CN103361368A - 一种棉花细胞色素p450基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种棉花细胞色素P450基因及应用，一种含有SEQIDNO.1或SEQIDNo.2所示序列的基因表达载体，该载体通过表达由上述核酸序列形成的双链核酸分子并用于抑制棉花内源基因GhSSN的表达以促进茉莉酸的合成和其活性形式的积累，还提供了一种含有以上表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和棉花细胞，一种棉花细胞色素氧化酶基因GhSSN在控制棉花抗黄萎病中的应用，通过调节GhSSN或与之等同的同源基因在棉花植株中的表达来调控棉花茉莉酸的合成。GhSSN基因在棉花根和子叶中优势表达，具有控制茉莉酸合成的功能，通过遗传转化可应用于棉花抗黄萎病品系的培育，同时可作为棉花抗黄萎病反应的标记基因。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种棉花细胞色素P450基因，还涉及一种棉花细胞色素氧化酶基因在控制棉花抗黄萎病中的应用。采用反向遗传学的方法，通过对棉花抗黄萎病反应基因表达谱的分析，分离克隆的GhSSN基因为控制棉花茉莉酸合成的基因，能影响棉花对黄萎病的抗性。
背景技术
棉花黄萎病是目前危害我国棉花生产的主要病害之一，对我国棉花生产常年造成减产10-20％，部分地区发病严重时的高达70％，已成为我国棉花生产可持续发展的主要障碍之一。1993年黄河和长江流域棉区棉花黄萎病发病面积达267万公顷，2002年黄萎病已在全国各个棉区的影响面积已超过300万公顷(简桂良等，2003.Current Status and Countermeasure of Verticillium Wilt of Cottonin Chin.中国棉花，2003，30：13-14)。近年来棉花黄萎病在我国发生日趋严重，特别是在新疆和黄河流域等主产棉区大面积发生。种植抗病品种是防治黄萎病的有效途径。研究表明陆地棉对于黄萎病基本表现为感或耐病，其具有的抗病位点也多为微效多基因位点，受环境影响较大，难以进行聚合，因此生产上还没有高抗棉花黄萎病的品种大面积推广应用。
细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)是一类广泛存在于动物、植物和微生物等生物体中的氧化酶体系，因其还原态与CO结合后在波长450nm处有最大吸收峰而得名(Degtyarenko and Archakov，1993 Molecular evolution ofP450superfamily and P450-containing monooxygenase systems.FEBS letters 332，1-8)。基因组测序结果表明CYP450是一个古老的基因超家族，迄今为止数据库中已有超过3000多条CYP450单基因序列，是植物最大的酶蛋白家族，其数量约占各物种总基因数量的1％(Nelson et al.，2008Comparison of cytochrome P450 genes from six plant genomes.Tropical Plant Biology 1，216-235)，研究发现多数植物P450基因都受到发育及组织特异性或外界环境的调节，广泛参与了生物碱、萜类、脂肪酸、糖苷类、黄酮与类黄酮类、以及激素类物质的代谢等。如CYP450类基因在生长素、油菜素内酯等其他植物激素的合成与调控中起着非常重要的作用(Stepanova et al.，2011The Arabidopsis YUCCA1 Flavin Monooxygenase Functions in the Indole-3-Pyruvic Acid Branch of Auxin Biosynthesis.Plant Cell 23，3961-3973；Zhang et al.，2012Functional complementationof dwf4 mutants of Arabidopsis by overexpression of CYP724A1.J Plant Physiol 169，421-428)。虽然大部分植物CYP450类基因的功能并不清楚，而其在植物免疫系统和抗病反应中的重要功能也在近年来越来越受到人们的重视。
苯丙烷合成及其次生代谢途径是合成木质素及多种防卫分子的重要途径，肉桂酸羟化酶(C4H)，参与了苯丙烷合成途径的前期步骤(Schoch et al.，2002Chemical inactivation of the cinnamate 4-hydroxylase allows for the accumulationof salicylic acid in elicited cells.Plant physiology 130，1022-1031)。CYP83家族是一类IAA代谢路径分支的酶系(Bak and Feyereisen，2001The involvementof two P450enzymes，CYP83B1and CYP83A1，in auxin homeostasis and glucosinolate biosynthesis.Plant physiology 127，108-118)，CYP83A 1基因突变后能影响拟南芥的抗病反应，进一步研究发现该基因不仅参与了芥子油甙类的合成，同时也参与了苯丙烷合成途径(Hemm et al.，2003The Arabidopsis ref2mutantis defective in the gene encoding CYP83A1and shows both phenylpropanoidand glucosinolate phenotypes.The Plant Cell 15，179-194)。而对其同源基因CYP83B1的分析表明，该基因不仅受到多种胁迫信号的诱导，而且其突变还可以导致叶片出现类病斑的表型，显示它可能和植物防卫反应相关(Smolen and Bender，2002Arabidopsis cytochrome P450cyp83B 1mutations activate the tryptophanbiosynthetic pathway.Genetics 160，323)。硫代葡萄糖苷类化合物是植物重要的次生代谢产物，当植物组织受伤时，硫代葡萄糖苷水解为异硫氰酸、腈等有毒物质来保护自身免遭食草动物的进一步伤害。CYP79和CYP83这两个家族参与硫代葡萄糖苷类物质前期代谢过程，其中CYP79家族的成员催化氨基酸羟基化生成乙醛肟，而CYP83家族的成员催化乙醛肟到硫代葡萄糖苷的反应(Nafisi et al.，2006Cytochromes P450in the biosynthesis of glucosinolates and indole alkaloids.Phytochemistry Reviews 5，331-346)。近来研究又发现CYP81F2基因在病原诱导的作用下能催化硫代葡萄糖苷类物质4-methoxyindol-3-ylmethylglucosinolate的积累，该物质在PEN2芥子酶的转化激活后具有杀真菌作用(Bednarek et al.，2009A glucosinolate metabolism pathway in living plant cells mediates broad-spectrum antifungal defense)。羟肟酸类次生代谢物在植物的抗病和抗虫中起着重要作用，研究表明CYP71C家族的四个成员CYP71C1、CYP71C2、CYP71C3、CYP71C4形成一个基因簇，共同参与禾谷类植物羟肟酸类防御次生物质DIMBOA(2，4-二羟基1，4-苯丙噁嗪-3-酮)的合成途径(Frey et al.，1995Expression ofa cytochrome P450gene family in maize.Molecular and General Genetics MGG 246，100-109；Frey et al.，1997Analysis of a chemical plant defense mechanism in grasses.Science 277，696)。低分子量抗菌化合物植物抗毒素是吲哚类衍生物，拟南芥突变体pad3由于缺乏植物抗毒素的存在，显著降低了拟南芥对病原真菌黑斑病菌的抗性，图位克隆研究发现pad3是由于一个P450基因CYP71B15发生突变而造成(Zhou et al.，1999Arabidopsis PAD3，a gene required for camalexin biosynthesis，encodes a putative cytochrome P450monooxygenase.The Plant Cell Online 11，2419-2428)，在酵母中异源表达CYP71B15的研究发现其催化植物生产植物抗毒素由dihydrocamalexic acid向camalexin转化的最终步骤(Schuhegger et al.，2006CYP71B15(PAD3)catalyzes the final step in camalexin biosynthesis.Plant physiology 141，1248-1254)。P450基因除了通过调控植物次生代谢物合成影响植物抗病反应外，还能通过调控脂类代谢和影响抗病重要信号分子茉莉酸的合成和活性转变参与植物抗病反应。
茉莉酸(jasmonic acid，JA)是一类脂肪酸的衍生物，是植物对病原性微生物和虫害防御反应的关键激素之一，能调节高等植物的发育、应答外界刺激、调节基因表达。研究表明茉莉酸合成途径起始于亚麻酸及一些中间代谢产物，α-亚麻酸从植物细胞膜上释放后，在质体中经脂氧合酶途径氧化为13(S)-氢过氧-亚麻酸。Park等通过反向遗传学筛选的方法找到一个茉莉酸合成的突变体aos，AOS由CYP74A编码，参与茉莉酸合成路径的早期步骤，催化13(S)-氢过氧-亚麻酸脱水生成不稳定的丙二烯氧化物。伤害能诱导野生型拟南芥中内源茉莉酸的含量水平上调100倍，而在突变体aos中茉莉酸含量却没有变化(Park et al.，2002A knock-out mutation in allene oxide synthase results in male sterility and defective wound signal transduction in Arabidopsis due to a block in jasmonic acid biosynthesis.The Plant Journal 31，1-12)；最新研究发现拟南芥CYP94B3在茉莉酸合成及活性调节中具有关键作用，Hwang等发现cyp94b3突变体对丁香假单胞菌DC3000的感病性增强(Hwang and Hwang，2010Role of the pepper cytochrome P450gene CaCYP450A in defense responses against microbialpathogens.Planta，1-13)，进一步研究发现它能催化茉莉酸信号路径的活性物质JA-Ile转化为12OH-JA-Ile，使JA-Ile失活，代谢产物分析显示cyp94b3突变体中JA-Ile过量积累，而超量表达该酶使JA-Ile耗尽(Koo et al.，2011Cytochrome P450CYP94B3 mediates catabolism and inactivation of the plant hormone jasmonoyl-L-isoleucine.Proceedings of the National Academy of Sciences 108，9298)。
Kawchuk等从番茄中采用图位克隆法得到Ve1和Ve2两个抗黄萎病基因(Kawchuk et al.，2001Tomato Vedisease resistance genes encode cell surface-likereceptors.Proc Natl Acad Sci U S A 98，6511-6515)。随后的研究发现，只有Ve1能介导番茄对大丽轮枝菌1号生理小种的抗性。通过VIGS(virus-inducedgene silencing)在番茄中的研究发现，Ve1介导的信号级联反应依赖于EDS1和NDR1，并且NRC1、ACIF、MEK2和SERK3/BAK1是Ve1信号路径的正调控因子(Fradin et al.，2009Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1.Plant Physiol 150，320-332)。2011年Fradin等研究还发现Ve1转化拟南芥后也能使拟南芥产生对黄萎病菌的抗性，并且所采用的信号路径与番茄中类似，茉莉酸信号路径在Ve1所介导的抗性反应中具有重要作用(Fradinet al.，2011Interfamily transfer of tomato Ve1 mediates Verticillium resistancein Arabidopsis.Plant Physiol 156，2255-2265)，表明Ve1及其信号路径在植物抗黄萎病反应中具有保守性和可转移性，而茉莉酸信号路径在植物抗黄萎病反应中具有重要作用。
在本发明提出之前申请人通过分析受黄萎病菌诱导后的棉花根部抑制差减cDNA文库，分离获得一个受黄萎病菌诱导的细胞色素P450类基因GhSSN。生物信息学分析表明它与已知的其他植物P450类基因同源度较低，表明这是一个新的植物P450基因，在棉花中也未有其功能的报道。通过转基因验证表明该基因能调控棉花茉莉酸的合成从而影响棉花对黄萎病菌的抗性。对该基因参与棉花茉莉酸合成路径的研究以及利用其创制转基因抗黄萎病棉花材料均具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种棉花细胞色素氧化酶基因，本发明命名为GhSSN。该基因从棉花接种黄萎病菌的基因表达谱中鉴定并分离克隆，具有如SEQ ID No.1(全长cDNA序列)或SEQ ID NO.2(为ORF)所示的核苷酸序列，或至少55％同源性的序列，以及上述DNA片段编码的蛋白或经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。
本发明的另一个目的在于提供了一种用GhSSN基因进行高效棉花遗传转化的方法。具体地说，本发明提供了一种含有SEQ ID NO.1或SEQ ID No.2所示序列的基因或该基因的部分类似功能片段的载体，该载体通过表达由上述核酸序列形成的双链核酸分子并用于抑制棉花内源基因GhSSN的表达以促进茉莉酸的合成。本发明还提供了一种含有以上表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和棉花细胞。
本发明再一个目的是在于提供了一种棉花细胞色素氧化酶基因GhSSN在控制棉花抗黄萎病中的应用，通过调控GhSSN，SEQ ID NO.1或SEQ ID No.2或与其功能等同的同源基因在棉花植株中的表达来达到调控棉花茉莉酸的合成，从而应用于棉花抗黄萎病品系的培育，同时可作为抗黄萎病棉花的标记基因。
本发明GhSSN基因的表达载体转化的宿主是棉花，可用于培育抗黄萎病的棉花品系和品种。
实现本发明的技术如下：
本发明申请人前期工作是研究海岛棉‘海7124’接种黄萎病菌后根部基因表达差异，通过分析发现一个在接种黄萎病菌后表达有明显变化的基因。利用荧光定量PCR(qPCR)鉴定表明该基因在抗病的海岛棉‘海7124’和感病的陆地棉‘YZ-1’接种黄萎病菌‘V991’(中国农科院植物保护所简桂良副研究员惠赠，)后具有明显不同的表达模式(图1B、图1C)。该基因在棉花根中高量表达，在茎和叶片中表达很少，并且该基因受植物抗病信号分子水杨酸的诱导，同时受茉莉酸的强烈诱导(图2B)。从陆地棉品系‘YZ-1’中提取接种黄萎病菌后棉花根部的总RNA(提取方法根据Zhu等，An improved simple protocol for isolation of high quality RNA from Gossypium spp.suitable for cDNA library construction，Acta Agronomica Sinica.2005，31.1657-1659.)，利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃5min，50℃60min，70℃10min。
采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)(Frohman等，Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts：amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer.PNAS 1988，85，8998-9002.)扩增出cDNA 5’和3’端，利用sequencher软件(公用的分析软件http://genecodes.com/)进行序列拼接后得到GhSSN的cDNA序列，一种分离的棉花细胞色素氧化酶基因，其序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。再通过ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对获得的cDNA进行分析，确定该序列中包含一个完整的ORF，一种分离的棉花细胞色素氧化酶基因，其序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
通过BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定SEQ ID No.2所编码的522个氨基酸序列具有植物细胞色素P450蛋白特有的保守结构域，包括以FxxGxRxCxG为特征序列的血红素结合域；以(A/G)Gx(D/E)T(T/S)为特征序列氧结合部位螺旋I区；以ExxR为特征序列的螺旋K区(图3A)。即得到一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。与其同源度最高的基因为毛果杨的CYP82D2(XM_002327054)，同源度只有55％，该基因的生物学功能未有报道。按照细胞色素P450类基因的分类方法(Chapple，C.Molecular-genetic analysis ofplant cytochrome P450-dependent monooxygenases.Annual Review of Plant Biology，1998.49(1)：311-343.)，这个序列为一个细胞色素P450基因家族的新成员。
根据GhSSN的ORF设计引物，在引物的两端分别加上用于重组的attB位点序列及保护碱基，即正义引物5’端加上5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC3′接头，反义引物5’端加上5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTG3′接头，分别将该引物命名为GhSSNoe-F(5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATCTCTACACTTTCTTAACACAGCAG3′)和GhSSNoe-R(5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTCTGTCCTTCACACTTTATTATTGC3′)。再以GhSSN基因的cDNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物通过BP反应构建到中间载体pDNOR221(购自Invitrogen公司)上，BP反应体系(5μl)：PCR产物2μl，pDNOR221载体1μl，BP酶(购自Invitrogen公司)1μl，TE(PH8.0)1μl。然后再将含有GhSSN基因的pDNOR221载体和pK2GW7，0(从比利时国立根特大学购买)载体进行LR重组反应，把GhSSN基因构建到pK2GW7，0的载体上，从而获得超量表达载体p35s-GhSSN。LR反应体系(5μl)：含有GhSSN基因的pDNOR221载体pDNOR221载体1μl，pK2GW7，0载体2μl，LR酶(购自Invitrogen公司)1μl，TE(pH8.0)1μl。所述的超表达载体p35s-GhSSN含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(图4)，以及植物表达载体pK2GW7，0。
一种棉花细胞色素氧化酶基因GhSSN在控制棉花抗黄萎病中的应用，其应用过程是：
根据免费的基因RNAi抑制表达位点预测软件(网址http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress)分析结果，设计GhSSN基因的RNAi抑制表达载体构建引物，在引物的两端分别加上用于重组的attB位点序列及保护碱基，分别将该引物命名为GhS SNi-F(5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCAGTGTTGTTGCAGAGGAAGACCAGA 3′)和GhS SNi-R(5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGACACCAATTTGCCGATGTCTGTTT3′)，再以GhSSN基因cDNA为模板进行PCR扩增，得到的产物通过BP重组反应导入RNAi载体pHellsgate4(重组酶购自Invitrogen公司，美国；RNAi载体见Wesley等，Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing in plants.Plant J.2001.27，581-590.)，构建的RNAi载体为pHellsgate4-GhSSN(图5)。
采用农杆菌LBA4404(Roger等，A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.Trends in plant science.2000.5，1360-1385.)介导的遗传转化棉花的方法和程序参照Jin等建立的棉花高效转化体系(Identification of a novel elite genotypefor in vitro culture and genetic transformation of cotton.Biologia Plantarum，2006，50：519-524；An efficient grafting system for transgenic plant recovery incotton(Gossypium hirsutum L.).Plant Cell，Tissue and Organ Culture，85：181-185，2006；Factors affecting stable transformation and plant regeneration during transforming embryogenic callus of Upland cotton(Gossypium hirsutum L.)via Agrobacterium tumefaciens，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，81：229-237，2005)，将构建好的p35s-GhSSN和pHellsgate4-GhSSN载体分别导入陆地棉材料‘YZ-1’。
在将pHellsgate4-GhSSN载体导入棉花后发现获得的转基因棉花幼苗在无菌条件下从茎部产生病斑，并导致大量转基因苗死亡，少数存活的转基因植株在成株的茎上仍会产生类病斑，因此该基因被命名为GhSSN(Silencing-induced StemNecrosis，SSN)(图6)。而同期的p35s-GhSSN载体转化得到的超量表达转基因棉花幼苗及本研究组其他基因的RNAi转基因棉花幼苗均未有此现象。采用Southern blotting对转pHellsgate4-GhSSN载体的转基因棉花3个生长相对正常的植株进行拷贝数分析(DNA提取和Southern实验参照J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)，实验结果表明3个家系有着不同的插入位点(图7)。对转基因棉花植株分单株提取叶片的RNA，利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，以GhSSNRt-F(5′CTTGGGTTACAACTATGCCATGT 3′)和GhSSNRt-R(5′ATTGAGCCTTCTATTTCCGAGAC 3′)引物进行RT-PCR，PCR反应条件为：95℃预变性30sec；95℃5sec，58℃35sec，40个循环，对转pHellsgate4-GhSSN载体的转基因棉花进行GhSSN的表达量分析。表达分析显示出现类病斑的转基因棉花幼苗中GhSSN基因的表达相对野生型均明显下降(图8)。通过以上分析，说明转基因棉花幼苗茎部的病斑与GhSSN表达量降低相关联，而不是因为插入突变引起的。
在获得高世代转基因棉花系之后，参考Fradin等的植物黄萎病抗性鉴定方法(Fradin et al.，2009Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediatedby tomato Ve1.Plant Physiol 150，320-332)，利用黄萎病菌‘V991’分别接种GhSSN RNAi抑制表达转基因棉花以及‘YZ-1’，结果发现GhSSN RNAi抑制表达转基因棉花对黄萎病菌的抗性比野生型棉花‘YZ-1’明显提高(图10)。通过基因表达分析表明，GhSSN RNAi抑制表达转基因棉花中参与植物抗病信号激素茉莉酸合成的基因均显著上调表达，茉莉酸在植物体内的活性形式JA-Ile的含量较野生型明显提高(图9)，表明在棉花体内通过抑制GhSSN的表达能增强棉花体内茉莉酸的合成，从而提高了其对黄萎病菌的抗性。因此GhSSN基因是一个负调控棉花体内茉莉酸合成的基因，通过调控GhSSN基因表达水平可以影响棉花抗黄萎病，对培育棉花抗黄萎病品系具有重要意义。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
从抗病的海岛棉‘海7124’与黄萎病菌互作的表达谱中鉴定了参与棉花抗黄萎病反应的基因GhSSN，并对其完成了分离克隆、功能验证和应用。GhSSN基因编码的蛋白质与毛果杨的CYP82D2编码的蛋白质具有55％的同源性。GhSSN基因具有控制茉莉酸合成的功能，通过遗传转化可应用于棉花抗黄萎病品系的培育，同时可作为棉花抗黄萎病反应的标志基因。
1.虽然在拟南芥及水稻中克隆到了许多参与茉莉酸合成的基因，但目前对于其详细的调控网络仍不是很清楚，与GhSSN同源度较高的毛果杨的CYP82D2以及较同源的拟南芥CYP82C2均未有生物学功能研究的报道(图3B)。目前在棉花中还没有棉花体内茉莉酸的合成调控研究的报道，本发明克隆的GhSSN基因对棉花茉莉酸合成有显著的影响，这对阐明GhSSN的生物学功能和细化植物茉莉酸的合成调控网络有重要意义。
2.抑制表达GhSSN的棉花体内能持续合成茉莉酸并产生茉莉酸过量的生理表型，在棉花茎部产生类病斑，这说明GhSSN基因对棉花茉莉酸合成的影响很明显，通过基因工程技术精确调控GhSSN基因的表达量能够控制棉花体内茉莉酸的合成。
3.茉莉酸的合成调控直接影响植物的抗病性，通过基因工程技术精确调控GhSSN基因的表达量能够达到控制棉花茉莉酸合成的目的，GhSSN基因的克隆将有助于棉花抗黄萎病材料的创制。
4.选育抗病的棉花材料一直为棉花育种家所重视，控制棉花茉莉酸合成基因的发现和利用将有助于解决生产上棉花抗黄萎病性差的难题。由于目前生产上黄萎病发生造成的棉花产量损失巨大，使得选育抗黄萎病的品种显得尤其重要，GhSSN基因的克隆和功能验证将有助于培育高抗的棉花品种。
5.通过GhSSN基因深入探讨棉花调控茉莉酸合成的分子机理以及在棉花与黄萎病菌互作过程中的作用具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
图1为一种海岛棉‘海7124’和陆地棉‘YZ-1’在根部接种黄萎病菌‘V991’后的表型差异及GhSSN在接种黄萎病菌后在两个棉花材料中的表达分析示意图。
在接种强致病性黄萎病菌‘V991’后14天，抗病的海岛棉‘海7124’与感病的陆地棉‘YZ-1’表现出明显不同的病理特征。‘海7124’接种黄萎病菌后基本不受‘V991’的危害，没有明显的病理反应，而‘YZ-1’则表现为叶片黄化、萎蔫和脱落等典型的黄萎病症状(图1A)。利用荧光定量PCR(qPCR)检测发现GhSSN在‘海7124’和‘YZ-1’在接种黄萎病菌后具有不同表达模式(图1B、图1C)。
图2为一种用qPCR测定GhSSN基因在棉花不同组织中的表达水平和对植物抗病信号分子茉莉酸和水杨酸的响应示意图。
qPCR结果显示该基因在棉花根中表达量最大，在茎和叶片中表达量很少(图2A)。GhSSN基因受植物抗病信号水杨酸少量诱导但受茉莉酸的强烈诱导，表明该基因参与了植物抗病反应网络(图2B)。qPCR检测各组织GhSSN基因相对表达量时以GhUB7(基因登录号：DQ116441)为内参基因。
图3为一种采用ClustalW软件(公开免费软件)对GhSSN蛋白质序列分析示意图。
结果表明GhSSN具有植物细胞色素P450类基因特有的保守结构域，包括以FxxGxRxCxG为特征序列的血红素结合域；以(A/G)Gx(D/E)T(T/S)为特征序列氧结合部位螺旋I区；以ExxR为特征序列的螺旋K区，但其他区域的同源度较低(图3A)。对GhSSN基因与拟南芥等植物P450类基因进行进化树分析，结果表明GhSSN与毛果杨的CYP82D2最为接近，同时与拟南芥基因CYP82C2也有相对较近的同源关系(图3B)，表明GhSSN可能属于植物CYP82D亚家族，但未有其功能研究的报道。
图4为一种超量表达载体p35s-GhSSN的构建示意图。
将GhSSN全长ORF经BP和LR重组反应构建到载体pK2GW7，0上的情况。
图5为一种RNAi载体pHellsgate4-GhSSN的构建示意图。
将GhSSN部分基因片段(619-1108bp)经重组反应插入pHellsgate4载体。
图6为一种通过RNAi技术将GhSSN在棉花中抑制表达后的转基因棉花表型分析示意图。
大量GhSSN的RNAi抑制表达转基因棉花幼苗在无菌条件下能产生类病斑并导致死亡(图6A)，少量转基因RNAi抑制表达棉花能能够存活，但在棉花成株不同部位上仍会出现类病斑。WT为未转基因的‘YZ-1’植株，GhSSNi-15、GhSSNi-28和GhSSNi-54为不同的转基因棉花单株(图6B)。
图7为一种转基因棉花GhSSNi-15、GhSSNi-28、GhSSNi-54中转基因载体插入棉花基因组的拷贝数分析示意图。
图8为一种GhSSNi-15、Gh SSNi-28、Gh SSNi-54和WT中GhSSN的基因表达分析示意图。
利用qPCR的方法鉴定表明，GhSSN的RNAi抑制表达转基因棉花幼苗中GhSSN的表达量相对野生型明显降低。图中GhSSNi-15、GhSSNi-28、GhSSNi-54分别为GhSSN的RNAi抑制表达的3个株系，WT为未转基因的‘YZ-1’植株。
图9为一种转基因棉花GhSSNi-15、GhSSNi-28、GhSSNi-54的转基因T2代和WT中参与茉莉酸合成的相关基因的表达分析及转基因棉花体内茉莉酸活性形式JA-Ile含量测定分析的示意图。
利用qPCR的方法鉴定表明，GhSSN的RNAi抑制表达转基因棉花幼苗中参与茉莉酸合成的基因表达相对野生型均明显上升。茉莉酸含量测定表明GhSSN的RNAi抑制表达转基因棉花体内JA-Ile含量较野生型明显增多，这与参与茉莉酸合成与信号响应相关基因的表达增强相一致。
图中GhSSNi-15、GhSSNi-28、GhSSNi-54分别为GhSSN的RNAi抑制表达的3个株系，WT为未转基因的‘YZ-1’植株。
图10为一种转基因棉花GhSSNi-15、GhSSNi-28和WT抗黄萎病鉴定分析示意图。
利用强致病力棉花黄萎病菌‘V991’接种表明，GhSSN的RNAi抑制表达的转基因棉花相对于野生型棉花具有显著提高的抗性。
具体实施方式
实施例1：GhSSN基因分离克隆
1、表达分析
本发明申请人前期工作是研究海岛棉‘海7124’接种黄萎病菌后根部基因表达差异，通过分析发现一个在接种黄萎病菌后表达有明显变化的基因。利用荧光定量PCR鉴定表明该基因在抗病的海岛棉‘海7124’和感病的陆地棉‘YZ-1’接种黄萎病菌‘V991’后具有明显不同的表达模式(见图1B、图1C)。从陆地棉品系‘YZ-1’中提取接种黄萎病菌后棉花根部的总RNA(提取方法根据Zhu等，An improved simple protocol for isolation of high quality RNA from Gossypium spp.suitable for cDNA library construction，Acta Agronomica Sinica.2005，31.1657-1659.)，利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃5min，50℃60min，70℃10min。
2、基因序列获得
采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)(Frohman等，Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts：amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer.PNAS 1988，85，8998-9002.)扩增出cDNA5’和3’端，进行序列拼接后得到GhSSN的cDNA序列，一种分离的棉花细胞色素氧化酶基因，其序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。通过ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对获得的cDNA进行分析，确定该序列中包含一个完整的ORF，一种分离的棉花细胞色素氧化酶基因，其序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。再通过BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定SEQ IDNo.2所编码的522个氨基酸序列具有植物细胞色素P450蛋白特有的保守结构域，包括以FxxGxRxCxG为特征序列的血红素结合域；以(A/G)Gx(D/E)T(T/S)为特征序列氧结合部位螺旋I区；以ExxR为特征序列的螺旋K区(图3)。即得到一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。与其同源度最高的基因为毛果杨的CYP82D2(XM_002327054)，同源度只有55％。
实施例2：GhSSN在棉花不同组织的表达分析和对植物抗病信号分子的响应
以陆地棉‘YZ-1’为材料，提取以下3个不同组织的RNA，用Real-time PCR检测GhSSN基因的表达水平。选取的3个组织分别是：1.根；2.茎；3.叶片。棉花总RNA提取方法根据上述Zhu等(An improved simple protocol for isolation of high quality RNA from Gossypium spp.suitable for cDNA library construction.Acta Agronomica Sinica.2005，31.1657-1659.)发表的文献，RNA提取完成后后用DNaseI(购自Promega公司)处理，RNA完整性通过1.2％(w/v)琼脂糖胶(EtBr)电泳检测(5V/cm)。核酸浓度的测定在Beckman DU800spectrophotometer(美国，贝克曼公司)上进行。RNA 260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.0的RNA用于下一步的分析。cDNA的合成是以3μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司，美国)，1μl 10mM dNTP，DEPC-water混合，总体积为12μl；然后65℃变性5min冰上骤冷；再加入8μl含有4μl RT buffer，2μl 0.1M dithiothreitol，40units of
Ribonuclease Inhibitor(Promega)，和200units of SuperscriptIIIRT(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；50℃温浴1h合成第一链；反应结束后75℃处理15min使SuperscriptIII RT失活。每份cDNA稀释到300μl后-20℃保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，以实施例1中获得的基因设计特异引物GhSSNRt-F(5′CTTGGGTTACAACTATGCCATGT 3′)和GhSSNRt-R(5′ATTGAGCCTTCTATTTCCGAGAC 3′)对GhSSN基因进行PCR扩增(扩增产物长147bp)。同时用引物UB7-F(5′GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3′)和UB7-R(5′CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3′)对棉花GhUbi7(GenBank登陆号：DQ116441)基因做特异扩增(扩增产物长198bp)，以作为内对照进行相对定量分析。定量PCR仪为ABI7500，定量PCR试剂购自Bio-Rad公司。PCR反应体系(20μl)包括：1μl稀释后的cDNA(等于10ng起始总RNA)，10μl 2×PCR Master Mix，200nM的引物。反应条件为：95℃30sec；95℃5sec，60℃35sec，40个循环。结果表明：本发明克隆的基因GhSSN在棉花根部高效表达(图2A)。
分别利用50μM茉莉酸甲酯和500μM水杨酸处理棉花‘YZ-1’幼苗的根(同时设置未做处理的平行对照)，分别在处理后0，1，4，12，24，48小时取棉花根组织。按前述方法提取根组织的总RNA。RNA的检测如前所述，质量合格的总RNA进行cDNA的合成。cDNA的合成是以3μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司，美国)，1μl 10mM dNTP，DEPC-water混合，总体积为12μl；然后65℃变性5min冰上骤冷；再加入8μl含有4μl RT buffer，2μl 0.1M dithiothreitol，40units of 
Ribonuclease Inhibitor(Promega)，和200units of SuperscriptIII RT(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；50℃温浴1h合成第一链；反应结束后75℃处理15min使SuperscriptIII RT失活。每份cDNA稀释到300μl后-20℃保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物GhSSNRt-F(5′CTTGGGTTACAACTATGCCATGT 3′)和GhSSNRt-R(5′ATTGAGCCTTCTATTTCCGAGAC 3′)对GhSSN基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长147bp)。同时用引物UB7-F(5′GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3′)和UB7-R (5′CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3′)对棉花GhUbi7(GenBank登陆号：DQ116441)基因做特异扩增(扩增产物长198bp)，以作为内对照进行相对定量分析。定量PCR仪为ABI7500，定量PCR试剂购自Bio-Rad公司。PCR反应体系(20μl)包括：1μl稀释后的cDNA(等于10ng起始总RNA)，10μl 2×PCR Master Mix，200nM的引物。反应条件为：95℃30sec；95℃5sec，60℃35sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明：本发明克隆的基因GhSSN受茉莉酸诱导高效表达，同时也受水杨酸诱导，表明其参与了植物抗病反应信号路径(图2B)。
实施例3：超量表达载体及RNAi抑制表达载体的构建和转化
为了验证GhSSN基因的功能，申请人构建了超量表达和RNAi抑制表达载体转化棉花。
根据实施例1中得到GhSSN设计超表达引物，在引物的两端分别加上用于重组的attB位点序列及保护碱基，即正义引物5’端加上5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC3′接头，反义引物5’端加上5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTG3′接头，分别将该引物命名为GhSSNoe-F(5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATCTCTACACTTTCTTAACACAGCAG3′)和GhSSNoe-R(5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTCTGTCCTTCACACTTTATTATTGC3′)。再以GhSSN基因的cDNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物通过BP反应构建到中间载体pDNOR221(购自Invitrogen公司)上，BP反应体系(5μl)：PCR产物2μl，pDNOR221载体1μl，BP酶(购自Invitrogen公司)1μl，TE(PH8.0)1μl。然后再将含有GhSSN基因的pDNOR221载体和pK2GW7，0(从比利时国立根特大学购买)载体进行LR重组反应，把GhSSN基因构建到pK2GW7，0的载体上，从而获得超量表达载体p35s-GhSSN。LR反应体系(5μl)：含有GhSSN基因的pDNOR221载体pDNOR221载体1μl，pK2GW7，0载体2μl，LR酶(购自Invitrogen公司)1μl，TE(pH8.0)1μl。所述的超表达载体p35s-GhSSN含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(图4)，以及植物表达载体pK2GW7，0。
根据免费的基因RNAi抑制表达位点预测软件(网址http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress)分析结果，设计GhSSN基因的RNAi抑制表达载体构建引物，在引物的两端分别加上用于重组的attB位点序列及保护碱基，分别将该引物命名为引物GhSSNi-F(5′GGGGACAATTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCAGTGTTGTTGCAGAGGAAGACCAGA3′)和引物GhS SNi-R(5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGACACCAATTTGCCGATGTCTGTTT3′)，再以实施例1中得到GhSSN基因cDNA为模板进行PCR扩增，得到的产物通过BP重组反应导入RNAi载体pHellsgate4(重组酶购自Invitrogen公司，美国；RNAi载体见Wesley等，Construct design for efficient，efiective and high-throughputgene silencing in plants.Plant J.2001.27，581-590.)，构建的RNAi载体pHellsgate4-GhSSN见(图5)。
引物序列如下：
GhSSNoe-F：5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATCTCTACACTTTCTTAACACAGCAG 3′；
GhSSNoe-R：5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTCTGTCCTTCACACTTTATTATTGC3′；
GhSSNi-F：5′GGGGACAATTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCAGTGTTGTTGCAGAGGAAGACCAGA3′；
GhSSNi-R：5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGACACCAATTTGCCGATGTCTGTTT3′
将构建的载体转化农杆菌菌株LBA4404(Roger等，A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.Trends in plant science.2000.5，1360-1385.)，以下LBA4404来源相同，再通过农杆菌介导的转化方法转化棉花。
转化棉花所采用的转化受体材料为‘YZ-1’，此材料是本实验室经过大量的筛选发现的一个具有很高胚胎发生能力的材料，农杆菌介导的转化棉花的转化方法和程序参照Jin等建立的高效转化体系(Identification of a novel elite genotype for in vitro culture and genetic transformation of cotton.Biologia Plantarum，2006，50：519-524；An efficient grafting system for transgenic plant recovery incotton(Gossypium hirsutum L.).Plant Cell，Tissue and Organ Culture，85：181-185，2006；Factors affecting stable transformation and plant regeneration duringtransforming embryogenic callus of Upland cotton(Gossypium hirsutum L.)via Agrobacterium tumefaciens，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，81：229-237，2005)，具体方法和流程如下：
1、无菌苗的培养
将将棉花品系‘YZ-1’(参见：Jin等的文献(Identification of a novel elite genotype for in vitro culture and genetic transformation of cotton.Biologia Plantarum，2006，50：519-524)棉籽壳去掉，用0.1/100的升汞灭菌10min，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基上(配方如下：1/2MS大量元素+葡萄糖15g/L+植物胶phytagel(购自sigma公司，美国)2.5g/L)，在28℃暗培养3-6天。
2.农杆菌的活化和保存
2.1准备：
农杆菌LBA4404，制备含卡那霉素50mg/L的MGL液体培养基(配方：胰化蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，MgSO4.7H2O 0.1g/L，KH2PO40.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L，调pH至7.0)，无菌三角瓶，LB(固、液)培养基(含卡那霉素50mg/L)，灭菌甘油，无菌枪头，无菌1.5mL离心管。
2.2操作：
2.2.1活化，悬浮：
从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因的LBA4404菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上划线，26.5℃暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的LB平皿划线，26.5℃暗培养36-48h，待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基中，27℃、200rpm摇2h，OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。
2.2.2菌株的保存：
从2.2.1操作中长出菌落的培养皿内挑取单菌落接于LB液体培养基中150rpm，26℃摇48h，按菌液和甘油体积比为1∶1加入1.5mL离心管混匀，-70℃保存。
3.浸染，共培养：
3.1准备：
暗培养5天左右幼嫩健壮的‘YZ-1’幼苗，经活化的农杆菌，无菌培养皿和无菌滤纸等。
3.2操作：
无菌条件下将‘YZ-1’幼苗下胚轴用锋利的刀片切成0.5-1cm长的切段，转入到经活化的农杆菌菌液中，搅匀，静置5-10min，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5min使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的共培养培养基中(配方：MS无机盐+B5有机物+2，4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L，pH 7.0)，20℃暗培养38-42h。
4.愈伤组织的诱导
将侵染共培养后的下胚轴切段接种于诱导培养基上(配方如下：MS无机盐+B5有机物+2，4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L，pH5.8)。
5、非胚性愈伤组织的增殖
非胚性愈伤组织的增殖培养基如下所示：MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5有机物+2，4-D 0.05mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g//L，pH 5.8。
6、愈伤组织的分化
愈伤组织经继代(一个月继代一次)几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基上(配方：MS基本培养基+B5有机物+激动素(KT)0.15mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L，调pH至5.8)，进一步分化成胚状体。
7、胚性愈伤组织的继代
胚性愈伤组织的继代培养基如下所示：
MS无机盐(其中硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5有机物+KT0.15mg/L+IBA0.5mg/L+Gln(谷胺酰胺)1.0mg/L+天冬酰胺(Asn)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，pH 5.8。
8、成苗生根培养
将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长培养基上(配方：1/2MS无机盐+B5有机物+葡萄糖15g/L+phytagel 2.5g/L，pH 5.8)。
9、炼苗移栽
将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一周左右移栽温室。
附：MS培养基母液配制：
1.配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解再逐一加到容量瓶中(最后加入CaCl2否则容易产生沉淀)，定容到一升。
2.配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液(浓缩10000倍)，再稀释成二级母液(浓缩100倍)，母液配制完毕后放置于室温(20-25℃，以下相同)下10h以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。
3.配制铁盐时，两种盐用热水分别溶解，然后混合，放置于室温下10h以上看是否有沉淀产生，然后才能使用。
4.各种生长激素一般可以用1mol/L的NaOH或HCl溶解后，再定容。
5.配制B5有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用完以防污染
6.各种母液配制好后应存放在4℃冰箱中，发现有沉淀后，不得使用。
大量元素(20倍)母液(g/L)
KNO3 38；
NH3NO3 33；
MgSO4·7H2O(无水MgSO4) 7.4(3.8)；
KH2PO4 3.4；
CaCl2·2H2O(无水CaCl2) 8.8(6.6)。
微量元素(100倍)母液(g/L)
CoCl2·6H2O 0.0025；
CuSO4·5H2O 0.0025；
H3BO3 0.62；
KI 0.083；
MnSO4·4H2O 2.23；
NaMO4·2H2O 0.025；
ZnSO4·7H2O 0.86。
铁盐(100倍)母液(g/L)
FeSO4·7H2O 2.78；
Na2EDTA 3.73。
B5有机物
VB1(硫胺素) 10mg/L；
VB5(盐酸吡哆醇) 1mg/L；
VB6(烟酸) 1mg/L；
肌醇 100mg/L；
甘氨酸 2mg/L。
实施例4：pHellsgate4-GhSSN转基因株系相关分析
1、pHellsgate4-GhSSN转基因株系表型分析
在将pHellsgate4-GhSSN载体导入棉花后得到45个转基因植株，能够存活并实现正常结实的共有3个家系。大量获得的转基因棉花幼苗在无菌条件下从茎部产生病斑，并导致转基因苗死亡，而同期的p35s-GhSSN载体转化得到的超量表达转基因棉花幼苗及本研究组其他转基因棉花幼苗均未有此现象，因此该基因被命名为GhSSN(Silencing-induced Stem Necrosis，SSN)(图6)。
2、pHellsgate4-GhSSN转基因株系拷贝数分析
采用Southern blotting对转pHellsgate4-GhSSN载体的转基因棉花3个生长相对正常的植株进行拷贝数分析(DNA提取和Southern实验参照J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)，实验结果表明3个家系有着不同的插入位点(图7)。
3、pHellsgate4-GhSSN转基因株系基因表达分析
对转基因棉花植株分单株提取根的RNA，利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，以GhSSNRt-F(5′CTTGGGTTACAACTATGCCATGT 3′)和GhSSNRt-R(5′ATTGAGCCTTCTATTTCCGAGAC3′)引物进行Real-time PCR，PCR反应条件为：95℃预变性30sec；95℃5sec，58℃35sec，40个循环，对转pHellsgate4-GhSSN载体的转基因棉花进行GhSSN的表达量分析。表达分析显示出现类病斑的转基因棉花幼苗中GhSSN基因的表达相对野生型均明显下降(图8)。通过以上分析，说明转基因棉花幼苗茎部的病斑与GhSSN表达量降低相关联，而不是因为转基因插入突变引起的。
4、pHellsgate4-GhSSN转基因株系影响茉莉酸合成的分析
利用本实施例中4所合成的GhSSNRt-F(5′CTTGGGTTACAACTATGCCATGT 3′)和GhSSNRt-R(5′ATTGAGCCTTCTATTTCCGAGAC 3′)，利用Real-time PCR的方法鉴定表明，GhSSN的RNAi抑制表达转基因棉花幼苗中参与茉莉酸合成的基因表达相对野生型均明显上升。茉莉酸活性形式JAIle含量测定表明GhSSN的RNAi抑制表达转基因棉花体内JAIle含量较野生型明显增多(图9)，这与参与茉莉酸合成相关基因的表达增强相一致。
5、pHellsgate4-GhSSN转基因株系对棉花黄萎病抗病性变化的分析
参考Fradin等的植物黄萎病抗性鉴定方法(Fradin et al.，2009Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Vel.Plant Physiol 150，320-332)，利用黄萎病菌‘V991’分别接种GhSSN基因RNAi抑制表达转基因棉花以及野生型对照‘YZ-1’，结果发现GhSSN RNAi抑制表达转基因棉花对黄萎病菌的抗性比野生型‘YZ-1’明显提高(图10)。
<110> 华中农业大学
<120> 一种棉花细胞色素P450基因及其应用
<130> 一种棉花细胞色素P450基因及其应用
<141> 2012-03-21
<160> 3
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1627
<212> cDNA
<213> 棉花（Gossypium hirsutum）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1627)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (29)..(1597)
<223>
<400>
atctctacac tttcttaaca cagcagtgat ggatcttctt gatttctcca cttttggtta 60
tgcagtagtg ttaggcatca cgctactgtt tttgtacacc aaactcaaga agtctagctc 120
aggaagtagc agcaaagctg cacccgtagc agccggtgca tggccaataa tcggtcacct 180
tccgctgtta ggcggaccca agacccctca tgaaacattg ggagacttag gtgagaaata 240
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ggctgcgaaa aaggatggct caagtaaggt gttggttgag atgaagaaac acttttcaga 600
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gcagccggtg catggccaat aatcggtcac cttccgctgt taggcggacc caagacccct 180
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catatactca aaaaggctca agaagaatta gacacctata taggcaggga taggtttgtg 1080
aatgagacag acatcggcaa attagtgtac atccaagcca tagttaaaga gacattaaga 1140
atgtatccac ctgcaccttt gtcagcacct cgtgagctca gtgaaagttg ttctattgga 1200
ggctatgaca tccccaaagg cacccgactg atcataaacc ttcataagat ccaaagggat 1260
cctaaaaaat ggccagaacc atcagagttt aagcccgaga ggtttctcac aacccacaaa 1320
gatgtggatg ttaggggcca gcattttgaa ctgatgcctt ttggcagtgg taggaggagt 1380
tgtcctggaa catcgtttgc actccatatg ctatacttga ccatgtctaa tttcttgcac 1440
gcctttgatt tctcaacacc atccaatggt ttgattgact tgactggcac agttggattg 1500
accaacatta aatctacccc gcttgaagca ttggtctcac ctcgccttgc tcctgagctc 1560
tataactaa 1569
<210> 3
<211> 522
<212> PRT
<213> 棉花（Gossypium hirsutum）
MDLLDFSTFG YAVVLGITLL FLYTKLKKSS SGSSSKAAPV AAGAWPIIGH LPLLGGPKTP 60
HETLGDLGEK YGPAYMIRIG VHPALVVNSS EVAKEIFTVN DMYVSSRSEF AAAEHLGYNY 120
AMFGFSPYGQ YWREMRKITM LEVLSNHRID QLKKVFVSEI EGSMKLLYKT WAAKKDGSSK 180
VLVEMKKHFS DLTLNVIMRT VAGKRYSVVA EEDQKEVLRY RKALRDFFHL TGMFVLGDAV 240
PFLRWLDIGG YEKWMKKTAK ELDEISGGWL DDHRKGGRWD ENKKEKDFMD VMNSVLKGAS 300
LAGYDADTIN KATSLNMILA GSDTTTVTLI WGLSLMLNKP HILKKAQEEL DTYIGRDRFV 360
NETDIGKLVY IQAIVKETLR MYPPAPLSAP RELSESCSIG GYDIPKGTRL IINLHKIQRD 420
PKKWPEPSEF KPERFLTTHK DVDVRGQHFE LMPFGSGRRS CPGTSFALHM LYLTMSNFLH 480
AFDFSTPSNG LIDLTGTVGL TNIKSTPLEA LVSPRLAPEL YN 522
Claims (6)
1.一种分离的棉花细胞色素氧化酶基因，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸。
2.一种分离的棉花细胞色素氧化酶基因，其序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸。
3.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
4.含有权利要求1或2所述的核苷酸的载体p35s-GhSSN。
5.含有权利要求1或2所述的核苷酸的载体pHellsgate4 –GhSSN。
6.权利要求1或2所述的一种棉花细胞色素氧化酶基因在控制棉花抗黄萎病中的应用。
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