CN102212552A - 一种利用化学杀雄剂高效活体转化基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化学杀雄、花粉管通道和花粉介导转化技术，属于分子育种和基因工程技术领域。本发明首先对现蕾期的农作物T₀进行化学杀雄处理，再将花蕾进行柱头切除，接着利用花粉管通道技术，即用OD₆₀₀=0.8的含有靶基因的农杆菌侵染液（附加5%蔗糖，500μL/L的SilwetL-77）混合可育花粉，用脱脂棉球蘸取菌液涂抹到切除柱头的子房上，遮光处理三天后正常生长，最后收取自交种。将T₁代进行除草剂抗性筛选，对抗性植株进行PCR检测，确定阳性植株。本发明方法具有成本低、操作简单、不需要昂贵仪器设备和转化效率高等特点,转化率达1%-5%，适合于任何开花植物并可应用到大规模的农作物遗传转化中。

Description

一种利用化学杀雄剂高效活体转化基因的方法

技术领域

本发明属于分子育种和基因工程技术领域，特别是涉及一种利用化学杀雄剂高效活体转化基因的方法。

背景技术

植物基因工程进开始于20世纪80年代，它是在植物组织培养技术、细胞培养技术和DNA体外重组技术基础上，不断结合其它技术而逐步发展起来的一门技术。目前的转基因技术主要是依靠脱分化的细胞进行菌液侵染，然后再分化和再生，实现外源基因的转移，从而获得转基因植株。这一途径有其独特优势，如重复性较好，基本不受季节限制，各种作物的转化技术借鉴性强，转化率较高等，但是该途径也有其不足之处，如组织培养及转化再生能力受基因型影响比较明显，即使在模式植物拟南芥中，不同的生态型及不同基因型的材料转化难易程度差异仍然比较大，并且有些物种，组织培养难于操作，还有的物种受感染细胞与农杆菌间容易产生过敏性反应，导致感染部位的褐化和坏死。另外，有些作物如甘蓝型油菜转化频率普遍很低。因此，寻求新的不依赖于植物组织培养技术的转化方法，是许多从事基因工程科研工作者非常关注的事情。

20世纪90年代,一些不依赖或很少依赖组织培养程序的转化技术相继被开发出来, 如花粉管通道法、花粉介导法、子房注射法、萌动种子浸染法、真空渗入法、花序浸染法和基因枪法等。

1. 花粉管通道法(pollen-tube pathway)是指利用植物授粉后所形成的花粉管通道(又叫花粉管引导组织), 使外源DNA(基因组DNA或重组DNA)沿着花粉管渗入, 然后经珠心进入胚囊, 进而进入尚不具备正常细胞壁的卵子、合子或早期的胚胎细胞进行转化。此法先后在棉花、大豆、玉米、水稻、甘蓝和小麦等植物中应用并获得成功(刘芳等, 2007)。此种转化方法缺点是转化机理不够明确、转化的靶基因拷贝数较多、遗传基础复杂且整合的外源DNA多发生缺失, 这可能与整合机制有关。另外,操作人员不同转化效率也不同，因此对于花朵较小物种、花粉萌发及受精过程尚不明确的物种很难采用；2. 花粉介导法(pollen-mediated transformation)是指以花粉作为载体, 通过直接匀浆或辅以机械方法(如电击和超声波等)将外源DNA导入花粉,将携带有外源DNA的花粉授粉于受体植物从而获得转基因植株的方法。花粉介导法先后在棉花、玉米、矮牵牛、小麦和烟草等植株上应用并获得成功。但转化效率和重复性有待提高, 物种之间有明显差异。主要原因可能有2种: 一是有些花粉粒具有坚硬的外壁, 外源DNA很难进入花粉；二是外源DNA易被核酸酶降解。研究表明, 萌发的花粉及柱头都有核酸酶活性存在, 匀浆时它们在短短几分钟内就可使外源DNA降解。另外，花粉介导法需要成熟的花粉离体萌发技术。3.子房注射法(ovary injection)是一种花粉管通道法的改良方法, 该方法是利用显微注射器把外源DNA溶液直接注入到子房或胚囊中，外源DNA在子房或胚囊产生的高压和卵细胞的吸收作用下进入刚受精的卵细胞，进而获得转基因植株。此方法在黑麦、龙葵、棉花、茄子、大麦、玉米、油菜、小麦和黄瓜等植物中应用。然而，研究表明植株所处于的状态、注射针的大小、注射时间、部位和深度以及所注射DNA的量等均影响转化效率。另外，转化实验是在大田中进行, 操作不方便、劳动强度大且注射的位置和深度经验性强, 从而影响转化效率。再有, 注射后的子房受到损伤容易被病原物感染而引起霉烂也是转化效率降低的重要因素；4. 农杆菌介导萌动种子侵染法(Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds)是指让种子先晒干后，在水中短时间内吸水快速膨胀，将农杆菌吸入体内, 在侵染前或侵染期间时借助机械损伤辅以转化, 进而获得转基因植株。此方法处理的难度在于对茎尖进行机械损伤的力度和位置难以控制, 且种子的大小形状和种皮厚薄等因素均会影响转化的效率。5.真空渗入法(vacuum infiltration)是将受体材料(包括开花早期的花序)浸入含有农杆菌的侵染液中, 然后用真空泵抽真空使农杆菌渗入植物组织内部，再恢复常压,进而获得转基因植株的转化方法。此方法在模式植物拟南芥中转化比较成熟，成为拟南芥转基因功能验证、T-DNA 插入突变体库构建和基因打靶等重要研究领域的首选转基因技术。但此方法相对来说比较繁琐，并且转化株结实率较低，主要适用于株型较小并且种子繁殖系数高的物种的转化。转化效果也受植株发育时期、花瓣萼片多少和厚薄、真空渗入时间和接种后遮光处理时间等多种因素的影响；6. Clough（1998）等在真空渗入法基础上发展起来花序侵染法，用5%蔗糖，500μL/L的Silwet L-77，OD₆₀₀=0.8的侵染液直接蘸花替代真空渗入，得到了0.5%-3%的转化率。并总结了转化成功的3个条件：合适的发育时期、蔗糖浓度和表面活性剂。这种方法也很难直接在其他作物上应用，因为其他作物不像拟南芥那样花瓣壁薄，所以很难侵染。另外，对于转化的细胞和转化的时间仍然不太清楚。7 基因枪转化方法虽然不受物种限制，在较多物种中被使用，但是其成本较高，需要昂贵的设备，转化效率偏低，许多科研人员望洋兴叹。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用化学杀雄剂高效活体转化基因的方法。该方法将化学杀雄剂、改进的花粉管通道和花粉介导技术有机结合，试图找出用农杆菌介导的农作物基因遗传转化的最简便有效的方法，建立不依赖于植物细胞和组织培养的高效、规模化的转化体系，使基因工程技术能与常规育种有效结合，成为大多数育种工作者手中的有力工具，促进更多的基因工程品种用于生产。本发明的技术方案如下：

首先在植物现蕾期对可育植株进行化学杀雄，对杀雄后的不育植株进行柱头切除，取未经化学杀雄的同一材料的可育单株的花粉，加入含有靶基因的农杆菌菌液，然后通过花粉管通道技术和花粉介导法进行授粉，遮光处理三天，之后正常生长，收获自交种；将收获的种子种植于田间，进行抗除草剂筛选和PCR检测，最后进行阳性植株鉴定。

本发明所提供的一种利用化学杀雄剂高效活体转化基因方法，依次通过如下步骤实现：

1) 取纯合的待转化植株材料的种子条播在A和B两个小区，种子数量根据物种繁殖系数而定，保证下代种子在1万粒以上；

2) 现蕾期用常规方法对A区进行化学杀雄处理，B区进行套袋处理；

3) 花期配制含有靶基因的农杆菌菌液，其中OD₆₀₀=0.8，附加质量比浓度为5%的蔗糖和500μL/L的Silwet L-77，与B区花粉混合，制成混液；

4）始花期对A区花蕾从子房与柱头结合处进行柱头切除，用步骤3所得混液进行花粉管通道技术授粉；

5）授粉处理后套黑色袋子，暗处理3d；

6）3d后，摘取黑袋，正常生长，收取自交种；

7）当年将收获的种子种植于大田中，苗期分别在3片叶和5片叶时进行2次抗除草剂筛选；

8）取筛选后生长正常的植株叶片，提取DNA，根据靶基因序列和启动子序列设计引物进行PCR检测；确定阳性单株，同时套袋自交，收取阳性单株的自交种子。

将上述方法获得的阳性单株的自交种子种植于田间，筛选纯合单株，可进行其它有关的实验。

本发明具有如下优点：

1）化学杀雄后，雄蕊退化，花粉极少，保证切除的柱头只能接受外源花粉，并且保证第二年植株是可育的，使实验更快捷方便；

2）切除柱头可减少花粉管和花柱向外分泌核酸酶，外源花粉经过花柱的长度变短,可降低花粉被分解的数量，增大进入胚囊的机会；

3）切除柱头后，产生愈伤组织，有利于农杆菌侵染，同时增大花粉与花柱切面的接触面积，可提高转化效率；花粉与农杆菌侵染液混合，使部分侵染液进入到花粉中，配合外源片段进入到胚囊中，可提高转化效率，转化率达到1-5%；

4）该方法不依赖于植物组织培养和诱导再生植物等一整套人工培养过程。由于花粉管通道法的转化可以直接获得转基因种子, 从而避免了植物组织培养过程中可能产生的对植物基因型的依赖和各种无法预测的体细胞变异对后代的不利影响, 一般也不会形成嵌合体, 纯合速度快；

5）由于花粉管通道是天然存在的普遍现象, 故利用花粉管通道法进行外源基因的遗传转化, 可应用于任何开花植物, 进行任何物种之间包括人工合成的基因转移, 从而扩大了基因工程目的基因的来源和受体植物的范围；

6）鉴定时可直接针对报告基因的表型来进行,快捷高效，避免了鉴定过程中大量使用抗生素进行筛选的弊端；

7）转化速度较快, 一般当年即可获得转基因植株。对于大多数植物(农作物)而言, 从开花到收获种子均在2～3个月。因而在花期进行转基因操作, 到收获转基因种子, 再由转基因种子出苗进行目标性状和转基因的分子鉴定, 一般的周期约为4个月, 基本上可以达到当年转化和当年获得转基因植物的结果；

8）方法简便有效，与组培相比成本低，适合于大规模的农作物遗传转化。由于是直接获得转基因植物, 在进行转基因目标性状和转基因分子鉴定的同时, 即可针对转基因植株的农艺性状进行定向筛选, 形成转基因农作物新品种的效率得到提高, 周期大大缩短。

具体实施方式

以甘蓝型油菜为例：

1) 取纯合的甘蓝型油菜中双11号，条播于A和B两个小区，每个小区3×3m² ；

2) 现蕾初期对A区植株用0.6 μg/ mL浓度的ESP（化学杀雄剂，全不育株达98%）进行化学杀雄处理，B区进行套袋处理；

3) 农杆菌的培养：挑取平板保存的农杆菌单菌落接种于YEP培养液中(附加利福平50mg/L、链霉素25mg/L和卡那霉素100mg/L)，28℃摇菌16～18h (200r/min)，取1～5 mL菌液接到100mL YEP培养液(含乙酰香酮100μmol/L 、利福平25mg/L、链霉素12.5mg/L和卡那霉素50mg/L)中扩大培养约2～4h ,至农杆菌的对数生长期(OD₆₀₀= 0.3～0.5)，4800 r/min 离心6 min 收集菌体，重悬于MS液体培养基中并调OD值；

菌液的培养：将制备好的已转化了绿色荧光蛋白基因的基因（报告基因为Basta基因）pC2301M1质粒的农杆菌菌液10 mL ,在转化前1 d晚上,转入大瓶过夜培养，第2天取出使用时农杆菌液OD₆₀₀约2.0；室温5 000 r/min离心15 min ,弃上清液,将农杆菌沉淀悬浮于约3倍体积的渗透培养液（5%蔗糖+500μL/L的silwet L-77）中,使OD₆₀₀在0.8左右，以备第二天使用；

4）花期用小刷收集B区花粉50 mg并混合于步骤3所得农杆菌液5mL；

5）始花期用剪刀或刀片将A区花蕾进行柱头切除，切除位置为柱头和子房结合处；

6）用脱脂棉球蘸取步骤4所得混合了花粉的农杆菌液涂抹在剪去柱头的子房上，套黑色袋子，避光处理3d；

7）3d后，摘取黑袋，正常生长，收取自交种，为T₀代；

8）当年将收获的种子种于大田中，并于苗期进行2次basta除草剂筛选，T₁代种子出苗后，在2片真叶时，对T₁代植株喷洒50 mg/ L Basta 溶液(主要成分为草丁膦) ,进行抗性初步筛选，在5片真叶时用同样浓度的Basta 溶液对抗性株进行复筛；

9）Basta基因的检测：在田间选取除草剂抗性株的幼嫩叶片，按CTAB法提取油菜叶片基因组DNA并将其溶于ddH₂O后，-20 ℃保存待用；

10）根据靶基因序列和启动子序列设计引物，进行PCR检测:以提取的DNA为模板，按下列反应体系进行：PCR反应的总体积为10μL，其体系为10×扩增缓冲液1.0μL，MgCl₂(25mmol/L) 1.0μL，dNTP (10mmol/L pH 7.5) 0.2μL，样品DNA (50ng/μL) 1.0μL，F-Primer(50ng/μL) 0.5μL，R-Primer(50ng/μL) 0.5μL，TaqDNA 聚合酶(5U/μL) (购自上海SABC公司) 0.1μL，ddH₂O5.7μL；

PCR程序为 94℃ 5min，[94℃ 30s， 60℃ 45s，72℃ 1min] ×35cycles，72℃ 10min；

11）结果分析：取PCR产物5 μL 经1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果阳性植株占2/3。

13）将阳性单株的种子种植于田间，筛选纯合单株并进行其它有关的实验。

Claims (2)

1.一种利用化学杀雄剂高效活体转化基因的方法，其特征在于，首先在植物现蕾期对可育植株进行化学杀雄，对杀雄后的不育植株进行柱头切除，取未经化学杀雄的同一材料的可育单株的花粉，加入含有靶基因的农杆菌菌液，然后通过花粉管通道技术和花粉介导法进行授粉，遮光处理三天，之后正常生长，收获自交种；将收获的种子种植于田间，进行抗除草剂筛选和PCR检测，最后进行阳性植株鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，依次通过如下步骤实现：

1) 取纯合的待转化植株材料的种子条播在A和B两个小区，种子数量根据物种繁殖系数而定，保证下代种子在1万粒以上；

2) 现蕾期用常规方法对A区进行化学杀雄处理，B区进行套袋处理；

3) 花期配制含有靶基因的农杆菌菌液，其中OD₆₀₀=0.8，附加质量比浓度为5%的蔗糖和500μL/L的Silwet L-77，与B区花粉混合，制成混液；

4）始花期对A区花蕾从子房与柱头结合处进行柱头切除，用步骤3所得混液进行花粉管通道技术授粉；

5）授粉处理后套黑色袋子，暗处理3d；

6）3d后，摘取黑袋，正常生长，收取自交种；

7）当年将收获的种子种植于大田中，苗期分别在3片叶和5片叶时进行2次抗除草剂筛选；

8）取筛选后生长正常的植株叶片，提取DNA，根据靶基因序列和启动子序列设计引物进行PCR检测；确定阳性单株，同时套袋自交，收取阳性单株的自交种子。