CN105886526B - 一种抑制细胞色素p450基因表达的载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体及其构建方法，以及，一种干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达的方法和获得除草剂显性敏感植物的方法。将RNAi植物表达载体转化水稻，能够成功抑制基因CYP81A6的表达，并将水稻从对除草剂具有抗性转变为敏感，从而培育了一种对除草剂显性敏感的水稻。使得敏感植株可以通过施用除草剂的方式被清除。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。

Description

一种抑制细胞色素P450基因表达的载体及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
农作物杂种优势利用是农业增产重要手段之一。水稻是全世界最重要的粮食作物之一，具有明显的杂种优势。中国是世界上首个成功实现杂交水稻商品化生产的国家，杂交水稻使我国水稻产量提高了20％，全国杂交水稻常年种植面积已超过水稻年播种面积的50％。“三系法”和“两系法”是目前杂交水稻制种的主要方法，但由于三系核质互作的基因型限制及两系的光温敏在特殊条件下的不稳定，杂交水稻产业的发展已受到制约。美国先锋公司的SPT技术利用转基因技术成功解决了杂交制种中的一系列问题，并于2012年在玉米中实现商业化应用，水稻杂交制种也极有可能利用类似SPT技术实现更新换代。同时，转基因技术在各种农作物领域的应用越来越广泛。然而转基因产品自诞生之日起产生的争议，至今仍甚嚣尘上。因此，转基因产品需要加以严格的控制和监管，防止转基因漂移污染其他品种甚至其他物种就显得尤为重要。
因此，需要建立一种能够定向清除杂交种子或转基因植株的机制。培育获得除草剂敏感的不育系是解决问题的有效手段之一。
苯达松(bentazon)是一种苯并噻二唑类除草剂，属杂环类选择性化学除草剂，多数阔叶类杂草和莎草科杂草对苯达松敏感，而包括水稻在内的禾本科和豆科植物则对其有较强的耐药性，苯达松具有广谱，高效，低毒的特性。因此，苯达松用于清除稻田的阔叶类杂草和莎草科杂草十分有效，而对水稻又十分安全(张集文(2010)水稻苯达松敏感突变研究进展.中国水稻科学24:551-558)。水稻对苯达松抗性由一个单隐性基因细胞色素P450(CYP81A6)控制，该基因位于水稻第3号染色体上，参与苯达松在植物体内的羟基化脱毒过程。苯达松敏感型突变体“Norin 8m”、“M8077S”、“嘉浙mB”、“GZ mlS”和“GZ m2S”等都是由于CYP81A6基因突变造成的。CYP81A6基因的突变，导致上述突变体无法在体内降解苯达松，从而导致喷施苯达松除草剂时，植物死亡。同时，该细胞色素P450也是磺酰脲类除草剂的作用靶标，包含CYP81A 6突变基因或苯达松敏感的植物，在喷施磺酰脲类除草剂时，也会导致死亡。
因此，有必要开发出一种能够有效的影响水稻细胞色素P450(CYP81A6)表达的技术手段，从而为杂交水稻制种、培育转基因新品种、防止转基因逃逸等方面提供有效管控方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够有效的影响水稻细胞色素P450(CYP81A6)表达的植物表达载体及其构建方法：
为达到以上目的，本发明提供了一种抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。
其中，SEQ ID No.1所示的DNA片段为基于CYP81A6的长度为471bp的正向DNA片段，SEQ ID No.3所示的DNA片段为基于CYP81A6的长度为471bp的与SEQ ID No.1所示的DNA片段反向互补的DNA片段。SEQ ID No.2为来自水稻Zinc finger基因的内含子序列(Riceintron)。
SEQ ID No.1至3所示的DNA片段按照从上游到下游的方向依次排列。该发夹表达盒可在转化的植物细胞中转录形成发卡式的二级结构，SEQ ID No.2所示的DNA片段形成发卡的“环”，SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”。
其中，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子。
其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV35S启动子或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。优选的，当启动子为水稻或玉米的Ubi启动子时，能够取得非常强的干扰CYP81A6基因表达的效果。
所述终止子包括：NOS终止子，Ubi终止子等在植物中可以终止基因转录的DNA序列。优选的，所述终止子为NOS终止子。
所述RNAi植物表达载体还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子，CAMV 35S启动子或Actin启动子，优选的，当启动子为CAMV 35S启动子时，能够取得良好的驱动选择标记基因在植物中超量表达的效果。所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子，优选为NOS终止子。
所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、荧光标记基因(如荧光蛋白基因)、抗生素标记基因(可供筛选的抗生素标记如潮霉素、庆大霉素、卡那霉素基因)、除草剂筛选标记基因(如抗草甘膦基因、抗双草醚基因等)或抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因等)。特别优选的，所述标记基因为潮霉素基因。
本发明所得到的RNAi植物表达载体pTCK303-P450i-3。
特别优选的，所述的RNAi植物表达载体，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
其中，所述植物为水稻，优选的，所述植物为转基因水稻株系。
值得注意的是，用于RNAi植物表达载体构建的中间载体和具有选择标记基因的RNAi表达载体，工程菌及包含P450i-3茎环结构的细胞、愈伤组织、转基因苗、种子等均属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种本发明所述的RNAi植物表达载体在干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达制备除草剂显性敏感植物中的应用。
本发明的RNAi植物表达载体可通过农杆菌介导遗传转化法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
优选的，所述应用包括将pTCK303-P450i-3导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织。所述愈伤组织可以为花药诱导的愈伤组织、成熟胚诱导的愈伤组织、幼胚诱导的愈伤组织、幼穗诱导的愈伤组织。
本发明的一个方面还提供了一种获得除草剂显性敏感植物的方法，包括将所述RNAi植物表达载体转化植物，干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达。
本发明利用RNAi技术，构建了一个针对水稻细胞色素P450(CYP81A6)的植物双元转基因载体。将该载体转化水稻，成功抑制了该基因的表达，并将水稻从对苯达松或磺酰脲类除草剂具有抗性转变为敏感，从而培育了一种对苯达松或磺酰脲类除草剂显性敏感的水稻。使得转基因植株可以通过施用除草剂的方式被清除。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有非常重要的应用价值。
附图说明
图1为转基因株系潮霉素抗性基因PCR检测电泳图；1，H2O；2，阴性对照(中花11非转基因植株)；3，阳性对照；4-20，转基因敏感株系；M，Marker。
图2为pTCK303-P450i-3转基因T0代三叶期幼苗对0.25g/L苯达松溶液敏感度测试。枯萎死亡的均为敏感株系。
图3为pTCK303-P450i-3转基因幼苗细胞色素P450基因CYP81A6的表达量。其中WT为中花11作为阴性对照，其余为转基因株系。
图4对比例1中苯达松敏感的P450i转基因株系T0代3-5叶期幼苗对10g/L以上浓度苯达松溶液敏感度测试。其中22、23、24、60为独立P450i转基因株系
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
菌株和质粒
作为骨架载体的植物双元转化载体pTCK303包含潮霉素抗性基因、玉米Ubi启动子及NOS终止子；pMD18-T克隆载体(Takara)。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为DH5α；农杆菌(Agrobacterim tumefacieus)菌株为EHA105。
实施例1农杆菌转化水稻及转基因植株鉴定
将pTCK303-P450i-3重组质粒导入农杆菌EHA105菌株，并转化粳稻中花11愈伤组织，经潮霉素抗性筛选，分化，生根获得再生转基因株系25株，通过PCR鉴定转基因植株中转入的潮霉素抗性基因，结果显示，PCR阳性植株20株(图1)，将阳性植株移栽至泥土中，成活17株。
实施例2水稻苯达松敏感与抗性转基因株系的获得
为了检测所设计干扰载体片段在转基因植株中的效果，用48％苯达松母液(常州精度生物科技有限公司)配制0.25g/L苯达松溶液，喷施pTCK303-P450i-3转基因T0代三叶期幼苗，按100ml/m2计算，喷施量为0.01-0.05g/m2，喷后连续观察。喷施后4d，P450i-3转基因T0代幼苗部分株系叶片叶尖卷曲枯黄；喷施后7d，P450i-3转基因17个株系中，有10个株系出现不可逆死亡，属于高度敏感株系；有3个株系之前叶片枯萎严重但逐渐恢复生长，属于中度敏感株系；还有4个株系喷施前后无明显变化，属于抗性株系(图2)。需要强调的是，虽然本实施例用0.25g/L苯达松喷施筛选苯达松敏感转基因株系，但筛选敏感株系并不限于0.25g/L，0.1g/L为本发明所应用的苯达松最低浓度。以上结果表明，我们成功获得了除草剂显性敏感的转基因材料。
实施例3细胞色素P450基因CYP81A6表达量的检测
为了进一步确定干扰载体片段所导致的除草剂显性敏感，是由于其对细胞色素P450基因CYP81A6的抑制造成的，我们检测了CYP81A6基因的表达量。分别取转基因敏感株系、中度敏感株系、抗性株系叶片各2个株系，以中花11作为阴性对照，提取总RNA，并进行反转录获得cDNA。在Thermo PikoReal96实时荧光定量PCR系统中，以Actin基因为内参，检测CYP81A6基因的表达。反应体系及程序如下：
RT-PCR引物序列：
荧光定量PCR反应体系及程序如下：
程序：94℃预变性7min，94℃变性15s，55℃退火15s；72℃延伸15s(荧光检测)；40个循环；60℃保温，30s。溶解曲线程序：60-95℃(每升高0.2℃，保持1s)；20℃保温，10s；结束。
程序：94℃预变性7min，94℃变性15s，55℃退火15s；72℃延伸15s(荧光检测)；40个循环。溶解曲线程序：60-95℃(每升高0.2℃，保持1s)；20℃保温，10s；结束。
荧光定量PCR扩增结果显示，目标基因和内参基因的熔解曲线峰均为单一峰形，形状锐利。提示各样品熔解温度均一，扩增产物特异性好，未见非特异的双链DNA产物或引物二聚体。扩增曲线光滑平稳，荧光吸收图谱的S形曲线形状完好，符合定量检测要求。采用比较阀值法(2-△△Ct法)进行相对定量(Liva K J,Schmittgen T D.Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and 2(-Delta Delta C(T))Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.)结果表明，转基因敏感株系中CYP81A6基因的表达剧烈下调，仅为野生型对照的6％-7％，说明P450i-3干扰片段对CYP81A6基因的表达有极强的抑制作用(图3，敏感株系7-2、敏感株系38-2代表不同的转基因株系)；中度敏感株系中CYP81A6基因的表达也显著下调，约为野生型对照的30％-41％左右，对CYP81A6基因的表达也起到显著的抑制作用(图3，中度敏感株系76-2、中度敏感株系80-2代表不同的转基因株系)；但抗性株系中，该基因表达并未呈现明显变化(图3、抗性株系6-2和抗性株系50-2代表不同的转基因株系)。CYP81A6基因在对照和各转基因敏感、中度敏感、抗性株系中的表达与这些株系对苯达松的敏感程度相吻合，表明转基因株系对苯达松的敏感的确是由于CYP81A6基因的表达下调造成的。以上结果表明，P450i-3干扰片段及pTCK303-P450i-3的植物双元转化载体可成功用于抑制细胞色素P450基因CYP81A6的表达，并培育除草剂显性敏感的材料。
实施例4敏感株系各生育期对苯达松的敏感度测试
为了检测显性敏感株系在不同生育期对苯达松的敏感程度，在不同生育期对其进行苯达松临界浓度测试。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系苗期(五叶期之前)喷施苯达松溶液0.01-0.2g/m2，喷施后连续观察，10d～15d后，敏感株系出现不可逆死亡，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系初分蘖期喷施苯达松溶液0.25-0.5g/m2，喷施后连续观察，10d～15d后，敏感株系出现不可逆死亡，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系最大分蘖期喷施苯达松溶液0.5-0.65g/m2，喷施后连续观察，10d～15d后，敏感株系出现不可逆死亡，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系孕穗期喷施苯达松溶液0.65-0.8g/m2，喷施后连续观察，10d～15d后，敏感株系出现不可逆死亡，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系苗抽穗期喷施苯达松溶液0.8-1.2g/m2，喷施后连续观察，10d～15d后，敏感株系出现不可逆死亡，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系开花后7d喷施苯达松溶液1.2-1.8g/m2，喷施后连续观察，10d～15d后，敏感株系出现不可逆死亡，但野生型却正常生长。
实施例5敏感株系各生育期对磺酰脲类除草剂的敏感度测试
为了检测显性敏感株系在不同生育期对磺酰脲类除草剂的敏感程度，我们在不同生育期对其进行磺酰脲类除草剂如苄嘧磺隆临界浓度测试。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系苗期(五叶期之前)喷施苄嘧磺隆溶液1-5mg/m2，喷施后连续观察，5d～10d后，敏感株系出现生长停滞，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系初分蘖期喷施磺苄嘧磺隆溶液5-15mg/m2，喷施后连续观察，5d～10d后，敏感株系出现生长停滞，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系最大分蘖期喷施苄嘧磺隆溶液15-20mg/m2，喷施后连续观察，5d～10d后，敏感株系出现生长停滞，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系孕穗期喷施苄嘧磺隆溶液20-35mg/m2，喷施后连续观察，5d～10d后，敏感株系出现生长停滞，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系抽穗期喷施苄嘧磺隆溶液35-40mg/m2，喷施后连续观察，5d～10d后，敏感株系出现生长停滞，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系开花后7d喷施苄嘧磺隆溶液40-50mg/m2，喷施后连续观察，5d～10d后，敏感株系出现生长停滞，但野生型却正常生长。
对比例1
按照Lin等先前报道的方法(Lin C,Fang J,Xu X,Zhao T,Cheng J,Tu J,Ye G,Shen Z(2008)A built-in strategy for containment of transgenic plants:creationof selectively terminable transgenic rice.PLoS One 3:e1818)构建发卡结构并利用中花11制备获得苯达松敏感的转基因株系。
对苯达松敏感的转基因株系分别喷施浓度为0.5g/L和1g/L的苯达松，结果发现没有任何一棵转基因株系被杀死。当对转基因株系喷施10g/L以上浓度苯达松时才有表型，且苯达松敏感的表型率较低，表明按照此方法设计的P450i对内源基因的干扰效率较低。苯达松敏感的P450i转基因株系T0代3-5叶期幼苗对10g/L以上浓度苯达松溶液敏感度测试结果见图4，图4中22、23、24和60代表不同的株系的编号。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体，其特征在于，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构；
所述的RNAi植物表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.权利要求1所述的RNAi植物表达载体在干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达以制备除草剂显性敏感植物中的应用。
3.一种获得除草剂显性敏感植物的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的RNAi植物表达载体转化植物，干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达。
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Oryza sativa Indica Group CCCH-type zinc finger protein (C3H12) gene, complete cds;Genbank登录号：JF99943.1;《Genbank数据库》;20120215;参见序列及相关信息 *
水稻细胞色素P450基因家族成员CYP81A6基因RNAi载体构建;田迪等;《分子植物育种》;20160229;第14卷(第2期);第370-373页，参见摘要及第372页左栏末段 *

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