DE102013101617B4

DE102013101617B4 - Mittel zur Selektion und/oder Erzeugung von gegen Gelbmosaikvirose resistenter Gerste

Info

Publication number: DE102013101617B4
Application number: DE102013101617.0A
Authority: DE
Inventors: Ping Yang; Thomas Lüpken; Frank Ordon; Nils Stein
Original assignee: LEIBNIZ INST fur PFLANZENGENETIK und KULTURPFLANZENFORSCHUNG IPK; Leibniz-Institut fur Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (ipk)
Current assignee: LEIBNIZ INST fur PFLANZENGENETIK und KULTURPFLANZENFORSCHUNG IPK; Leibniz-Institut fur Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (ipk)
Priority date: 2013-02-19
Filing date: 2013-02-19
Publication date: 2018-03-08
Anticipated expiration: 2033-02-20
Also published as: DE102013101617A1

Abstract

Isolierte Nukleinsäure oder ein Fragment davon, wobei die Nukleinsäure die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5, oder eine zu der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 homologe Nukleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 80% bei Vergleich der jeweils vollständigen Längen, oder eine zur Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 5 komplementäre Nukleotidsequenz hat.

Description

Die Erfindung betrifft Mittel zur Selektion und/oder Erzeugung von Pflanzen der Gattung Hordeum (Gerste), die gegen Gelbmosaikvirose resistent sind.
Die Kulturgerste (Hordeum vulgare) ist eine weltweit angebaute Kulturpflanze und spielt eine bedeutende Rolle beispielsweise als Viehfutter und Braugerste. Die Gelbmosaikvirose hat sich in Deutschland seit ihrem ersmaligen Nachweis im Jahre 1978 zu einer der bedeutendsten Krankheiten der Wintergerste entwickelt, und wird durch verschiedene Stämme des Gerstengelbmosaikvirus (Barley yellow mosaic virus, BaYMV) und des Milden Gerstenmosaikvirus (auch Gerstenmildmosaikvirus, Barley mild mosaic virus, BaMMV) hervorgerufen, die durch den bodenbürtigen Pilz Polymyxa graminis übertragen werden. Die Krankheit verursacht Ertragsverluste von bis zu 50%, und kann nicht mit chemischen Mitteln bekämpft werden. Gersten mit Resistenz gegen die Gelbmosaikvirose sind daher von großer Bedeutung.
Resistenzgene gegen die Bymoviren BaYMV/BaMMV sind bei Gerste grundsätzlich bekannt (Friedt, W.; Humbroich, K.; Ordon, F. (2008) Genetic diversity of resistance against barley yellow mosaic virus complex in barley, Seite(n): 6, 7–12, The 10th International Barley Genetics Symposium, Alexandria, Ägypten). In europäischen Gerstensorten beruht die Resistenz hauptsächlich auf den rezessiv vererbten Resistenzgenen rym4 und rym5. Allerdings wurden diese Resistenzen bereits durch resistenzbrechende Virusstämme des BaMMV bzw. BaYMV überwunden (Habekuss, A., Kühne, T. Kramer, I. Rabenstein, F. Ehrig, F. Ruge-Wehling, B. Huth, W. Ordon, F. (2008), Identification of barley mild mosaic virus isolates in Germany breaking rym5 resistance, J. Phytopathol. 156, S. 36–41). Ein anderes Resistenzgen ist rym11, das in der Nähe des Centromers auf Chromsom 4HL lokalisiert ist (Bauer E., J. Weyen, A. Schiemann, A. Graner, F. Ordon, 1997, Molecular mapping of novel resistance genes against barley mild mosaic virus (BaMMV), Theor. Appl. Genet. 95, 1263–1269; Nissan-Azzouz, F., Graner, A., Friedt, W., Ordon, F. (2005). Fine-mapping of the BaMMV, BaYMV-1 and BaYMV-2 resistance of barley (Hordeum vulgare) accession PI1963, Theor Appl Genet 110, 212–218), das ebenfalls rezessiv vererbt wird und als einziges aus Hordeum vulgare stammendes Resistenzgen gegen alle bisher in Europa bekannten Erregerisolate der Gelbmosaikvirose (BaMMV; BaYMV) wirksam ist. Ein Beispiel für eine Gerstensorte, die eine auf rym11 basierende Resistenz aufweist, ist die Genbankherkunft Russia57 (Bauer, E., Weyen, J., Schiemann, A., Graner, A., Ordon, F. (1997) Molecular mapping of novel resistance genes against Barley Mild Mosaic Virus (BaMMV), Theoretical and Applied Genetics 95, 1263–1269).
Es besteht nach wie vor ein Bedarf an Gerstenpflanzen, die eine Resistenz gegenüber der durch den Gerstenmosaikvirus-Komplex (BaMV-Komplex, BaYMV und BaMMV) hervorgerufenen Gelbmosaikvirose aufweisen. Insbesondere ist es erstrebenswert, gegen Gerstenmosaikvirose resistente Gerstenpflanzen in einer gezielten und kontrollierten Weise selektieren und/oder erzeugen zu können.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel bereitzustellen, mit deren Hilfe Gerstenpflanzen erhalten werden können, die gegen den Gerstenmosaikvirus-Komplex resistent sind.
Zur Lösung der Aufgabe stellt die Erfindung erstmals eine Möglichkeit bereit, gezielt eine auf dem Resistenzfaktor rym11 basierende Resistenz gegen die Gelbmosaikvirose in Gerste zu erzeugen oder Gerstenpflanzen zu selektieren und/oder zu isolieren, die eine auf rym11 basierende Resistenz gegen Gelbmosaikvirose aufweisen.
Die Erfindung macht sich die überraschende Erkenntnis zu Nutze, dass ein in der Nähe des Centromers des Gerstenchromosoms 4HL gelegenes Gen, das für ein Protein-Disulfid-Isomerase-ähnliches Protein kodiert, eine Schlüsselrolle bei der Vermittlung der rym11-Resistenz gegenüber der Gelbmosaikvirose zukommt, wobei angenommen wird, dass der Resistenz ein fehlendes oder funktionsloses Proteinprodukt des Gens zu Grunde liegt. Das Protein wird im folgenden als HvPDIL5-1 bezeichnet (Hv steht für Hordeum vulgare, PDIL für protein disulfide isomerase like). Die Protein-Disulfid-Isomerase (PDI, EC 5.3.4.1) ist ein im Endoplasmatischen Retikulum (ER) vorkommendes Protein, das die Umlagerung von Disulfidbindungen in sich faltenden Proteinen katalysiert und auch als Chaperon fungiert (Wilkinson, B., Gilbert, H.F. (2004), Protein disulfide isomerase, Biochimica et Biophysica Acta 1699: 35–44, Gruber, C.W., Cemazar, M., Heras, B., Martin, J.L., Craik, D.J. (2006), Protein disulfide isomerase: the structure of oxidative folding, Trends in Biochemical Sciences 31: 455–64). Die Protein-Disulfid-Isomerase gehört zu einer Proteinfamilie, die mehr als 10 Mitglieder in Pflanzen und im Menschen umfasst (Houston, N.L., Fan, C., Xiang, Q.Y., Schulze, J.M., Jung, R., Boston, R.S. (2005), Phylogenetic Analyses Identify 10 Classes of the Protein Disulfide Isomerase Family in Plants, Including Single-Domain Protein Disulfide Isomerase-Related Proteins, Plant Physiol. 137: 762–778; Ellgaard L, Ruddock LW: The human protein disulphide isomerase family: substrate interactions and functional properties. EMBO Rep 2005, 6:28–32). Mit der vorliegenden Erfindung ist es erstmals gelungen, die Beteiligung eines Mitglieds der PDI-Proteinfamilie an einer Virusresistenz bei Pflanzen nachzuweisen und nutzbar zu machen, wobei angenommen wird, dass der auf rym11 basierenden Resistenz gegenüber Gelbmosaikvirose ein fehlendes oder funktionsloses HvPDIL5-1 zu Grunde liegt. Die Aminosäuresequenz von HvPDIL5-1 (151 Aminosäuren) ist in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 angegeben, die zugehörige kodierende Nukleinsäuresequenz des hierfür kodierenden Gens in der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1. Die genomische Nukleinsäuresequenz von HvPDIL5-1 ist in SEQ ID NO: 5 angegeben. Die genomische Sequenz enthält vier Exons: Exon 1: Positionen 1–135, Exon 2: Positionen 521–579, Exon 3: Positionen 682–856, Exon 4: Positionen 1888–1974. In der kodierenden Sequenz (SEQ ID NO: 1) entspricht dies den Positionen 1–135 (Exon 1), 136–194 (Exon 2), 195–369 (Exon 3) und 370–456 (Exon 4).
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure und Fragmente davon bereit, wobei die Nukleinsäure die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5, oder eine zu der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 homologe Nukleotidsequenz aufweist. Die Nukleinsäure kann beispielsweise auch eine zur Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 5 komplementäre Nukleotidsequenz aufweisen, oder eine Nukleinsäure sein, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure hybridisiert, die zu der Nukleinsäure mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 komplementär ist.
Die Nukleinsäure mit den in den SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenzen kodiert für das PDIL5-1-Protein aus Hordeum vulgare. Die in der SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz umfasst dabei die für das Protein HvPDIL5-1 kodierenden Bereiche des Gens ohne Introns, die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 gibt die genomische Sequenz des HvPDIL5-1-Gens wieder. Mit der vorliegenden Erfindung wird erstmals das für eine rym11-Resistenz verantwortliche Gen mit dessen Nukleotidsequenz verfügbar gemacht. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann vorteilhaft verwendet werden, um mittels biotechnologischer Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, bei Pflanzen, insbesondere bei Gerste, gezielt eine Resistenz gegenüber einem Virus zu erzeugen, das das Produkt dieses Gens benötigt, um sich in der Pflanzenzelle zu vermehren und/oder die Pflanzenzelle zu verlassen, um weitere Zellen zu infizieren. Insbesondere kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure, oder ein Fragment davon, vorteilhaft genutzt werden, um das Gen bzw. dessen Proteinprodukt in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder Teilen davon zu deaktivieren und/oder die Expression des Gens zu verhindern oder zu vermindern und/oder das Gen so zu verändern, dass kein oder ein funktionsloses oder funktionsgemindertes Protein resultiert. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure, oder Fragmente davon, kann auch vorteilhaft genutzt werden, um Pflanzen aufzufinden und/oder zu selektieren, die eine rym11-Resistenz oder eine Resistenz aufweisen, die auf einem funktionslosen/funktionsgeminderten Produkt eines homologen Gens in einer anderen Pflanze als Hordeum vulgare, z.B. Reis (Oryza sativa), beruht. Beispielsweise können anhand der zur Verfügung gestellten Sequenz geeignete Genmarker ermittelt werden. Eine weitere Möglichkeit besteht beispielsweise in der Einbringung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder Fragmenten davon, beispielsweiser komplementärer und/oder mutierter Nukleinsäuren oder Fragmente, in eine Pflanzenzelle zwecks Deaktivierung oder Funktionsminderung des Gens oder des Proteinproduktes. Mittel und Verfahren sind dem Fachmann bekannt und beinhalten beispielsweise das so genannte Gene Silencing.
Unter einer „Gerstenpflanze“ wird hier eine Pflanze der Gattung Hordeum, insbesondere eine Pflanze der Art Hordeum vulgare L., verstanden.
Unter „Resistenz“ wird hier die Widerstandsfähigkeit einer Pflanze, insbesondere einer Gerstenpflanze, gegenüber einem Pathogen wie dem Gerstenmosaikvirus-Komplex verstanden. Unter dem „Gerstenmosaikvirus-Komplex“ werden Stämme des Gerstengelbmosaikvirus (BaYMV) und des Milden Gerstenmosaikvirus (BaMMV/BaYMV) verstanden. Dabei handelt es sich um Vertreter der Bymoviren, einer Untergruppe der Potyviridae. Unter einer „Rym11-Resistenz“ wird eine Resistenz verstanden, die auf dem Vorhandensein des rezessiven Resistenzgens rym11 beruht, insbesondere eine Resistenz, die darauf beruht, dass das Proteinprodukt des Gens rym11 nicht oder nicht in ausreichender Menge gebildet wird, oder ein inaktives oder wenig aktives Proteinprodukt des Gens rym11 gebildet wird, oder ein in der Aminosäuresequenz verändertes funktionales Protein gebildet wird, dessen Interaktionsfähigkeit mit Viren des Gerstenmosaikvirus-Komplex behindert oder eliminiert ist.
Unter „Gelbmosaikvirose“ wird eine durch den Gerstenmosaikvirus-Komplex hervorgerufene Erkrankung verstanden. Symptome sind nesterartige oder auch streifige Vergilbungen der Blätter, die sich im weiteren Verlauf zu braunen von den Blattspitzen ausgehenden Nekrosen entwickeln können. Befallene Pflanzen bleiben im Wuchs zurück und zeigen eine schlechte Wurzelentwicklung.
Unter dem Begriff „Deaktivieren eines Gens oder Deaktivieren eines Produktes dieses Gens“ wird hier jede Manipulation oder Modifikation verstanden, die dazu führt, dass in einer Pflanzenzelle kein Proteinprodukt des Gens oder eine nur geringe Menge des Proteinproduktes des Gens oder ein funktionsloses oder funktionsgemindertes Proteinprodukt des Gens gebildet wird oder ein in der Aminosäuresequenz derart verändertes Protein gebildet wird, das die Wirtsfunktion erhalten ist, aber die Möglichkeit zur Interaktion mit dem Virus verhindert oder eliminiert ist. „Kein Proteinprodukt“ bedeutet hier, dass ein Proteinprodukt nicht nachweisbar ist. Unter einer „geringen Menge des Proteinproduktes“ wird dabei eine Menge verstanden, die die in einer Wildtypzelle, z.B. eine Zelle, bei der das Gen die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 aufweist, z.B. einer Zelle der Gerstensorte „Naturel“, gebildete Menge um mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60%, 70%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt um mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% unteschreitet. Wenn hier von „verminderter Expression“ gesprochen wird, ist dies gleichbedeutend mit der Bildung einer geringen Menge des Proteinproduktes im obigen Sinne. Unter einem „funktionslosen Proteinprodukt“ wird ein Protein verstanden, dass eine von dem entsprechenden Enzym im Wildtyp ausgeübte Funktion bzw. Aktivität, beispielsweise Enzymaktivität, nicht mehr hat, d.h. dessen Aktivität unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Unter einem „funktionsgeminderten Proteinprodukt“ wird ein Proteinprodukt verstanden, dessen Aktivität, z.B. enzymatische Aktivität, gegenüber dem Wildtyp um mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60%, 70%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt um mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% gemindert ist.
Deaktivieren kann dabei bedeuten, dass das Gen teilweise oder vollständig entfernt oder mutiert wurde, oder durch Eingriffe auf transkriptioneller, posttranskriptioneller, translationaler oder posttranslationaler Ebene die Bildung eines (funktionsfähigen) Produktes, z.B. eines Proteins, verhindert oder deutlich vermindert wird. Beispielsweise kann das Gen durch Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen, z.B. Punktmutationen, derart gegenüber dem Wildtypgen verändert werden, dass das Gen nicht oder deutlich vermindert transkribiert wird, oder eine mRNA gebildet wird, deren Translation zu einem funktionslosen oder deutlich funktionsgeminderten Protein führt. Die Begriffe „funktionslos“ bzw. „funktionsgemindert“ beziehen sich hier auf eine fehlende oder verminderte Funktion hinsichtlich einer Interaktion mit dem Virus, die notwendig ist, um die Vermehrung des Virus in der Zelle und/oder den Befall weiterer Zellen zu verhindern oder zu behindern. Der Begriff umfasst demnach auch eine Situation, in der ein gebildetes Protein nach wie vor die ursprüngliche Wildtypfunktion mit Blick auf die Pflanzenzelle ausübt, jedoch die Interaktion mit dem Virus derart behindert oder unterbunden ist, dass das Virus sich in der Zelle nicht vermehren und/oder die Zelle nicht verlassen kann. Deaktivieren kann insbesondere bedeuten, dass durch den Austausch (Substitution), die Deletion oder Insertion mindestens eines Nukleotids ein mutiertes Gen resultiert, das entweder nicht oder deutlich vermindert transkribiert wird. Mittel und Verfahren zur Erzeugung von Substitutionen, Deletionen und Insertionen sind dem Fachmann bekannt und können durch entsprechende Mutageneseverfahren hervorgerufen werden. Beispielsweise können Mutationen durch radioaktive Strahlung oder Chemikalien hervorgerufen werden. Beispielsweise werden bei der als TILLING („Targeted Induced Local Lesions in Genomes“) bezeichneten Methode (s. z.B. McCallum CM, Comai L, Greene EA, Henikoff S. 2000: Targeted screening for induced mutations, Nat. Biotechnol. 18(4):455–457; McCallum CM, Comai L, Greene EA, Henikoff S. 2000: Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123(2):439–442) mittels Chemikalien, z.B. Ethylmethansulfonat (EMS), Punktmutationen hervorgerufen und mittels Heteroduplexanalyse identifiziert. Mutationen können in geeigneter Weise auch mittels TALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases“) hervorgerufen werden (s. z.B. Sander, J. D.; Cade, L.; Khayter, C.; Reyon, D.; Peterson, R. T.; Joung, J. K.; Yeh, J. R. J. 2011, „Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs“, Nature Biotechnology 29 (8): 697–698). Fusionsprodukte aus Transkriptionsaktivator-ähnlichen („transcription activator-like“ TAL) Effektoren des Pflanzenpathogens Xanthomonas spp. und Restriktionsendonukleasen wie z.B. FokI bilden so genannte TALEN, die spezifisch an DNA binden und diese spalten können. Die Bindungsspezifität der TALEN wird durch polymorphe Aminosäurewiederholungen bestimmt, die angepasst werden können (s. z.B. Cermak T., Doyle, E. L., Christian, M. Wang, L., Zhang, Y., Schmidt, C., Baller, J. A., Somia, N. V., Bogdanove A. J., und Voytas, D. F. 2011, Nucleic Acids Res. 2011 September; 39(17): 7879). Radioaktive Strahlung, beispielsweise Röntgen- oder Gammastrahlung, kann zur Erzeugung von Mutationen, insbesondere Deletionen, verwendet werden (s. z.B. Tarroum, M., Khan, S. und Al-Qurainy, F. 2011, Evaluation of drought tolerance of γ-irradiated mutants of Hordeum vulgare, Journal of Medicinal Plants Research Vol. 5(14), 2969–2977; Sarduie-Nasab, S., Sharifi-Sirchi, G. R. und Torabi-Sirchi, M. H., 2010, Assessment of dissimilar gamma irradiations on barley (Hordeum vulgare spp.), Journal of Plant Breeding and Crop Science Vol. 2(4), 059–063). Auch mittels epigenetischer Veränderungen der DNA, wie insbesondere DNA-Methylierung oder Histonmodifikationen, kann ein Unterbleiben oder eine deutliche Verminderung der Transkription erreicht werden. „Deutlich vermindert“ bedeutet, dass die Bildungsrate gegenüber dem Wildtyp um mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60%, 70%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt um mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% gemindert ist. Ein Beispiel für einen posttranskriptionellen Eingriff ist die Erzeugung einer Antisense-RNA. Dem Fachmann sind andere Methoden des posttranskriptionellen Gene-Silencing (PTGS) wie beispielsweise RNA-Interferenz (RNAi) bekannt (s, z.B. Fire, A, Xu, S, Montgomery, M, Kostas, S, Driver, S, Mello, C (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature 391 (6669): 806–811).
Der Begriff „homolog“ in Bezug auf eine Nukleinsäure oder ein Protein bedeutet, dass eine Nukleinsäure in seiner Nukleotidsequenz weitgehend mit einer anderen Nukleinsäure übereinstimmt, oder dass ein Protein in seiner Aminosäuresequenz weitgehend mit einem damit verglichenen anderen Protein übereinstimmt, ohne vollständig damit identisch zu sein. Das Vorhandensein einer Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren oder Proteinen kann festgestellt werden, indem man jeweils eine Position in der einen Sequenz mit der entsprechenden Position in der anderen Sequenz vergleicht und ermittelt, ob hier identische oder ähnliche Reste vorhanden sind. Zwei miteinander verglichene Sequenzen sind homolog, wenn ein bestimmter Mindestanteil identischer oder ähnlicher Nukleotide bzw. Aminosäuren vorliegt. Identität heißt, dass beim Vergleich zweier Sequenzen an äquivalenten Stellen jeweils dasselbe Nukleotid bzw. dieselbe Aminosäure steht. Dabei kann es gegebenenfalls erforderlich sein, Sequenzlücken zu berücksichtigen, um einen möglichst guten Abgleich, insbesondere eine möglichst gute Alinierung, der Vergleichssequenzen herzustellen. Ähnliche Nukleotide/Aminosäuren sind dabei nichtidentische Nukleotide/Aminosäuren mit gleichen oder äquivalenten chemisch-physikalischen Eigenschaften. Beim Austausch eines Nukleotids (einer Aminosäure) durch ein anderes Nukleotid (eine andere Aminosäure) mit gleichen oder äquivalenten chemisch-physikalischen Eigenschaften spricht man von einem „konservativen Austausch“. Beispiele für physikalisch-chemische Eigenschaften einer Aminosäure sind beispielsweise die Hydrophobie oder die Ladung. In Zusammenhang mit Nukleinsäuren wird auch von einem ähnlichen Nukleotid bzw. einem konservativen Austausch gesprochen, wenn in einer kodierenden Sequenz ein Nukleotid in einem Kodon durch ein anderes ersetzt wird, wobei jedoch, z.B. aufgrund der Degeneration des genetischen Kodes, dieselbe Aminosäure oder eine ähnliche Aminosäure wie in der Vergleichssequenz von dem vom Austausch betroffenen Kodon kodiert wird. Dem Fachmann ist bekannt, welcher Nukleotid- bzw. Aminosäureaustausch ein konservativer Austausch ist. Zur Feststellung des Grades an Ähnlichkeit bzw. Identität zwischen zwei Nukleinsäuren wird dabei vorzugsweise von einer Mindestlänge von 60 Nukleotiden bzw. Basenpaaren, bevorzugt einer Mindestlänge von 70, 80, 90, 100, 110, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350 oder 400 Nukleotiden bzw. Basenpaaren, oder von einer Mindestlänge von 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder 95% der Nukleotide der jeweiligen Nukleotidsequenzen, bei Proteinen vorzugsweise von einer Mindestlänge von 20, bevorzugt einer Mindestlänge von 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 80 oder 100, weiter bevorzugt einer Mindestlänge von 120, 140, 160, 180 oder 200 Aminosäuren, oder von einer Mindestlänge von 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder 95% der Aminosäuren der jeweiligen Aminosäuresequenzen ausgegangen. Besonders bevorzugt wird von der vollen Länge des jeweiligen Proteins oder der jeweiligen Nukleinsäure ausgegangen. Der Grad der Ähnlichkeit oder Identität zweier Sequenzen kann beispielsweise mit Hilfe des Computerprogramms BLAST (S.F. Altschul et al. (1990), Basic Local Alignment search tool, J.Mol. Biol. 215: 403–410; s. z.B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) unter Verwendung von Standardparametern ermittelt werden. Die Feststellung einer Homologie hängt von der Länge der verglichenen Sequenzen ab. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird von Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen, deren kürzere mindestens 100 Nukleotide umfasst, ausgegangen, wenn mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens 99% der Nukleotide identisch und/oder ähnlich („identities“ oder „positives“ gemäß BLAST), vorzugsweise identisch, sind. Bei einer Sequenzlänge von 50–99 Nukleotiden wird bei einer Identität oder zumindest Ähnlichkeit von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, oder 90% bei einer Sequenzlänge von 15–49 Nukleotiden bei einer Identität oder Ähnlichkeit von mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% von Homologie zwischen den Sequenzen ausgegangen. Im Falle kodierender Nukleinsäuren wird auch von einer Homologie ausgegangen, wenn die übersetzten Aminosäuresequenzen homolog sind. Als ähnliche Aminosäuren werden insbesondere solche nichtidentischen Aminosäuren angesehen, die anhand der von dem Computerprogramm „Basic Local Alignment Search Tool“, abgekürzt BLAST, (S.F. Altschul et al. (1990), Basic Local Alignment search tool, J.Mol. Biol. 215: 403–410; s. z.B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) verwendeten BLOSUM62-Substitutionsmatrix (Henikoff, S., und Henikoff, J., Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915–10919, 1992) als „positiv“ ausgegeben werden, d.h. in der BLOSUM62-Substitutionsmatrix eine positive Punktzahl aufweisen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass eine Homologie zwischen zwei Aminosäuresequenzen vorhanden ist, wenn mindestens 55%, vorzugsweise mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens 99% der Aminosäuren identisch oder ähnlich, vorzugsweise identisch, sind. Insbesondere wird vom Vorhandensein einer Homologie zwischen zwei Sequenzen ausgegangen, wenn bei Verwendung des Computerprogramms BLAST (S.F. Altschul et al. (1990), Basic Local Alignment search tool, J.Mol. Biol. 215: 403–410; s. z.B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) unter Verwendung von Standardparametern und der BLOSUM62-Substitutionsmatrix (Henikoff, S., und Henikoff, J., Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915–10919, 1992) eine Identität oder Ähnlichkeit („Positives“), vorzugsweise Identität, von mindestens 55%, vorzugsweise mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens 99% erhalten wird. Dem Fachmann ist anhand seines Fachwissens ohne Weiteres ersichtlich, welches der verfügbaren BLAST-Programme, z.B. BLASTp oder PLASTn, für die Ermittlung der Homologie in Frage kommt. Darüber hinaus existieren noch weitere Programme, die der Fachmann kennt, und die er im Bedarfsfall bei der Beurteilung der Homologie zweier oder mehrerer zu vergleichender Sequenzen heranziehen kann. Solche Programme sind beispielsweise auf den Internetseiten des European Bioinformatics Institute (EMBL) verfügbar (s. z.B. http://www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html).
Unter einer „Nukleinsäure“ wird ein Polymer verstanden, dessen Monomere Nukleotide sind. Ein Nukleotid ist eine Verbindung aus einem Zuckerrest, einer stickstoffhaltigen heterozyklischen organischen Base (Nukleotid- oder Nukleobase) und einer Phosphatgruppe. Der Zuckerrest ist in der Regel eine Pentose, im Falle von DNA Desoxyribose, im Falle von RNA Ribose. Die Verknüpfung der Nukleotide erfolgt über die Phosphatgruppe mittels einer Phosphodiesterbrücke in der Regel zwischen dem 3'-C-Atom der Zuckerkomponente eines Nukleosids (Verbindung aus Nukleobase und Zucker) und dem 5'-C-Atom der Zuckerkomponente des nächsten Nukleosids. Der Begriff „Nukleinsäure“ umfasst beispielsweise DNA, RNA und DNA/RNA-Mischsequenzen.
Der Ausdruck „kodierende Sequenz“ ist hier so zu verstehen, dass die genomische DNA ohne Introns angegeben ist, wobei auch deletierte Nukleotide, d.h. gegenüber einer Wildtypsequenz fehlende Nukleotide, mit angegeben sein können. Sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist, steht hier der Buchstabe „N“ jeweils für ein deletiertes Nukleotid. Der Begriff „genomische Sequenz“ bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, wie sie im Genom vorliegt, im Falle eines Gens also einschließlich Introns. Auch bei einer genomischen Sequenz können im Vergleich zu einer Ursprungssequenz, d.h. einer Wildtypsequenz, fehlende Nukleotide angegeben sein, wobei hierfür ebenfalls der Buchstabe „N“ angegeben ist.
Unter einer „isolierten Nukleinsäure“ wird eine aus ihrer natürlichen bzw. ursprünglichen Umgebung herausgelöste Nukleinsäure verstanden. Der Begriff umfasst auch eine synthetisch hergestellte Nukleinsäure.
Unter einem „Fragment“ oder einer „Teilsequenz“ einer Nukleinsäure ist hier ein zusammenhängender Teilabschnitt der Nukleinsäure zu verstehen, d.h. ein Sequenzabschnitt aus aufeinander folgenden Nukleotiden der Nukleinsäure. Fragmente können z.B. in einem RNAi- oder miRNA-Ansatz vorteilhaft eingesetzt werden, wobei die Sequenz dabei beispielsweise in Antisinn(„antisense“)-Richtung eingesetzt werden kann. „Antisinnrichtung“ bzw. „Antisinnorientierung“ einer Nukleinsäuresequenz, z.B. einer DNA-Sequenz, bedeutet hier beispielsweise, dass eine Transkription der DNA-Sequenz zu einer mRNA führt, deren Nukleotidsequenz komplementär ist zu einer natürlichen (endogenen) mRNA, so dass deren Translation durch Anlagerung der komplementären RNA behindert oder verhindert wird. Unter einer „Antisinn-RNA“ bzw. „Antisense-RNA“ wird eine zu einer bestimmten mRNA oder zu bestimmten anderen RNAs komplementäre RNA verstanden. „Antisinnrichtung“ oder „Antisinnorientierung“ einer mRNA-Sequenz bedeutet daher, dass die mRNA eine Sequenz aufweist, die komplementär ist zu einer mRNA-Sequenz, deren Translation somit durch Anlagerung behindert oder verhindert werden kann. Bevorzugt umfasst ein Fragment oder eine Teilsequenz einer Nukleinsäure mindestens 10 oder 15, vorzugsweise mindestens 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 oder mindestens 100 aufeinander folgende Nukleotide, weiter bevorzugt mindestens 150, 200, 250, 300, 350, 400 oder 450 aufeinander folgende Nukleotide. Bezogen auf ein Protein bedeutet „Fragment“ eine zusammenhängende Teilsequenz von mindestens 5, vorzugsweise mindestens 10, 15, 20, 25, 30, 40 oder 50, besonders bevorzugt mindestens 60, 70, 80, 90 oder mindestens 100 aufeinander folgenden Aminosäuren. Wenn hier in Bezug auf einen Primer von einer Teilsequenz gesprochen wird, bedeutet dies bevorzugt eine Teilsequenz aus mindestens 15, bevorzugt mindestens 18, besonders bevorzugt mindestens 19 oder 20, vorzugsweise 20–30, 20–29 oder 20–28, d.h. 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 oder 28 zusammenhängenden Nukleotiden.
Unter „Hybridisieren“ oder „Hybridisierung“ wird ein Vorgang verstanden, bei dem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül sich an einen komplementären Nukleinsäurestrang anlagert, d.h. mit diesem eine Basenpaarung eingeht. Standardverfahren zur Hybridisierung sind beispielsweise in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3. Aufl. 2001) beschrieben. Vorzugsweise wird darunter verstanden, dass mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Basen des Nukleinsäurestranges eine Basenpaarung mit dem komplementären Nukleinsäurestrang eingehen. Die Möglichkeit einer solchen Anlagerung hängt von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ab. Der Begriff „Stringenz“ bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen. Hohe Stringenz ist dann gegeben, wenn eine Basenpaarung erschwert ist, niedrige Stringenz, wenn eine Basenpaarung erleichtert ist. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen hängt beispielsweise von der Salzkonzentration bzw. Ionenstärke und der Temperatur ab. Generell kann die Stringenz durch eine Erhöhung der Temperatur und/oder eine Erniedrigung des Salzgehaltes erhöht werden. Unter „stringenten Hybridisierungsbedingungen“ sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung überwiegend nur zwischen homologen Nukleinsäuremolekülen stattfindet. Der Begriff „Hybridisierungsbedingungen“ bezieht sich dabei nicht nur auf die bei der eigentlichen Anlagerung der Nukleinsäuren herrschenden Bedingungen, sondern auch auf bei den anschließenden Waschschritten herrschenden Bedingungen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Bedingungen, unter denen überwiegend nur solche Nukleinsäuremoleküle hybridisieren, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Sequenzidentität aufweisen. Wenig stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 × SSC bei 37 °C und anschließendes mehrfaches Waschen in 1 x SSC bei Raumtemperatur. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 × SSC bei 65 °C und anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 × SSC bei 65 °C für insgesamt etwa 1 Stunde.
Der Begriff „komplementär“ bezieht sich auf die Fähigkeit von Purin- und Pyrimidinnukleotiden, über Wasserstoffbrückenbindungen miteinander Basenpaare zu bilden. Komplementäre Basenpaare sind beispielsweise Guanin und Cytosin, Adenin und Thymin sowie Adenin und Uracil. Ein komplementärer Nukleinsäurestrang ist dementsprechend ein Nukleinsäurestrang, der durch Paarung mit komplementären Basen eines anderen Nukleinsäurestrangs einen Doppelstrang bilden kann.
Mit dem Begriff „Gen“ ist hier insbesondere eine für ein Protein HvPDIL5-1 (SEQ ID NO: 2) kodierende Nukleinsäure gemeint, wobei sich der Begriff sowohl auf die genomische DNA mit Introns als auch auf die kodierende DNA ohne Introns bezieht. Der Begriff bezieht sich insbesondere auf die in den SEQ ID NO: 1, 5 angegebenen Nukleinsäuren, schließt aber auch zu dem Gen homologe Gene ein, d.h. Gene, die für ein zu HvPDIL5-1 homologes Protein kodieren.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung auch eine vorzugsweise isolierte Nukleinsäure bereit, umfassend eine Nukleotidsequenz, die gegenüber der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 durch Substitution, Insertion oder Deletion in mindestens einem Nukleotid mutiert ist und für ein funktionsloses oder funktionsgemindertes HvPDIL5-1-Protein oder ein dazu homologes Protein kodiert, mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäure nicht eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13 aufweist.
Die Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 6–13 sind Sequenzen von mutierten Genen gemäß SEQ ID: 1 oder SEQ ID NO: 5 aus natürlich vorkommenden Pflanzen, die eine Resistenz gegen Gelbmosaikvirose aufweisen. Die Allele der resistenten Varietät W757-112 (rym11-a) sind in den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 6 (kodierende Sequenz) und SEQ ID NO: 7 (genomische Sequenz) und die Allele der resistenten Varietät Russia57 (rym11-b) in den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 8 (kodierende Sequenz) und SEQ ID NO: 9 (genomische Sequenz) angegeben. Der Ausdruck „kodierende Sequenz“ ist in diesem Zusammenhang so zu verstehen, dass hier die genomische DNA ohne Introns angegeben ist, wobei auch deletierte Nukleotide, d.h. gegenüber der Wildtypsequenz (SEQ ID NO: 1, 5) fehlende Nukleotide, mit angegeben sind. Für deletierte Nukleotide ist jeweils der Buchstabe „N“ angegeben. W757-112 weist beispielsweise im Vergleich zur Wildtypsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 eine Deletion von 299 deletierten Basenpaaren (Positionen 1–299) für den kodierenden Bereich und von 786 deletierten Basenpaaren (Positionen 1–786) für die genomische DNA auf. Die Deletion umfasst somit das Exon 1 und 2 sowie einen Teil (105 Basenpaare) des Exons 3. Russia57 weist eine 17 Basenpaare umfassende Deletion im Exon 3 gemäß SEQ ID NO: 1, 5 auf (Positionen 315–331 in der kodierenden Sequenz, Positionen 802–818 in der genomischen Sequenz). Die Sequenzen zweier weiterer natürlich vorkommender resistenzvermittelnder Allele (rym11-c und rym11-d) sind in den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 10–13 (rym11-c: SEQ ID NO: 10–11; rym11-d: SEQ ID NO: 12–13) angegeben. Die Sequenzen mit den SEQ ID NO: 10 und 12 betreffen kodierende Sequenzen, die Sequenzen mit den SEQ ID NO: 11 und 13 genomische Sequenzen. Bei der kodierenden Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10 ist eine Deletion an Position 185 vorhanden, die einer Deletion an Position 570 in der genomischen Sequenz (SEQ ID NO: 11) entspricht. Bei der kodierenden Sequenz gemäß den SEQ ID NO 12 ist eine Substitution von G zu A an Position 182 vorhanden, entsprechend einer G-A-Substitution an Position 587 in der genomischen Sequenz (SEQ ID NO: 13).
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die gegenüber der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 durch Substitution, Insertion oder Deletion in mindestens einem Nukleotid mutiert ist und für ein funktionsloses oder funktionsgemindertes HvPDIL5-1-Protein kodiert, wobei die Substitution, Insertion oder Deletion vorzugsweise in Exon 1, 2, 3 oder 4, bevorzugt 1, 2 oder 3, besonders bevorzugt 2 oder 3 liegt, vorzugsweise mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäure nicht eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 6–13 aufweist. Wenn hier auf Exons Bezug genommen wird, bezieht sich dies auf die Wildtypsequenz (SEQ ID NO: 1). Exon 2 erstreckt sich über die Positionen 136–194 (genomisch 521–579), Exon 3 über die Positionen 195–369 (genomisch 682–856). Bevorzugt liegt die Substitution, Insertion oder Deletion zwischen den Positionen 136–300 (genomisch 521–787), weiter bevorzugt zwischen den Positionen 136–280 (genomisch 521–767), 136–260 (genomisch 521–747), 160–260 (genomisch 545–747) oder 160–240 (genomisch 545–727).
In einer bevorzugten Ausführungsform hat oder umfasst die Nukleinsäure eine der in den SEQ ID NO: 14, 15, 16 oder 17 angegebenen Sequenzen. Die Sequenzen betreffen durch EMS-Mutagenese erzeugte und durch TILLING identifizierte resistenzvermittelnde Allele. Kodierende Sequenzen finden sich in den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 14 und 16, die zugehörigen genomischen Sequenzen in den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 15 und 17. Wie bereits angegeben, weisen die Allele Punktmutationen auf, die zu einem funktionslosen oder zumindest wesentlich funktionsgeminderten Genprodukt führen. Die Punktmutationen führen zu Stopcodons, so dass angenommen wird, dass kein vollständiges Proteinprodukt gebildet wird. Die Allele werden hier als „rym11-Tilling-9699“ oder kurz „rym11-9699“ (SEQ ID NO:14, 15) und „rym11-Tilling-10253“ oder kurz „rym11-10253“ (SEQ ID NO:16, 17) bezeichnet.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung molekulare Genmarker, die den betroffenen Genlokus auf Chromosom 4HL direkt allelspezifisch nachweisen und so eine Resistenz gegen Gelbmosaikvirose anzeigen. Die Genmarker werden je mit einem Primersatz (s. Tabelle 1a, 1b) mit Hilfe einer Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert und sind codominant auswertbar. In allen Fällen wird der allelspezifische Sequenzunterschied zwischen Wildtyp- und Resistenzallel des Gens HvPDIL5-1 direkt über PCR oder durch eine nachgeschaltete enzymatische Spaltung (Restriktionsverdau) des Amplifikationsproduktes und anschliessende Gelelektrophorese (oder ein vergleichbares chromatographisches Verfahren) sichtbar gemacht. Die Marker sind unter standardisierten PCR-Bedingungen amplifizierbar, wobei Thermocycler-bedingte Optimierungen erforderlich sein können. In der folgenden Tabelle 1a sind die Primersequenzen angegeben, Tabelle 1b zeigt die nachweisbaren Fragmente und deren Fragmentlängen. Tabelle 1a: Diagnostische PCR-basierte Genmarker für rym11-Resistenzallele. Primersequenzen (in 5’-3’-Richtung), Primer-Namen und die zugehörigen Sequenzkennzahlen sind angegeben. Die ggfs. nach Verdau mit einem Restriktionsenzym nach Gelelektrophorese nachweisbaren Fragmente sind in Tabelle 1b angegeben.

Tabelle 1b: Mit Hilfe der Primer gemäß Tabelle 1a nachweisbare Fragmente des Wildtypallels bzw. des jeweiligen Resistenzallels.
Im Folgenden sind für die allelspezifischen diagnostischen Marker gemäß Tabellen 1a, b die beispielhaften Analysenbedingungen wiedergegeben:
A. rym11-a_ C_205243

PCR: 10 min bei 94 °C; 12 Zyklen mit 40 s bei 94 °C, 40 s bei 62 °C, 2 min bei 72 °C (–0,5 °C/Zyklus); 45 Zyklen mit 40 s bei 94 °C, 40 s bei 56 °C, 2 min bei 72 °C; abschließend 72°C für 10 min.
Elektrophorese (nach Sambrook J, Russel D (2001) Molecular cloning – a laboratory manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York): 1 % Agarosegel, 1-fach konzentrierter TBE Puffer

B. rym11-a

PCR: 10 min bei 94°C; 6 Zyklen mit 1 min bei 94°C, 1 min bei 64°C bis 58°C (–1°C pro Zyklus), 3 min bei 72°C, dann 35 Zyklen mit 1 min bei 94°C, 1 min bei 58°C, 3 min bei 72°C, abschliessend 5 min bei 72°C
Elektrophorese (s.o.): 1,5% Agarosegel, 1-fach konzentrierter TBE Puffer

C. rym11-b

PCR: 10 min bei 94°C; 6 Zyklen mit 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 64°C bis 58°C (–1°C pro Zyklus), 30 sec bei 72°C, dann 35 Zyklen mit 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 58°C, 30 sec bei 72°C, abschliessend 5 min bei 72°C
Elektrophorese (s.o.): 4% Agarosegel, 1-fach konzentrierter TBE Puffer

D. rym11-c

PCR: 10 min bei 94°C; 6 Zyklen mit 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 64°C bis 58°C (–1°C pro Zyklus), 1 min bei 72°C, dann 35 Zyklen mit 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 58°C, 1 min bei 72°C, abschliessend 5 min bei 72°C

Restriktionsverdau:

Reagenzien Volumen (µl)

PCR Produkte 10

NEB Puffer 4 (10X) 2

MseI (10U/µl R0525L, NEB) 0,2 (2U)

BSA (100X) 0,2

H₂O 7,6

Reaktionsvolumen 20

Elektrophorese (s.o.): 1,5% Agarosegel, 1-fach konzentrierter TBE Puffer
E. rym11-d

Restriktionsverdau:

Reagenzien Volumen (µl)

PCR Produkte 10

NEB Puffer 3 (10X) 2

DdeI (10U/µl, R0175L, NEB) 0,2 (2U)

H₂O 7,8

Reaktionsvolumen 20

Elektrophorese (s.o.): 1,5% Agarosegel, 1-fach konzentrierter TBE Puffer
F: rym11-9699

PCR: 10 min bei 94°C; 6 Zyklen mit 20 sec bei 94°C, 20 sec bei 64°C bis 58°C (–1°C pro Zyklus), 25 sec bei 72°C, dann 35 Zyklen mit 20 sec bei 94°C, 20 sec bei 58°C, 25sec bei 72°C, abschliessend 5 min bei 72°C

Restriktionsverdau:

Reagenzie n Volumen (µl)

PCR Produkte 10

NEB Puffer 3 (10X) 2

DdeI (10U/µl, R0175L, NEB) 0,2 (2U)

H₂O 7,8

Reaktionsvolumen 20

Elektrophorese (s.o.): 3% Agarosegel, 1-fach konzentrierter TBE Puffer
G. rym11-10253

Restriktionsverdau:

Reagenzien Volumen (µl)

PCR Produkte 10

NEB Puffer 3 (10X) 2

NcoI (10U/µl, R0193L, NEB) 0,2 (2U)

H2O 7,8

Reaktionsvolumen 20

Elektrophorese (s.o.): 4% Agarosegel, 1-fach konzentrierter TBE Puffer

In der folgenden Tabelle 2 sind beispielhafte geeignete PCR-Bedingungen angegeben: Tabelle 2: PCR-Bedingungen

PCR Reagenzien	Volumen (µl)
Template DNA (10–20 ng/µl)	2
10 X PCR-Puffer (MgCl₂ enthalten, z.B. Qiagen, Deutschland)	2
dNTPs (je 2 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP, z.B. Fermentas, Deutschland)	2
Primer-F (5 µM)	2
Primer-R (5 µM)	2
Hot-star or Taq polymerase (z.B. Qiagen, Deutschland)	0,1 (0,5 U)
Entionisiertes steriles H₂O	9,9
Gesamtvolumen	20

Die Erfindung stellt damit Genmarker bereit, die unmittelbar mit dem Genlokus für rym11-Resistenz gekoppelt sind und sich hervorragend dafür eignen, beispielsweise resistente Gerstenpflanzen aufzufinden, zu selektieren und/oder zu isolieren. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Genmarker verwendet werden, um ein Screening nach resistenten Gerstenlinien durchzuführen. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verwendung zur Isolierung weiterer Nukleinsäuren, die eine rym11-Resistenz vermitteln. Neben den hier angeführten allelspezifischen PCR-Nachweissystemen sind gemäss der Erfindung weitere funktionelle, zum spezifischen Nachweis rym11-basierter Resistenzallele geeignete, Primerkombinationen beispielsweise anhand der genomischen Sequenz des Gens HvPDIL5-1 (SEQ ID NO: 5), vorzugsweise inklusive der jeweils 2000 Basenpaare 5’seitig des ATG-Startcodons sowie 3‘-seitig des Stopcodons entwickelbar. Die Erfindung betrifft daher auch einen Genmarker, der mit einem Genlokus auf Chromosom 4HL einer Gerstenpflanze gekoppelt ist und eine Resistenz gegen Gelbmosaikvirose anzeigt, wobei der Genmarker amplifiziert wird mit einem Primersatz, umfassend einen Forward-Primer und einen Reverse- Primer mit einer Teilsequenz von einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 5, 34, 35 oder 36 und/oder einer zu einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 5, 34, 35 oder 36 komplementären Teilsequenz. Geeignete Primerkombinationen kann der Fachmann anhand seines Fachwissens und der hier bereit gestellten Erkenntnisse ermitteln. Vorzugsweise liegt zwischen den Teilsequenzen für ein Primerpaar aus Forward- und Reverse-Primer eine vom Fachmann im Einzelfall anhand seines Fachwissens ermittelbare Anzahl von Nukleotiden.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Gerstenpflanze mit Resistenz gegen Gelbmosaikvirose, umfassend den Schritt des Deaktivierens eines Gens oder Deaktivierens eines Produktes dieses Gens, wobei das Gen auf Chromosom 4HL der Gerstenpflanze lokalisiert ist und die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5, eine dazu homologe Nukleotidsequenz oder eine mit einer zur Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist oder umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst der Schritt des Deaktivierens des Gens oder Genprodukts daher das Verhindern oder Vermindern der Expression des Gens, die Deletion des gesamten Gens und/oder das Erzeugen eines funktionslosen oder funktionsgeminderten Proteinproduktes des Gens. Besonders bevorzugt umfasst der Schritt des Deaktivierens des Gens oder Genprodukts das Erzeugen ein oder mehrerer Substitutionen, z.B. Punktmutationen, und/oder Deletionen und/oder Insertionen in dem Gen, und/oder das Verhindern der Expression des Gens mittels Gene-Silencing.
In einer Ausgestaltung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den Schritt des Erzeugens ein oder mehrerer Substitutionen und/oder Deletionen und/oder Insertionen in dem Gen in einer Gerstenzelle, einem Gerstenembryo, einem Gerstensamen oder einem Teil einer Gerstenpflanze, und Regenerierens einer Gerstenpflanze aus der Gerstenzelle, dem Gerstenembryo, Gerstensamen oder dem Teil der Gerstenpflanze. Beispielsweise können in dem Gen eine oder mehrere Punktmutationen erzeugt werden, die zu einem Funktionsverlust des Gens führen. Zum Beispiel kann die Deletion, Insertion oder Substitution schon eines Nukleotids dazu führen, dass ein für eine Aminosäure kodierendes Codon zu einem Stopcodon wird. Beispiele für eine solche Mutation sind in den beiden Allelen rym11-c und rym11-d gemäß SEQ ID NO: 10–13 zu finden. Bei rym11-c führt die Deletion eines Nukleotids, bei rym11-d die Substitution eines Nukleotids zur Entstehung eines Stopcodons. Eine Deletion, Insertion oder Substitution kann aber auch durch eine dadurch bewirkte Änderung des Splicing zu einem funktionslosen oder funktionsgeminderten Genprodukt führen. Punktmutationen können beispielsweise durch mutagene Substanzen, z.B. Ethylmethansulfonat (EMS), hervorgerufen werden. Verfahren und Mittel, die zur Erzeugung und gegebenenfalls Identifikation geeigneter Mutationen verwendet werden können, sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf TILLING oder TALEN. In Frage kommt auch die Erzeugung von Mutationen, z.B. Deletionen, mittels Bestrahlung. Mit Hilfe des TILLING-Verfahrens können beispielsweise mittels mutagener Substanzen wie z.B. Ethylmethansulfonat (EMS) Punktmutationen in dem Wildtypgen hervorgerufen und anschließend Pflanzen selektiert werden, die eine geeignete, d.h. resistenzvermittelnde Mutation aufweisen. Dieser Ansatz hat gegenüber Verfahren, die beispielsweise die Einführung von Merkmalen mittels Vektoren beinhalten, den Vorteil, dass hier keine unbekannten und gegebenenfalls unerwünschten Gene, die mit dem eigentlich gewünschten Gen oder Merkmal gekoppelt sind, eingeführt werden. Diese als „Linkage drag“ bezeichneten mit dem gewünschten Merkmal gekoppelten Merkmale können mit dieser Methode vermieden werden. Selbstverständlich ist aber auch die vektorgestützte Einführung von beispielsweise Nukleinsäuren, z.B. Antisense-Nukleinsäuren, die nach ihrer Transkription mit der mRNA von HvBDIL5-1 hybridisieren und deren Translation verhindern, von der Erfindung umfasst. Geeignete Vektoren und Verfahren zur Einführung von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
Mittels TILLING wurden durch das erfindungsgemäße Verfahren die Resistenzallele erzeugt und isoliert, deren Sequenzen unter den SEQ ID NO: 14–17 angegeben sind. Kodierende Sequenzen sind in den Sequenzen mit der SEQ ID NO:14 und 16 angegeben, genomische Sequenzen in den Sequenzen mit der SEQ ID NO:15 und 17 angegeben. Das Allel (rym11-Tilling-9699 oder kurz rym11-9699) mit der in SEQ ID NO:14, 15 angegebenen Sequenz weist in Exon 3, genauer an Position 216 (bezogen auf die kodierende Sequenz, SEQ ID NO:14; bezogen auf die genomische Sequenz, SEQ ID NO: 15, Position 703) eine Punktmutation von G zu A auf, das Allel (rym11-Tilling-10253 oder kurz rym11-10253) mit der in SEQ ID NO:16, 17 angegebenen Sequenz weist in Exon 2, genauer an Position 183 (bezogen auf die kodierende Sequenz, SEQ ID NO:16; bezogen auf die genomische Sequenz, SEQ ID NO: 17, Position 568) eine Punktmutation von G zu A auf. Beide Punktmutationen führen zu Stopcodons.
Besonders bevorzugt werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein oder mehrerer Substitutionen und/oder Deletionen und/oder Insertionen in Exon 2 und/oder 3 erzeugt, wobei die resultierende Nukleinsäure bevorzugt nicht eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 6–13 aufweist. Wenn hier auf Exons Bezug genommen wird, bezieht sich dies auf die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 angegebene Wildtypsequenz oder auf dazu homologe Strukturen in zur Wildtypsequenz homologen Sequenzen oder Sequenzen, die mit einer zur Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren. In der Wildtypsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 erstreckt sich Exon 2 über die Positionen 136–194 (genomisch 521–579), Exon 3 über die Positionen 195–369 (genomisch 682–856). In der genomischen Wildtypsequenz gemäß SEQ ID NO: 5 erstreckt sich Exon 2 über die Positionen 521–579, Exon 3 über die Positionen 682–856. Bevorzugt wird die Substitution, Insertion oder Deletion zwischen den Positionen 136–300 (genomisch 521–787), weiter bevorzugt zwischen den Positionen 136–280 (genomisch 521–767), 136–260 (genomisch 521–747), 160–260 (genomisch 545–747) oder 160–240 (genomisch 545–727) erzeugt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch eine Pflanze mit Resistenz gegen Potyviren, insbesondere eine Pflanze der Familie der Süßgräser (Poaceae, Gramineae), beispielsweise eine Weizen-, Roggen-, Gersten-, Hafer-, Hirse-, Mais- oder Reispflanze, insbesondere eine Gerstenpflanze. Besonders bevorzugt ist die Pflanze eine Gerstenpflanze mit Resistenz gegen Gelbmosaikvirose, die nach einem Verfahren gemäß dem vorhergenden Aspekt der Erfindung erhalten wurde oder erhältlich ist, mit der Maßgabe, dass das bei der Pflanze auf Chromosom 4HL liegende Gen oder Allel nicht eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 6–13 aufweist. Die Pflanze, beispielsweise Gerstenpflanze, kann beispielsweise ein Allel gemäß einer der SEQ ID NO: 14, 15, 16 oder 17 umfassen, oder ein zu dem hier offenbarten HvPDIL5-1 orthologes Allel mit einer Mutation, die Resistenz gegenüber einem Potyvirus vermittelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Gerstenpflanze oder ein Teil davon mindestens eine Punktmutationen und/oder Deletion und/oder Insertion im Exon 2 und/oder im Exon 3 des Gens auf, vorzugsweise, bezogen auf die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, zwischen den Positionen 136–300, besonders bevorzugt zwischen den Positionen 136–280, 136–260, 160–260 oder 160–240, und/oder das Gen ist vollständig entfernt, und/oder das Gen weist eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 14–17 auf. Selbstverständlich kann es sich bei dem Gen auch um ein Gen handeln, das zu dem in SEQ ID NO: 1 bzw. in SEQ ID NO: 5 angegebenen Gen homolog ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch einen Kit, beispielsweise Analysenkit, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder

a. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 4, und/oder
b. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 18 und einen Revers-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 19, und/oder
c. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 20 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 21, und/oder
d. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 22 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 23, und/oder
e. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 24 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 25, und/oder
f. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 26 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 27, und/oder
g. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 28 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 29, und/oder
h. einen Forward-Primer und einen Reverse-Primer mit einer Teilsequenz von einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 5, 34, 35 oder 36 und/oder einer zu einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 5, 34, 35 oder 36 komplementären Teilsequenz.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Figuren rein zu Veranschaulichungszwecken näher beschrieben.
1. Nachweis des Resistenzallels rym11-a mittels PCR und Gelelktrophorese. Ergebnis einer gelelektrophoretischen Auftrennung von DNA anfälliger (Naturel, Nat/W757), und resistenter (W757-112) Gerstenpflanzen. Die Gersten-Akzession W757-112 ist homozygot rezessiv für rym11. Anfällige heterozygote Pflanzen, d.h. Kreuzungen von Naturel und W757-112, sind mit „Nat/W757“ bezeichnet. Water = Wasser (Kontrolle). Die Primerkombination C_205243_E-1f (Forward-Primer) und C_205243_4730r (Reverse-Primer) wurde zur Amplifikation des Markers verwendet.
2. Ergebnis einer gelelektrophoretischen Auftrennung von DNA diverser Wintergerstensorten und Gersten-Akzessionen mit dem erfindungsgemäßen Marker. Naturel = Anfällige Sorte „Naturel“, W757 = resistente Akzession W757-112, water = Wasser (Kontrolle).
3: TILLING-Analyse des Gens HvPDIL5-1. PCR Produkte gewonnen mit der Primer-Kombination Till_A1_F/R wurden mittels Mutation Discovery Kit der Firma Advance Analytical analysiert und aufgetrennt. Die offenen Pfeilköpfe zeigen das gespaltene Produkt der Pflanze 10253 nach Heteroduplexanalyse und Kapillarelektrophorese an. Die geschlossenen Pfeilköpfe markieren Pflanze 10453 und die fett umrandeten und schraffierten Pfeilköpfe markieren Pflanze 10509.
Beispiel 1. Genmarker C_205243_E1f&4730r
Für den Nachweis des Resistenzallels rym11-a mittels der Primer Kombination C_205243_E1f (SEQ ID NO: 3)/C_205243_4730r (SEQ ID NO: 4) wird zunächst genomische DNA aus Gerstepflanzen gemäß beschriebener Methoden isoliert (z.B. Graner A, Jahoor A, Schondelmaier J, Siedler H, Pillen K, Fischbeck G, Wenzel G, Herrmann RG (1991) Construction of an RFLP Map of Barley. Theor Appl Genet 83:250–256; Stein N, Herren G, Keller B (2001) A new DNA extraction method for high-throughput marker analysis in a largegenome species such as Triticum aestivum. Plant Breed 120:354–356) und in 1 × TE Puffer (pH 7.5) aufgenommen (nach Sambrook J, Russel D (2001) Molecular cloning – a laboratory manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Für den Nachweis per PCR wird eine Gebrauchslösung mit einer Konzentration von 10–20 ng/µl hergestellt, die als Matrize für die PCR Reaktion verwendet wird. PCR-Reaktionen (Volumen: 10 bzw. 20 µl) werden gemäss Tabelle 2 (s. oben) zusammengesetzt, in PCR-Reaktionsgefässe (0,2 ml, dünnwandig) pipettiert und mit dem oben angegebenen Protokoll auf einem Thermocycler (z.B.: Applied Biosystems Gene Amp PCR System 9700) inkubiert und amplifiziert. Ein Teil (z.B. 2 µl) oder der gesamte Reaktionsansatz werden anschliessend in ein 1%iges Agarosegel (1x TBE, nach Sambrook J, Russel D (2001) Molecular cloning – a laboratory manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) pipettiert und für 30 min, 150V elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wird mit Hilfe von Ethidiumbromid angefärbt (nach Sambrook J, Russel D (2001) Molecular cloning – a laboratory manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) und per UV-Transilluminator sichtbar gemacht und bildtechnisch dokumentiert. Auf diese Weise lassen sich anfällige von resistenten Herkünften, die das Allel rym11-a tragen nachweisen (1 und 2).
Beispiel 2. Nachweis induzierter Allele des Gens HvPDIL5-1 mittels TILLING.

Der Nachweis per EMS induzierter Punktmutationen erfolgt per PCR-Amplifikation, Heteroduplexanalyse und Auftrennung per Polyacrylamid(PA)-Gelelektrophorese im Plattengel- oder Kapillarformat. Als Matrizen-DNA dienen Gemische aus DNA von bis zu acht M2-Individuen in zwei-dimensionalen Pools (Gottwald S, Bauer P, Komatsuda T, Lundqvist U, Stein N (2009) TILLING in the two-rowed barley cultivar 'Barke' reveals preferred sites of functional diversity in the gene HvHox1. BMC Research Notes 2:258). Auf diese Weise liegen Einzelmutationsereignisse immer im Gemisch mit Wildtyp-Allel vor, was bei der Durchführung der PCR zu Heteroduplexbildung der amplifizierten Allele führt, die durch eine Einzelbasen-Mispaarung-spezifische Endonuklease (z.B. CelI; Till BJ, Reynolds SH, Greene EA, Codomo CA, Enns LC, Johnson JE, Burtner C, Odden AR, Young K, Taylor NE, Henikoff JG, Comai L, Henikoff S (2003) Large-scale discovery of induced point mutations with high-throughput TILLING. Genome Res 13:524–530) nachgewiesen werden kann. Die vier Exons des Gens HvPDIL5-1 lassen sich mit Hilfe der Primerkombinationen Till_A_1_F/R (Exon 1–3: 5‘-GTATCCGCCTTCTCCTCGTC-3‘ (SEQ ID NO: 30)/5‘-CCCAATGCAATAGATTCCAAC-3‘ (SEQ ID NO: 31) bzw. TILL_B_1_F/R (Exon 4: 5‘-CAGTTTGGCGATACGTTCTTT-3‘ (SEQ ID NO: 32)/5‘-AAAGTTAAGCCCGCAAATAGC-3‘ (SEQ ID NO: 32) nach folgendem Protokoll amplifizieren: Reaktionsansatz:

PCR-Ansatz
	Einzelansatz (µl)	100x (µl)	25x (µl)
H₂O bidest.	22,84	2284	571
PCR-Puffer 10x	3	300	75
dNTPs [5mM]	1,2	120	30
Primer [10 µM/µl]
forward	0,9	90	22,5
reverse	0,9	90	22,5
Taq [5 U/µl]	0,16	16	4
DNA (20 ng/µl)	1	100 x 1
Summe	30	2900
Mastermix pro Probe	29

PCR-Programm: Die Amplifikation erfolgt für 5 min bei 95 °C; 35 Zyklen mit 45 sec bei 94 °C, 45 s bei 60 °C, 1 min bei 72 °C; dann Abkühlung von 70°C auf 4°C in –0,9°C/20 sec; abschliessend kühlen bei 4°C bis zur weiteren Analyse per CelI Verdau.
Analyse per Licor PA-Gelelektrophorese:
Für die Analyse per Licor – PA-Gelektrophorese muss mindestens ein PCR-Primer mittels Fluoreszenzfarbstoff (IRD-700 oder IRD-800, Licor, Deutschland) markiert sein. Die PCR Produkte werden nach bekannten Protokollen (Gottwald S, Bauer P, Komatsuda T, Lundqvist U, Stein N (2009) TILLING in the two-rowed barley cultivar 'Barke' reveals preferred sites of functional diversity in the gene HvHox1. BMC Research Notes 2:258) mittels CelI geschnitten und per PA-Gelelektrophorese aufgetrennt und sichtbar gemacht.
Analyse per AdvanCE FS 96:
Für den CelI Verdau wird der Advanced Analytical TILLING kit verwendet (DNF-910-3000T Mutation Discovery Kit & Gel, ds D.N.A. Reagent Kit, 35–1500 bp; Firma: ADVANCED ANALYTICAL). PCR Durchführung wie oben angegeben. Die Analyse erfolgt gemäss Herstellerangaben (Advanced Analytical Technologies GmbH, Heidelberg, Deutschland) PCR Produkte werden dann in den Restriktionsansatz eingesetzt: 1) Vorbereitung Enzym-Mix (1:125 Verdünnung): für 1 Platte: 1.6 µl dsDNA Cleavage Enzyme + 198.4 µl T-Digest Buffer, 2) 2 µl (bis zu 4µl = abhängig vom PCR Produkt) PCR-Produkt +2 µl vorbereiteter Enzym-Mix gut mischen und kurz zentrifugieren, 3) 30 min bei 45°C in PCR-Cycler incubieren, danach 4°C halten und sofort auf Eis, 4) 26 µl aus Dilution Buffer in jede Probe pipettieren, gut mischen, Endvolumen 30 µl/well (30 µl Endvolumen), 5) Lagerung bei –20°C falls die Analyse nicht sofort erfolgt, 6) vor der Kapillarelektrophorese Probenplatte kurz zentrifugieren. Der Kapillarelektrophorese-Mix enthält einen DNA-Farbstoff für die Sichtbarmachung der PCR-Produkte – eine Amplifizierung mit Fluoreszenz-markierten Primern ist deshalb für diese Nachweismethode nicht erforderlich. Ein typisches Analyseergebnis mittels der AdvanCE FS96 Methode ist in 3 gezeigt.
Sequenzprotokoll – freier Text

n

= deleted nucleotide bedeutet n = deletiertes Nukleotid

Genomic DNA

= genomische DNA

Downstream sequence

= „Downstream“-Sequenz

Upstream sequence

= „Upstream“-Sequenz

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Isolierte Nukleinsäure oder ein Fragment davon, wobei die Nukleinsäure die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5, oder eine zu der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 homologe Nukleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 80% bei Vergleich der jeweils vollständigen Längen, oder eine zur Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 5 komplementäre Nukleotidsequenz hat.
Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die gegenüber der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 durch Substitution, Insertion oder Deletion in mindestens einem Nukleotid mutiert ist und für ein funktionsloses oder funktionsgemindertes HvPDIL5-1-Protein oder ein dazu homologes Protein kodiert, mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäure nicht eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 6–13 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei die Nukleinsäure mindestens eine Substitution, Insertion oder Deletion in Exon 1, 2, 3 oder 4, vorzugsweise Exon 1, 2 oder 3, besonders bevorzugt 2 oder 3 aufweist, bevorzugt, bezogen auf eine Wildtypsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, zwischen den Positionen 136–300, besonders bevorzugt zwischen den Positionen 136–280, 136–260, 160–260 oder 160–240.
Nukleinsäure nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Nukleinsäure eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 14–17 umfasst oder aufweist.
Genmarker, der mit einem Genlokus auf Chromosom 4HL einer Gerstenpflanze gekoppelt ist und eine Resistenz gegen Gelbmosaikvirose anzeigt, wobei der Genmarker amplifiziert wird mit einem Primersatz, umfassend a. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 4, und/oder b. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 18 und einen Revers-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 19, und/oder c. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 20 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 21, und/oder d. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 22 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 23, und/oder e. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 24 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 25, und/oder f. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 26 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 27, und/oder g. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 28 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 29, und/oder h. einen Forward-Primer und einen Reverse-Primer mit einer Teilsequenz von einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 5, 34, 35 oder 36 und/oder einer zu einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 5, 34, 35 oder 36 komplementären Teilsequenz.
Verwendung eines Genmarkers nach Anspruch 5 zur Selektion und/oder Isolierung einer Gerstenpflanze mit Resistenz gegen Gelbmosaikvirose.
Verwendung eines Genmarkers nach Anspruch 5 zur Isolierung einer Nukleinsäure umfassend ein Gen, das Resistenz gegen Gelbmosaikvirose vermittelt.
Kit, umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder a. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 4, und/oder b. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 18 und einen Revers-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 19, und/oder c. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 20 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 21, und/oder d. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 22 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 23, und/oder e. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 24 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 25, und/oder f. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 26 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 27, und/oder g. einen Forward-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 28 und einen Reverse-Primer mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 29, und/oder h. einen Forward-Primer und einen Reverse-Primer mit einer Teilsequenz von einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 5, 34, 35 oder 36 und/oder einer zu einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 5, 34, 35 oder 36 komplementären Teilsequenz.