JP7375028B2 - 植物病害に対する抵抗性の遺伝子 - Google Patents

Description

本発明は、ポリペプチドをコードする核酸分子に関し、該核酸分子は、該ポリペプチドが発現する植物、特にビータ・ウルガリス種（Beta vulgaris）の植物において、セルコスポラ病、特に真菌セルコスポラ・ベティコラ（Cercospora beticola）に対する抵抗性を与えることができ、また本発明は、本発明の核酸分子によりコードされる該ポリペプチドにも関する。具体的には、本発明の核酸分子は、該ポリペプチドによって与えられるセルコスポラ病に対する抵抗性効果が優性であることを特徴とする。さらに、本発明は、該核酸分子またはその一部分を、内在遺伝子として、編集遺伝子として、または導入遺伝子として含む、セルコスポラ抵抗性の植物、植物細胞、植物器官、植物組織、植物部分、または植物の種子もしくは子孫に関する。さらに、本発明は、ビータ・ウルガリス種の植物においてセルコスポラ病に対する抵抗性を増加させる方法、ならびにセルコスポラ抵抗性植物を製造する、または特定する、かつ可能であれば選択する方法も包含する。本発明は、病原体セルコスポラ・ベティコラによる侵襲を観察する方法、ならびに本発明の核酸分子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーも包含する。

発明の背景
セルコスポラ葉斑病は、世界各地で蔓延している最も重要なビータ・ウルガリス種の植物の葉の病害に数えられる。その原因は、真菌のセルコスポラ・ベティコラである。この病害に侵された植物は、典型的には、赤褐色の縁で囲まれた、中心が灰白色の、小さな比較的丸い葉斑（２～３ｍｍ）を形成する。侵襲が重度の場合、葉斑が互いに重なって、葉身全体が萎びてしまう。完全に形成した病斑の中には小さな黒点（偽子座）が見え、また高湿条件では主として葉の裏側に灰色のフェルト様の覆い（分生子を含む分生子担持体）が形成する。葉が重度に侵されると、最初に黄色に変色し、それから褐色になって枯れる。並行して新しい葉も生長するが、それらも罹病して枯れる。最初のうちは損傷の徴候は個々の植物で見られるだけだが、病害が拡がるにしたがって、しぶとい侵襲巣が発生しがちである。圃場全体へのさらなる拡散が雨風により起きる。

病原体セルコスポラ・ベティコラが最初に記述されたのは、１９世紀後半のイタリアだった。高湿の天候、早期の閉畝、過去の年からの高感染確率、または強度の灌漑から引き起こされ得る重度の侵襲は、４０％に上る作物の損失を招き得る。そうした損失は、ビート収穫の減少および糖分の減少によるものである。“Cercospora beticola Sacc. Biology, Agronomic Influence and Control Measures in Sugar Beet,” vol. 2 (M.J.C. Asher, B. Holtschulte, M.R. Molard, F. Rosso, G. Steinruecken, R. Beckers, eds.). International Institute for Beet Research, Brussels, Belgium, 215 pp.)の５～１６頁のHoltschulte (2000) “Cercospora beticola - worldwide distribution and incidence”を参照されたい。この病害に反撃するために、間作または殺菌剤がしばしば用いられる。殺菌剤によるセルコスポラ・ベティコラの化学的管理は、農家にコスト負担を負わせ、環境を汚染する。殺菌剤を繰り返し使えば、さらに、殺菌剤耐性セルコスポラ・ベティコラ株に対する選択圧も増す。それは持続可能な農業の実践に反するものである。

間接的な闘いは、葉が健康な栽培品種の選択、およびビートを少なくとも３年の輪作で栽培することにより行われる。とりわけ優れた侵襲管理が、耐性または抵抗性のある栽培品種の組み合わせにより実現され得る。２０００年以降、易罹病性の低いセルコスポラ耐性ビート栽培品種が市販されている（Steinruecken 1997, “Die Zuechtung von Cercospora-resistenten Zuckerrueben.”［セルコスポラ抵抗性テンサイの育種］, Vortraege fuer Pflanzenzuechtung ［植物育種に関する講義］, Volume 37, Lecture symposium, March 4-5, 1997, Kiel）。これらの栽培品種には、セルコスポラ・ベティコラに対する量的抵抗性が備わっている。これらの栽培品種の抵抗性は、いくつかの遺伝子に基づいていて、量的に受け継がれていくが、抵抗性を担う遺伝子の正確な数はわかっていない。Weiland and Koch (2004), Sugarbeet leaf spot disease (Cercospora beticola Sacc.), The Plant Journal, 5(3), 157-166を参照されたい。複雑な量的遺伝が、いくつかの量的形質座位（ＱＴＬ）解析により確認された。この方法は、多遺伝子の遺伝的な抵抗性のマッピングを可能にし、かつ宿主植物の遺伝子連鎖マップ上で遺伝子的抵抗性因子の数および位置を特定する信頼性の高い技法である。それによって、テンサイの各染色体上で複数の原因ＱＴＬを決定することができた。

該マッピングは、異なるセルコスポラ抵抗性ドナーを用いて実施され、観測されたＱＴＬ効果は、たいていはわずかなものだった。表現型の最高宣言値は５％であった。

継続研究では、差異的に発現させた多数の遺伝子が記述されている。Weltmeierらの研究（(2011) Transcript profiles in sugar beet genotypes uncover timing and strength of defense reactions to Cercospora beticola infection, Molecular plant-microbe interactions, 24(7), 758-772）では、マイクロアレイに基づく技術の助けを借りて、病原体感染時のテンサイのさまざまな遺伝子型（すなわち、セルコスポラ抵抗性、耐性、易罹病性、その他）に関するゲノム側の発現プロファイルを作成して、葉斑に関する発現プロファイルの転写の変化を分析した。著者らは、これらの分析を介して、試験したさまざまなテンサイ遺伝子型の病原体誘導性転写プロファイルを作り、そして可能な候補遺伝子を決定する立場にあった。ところが、そうした遺伝子はまだ詳細に特徴決定されていない。セルコスポラ抵抗性の遺伝子的および機能的な背景、ならびに抵抗性遺伝子の正体は、今に至るまでもっぱら不明である。

しかしながら、ＱＴＬの量的遺伝では、望ましいセルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性だけが植物内に導入されるのではなく、セルコスポラ抵抗性という正の特徴と連鎖して追加の遺伝子が受け継がれるため、むしろ、たとえば収量低下などの望ましくない特徴も導入されることが多い。この現象は、「リンケージドラッグ」という用語でも知られている。さらに、収量を低下させることなく複数の抵抗性座位を選択するために必要とされる厖大な育種の代価は、植物の生命力に負の作用を及ぼし得る。Weiland and Koch, 2004を参照されたい。

種苗企業がセルコスポラ耐性の栽培品種を販売するようになって１０年以上になる。そうした栽培品種の抵抗性は、複数の抵抗性遺伝子を介して効果少なく受け継がれる。しかしながら、そうした栽培品種のデメリットは、複雑な遺伝のせいで栽培品種の開発が非常に難儀かつ煩雑であること、そしてそのような栽培品種は侵襲の非存在下で正常な栽培品種と比べて著しく収量が低いことにある。このことはとりわけ、一部の抵抗性遺伝子と糖生産を担う遺伝子とのエピジェネティックな相互作用に関連があり得、それは病原体の非存在下で植物の健康状態の低下をもたらす。

たとえばＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ系、および遺伝子導入アプローチによる、遺伝子編集に基づく新しい育種技法の使用は、複雑な遺伝、および抵抗性発生に関与する遺伝子の豊富さ（その大多数がまだ特定も特徴決定もされていない）のせいで事実上不可能である。

抵抗性に打ち勝つセルコスポラ変種の危険に対抗することができる、セルコスポラ葉斑病に対する持続可能な育種のためには、継続して新しい抵抗性遺伝子を特定すること、そしてテンサイなどの栽培植物の遺伝子プールにそれらを組み込むことが必要である。具体的には、目的は、植物における発現後、セルコスポラ・ベティコラに対する非常に多大かつ優性な抵抗性効果を自らが既に生み出している、好適な抵抗性遺伝子の提供にある。本発明では、この目的は、請求項および明細書に特徴が記載される実施形態によって実現される。

発明の概要
本発明は、植物、特にビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリス（Beta vulgaris subsp. vulgaris）において、セルコスポラ病、特に真菌セルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性を与えることが可能な核酸分子に関する。該核酸分子によりコードされるポリペプチドは、したがって、該植物において産生される。該核酸分子の発現後に該ポリペプチドが産生される該核酸分子は、該植物において、セルコスポラ・ベティコラに対する非常に多大かつ優性な抵抗性効果を自らが既に生み出している。

さらに、本発明は、該核酸分子またはその一部分を含む、セルコスポラ抵抗性の植物、植物細胞、植物器官、植物組織、植物部分、植物の種子、植物の種子ストック、または植物の子孫に関する。該核酸は、たとえば内在的にまたは遺伝子導入的に含まれ得る。さらに、該核酸は、遺伝子移入（introgresson）として含まれ得る。任意選択により、本質的に生物学的なプロセスにより得られた植物およびそれらの構成要素は除外される。

ビータ・ウルガリス種の植物においてセルコスポラ病に対する抵抗性を増加させる方法、ならびにセルコスポラ抵抗性植物を製造する、または特定する、かつ可能であれば選択する方法も、同様に本発明に包含される。本発明は、病原体セルコスポラ・ベティコラの侵襲を観察する方法、ならびに本発明の核酸分子とハイブリダイズするプローブおよびプライマーとしてのオリゴヌクレオチドも包含する。

本発明はしたがって、以下のポイントに挙げられる、かつ実施例および図に例示される、実施形態に関する。

［１］ポリペプチドが発現する植物においてセルコスポラ病に対する抵抗性を与えることが可能な該ポリペプチドをコードする核酸分子であって、該核酸分子が、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２のＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１または配列番号５３からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）または（ｃ）によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および／または付加により、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）によるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号１または配列番号２のＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含み、
ここで該セルコスポラ病に対する抵抗性は、好ましくはセルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性であるか、または該植物は、好ましくは亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物であり、特に好ましくはテンサイであることを特徴とする、核酸分子。

［２］該ポリペプチドにより与えられるセルコスポラ病に対する抵抗性効果が、該植物において優性であり、好ましくは、ここで該ポリペプチドは、少なくとも１の格付けスコア、好ましくは２以上の格付けスコア、特に好ましくは少なくとも２の格付けスコア、特に好ましくは少なくとも３の格付けスコア、特に好ましくは少なくとも４の格付けスコアの抵抗性効果を与えることを特徴とする、［１］に記載の核酸分子。

［３］該核酸分子が、ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマ（Beta vulgaris subsp. maritima）に由来することを特徴とする、［１］または［２］に記載の核酸分子。

［４］［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子によりコードされる、ポリペプチド。

［５］［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子を含むベクターまたは発現カセットであって、該核酸分子は好ましくは該ベクターまたは該発現カセットに対し非相同である、ベクターまたは発現カセット。

［６］［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子、または［５］に記載のベクターもしくは発現カセットを含む細胞であって、該核酸分子または該発現カセットが好ましくは内在遺伝子または導入遺伝子として存在している、細胞。

［７］セルコスポラ抵抗性植物またはその一部分であって、該植物またはその一部分が、［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子を内在的にもしくは遺伝子導入的に、または［５］に記載のベクターもしくは発現カセットを含み、ここで該核酸分子を内在的に含む該植物は、ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマではないビータ・ウルガリス種の植物、またはビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物であることを特徴とする、セルコスポラ抵抗性植物またはその一部分。

［８］ハイブリッド植物であることを特徴とする、［７］に記載の植物。

［９］ゲノム内に該核酸分子がヘテロ接合的またはホモ接合的に存在していることを特徴とする、［７］または［８］に記載の植物。

［１０］［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子、または［５］に記載のベクターもしくは発現カセットを遺伝子導入的にまたは内在的に含む、［７］から［９］のうちの１つに記載の植物の種子または子孫。

［１１］植物においてセルコスポラ病に対する抵抗性を増加させる方法であって、
（ｉ）［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子、または［５］に記載のベクターもしくは発現カセットを、相同性指向性修復または相同組換えにより、好ましくは部位特異的ヌクレアーゼの補助により、植物の少なくとも１つの細胞のゲノムに組み込み、任意選択で、該少なくとも１つの植物細胞から植物を再生させるステップ；または
（ｉｉ）好ましくは、たとえば配列番号７のＤＮＡ配列を含むネイティブプロモーターの修飾により、または［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子を、たとえば特にセルコスポラ病感染後に配列番号７のＤＮＡ配列を含むネイティブプロモーターと比べてより高い活性レベルを有する非相同プロモーターと連結させることにより、該植物の少なくとも１つの細胞内で［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子の発現を増加させ、任意選択で、該少なくとも１つの植物細胞から植物を再生させるステップ；または
（ｉｉｉ）植物の少なくとも１つの細胞における［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子のヌクレオチド配列の修飾により、［４］に記載のポリペプチドの活性および／または安定性を増加させ、任意選択で、該少なくとも１つの植物細胞から植物を再生させるステップ；または
（ｉｖ）［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子、または［５］に記載のベクターもしくは発現カセットで植物細胞を形質転換し、任意選択で、該形質転換植物細胞から（遺伝子導入）植物を再生させるステップ
を含み、
該セルコスポラ病に対する抵抗性は、好ましくはセルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性であり、または該植物は、好ましくはビータ・ウルガリス種の植物、好ましくはビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスであり、特にテンサイである、方法。

［１２］［７］から［９］のうちの１つに記載のセルコスポラ抵抗性植物を製造する方法であって、
（ａ）［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子、または［５］に記載のベクターもしくは発現カセットで植物細胞を形質転換するステップ；および
（ｂ）該形質転換植物細胞から遺伝子導入植物を再生させるステップ；または
（ｉ）ビータ・ウルガリス種の植物の細胞に、部位特異的ヌクレアーゼおよび修復マトリックスを導入するステップであって、該部位特異的ヌクレアーゼは、該細胞のゲノムにおいて、好ましくは標的領域の上流および／または下流に、少なくとも１つのＤＮＡ二本鎖切断を生じさせることができ、該修復マトリックスは、［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子を含んでいるステップ；
（ｉｉ）相同性指向性修復または相同組換えを可能にする条件下で、（ｉ）の細胞を培養するステップであって、該核酸分子が、該修復マトリックスから該植物のゲノム内に取り込まれるステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で修飾された細胞から植物を再生させるステップ
を含む、方法。

［１３］該標的領域が、［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子の対立遺伝子多型を含み、ここで該対立遺伝子多型は、セルコスポラ病に対する抵抗性またはわずかな抵抗性を与えないポリペプチドをコードすることを特徴とする、［１２］に記載の方法。

［１４］該少なくとも１つの二本鎖切断が、該標的領域から多くとも１０，０００塩基対だけ上流および／または下流の位置、または［１３］で規定された対立遺伝子多型から多くとも１０，０００塩基対だけ離れた位置で生じることを特徴とする、［１２］または［１３］に記載の方法。

［１５］該核酸分子の該対立遺伝子多型が、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号５のＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号４のＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）または（ｃ）によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加により、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）によるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、［１２］または［１３］に記載の方法。

［１６］［１２］から［１５］のうちの１つに記載の方法により得られた、または得ることができる、植物またはその一部分。

［１７］セルコスポラ病に対して抵抗性のあるビータ・ウルガリス種の植物を特定し、任意選択で準備する方法であって、
（ｉ）該植物または該植物の一部分における、［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子の存在および／または発現、または［４］のポリペプチドの存在を検出するステップ；および／または
（ｉｉ）［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子のヌクレオチド配列における、または同時分離領域における、少なくとも１つのマーカー座位を検出するステップ；および
（ｉｉｉ）可能であれば、セルコスポラ・ベティコラ抵抗性植物を選択するステップ
のうちの少なくともステップ（ｉ）または（ｉｉ）を含むことを特徴とする、方法。

［１８］ポリペプチドが発現するビータ・ウルガリス種の植物においてセルコスポラ病に対する抵抗性を与えることが可能な該ポリペプチドをコードする核酸分子を特定する方法であって、
（ｉ）［４］に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と配列データベースのアミノ酸配列とを比較する、またはビータ・ウルガリス種の遺伝子型における［４］に記載のポリペプチドをコードする対立遺伝子多型を特定するステップ；
（ｉｉ）アミノ酸配列、またはアミノ酸配列をコードする対立遺伝子多型を特定するステップであって、該アミノ酸配列は［４］に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるステップ；
（ｉｉｉ）核酸分子、または特定されたアミノ酸配列をコードする対立遺伝子多型を、ビータ・ウルガリス種の植物に導入し、そして該植物において該核酸分子を発現させるステップ；および
（ｉｖ）セルコスポラ病に対する抵抗性を検出するステップ
を含むことを特徴とする、方法。

［１９］ビータ・ウルガリス種の植物を栽培する方法であって、
（ｉ）［７］から［９］のうちの１つに記載の植物を準備すること、［１２］から［１５］のうちの１つに記載の方法を用いてビータ・ウルガリス種の植物を製造すること、または［１７］に記載の方法を用いてビータ属の植物を特定しかつ選択すること、および
（ｉｉ）（ｉ）の植物またはその子孫を栽培すること、
を含み、
栽培された植物のセルコスポラ病侵襲に対抗する、方法。

［２０］少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０、好ましくは少なくとも２１、２２、２３、２４、または２５、特に好ましくは少なくとも３０、３５、４０、４５、または５０、特に好ましくは少なくとも１００、２００、３００、または５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、［１］から［３］のうちの１つで規定されたヌクレオチド配列とハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。

［２１］一対のオリゴヌクレオチド、好ましくは［２０］に記載のオリゴヌクレオチド、またはこれらのオリゴヌクレオチドを含むキットであって、ビータ・ウルガリスにおいて［４］に記載のポリペプチドにより与えられるセルコスポラ抵抗性または［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子との同時分離を有するビータ・ウルガリスのゲノム内の領域とのハイブリダイゼーションのフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして好適である、オリゴヌクレオチド。

［２２］亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスのセルコスポラ抵抗性植物の製造における、［１］から［３］のうちの１つに記載の核酸分子の使用。

［２３］［１］に記載の変異バージョン、および／または
（ａ）配列番号７
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の配列に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号７の配列と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列
から選択される核酸配列を含むプロモーターの変異バージョン
を含む生物を製造する方法であって、
（Ｉ）該核酸分子および／または該プロモーターを含む生物または細胞を準備するステップ；
（ＩＩ）該生物もしくは該細胞の変異率または該生物もしくは該細胞の変異誘発を増加させるステップ；
（ＩＩＩ）変異の結果としてセルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性の変化もしくは抵抗性レベルの変化を示す生物の表現型を選択する、または該核酸分子および／または該プロモーターに変異を含む生物もしくは細胞の遺伝子型を選択するステップであって、該変異はステップ（ＩＩ）により生じたものであるステップ；ならびに任意選択で
（ＩＶ）ステップ（ＩＩＩ）により得られた細胞から生物を再生させるステップ
を含む、方法。

［２４］該生物が植物である、［２３］に記載の方法。

［２５］該植物が、ビータ・ウルガリス、好ましくはビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリス、より好ましくはテンサイである、［２４］に記載の方法。

まず、本願で用いるいくつかの用語について、以下に詳細に説明する。

本発明の意味では、「格付けスコア」は、セルコスポラ侵襲に対する抵抗性の量的な査定と理解され、１～９のスケール（１＝強い抵抗性、９＝抵抗性なし）により表される。

セルコスポラ属には、さまざまな種、たとえばセルコスポラ・アラキディコラ（Cercospora arachidicola）、セルコスポラ・アリミニエンシス（Cercospora ariminiensis）、セルコスポラ・アスパラギ（Cercospora asparagi）、セルコスポラ・ベルトレアエ（Cercospora bertoreae）、セルコスポラ・ベティコラ、セルコスポラ・ビッツォゼリアナ（Cercospora bizzozeriana）、セルコスポラ・カネセンス（Cercospora canescens）、セルコスポラ・カロタエ（Cercospora carotae）、セルコスポラ・チェノポジイ（Cercospora chenopodii）、セルコスポラ・シスチネアルム（Cercospora cistinearum）、セルコスポラ・クラドスポリオイデス（Cercospora cladosporioides）、セルコスポラ・ディアズ（Cercospora diazu）、セルコスポラ・ドゥルカマラエ（Cercospora dulcamarae）、セルコスポラ・エリシミ（Cercospora erysimi）、セルコスポラ・ハイイ（Cercospora hayii）、セルコスポラ・キクチイ（Cercospora kikuchii）、セルコスポラ・マルバセアルム（Cercospora malvacearum）、セルコスポラ・マルビコラ（Cercospora malvicola）、セルコスポラ・メディカギニス（Cercospora medicaginis）、セルコスポラ・オリザエム（Cercospora oryzaem）、セルコスポラ・ペルソナタ（Cercospora personata）、セルコスポラ・プランタギニス（Cercospora plantaginis）、セルコスポラ・リシネラ（Cercospora ricinella）、セルコスポラ・セタリアエ（Cercospora setariae）、セルコスポラ・ウナムノイ（Cercospora unamunoi）、セルコスポラ・ヴィオラエ（Cercospora violae）またはセルコスポラ・ゼアエ－マイディス（Cercospora zeae-maydis）といった種が包含される。

ヌクレオチド配列の長さの記載に関し、「およそ」という用語は、＋／－２００塩基対の、好ましくは＋／－１００塩基対の、特に好ましくは＋／－５０塩基対の偏差を意味する。

「ビータ属の植物」は、アマランス科（アマランサケアエ（Amaranthaceae））に属する。これらの植物としては、ビータ・マクロカルパ（Beta macrocarpa）、ビータ・ウルガリス、ビータ・ロマトゴナ（Beta lomatogona）、ビータ・マクロリヒザ（Beta macrorhiza）、ビータ・コロリフロラ（Beta corolliflora）、ビータ・トリギナ（Beta trigyna）、およびビータ・ナナ（Beta nana）といった植物種が挙げられる。ビータ・ウルガリス種の植物は、具体的には、亜種のビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物である。たとえば、これらには、ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスｖａｒ．アルティッシマ（Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima）（狭義のテンサイ）、ビータ・ウルガリスｓｓｐ．ウルガリスｖａｒ．ウルガリス（Beta vulgaris ssp. vulgaris var. vulgaris）（フダンソウ）、ビータ・ウルガリスｓｓｐ．ウルガリスｖａｒ．コンディチヴァ（Beta vulgaris ssp. vulgaris var. conditiva）（ビートルート／レッドビート）、ビータ・ウルガリスｓｓｐ．ウルガリスｖａｒ．クラッサ／アルバ（Beta vulgaris ssp. vulgaris var. crassa/alba）（飼料ビート）がある。なお、本発明の核酸は、テンサイ、フダンソウ、ビートルート、または飼料ビートにおいて自然に生じるのではなく、人為的にこれらに導入され得るものである。

ヌクレオチド配列の「機能断片」は、その機能断片が由来する完全なヌクレオチド配列の機能性と同一の、またはそれに匹敵する機能性を有するヌクレオチド配列のセグメントを意味する。したがって、機能断片は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、または９９％の長さにわたり全ヌクレオチド配列と同一または相同であるヌクレオチド配列を有し得る。それはまた、９０～１００％の範囲を明示的に包含する。さらに、ヌクレオチド配列の「機能断片」はまた、たとえば転写後のまたは転写時の遺伝子サイレンシングの過程で、全ヌクレオチド配列の機能性を改変する、ヌクレオチド配列のセグメントを意味し得る。したがって、ヌクレオチド配列の機能断片は、全ヌクレオチド配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の、好ましくは少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、または１４０の、特に好ましくは少なくとも１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００の連続するヌクレオチドを含み得る。それはまた、２１～５０ヌクレオチドの範囲を明示的に包含する。

タンパク質の「機能部分」は、タンパク質のセグメント、または該タンパク質をコードするアミノ酸配列のセクションを意味し、該セグメントは、植物細胞において完全なタンパク質と同一の、または匹敵する機能性を発揮し得る。タンパク質の機能部分は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、または９９％の長さにわたり、該機能部分が由来するタンパク質と同一の、あるいは保存的および半保存的アミノ酸交換を考慮すれば類似の、アミノ酸配列を有する。

「非相同」という用語は、導入されるポリヌクレオチドが、同種または異種の、異なる遺伝的背景を有する細胞または生物に由来すること、あるいは原核生物または真核生物の宿主細胞と相同ではあるが、異なる遺伝的環境に置かれたため、自然に存在し得る対応するポリヌクレオチドとは異なることを意味する。非相同ポリヌクレオチドは、対応する内在遺伝子に加えて存在していてもよい。

本発明の意味では、「ホモログ」は、系統発生起源が同じタンパク質と理解され、「アナログ」は、同じ機能を発揮するが、異なる系統発生起源を有するタンパク質と理解され、「オーソログ」は、同じ機能を発揮する異種に由来するタンパク質と理解され、「パラログ」は、ある種において重複により現れたタンパク質と理解され、このコピーは、同じタンパク質機能を保持する、またはその発現鋳型を変えるが機能は変えない、またはそのタンパク質機能を変える、またはもとの遺伝子機能を両コピー間で分割する。

「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」は、一本鎖核酸分子が最大限相補的な核酸鎖に結合する、すなわちそれと塩基対を形成するプロセスと理解すべきである。ハイブリダイゼーションの標準的な方法は、たとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001に記載されている。それは好ましくは、核酸分子の塩基の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％、特に好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、最大限相補的な核酸鎖と塩基対を形成することと理解される。そのようなアニーリングの可能性は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーにかかっている。「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーション条件に関する。塩基対形成をより難しくする場合は高ストリンジェンシーが存在し、塩基対形成をより容易にする場合は低ストリンジェンシーが存在する。たとえば、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、塩濃度またはイオン強度および温度に左右される。一般に、ストリンジェンシーは、加温および／または塩含有率の低下により増加させることができる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションが主として相同核酸分子間でのみ生じる条件と理解すべきである。したがって「ハイブリダイゼーション条件」という用語は、実際の核酸の付加に通用する条件のみならず、後の洗浄ステップにも通用する条件に関する。たとえば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、主として、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸分子だけがハイブリダイズする条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、たとえば、４ｘＳＳＣ中６５℃でのハイブリダイゼーション、および後続の０．１ｘＳＳＣ中６５℃でのおよそ全１時間の反復洗浄である。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件下で実施される。

二本鎖ＤＮＡの形態の核酸に関連して、「相補的」ヌクレオチド配列は、第１のＤＮＡ鎖に相補的な第２のＤＮＡ鎖が、塩基対形成のルールにしたがい第１の鎖の塩基に対応するヌクレオチドを有することを意味する。相補配列は、好ましくは相手方配列と完全に相補的であり、したがって好ましくは同じ長さを有する。

「単離核酸分子」は、その自然のまたはもとの環境から抽出された核酸分子と理解される。この用語は、合成生産された核酸分子も包含する。「単離ポリペプチド」は、その自然のまたはもとの環境から抽出されたポリペプチドと理解される。この用語は、合成生産されたポリペプチドも包含する。

「分子マーカー」は、植物集団における多型の核酸であり、リファレンスまたは定位ポイントとして用いられる。組換え事象の検出用マーカーは、植物集団内の差異または多型の観察に適したものである。そのようなマーカーは、したがって、さまざまな同座対立遺伝子状態（アレル）を検出し、かつそれらを区別することができる。「分子マーカー」という用語はまた、ゲノム配列、たとえばプローブまたはプライマーとして用いられる核酸と、相補的である、または少なくともほぼ相補的である、または相同であるヌクレオチド配列に関する。こうしたＤＮＡレベルの差異が、マーカーとして見出されることになり、それらはたとえば、ポリヌクレオチド配列の差異、たとえばＳＳＲ（単純反復配列）、ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）、ＦＬＰ（断片長多型）またはＳＮＰ（一塩基多型）の差異である。マーカーは、ゲノム核酸または発現した核酸、たとえばスプライスＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＥＳＴに由来してもよく、また、プローブまたはプライマー対として用いられる核酸に関連してもよく、したがって、ＰＣＲベースの方法を用いる配列断片の増幅に適している。（ある集団の部分間の）遺伝的多型を表すマーカーを、従来技術の定着した方法を用いて検出してもよい（An Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, Griffiths, Miller, Suzuki, et al., 2000）。それにはたとえば、ＤＮＡシーケンシング、ＰＣＲベースの配列特異性増幅、ＲＦＬＰの検証、アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）によるポリヌクレオチド多型の検証、増幅させた植物ゲノム可変配列の検出、３ＳＲ（自家持続配列複製）の検出、ＳＳＲの検出、ＳＮＰの検出、ＲＦＬＰの検出、またはＡＦＬＰ（増幅断片長多型）の検出が含まれる。さらに、ＥＳＴ（発現配列タグ）およびＥＳＴ配列に由来するＳＳＲマーカーおよびＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ）を検出する方法も公知である。文脈によっては、本明細書における「マーカー」という用語は、特定のマーカー（たとえばＳＮＰ）が見つかり得る、ある種のゲノムの特定の染色体位置を意味することもある。

マーカーとしては、１つ以上の検出分子と接続され得る合成オリゴヌクレオチドも挙げられ、ここで検出分子は、検証方法の範囲内で、検出反応またはシグナル生成に用いられ得る。合成オリゴヌクレオチドとしては、標識プライマーも挙げられる。合成オリゴヌクレオチドおよび標識プライマーは、人工化合物であり、自然界では発生しないので、自然界から単離できない。そのような化合物の製造について、もっと後で説明する。

「プロモーター」は、典型的にはコード領域の上流の、翻訳されない制御ＤＮＡ配列であり、ＲＮＡポリメラーゼの結合点を含有し、ＤＮＡの転写を開始する。プロモーターは、遺伝子発現のレギュレーター遺伝子として作用する他のエレメント（たとえばｃｉｓ調節エレメント）を追加で含有する。「コアまたはミニマルプロモーター」は、転写開始に必要な基本エレメント（たとえばＴＡＴＡ ｂｏｘおよび／またはイニシエーター）を有するプロモーターである。

「病原体」は、植物と相互作用して、該植物の１つ以上の器官の病徴をもたらす生物を意味する。こうした病原体には、たとえば、動物、真菌性、細菌性、またはウイルス性の生物もしくは卵菌が含まれる。

「病原体感染」は、病原体が植物宿主組織と相互作用する最初の時点と理解すべきである。この意味で、「侵襲」は、病原体と宿主との接触の発生を意味する。宿主に病原体が、たとえば植物の葉面に菌類胞子が固着すると、該植物宿主細胞内で病原体検出およびシグナル中継の機構が始動する。セルコスポラ・ベティコラの場合、高温多湿の天候で分生子が形成し、それが雨風により近隣植物へと移動していく。新たな感染では、初めに、生理的に高齢である外側の葉に個々の葉斑が生じるのが常である。それらはたいてい褐色の輪によって健康な葉組織と明確に区切られる。拡大鏡の助けを借りれば、斑点の中央部に真菌の褐色の分生子担持体が観測できることもある（格付けスコア３）。こうした褐色の斑点の数はたちまち増え、初めは胞子嚢果が小さめの枯死部にも重なっている（格付けスコア５）。病害がさらに進むと内側の葉にも及び、ついに外側の葉が次々に枯死し始め（格付けスコア７）、やがて事実上すべての葉が枯れる（格付けスコア９）。病害の経過および症状の重度は、場所、および年々変動する天候条件に大きく左右される。

植物「器官」は、たとえば、葉、芽、茎、根、胚軸、枝芽、分裂組織、胚、葯、胚珠、種子、または果実を意味する。「植物部分」としては、限定ではないが、花粉の他、芽または主軸、葉、花、花房、根、果実、および種子が挙げられる。「植物部分」という用語は、複数の器官の集合、たとえば花もしくは種子、または器官の一部、たとえば植物の芽の断面も意味する。植物「組織」は、たとえば、カルス組織、貯蔵組織、分裂組織、葉組織、芽組織、根組織、植物腫瘍組織、または生殖組織、ならびに形成層、柔組織、維束管組織、厚膜組織、および表皮である。とはいえ、組織はこのリストに限定されない。たとえば、植物「細胞」は、たとえば細胞壁を有する単離細胞もしくはそれらの凝集体、または原形質体と理解される。

本発明に関連して、「制御配列」という用語は、特異性および／または発現強度に影響するヌクレオチド配列に関し、たとえば制御配列は所定の組織特異性を与える。そのような制御配列は、ミニマルプロモーターの転写開始点の上流に、しかしながらその下流にも、たとえば転写されるが翻訳はされないリーダー配列に、またはイントロン内に位置し得る。

「抵抗性」という用語は、広義に理解すべきであり、病害発生の遅延から完全ブロックまでの範囲の防護を意味する。重要な病原体の一例が、セルコスポラ・ベティコラである。本発明の抵抗性植物細胞または本発明の抵抗性植物は、好ましくはセルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性を獲得する。ある病原体に対する抵抗性は、同病原体がもたらす病害への抵抗性と同等に扱われ、たとえば、セルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性は、葉斑病に対する抵抗性でもある。たとえば、抵抗性の増加は、宿主植物における真菌生物量の低下により測定することができ、その場合、定量ＰＣＲの助けを借りて、真菌ＤＮＡを侵された植物組織中の植物ＤＮＡと比較して決定することができる。抵抗性の測定に追加される１つのアプローチは目視による格付けであり、１（易罹病性ではない）から９（易罹病性が非常に高い）までの格付けスコアが付与される。

「遺伝子導入植物」は、そのゲノムに少なくとも１つのポリヌクレオチドが組み込まれている植物に関する。したがってそれは非相同ポリヌクレオチドであり得る。このポリヌクレオチドは、好ましくは安定して組み込まれており、それはこの組み込まれたポリヌクレオチドが、該植物において安定して保存され、発現し、そして安定して子孫へと受け継がれる場合もあることを意味する。植物のゲノムへのポリヌクレオチドの安定導入は、その前の親世代の植物のゲノムへの組み込みも含み、該ポリヌクレオチドはその後も安定して受け継がれ得る。「非相同」という用語は、導入されるポリヌクレオチドが、同種または異種の、異なる遺伝的背景を有する細胞または生物に由来すること、あるいは原核生物または真核生物の宿主細胞と相同ではあるが、たとえば異なる遺伝的環境に置かれたため、自然に存在し得る対応するポリヌクレオチドとは異なることを意味する。非相同ポリヌクレオチドは、対応する内在遺伝子に加えて存在していてもよい。

「産業的製糖の原材料」は、テンサイからの糖分抽出に特化した製糖設備に供給され得る植物材料を意味する。そのような原材料は、典型的には、収穫したテンサイのビート本体（主根）である。抽出プロセスに確実に適合するよう、ビート本体は十分な質量、体積、および円錐形を有する必要があり、そうすれば原材料を機械的に裁断して細片化（ビート切片）することができる。これらのビート切片は、糖分抽出のための表面積を最大限にし、また、高効率に抽出できるようにナトリウム、カリウム、および窒素の含有率が低くなくてはならない。抽出後、残ったビートパルプを圧縮し、乾燥させ、動物の飼料として用いる。

「ショ糖濃度」は、根の生重量に対するパーセンテージとして表される。

「単胚」は、種子がきっかり１個体の植物に生長することを意味し、多胚種子（「シードボール」とも呼ばれる）は、複数の植物体に生長することを意味する。

「抽苔」は、自然の試みとして種子を生産し繁殖するために、テンサイが有花茎をつけることである。テンサイの抽苔を誘発するのは、たとえば越冬の寒さストレスである。しかしながら、このプロセスによりビートの糖含有率が低下するので、商用育成されるテンサイは抽苔前に収穫される。

「遺伝子移入」は、あるヌクレオチド配列が、ある植物のゲノム内に移行されていることを意味し、このヌクレオチド配列は、同種または同亜種に属さない植物に由来している。このことは、たとえば、亜種ビータ・ウルガリス・マリティマ（Beta vulgaris maritima）の植物に由来するヌクレオチド配列が、亜種ビータ・ウルガリス・ウルガリス（Beta vulgaris vulgaris）の植物内に移行されていることを意味し得る。

特許出願中の（pending）配列および図を参照しながら、本発明の設計（designs）および実施形態を、例として記載する。

抵抗性タンパク質（植物においてセルコスポラ抵抗性を与えるタンパク質）と感受性タンパク質（植物においてセルコスポラ抵抗性を与えないタンパク質）とのタンパク質配列アラインメントの図である。多型をグレーで強調している。 抵抗性タンパク質（植物においてセルコスポラ抵抗性を与えるタンパク質）と感受性タンパク質（植物においてセルコスポラ抵抗性を与えないタンパク質）とのタンパク質配列アラインメントの図である。多型をグレーで強調している。 ＬＲＲ領域を含むベクターｐＺＦＮ－ｎｐｔＩＩのベクターマップである。 抵抗性遺伝子の遺伝子導入の検証中、感染８日後に作成されたデータの統計学的箱ひげ図による評価である。 抵抗性遺伝子の遺伝子導入の検証中、感染１１日後に作成されたデータの統計学的箱ひげ図による評価である。 抵抗性遺伝子の遺伝子導入の検証中、感染８日後に作成されたデータの統計学的箱ひげ図による評価である。 抵抗性遺伝子の遺伝子導入の検証中、感染１５日後に作成されたデータの統計学的箱ひげ図による評価である。

発明の詳細な説明
本発明は、植物、特にビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスにおいてセルコスポラ病に対する抵抗性を与えることが可能な核酸分子に関し、該植物において該核酸分子によりコードされるポリペプチドが発現する。本発明の好ましい実施形態によると、病原体は真菌セルコスポラ・ベティコラであり、それはとりわけテンサイ、ビートルート、およびフダンソウの葉の病原体のなかで最も重要かつ破壊的なものに数えられ、４０％を超える作物損失をもたらし得る。この真菌は、二次的代謝物セルコスポリン（cercosporin）を産生し、それが光の存在下で酸素と反応することで、活性酸素種（ＲＯＳ）が形成する。ＲＯＳは侵された植物の葉組織に多大な細胞損傷をもたらし、それは壊死として目に見える。

本発明は、ドナーのビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマに由来する遺伝子の、または遺伝子座の、遺伝子ファインマッピング、特定、単離、および特徴決定に基づくものであり、植物、特にビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスにおけるその存在は、セルコスポラ葉斑病に関し植物の抵抗性と互いに関連があるか、または抵抗性の原因となる。当初の材料は、異なる起源に由来する３７のビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマ登録株から作られたビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマ集団であった。

本発明の核酸分子のヌクレオチドおよびアミノ酸コード配列は多数の多型を特徴とし、それが本発明により特定されるＮＰＳ－ＬＲＲ遺伝子を同遺伝子の「感受性」変異型、すなわちセルコスポラ病に対する抵抗性を与えない同遺伝子の変異型と区別している。多型の例を図１に示す。

本発明の核酸分子は、単離核酸分子であり得る。それは好ましくはＤＮＡであり、特に好ましくはｃＤＮＡ（コードＤＮＡ）である。本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドは、好ましくは、セルコスポラ葉斑病という植物病害の原因となる病原体セルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性を与える。さらに、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドは、特にビータ属の植物において、この病原体に対する抵抗性を与える。植物は、好ましくはビータ・ウルガリス種の植物、特に好ましくは亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物であり、たとえばテンサイ、ビートルート、飼料ビート、フダンソウ、およびスイス・チャードといった栽培品種が挙げられる。

本発明の一実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および／または配列番号２のコードＤＮＡ配列を含む。さらに、本発明は、配列番号１および配列番号５３のＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列を提供する。

本発明により特定された遺伝子は、ＮＢＳ－ＬＲＲ型の抵抗性遺伝子／タンパク質であり、特異な構造モチーフを特徴とする。植物におけるそのような抵抗性タンパク質の一般的な構造は、既によく調査されている（Martin et al., Annual Review Plant Biology 54 (2003), 23-61）。しかしながら、ほとんどの未知の病原性エフェクターについて見込み検出ドメインとして適用される、特にＬＲＲドメインとして知られるものの構造的具現化の法則は予測不能であり、また、この抵抗性遺伝子の機能背景、すなわち遺伝子構造は、概してほとんど未知である。したがって、セルコスポラ抵抗性を与える遺伝子またはタンパク質を、既知の構造モチーフのみに基づき特定することは、不可能である。さらに、その配列領域は、なかでも非常に配列相同性の高いタンデムリピートを含む、繰り返しの多い領域であることが判明し、そのため診断マーカーの開発ならびに配列データのアセンブリも、特に困難なものになる。

４０００以上に分かれる子孫の集団のセットアップ、および特別な組換えスクリーンの開発の助けを借りて、一連の抵抗性試験の有益な組換体（遺伝子型および表現型）の分析によって標的領域を縮小し、そしてさらに単離した。この遺伝子マッピング、ならびにＷＨＧシーケンシング（「全ゲノムシーケンシング」）、ＢＡＣ比較（Ｂａｃ－ｂｙ－Ｂａｃ）シーケンシング、およびバイオインフォマトリック（bioinformatoric）分析を伴う物理的マップの作成から、３つの組換え遺伝子型の特定が導かれ、抵抗性遺伝子が確認された（一方は隣接遺伝子に１つの組換体、他方は隣接遺伝子に２つの組換体）。本発明者らは、特有の要件を考慮して、なかでも非常に配列相同性の高いタンデムリピートを含む繰り返しの多い構造を標的領域内に置いたため、マーカーの開発、ひいては有益な組換体の特定は、格段に困難であった。以下のステップが、抵抗性遺伝子の遺伝子構造の場所について、特に決め手となった。
－マーカーｓ４ｐ０２６４ｓ０１、ｓ４ｐ２２７１ｓ０１、ｓｘｈ０６７８ｓ０１、ｓ４ｐ４２９３ｓ０１、ｓ４ｐ４２９５ｓ０１、ｓ４ｐ４３０１ｓ０１（表１Ｂ参照）の開発。
－ファインマッピングと集中的な表現型決定との併用。表現型は、温室試験で一植物につき９０～１８０の子孫で、また集中的な統計学的方法（たとえばｔ検定、検定力分析、その他）により、検証した。
－ＢＡＣプールから抵抗性遺伝子型のＢＡＣクローンの特定および配列決定。
－ＲＲ（すなわち抵抗性）遺伝子型およびｓｓ（すなわち感受性）遺伝子型の配列評価、ならびにそれらの配列およびタンパク質の比較；これによるＲＲおよびｓｓ配列データの明確なアセンブリは、配列の複雑さのせいで、常に可能とは限らなかった。

表１Ｂに記載の化合物は、本発明による分子マーカーとして使用することができる。

分析によると、ＬＲＲ遺伝子は、トマト由来のＣｆ－２抵抗性タンパク質（ＵＮＩＰＲＯＴ｜Ｑ４１３９７＿ＳＯＬＰＩＰ．Ｃｆ－２．１）と中程度のタンパク質相同性（配列同一性３２２／８３０＝３８％）を有する。実は、特定されたセルコスポラ抵抗性を与えるタンパク質は、Ｃｆ－２トマト抵抗性タンパク質に対し最高のテンサイタンパク質ホモログであった。トマト由来のＣｆ－２抵抗性タンパク質は、黒カビ真菌の一種クラドスポリウム・フルヴム（Cladosporium fulvum）由来の弱毒性タンパク質Ａｖｒ２との相互作用を介し、Ｃ．フルヴムに対する抵抗性を与える（米国特許第６２８７８６５号明細書）。それが、該病原体に対する植物の免疫防御の活性化につながる。Dixonら（1996）を参照されたい（Dixon, Mark S., et al., “The tomato Cf-2 disease resistance locus comprises two functional genes encoding leucine-rich repeat proteins.” Cell 84.3 (1996): 451-459）。１つの理論に縛られるものではないが、Ｃｆ－２遺伝子と特定したＬＲＲ遺伝子との配列相同性から、セルコスポラ抵抗性の基礎をなす類似の防御機構がテンサイの場合も発生すると仮定できる。とはいえ、配列相同性は中程度であるため、別の機構を排除するものではない。

さらに、本発明のヌクレオチド配列に、単独でも組み合わせでも該ヌクレオチド配列を実際に変更するような置換、欠失、挿入、付加、および／または任意のその他の変更が導入され得るが、修飾されたヌクレオチド配列は、当初の配列と同じ機能を果たし得る。このケースは、セルコスポラ葉斑病に対する抵抗性を与えるアミノ酸配列のコード化に関する。さらなる実施形態では、本発明はしたがって、本発明のヌクレオチド配列によりコードされるかまたは本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドの誘導体であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。コードされたポリペプチド／タンパク質の機能性が保存されている、１つ以上のアミノ酸の少なくとも１つの置換、欠失、挿入、または付加を有する誘導されたアミノ酸配列は、ポリペプチドの誘導体となる。ヌクレオチド配列が実際に変更されるが当初の配列と同じ機能を実行するような単独のまたは組み合わせの置換、欠失、挿入、付加、および／または任意のその他の変更は、したがって、従来技術で公知の従来の方法を用いて、たとえば部位特異的変異誘発、ＰＣＲに媒介される変異誘発、トランスポゾン変異誘発、ゲノム編集その他により、ヌクレオチド配列に導入することができる。

あるアミノ酸を、同一または同等または類似の化学的／物理的特性を有する別のアミノ酸で置換することは、「保存的置換」または「半保存的置換」と呼ばれる。アミノ酸の物理的／化学的特性の例は、たとえば、疎水性または電荷である。どのアミノ酸置換が保存的置換または半保存的置換となるかは、当業者には公知である。さらに、当業者であれば、一般的なノウハウによって、どのアミノ酸欠失および付加であれば抵抗性タンパク質の機能性にとって無害であるか、そしてどの位置ならそれが可能であるか、認識し、識別し、そして検出することができる。当業者であれば、このＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質のアミノ酸配列の修飾（１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加）の場合、特に保存ドメインの機能性が保存されなくてはならないこと、したがってこれらのドメインでは前記の修飾が限定的にしか可能でないことを、認識している。

本発明はしたがって、本発明のヌクレオチド配列の機能断片を含む。「断片」という用語には、したがって、前述のヌクレオチド配列と十分に類似したヌクレオチド配列を有する遺伝子が含まれる。「十分に類似した」という用語は、第１のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、第２のヌクレオチド配列または第２のアミノ酸配列に対し相対的に、十分なまたは最小限の数の同一または同等のヌクレオチドまたはアミノ酸群を有することを意味する。

アミノ酸配列に関しては、前述の方法による修飾後、やはり共通の構造ドメインを有し、かつ／または共通の機能活性をもっている。本発明のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９１％、少なくともおよそ９２％、少なくともおよそ９３％、少なくともおよそ９４％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９６％、少なくともおよそ９７％、少なくともおよそ９８％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％の同一性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、本明細書では、十分に類似していると定義される。このことはまた、９０％～１００％の範囲を明示的に包含する。機能断片の場合は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、先に挙げた本発明のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と同じ特性を概ね有していれば、十分な類似性が確立される。誘導体をコードするヌクレオチド配列、または誘導されたアミノ酸配列のヌクレオチド配列は、直接または間接的に（たとえば増幅または複製ステップにより）、全長または少なくとも一部にわたり、本発明のヌクレオチド配列に対応する当初のヌクレオチド配列から生成される。

したがって、本発明は、ストリンジェントな条件下で、本発明によるヌクレオチド配列、または本発明によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能な、ヌクレオチド配列を含む。

さらなる実施形態では、本発明による核酸分子は、植物において発現した後、病原体に対する、好ましくはセルコスポラ・ベティコラに対する優性な抵抗性効果を既に自らが与えていること、またはセルコスポラ病に対する優性な抵抗性効果を与えることができるポリペプチドをコードすることを特徴とする。好ましい実施形態では、該核酸分子または該ポリペプチドは、少なくとも１の格付けスコア、好ましくは少なくとも２の格付けスコア、特に好ましくは３～４の格付けスコアの抵抗性効果を与える。植物においてそのようなきわめて顕著なセルコスポラ病に対する抵抗性を既に自らが与えるような、あるいはそのような顕著な抵抗性を与えることが可能なポリペプチドをコードするような遺伝子は、従来技術からは公知でない。既に上述したように、過去に市販された品種では、セルコスポラ抵抗性は、多くの抵抗性遺伝子により伝えられるが効果はほとんどなく、また、そのような品種のデメリットは、複雑な遺伝のせいで開発が非常に遅く、かつ高価になること、ならびにそのような品種は侵襲の非存在下で正常な品種と比べて著しく収量が低いことである。このことはとりわけ、一部の抵抗性遺伝子と糖生産を担う遺伝子とのエピジェネティックな相互作用に関連があり得、それは病原体の非存在下で植物の健康状態の低下をもたらす。

このように、本発明者らは初めて、著しく簡略化された育種に使用できるセルコスポラ抵抗性遺伝子を提供することができた。この遺伝子をエリート系統に取り込むことにより、高いセルコスポラ抵抗性をもつ非常に高収量の品種を非常に速く開発することが今や可能である。したがって、本発明の枠内で、セルコスポラ・ベティコラに対し本発明の抵抗性を有するテンサイ植物、フダンソウ植物、レッドビートまたはビートルート植物、飼料ビート植物が初めて提供され、したがって本発明に包含される。列挙の植物はすべて栽培植物であるため、農業栽培に適した、本発明による抵抗性を有する、作物または植物は、本発明の一部である。特に、食料、砂糖の原材料または製造原料として利用可能な地下貯蔵器官を含むような、かつ本発明の抵抗性を含むような作物は、本発明の一部であり、本発明のさらなる態様である。貯蔵器官は、たとえば糖分を含有するテンサイのビート本体、消費可能なレッドビートのビート本体、または餌になる飼料ビートのビート本体であり得る。地下貯蔵器官は、完全に生長した植物の全質量の５０％超を占める場合があり、テンサイの場合は７０％超にもなり得る。さらに、こうした植物の種子または播種材料も本発明の一部である。種子または播種材料は、もっと後で記載するように技術処理され得る。

この文脈では、本発明は、配列番号３のタンパク質をコードする核酸も含み、ただし特定の実施形態では、配列番号１の天然の核酸は除外される。

さらに、本発明は、本発明の核酸分子の配列を含む、組換えおよび／または非相同ＤＮＡ分子に関する。このＤＮＡ分子は、さらに、好ましくは制御配列を含む。したがって該ＤＮＡ分子は、この制御配列と機能的に連結され得、またはこの制御配列の影響下にあり得る。この制御配列は、好ましくはプロモーター配列および／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントの、たとえばｃｉｓエレメントの配列である。本発明の核酸分子を含む遺伝子の発現を制御するこの制御配列は、好ましくは、病原体感染の結果として発現を与えるか調整することができる配列である。このプロモーターは、好ましくは、特に植物の葉におけるＤＮＡ配列の発現を制御することができる。制御配列は、発現する配列に対し非相同であってもよい。そのようなアプローチには、発現する配列の発現率、発現が生じる組織、および発現が生じる時点を当業者が調節しやすくなり得るという利点があり、当業者はそれぞれの使用事例に最適な制御配列を選択する。非相同ＤＮＡ配列は、好ましくは、植物の病原体防御の構成要素をコードするヌクレオチド配列を含む（例：抵抗性遺伝子（Ｒ遺伝子）、あるいはシグナル伝達に関与するキナーゼもしくはホスファターゼなどの酵素およびＧタンパク質をコードする、または病原性エフェクター（弱毒性遺伝子（ａｖｒ）として公知のもの））をコードする遺伝子）。非相同ＤＮＡ配列は、本発明のＤＮＡ配列の１つであってもよい。非相同ＤＮＡ配列はまた、植物の病原体防御のさらなる構成要素を追加でコードし得る。したがって、非相同ＤＮＡ配列は、その転写後に多シストロン性ｍＲＮＡが生じるように設計され得る。

本発明はさらに、本発明の核酸分子によりコードされ得るポリペプチドならびにその機能的および／または免疫学的活性断片に、ならびに該ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体にも関する。ポリペプチドは、特に好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。タンパク質、ポリペプチド、および断片の組換え生産について、当業者は熟知している（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, またはWingfield, P. T., 2008, Production of Recombinant Proteins, Current Protocols in Protein Science, 52:5.0:5.0.1－5.0.4）。当業者は、本発明のタンパク質に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、公知の方法により製造することができる（E. Harlow et al., editor, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)）。モノクローナル抗体の製造も、タンパク質検出法において同じく有用なＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片の製造も、さまざまな従来の方法により実施することができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 98-118, New York: Academic Press (1983)）。そして抗体を発現ｃＤＮＡライブラリーの選別に用いて、免疫学的選別により同一、相同、または非相同遺伝子を特定することができ（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, またはAusubel et al., 1994, “Current Protocols in Molecular Biology.” John Wiley & Sons）、あるいはウェスタンブロット分析に用いることができる。具体的には、本発明は、本発明のセルコスポラ抵抗性を与えるアレルによりコードされるポリペプチドは選択的に検出するが、対応する感受性アレルによりコードされるポリペプチドは本質的に検出しない抗体に関し、すなわち該抗体は、対応する感受性アレルによりコードされるポリペプチドを、本発明のセルコスポラ抵抗性を与えるアレルによりコードされるポリペプチドと比べて２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍以上少なく検出する。

好ましい実施形態では、本発明の抗体は、自然界では発生しない合成ポリペプチドであることを特徴とする。

さらに、本発明の抗体を、たとえば免疫組織化学法で利用できるように、そして抗体呈色を誘起するために、蛍光色素と連結することができる。蛍光色素はフルオロクロムであり得る。本発明の抗体は、他のシグナリング分子と連結されて存在していてもよい。これらとしては、たとえばビオチン、放射性同位体、アルカリホスファターゼなどのレポーター酵素、またはオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。

本発明の追加の主題は、植物において、可能であれば調節エレメントの制御下にある、特に機能調節エレメントの制御下にある、本発明の核酸分子または組換えＤＮＡ分子を含む、ベクターまたは発現カセット、ならびに陰性および／または陽性選択マーカーである。したがって、ベクターの主鎖は本発明の核酸分子に対し非相同であり、つまりそのようなベクターは自然界では発生せず、自然界からは単離できない。ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、または発現ベクター、形質転換ベクター、シャトルベクター、もしくはクローニングベクターであり；二本鎖でも一本鎖でも、直線状でも環状でもよく；あるいはゲノムへの組み込みによりまたは染色体外で、原核生物または真核生物を形質転換することができる。発現ベクターまたは発現カセット内の本発明の核酸分子またはＤＮＡ分子は、好ましくは、原核生物または真核生物の細胞における転写および任意選択で発現を可能にする１つ以上の制御配列と機能的に連結されている（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001）。これらの制御配列は、好ましくはプロモーターまたはターミネーターであり、特に転写開始出発点、リボソーム結合位置、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終止位置、および／またはポリアデニル化シグナルである。たとえば、核酸分子はここで好適なプロモーターおよび／またはターミネーターの制御下にある。好適なプロモーターは、構成的プロモーター（例：「カリフラワーモザイクウイルス」由来の３５Ｓプロモーター（Odell et al., Nature 313 (1985), 810 - 812）；病原体により誘起可能なプロモーターが特に好適である（例：パセリ由来のＰＲ１プロモーター（Rushton et al., EMBO J. 15 (1996), 5,690－5,700)）であり得る。病原体により誘起可能な特に好適なプロモーターは、自然界では発生しない合成またはキメラプロモーターであり、複数エレメントで構成され、ミニマルプロモーターを含有し、かつ少なくとも１つのｃｉｓ調節エレメントをミニマルプロモーターの上流に有しており、該少なくとも１つのｃｉｓ調節エレメントは特定の転写因子の結合位置となる。キメラプロモーターは、所望の要件にしたがい設計され、異なる因子により誘起されたり抑制されたりする。そのようなプロモーターの例は、国際公開第００／２９５９２号明細書、同第２００７／１４７３９５号明細書、および同第２０１３／０９１６１２号明細書に記載されている。たとえば、好適なターミネーターは、ｎｏｓターミネーターである（Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 561-573）。好適なプロモーターおよびターミネーターは、ネイティブプロモーターおよびネイティブターミネーターであってもよく、そのＤＮＡ配列が配列番号７および８に再生されている。ベクターまたは発現カセットは、所望のベクターまたはＤＮＡ分子／核酸分子の移動を検出するために、またこれらを含有する個体を選択するために、従来のインジケーター／レポーター遺伝子または抵抗性遺伝子を追加で含有するが、それは、遺伝子の発現を介する直接の検出がたいていはかなり難しいためである。本発明の核酸分子は、それ自体がセルコスポラ葉斑病に対する抵抗性を与えるポリペプチドをコードするので、植物細胞における発現にとって追加の抵抗性遺伝子を提供することは必須ではないが、速やかな選択を可能にするためには推奨される。

インジケーター／レポーター遺伝子の例は、たとえばルシフェラーゼ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子である。これらはさらに、遺伝子のプロモーターの活性および／または制御の試験も可能にする。特に植物の形質転換に関する抵抗性遺伝子の例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、またはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。追加の陽性選択マーカーは、非形質転換植物よりも形質転換植物に選択利益、特に養分の利益を与える、たとえばマンノース－６－ホスファートイソメラーゼまたはキシロースイソメラーゼなどの酵素であり得る。とはいえ、当業者に公知の追加のインジケーター／レポーター遺伝子または抵抗性遺伝子を除外するわけではない。好ましい実施形態では、ベクターは植物ベクターである。さらに、発現カセットは、植物ゲノムに組み込まれて存在していてもよい。

さらなる態様では、本発明は、本発明のベクター、組換えＤＮＡ分子、および／または核酸分子を含む、細胞に関する。細胞は、本発明の意味では、原核生物（たとえば細菌）の細胞または真核生物の細胞（たとえば植物細胞または酵母細胞）であり得る。細胞は、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）もしくはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）などのアグロバクテリウム、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）細胞、または植物細胞であり；植物細胞は、特に好ましくはビータ属の植物の、ビータ・ウルガリス種の、または亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの細胞である。細胞は、培養物として存在する場合もある。したがって本発明は、そのような細胞を含有する細胞培養物もカバーする。細胞培養物は、好ましくは、別の細胞型を含まない純粋または単離培養物である。

本発明の核酸分子、組換えＤＮＡ分子、および／または本発明のベクターもしくは発現カセットをアグロバクテリウムに導入することができるコンジュゲーションまたは電気穿孔などの多くの方法も、本発明の核酸分子、ＤＮＡ分子、および／または本発明のベクターを植物細胞に導入することができる多様な形質転換法（微粒子銃形質転換、アグロバクテリウム媒介性形質転換）などの方法も、どちらも当業者には公知である（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001）。

さらに、本発明は、好ましくは、セルコスポラ抵抗性を与える本発明の核酸分子を含むセルコスポラ抵抗性植物、好ましくはビータ・ウルガリス種ｓｕｂｓｐ．ウルガリス（species Beta vulgaris subsp. vulgaris）の植物、またはその一部分に関する。セルコスポラ抵抗性植物は、本発明の核酸分子を導入遺伝子として、または内在遺伝子として含み得る。本発明の範囲内で、本発明の核酸分子を含む亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物が、初めて製造された。ここで本発明は、本発明の核酸分子を内在遺伝子として含む亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物も含む。

したがって一部分とは、細胞、組織、器官、または複数の細胞、組織、もしくは器官の組み合わせであり得る。複数の器官の組み合わせは、たとえば花または種子である。本発明のセルコスポラ抵抗性植物は、好ましくは、セルコスポラ病、特にセルコスポラ・ベティコラに対し、本発明の核酸分子を含まない対応する植物（対照植物）よりも高い抵抗性を示す。対照植物は理想的には遺伝子導入植物と同一の遺伝子型を有しており、同一条件で栽培されているが、抵抗性を与える核酸分子は含んでいない。たとえばセルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性のレベルは、ビータ属の植物において格付けスコアを決定することにより量的に確立され得る。より高い抵抗性は、少なくとも１の格付けスコアの、少なくとも２の格付けスコアの、好ましくは少なくとも３以上の格付けスコアの抵抗性の向上として現れる。

本発明の核酸分子を含む本発明の植物細胞または植物またはその一部分、特にビータ属の植物は、好ましくは、病原体、特にセルコスポラ・ベティコラに対し、本発明の核酸分子を含まない、または該核酸分子の感受性対立遺伝子多型を含む対応する植物細胞または植物またはその一部分よりも高い抵抗性を示す。たとえばセルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性のレベルは、ビータ属の植物において格付けスコアを決定することにより量的に確立され得る。より高い抵抗性は、少なくとも１の格付けスコアの、少なくとも２の格付けスコアの、好ましくは少なくとも３以上の格付けスコアの抵抗性の向上として現れる。

遺伝子導入植物細胞または植物もしくはその一部分の場合、これは、本発明の核酸分子またはＤＮＡ分子を導入遺伝子として、または本発明のベクターもしくは発現カセットを含む。そのような遺伝子導入植物細胞または植物もしくはその一部分は、たとえば、本発明の核酸分子、ＤＮＡ分子、または本発明のベクターもしくは発現カセットで、好ましくは安定的に形質転換されているものである。好ましい実施形態では、核酸分子は、植物細胞における転写および任意選択で発現を可能にする１つ以上の制御配列と機能的に連結されている。その場合は本発明の核酸分子および制御配列でできている構造全体が導入遺伝子となる。そのような制御配列は、たとえばプロモーターまたはターミネーターである。植物に適用される数々の機能プロモーターおよびターミネーターが当業者には公知である。

本発明は、本発明の細胞の液胞、およびその中に貯蔵される中身の物質も含む。

さらに、本発明はまた、細胞からの、好ましくは植物細胞からの、特に好ましくはビータ・ウルガリスの細胞からの、特に好ましくはテンサイ、フダンソウ、またはビートルートのうちの１つの作物の細胞からの、細胞抽出物に関する。細胞抽出物から植物を再生させることはできない。

本発明の核酸を含有する植物ゲノムも、同様に本発明に包含される。植物ゲノムから植物を再生させることはできない。

該細胞抽出物からの糖濃度は、したがって、本発明の細胞ではないが同種または同作物に属する細胞に対し相対的に増加し得る。このことは、特に、セルコスポラ病に侵されたときの条件下で当てはまる。

砂糖（サッカロース）を製造するための、または汁液、好ましくはビートルートの汁液を製造するための、細胞抽出物の使用も本発明に包含される。

本発明の細胞およびその液胞に含有される糖分、具体的にはサッカロースも、同様に本発明に包含される。

本発明の追加の態様は、本発明の核酸を含有する種子を含む種子ストックである。本発明の核酸は、遺伝子導入的または内在的に存在し得る。種子ストックおよび種子は、技術処理されていてもよい。したがって本発明は、技術処理済み種子ストックおよび技術処理済み種子も含む。技術処理済み種子ストックのさまざまな実施形態を以下に詳しく説明するが、種子ストックという用語には種子も含まれる。技術処理済み種子ストックは、研磨された形態で存在し得る。それによって種子の最外層が除去されているので、種子はより丸い形をなす。最適に均一化された形状は種子ストック粒の均一な散布をもたらすので、それは播種に役立つ。技術処理済み種子ストックには、ペレット種子ストックもさらに包含される。それによって種子ストックはペレット塊に埋め込まれ、該ペレット塊はそれが含有する種子ストックを保護し、そしてより大きい塊になるので、ペレット種子ストックは風流に対しより高い抵抗能を示し、したがってより風に吹き飛ばされにくくなり、それと同時に播種時のより精密な位置決めが可能になる。本発明の好ましい実施形態では、販売用のバッチまたはユニットのペレット種子ストック粒はすべて、本質的に同形状および同質量を有する。直径および質量の５％の偏差が可能である。しかしながら、好ましくは、偏差は１％を超えない。主構成要素の一つとして、ペレット塊は、たとえば鉱物を、たとえば粘土、ベントナイト、カオリン、腐植土および／または泥炭などを含有し得る。ポリアシルアミドのような接着性材料を添加してもよい。追加の可能な構成要素が、米国特許第４０６７１４１号明細書に言及されている。さらに、ペレット塊は、実際の栽培にプラスに影響する追加の化学剤を含有し得る。ここではこれらは肥料に数えられる物質であってもよい。これらとしては、窒素、リン、およびカリウム（多量養素）のうちの１つ以上の元素を豊富に含む化合物が挙げられる。したがって、肥料成分には、たとえば硝酸性窒素、アンモニウム窒素、硝酸マグネシウム、硝酸アンモニウムカルシウム、モノアンモニウムホスファート、モノカリウムホスファート、および硝酸カリウムが含まれ得る。さらに、ペレット塊は、殺菌剤、殺虫剤、および／または摂食阻害剤を含有し得る。殺菌剤は、チラムおよび／またはヒメキサゾールおよび／またはその他の殺菌剤であり得る。殺虫剤は、ネオニコチノイド群の物質であり得る。ネオニコチノイド群の物質は、好ましくはイミダクロプリド（ＡＴＣＣｏｄｅ：ＱＰ５３ＡＸ１７）および／またはクロチアニジン（ＣＡＳナンバー２１０８８０－９２－５）である。さらに、殺虫剤は、シフルトリン（ＣＡＳナンバー６８３５９－３７－５）、ベータ－シフルトリン、またはテフルトリンであってもよい。粉衣（dressing）またはペレット塊に含まれる化合物は、植物に吸収され、浸透性効果を示し、それによって全植物の好適な保護を提供することは、特筆に値する。１つ以上の病虫害防除剤を含むペレット種子から得られた植物は、したがって、自然に生息する植物とは異なり、生物的ストレス条件下でより良い性能を示す。この文脈では、本発明は、ペレット塊と本発明の種子との混合物も包含する。さらに、本発明は、本発明のペレット種子を製造する方法も包含し、該方法は、
ａ）本発明の核酸を含むテンサイ植物の種子を準備するステップ、
ｂ）該テンサイ植物の種子をペレット塊に埋め込むステップ、
ｃ）該ペレット塊を乾燥させるステップであって、該種子は任意選択によりプライムもしくは予発芽種子であってもよく、または該種子はステップｂ）の間にプライム処理されていてもよいステップ
を含む。

ペレット種子ストックは、粉衣種子ストックの具体的な実施形態である。この文脈では、技術処理済み種子ストックは、粉衣種子ストックも包含する。とはいえ本発明はペレット種子ストックに限定されず、むしろどのような形態の粉衣種子ストックにも応用することができる。本発明はしたがって、粉衣種子ストックにも関し、それはペレット種子ストックも含むがそれに限定されない。したがって、乾式粉衣、湿式粉衣、および懸濁粉衣も包含される。それにより粉衣は少なくとも１つの色素（着色剤）も含み得、したがって粉衣種子ストックと非粉衣種子ストックとを即座に見分けることができるうえに、播種後の環境における良好な視界も保証される。粉衣はピリング塊の文脈で記載される農薬も含有し得る。本発明はしたがって、少なくとも１つの殺虫剤などの摂食阻害剤および／または少なくとも１つの殺菌剤が粉衣に含まれるような、粉衣種子ストックを含む。任意選択により、いわゆる電気（electonical）粉衣（電気エネルギーの印可による粉衣）が適用され得る。とはいえ、電気粉衣はその用語の厳密な意味での粉衣ではない。

技術処理済み種子ストックの追加の形態は、外殻形成された種子ストックである。コーティング処理された種子ストックと同じく、コーティングとして知られるものもこの文脈で語られる。ペレット種子ストックとの違いは、種子粒がもとの形状を保っていることであり、この方法は特に経済的である。この方法は、たとえば欧州特許出願公開第０３３４２５８号明細書に記載されている。技術処理済み種子ストックの追加の形態は、出芽またはプライム種子ストックである。出芽種子ストックは予発芽処理により前処理されており、プライム種子ストックはプライミング（「発芽処理」）により前処理されている。予発芽およびプライム種子ストックには、発芽までの時間が短いという利点がある。と同時に、播種後に発芽する時点がよりしっかりと同期する。それによって、栽培の間、そして特に収穫の間、より良い農業工学プロセシングが可能になる他、収量も増加する。予発芽処理では、種子ストックの種皮から幼根が出るまで種子ストックを発芽させ、次いでプロセスを停止する。プライミングでは、種子ストックの種皮から幼根が出る前にプロセスを停止する。予発芽種子ストックと比べて、プライミングに供した種子ストックのほうが、再乾燥のストレスに感受性が低く、そのような再乾燥後も予発芽種子ストックと比べて貯蔵寿命が長く、そのため予発芽種子ストックには一般に再乾燥を勧めない。この文脈では、事前に技術処理された種子ストックには、プライムおよび再乾燥種子ストックも含まれる。予発芽処理のプロセスは、米国特許第４９０５４１１号明細書に説明されている。プライミングのさまざまな実施形態が、欧州特許出願公開第０６８６３４０号明細書に説明されている。それに加えて、１つのプロセスで種子ストックを同時に丸めてプライム処理することも可能である。この方法は、欧州特許第２００２７０２号明細書に記載されている。ペレット処理もされているプライム種子ストックが、本発明に包含される。

技術処理済み種子ストックは、追加で、上記に説明した１つ以上の除草剤の抵抗性も備え得る。それによって、事前に除草剤で処理されたため雑草が生えない圃場に技術処理済み種子ストックを散布することができるので、さらに改良された農業工学的栽培が可能になる。

それに加えて、本発明は、本発明の種子ストックまたは本発明の種子と上記で定義した粉衣塊とを含有する混合物も包含する。したがって粉衣塊は、好ましくは上記で定義したようなペレット塊として具現化される。

本発明の種子ストックの貯蔵については、貯蔵条件は、好ましくは、種子ストックの安定性または貯蔵寿命に負の影響を与えないように選ばれる。ここで湿度の変動は特に不利な効果を有し得る。本発明の一部は、撥水性と通気性とを兼ね備えた袋または容器で種子ストックを貯蔵する方法である。そのような袋または容器は、カートン箱または包装材として設計され得る。そのようなカートン箱または包装材は、内部のベーパーバリアを任意選択により有し得る。カートン箱または包装材が二重カートン箱として設計される場合、その安定性が増加する。本発明の種子ストックまたは本発明の技術処理済み種子ストックを含む容器、袋、カートン箱、または包装材も、同様に本発明の一部である。本発明の種子ストックまたは本発明の技術処理済み種子ストックをそのような袋、容器、包装材、またはカートン箱に貯蔵することも、同様に本発明の一部である。

一実施形態では、本発明の植物は、ハイブリッド植物またはダブルハプロイド植物である。ハイブリッド植物もダブルハプロイド植物も自然界では発生せず、自然界からは単離できない。本発明の植物のさらなる実施形態では、本発明の核酸分子が、ヘテロ接合型として、またはホモ接合型として存在する。ハイブリッド植物の場合、該核酸分子はヘミ接合型としても存在し得る。本発明は、本発明の核酸または本発明のポリペプチドを含むハイブリッド種子またはダブルハプロイド種子も包含する。

本発明のさらなる実施形態は、セルコスポラ病に対する抵抗性がさらに増加していることを特徴とする植物、好ましくはビータ・ウルガリス種の植物を含む。このことは、たとえば「遺伝子スタッキング」により実現され得、すなわちこの用量効果により抵抗性が増加している。そのために、セルコスポラ抵抗性を与えるアレルを含む本発明の植物を、この抵抗性アレルで過剰に形質転換して、該植物における該遺伝子の転写量を増加させる。代替アプローチとしては、抵抗性を与えるアレルのネイティブプロモーターの遺伝子編集／部位特異的変異誘発またはＴＩＬＬＩＮＧ媒介修飾が挙げられ、それによってその発現率を増加させ、あるいは抵抗性を与えるＬＲＲ遺伝子アレル自体の修飾が挙げられ、それによってその活性または安定性を増加させる。抵抗性遺伝子の修飾により活性を増加させるような方法は、たとえば国際公開第２００６／１２８４４４号に記載されており、当業者には公知の技法を使って実施することができる。追加のアプローチとしては、本発明の核酸分子を、特にセルコスポラ感染後にネイティブプロモーターと比べてより高い活性を示す非相同プロモーターと融合させることが挙げられ得る。

本発明の追加の実施形態は、発芽から１０、１１、１２、１３、１４、または１５カ月以内に抽苔が生じることがなく、かつビート本体の成長はこの期間のうちに終わるので、抽苔前に収穫可能なテンサイ植物、またはそのような植物のペレット種子に関する。

本発明の一実施形態では、テンサイ植物、またはそのような植物のペレット種子が、完全に生長した植物の全質量の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％にもなる質量を有するビート本体の成長を可能にするゲノムを有する。

本発明の別の実施形態では、テンサイ植物、またはそのような植物のペレット種子は、光合成により、２００ｇ、２５０ｇ、３００ｇ、３５０ｇ、４００ｇ、４５０ｇ、または５００ｇの最小質量、および１０００ｇ、１１００ｇ、１２００ｇ、１３００ｇ、１４００ｇ、１５００ｇ、１６００ｇ、１７００ｇ、１８００ｇ、１９００ｇ、または２０００ｇもの最大質量を有するビート本体の成長を可能にするゲノムを有する。

本発明の追加の実施形態は、テンサイ植物、またはそのような植物のペレット種子に関し、該テンサイ植物のゲノムは、少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％ものサッカロース濃度を有するビート本体の成長を可能にする。

本発明の一実施形態では、テンサイ植物、またはそのような植物のペレット種子は、配列番号４に対し相対的に、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも１０の、少なくとも２０の、または少なくとも３０もの変異を含む。

上記実施形態［１］の核酸分子の変異バージョン、および／またはストリンジェントな条件下で（ａ）配列番号７、（ｂ）（ａ）の配列に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、および（ｃ）配列番号７の配列と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列を含むプロモーターの変異バージョンを含む生物を製造する方法であって、
（Ｉ）該核酸分子および／または該プロモーターを含む生物または細胞を準備するステップ；
（ＩＩ）該生物もしくは該細胞の変異率または該生物もしくは該細胞の変異誘発を増加させるステップ；
（ＩＩＩ）変異の結果としてセルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性の変化もしくは抵抗性レベルの変化を示す生物の表現型を選択する、または該核酸分子および／または該プロモーターに変異を含む生物もしくは細胞の遺伝子型を選択するステップであって、該変異はステップ（ＩＩ）により生じたものであるステップ；ならびに任意選択により
（ＩＶ）ステップ（ＩＩＩ）により得られた細胞から生物を再生させるステップ
を含む、方法。

生物は、植物であり得る。好ましくは、植物は、ビータ・ウルガリスである。しかしながら、細菌としての単細胞生物を使用することもできる。細菌は、Ｅ．コリ（E.coli）であり得る。生物が植物であれば、方法をインビトロだけでなくインビボで適用することができる。生物が植物であって、方法をインビトロで適用する場合、植物の細胞培養物が確立され得、そして変異率または変異誘発の増加がこの細胞培養物において生じ得る。変異率の増加には、たとえば５－ブロモウラシルもしくはエチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）のような変異誘発剤の使用、または電離放射線もしくはＵＶ光のような物理的変異原の使用が包含される。変異誘発には、標的化変異誘発も包含される。標的化変異誘発は、（もっと後で説明するような）遺伝子編集などの精密な方法により達成され得る。細胞から生物を再生させることは、細胞生物学のさまざまな標準的な参考文献で説明されている。植物の再生は、たとえば標準的な参考文献、”Plant biotechnology: comprehensive biotechnology, second supplement”（Michael W. Fowler, Graham Warren, Murray Moo-Young ‐ Pergamon Press - 1992）で説明されている。細胞培養物からのビータ・ウルガリスの再生が、Lindsey & Gallois “Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterium tumefaciens.” Journal of experimental botany 41.5 (1990): 529-536に記述されている。

これらの参照文献には、いかにして植物細胞の培養物を確立するかも記載されている。先に説明したように、核酸分子およびプロモーターそれぞれの変異バージョンは、好ましくは、変異により増加した、抵抗性を与える核酸分子の発現率を特徴とする。そのような効果は、いくつかの変異の存在にも依拠し得る。たとえば、プロモーターまたは核酸分子に２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の変異を導入することができる。

こうして変異の導入により、細胞内でより抵抗性を与えるタンパク質が組み立てられ得、または該タンパク質はより良い効果を有する。それによって、未改変の本発明の核酸を含む対照植物と比べて、抵抗性がたとえば少なくとも１、２、３、４、５パーセントまたはそれ以上増加し得る。この増加は、もっと後で説明するようにして測定され得る。さらに、１つ以上の変異による抵抗性は、少なくとも１の格付けスコアだけ増加し得る。格付けスコアの決定については、本明細書の他の箇所で説明する。さらに、抵抗性タンパク質は、変異の結果として、効果の変化を与えることができ、また場合によっては、当初の抵抗性機構に適応してしまったような病原体に対する効果を発揮することもできる。この文脈では、本発明は、そのような本発明の核酸の変異した変異型および本発明のタンパク質の変異した変異型も包含する。好ましくは、本発明は、自然界では発生せず、自然界からは単離できないような変異型も包含し、病原体にそのような変異型に適応する機会を与えない。上記の変異バージョンの核酸分子を含む生物を製造する方法は、１つ以上の変異のせいでさらに増加した抵抗性を有する生物またはそれぞれの植物を特定するさらなるステップを、さらに含み得る。抵抗性の増加が生じたかどうかは、本明細書で説明する格付けスコアにより、または抵抗性レベルの測定により、決定することができる。

核酸分子のまたはプロモーターの変異バージョンを含む生物の製造に関し上記に記載した方法の他にも、単離状態の上記の核酸を化学的に修飾して、（たとえば上記に記載したような）所望の効果を得ることも可能である。このアプローチの利点は、化合物をより精密に編集できることである。そのために、以下の方法が提供される：
化学修飾された上述の実施形態［１］の核酸分子および／または
（ａ）配列番号７；
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号７の配列と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含む化学修飾されたプロモーター
を製造する方法であって、
（Ｉ）上述の核酸分子を単離形態で準備するステップ、
（ＩＩ）
（ＩＩａ）変異誘発
（ＩＩｂ）遺伝子編集
（ＩＩｃ）制限および連結、それぞれ挿入または欠失
の各ステップのうちの１つにより、該核酸分子または該プロモーターを化学修飾するステップ
を含む、方法。

さらに、化学修飾は、対立遺伝子多型の文脈で本明細書の他の箇所で記載されるようなアプローチにより生じさせることができる。上のステップ（ＩＩ）での遺伝子編集は、「ゲノム編集」という用語と等価である。任意選択により、化学修飾された核酸分子または化学修飾されたプロモーターを続けて細胞に導入してもよいし、安定的に組み込んでもよい。そのような細胞のおかげで、化学修飾された核酸分子および修飾されたプロモーターを細胞増殖の文脈で増やすことができる。次いでこれらを大量に単離することができ、そして発現分析を実施することができる。発現分析は、化学修飾がプロモーターに関する場合は特に好適である。細胞を採取し、そして化学修飾された抵抗性タンパク質を単離して、化学的に分析することができる。化学修飾された核酸分子または修飾されたプロモーターを含む細胞が植物細胞である場合、この細胞から完全体の植物が再生され得る。本段落に記載するこれらのアプローチは、核酸分子の修飾体および／または修飾されたプロモーターを製造する上記の方法に続いて実施することができ、得られた変異型も本発明の一部である。さらに、化学修飾された核酸分子または修飾されたプロモーターを含む植物も、本発明の一部である。したがって、本発明は、この方法により得られた植物にも関する。さらに、本発明は、この方法により得られた化学修飾された核酸分子に、およびコードされるポリペプチドにも関する。これらの化合物は、もとの（修飾されていない）化合物の最適化バージョンであり得、先に説明したように、結果としての抵抗性レベルが少なくとも１、２、３、４、５パーセントもしくはそれ以上増加し得、または少なくとも１の格付けスコアだけ増加し得る。この点で、化学修飾された核酸分子を製造する方法は、該核酸分子を最適化する方法でもある。最適化の方法は、未修正の変異型と比べて植物において抵抗性の増加をもたらす核酸分子の改変した変異型を特定する、追加のステップをさらに含み得る。

さらなる実施形態では、本発明の植物は、追加で、ゲノム内の別の位置に第２の核酸分子を遺伝子導入的にまたは内在的に含み、該第２の核酸分子はポリペプチドをコードし、該ポリペプチドはそれが発現する植物においてセルコスポラ病に対する抵抗性を与えることが可能である。たとえば、従来技術に記載される抵抗性遺伝子または抵抗性座位の１つ以上が、それらが当初の遺伝子型に既存でなければ、本発明の植物内に、該植物における交雑、形質転換、相同性指向性修復、または相同組換えにより導入され得る。それらには、たとえば叢根病抵抗性ＲＺ１（Lewellen, R. T., I. O. Skoyen, and A. W. Erichsen, “Breeding sugar beet for resistance to rhizomania: Evaluation of host-plant reactions and selection for and inheritance of resistance.” 50th Winter Congress of the International Institute for Sugar Beet Research, Brussels (Belgium), Feb. 11-12, 1987. IIRB. Secretariat General, 1987）または叢根病抵抗性ＲＺ３（国際公開第２０１４／２０２０４４号）がある。

本発明はさらに、ビータ・ウルガリス種の植物においてセルコスポラ病に対する抵抗性を増加させる方法に関し、同質遺伝子植物と比べての抵抗性の増加が、本発明の抵抗性を与える遺伝子なしで生じる。

上記の抵抗性の増加は、本発明の核酸分子をビータ・ウルガリス種の植物の少なくとも１つの細胞のゲノムに組み込むことにより、ならびに可能であれば該植物細胞から植物を再生させることにより生じ得る。組み込みは、たとえば上述のビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマの１つとの有性交雑およびその後の選択によって、および相同性指向性修復または相同組換えによって生じ得る。言及した後者の２つの方法は、好ましくは部位特異的ヌクレアーゼに支援され、該ヌクレアーゼは、限定ではないが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、もしくはＣｐｆ１ヌクレアーゼなどのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、ＦｏｋＩもしくはその変異型などの制限エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、または二部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼから選択され得る。ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスにおけるＣＲＩＳＰＲ媒介相同組換えによる抵抗性を与える遺伝子の導入を、実施例１に示す。

代替アプローチとしては、植物における本発明の核酸分子の発現の増加が挙げられる。それはネイティブプロモーターの修飾によって生じ得、該修飾は、好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼおよび場合によっては修復モデルに媒介される、遺伝子編集または部位特異的変異誘発により生じ得る。そのようなヌクレアーゼの例は既に上記で言及した。本発明の核酸分子の発現の増加は、核酸分子と、特にセルコスポラ感染後にネイティブプロモーターと比べて高い活性を示す非相同プロモーターとの融合によっても生じ得る。該融合も部位特異的ヌクレアーゼおよび修復モデルによって生じ得るが、二本鎖切断後の直接挿入によっても生じ得る。

上記で既に述べたように、セルコスポラ抵抗性を増加させる方法は、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の修飾により、本発明のポリペプチドの活性および／または安定性を増加させることにもなり得る。抵抗性遺伝子の修飾により活性を増加させるような方法は、たとえば国際公開第２００６／１２８４４４号に記載されており、当業者には公知の技法を使って実施することができる。このアプローチは、もっと後で詳しく説明する。

あるいは、セルコスポラ感受性遺伝子の核酸配列のランダムまたは指定変異誘発により、該感受性遺伝子型からセルコスポラ抵抗性遺伝子型を製造することができ、したがってセルコスポラ抵抗性が増加し得る。感受性アレルと抵抗性アレルとを区別する多型の例を図１に示す。

たとえば、感受性アレルは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による遺伝子変異により修飾することができ、とりわけ後者は、例として国際公開第２０１４／１４４１５５号明細書（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いる植物ゲノム工学）およびOsakabe & Osakabe, Plant Cell Physiol., 56 (2015), 389-400に記載されている。これは、ＴＩＬＬＩＮＧ（標的化されたゲノム内局所病変の誘起（Targeted Induced Local Lesions in Genomes））と呼ばれる方法の使用によっても実現でき、たとえば独国特許出願公開第１０２０１３１０１６１７号明細書には、感受性遺伝子においてどうやって点変異を起こさせるかが記載されており、その後好適な変異、すなわち抵抗性を与える変異を示す植物、たとえばイエローモザイクウイルス抵抗性のオオムギが選択される。独国特許出願公開第１０２０１３１０１６１７号明細書の４、８、および１２ページの段落［００１４］、［００２６］、および［００３８］を参照されたい。ＴＩＬＬＩＮＧ法は、Henikoffらの発表文献（Henikoff et al., Plant Physiol. 135, 2004, 630-636）にも詳細に記載されている。

こうした方法は、少なくとも１の格付けスコアの抵抗性の向上、特に好ましくは少なくとも２、３、またはそれ以上の格付けスコアの抵抗性の向上を好ましくはもたらす。植物細胞の変異誘発およびその後の変異誘発された植物細胞からの植物再生の後、または植物の変異誘発の後、その植物は、内在核酸分子中に図１に示すような１つ以上の変異を示すと、特定され得る。この文脈では、既述の本発明の植物は、抵抗性が少なくとも１の格付けスコアだけ、好ましくは少なくとも２以上の格付けスコアだけ増加したと特徴づけられ得る。あるいは、本発明の植物の抵抗性は、本発明の核酸を含まない対照植物と比べて、たとえば少なくとも１、２、３、４、５パーセントまたはそれ以上増加し得る。この増加は、それぞれ１枚の健康な葉に病原体単離物を接種し、その１５日後に侵襲表面を決定することで、測定され得る。侵襲表面の５％の減少は、抵抗性の５％の増加に相当する。測定を実施するためのさらなるパラメーターは、以下の実施形態の「抵抗性試験（resistance rest）」から導かれ得る。

本発明の追加の実施形態は、セルコスポラ抵抗性植物を製造する方法であって、該方法は、植物細胞を本発明の核酸分子、組換えＤＮＡ分子で、またはベクターもしくは発現カセットで形質転換し、そして形質転換した植物細胞から遺伝子導入植物を再生することによって（実施例２参照）、ならびに上述したように、感受性遺伝子の核酸配列のランダムもしくは標的化変異誘発によりセルコスポラ抵抗性遺伝子型を生成することによって、あるいはたとえば前述のビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマの１つとの交雑および選択によって、行われ得る。植物を形質転換するためのベクターまたは発現カセット、ならびにその方法についても既に上述した。

セルコスポラ抵抗性植物を製造する方法は、代わりに、上述したように、部位特異的ヌクレアーゼおよび修復マトリックスをビータ・ウルガリス種の植物の細胞に導入することを含み、該部位特異的ヌクレアーゼは、該細胞のゲノムにおいて、好ましくは標的領域の上流および／または下流に、少なくとも１つのＤＮＡ二本鎖切断を生じさせることができ、該修復マトリックスは、本発明の核酸分子を含んでいる。該方法は、この細胞を、相同性指向性修復または相同組換えを可能にする条件で培養することをさらに含み、該核酸分子は該修復マトリックスから該植物のゲノム内に取り込まれる。さらに、該修飾された植物細胞から植物を再生させることが包含される（実施例１参照）。

好ましい実施形態では、該標的領域は本発明の核酸分子の対立遺伝子多型であり、該対立遺伝子多型は、セルコスポラ病に対する抵抗性を与えないポリペプチドをコードする。さらに好ましい実施形態では、この対立遺伝子多型は、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、かつ／または配列番号５のコードされたＤＮＡ配列もしくは配列番号４のゲノムＤＮＡ配列を含む、ヌクレオチド配列を含む。

本発明の核酸分子に関して記載したように、ヌクレオチド配列が実際に変更されるが当初の配列と同じ機能を実行するような単独のまたは組み合わせの置換、欠失、挿入、付加、および／または任意のその他の変更が、ここでは本発明の核酸分子の対立遺伝子多型のヌクレオチド配列に導入され得る。したがって、さらなる実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子の対立遺伝子多型によりコードされるかまたは本発明の核酸分子の対立遺伝子多型のアミノ酸配列を含むポリペプチドの誘導体であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。コードされるポリペプチド／タンパク質の機能性が保存される、１つ以上のアミノ酸の少なくとも１つの置換、欠失、挿入、または付加を有する誘導されたアミノ酸配列は、ポリペプチドの誘導体である。ヌクレオチド配列は、従来技術で公知の従来の方法を用いて、たとえば部位特異的変異誘発、ＰＣＲに媒介される変異誘発、トランスポゾン変異誘発、ゲノム編集その他によって、該ヌクレオチド配列が実際に変更されるが当初の配列と同じ機能を実行するような置換、欠失、挿入、付加、および／または任意のその他の変更を、単独でまたは遺伝子と組み合わせて、導入され得る。

アミノ酸配列に関しては、前述の方法による修飾後、やはり共通の構造ドメインを有している、かつ／または共通の機能活性をもっている。言及した本発明の核酸分子の対立遺伝子多型のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９１％、少なくともおよそ９２％、少なくともおよそ９３％、少なくともおよそ９４％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９６％、少なくともおよそ９７％、少なくともおよそ９８％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一であるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、本明細書では、十分に類似していると定義される。したがって、本発明は、ストリンジェントな条件下で、本発明の核酸分子の対立遺伝子多型のヌクレオチド配列または対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。

さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、実施形態［１］の核酸分子の対立遺伝子多型で二本鎖切断が生じること、または該少なくとも１つの二本鎖切断が該対立遺伝子多型の少なくとも１万塩基対だけ上流もしくは下流の位置で生じることを特徴とし、該対立遺伝子多型は、セルコスポラ病に対する抵抗性を与えないポリペプチドをコードする。

本発明の核酸分子に由来するがセルコスポラ病に対する抵抗性を与えない異なる感受性配列が多数生じ得るので、上記に挙げた配列（配列番号４、５、および６）はあくまで配列の例とみなすべきであり、本発明は前述の本発明の核酸分子の対立遺伝子多型に限定されないことは、当業者にとっては明白である。そのような対立遺伝子多型は、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号５のＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号４のＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）または（ｃ）による相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加により、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）によるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号４または配列番号５のＤＮＡ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。

上述したように、ＱＴＬの量的遺伝では、望ましい抵抗性だけが植物内にしばしば導入されるだけでなく、抵抗性という正の特徴と関連のない追加の遺伝子が受け継がれるため、むしろ、たとえば収量低下などの望ましくない特徴も導入されることが多い。それは、セルコスポラ抵抗性の場合のように、以前から入手可能な栽培品種において、抵抗性が多くの抵抗性遺伝子によって効果少なく受け継がれている場合に次第に生じていく。したがって、好ましい実施形態では、既に自らが優性な抵抗性効果を示している本発明の核酸分子の、またはベクターもしくは発現カセットの導入は、望ましくない特徴の導入とは関連がなく、好ましくは収量に負の影響がない。さらに、そのような方法により得られる植物が本発明により包含される。

従来技術から以前より公知のＱＴＬ分析により実際のＱＴＬを検出することができたが、その根本であるＱＴＬ効果を示したゲノム領域も上記のデメリットを媒介したことから、この文脈で「リンケージドラッグ」も論じられる。同時に、該ＱＴＬおよびそれに関連する効果は、それぞれの従来技術で一様には記述されておらず、また弱い効果を媒介しただけなので、こうした結果をセルコスポラ抵抗性植物の育種に活用することは、限られた範囲内でしか可能でなく、また多分に不確実であった。本明細書に記載の抵抗性遺伝子の特定によって、今や標的化されたテンサイの育種、およびテンサイの遺伝子プールに抵抗性遺伝子を制御下で組み込むことが可能になった。これにより、砂糖収量に負の効果を及ぼすことなく、セルコスポラ病原体に対し高い抵抗性を示すまったく新規なセルコスポラ抵抗性栽培品種の育種および生成が保証される。

本発明はまた、病原体セルコスポラに対して抵抗性のあるビータ・ウルガリス種の植物を特定し、かつ可能であれば準備する方法に関し、該方法は、植物またはその試料／一部分における本発明の核酸分子のまたは本発明のポリペプチドの存在および／または発現を検出するステップを含むことを特徴とする。本発明の核酸分子のまたは本発明のポリペプチドの存在および／または発現は、当業者には公知の標準的な方法、たとえばＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、またはウェスタンブロットにより試験することができる。

さらに、本発明の特定する方法はまた、１つ以上の多型を検出する分子マーカーを用いて、抵抗性配列と感受性配列との間の、すなわち上述した本発明の核酸分子の配列と本発明の核酸分子の対立遺伝子多型の配列との間の少なくとも１つの多型を検出することにより、本発明の核酸分子を検出することを含む。既に上述したように、多数の感受性配列が存在すること、すなわち本発明の核酸分子の対立遺伝子多型をコードする多数の配列が存在することは、当業者にとっては明白である。その１つを、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列との配列比較例として図１に示す。したがって、本発明の方法の好ましい実施形態は、多型、特に診断多型を検出する分子マーカーを用いて、図１に示す少なくとも１つの多型を検出することを含む。この検出は、好ましくは、多型１つにつき、特に診断多型１つにつき、少なくとも１つの分子マーカーを用いて行われる。対応する多型の検出にどのマーカー技法を適用すべきか、そしてそのための分子マーカーをどうやって構築するか、当業者には公知である（Advances in Seed Science and Technology Vol. I, Vanangamudi et al., 2008を参照）。さらに、本発明は、図１の多型を検出するための分子マーカーの使用など、図１の多型を表すまたは検出する分子マーカーを包含する。したがって、さまざまな多型同士を区別しないマーカーであっても、本発明の核酸分子内には生じるが感受性対立遺伝子多型には含まれないような多型を検出できるならば、使用することも可能である。

あるいは、またはそれに加えて、本発明の特定する方法は、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列またはその同時分離領域における少なくとも１つのマーカー座位を検出するステップを含む。好ましくは、同時分離領域は、本発明のポリペプチドにより与えられるセルコスポラ抵抗性と、または本発明の核酸分子といっしょに同時分離するビータ・ウルガリスのゲノム領域であって、より好ましくは、同時分離領域は、マーカーｓｘｈ０６７８ｓ０１およびｓ４ｐ０２６４ｓ０１、マーカーｓ４ｐ４３０１ｓ０１およびｓ４ｐ２２７１ｓ０１、マーカーｓ４ｐ４３０１ｓ０１およびｓ４ｐ４２９３ｓ０１、またはマーカーｓ４ｐ４３０１ｓ０１およびｓ４ｐ４２９５ｓ０１を含み、かつそれらに隣接されている。したがって検出は、少なくとも１つのマーカーまたは少なくとも１つのプライマー対が、配列番号７４または７５の座位に、好ましくは配列番号７６または７７の座位に結合する方法ステップにより行われ得、任意選択により、その結果として、シグナル、たとえば蛍光シグナル、または配列増幅体（amplificate）が生じる。したがって、代わりに、または加えて、該同時分離領域は、配列番号７４および／または７５の配列、あるいは配列番号７６および／または７７の配列を含み得る。さらに、先述の特定する方法は、本発明のセルコスポラ病に対する抵抗性を示す植物を選択する方法にもなる。この選択する方法は、抵抗性植物を選択する最終ステップを含む。

この文脈で、本発明は、本発明の核酸分子（抵抗性アレル）と感受性対立遺伝子多型との間の前述の多型を検出するのに好適な分子マーカーの開発または製造も含み、ここで該マーカーは、好ましくは、図１に示す多型の検出に、または本発明の核酸分子のヌクレオチド配列に特異的に結合するハイブリダイゼーションプローブの構築に、または本発明の核酸分子に特異的な領域をＰＣＲで増幅するのに好適な一対の核酸分子の製造に好適であり、したがって植物または植物細胞においてそれらを検出するのに好適である。

本発明は、好ましくは、本発明の核酸分子のまたはそれに相補的な核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０、好ましくは少なくとも２１、２２、２３、２４、または２５、特に好ましくは少なくとも３０、３５、４０、４５、または５０、特に好ましくは少なくとも１００、２００、３００、５００、または１０００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、あるいは好ましくはオリゴヌクレオチドの形態の一対の核酸分子を製造する方法を含み、該一対の核酸分子は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして本発明の核酸分子に特異的な領域に付着させ、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でこれを増幅するのに好適であり、またはフォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてビータ・ウルガリスゲノム内の一領域とのハイブリダイゼーションに好適であり、該領域は、ビータ・ウルガリスにおいて、本発明のポリペプチドにより与えられるセルコスポラ抵抗性または本発明の核酸分子との同時分離を有する。本発明の抵抗性媒介ヌクレオチド配列を検出する好適なプライマーの一例を、配列番号９８および配列番号９９に示す。これらの２つの配列は、ＰＣＲで使用可能なプライマー対を作る。

オリゴヌクレオチドを製造する方法は、最初に、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列と、抵抗性を与えない対応する核酸分子のヌクレオチド配列または好ましくは配列番号４もしくは５のヌクレオチド配列を有する感受性対立遺伝子多型のヌクレオチド配列との比較；該２つのヌクレオチド配列の配列差異の特定；および本発明の核酸分子に特異的に結合するが、抵抗性を媒介しない核酸分子には結合しない核酸分子、つまりここではオリゴヌクレオチドの生成、を含む。

さらに、本発明のオリゴヌクレオチドを、たとえば対応する波長の光による励起下で蛍光シグナルを発するように、蛍光色素と結合させることができる。蛍光色素はフルオロクロムであり得る。本発明のオリゴヌクレオチドを、シグナル発生に好適な他の化合物と連結する場合もある。そのようなオリゴヌクレオチドは自然界では発生せず、自然界から単離することもできない。以下を実行して、そのような標識されたオリゴヌクレオチドを製造する：ＤＮＡを生体直交的に標識することができる。そのために、インビボまたはインビトロでＤＮＡをヌクレオシドアナログで標識してから、たとえばＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応によりフルオロフォアと結合させることができる。これに加えて、ＤＮＡに化学的にフルオロフォアを与えることもできる。オリゴヌクレオチドをホスホラミダイト合成によりフルオロフォアで標識して、たとえばＱＰＣＲ、ＤＮＡシーケンシング、およびインサイチュハイブリダイゼーションで用いることができる。さらに、ＤＮＡは、蛍光ヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応の間に酵素的に生成してもよいし、リガーゼまたは末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて標識してもよい。ＤＮＡは、ビオチン化および蛍光アビジンを介して間接的に検出することもできる。結合には、フルオロフォアとして、とりわけフルオレセイン、蛍光ランタニド、金ナノ粒子、カーボンナノチューブ、または量子ドットが用いられる。最も一般的に用いられる蛍光物質の一つが、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）である。したがって、オリゴヌクレオチド、および特にＦＡＭ標識をもつプライマーが、本発明に包含される。ＦＡＭは、好ましくは６－ＦＡＭとして存在するが、所望の発光および励起の波長によっては、他のＦＡＭ変異型、たとえば５－ＦＡＭも使用され得る。追加の蛍光マーカーの例は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ、ＡＴＴＯ、Ｄａｂｃｙｌ、ＨＥＸ、Ｒｏｘ、ＴＥＴ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、およびＹａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗである。使用分野にもよるが、オリゴヌクレオチドに塩基のまたは糖リン酸突起の修飾を施す場合もある。それらはとりわけ、アミノ－ｄＴ、アジド－ｄＴ、２－アミノプリン、５－Ｂｒ－ｄＣ、２’－デオキシイノシン（ＩＮＯ）、３’－デオキシ－Ａ、Ｃ、Ｇ、５－Ｍｅｔ－ｄＣ、５－ＯＨ－Ｍｅｔ－ｄＣＮ６－Ｍｅｔ－ｄＡ等である。

さらに、本発明は、検出に好適な本発明のオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含むマーカーチップ（「ＤＮＡチップ」またはマイクロアレイ）にも関する。このマーカーチップは、本発明の１つ以上の検出する方法での適用に好適である。

本発明は、本発明のタンパク質を製造する方法も含む。この方法は、配列番号２を含む細胞培養物を準備する、または培養すること、およびそれに続いて配列番号２によりコードされるタンパク質を発現させることを含む。

さらに、本発明は、先述の方法により特定され、かつ適宜選択された、セルコスポラ抵抗性植物またはその一部分にも関する。具体的には、本発明は、先述の本発明の方法の１つにより得られる、かつ好ましくはセルコスポラ葉斑病またはセルコスポラ病侵襲に対して抵抗性である、かつ本発明の核酸分子の存在を特徴とする、植物体を含む、植物集団に関する。この集団は、好ましくは、植物体を少なくとも１０、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、特に好ましくは少なくとも５００、特に農作では好ましくは少なくとも１０００有する。本発明の核酸分子を担持しない、かつ／またはセルコスポラ葉斑病に易罹病性の植物体が該集団に占める比率は、好ましくは２５％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％、特に好ましくは存在するとしても５％未満である。

上記のファインマッピングにより、ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマのゲノム内のセルコスポラ抵抗性を与える遺伝子の位置を決定することができ、また遺伝子自体および周囲配列領域を特定することができた。これはＤＮＡハイブリダイゼーションプローブまたは標的領域における遺伝子マーカーの開発の根拠となり、その助けを借りて、セルコスポラ抵抗性媒介遺伝子を検出することができ、または抵抗性を与えない遺伝子と区別することができた。

ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを、セルコスポラ抵抗性を与える遺伝子の配列から誘導することができ、所望の生物のゲノムおよび／またはｃＤＮＡバンクの選別に用いることができる。該プローブはまた、既知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスにより、特定された相同遺伝子を増幅するのに、およびセルコスポラ抵抗性を与える遺伝子が生物に内在的に存在するかどうか、もしくは成功裏に非相同的に導入されたかどうかチェックするのに用いられ得る。

ここで当業者は、通常のハイブリダイゼーション、クローニング、および配列決定の方法を活用することができ、それらはたとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001に挙げられている。また当業者であれば、オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そしてセルコスポラ抵抗性を与える遺伝子の配列の増幅に用いることができる。特異的ハイブリダイゼーションを実現するために、そのようなプローブは、特異的であり、かつ少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さを有するべきである。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part 1, Chapter 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays.” Elsevier, New York (1993);およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., eds., Greene Publishing and Wiley lnterscience, New York (1995)に記載されている。

したがって、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０、好ましくは少なくとも２１、２２、２３、２４、または２５、特に好ましくは少なくとも３０、３５、４０、４５、または５０、特に好ましくは少なくとも１００、２００、３００、５００、または１０００ヌクレオチド長の核酸分子が、本発明の主題であり、この核酸分子は、先述したセルコスポラ抵抗性を与える遺伝子を含む本発明のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする。これは、１５～３５ヌクレオチドの範囲も明白に包含する。

本発明はしたがって、オリゴヌクレオチドとしてのマーカー、具体的にはプライマーオリゴヌクレオチドにも関する。これらは、先に定義したヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸分子を含む。

具体的には、本発明は、好ましくはオリゴヌクレオチドの形態である一対の核酸分子、またはこのオリゴヌクレオチド対を含むキットを包含し、それはフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして本発明の核酸分子に特異的な領域とのハイブリダイゼーションに、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でこれを増幅するのに好適であり、あるいはフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、ビータ・ウルガリスにおいて本発明のポリペプチドにより与えられるセルコスポラ抵抗性または本発明の核酸分子との同時分離を示すビータ・ウルガリスゲノム内の一領域とのハイブリダイゼーションに好適である。

ビータ属の新抵抗性植物系統の育種および開発の以下の利点も、本発明により実現され得る。配列情報、ならびに開示の遺伝子の抵抗性アレルと易罹病性アレルとの、すなわちセルコスポラ抵抗性を与えるアレルとこの抵抗性を与えることができないアレルとの区別を可能にする特定された多型は、上述したように遺伝子における直接の、ならびに上流および下流にある領域内のマーカー開発を可能にし、そのことは、特に「リンケージドラッグ」のない最適化されたエリート系統の開発に関し、育種家にとって重要な容易化となる。さらに、配列構造に関する知識を、たとえば相同のまたはオーソロガスな追加の抵抗性遺伝子、特にセルコスポラ抵抗性遺伝子の特定に用いることができる。

したがって、本発明は、ポリペプチドまたは追加のタンパク質をコードする追加の核酸分子を特定する方法も包含し、該ポリペプチドまたは追加のタンパク質は、該ポリペプチドが発現する植物においてセルコスポラ病に対する抵抗性を与えることが可能である。したがって当業者はデータベースを用いて、好適な検索プロファイルおよびコンピュータープログラムを利用して、相同配列を選別したり配列を比較したりすることができる。さらに、当業者自身が従来の分子生物学的技法によりセルコスポラ抵抗性タンパク質をコードする追加のＤＮＡ配列を誘導することができ、それらを本発明の範囲内で使用することができる。たとえば、本発明の核酸分子の配列から好適なハイブリダイゼーションプローブを誘導することができ、所望の生物のゲノムおよび／またはｃＤＮＡバンクの選別に用いることができる。ここで当業者は、通常のハイブリダイゼーション、クローニング、および配列決定の方法を活用することができ、それらはたとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001に挙げられている。当業者はまた、既知の配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを合成することができ、それらを用いてセルコスポラ抵抗性を与える核酸分子の配列を増幅することができる。

一実施形態では、本発明はしたがって、ポリペプチドが発現するビータ・ウルガリス種の植物においてセルコスポラ病に対する抵抗性を与えることが可能な該ポリペプチドをコードする核酸分子を特定する方法を包含する。したがってこの方法は、ビータ・ウルガリス種の遺伝子型における、ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスにおいてセルコスポラ抵抗性を与える本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と、配列データベースのアミノ酸配列との、または本発明のポリペプチドの対立遺伝子多型の配列との比較を含む。さらに、本発明の方法は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列または対立遺伝子多型の特定、ならびにビータ・ウルガリス種の植物における特定されたアミノ酸配列または対立遺伝子多型をコードする核酸分子の導入；該植物における該核酸分子の発現；そして任意選択により、セルコスポラ病に対する抵抗性のその後の検証も含む。

先述したように、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、または９８％も同一である、追加のセルコスポラ抵抗性を与えるタンパク質、またはそれらのコード遺伝子、すなわちホモログ、アナログ、およびオーソログが、古典的なバイオインフォマティクスのアプローチ（データベース検索およびコンピュータープログラムによる相同配列の選別）により特定され得る。

ホモログという用語はしたがって、（２つの異なる植物種に由来する）問題の遺伝子が本質的に同じ機能および共通の祖先をもつので、それらの核酸またはコードされるアミノ酸の配列は典型的には有意な同一性を示すことを意味する。しかしながら、タンパク質配列が有意味な対のアラインメントを生じなくても、互いに相同な遺伝子は多数ある。これに対し、アナログという用語は、（同じく）同一のまたは類似の機能を有するが、同一構造から作られていない、すなわち共通の祖先をもたない遺伝子またはタンパク質を表す。この場合、それらの核酸配列もしくはコードされるアミノ酸配列において、または最良の場合は特定の機能ドメインにおいて、有意な同一性が確立し得ないことが多い。

ゲノムシーケンシングの文脈では、ホモログは、注釈でさらに細かく分類される。そのためにオーソロジーおよびパラロジーという用語が導入されている。オーソログは、種分化の現象を介してつながりのある遺伝子である。パラログは、重複の現象に起因する遺伝子である。

そうしてみると、遺伝子は、植物においてセルコスポラ抵抗性を与えることが可能な場合、本発明の意味では基本的にホモログ、アナログ、またはオーソログである。それをチェックするには、既に先述した当業者に公知の方法、たとえば、特定されたホモログまたはアナログまたはオーソログのＰＣＲによる増幅、発現ベクターにおけるクローニング、標的植物または植物細胞への導入、および抵抗性をチェックすることが用いられる。

上述したように、シス遺伝因子またはトランス遺伝因子のアプローチに本開示の抵抗性遺伝子アレルを利用することで、用量効果によって、より高い抵抗性を示す、あるいは本開示の遺伝子とその他の抵抗性遺伝子とのスタッキングにより抵抗性の中断が回避され得、かつ抵抗性の発達が最適化され得る、ビータ属の新たな抵抗性種の可能性が開ける。新たなまたは修飾された抵抗性アレルの発現を増加させる、または開発するために、ＴＩＬＬＩＮＧまたは標的化操作により遺伝子を修飾してコドン選択を最適化することも可能である。好ましい実施形態では、コドン最適化配列または修飾抵抗性アレルは自然界では発生せず、人工である。配列番号９４は修飾ゲノム配列の一例を提供しており、位置１６～１８のコドンが修飾されているが、コードされるアミノ酸配列はもとのままであり、配列番号３に対応している。配列番号９５は修飾ｃＤＮＡ配列の一例を提供しており、位置５５～５７のコドンが修飾されているが、コードされるアミノ酸配列はもとのままであり、配列番号３に対応している。配列番号９６のアミノ酸配列は、修飾された抵抗性を与えるアレルの一例を示しており、位置２０９のアミノ酸バリンがアミノ酸ロイシンで置換されている。配列番号９６のアミノ酸配列は、配列番号９７の修飾ｃＤＮＡによりコードされる。これらの配列は自然界では発生せず、人工である。たとえば配列番号３の抵抗性媒介配列においてアミノ酸を置換する場合、以下の群内でのアミノ酸の置換が推奨される：
ａ）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
ｂ）セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン
ｃ）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
ｄ）ヒスチジン、リジン、アルギニン
ｅ）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン。

本発明は、植物において、耕種学的に有利な特性を与えることができる他の遺伝要素といっしょに、遺伝子的または分子的スタックとして、特定されたセルコスポラ抵抗性を与える遺伝子アレルを使用することにも関する。それによって栽培植物の経済的価値は著しく増加し得、たとえば同じ遺伝的性質をもつが本発明の核酸を備えていない植物と比べて、収量が増加する。さらに、強い病原体圧などの生物要因のせいで以前はこの植物の栽培にとってアクセス不可能だった新しい植物作付面積が切り開かれるかもしれない。具体的には、本発明は、農業または園芸におけるビータ属の植物の栽培で、病原体セルコスポラ・ベティコラの侵襲を制御する方法において、特定されたセルコスポラ抵抗性を与える遺伝子アレルを使用することに関し、たとえば、先述した方法の１つを用いるビータ属の植物の特定および選択、および／またはそうして選択された植物もしくはその子孫の栽培を包含する。本発明はしたがって、ビータ・ウルガリス種の植物を栽培する方法を含み、第１のステップには、本発明のセルコスポラ抵抗性のビータ・ウルガリス種の植物の準備、または本発明の製造方法を用いるビータ・ウルガリス種の植物の製造、または先述した本発明の特定する方法を用いるビータ・ウルガリス種の植物の特定および選択が含まれ；そして第２のステップには、第１のステップの植物の栽培、または第１のステップの植物の種子ストックの散布、または第１のステップの植物の育成が含まれる。そうすることにより、栽培する方法は、栽培植物のセルコスポラ病による侵襲に対抗する。栽培する方法は、砂糖を製造する方法の一部であり得る。砂糖を製造する方法は、栽培する方法のステップに加えて、最後から２番目のステップとして、栽培植物を収穫すること、および最後のステップとして、前述の植物から砂糖を抽出することを含む。

栽培する方法は、種子ストックを製造する方法の一部でもあり得る。種子ストックを製造する方法には、栽培する方法のステップに加えて、最後から２番目のステップとして、栽培植物の春化を、そして最後のステップとして、前述の植物からの種子の抽出を含む。

抽出された種子は、任意選択により、ビータ・ウルガリス種のペレット種子ストックを得るために、ペレット化することができる。それはこの場合、ペレット種子ストックを製造する方法である。

さらに、種子ストックを製造する方法は、セルコスポラ抵抗性種子ストックを製造する方法として設計される場合がある。セルコスポラ抵抗性種子ストックを製造する方法には、上述の種子ストックを製造する方法のステップに加えて、最後のステップとして、抽出された種子の少なくとも１つにおける、好ましくは抽出された種子の少なくとも０．１％、または少なくとも１％における、本明細書に記載される方法による本発明の核酸の検証が含まれる。検証は、特に好ましくは、種子の発芽可能性が保たれるように、実施される。これは、検証に必要なＤＮＡを種子から抽出しても、種子の発芽可能性を消さない、という意味である。そのような場合、本発明の核酸の検証は、抽出された全種子に対し特に大きい比率で行われたかもしれない。たとえば、抽出された全種子の少なくとも２％、好ましくは少なくとも３％、特に好ましくは少なくとも４％に対し検証を行うことができる。

本発明の植物、それらの細胞、または本発明の種子もしくは種子ストックは、追加の耕種学的に有利な特性を有する場合もあるし、それらを備えている場合もある。一例は、グリホサート、グルホシネート、またはＡＬＳ阻害剤などの除草剤に対する耐性または抵抗性である。グリホサートまたはＡＬＳ阻害除草剤に対する耐性が好ましい。グリホサート抵抗性の具体的な実施形態が、米国特許第７３３５８１６号明細書に開示されている。そのようなグリホサート抵抗性は、たとえば、ＮＣＩＭＢ（連合王国スコットランドのアバーディーン）に寄託番号ＮＣＩＭＢ ４１１５８またはＮＣＩＭＢ ４１１５９として保存されている種子ストックから入手可能である。そのような種子を、グリホサート耐性テンサイ植物を得るのに用いることができる。グリホサート抵抗性は、交雑によりビータ属の他の種にも導入され得る。

したがって、本発明は、植物、それらの細胞、または種子もしくは種子ストックも包含し、それらが本発明の核酸を含んでいることを特徴とし、さらに、
ａ）植物、またはその一部もしくは種子のゲノムＤＮＡのＤＮＡ断片が、配列番号８１のヌクレオチド配列を有する第１のプライマー、および配列番号８２のヌクレオチド配列を有する第２のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅され得、ここで該ＤＮＡ断片は配列番号８３のヌクレオチド配列と少なくとも９５％、好ましくは１００％同一であること、および／または
ｂ）植物、またはその一部もしくは種子のゲノムＤＮＡのＤＮＡ断片が、配列番号８４のヌクレオチド配列を有する第１のプライマー、および配列番号８５のヌクレオチド配列を有する第２のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅され得、ここで該ＤＮＡ断片は配列番号８６のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、好ましくは１００％同一であること、および／または
ｃ）植物、またはその一部もしくは種子のゲノムＤＮＡのＤＮＡ断片が、配列番号８７のヌクレオチド配列を有する第１のプライマー、および配列番号８８のヌクレオチド配列を有する第２のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅され得、ここで該ＤＮＡ断片は配列番号８９のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、好ましくは１００％同一であること
を特徴とする。

ＡＬＳ阻害除草剤抵抗性の具体的な実施形態が、国際公開第２０１２／０４９２６８号明細書に開示されている。たとえば、そのようなＡＬＳ阻害除草剤抵抗性は、ＮＣＩＭＢ（連合王国アバーディーン）の番号ＮＣＩＭＢ ４１７０５の寄託物から入手可能である。さらに、そのようなＡＬＳ阻害剤抵抗性は、ＴＩＬＬＩＮＧ法または部位特異的変異誘発により、たとえば遺伝子編集により、たとえばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥＮＳ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、生み出すことができる。したがって、本発明は、植物、それらの細胞、または種子もしくは種子ストックも包含し、それらが本発明の核酸を含んでいること、かつさらに、内在性アセト乳酸シンターゼ遺伝子の変異を示すことを特徴とし、ここで該アセト乳酸シンターゼ遺伝子は、位置５６９の変異の結果としてトリプトファンではないアミノ酸を有するアセト乳酸シンターゼタンパク質をコードする。変異の結果として、位置５６９のアミノ酸は、好ましくはアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、バリン、またはアルギニンである。位置５６９は、好ましくは、配列番号９０の位置５６９によって定義される。さらに、変異アセト乳酸シンターゼ遺伝子の配列番号９１という具体的な配列が好ましい。アセト乳酸シンターゼ遺伝子の変異配列、つまり配列番号９１の配列は、自然界では発生せず、自然界からは単離できない。さらに、該変異は、植物、それらの細胞、または種子、または種子ストックに、ヘテロ接合型としてもホモ接合型としても存在することができる。本発明者らは該変異がホモ接合的に存在することを推奨するが、それは、そのほうがより安定した、またはより集約された抵抗性の表現型発生を促進するからである。

多数の追加の除草剤およびそれらの適用可能性が、従来技術から当業者には公知である。当業者は従来技術を利用して、どの遺伝要素をどのように用いれば対応する耐性を植物に実装させられるかの知識を得ることができる。

さらに、除草剤耐性は、除草剤の使用により雑草の発生が抑えられるという相乗効果を有する。セルコスポラ・ベティコラの分生子（無性胞子）または偽子座（菌糸）は植物材料上で最高２年間生存できることがわかっているので、それはセルコスポラ病との闘いにおいて有利である。

耕種学的に有利な特性のさらなる例は、追加の病原体抵抗性であり、病原体はたとえば昆虫、ウイルス、線虫、細菌、または真菌であり得る。たとえば異なる病原体抵抗性／耐性の組み合わせによって植物の広範な病原体防御を獲得することができるが、それは遺伝要素同士が相加効果を発揮し得るからである。たとえば、そのための多数の抵抗性遺伝子が、遺伝要素として当業者には公知である。たとえば米国特許出願公開第２０１６／０１５２９９９号明細書は、叢根病に対するＲＺ抵抗性遺伝子を開示している。この病害は、「ビートえそ性葉脈黄化ウイルス」という作用因子を原因とする。１つの植物体に含まれるいくつかの病害抵抗性は、互いに相乗効果を有する。ある植物がある病原体に初めて侵された場合、通常はその免疫系が弱化し、外側バリアとしての表皮が損傷することが多く、したがってさらなる感染の確率が高まる。耕種学的に有利な特性の追加の例は、寒さまたは霜に対する耐性である。この特性を示す植物は、たとえば、１年のより早い時期から蒔くことができ、またはより長期間圃場に残すことができ、したがって収量が増加し得る。ここでも当業者は従来技術を利用して好適な遺伝要素を見つけることができる。耕種学的に有利な特性の追加の例は、水利用効率、窒素利用効率、および収量である。そのような特性を与えるために用いることができる遺伝要素を従来技術から見出すことができる。

さらに、病原体防御のための多数の修飾が当業者に知られている。よく記載されているＲ遺伝子ファミリーに加えて、Ａｖｒ／Ｒアプローチ、Ａｖｒ遺伝子相補（国際公開第２０１３／１２７３７９号）、Ｒ遺伝子の自己活性化（国際公開第２００６／１２８４４４号）またはＨＩＧＳ（宿主誘導型遺伝子サイレンシング）アプローチ（たとえば国際公開第２０１３／０５００２４号）が有利に用いられ得る。本発明にとっては、Ｒ遺伝子の自己活性化が特に重要であり得る。その場合、植物において病原体に対する抵抗性を生じさせるため、自己活性化する抵抗性タンパク質をコードする核酸を作成することになる。この核酸はそのとき、ｗｂ－Ｒ遺伝子などの、ＮＢＳ－ＬＲＲ抵抗性遺伝子の限定的な一部分のみを有しており、それはＮＢＳ－ＬＲＲ抵抗性遺伝子のコード領域の５’末端から、下流のＮＢＳ－ＬＲＲ抵抗性遺伝子のＮＢＳドメインのコード開始部へと伸びている。

この文脈では、本発明の核酸のその領域、つまりＮ末端領域をコードする、かつＮＢＳドメインのｐループから開始してＮ末端領域の端部まで伸長する領域を除去するステップを含む方法も包含される。

そのような短縮核酸によりコードされる抵抗性タンパク質は概して自己活性化し、それらの抵抗性タンパク質は関連病原体が存在しなくても植物内で免疫応答を引き起こすので、該植物の基礎免疫を高める。そのような本発明の短縮核酸、およびそれによりコードされるポリペプチドも、さらに包含される。

さらに、本発明は、先述の修飾の１つと、または植物において１つもしくは複数の耕種学的に有利な特性を伝達し得る先述の遺伝要素の１つと組み合わせるための、上述の方法により特定されるセルコスポラ抵抗性を与える遺伝子アレルの使用も含む。

本発明は、本発明の植物に関する他、典型的には持続可能な原材料から製造される、食材および動物の餌などの製品、好ましくは砂糖またはシロップ（モラセス）の製造における、その種子もしくは子孫に、またはその器官、植物部分、組織、もしくは細胞にも関し、モラセスは、産業用途にも、たとえばアルコールの製造に、またはバイオテクノロジー製品を生産する生育培地としても使用され、化学産業の材料または物質、たとえば精製化学品、医薬もしくはその前駆体、診断薬、化粧品、バイオエタノール、またはバイオガスの製造にも使用される。バイオガス工場で生体起源の原材料としてテンサイを使用する例が、独国特許出願公開第１０２０１２０２２１７８号明細書に記載されている。たとえば段落１０を参照されたい。

以下の実施例は本発明を説明するが、本発明の主題を制限することはない。特に断らない限り、標準的な分子生物学的方法を用いている。たとえばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, Fritsch et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989; Mayer et al., Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, eds., Academic Press, London, 1987, およびWeir et al., Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV, Blackwell, eds., 1986を参照されたい。

本発明の最重要配列の一部を以下に詳しく説明する：
－ 配列番号１：ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマ由来のセルコスポラ抵抗性を与える遺伝子のゲノムＤＮＡ配列
－ 配列番号２：自然界では発生しない、セルコスポラ抵抗性を与える遺伝子のｃＤＮＡ配列
－ 配列番号３：配列番号１または配列番号２によりコードされる、セルコスポラ抵抗性を与えるタンパク質のアミノ酸配列
－ 配列番号４：セルコスポラ抵抗性を与える遺伝子の感受性変異型のゲノムＤＮＡ配列
－ 配列番号５：セルコスポラ抵抗性を与える遺伝子の感受性変異型のｃＤＮＡ
－ 配列番号６：セルコスポラ抵抗性を与える遺伝子の感受性変異型のアミノ酸配列
－ 配列番号７：ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマ由来のセルコスポラ抵抗性を与える遺伝子のネイティブプロモーター
－ 配列番号８：ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマ由来のセルコスポラ抵抗性を与える遺伝子のネイティブターミネーター
－ 配列番号５３：配列番号１のセルコスポラ抵抗性を与える遺伝子を含むビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマ由来の座位の配列

実施例
実施例１：ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスにおけるＣＲＩＳＰＲ媒介相同組換えによる抵抗性を与える遺伝子の導入
ｃｒＲＮＡの設計および選択：
Ｃｐｆ１に媒介される二本鎖切断の誘発に好適なｃｒＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓの助けを借りて設計した（Park J., Bae S., and Kim J.-S. Cas-Designer: A web-based tool for choice of CRISPR-Cas9 target sites. Bioinformatics 31, 4014-4016 (2015); Bae S., Park J., and Kim J.-S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475 (2014)）。そのために、ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマ由来のセルコスポラ抵抗性遺伝子の５’および３’末端に隣接する５００～１３００塩基長を有するゲノムＤＮＡ配列内で、好適なプロトスペーサーを探した。ラクノスピラセアエ（Lachnospiraceae）細菌ＮＤ２００６（Ｌｂ）由来のエンドヌクレアーゼＣｐｆ１の機能性を確保するために、５’末端のゲノム結合配列が配列５’－ＴＴＴＶ－３’（Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡ）を有する必須のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接された、２４ｎｔの長さを有するプロトスペーサーを選択した。ツールの所定の品質基準にしたがい好適なプロトスペーサーを選択し、Ｂ．ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリス（B. vulgaris subsp. vulgaris）の参照ゲノムとの潜在的オフターゲットについて調整した。継続試験のために、実際の標的配列に加えて、機能性ＰＡＭと同一の塩基を多くとも１５有するｃｒＲＮＡを限定的に選択した。標的配列の検出および切断に不可欠なのはプロトスペーサーの最初の１８ｎｔなので、そうすれば、他のゲノム配列内での望ましくない切断を防ぐことができる（Tang, X., L. G. Lowder, T. Zhang, A. A. Malzahn, X. Zheng, D. F. Voytas, Z. Zhong, Y. Chen, Q. Ren, Q. Li, E. R. Kirkland, Y. Zhang, and Y. Qi (2017), “A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants.” Nat Plants 3: 17018）。こうして、抵抗性遺伝子の５’隣接領域で４つの候補ｃｒＲＮＡ（５’ｃｒＲＮＡ＃１～４）を、および３’隣接領域で３つのｃｒＲＮＡ（３’ｃｒＲＮＡ＃１～３）を特定することができた（表Ａ参照）。

遺伝要素のクローニング：ｃｐｆ１発現カセットおよびｃｒＲＮＡ発現カセットのクローニングでは、まず、クローニングを妨げる制限酵素ＢｂｓＩの検出配列を、点変異（ＴからＧ）の導入により、標的ベクターｐＺＦＮｎｐｔＩＩから除去した。変異誘発キットをメーカーの指示通りに用いて、２つの変異誘発プライマー（表Ｂ参照）を用いて変異誘発を行った。

Ｂ．ウルガリスにおいてＬｂｃｐｆ１遺伝子を発現させるために、ペトロセリヌム・クリスプム（Petroselinum crispum）由来の５’隣接ＰｃＵｂｉプロモーター配列（配列番号７９）およびピー種（Pea sp.）由来の３’隣接３Ａターミネーター配列を有する、Ａ．タリアナ（A. thaliana）のコドン最適化ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ断片として、合成により製造した。コード領域内で不慮の切断が起きないように、Ｌｂｃｐｆ１コード配列（ＣＤＳ）［配列番号７８］内のクローニングに関連する制限インターフェース（ＨｉｎｄＩＩＩ）を、サイレント変異（アミノ酸配列を修飾しない塩基交換）の導入により除去した。コドン最適化は、Invitrogene/ThermoScientificのＧｅｎｅＡｒｔアルゴリズムの助けを借りて行った。細胞核内のＣｐｆ１の輸送を可能にするために、ＳＶ４０の核局在化シグナル（ＮＬＳ）のコード配列をｃｐｆ１ ＣＤＳの５’末端に組み込み、ヌクレオプラスミンのＮＬＳを３’末端に組み込んだ。バイナリー標的ベクターｐＺＦＮｎｐｔＩＩにおける連結は（図２）、発現カセットに２つのＨｉｎｄＩＩＩ制限インターフェースを隣接させ、その後ｐＺＦＮｎｐｔＩＩ＿ＬｂＣｐｆ１に連結させた。ＰｃＵｂｉ：：Ｃｐｆ１：：ＴＰｅａ発現カセットの成功裏の挿入を配列決定により検証し、ここで配列決定に用いた各プライマーの結合領域は、隣接ベクター領域および発現カセット内の両方に位置していた（表Ｃ参照）。

ｃｒＲＮＡは、植物細胞内に転写された後、２つの隣接リボザイムにより切り取られなくてはならない。そのために、前駆ｃｒＲＮＡに、ハンマーヘッド型リボザイムおよびＨＤＶリボザイムのコード配列を隣接させた（Tang, X., L. G. Lowder, T. Zhang, A. A. Malzahn, X. Zheng, D. F. Voytas, Z. Zhong, Y. Chen, Q. Ren, Q. Li, E. R. Kirkland, Y. Zhang, and Y. Qi (2017), “A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants.” Nat Plants 3: 17018）。

ｃｒＲＮＡリピートのコード配列に個々のプロトスペーサーを完璧に連結させるために、ｃｒＲＮＡリピートとＨＤＶリボザイムとの間に２つのＢｂｓＩ検出配列を組み込み、ここでクローニングに用いるオーバーハングをそれに合うように適合させた。ｃｐｆ１およびｃｒＲＮＡの発現の強度が同一になるように、ｃｒＲＮＡリボザイムカセットの５’末端にＰｃＵｂｉプロモーター配列を、そして３’末端に３Ａターミネーター配列を結合させた。標的ベクターｐＺＦＮｎｐｔＩＩ＿Ｃｐｆ１における後の連結のために、ｃｒＲＮＡ発現カセットに２つのＰｓｔＩインターフェースを隣接させ、合成ＤＮＡ断片としてオーダーした。プロトスペーサーを相補オリゴヌクレオチドとして合成し、標準的なプロトコルにしたがいアニーリングした。こうして作成した２４ｂｐ長のＤＮＡ断片に、連結に適した４ｎｔのオーバーハングを隣接させた（表Ｄ参照）。

４つのｃｒＲＮＡの効率を、Ｂ．ウルガリスの葉のアグロバクテリア媒介性遺伝子導入により試験した。形質転換効率をチェックするために、ｐＺＦＮｔＤＴｎｐｔＩＩプラスミドを同時形質転換した。葉外植片の形質転換は、標準的なプロトコルにしたがい減圧浸潤により行った。６日後、蛍光顕微鏡法によりｔＤＴの蛍光を確認し、非相同蛍光の葉外植片を廃棄した。浸潤を実施した１０日後、葉外植片を液体窒素で急速冷凍し、すり潰して、ＣＴＡＢ法によりゲノムＤＮＡを単離した（Clarke, Joseph D., “Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation.” Cold Spring Harbor Protocols 2009.3 (2009): pdb-prot5177）。個々のｃｒＲＮＡの効率は、外部業者によって、挿入した編集（たとえば挿入、欠失、または塩基交換）の頻度をゲノムＤＮＡの無編集の配列とＮＧＳにより比較して決定された。

合成ＤＮＡ構築体として、先述のリボザイム、プロモーター、およびターミネーター配列を有する最も効率のよいｃｒＲＮＡ、５’ｃｒＲＮＡ＃３および３’ｃｒＲＮＡ＃１を、逆向き発現カセットとしてオーダーした。該ＤＮＡ構築体全体を、標的ベクターｐＺＦＮｎｐｔＩＩ＿ＬｂＣｐｆ１におけるクローニングのため、２つのＰｓｔＩ制限インターフェースに隣接させた。該ｃｒＲＮＡの挿入が行われた後、ベクターｐＺＦＮｎｐｔＩＩ＿ＬｂＣｐｆ１＿ｃｒＲＮＡから、ＬｂＣｐｆ１およびｃｒＲＮＡ発現カセットが、ＨｉｎｄＩＩＩを介して、ｐＵｂｉｔＤＴｎｐｔＩＩベクター内に連結された。

相同組換えによりＢ．ウルガリスのゲノム内に組み込まれるべき修復鋳型として、抵抗性遺伝子発現カセットの５’末端に５’ｃｒＲＮＡ＃３を、そして３’末端に３’ｃｒＲＮＡ＃１結合配列を隣接させた。それによって、プラスミドからＣｐｆｌによって抵抗性遺伝子発現カセットを切り出すことが可能になった。ＤＮＡ鋳型全体を８万７３２６ｂｐ長の合成ＤＮＡ断片（配列番号８０）として合成し、形質転換のためにベクター主鎖で直接用いた。抵抗性遺伝子プラスミドおよびｐＵｂｉｔＤＴｎｐｔＩＩ＿ＬｂＣｐｆ１＿ｃｒＲＮＡプラスミドを、遺伝子銃の助けを借りてＢ．ウルガリスのカルス培養物に導入した。

形質転換効率は、形質転換の１日後に蛍光顕微鏡法によって、一過性ｔＤＴ蛍光により決定した。カルス培養物を選択圧なしで（カナマイシンなしで）芽誘導培地で培養し、次に、再生した芽を、抵抗性を与える抵抗性遺伝子カセットの部位特異的組み込みについてチェックした。そのために、ゲノムＤＮＡをＣＴＡＢにより単離した。抵抗性を与える遺伝子の組み込みは、配列番号４７のｐＣＲＢＭ４＿Ｆ１プライマーおよび配列番号４８のｐＣＲＢＭ４＿Ｒ１プライマーを用いてＰＣＲにより増幅し（表Ｅ参照）、次いで両プライマーによってＰＣＲ産物を配列決定した。こうして発現カセットの成功裏の挿入が検証できた芽を、続いて抵抗性遺伝子の組み込み部位の分析において特定した。ゲノム内の所望の標的配列に挿入されたことを検証するために、抵抗性遺伝子発現カセットの隣接領域をＰＣＲにより増幅した。ここで、一プライマーの結合は抵抗性遺伝子ＤＮＡ配列内で生じ、第２のプライマーの結合は挿入された発現カセットの５’または３’隣接相同領域の外側で生じていた（表Ｅ参照）。増幅されたＤＮＡ配列を、同じプライマーを用いて配列決定し、こうして所望の場所に組み込まれたことを確認した。プライマーｐＣＲＢＭ４＿Ｆ１（配列番号４７）、ｐＣＲＢＭ４＿Ｒ１（配列番号４８）、ｐＣＲＢＭ４＿Ｒ２（配列番号５０）、およびｐＣＲＢＭ４＿Ｆ３（配列番号５１）がゲノム内の配列が似た領域で結合するのを防ぐために、前もってすべてのプライマー配列をＢ．ウルガリスのゲノムと比較しておいた。プライマーｐＣＲＢＭ４＿Ｆ３（配列番号５１）に関しては、野生型配列との結合を妨げられるようなヌクレオチド配列を選択することが不可能だった。したがって、抵抗性遺伝子が陽性だったすべての芽の３’隣接領域を増幅し、その後の配列決定により、部位特異的挿入を排他的に検証した。そうすることにより生成されＰＣＲ産物は、野生型配列と１８ｂｐだけ異なっていた。増幅配列の完全な配列決定を可能にするために、ＰＣＲ産物を、増幅配列内に結合場所がある第３のプライマーによって、さらに配列決定をした（ｐＣＲＢＭ４＿Ｓ２、ｐＣＲＢＭ４＿Ｓ３；表Ｅ参照）。野生型ゲノム内のプライマーｐＣＲＢＭ４＿Ｆ１（配列番号４７）、ｐＣＲＢＭ４＿Ｒ１（配列番号４８）、およびｐＣＲＢＭ４＿Ｒ２（配列番号５０）の非特異的結合を防ぐために、ヌクレオチド配列をＢ．ウルガリスの内部参照ゲノムと比較した。ＰＣＲにより、Ｂ．ウルガリス野生型植物のゲノム配列における結合について、プライマーを追試した。

ゲノムの他の場所に抵抗性遺伝子が組み込まれるのを防ぐために、標的場所の標的化された増幅を実施した（標的化座位増幅、ＴＬＡ）。

Ｂ．ウルガリスのゲノムへの抵抗性遺伝子発現カセットの検証および成功裏の挿入に加えて、プラスミドＤＮＡの望ましくない組み込みについてもチェックした。そのために、抵抗性遺伝子が所望の標的部位に成功裏に挿入されたことが検証されたゲノムＤＮＡを、ＰＣＲによって、プラスミドＤＮＡの存在についてチェックした。したがってｃｐｆ１、ｃｒＲＮＡリボザイムカセット、およびｔＤＴ内の配列領域を、表Ｆに挙げるプライマーを用いて増幅し、続いて配列決定した。

実施例２：遺伝子形質転換により、抵抗性を与える遺伝子を導入遺伝子としてビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスに導入
セルコスポラ抵抗性植物を製造するための遺伝子導入アプローチは、抵抗性を与える遺伝子としてのＬＲＲ遺伝子の代替的な実証に役立つのみならず、新規なセルコスポラ抵抗性を与える、または既存のセルコスポラ抵抗性を向上させる遺伝子導入による抵抗性の事象を生み出す手段としても役立った。

バイナリーベクターｐＺＦＮ－ｎｐｔＩＩ－ＬＲＲを、次のような標準的なクローニング手順によって作成した。このベクターのＴ－ＤＮＡ内で、配列番号２の抵抗性遺伝子のｃＤＮＡをそのネイティブプロモーター配列といっしょにクローン化させた。Ｔ－ＤＮＡは、カナマイシンまたはパロモマイシンなどのある帯域幅のアミノグリコシド系抗生物質に対する抵抗性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子をさらに含んでいた。これらの抗生物質抵抗性を、遺伝子導入植物細胞および組織の選択に用いた。ｎｐｔＩＩ遺伝子にＮＯＳプロモーターおよびｐＡＧ７ターミネーターを隣接させた。バイナリーベクターの主鎖は、さらに、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）におけるプラスミド複製のｃｏｌＥ１起点およびｐＶＳ１起点を含んでいた。ａａｄＡ遺伝子が、細菌選択のためのストレプトマイシン／スペクチノマイシン抵抗性を与える。標準的な手順によってｐＺＦＮ－ｎｐｔＩＩ－ＬＲＲプラスミドをアグロバクテリウム株ＡＧＬ－１に導入し形質転換した。

テンサイの形質転換は、Lindsey & Gallois (1990), “Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterium tumefaciens.” Journal of experimental botany 41.5, 529-536にしたがい行った。そのために、出発材料として、本発明の抵抗性遺伝子を担持していない遺伝子型０４Ｅ０５Ｂ１ＤＨ５の「マイクロプロパゲーションされた（micropropagated）芽」を用いた。芽は、Lindsey & Gallois (1990)にしたがい、対応する培地で繁殖させた。できるだけ多くの成長点を誘導するために、「芽」を別の培地に移し（Lindsey & Gallois (1990)参照）、およそ３０℃で数週間、暗所でインキュベートした。ベクターｐＺＦＮ－ｎｐｔＩＩ－ＬＲＲを含むアグロバクテリウム株ＡＧＬ－１（図３）を、追加の培地（Lindsey & Gallois (1990)参照）で培養し、選択用の対応する抗生物質を追加で与えた。処理すべき芽に基づく分裂組織の切片を、追加の培地（Lindsey & Gallois (1990)）参照）でアグロバクテリウムといっしょに数時間インキュベートした。植物外植片およびアグロバクテリアを暗所で少なくとも２日間培地（Lindsey & Gallois (1990)参照）で共培養し、その後、接種済み外植片を暗所でおよそ２週間、追加の培地（Lindsey & Gallois (1990)参照）でインキュベートした。それから外植片を追加の培地（Lindsey & Gallois (1990)参照）でさらに繁殖させ、遺伝子導入組織が選択できるように継代培養した。選択期を終えるために、かつキメラ形成の程度を抑えるために、緑の「芽」を培地Ｈに移し、すべて２週間繁殖させた。次に成長中の緑の「芽」から葉材料を抽出し、ＰＣＲにより、導入遺伝子の存在について調べた。好適な「芽」を培地Ｉで発根させ、その後温室に移してＴ１種子ストックを製造した。さらに、これらの「芽」に由来する葉材料を、形質転換された抵抗性遺伝子の発現の分析に用いた。

発現レベルの分析
インビトロの「芽」の葉からＲＮＡを単離し、ｑＲＴ－ＰＣＲに用いた。ｑＲＴ－ＰＣＲは、Weltmeierら（2011）（発明の背景を参照）にしたがい実施した。測定値を参照遺伝子ＰＬＴ３＿０７５＿Ｆ０９（Weltmeierら（2011）を参照）に対し正規化した。発現は、以下のプライマー配列を用いて決定した。

セルコスポラ・ベティコラ接種後のテンサイの温室条件下の抵抗性試験：
既知の高い毒性をもつ純粋セルコスポラ・ベティコラ培養物を、ペトリ皿（直径９ｃｍ）の野菜ジュース寒天上で、近紫外（ＮＵＶ）光の下、２０℃で繁殖させた。１４日後、カビが生えた寒天の表面を、各ペトリ皿につき１０ｍｌの滅菌水で冠水させ、対象担持体（subject carrier）を用いて分生子および菌糸の断片をそっと掻き取った。分生子／菌糸断片の接種密度を２万／ｍｌとし、０．１％ＴＷＥＥＮ ２０を加えたものを、植物の接種に用いた。植物は、接種の時点で、温室条件で８～９週間栽培されていた。葉の上面および下面を接種材料で処理した。その後、植物を２５℃、１８時間／６時間の明／暗期、湿度およそ１００％で、５～７日間インキュベートした。１２～１４時間後、テンサイの葉にセルコスポラ病の最初の徴候が生じた。表１Ａに示す格付けスコアの査定を補助として、個々の植物の徴候の査定を定期的に行った。結果を以下に示す。

本発明の抵抗性遺伝子の遺伝子導入の実証結果（表Ｇ参照）
試験群１は、陰性対照である。遺伝子型は試験群２～１１と同じであるが、形質転換していない。したがって、発現は検出できなかった。試験群４は形質転換しているが、発現が検出できなかった。試験群２、３、および５から１１は、形質転換のみによって本発明の抵抗性遺伝子を担持する形質転換体である。試験群１２は、非遺伝子導入バージョンの本発明の抵抗性遺伝子を含む育種系統である。上記のように植物材料にセルコスポラ・ベティコラを接種した後、すべての系統の格付けスコアを確立した。試験群１２は、最終値５．１９という最高の抵抗性を示す。

遺伝子導入系統は、以下の表の格付けスコアを示した。

表Ｈは、遺伝子導入実証群のみの格付けスコアを示す。最初にすべての遺伝子導入試験群（第４群を除く）の平均値を示す。その下に、少なくとも１０の発現レベルを示した遺伝子導入系統（第３、８、９、１０群；表Ｇ参照）のみの格付けスコアを示す。ここで、最終の格付けスコアは５．９１であった。それは、６．４６でしかなかった第１群の陰性対照の格付けスコアよりも有意に高い抵抗性である（最小有意差＝０.４；表Ｇ参照）。最良の遺伝子導入試験群（第８群）は、格付けスコアが５．４８なので、さらに優れた抵抗性を示している（表Ｇ参照）。

遺伝子導入による挿入の発現レベルが、組み込み座位により影響され得ることは、特筆に値する。発現レベルをインビトロで測定したが、感染条件下では、特に該抵抗性遺伝子が病原体誘導型プロモーターの制御下にあるような条件下では、実際の発現レベルはもっと高い可能性がある。

遺伝子導入の実証結果の統計学的評価

表Ｉは、表Ｇ記載の格付けスコアの統計学的評価を示す。各文字は、統計学的グループへの割り当てを表している。たとえば、最終評価（１５ｄｐｉ）後、（遺伝子導入検証）試験群８は、（抵抗性源）試験群１２と同じクラスターにあるが、（陰性対照）試験群１とは違うクラスターにあることが明らかである。これによると、試験群８は、試験群１とは有意差があるが、試験群１２とは有意差がない。

それに加えて、箱ひげ図分析を実施した。箱ひげ図の例示を図４～７に示す。

Claims (13)

1. ポリペプチドを発現する植物においてセルコスポラ・ベティコラ（Cercospora beticola）に対する抵抗性を与えることが可能な前記ポリペプチドをコードする核酸分子であって、前記核酸分子は、
   （ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
   （ｂ）配列番号２のＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列；
   （ｃ）配列番号１または配列番号５３のＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列；
   （ｆ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
   （ｇ）配列番号１または配列番号２のＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列
   から選択されるヌクレオチド配列を含み、
   ここで、前記植物は、亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリス（Beta vulgaris subsp. vulgaris）に属することを特徴とする、核酸分子。
2. 請求項１記載の核酸分子によりコードされる、ポリペプチド。
3. 請求項１記載の核酸分子を含む、ベクターまたは発現カセット。
4. 請求項１記載の核酸分子、または請求項２記載のポリペプチドを含む、細胞。
5. セルコスポラ・ベティコラ抵抗性植物またはその一部分であって、前記植物またはその一部分は、請求項１記載の核酸分子を遺伝子導入的にまたは遺伝子移入により含み、ここで前記核酸分子を含む前記植物は、亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスに属することを特徴とする、セルコスポラ・ベティコラ抵抗性植物またはその一部分。
6. 請求項１記載の核酸分子を遺伝子導入的にまたは遺伝子移入により含む、請求項５記載の植物の種子または子孫。
7. （ａ）研磨
   （ｂ）粉衣、
   （ｃ）外殻形成
   （ｄ）着色
   からなる群から選択される技術処理が施されている、請求項６記載の種子。
8. 亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物においてセルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性を増加させる方法であって、
   （ｉ）部位特異的ヌクレアーゼにより助長された、請求項１記載の核酸分子を、相同性指向性修復または相同組換えにより、亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物の少なくとも１つの細胞のゲノムに組み込み、前記植物細胞から植物を再生させるステップ；または
   （ｉｉ）配列番号７のネイティブプロモーターの修飾により、または前記核酸分子を、特にセルコスポラ・ベティコラ感染後に前記ネイティブプロモーターと比べてより高い活性を示す非相同プロモーターと融合させることにより、前記植物における請求項１記載の核酸分子の発現を増加させるステップ；または
   （ｉｖ）請求項１記載の核酸分子、または請求項３記載のベクターもしくは発現カセットで植物細胞を形質転換し、かつ前記形質転換植物細胞から遺伝子導入植物を再生させるステップ；または
   （ｖ）請求項１記載の核酸分子を、亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物と、亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．マリティマ（Beta vulgaris subsp. maritima）の植物との交雑によって組み込み、かつ、セルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性の増加した植物を選択するステップ
   を含む、方法。
9. 請求項５記載のセルコスポラ・ベティコラ抵抗性植物を製造する方法であって、
   （Ｉａ）請求項１記載の核酸分子、または請求項３記載のベクターもしくは発現カセットで植物細胞を形質転換するステップ；および
   （Ｉｂ）前記形質転換植物細胞から遺伝子導入植物を再生させるステップ；または
   （ＩＩａ）ビータ・ウルガリス種の植物の細胞に、部位特異的ヌクレアーゼおよび修復マトリックスを導入するステップであって、前記部位特異的ヌクレアーゼは、前記細胞のゲノムにおいて少なくとも１つのＤＮＡ二本鎖切断を生じさせることができ、前記修復マトリックスは、請求項１記載の核酸分子を含んでいるステップ；
   （ＩＩｂ）相同性指向性修復または相同組換えを可能にする条件下で（ＩＩａ）の細胞を培養するステップであって、前記核酸分子が前記修復マトリックスから前記植物のゲノム内に組み込まれるステップ；および
   （ＩＩｃ）（ｂ）で修飾された細胞から植物を再生させるステップ
   を含む、方法。
10. 前記少なくとも１つの二本鎖切断が、請求項１記載の核酸分子の感受性対立遺伝子多型で生じるか、または前記少なくとも１つの二本鎖切断が、前記感受性対立遺伝子多型から多くとも１０，０００塩基対だけ上流もしくは下流の位置で生じ、ここで前記対立遺伝子多型は、セルコスポラ・ベティコラに対する抵抗性を与えないポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項９記載の方法。
11. 前記感受性対立遺伝子多型が、
    （ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
    （ｂ）配列番号５の配列を含むヌクレオチド配列
    （ｃ）配列番号４の配列を含むヌクレオチド配列
    （ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
    （ｇ）配列番号４または配列番号５の配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列
    から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１０記載の方法。
12. セルコスポラ・ベティコラに対して抵抗性のある亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物を特定し、かつ任意選択で準備する方法であって、
    （ｉ）前記植物または前記植物の一部分における、請求項１記載の核酸分子の存在および／または発現、または請求項２記載のポリペプチドの存在を検出するステップ；および／または
    （ｉｉ）請求項１記載の核酸分子のヌクレオチド配列における、または同時分離領域における、少なくとも１つのマーカー座位を検出するステップ；ならびに
    （ｉｉｉ）任意選択で、セルコスポラ・ベティコラ抵抗性植物を選択するステップ
    のうちの少なくともステップ（ｉ）またはステップ（ｉｉ）を含み、
    ここで、前記同時分離領域は、請求項２記載のポリペプチドにより与えられるセルコスポラ・ベティコラ抵抗性といっしょに、または請求項１記載の核酸分子といっしょに同時分離する亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスのゲノム領域であり、前記同時分離領域は、
    ａ）マーカーｓｘｈ０６７８ｓ０１およびｓ４ｐ０２６４ｓ０１を含み、かつそれらに隣接されているか、または
    ｂ）配列番号７４および／または７５の配列を含むことを特徴とする、方法。
13. （ｉ）請求項５記載の植物を準備すること、請求項８から１２までのいずれか１項記載の方法により亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物を製造すること、または請求項１２記載の方法により亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物を特定しかつ選択すること、および
    （ｉｉ）（ｉ）の植物またはその子孫を栽培すること
    を含む、亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物を栽培する方法であって、
    栽培された植物のセルコスポラ・ベティコラ侵襲に対抗する、方法。

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