JP2019524135A - 叢根病に対する耐性遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
叢根病(リゾマニア)は、世界中に広がる経済的に最も重大なテンサイの病気であり、それにより50%以上の収穫高損失が引き起こされることがある。「叢根病」とも呼ばれるその病気は、「ビート壊疽性葉脈黄化ウイルス」(BNYVV)により引き起こされ、土壌原生動物のポリミクサ・ベタエ(Polymyxa betae)により媒介される。BNYVV感染は、細根および側根の増殖の増加、そして糖含量が低下した大幅に小さくなった根の本体の形成で現れる。感染した植物は、吸水力の低下を示すため、より乾燥ストレスを受けやすい。植物全体に感染が広がると、葉脈の黄化、壊死性の病変、および葉上の黄斑が引き起こされる。その病気の根治的撲滅は他のウイルス性の病気の場合のように可能ではないため、耐性品種の栽培によってのみ損害を食い止めることができるにすぎない。したがってリゾマニアに対する遺伝的耐性を有する遺伝子型の開発は、テンサイの品種改良のためには決定的に重要である。
本発明は、植物、特にフダンソウ属の植物において病原体、特に「ビート壊疽性葉脈黄化ウイルス(BNYVV)」に対する耐性を与えることができる該植物において発現されるポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明はさらに、前記核酸分子もしくはその部分を含む植物、特に遺伝子導入植物、植物細胞、植物器官、植物組織、植物部分、または植物の種子、および内因性核酸分子において1つ以上の突然変異を導入することにより前記耐性が与えられるBNYVV耐性植物もしくはその部分に関する。そのような遺伝子導入植物または植物細胞およびBNYVV耐性の非遺伝子導入植物の製造方法も同様に本発明に含まれる。さらに本発明はまた、BNYVV耐性の植物の特定および選抜のためのマーカーベースの方法、ならびに病原体BNYVVによる感染の防除のための方法を含む。
(a)配列番号2によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくは配列番号2と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列の1つ以上の突然変異に基づき少なくとも1つのアミノ酸交換、好ましくは位置307のリジン(K)および/もしくは位置437のグルタミン(Q)でのアミノ酸交換が存在するヌクレオチド配列、
(b)配列番号1による配列を含むか、もしくは配列番号1と相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、1つ以上の突然変異に基づき、アミノ酸交換、好ましくは位置919〜921および/もしくは1309〜1311でのアミノ酸交換をもたらす少なくとも1つのヌクレオチド交換が存在するヌクレオチド配列、
(c)(a)もしくは(b)によるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および/もしくは付加により、(a)もしくは(b)によるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドから誘導されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(d)ヌクレオチド配列であって、
(i)配列番号4のアミノ酸位置558〜594、有利には配列番号4のアミノ酸位置542〜594、
(ii)配列番号4のアミノ酸位置604〜634、有利には配列番号4のアミノ酸位置582〜634、
(iii)配列番号4のアミノ酸位置760〜790、
(iv)配列番号4のアミノ酸位置838〜869、
に相当する少なくとも1つのロイシンリッチドメイン(LRR)、および/もしくは
(I)配列番号4のアミノ酸位置177〜289、
(II)配列番号4のアミノ酸位置156〜263、
に相当する少なくとも1つのAAA ATPアーゼドメイン
をコードするヌクレオチド配列、
から選択されるヌクレオチド配列を含み、好ましくは前記病原体は、ビート壊疽性葉脈黄化ウイルス(BNYVV)であり、かつ前記植物は、フダンソウ属の植物、好ましくはテンサイ(ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)L.)であることを特徴とする、核酸分子。
(a)位置919でAに代えてC、
(b)位置1310でAに代えてG、
(c)位置1697でGに代えてA、
(d)位置2191でCに代えてA、および/または
(e)位置2491でCに代えてT
の1つ以上を有することを特徴とする、項目[3]記載の核酸分子。
(a)植物細胞を突然変異誘発させるのに続き該突然変異誘発された植物細胞から植物を再生させる工程、または植物を突然変異誘発させる工程と、任意に
(b)内因性核酸分子中に項目[1]から[5]までのいずれかに定義される1つ以上の突然変異を有する工程(a)からの植物を特定する工程と、
を含む、BNYVV耐性の植物の製造方法。
(i)植物またはその試料において項目[1]から[5]までの1つに記載の核酸分子の存在および/もしくは発現を検出する工程、ならびに/または
(ii)項目[1]から[5]までの1つに記載の核酸分子のヌクレオチド配列中、もしくは直ぐ近くに、好ましくは第3染色体上において少なくとも1つのマーカー座を検出する工程、ならびに/または
(iii)前記植物における第3染色体上において少なくとも2つのマーカー座を検出する工程、
ここで、少なくとも1つのマーカー座は、s3e4516s05(配列番号5)から項目[1]から[5]までの1つに記載の核酸分子までの染色体区間上または該染色体区間内に局在化されており、かつ少なくとも1つのマーカー座は、項目[1]から[5]までの1つに記載の核酸分子からs3e5918s01(配列番号6)までの染色体区間上または該染色体区間内に局在化されており、任意選択で
(iv)BNYVV耐性の植物を選抜する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
本発明は、植物、特にフダンソウ属において病原体、特に「ビート壊疽性葉脈黄化ウイルス(BNYVV)」に対する耐性を与えることができる該植物において発現されるポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明は、供与体のベータ・ブルガリス亜種マリチマに由来する遺伝子の遺伝的ファインマッピング、特定、単離、および特性調査に基づき、植物、特にテンサイにおけるその遺伝子の存在は、当該植物の叢根病(WB)に対する耐性と相関し、またはその原因となり、かつそのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列は、図1Aおよび図1Bに示される本発明により特定されたNBS−LRR遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対する少なくとも1つのヌクレオチド交換またはアミノ酸交換を特徴とし、その際、好ましくは該ヌクレオチド交換またはアミノ酸交換は、図1Aおよび図1Bに示される全体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対して50%以下、有利には60%以下、より有利には70%以下、さらにより有利には80%以下、さらになおもより有利には90%以下、特に有利には95%以下を成す。本発明による核酸分子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の特に有利な実施形態は、図1Cおよび図1Dに示されており、実施例ならびに図面の説明に記載されている。
(i)植物もしくはその試料において本発明によるWB耐性を与える核酸分子の存在および/もしくは発現を検出する工程、ならびに/または
(ii)本発明によるWB耐性を与える核酸分子のヌクレオチド配列中、もしくは直ぐ近くに、好ましくは第3染色体上において少なくとも1つのマーカー座を検出する工程、ならびに/または
(iii)前記植物における第3染色体上において少なくとも2つのマーカー座を検出する工程、
ここで、少なくとも1つのマーカー座は、s3e4516s05から本発明によるWB耐性を与える核酸分子までの染色体区間上または該染色体区間内に局在化されており、かつ少なくとも1つのマーカー座は、上述の核酸分子からs3e5918s01までの染色体区間上または該染色体区間内に局在化されており、任意選択で
(iv)BNYVV耐性の植物を選抜する工程、
を含むことを特徴とする方法において、好ましくはさらに、前記少なくとも1つのマーカー座が、上記定義の突然変異の1つ以上を含むことを特徴とする方法に関する。さらなる実施形態においては、前記方法は、さらに、さらなる耐性遺伝子型、特に有利には国際公開第2014/202044号(WO2014/202044A1)に記載されるRZ−3遺伝子の相応の検出を含む。
実施例1:リゾマニア(叢根病、WB)に対して耐性を与える遺伝子(WB1)およびそれに属する感受性アレルの特定
ベータ・ブルガリス亜種マリチマの系統からの遺伝子浸透を伴うテンサイ(ベータ・ブルガリス L.)の群集において、この遺伝子浸透で、叢根病(リゾマニア)に対する耐性を与える遺伝子または遺伝子セグメントは、良好な診断値(DW)を有するマーカーによって検出することができた((a)s3e4516s05_cyt/DW=0.89(左側に隣接)および(b)s3e5918s01_ade/DW=0.91(右側に隣接))。両方のマーカーは、しかしながら、種々の系統におけるヌルアレルの発生により診断は完全なものではない。s3e4516s05とs3e5918s01との間のゲノム領域は、約100000塩基対の物理的長さに相当する0.11cMの遺伝的長さを含む。この配列領域は、高反復的であり、種々の遺伝子型において大幅な構造的変動を示し、したがってさらなる診断マーカーを開発することは非常に困難である。リゾマニア耐性を与える遺伝子セグメントの遺伝的構造が未知であることにより、さらに原因遺伝子の周辺の潜在的な「ネガティブなリンケージドラッグ」をさらに減少させることは限定的にのみ可能であるにすぎない。
Q437R 耐性遺伝子型における位置1310でのゲノム配列において「A」の代わりに「G」、これは、抵抗性のない遺伝子の位置437にコードされるグルタミン(Q)をアルギニン(R)により置き換える。
R566H 耐性遺伝子型における位置1697でのゲノム配列において「G」の代わりに「A」、これは、抵抗性のない遺伝子の位置566にコードされるアルギニン(R)をヒスチジン(H)により置き換える。
Q731K 耐性遺伝子型における位置2191でのゲノム配列において「C」の代わりに「A」、これは、抵抗性のない遺伝子の位置731にコードされるグルタミン(Q)をリジン(K)により置き換える。
P831S 耐性遺伝子型における位置2491でのゲノム配列において「C」の代わりに「T」、これは、抵抗性のない遺伝子の位置831にコードされるプロリン(P)をセリン(S)により置き換える。
これらは、図1を参照のこと。
近い組換体による遺伝子の上記の検証の他に、さらなる裏付けとして、RNA干渉による遺伝子の耐性作用を示すことができる(例えば、国際出願の国際公開第2014/202044号(WO2014/202044A1)の実施例(Examples)に記載されるRZ−3遺伝子の検証、または国際出願の国際公開第2011/032537号(WO2011/032537A1)の実施例(Examples)に記載されるvil遺伝子の検証を参照のこと)。このために、耐性の標準的なテンサイ遺伝子型を、二本鎖ヘアピンRNAをコードするDNA構築物で形質転換する。このdsRNAは、転写後に遺伝子サイレンシングをもたらすことができ、その遺伝子サイレンシングは、耐性のwb−R遺伝子アレルのその作用を減少または停止させることとなり、それにより以前は耐性であったテンサイ遺伝子型は、叢根病(リゾマニア)に対して感受性となるはずである。
本発明によるwb−R遺伝子の提供により、叢根病(リゾマニア)に対するより効果的な栽培、または新たな耐性の系統の開発が可能となる。本発明のwb−R遺伝子および上記の実施形態は、さらなる用途、例えば新たな耐性品種を開発することを目的とするシスジェネティックまたはトランスジェネティックなアプローチにおける耐性遺伝子アレルの利用、「遺伝子スタッキング」、つまりは用量効果に基づく耐性の向上、TILLINGまたは狙い通りのゲノム工学/遺伝子編集により遺伝子を修飾することによる新たな耐性アレルの開発、およびwb−Rと別のリゾマニア耐性遺伝子との間の相互作用を測定することによる最適な耐性を顕現する品種の開発を提供する。
Claims (15)
- 植物において病原体に対する耐性を与えることができる該植物において発現されるポリペプチドをコードする核酸分子において、前記核酸分子は、
(a)配列番号2によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくは配列番号2と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列の1つ以上の突然変異に基づき少なくとも1つのアミノ酸交換が存在し、好ましくは位置307でリジン(K)が、かつ/もしくは位置437でグルタミン(Q)が別のアミノ酸により交換されている、ヌクレオチド配列、
(b)配列番号1による配列を含むか、もしくは配列番号1と相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、1つ以上の突然変異に基づき少なくとも1つのヌクレオチド交換が存在することで、アミノ酸交換がもたらされ、好ましくは位置919〜921および/もしくは位置1309〜1311で1つ以上のヌクレオチドが交換されている、ヌクレオチド配列、
(c)(a)もしくは(b)によるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および/もしくは付加により、(a)もしくは(b)によるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドから誘導されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(d)ヌクレオチド配列であって、
(i)配列番号4のアミノ酸位置558〜594、有利には配列番号4のアミノ酸位置542〜594、
(ii)配列番号4のアミノ酸位置604〜634、有利には配列番号4のアミノ酸位置582〜634、
(iii)配列番号4のアミノ酸位置760〜790、
(iv)配列番号4のアミノ酸位置838〜869、
に相当する少なくとも1つのロイシンリッチドメイン(LRR)、および/もしくは
(I)配列番号4のアミノ酸位置177〜289、もしくは
(II)配列番号4のアミノ酸位置156〜263、
に相当する少なくとも1つのAAA ATPアーゼドメイン
をコードするヌクレオチド配列、
から選択されるヌクレオチド配列を含み、好ましくは前記病原体は、ビート壊疽性葉脈黄化ウイルス(BNYVV)であり、かつ前記植物は、フダンソウ属の植物、好ましくはテンサイ(ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)L.)である、核酸分子。 - 前記コードされるポリペプチドは、さらに(i)参照アミノ酸配列の配列番号2における位置566に相当する位置にアルギニン(R)とは異なるアミノ酸を有し、かつ/または(ii)参照アミノ酸配列の配列番号2における位置731に相当する位置にグルタミン(Q)とは異なるアミノ酸を有し、かつ/または(iii)参照アミノ酸配列の配列番号2における位置831に相当する位置にプロリン(P)とは異なるアミノ酸を有することを特徴とする、請求項1記載の核酸分子。
- 前記コードされるポリペプチドは、(i)参照アミノ酸配列の配列番号2における位置307に相当する位置にグルタミン(Q)を有し、かつ/または(ii)参照アミノ酸配列の配列番号2における位置437に相当する位置にアルギニン(R)を有し、かつ/または(iii)参照アミノ酸配列の配列番号2における位置566に相当する位置にヒスチジン(H)を有し、かつ/または(iv)参照アミノ酸配列の配列番号2における位置731に相当する位置にリジン(K)を有し、かつ/または(v)参照アミノ酸配列の配列番号2における位置831に相当する位置にセリン(S)を有することを特徴とする、請求項1または2記載の核酸分子。
- 前記核酸分子は、参照ヌクレオチド配列の配列番号1における位置に相当する位置に、以下のヌクレオチド置換:
(a)位置919でAに代えてC、
(b)位置1310でAに代えてG、
(c)位置1697でGに代えてA、
(d)位置2191でCに代えてA、および/または
(e)位置2491でCに代えてT
の1つ以上を有することを特徴とする、請求項3記載の核酸分子。 - 前記核酸分子は、配列番号4によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつ/または配列番号3によるコーディングDNA配列を含むことを特徴とする、請求項1から4までのいずれか1項記載の核酸分子。
- 請求項1から5までのいずれか1項記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項1から5までのいずれか1項記載の核酸分子を、任意に異種プロモーターの制御下に導入遺伝子として含むか、または請求項6記載のベクターを含む、遺伝子導入植物細胞、好ましくはフダンソウ属の植物の遺伝子導入植物細胞。
- 請求項7記載の植物細胞を含む、遺伝子導入植物、好ましくはフダンソウ属の遺伝子導入植物、またはその一部分。
- 請求項1から5までのいずれか1項記載の核酸分子が内因的に存在するか、または請求項1から4までのいずれか1項に定義される1つ以上の突然変異が、配列番号1による配列を含むもしくは配列番号1と相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する内因性核酸分子中に導入されている、亜種のベータ・ブルガリス亜種マリチマには属しないBNYVV耐性のフダンソウ属の植物またはその一部分。
- 前記植物は、ハイブリッド植物または倍加半数体植物であり、かつ/または前記核酸分子もしくは前記複数の突然変異の1つは、ヘテロ接合体またはホモ接合体で存在することを特徴とする、請求項8または9記載の植物。
- 上述の核酸分子またはベクターの1つ以上を導入遺伝子としてまたは内因的に含む、請求項8から10までのいずれか1項記載の植物の種子。
- 以下の工程:
(a)植物細胞を突然変異誘発させるのに続き該突然変異誘発された植物細胞から植物を再生させる工程、または植物を突然変異誘発させる工程と、任意に
(b)内因性核酸分子中に請求項1から5までのいずれか1項に定義される1つ以上の突然変異を有する工程(a)からの植物を特定する工程と、
を含む、BNYVV耐性の植物の製造方法。 - 病原体BNYVVに対して耐性であるフダンソウ属の植物の特定方法であって、以下の工程
(i)植物またはその試料において請求項1から5までのいずれか1項記載の核酸分子の存在および/もしくは発現を検出する工程、ならびに/または
(ii)請求項1から5までのいずれか1項記載の核酸分子のヌクレオチド配列中、もしくは直ぐ近くに、好ましくは第3染色体上において少なくとも1つのマーカー座を検出する工程、
ここで、前記少なくとも1つのマーカー座は、好ましくは、請求項1から4までのいずれか1項に定義される1つ以上の突然変異を含み、ならびに/または
(iii)前記植物における第3染色体上において少なくとも2つのマーカー座を検出する工程、
ここで、少なくとも1つのマーカー座は、s3e4516s05から請求項1から5までのいずれか1項記載の核酸分子までの染色体区間上もしくは該染色体区間内に局在化されており、かつ少なくとも1つのマーカー座は、請求項1から4までのいずれか1項記載の核酸分子からs3e5918s01までの染色体区間上もしくは該染色体区間内に局在化されており、任意選択で
(iv)BNYVV耐性の植物を選抜する工程、
を含む、方法。 - 請求項9もしくは10記載の植物、または請求項13記載の方法により特定され、任意選択で選抜された植物を含む植物の群集。
- フダンソウ属の植物の農業的または園芸的な栽培における病原体のビート壊疽性葉脈黄化ウイルス(BNYVV)による感染の防除のための方法であって、
I)前記フダンソウ属の植物を請求項13記載の方法により特定および選抜することと、
II)I)からの植物またはその子孫を栽培することと、
を含む、方法。
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