CN108588041A

CN108588041A - 海岛棉细胞色素p450基因、其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN108588041A
Application number: CN201810398404.9A
Authority: CN
Inventors: 赵君; 徐剑文; 肖松华; 刘剑光
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2018-04-27
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2038-04-27
Also published as: CN108588041B

Abstract

本发明公开了一种海岛棉细胞色素P450基因、其编码蛋白和应用，该基因由1542个碱基组成，自5’端第1位碱基为转录起始位点，至第1542位碱基为转录终止位点，该基因是一个全新的能赋予植物黄萎病抗性的基因，可以丰富抗病基因资源，为棉花抗黄萎病育种提供有效的新工具。

Description

海岛棉细胞色素P450基因、其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及海岛棉细胞色素P450基因、其编码蛋白和在植物抗黄萎病中的应用。

背景技术

棉花是重要的经济作物之一，棉纤维是主要的纺织工业原料。随着可耕地面积的减少和环境的恶化，棉花生产受到多种生物和非生物因子的影响，尤其是枯、黄萎病的频繁发生给我国棉花生产造成重大损失。通过传统的育种方法已经很难满足现代农业需求，所以通过基因工程的方法来改良现有品种将是今后育种的主要方法。前人研究结果显示，棉花黄萎病的抗性机制涉及到多种信号通路和物质。在已经获得的研究结果表明，萜醛类化合物和苯丙素类化合物参与棉花对黄萎病的抗性过程。已经获得的结果显示，至少活性氧、水杨酸、茉莉酸、乙烯、油菜素内酯，精胺和Camalexin(Johansson et al.，2006；Gao etal.，2013；Mo et al.，2015，2016)等信号途径参与棉花对黄萎病的抗性过程。为探究棉花对黄萎病的抗病机制，许多研究者克隆了大量与植物抗黄萎病相关的基因。其中番茄中的Ve1基因是目前克隆的最著名的抗黄萎病基因(Kawchuk et al.，2001；Fradin et al.，2011)，但是研究显示该基因对棉花的黄萎病没有抗性，这表明棉花对黄萎病的抗病机制与番茄存在较大差别(刘琳琳等，2014)。棉花中也克隆了一些Ve相关基因，转基因棉花对黄萎病表现出不同程度的抗性，但是其抗病机制的深入发掘还没有相关报道(Zhang et al.，2011；Zhang et al.，2012)。除了Ve基因，研究者还从棉花基因组中克隆了大量其它与抗黄萎病相关的基因，包括GbCAD1、GbSSI2(Gao et al.，2013)、GbRLK(Zhao et al.，2015)、GbSTK(Zhang et al.，2013)、GbTLP1(Munis et al.，2010)、GbERF1-like(Guo et al.，2016)、GhPAO(Mo et al.，2015)、GhSAMDC(Mo et al.，2016)和Gbvdr5(Yang et al.，2015)等。同时，部分研究者还证明一些外源基因也能提高棉花对黄萎病的抗性，如GAFPs(Wanget al.，2015)、Hpal_Xoo(Miao et al.，2010)、NaD1(Gaspar et al.，2014)、p35(Tian etal.，2010)、和Hcm1(Zhang et al.，2016)。上述研究还处于试验阶段，仅仅得到了对黄萎病有抗性的工程植株，但还没有通过转基因方法培育出抗性品种的报道，其在生产上的可利用性有待进一步深入探究。

CYP450是一类在微生物、植物和动物中广泛存在的蛋白家族。这些蛋白具有单加氧酶活性，能够催化多种不同的反应，但它催化作用的主要机理是：将氧气分子中的一个氧原子插入底物中，将另一个氧原子还原成水分子(Werck-Reichhart，Feyereisen，2000)。CYP450蛋白是植物中最大的蛋白家族之一，仅在拟南芥中就有272个CYP450基因家族成员，它们参与了多种物质的合成，不仅包括木质素、木栓质、角质等大分子物质，还包括激素和信号分子等小分子物质(Werck-Reichhart et al.，2002)。但由于数量众多，大部分CYP450蛋白的功能仍未被揭示。部分CYP450基因在植物的抗病性中具有重要作用，其抗病作用被陆续报道。如AtCYP76C2能够提高拟南芥对核盘菌的抗性(陈晓婷等，2011)，OsCYP71Z2能够提高水稻对白叶枯的抗性(Li et al.，2013)。近年来，有研究证明一些CYP450基因在植物黄萎病抗性中也具有重要作用。如野生茄子StoCYP77A2基因能够提高烟草对黄萎病菌的抗性(Yang et al.，2015)；棉花GhCYP82D蛋白编码基因SSN(SILENCE-INDUCED STEMNECROSIS)通过十八碳脂肪酸途径调节系统性细胞死亡，其沉默表达能够提高棉花对黄萎病菌的抗性，而过量表达株系的抗病性降低(Sun et al.，2014)。木质素合成途径在植物黄萎病抗性中起到重要作用，一些CYP450蛋白是该途径中关键的催化酶，如AtCYP73A5具有肉桂酸-4-羧化酶(Cinnamate 4-hydroxylase，C4H)功能，AtCYP98A3具有对香豆酰基莽草酸3’羧化酶(p-coumaroyl shikimate 3’hydroxylase，C3’H)功能(Fraser，Chapple，2011)。在抗黄萎病棉花品种中，C4H和C3’H编码基因的表达量显著高于感病品种(Xu et al.，2011)。

CYP450基因家族中，已有部分CYP72亚家族成员被报道参与植物对病原菌的响应及抗性。水稻中的CYP72A基因簇中，7个CYP72A基因的表达受到稻瘟病菌侵染的诱导(Yaling et al.，2004)。拟南芥中的CYP72A14的表达受到灰葡萄孢菌和马铃薯晚疫病菌的诱导，而它在陆地棉中的同源基因的EST序列(TC145315)也被检测到受黄萎病菌侵染的诱导(Xu et al.，2014)。皱叶烟草中NpCYP72A2基因能够提高烟草对假单胞菌的抗性(Smigocki，Wilson，2004)。但这些CYP72A基因的分子功能和作用机制尚且未知。

发明内容

本发明的目的在于提供一个海岛棉细胞色素P450基因(GbCYP450)，所述基因能显著提高棉花对黄萎病抗性。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一个海岛棉细胞色素P450基因(GbCYP450)，其DNA分子是如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或能够与序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述海岛棉细胞色素P450基因(GbCYP450)来自于海岛棉海7124，位于棉花染色体组的D4染色体。

上述海岛棉细胞色素P450基因(GbCYP450)编码的蛋白质，它是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

其中，序列中的SEQ ID NO.1由1542个碱基组成，自5’端第1位碱基为转录起始位点，至第1542位碱基为转录终止位点，完整编码框为1542个碱基，编码513个氨基酸，分子量为127KD，等电点为5.0。该蛋白具有1个跨膜结构域，1个P450区域。

以海岛棉品种H7124的DNA为模板，扩增获得细胞色素P450基因(GbCYP450)的基因组序列，然后提取海岛棉品种H7124接种黄萎病菌后不同时期的根部组织RNA，反转录获得cDNA为模板，使用F：ATGGATTCAACAGCAAAGC，R：CTATAAAGGATGAAGCATTAC引物对，扩增获得海岛棉海7124的细胞色素P450基因(GbCYP450)序列。

本发明的一个重要目的就是提供一种海岛棉细胞色素P450基因(GbCYP450)、其表达载体或者宿主细胞在获得具有抗黄萎病的转基因植株中的应用。其中，最主要的作用是在棉花抗黄萎病育种过程中的作用。

本发明涉及的细胞色素P450基因(GbCYP450)，受棉花黄萎病菌菌株Bp2的诱导后表达量显著升高，将细胞色素P450基因(GbCYP450)沉默，海岛棉海7124和导入系苏VR025对棉花黄萎病菌株Bp2的抗性显著降低，构建细胞色素P450基因(GbCYP450)的过表达载体，转化拟南芥，转基因拟南芥对黄萎病菌株Bp2和V991的抗性显著提高。可以利用本发明基因构建各种植物表达载体，可以提高黄萎病相关寄主植物的抗病性状或利用本发明基因改良棉花对黄萎病的抗性。

含有上述基因的表达载体、重组载体、重组菌株或转基因细胞系，都在本发明的保护范围。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以提高黄萎病相关寄主植物的抗病性。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白以及可以合成在功能上与细胞色素P450基因(GbCYP450)相同或类似的核苷酸序列和蛋白。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。

包含本发明所提供的非核糖体肽合成酶可以通过缺失、插入或失活来自于相同或不同的非核糖体肽合成酶系统的一个或多个非核糖体肽合成酶结构域、模块或基因而产生新的聚肽化合物。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用来构建非核糖体肽合成酶库或非核糖体肽合成酶衍生库或组合库。

本基因还可用在基因工程、蛋白表达、酶催化反应等方面，也可用于寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物或基因以扩大细胞色素P450基因(GbCYP450)的来源范围，具有较高的应用前景。

本发明具有如下优点：

(1)本发明获得细胞色素P450基因(GbCYP450)是一个全新的能赋予植物对黄萎病抗性的基因，该基因在植物中的功能还没有报道。在不同抗、感棉花品种中，该基因的编码区和接菌后表达模式存在显著差异，将细胞色素P450基因(GbCYP450)构建过表达载体，导入拟南芥，转基因拟南芥抗病性显著提高。因此，细胞色素P450基因(GbCYP450)基因的克隆可以丰富抗病基因资源，为棉花抗黄萎病育种提供有效的新工具。

(2)本发明获得的细胞色素P450基因(GbCYP450)可以进一步解析棉花抗黄萎病的分子机制。细胞色素P450基因(GbCYP450)是否参与抗病相关的信号途径，其上游和下游基因分别是什么，与其互作的蛋白是什么，所以通过对该基因做进一步研究，可以在理论上扩展棉花抗黄萎病机制的认识。

附图说明

图1是本发明涉及的细胞色素P450基因(GbCYP450)在不同棉种接种黄萎病菌后的表达模式，**：P＜0.01。

图2是利用VIGS沉默海岛棉H7124和陆地棉导入系苏VR025中细胞色素P450基因(GbCYP450)，对黄萎病的抗性显著降低。A：注射空载体阴性对照pTRV2：00、阳性对照pTRV2-GbCLA1和没注射的棉花植株14天后的表型观察；B：注射空载体阴性对照pTRV2：00和阳性对照pTRV2-GbCLA1后14天叶片表型观察；C和D：注射pTRV2：00和pTRV2-GbCYP450后苏VR025和H7124幼苗对黄萎病菌的抗性分析；E：RT-PCR验证注射pTRV2：00和pTRV2-GbCYP450后棉花幼苗中GbCYP450基因的表达情况；F：接种黄萎病菌21天后棉花幼苗的病级指数统计；标准差计算为3次重复，每次20棵幼苗所得，**：P＜0.01。

图3是过表达GbCYP450基因的拟南芥后代分子检测。A：转基因拟南芥目标基因特异引物、卡纳霉素抗性基因NPTII的PCR检测；B：转基因拟南芥目标基因表达分析；

图4是转GbCYP450基因拟南芥对黄萎病的抗性显著提高。A：转基因拟南芥模拟接种表型；B和C：转基因拟南芥分别接种黄萎病菌V991和Bp2后21天表型；D和E：转基因拟南芥接种黄萎病菌V991和Bp2后21天病指和发病率统计，*：P＜0.05，**：P＜0.01。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

1.试验材料

本实验所用的陆地棉苏棉8号以及海岛棉品种H7124由江苏省农业科学院引进，多年严格自交繁殖保纯。本发明所述的陆地棉导入系苏研VR025是本研究室经过多年选育的一个抗病材料(该材料在公开号为CN 105713976 A的发明专利，发明名称为“能提高陆地棉黄萎病抗性的海岛棉染色体片段及分子标记”中公开)，是一个以陆地棉苏棉8号为背景，携带海岛棉海7124染色体片段，经过2年病圃及温室抗病鉴定，其对黄萎病的抗性显著高于陆地棉苏棉8号。拟南芥品种为哥伦比亚型，易感黄萎病。本发明所使用的材料均能从市场上购买或者按照现有技术公开的方法获得，本实验所用方法如无特殊说明，都为常规方法。所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2.试验方法

2.1细胞色素P450基因(GbCYP450)的获得

利用分布在棉花26条染色体上的3100对SSR引物，对苏棉8号和苏VR025进行全基因组扫描，筛选到多态标记NAU3392，NAU6992，NAU6993，NAU3791，cgr6409，JESPR220，NAU5294，NAU7290，ZHX1，ZHX6，ZHX29(该引物在公开号为CN 105713976 A的发明专利，发明名称为“能提高陆地棉黄萎病抗性的海岛棉染色体片段及分子标记”中公开)。利用已经公布的棉花D基因组序列和引物序列，将该导入片段锚定在D4染色体上。根据棉花二倍体D基因组雷蒙德氏棉的基因组数据库，提取目标区段序列，开发SSR标记。SSRs信息挖掘通过SSRlocator I程序包来完成。SSRs的查找标准为：二核苷酸重复次数≥9；三核苷酸重复次数≥6；四核苷酸重复次数≥5；五核苷酸重复次数≥4；六核苷酸重复次数≥3；复合型的SSR整体长度不小于24bp。SSRs标记的引物通过primer3程序设计完成。引物设计的主要参数为：引物长度18-20bp，最佳为20bp；PCR产物长度100-280bp；Tm值55-65℃，最适60℃；GC含量为45％-65％，最适50％。南京金斯瑞生物技术有限公司完成所有引物的合成。

利用包含1100个单株的F₂(苏VR025×苏棉8号)群体构建连锁群，同时在温室中对F2：3接种非落叶性Bp2黄萎病菌，利用复合区间作图法定位抗病基因或抗病QTL。抗病鉴定在3个不同环境中进行3次，在标记ZHX57-ZXH70之间都检测到QTL，平均解释表型变异为22.4％，LOD值在4.9-9.6之间(表1)。

表1利用复合区间作图法(CIM)在3次独立重复实验中检测到的与抗黄萎病相关的QTL

注：E1，E2和E3分别代表3个不同的环境。

根据棉花基因组测序结果，分析海岛棉品种新海21和陆地棉品种TM-1的目标区段序列，对目标区段包含的基因进行预测。结果显示，在标记ZHX57-ZXH70区段中，新海21共包含20个基因(表2)。为了缩小获选基因的范围，我们根据基因GO(Gene Ontology)富集结果和已有研究结果，选择4个基因进行接菌后的表达分析，分别是Cytochrome P450，Probablereceptor-like protein kinase，6-phosphogluconate decarboxylating 3和ZZ-typezinc finger-containing protein。以苏VR025、海7124和苏棉8号棉花三叶期幼苗为材料，接种黄萎病菌Bp2，处理时间为0h、24h、48h、96h和144h，同时，以水处理相同时期作为对照。取1μg总RNA，按照TAKARA反转录试剂盒说明书操作。合成第一链cDNA。将反转录产物稀释10倍后取1μL进行qRT-PCR。以1对专一性扩增真核生物组成型表达基因EF1α(GenBank登录号AF120093)的引物进行平行PCR反应作为内对照，其引物序列为F：AGACCACCAAGTACTACTGCAC，R：CCACCAATCTTGTACACATCC。实时荧光定量PCR利用ABIPrism7500型荧光定量PCR仪(ABI，USA)操作，方法为SYBR Green I染料方法。反应体系为20μl，cDNA，1μl；Primer F(10μM)，1μl；Primer R(10μM)，1μl；SYBR green I mix，10μl，补水至20μl。程序为：95℃，10min；95℃，10s，退火：58℃，20s；72℃，30s；40个Cycles；72℃，10min，最后运行溶解程序。△△△CT＝[(Ct_目的基因-Ct_内参基因)_{指定时间的处理}-(Ct_目的基因-Ct_内参基因)_0h]_V.D-[(Ct_目的基因-Ct_内参基因)_{指定时间的处理}-(Ct_目的基因-Ct_内参基因)_0h]_CK。其中检测Cytochrome P450基因表达使用的引物为F：TAGCACTTCACCATGACCCTC，R：ATCAGAACTTCAGGCATCACCC。结果显示，Cytochrome p450的表达在抗、感品种中存在显著差异。在苏VR025和海7124中，Cytochrome p450基因在接菌后24h即开始上调，在48h有下降，随后在96h表达量达到最大值。在苏棉8号中，该基因在48h开始上调，且上调倍数低于苏VR025和海7124(图1)。因此，我们推测该基因在棉花抗黄萎病过程中可能扮演关键角色，将其命名为GbCYP450。

表2新海21目标区段包含的基因信息

2.2细胞色素P450基因(GbCYP450)的序列分析

根据GbCYP450基因的基因组序列，设计特异引物，以海岛棉海7124的DNA为模板，扩增获得基因组序列。提取海岛棉海7124接种黄萎病菌的根部RNA，以反转录获得的cDNA为模板，扩增获得海岛棉海7124中的GbCYP450基因的开放读码框。结果显示，GbCYP450基因在海岛棉海7124基因组序列长度是3678bp。基因的ORF长度为1542bp(SEQ ID NO.1)。通过对海岛棉海7124中GbCYP450基因序列进一步分析发现，该基因编码513个氨基酸(SEQ IDNO.2)，分子量为127KD，等电点为5.0。该蛋白具有1个跨膜结构域，1个P450结构域。与拟南芥CYP450基因进行聚类分析表明该基因属于CYP72A亚组。

2.3细胞色素P450基因(GbCYP450)抗病性分析

在本发明中，我们使用下述两种方法分析GbCYP450基因对棉花黄萎病的抗性。

一是利用病毒介导的基因沉默方法，验证GbCYP450基因沉默后棉花对黄萎病的抗性。病毒介导的基因沉默所用到的载体分别是pTRV1和pTRV2，并且用棉花白化基因(GhCLA1)作为对照(王心宇等，2014)。以GbCYP450基因的3’端设计引物，扩增398bp的片段并亚克隆至pTRV2载体上。挑取阳性的pTRV1、pTRV2(阴性对照)和pTRV2：CLA1(阳性对照)以及含有GbCYP450基因的pTRV2质粒农杆菌GV3101单菌落，培养至菌液OD600为0.5左右。4,000rpm室温离心10分钟收集菌体细胞，以适当体积的重悬液(10mM MgCl2，10mM MES以及200μM已酰丁香酮)重悬至终浓度为2.0，室温下将重悬液置静置3h，将TRV1和TRV2的恢复液，按体积比为1∶1比例混匀。待棉花幼苗两片子叶完全展开后进行农杆菌的接种实验。采用叶片针筒注射法将菌液注射至子叶。分别利用pTRV1/pTRV2和pTRV1/pTRV2：CLA1作为沉默处理的阴性对照和阳性对照。待注射TRV：CLA1的棉花幼苗出现白化表型时(图2A，B)，检测沉默GbCYP450基因的棉花体内GbCYP450基因的表达情况，以棉花EF-1a作为内参基因(图2E)。同时，接种黄萎病菌，并调查沉默后棉花的抗病情况。结果显示，接种黄萎病菌28天后，沉默GbCYP450基因后的H7124和苏VR025植株病情指数达到41.7％和53.8％，显著高于没有注射(苏VR025，CK，20.3％；H7124，CK，11.7％)或注射空载体(苏VR025，pTRV2：00，21.7％；H7124，pTRV2：00，10.3％)的对照(图2C，D，F)。

二是利用转基因拟南芥验证GbCYP450基因对棉花黄萎病的抗性。构建GbCYP450基因的过表达载体，使用的植物表达载体为35S-pCAMBIA2301-NORs，设计携带XmaI和SacI酶切位点的引物，扩增回收目的片段，与pMD-19(sample)载体连接，转化Top10感受态，测序，获得序列正确的阳性克隆，酶切携带目的基因的克隆载体和植物表达载体，分别回收2.3kb和13kb的目的片段，使用T4连接酶连接，转化Top10感受态，获得阳性克隆，即为含有CaMV35S启动子和目的基因GbCYP450片段的重组载体，命名为pCAMBIA2301-35S-GbCYP450。利用冻融法将重组载体转化农杆菌GV3101，利用花浸染法转化拟南芥，种子混收。消毒后，在包含浓度为50mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选，获得阳性植株移栽到营养基质中生长。取叶片提取DNA和RNA，检测目标基因是否成功转入和表达。最终，通过PCR检测，共获得4株转GbCYP450基因的株系(图3A，B)。连续自交2代，获得纯合株系，选择4个株系(#1-2，#2-2，#4-1和#6-1)进行抗黄萎病鉴定。将在灭菌土中生长四周的拟南芥挖出，先在灭菌水中洗干净拟南芥根部携带的培养基质，然后将拟南芥的根部浸入黄萎病病菌的分生孢子悬浮液中，2分钟后将其移栽到灭菌的基质中。接水作为模拟对照，每接菌20株换新鲜的灭菌水和黄萎病菌。每个家系接种40株，接种后拟南芥环境温度保持在23-25℃，保持土壤湿度，以利于发病。

结果显示，转基因拟南芥能够显著提高对棉花黄萎病菌的抗性。接种黄萎病菌Bp2后的21天，转基因拟南芥株系#1-2，#2-2，#4-1和#6-1的病指分别为29.2％、25％、29.2％和33.3％，发病率为66.7％、83.3％、83.3％和83.3％，而非转基因对照的病指为58.3％，发病率为100％；接种黄萎病菌V991后的21天，转基因拟南芥株系#1-2，#2-2，#4-1和#6-1的病指分别为41.7％、45.8％、29.2％和50％，发病率为100％、83.3％、66.7％和83.3％，而非转基因对照的病指为91.7％，发病率为100％(图4)。以上结果表明GbCYP450基因能够赋予受体植物对黄萎病的抗性。

本发明所用黄萎病菌为BP2和V991，可以通过科研单位引种，通过以下方法培养，其培养方法为：25℃下，将大丽轮枝菌BP2涂布于固体土豆培养基(马铃薯200g、琼脂17g、蔗糖20g、蒸馏水1000ml)表面，两周后转移到液体土豆培养基(马铃薯200g、蔗糖20g、蒸馏水1000ml)中，室温下振荡培养5天，过滤培养的病菌溶液，利用血球计数板测病菌孢子浓度，将浓度稀释至5×10⁷个孢子/ml。

本发明黄萎病发病级数调查按照以下标准进行，0级：植株健康，无病叶，生长正常；1级：植株四分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；2级：植株四分之一以上，二分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；3级：植株二分之一以上，四分之三以下叶片发病，变黄萎蔫；4级：植株四分之三以上叶片发病，或植株枯死。根据调查的结果计算各株系的病情指数(DI)。

DI＝[Σ(Ni×i)/(N×4)]×100；i＝0～4.Ni＝plant number of reaction i

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 海岛棉细胞色素P450基因、其编码蛋白和应用

<130> 2018

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1542

<212> DNA

<213> Gossypium barbadense Linn.

<400> 1

atggattcaa cagcaaagct tttaatcttt ctggcaagtt ctttaacctt atttctactg 60

aaattccttc ataagtactg gtggatacct ttcaaaatac aaagagcact gagtttacaa 120

ggaatcaaag gacctccata tgagttcatc catggcaaca acaaagcctc cacccgtttc 180

agatacgaag ctttaagcaa acccatggct tccttaactc ataatatagt ccccagagtt 240

attcctcaga ttcattcatg gatcaacact tatgggaaga attatcttac gtgggagggg 300

aatcgagctc aactggtgat atccgaaccc gaattaatca aagagatact gaaaaccaac 360

gacggatctt ttccgaaaag gaaggatgat tcgagtatta ttcataagat cgtcggggaa 420

ggcctcgtga cctccgaagg tgcgaaatgg gcgaagcaaa ggaagttggc gaatcatgct 480

ttccatggag agagcttgaa aaatatgaat ccagcagtga ttgctagcgt tgagacgatg 540

ttggagaagt ggaaaggtcg agaaggcgaa gagatcgaag tgtttaacga gttcaggttg 600

ttgacttcgg aagttatatc gagaacggct ttcggtagta attacttgga agggaagaag 660

attttcgaca tgttgacgaa attggcgata ctagttagtc gaaattattt caaaactccg 720

attcctggca tcagcaagat atggaaaact gcggatgaaa tagaatcgga gaaacttgcc 780

aatggaattc atgattgtgt gatggaaatg gttaagagaa gggaaaagaa agtagagaca 840

ggagaatctg acggttttgg caatgatttt ctaggattac ttataaatgc ttatcgcgat 900

ttcgacgaga aaaatcgatt ttccatcgag gatctagtgg atgagtgcaa aacattctac 960

tttgccggtc aagaaacaac caactccttg cttgcgtgga cgatccttgt tttagcaatt 1020

catactaaat ggcaagaaaa aacaaggcaa gaggtgtttg aggtatttgg ggaccaaaat 1080

cctaattctg aaggcattgc caaattaaaa attatgaaca tggtcgtcaa tgaaaccttg 1140

agattgtatt ctcctgtagc tgccgtgatc cgaaagatca aaaaagaagt tcgattggga 1200

aagctcgttt tgcctgcaaa tctggagata ttgatcccaa tcatagcact tcaccatgac 1260

cctcaactat ggggagacga tgtacatctt ttcaaaccgg agagattcgt tgaaggcatc 1320

gctagtgcta ccaaatacaa ccctgcagca ttcattccct tttcgatggg acctcgatct 1380

tgcgttggca tgagctttgc aaccacagaa acaaaggttg ctctctcaat gattctccaa 1440

cgctacgcct ttactctctc cccgacctac gttcatgcgc catttcctgt aatcacgctt 1500

caaccacaac acggaattca agtaatgctt catcctttat ag 1542

<210> 2

<211> 513

<212> PRT

<213> Gossypium barbadense Linn.

<400> 2

Met Asp Ser Thr Ala Lys Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Ser Leu Thr

1 5 10 15

Leu Phe Leu Leu Lys Phe Leu His Lys Tyr Trp Trp Ile Pro Phe Lys

20 25 30

Ile Gln Arg Ala Leu Ser Leu Gln Gly Ile Lys Gly Pro Pro Tyr Glu

35 40 45

Phe Ile His Gly Asn Asn Lys Ala Ser Thr Arg Phe Arg Tyr Glu Ala

50 55 60

Leu Ser Lys Pro Met Ala Ser Leu Thr His Asn Ile Val Pro Arg Val

65 70 75 80

Ile Pro Gln Ile His Ser Trp Ile Asn Thr Tyr Gly Lys Asn Tyr Leu

85 90 95

Thr Trp Glu Gly Asn Arg Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu Pro Glu Leu

100 105 110

Ile Lys Glu Ile Leu Lys Thr Asn Asp Gly Ser Phe Pro Lys Arg Lys

115 120 125

Asp Asp Ser Ser Ile Ile His Lys Ile Val Gly Glu Gly Leu Val Thr

130 135 140

Ser Glu Gly Ala Lys Trp Ala Lys Gln Arg Lys Leu Ala Asn His Ala

145 150 155 160

Phe His Gly Glu Ser Leu Lys Asn Met Asn Pro Ala Val Ile Ala Ser

165 170 175

Val Glu Thr Met Leu Glu Lys Trp Lys Gly Arg Glu Gly Glu Glu Ile

180 185 190

Glu Val Phe Asn Glu Phe Arg Leu Leu Thr Ser Glu Val Ile Ser Arg

195 200 205

Thr Ala Phe Gly Ser Asn Tyr Leu Glu Gly Lys Lys Ile Phe Asp Met

210 215 220

Leu Thr Lys Leu Ala Ile Leu Val Ser Arg Asn Tyr Phe Lys Thr Pro

225 230 235 240

Ile Pro Gly Ile Ser Lys Ile Trp Lys Thr Ala Asp Glu Ile Glu Ser

245 250 255

Glu Lys Leu Ala Asn Gly Ile His Asp Cys Val Met Glu Met Val Lys

260 265 270

Arg Arg Glu Lys Lys Val Glu Thr Gly Glu Ser Asp Gly Phe Gly Asn

275 280 285

Asp Phe Leu Gly Leu Leu Ile Asn Ala Tyr Arg Asp Phe Asp Glu Lys

290 295 300

Asn Arg Phe Ser Ile Glu Asp Leu Val Asp Glu Cys Lys Thr Phe Tyr

305 310 315 320

Phe Ala Gly Gln Glu Thr Thr Asn Ser Leu Leu Ala Trp Thr Ile Leu

325 330 335

Val Leu Ala Ile His Thr Lys Trp Gln Glu Lys Thr Arg Gln Glu Val

340 345 350

Phe Glu Val Phe Gly Asp Gln Asn Pro Asn Ser Glu Gly Ile Ala Lys

355 360 365

Leu Lys Ile Met Asn Met Val Val Asn Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Ser

370 375 380

Pro Val Ala Ala Val Ile Arg Lys Ile Lys Lys Glu Val Arg Leu Gly

385 390 395 400

Lys Leu Val Leu Pro Ala Asn Leu Glu Ile Leu Ile Pro Ile Ile Ala

405 410 415

Leu His His Asp Pro Gln Leu Trp Gly Asp Asp Val His Leu Phe Lys

420 425 430

Pro Glu Arg Phe Val Glu Gly Ile Ala Ser Ala Thr Lys Tyr Asn Pro

435 440 445

Ala Ala Phe Ile Pro Phe Ser Met Gly Pro Arg Ser Cys Val Gly Met

450 455 460

Ser Phe Ala Thr Thr Glu Thr Lys Val Ala Leu Ser Met Ile Leu Gln

465 470 475 480

Arg Tyr Ala Phe Thr Leu Ser Pro Thr Tyr Val His Ala Pro Phe Pro

485 490 495

Val Ile Thr Leu Gln Pro Gln His Gly Ile Gln Val Met Leu His Pro

500 505 510

Leu

Claims

1.编码海岛棉细胞色素P450基因，其特征在于，其DNA分子是如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或能够与序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2.权利要求1所述海岛棉细胞色素P450基因编码的蛋白质，其特征在于，它是SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。

3.含有权利要求1所述基因的表达载体、重组载体、重组菌株或转基因细胞系。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.权利要求1或2所述的海岛棉细胞色素P450基因在获得具有抗黄萎病的转基因植株中的应用。

6.权利要求5所述的海岛棉细胞色素P450基因在棉花抗黄萎病育种过程中的作用。

7.权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的宿主细胞在转化植物获得具有抗黄萎病的转基因植株中的应用。