁种，获得含有抗草甘膦基因G和细胞色素氧化酶基因的转基因玉米MGX1(含抗草甘膦基因G和细胞色素氧化酶基因X1)、MGX2(含抗草甘膦基因G和细胞色素氧化酶基因X2)和MGX3(含抗草甘膦基因G和细胞色素氧化酶基因X3)。
3.抗除草剂转基因大豆遗传转化
本发明中获得转基因大豆所用的方法是农杆菌介导的大豆子叶节转化法(Hinchee et al.,1988)，具体如下所示。
(1)挑选成熟的大豆种子，单层平铺培养皿中，干燥器中用氯气灭菌。灭菌12小时后，将大豆播在萌发培养基(GM)，24℃光培养12h。
(2)取含有目的基因的农杆菌接种到YEP固体培养基中暗培养48h后。收集农杆菌到GADT液体培养基中，用于侵染大豆外植体。
(3)将步骤(1)中吸胀的大豆种子沿中轴线剖开，用解剖刀轻微破坏生长点后浸入农杆菌液中约0.5-3h。将侵染后的外植体置于培养皿中，暗培养3d。
(4)将步骤(3)中共培养后的外植体转入恢复培养基(RM)中，光照培养1周。
(5)将步骤(4)中恢复培养后的外植体转到筛选培养基(SIM)中，光照培养3周。
(6)将步骤(5)中长出丛生芽的外植体的子叶和变黄部分切除，将丛生芽转移到伸长培养基(SEM)中，光照培养，每2周换一次培养基直至长出约3cm的幼苗。
(7)将步骤(6)中幼苗切下，用吲哚丁酸浸泡切口2min后转移到生根培养基(RM)中，光照培养诱导生根。
(8)将步骤(7)获得的生根苗从培养基中取出，转入土中于温室生长繁殖，收获种子。获得含有抗草甘膦基因G和细胞色素氧化酶基因的转基因大豆SGX1、SGX2和SGX3。
实施例2：抗除草剂转基因玉米的杂草防治
1.转基因玉米除草剂抗性分析
MGX1、MGX2和MGX3各选择5个转化株系进行除草剂抗性分析，在转基因苗生长至4-5叶期喷施(1-8喷施1次，其余喷施2次，可以根据实际需要进行多次喷施)除草剂，除草剂施用方式和使用量如下所示：
1)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+2,4-D(18g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，2,4-D600mg/L，溶剂为水；
2)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+烟嘧磺隆(2.4g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，烟嘧磺隆80mg/L，溶剂为水；
3)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+硝磺草酮(5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，硝磺草酮100mg/L，溶剂为水；
4)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+啶嘧磺隆(1.5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，啶嘧磺隆100mg/L，溶剂为水；
5)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+麦草畏(5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，麦草畏100mg/L，溶剂为水；
6)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+苯达松(75g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，苯达松2.5g/L，溶剂为水；
7)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+烟嘧磺隆(1.5g/亩)+硝磺草酮(2g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，烟嘧磺隆40mg/L，硝磺草酮50mg/L，溶剂为水；
8)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施硝磺草酮(10g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.2wt％，硝磺草酮80mg/L，溶剂为水；
9)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施2,4-D(18g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.2wt％，2,4-D600mg/L，溶剂为水。
使用除草剂后10-30天期间对转基因玉米的抗性水平进行评估。以0-5的等级对玉米损伤进行肉眼评估，其中0表示“无”损伤；1表示轻微损伤；2表示明显损伤，短期内能恢复；3表示严重损伤，需要长时间恢复生长；4表示严重损伤，不能恢复；5表示死亡。
转基因大豆除草剂抗性分析结果显示，本发明提供的三类转基因玉米都具有良好的广谱抗除草剂能力，常规对照玉米在使用除草剂7天后完全死亡，混合使用或者分开使用多种除草剂对本发明提供的转基因玉米不会产生明显的药害(表1)。
表1转基因玉米除草剂抗性水平
2.混合除草剂对转基因玉米杂草防治效果评价
MGX1、MGX2和MGX3各选择2个转化株系进行田间杂草防治效果评价。试验小区面积为20平米，根据6株/平米的密度种植转基因玉米和对照，在转基因苗生长至4-5叶期喷施除草剂(1-8喷施1次，其余喷施2次，可以根据实际需要进行多次喷施)，除草剂施用方案如下，以转基因玉米喷施清水为对照：
1)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+2,4-D(18g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，2,4-D600mg/L，溶剂为水；
2)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+啶嘧磺隆(1.5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，啶嘧磺隆100mg/L，溶剂为水；
3)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+五氟磺草胺(1.5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，五氟磺草胺25mg/L，溶剂为水；
4)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+麦草畏(5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，麦草畏100mg/L，溶剂为水；
5)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+苯达松(75g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，苯达松2.5g/L，溶剂为水；
6)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+烟嘧磺隆(1.2g/亩)+硝磺草酮(2.5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，烟嘧磺隆40mg/L，硝磺草酮50mg/L，溶剂为水；
7)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施麦草畏(5g/亩)+硝磺草酮(5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.2wt％，麦草畏100mg/L，硝磺草酮50mg/L，溶剂为水；
8)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施2,4-D(18g/亩)+苯达松(75g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.2wt％，2,4-D 600mg/L，苯达松2.5g/L，溶剂为水；
9)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施五氟磺草胺(1.5g/亩)+麦草畏(5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.2wt％，五氟磺草胺25mg/L，麦草畏100mg/L，溶剂为水；
10)莠去津(30g/亩)+硝磺草酮(5g/亩)施用30天后喷施草甘膦异丙胺盐(80g/亩)，其中莠去津1g/L，硝磺草酮50mg/L，草甘膦异丙胺盐0.2wt％，溶剂为水。
对使用除草剂20天后转基因玉米地杂草防治效果进行评价。杂草防治效果＝(对照区杂草株数-施药区杂草株数)/对照区杂草株数*100％。
转基因玉米田间杂草防治效果显示，多种除草剂分开使用或混合使用对转基因玉米田间杂草有良好的控制效果，可以有效控制玉米整个生长期间的杂草，对转基因玉米没有伤害。单独使用草甘膦早期可以有效控制杂草，但是使用20天后陆续有杂草发芽生长。使用多种除草剂比单独使用草甘膦具有更好的除草效果(表2)。
表2转基因玉米田间杂草防治效果
实施例3：抗除草剂转基因大豆的杂草防治
1.转基因大豆除草剂抗性分析
SGX1、SGX2和SGX3各选择5个转化株系进行除草剂抗性分析，在转基因大豆生长至3-4叶期喷施除草剂(1-8喷施1次，其余喷施2次，可以根据实际需要进行多次喷施)，除草剂施用方式和使用量为如下几种：
1)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+2,4-D(18g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，2,4-D600mg/L，溶剂为水；
2)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+烟嘧磺隆(1.2g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，烟嘧磺隆80mg/L，溶剂为水；
3)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+硝磺草酮(2.5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，硝磺草酮100mg/L，溶剂为水；
4)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+啶嘧磺隆(1.5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，啶嘧磺隆100mg/L，溶剂为水；
5)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+麦草畏(5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，麦草畏100mg/L，溶剂为水；
6)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+苯达松(75g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，苯达松2.5g/L，溶剂为水；
7)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+烟嘧磺隆(1.2g/亩)+硝磺草酮(2.5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，烟嘧磺隆40mg/L，硝磺草酮50mg/L，溶剂为水；
8)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施硝磺草酮(10g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.2wt％，硝磺草酮80mg/L，溶剂为水；
9)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施2,4-D(18g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.2wt％，2,4-D 600mg/L，溶剂为水。
使用除草剂后10-30天期间对转基因大豆的抗性水平进行评估。以0-5的等级对大豆损伤进行肉眼评估，其中0表示“无”损伤；1表示轻微损伤；2表示明显损伤，短期内能恢复；3表示严重损伤，难以恢复；4表示严重损伤，不能恢复；5表示死亡。
转基因大豆除草剂抗性分析结果显示，本发明提供的三类转基因大豆都具有良好的广谱抗除草剂能力，混合使用或者分开使用多种除草剂对本发明提供的转基因大豆不会产生明显的药害(表3)。
表3转基因大豆除草剂抗性水平
2.混合除草剂对转基因大豆杂草防治效果评价
SGX1、SGX2和SGX3各选择2个转化株系进行田间杂草防治效果评价。试验小区面积为20平米，根据15株/平米的密度种植转基因大豆和对照，在转基因大豆生长至3-4叶期喷施除草剂(1-8喷施1次，其余喷施2次，可以根据实际需要进行多次喷施)，除草剂施用方案如下，以转基因大豆喷施清水为对照：
1)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+2,4-D(18g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，2,4-D600mg/L，溶剂为水；
2)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+啶嘧磺隆(1.5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，啶嘧磺隆100mg/L，溶剂为水；
3)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+五氟磺草胺(1.5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，五氟磺草胺25mg/L，溶剂为水；
4)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+麦草畏(5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，麦草畏100mg/L，溶剂为水；
5)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+苯达松(75g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，苯达松2.5g/L，溶剂为水；
6)草甘膦异丙胺盐(40g/亩)+烟嘧磺隆(1.2g/亩)+硝磺草酮(2.5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.1wt％，烟嘧磺隆40mg/L，硝磺草酮50mg/L，溶剂为水；
7)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施麦草畏(5g/亩)+硝磺草酮(2.5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.2wt％，麦草畏100mg/L，硝磺草酮50mg/L，溶剂为水；
8)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施2,4-D(18g/亩)+苯达松(75g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.2wt％，2,4-D 600mg/L，苯达松2.5g/L，溶剂为水；
9)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)施用30天后喷施五氟磺草胺(1.5g/亩)+麦草畏(5g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.2wt％，五氟磺草胺25mg/L，麦草畏10mg/L，溶剂为水；
10)莠去津(30g/亩)+硝磺草酮(2.5g/亩)施用30天后喷施草甘膦异丙胺盐(80g/亩)，其中草甘膦异丙胺盐0.2wt％，莠去津1g/L，硝磺草酮50mg/L，溶剂为水。
11)草甘膦异丙胺盐(80g/亩)其中草甘膦异丙胺盐0.2wt％，溶剂为水。
使用除草剂后20天后转基因大豆地杂草防治效果进行评价。杂草防治效果＝(对照区杂草株数-施药区杂草株数)/对照区杂草株数*100％。
转基因大豆田间杂草防治效果显示，多种除草剂分开使用或混合使用对转基因大豆田间杂草有良好的控制效果，可以有效控制大豆整个生长期间的杂草，对转基因大豆生长发育没有影响。单独使用草甘膦早期可以有效控制田间杂草，但是使用20天后陆续有杂草发芽生长。使用多种除草剂比单独使用草甘膦具有更好的除草效果(表4)。
表4转基因大豆田间杂草防治效率

Claims (9)

1.一种农作物杂草防治方法，其特征在于所述方法为：在农作物长至4-5叶期，喷施第一类除草剂和/或第二类除草剂，喷施量为1～100g/亩，进行杂草防治；所述第一类除草剂为草甘膦异丙胺盐；第二类除草剂为2,4-二氯苯氧乙酸、麦草畏、硝磺草酮、莠去津、苯达松、烟嘧磺隆、啶嘧磺隆或五氟磺草胺中的一种或多种的混合。
2.如权利要求1所述农作物杂草防治方法，其特征在于所述第一类除草剂和第二类除草剂共同使用。
3.如权利要求1所述农作物杂草防治方法，其特征在于所述除草剂按下列方法之一喷施：(1)第一类除草剂与第二类除草剂混合，进行一次或多次喷施；(2)第一类除草剂与第二类除草剂交替使用进行一次或多次喷施；(3)第一类除草剂与第二类除草剂在不同种植季节间混合或交替使用。
4.如权利要求1所述农作物杂草防治方法，其特征在于所述草甘膦异丙胺盐用量为40-80g/亩，2,4-二氯苯氧乙酸用量为10-20g/亩，麦草畏用量为5-15g/亩，硝磺草酮用量为2-10g/亩，莠去津用量为30-100g/亩，苯达松用量为50-100g/亩，烟嘧磺隆用量为4g/亩，啶嘧磺隆用量为1-6g/亩，五氟磺草胺用量为1-2g/亩。
5.如权利要求1所述农作物杂草防治方法，其特征在于所述除草剂喷施方法为下列之一：
1)草甘膦异丙胺盐40-80g/亩+2,4-二氯苯氧乙酸18g/亩；
2)草甘膦异丙胺盐40g/亩+烟嘧磺隆1.2-2.4g/亩；
3)草甘膦异丙胺盐40g/亩+硝磺草酮2.5-10g/亩；
4)草甘膦异丙胺盐40g/亩+啶嘧磺隆1.5g/亩；
5)草甘膦异丙胺盐40g/亩+麦草畏5g/亩；
6)草甘膦异丙胺盐40g/亩+苯达松75g/亩；
7)草甘膦异丙胺盐40g/亩0五氟磺草胺1.5g/亩；
8)草甘膦异丙胺盐40g/亩+烟嘧磺隆1.2-1.5g/亩+硝磺草酮2-2.5g/亩；
9)草甘膦异丙胺盐40-80g/亩施用30天后喷施麦草畏5g/亩+硝磺草酮2.5-5g/亩；
10)草甘膦异丙胺盐80g/亩施用30天后喷施2,4-二氯苯氧乙酸18g/亩+苯达松75g/亩；
11)草甘膦异丙胺盐80g/亩施用30天后喷施五氟磺草胺1.5g/亩+麦草畏5g/亩；
12)莠去津30g/亩+硝磺草酮2.5-5g/亩施用30天后喷施草甘膦异丙胺盐80g/亩；
13)草甘膦异丙胺盐80g/亩；
14)草甘膦异丙胺盐80g/亩施用30天后喷施硝磺草酮10g/亩；
15)草甘膦异丙胺盐80g/亩施用30天后喷施2,4-二氯苯氧乙酸18g/亩。
6.如权利要求1所述农作物杂草防治方法，其特征在于所述农作物含抗草甘膦基因和细胞色素氧化酶基因。
7.如权利要求6所述农作物杂草防治方法，其特征在于所述抗草甘膦基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
8.如权利要求6所述农作物杂草防治方法，其特征在于所述细胞色素氧化酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7之一所示。
9.如权利要求6所述农作物杂草防治方法，其特征在于所述农作物为玉米、大豆、棉花、水稻、油菜或小麦。
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