DE102011114914A1

DE102011114914A1 - Transgene pflanze der art beta vulgaris mit gesteigerter resistenz gegenüber cercospora

Info

Publication number: DE102011114914A1
Application number: DE102011114914A
Authority: DE
Inventors: Dietmar Stahl; Nora Temme; Wilhelm Schäfer; Cornelia Stärkel
Original assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Current assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Priority date: 2011-10-06
Filing date: 2011-10-06
Publication date: 2013-04-11
Also published as: DE112012004161A5; WO2013050024A3; WO2013050024A2

Abstract

Die Erfindung betrifft eine transgene Pflanze der Art Beta vulgaris, in deren Genom eine Nukleinsäure stabil integriert wurde, vor der in der Pflanze RNA transkribiert wird, wobei gebildete RNA im Falle eines Befalls der Pflanze mit einem Pilz der Gattung Cercospora von diesem aufgenommen werden kann, so dass die Cercosporin-Biosynthese in dem Pilz derart beeinträchtigt wird, dass der Pilz in seiner biotrophen Wachstumsphase gehemmt wird und die Pflanze im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber dem Pilz aufweist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine transgene Pflanze der Art Beta vulgaris mit gesteigerter Resistenz gegenüber einem Pilz der Gattung Cercospora, transgene Teile einer solchen Pflanze sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
Bis zu 14% der potentiellen Ertragsverluste in der Zuckerrübenproduktion gehen auf pilzliche Pathogene zurück. Wichtigste Pilzerkrankung der Zuckerrübe ist die Cercospora-Blattfleckenkrankheit. Hervorgerufen durch den pilzlichen Erreger Cercospora beticola (Sacc.) verursacht die Cercospora-Blattfleckenkrankheit hohe Ertragsverluste und wirkt sich nachteilig auf die Qualität des Ernteproduktes aus. Je nach Standort und Zeitpunkt des Epiderniebeginns können Verluste von bis zu 20 t/ha entstehen.
Als hemibiotropher Pilz weist C. beticola eine biotrophe und eine nekrotrophe Wachstumsphase auf. Der Infektionszyklus beginnt mit Konidiosporen, die auf der Blattoberfläche der Zuckerrüben landen und auskeimen: Nach 3–4 Tagen wachsen die Hyphen durch die Stomata der Blattoberfläche in das Blattinnere ein. In dieser frühen Phase der Infektion wird die induzierbare pflanzliche Pathogenabwehr der Zuckerrübe durch C. beticola reprimiert (Schmidt et al. 2004, Schmidt et al. 2008), so dass eine erfolgreiche Abwehr des Pilzes unterbleibt. Der Pilz wächst zunächst biotroph interzellulär, kolonisiert das Parenchym und entzieht den Blättern Nährstoffe, ohne sichtbare Symptome in der Wirtspflanze auszulösen. Etwa 10–12 Tage nach der Sporenlandung kollabieren die Epidermis- und Blattparenchymzellen in der Nähe der Pilzhyphen und die typischen Blattnekrosen bilden sich aus. Das jetzt nekrotrophe Pilzwachstum setzt sich in den Nekrosen fort und es kommt zur Bildung von Konidiophoren mit Konidiosporen, von denen eine Sekundärinfektion und damit Ausbreitung der Krankheit ausgeht. Das Signal für diese Umstellung von der biotrophen zur nekrotrophen Lebensweise des Pilzes ist bisher unbekannt. Als Ursache für den Zellkollaps und die Freisetzung von Nährstoffen für das Pilzwachstum gilt das Toxin Cercosporin (Daub und Ehrenshaft 2000).
Eine indirekte Bekämpfung von C. beticola erfolgt derzeit durch die Wahl blattgesunder Sorten. Dieses Cercospora-resistente Germplasma, welches gegenwärtig zu Zuchtzwecken eingesetzt wird, wurde zu großen Teilen durch Auskreuzungen mit Beta vulgaris sp. maritima erhalten, um Resistenzgene in den Genpool einzubringen. Allerdings liefert die konventionelle Pflanzenzüchtung bisher nur moderate Cercospora-Resistenz, so dass ein Anbau dieser Sorten in Kombination mit der Anwendung von Fungiziden erforderlich ist. Zudem geht die Resistenz gegenüber Cercospora mit einem Verlust der Wüchsigkeit und einer Reduktion des Zuckergehalts einher. Eine chemische Bekämpfung von C. beticola durch Fungizide verursacht Kosten für den Landwirt und belastet die Umwelt. Wiederholte Anwendungen von Fungiziden erhöhen zudem den Selektionsdruck auf Fungizid-tolerante C. beticola-Stämme. Dies steht einer nachhaltigen landwirtschaftlichen Praxis entgegen.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass Mechanismen zur Ausbildung einer Cercospora-Resistenz an der Toxinreduktion oder der Entgiftung von Cercosporin ansetzen können. Das von Cercospora-Spezies produzierte photoaktivierte Sekundärmetabolit Cercosporin ist ein nicht-selektives Phototoxin und gilt als Pathogenitätsfaktor dieser Pilze (Daub 1982, Daub et al. 2005).
Ein Ansatz, der auf Entgiftung von Cercosporin ausgerichtet ist, wird in WO91/05061 beschrieben. Danach werden neben einem Verfahren zur Aufreinigung von Cercosporin auch transgene Zuckerrübenpflanzen offenbart, welche in der Lage sind Cercosporin abzubauen. Beschrieben wird ein Gen aus Cercosporin-resistenten Bakterien, das über einen geeigneten Vektor in eine Pflanze eingebracht werden kann.
In WO97/35001 werden transgene Pflanzen beschrieben, die ein Genom umfassen, welches genetisches Material für die Expression eines Cercospora kikuchii Membranpumpenproteins enthält. Bei Cercospora-Befall ist die transgene Pflanze in der Lage, das akkumulierende pilzliche Toxin durch das eingebrachte Pumpenprotein über die Plasmamembran aus der Zelle herauszutransportieren. Mit diesem Verfahren wird aber nicht verhindert, das Cercosporin zunächst in die Pflanzenzelle gelangt und dort Schäden anrichtet. Transgene Tabakpflanzen, die nach diesem Verfahren erstellt wurden, zeigen nach Cercospora nicotianae Befall lediglich eine Reduktion der Läsionengröße jedoch nicht der Läsionenzahl. Die grundsätzliche Anfälligkeit der Pflanzen gegenüber Cercospora wird durch diesen Ansatz nicht verringert (Upchurch et al. 2005). Weiterhin konnte die beschriebene Resistenzverbesserung nicht in jedem Labor beobachtet werden (Stahl, pers. Mitteilung).
Die Cercosporin-Biosynthese wurde erstmals in C. nicotianae beschrieben. Die Inaktivierung von CnCTB1, CnCTB2, CnCTB3 oder CnCTB8 führt zu einer Feedback-Hemmung der Transkription des gesamten Genclusters und somit zur Inhibierung der Cercosporin-Biosynthese in C. nicotiana (Chen et al. 2007). Solche Regulationsmechanismen der Sekundärmetabolit-Gencluster wurden auch in anderen phytopathogenen Pilzen wie Fusarium fujikuroi beschrieben (Wiemann et al. 2009).
Aus dem Stand der Technik ist ferner bekannt, dass ein Ausschalten der Gene CnCTB1, CnCTB3 und CnCTB4 in C. nicotianae starken Einfluss auf die Virulenz des Pathogens hat (Choquer et al. 2005, Choquer et al. 2007, Dekkers et al. 2007). Mit Hilfe von Primern, die zur Amplifizierung von CnCTB1 aus C. nicotianae genutzt worden waren, konnte in C. beticola ein Teil des CbCTB1-Gens identifiziert und durch die Gen-Disruptionskassette aus C. nicotianae ebenfalls inaktiviert werden. Die so entstandenen Mutanten produzierten kein Cercosporin und riefen weniger und kleinere Läsionen als der Wildtyp-Stamm nach Inokulation auf Zuckerrübenblättern hervor, die sich nach dem Kollabieren des Gewebes nicht weiter ausbreiteten. Cercospora-resistente Pflanzen basierend auf einer Manipulation der Cercosporin-Biosynthesegene wurden aber nicht erhalten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Pflanze der Art Beta vulgaris mit einer gegenüber dem Stand der Technik verbesserten Cercospora-Resistenz bereitzustellen.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der gestellten Aufgabe durch eine transgene Pflanze der Art Beta vulgaris, in deren Genom eine Nukleinsäure stabil integriert wurde, von der in der Pflanze RNA transkribiert wird, wobei gebildete RNA im Falle eines Befalls der Pflanze mit einem Pilz der Gattung Cercospora aufgenommen werden kann, so dass die Cercosporin-Biosynthese in dem Pilz derart beeinträchtigt wird, dass der Pilz in seiner biotrophen Wachstumsphase gehemmt wird und die Pflanze im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber dem Pilz aufweist.
Mit der vorliegenden Erfindung wurde es erstmals möglich, einen spezifischen und überraschend frühzeitigen Schutz gegenüber Cercospora zu gewährleisten. Die frühzeitige Wirkung birgt den Vorteil, dass das Toxin Cercosporin gar nicht erst in größeren Mengen in den Pflanzenzellen akkumuliert und überraschenderweise bereits das Eindringen von C. beticola in das Wirtsgewebe verhindert wird. Dadurch wird nicht nur die Bildung von Blattläsionen, die zu erheblichen Einschränkungen der Photosyntheseleistung und zu einem ertragsmindernden Neuaustrieb führen, sondern bereits der mit der biotrophen Kolonisierung der Blätter einhergehende pflanzliche Energieverlust und die Vermehrung des Pathogens vermindert. Die vorliegende Erfindung verhindert die Ausbreitung des Pilzes auf der Wirtspflanze und greift somit in den Lebenszyklus von Cercospora ein, so dass die erfolgreiche Vermehrung und Verbreitung des Pilzes stark eingeschränkt werden. Durch die Verwendung der transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung können die Kosten für den Einsatz von Fungiziden gegen Cercospora eingespart werden.
Überraschend wurde gefunden, dass eine Zuckerrübenpflanze, welche die integrierte Nukleinsäure aufweist, eine Beeinträchtigung der pilzlichen Cercosporin-Biosynthese zeigt, so dass im Falle eines Befalls der Pflanze mit Cercospora der Pilz in seiner biotrophen Wachstumsphase gehemmt wird. Der frühe Einfluss der für die Synthese des Phototoxins Cercosporin kodierenden Cercosporin-Biosynthesegene auf die Infektion des hemibiotrophen Pilzes Cercopora ist unerwartet, da bisher nur bekannt war, dass die Toxinproduktion in direktem Zusammenhang mit der Abtötung des Wirtsgewebes und somit der nekrotrophen Wachstumsphase steht. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass Cercosporin eine wichtige Rolle bei der Repression der pflanzlichen Pathogenabwehr in der Frühphase der Infektion spielt und eine Unterbrechung der Cercosporin-Biosynthese die volle Ausprägung der natürlichen Resistenzmechanismen der Zuckerrübe erlaubt.
Gemäß der Erfindung ist die ausgewählte Nukleinsäure, von der in der Pflanze RNA transkribiert wird, stabil in das Genom integriert. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure stabil in ein Chromosom der Pflanze integriert. Sie kann aber auch in ein extra-chromosomales Element integriert vorliegen. Der Vorteil einer stabilen Integration besteht darin, dass die ausgewählte Nukleinsäure an nachfolgende Generationen der transgenen Pflanze weitergegeben werden kann.
Im Sinne dieser Anmeldung ist mit ”Befall” das Zustandekommen eines Kontaktes zwischen Pathogen und Wirt gemeint. Mit einer Anheftung eines Pathogens an einen Wirt beispielsweise einer Pilzspore auf eine Blattoberfläche einer Pflanze, setzen Mechanismen der Pathogenerkennung und der Signalweiterleitung in der pflanzlichen Wirtszelle ein.
Die Gattung Cercospora umfasst verschiedene Arten, beispielsweise die Arten arachidicola, ariminiensis, asparagi, bertoreae, beticola, bizzozeriana, canescens, carotae, chenopodii, cistinearum, cladosporioides, diazu, dulcamarae, erysimi, hayii, kikuchii, malvacearum, malvicola, medicaginis, oryzaem, personata, plantaginis, ricinella, setariae, unamunoi, violae oder zeae-maydis.
Die erfindungsgemäße Pflanze weist im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber Cercospora auf. Die Kontrollpflanze hat idealer Weise den identischen Genotyp wie die transgene Pflanze und ist unter identischen Bedingungen angezogen worden, enthält aber nicht die Nukleinsäure, die in die transgene Pflanze eingebracht wurde.
Eine Steigerung der Resistenz lässt sich beispielsweise dadurch erkennen, dass die pilzliche Biomasse, die mit Hilfe der quantitativen PCR bestimmbar ist, im Vergleich zur pflanzlichen DNA im befallenen pflanzlichen Gewebe reduziert ist. Ein weiterer Ansatz zur Messung der Resistenz ist die optische Bonitur, wobei Boniturnoten von 1 (nicht anfällig) bis 9 (sehr anfällig) vergeben werden.
Der zeitliche Rahmen der ”biotrophen” Wachstumsphase beträgt beispielsweise bei C. beticola bis zu 10 Tage nach Auftreffen der Pilzspore auf die Blattoberfläche und wird neben dem Pathogen durch Umwelteinflüsse wie z. B. Luftfeuchtigkeit oder Temperatur und den pflanzlichen Wirt bestimmt. in der biotrophen Wachstumsphase wird kein Zelltod der Wirtszellen ausgelöst. Im Verlauf der biotrophen Wachstumsphase wächst der Pilz zunächst interzellulär und kolonisiert das Parenchym. Es kommt zu einem Stoffaustausch zwischen Pilz und Pflanze, sichtbar in der späteren biotrophen Wachstumsphase durch die Verstärkung der Zellwände der pflanzlichen Mesophyllzellen, wo beispielsweise ein Austausch von Nukleinsäuren stattfinden kann. Das Signal für den Wechsel zwischen biotropher und sich anschließender nekrotropher Wachstumsphase ist unbekannt. Unter ”nekrotropher” Wachstumsphase wird die Wachstumsphase des Pilzes verstanden, die einen Zelltod in den Wirtszellen auslöst. Mit Beginn der nekrotrophen Phase hat der Pilz die Mesophyllzellen der Pflanze kolonialisiert und es werden Nekrosen im pflanzlichen Gewebe sichtbar. An diesen Nekrosen kommt es schließlich zur Differenzierung neuer Konidiosporen.
Die transgenen Pflanzen zeigen bei Cercospora-Befall wenige, vorzugsweise keine Nekrosen. Idealer Weise bleiben die Blätter nahezu frei von Nekrosen und können im vollen Umfang Photosynthese betreiben. Weiterhin kann ein Neuaustrieb von Blättern unterbleiben, der mit einem unerwünschten Verbrauch der in der Wurzel eingelagerten Sucrose verbunden ist.
Die Differenzierung neuer Konidiosporen des Pilzes auf der Blattoberfläche ist stark eingeschränkt. in einer bevorzugten Ausführung ist die Vermehrung und Verbreitung des Pilzes inhibiert.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei dem Pilz um Cercospora beticola, der zu den wichtigsten und zerstörerischsten Blattpathogenen von Zuckerrübe, Roter Bete und Mangold zählt und Ertragsverluste von über 40% verursachen kann. Der Pilz produziert den Sekundärmetaboliten Cercosporin, welcher unter Lichteinwirkung mit Sauerstoff reagiert und zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führt. Die ROS rufen massive Zellschäden im Blattgewebe der befallenen Pflanze hervor, die in Form von Nekrosen sichtbar werden.
Eine weiter bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die transgene Pflanze dadurch gekennzeichnet ist, dass die Nukleinsäure

(a) eine Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NOS: 1–12 oder
(b) mindestens ein Fragment von jeweils mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer oder mehrerer der Nukleotidsequenzen gemäß den SEQ ID NOS: 1–12 oder
(c) eine Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer der Nukleotidseqenzen nach (a) oder (b)

Die hier verwendeten Nukleinsäuren sind insbesondere gegen die Cercosporin-Biosynthesegene aus C. beticola gerichtet. Die Cercosporin-Biosynthesegene bilden ein Gencluster, das für die Biosynthese des nicht-selektiven Phototoxins Cercosporin verantwortlich ist. Dieses Gencluster entspricht pilzlichen Sekundärmetabolit-Biosynthese-Genclustern. Pilzliche Sekundärmetabolit-Synthesegene sind solche Gene, die benachbart an einem Lokus im Genom als Cluster vorliegen und deren Transkription koordiniert reguliert wird. Im Fall der Cercosporin-Biosynthese umfasst das Gencluster die acht Gene CbCTB1, CbCTB2, CbCTB3, CbCTB4, CbCTB5, CbCTB6, CbCTB7 und CbCTB8, die für eine Polyketidsynthase (CbCTB1) eine O-Methyltransferase (CbCTB2), ein Protein mit C-terminaler Monooxygenase- und N-terminaler O-Methyltransferase-Aktivität (CbCTB3), drei Oxidoreduktasen (CbCTB5, CbCTB6, CbCTB7), einen MFS-Transporter (CbCTB4) und einen Zinkfinger-Transkriptionsfaktor (CbCTB8) kodieren und die durch die SEQ ID NOS: 1–8 repräsentiert sind.
Die in die Pflanze eingebrachte Nukleinsäure wird transkribiert, wobei die gebildete RNA, welche gegen eines oder mehrere Gene der Cercosporin-Biosynthese gerichtet ist, die Expression und die Funktion der pilzlichen CTB-Genclustergene reduzieren bzw. hemmen kann.
Die verwendeten Nukleinsäuren können unterschiedlich lang sein. So können die Nukleinsäuren mit einer Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NOS: 1–12 eine Länge zwischen 256 und 8436 Nukleotiden aufweisen. Eine besonders geeignete Nukleinsäure kodiert für die O-Methyltransferase CbCTB2 mit einer Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 2 mit einer Länge von 2495 Nukleotiden.
Bei den verwendeten Nukleinsäuren kann es sich aber auch um ein oder mehrere Fragmente einer oder mehrerer Nukleotidsequenzen gemäß den SEQ ID NOS: 1–12 handeln. Die Fragmente sollten dabei mindestens 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 oder 2100 aufeinanderfolgende Nukleotide einer oder mehrerer Nukleotidsequenzen gemäß den SEQ ID NOS: 1–8 oder mindestens 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 aufeinanderfolgende Nukleotide einer oder mehrerer Nukleotidsequenzen gemäß den SEQ ID NOS: 9–12 umfassen. Die Fragmente werden dabei vorzugsweise aus dem kodierenden Bereich der Nukleotidsequenzen gemäß den SEQ ID NOS: 1–8 ausgewählt, können aber auch Teile der nicht-kodierenden Bereiche umfassen wie z. B. Teile der Intronbereiche oder Teile des Promotorbereichs. Es sind Kombinationen von zwei oder mehr Fragmenten einer Nukleotidsequenz wie etwa von der gemäß SEQ ID NO: 2 oder von verschiedenen Nukleotidsequenzen wie etwa von den gemäß der SEQ ID NOS: 2 und 8 möglich. Eine bevorzugte Kombination von Nukleinsäuren umfasst die Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12. Durch die Kombination mehrerer Cercosporin-Biosynthesegene oder deren Fragmente wird die Wahrscheinlichkeit vermindert, dass die Resistenz der Pflanze durch eine natürlich vorkommende Mutation in dem Pilz gebrochen wird. Die entsprechenden Nukleinsäuren können über in der Pflanzenbiotechnologie bekannte und etablierte Transformationsverfahren gemeinsam zum Beispiel auf einem binären Vektor oder getrennt beispielsweise über Co-Transformation in eine Pflanzenzelle eingebracht werden. Es ist ebenfalls möglich, eine Kombination beispielsweise von zwei unterschiedlichen Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NOS: 4 und 8 durch Kreuzung entsprechender transgener Pflanzen nach bekannten Methoden der Pflanzenzüchtung zu erzielen. Des Weiteren kann die in die Pflanze eingebrachte Nukleotidsequenz komplementär zu einer oder mehreren der zuvor beschriebenen Nukleotidsequenzen sein. Unter komplementär wird bezogen auf eine Nukleotidsequenz in 5'-3' Richtung eine Nukleotidsequenz in 3'-5' Richtung verstanden, deren Basen entsprechend den Basenpaarungsregeln mit den Basen der ersten Nukleotidsequenz korrespondieren.
Von der vorliegenden Erfindung erfasst sind insbesondere auch solche Nukleinsäuren, die über einige wenige, beispielsweise 1 oder 2 Nukleotide verfügen, die nicht komplementär zu der pilzlichen Zielgensequenz der Cercosporin-Biosynthesegene sind. Im Pilz auftretende Sequenzvariationen, die beispielsweise auf einer genetischen Mutation durch z. B. Addition, Deletion oder Substitution oder auf einem Polymorphismus in einem Cercospora-Stamm basieren, und welche in einer Falschpaarung über einen Bereich von 1, 2 oder mehr Nukleotiden führen, können somit toleriert werden, sofern die von der Pflanze gebildete RNA immer noch mit der pilzlichen Zielgen interferiert.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung handelt es sich bei der gebildeten RNA um doppelsträngige RNA zum Gen-Silencing.
Unter ”gebildeter RNA” (Ribonukleinsäure) werden dabei alle Arten von Ribonukleinsäuren wie beispielsweise doppelsträngige RNA (dsRNA), small interfering RNA (sRNA), Boten-RNA (mRNA), Mikro-RNA (miRNA) oder Tranfer-RNA (tRNA) verstanden.
Die transgene Pflanze produziert ausgehend von der eingebrachten Nukleinsäure dsRNA, die durch endogene RNAi-/Silencing-Mechanismen zu siRNAs und mTRNAs prozessiert werden.
Um dsRNA zu erhalten, kann einer ersten Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NOS: 1–12 oder einem Fragment davon in sense und einer zweiten Nukleinsäure in antisense Orientierung verwendet werden, die durch ein Intron getrennt sind, das keine Ähnlichkeit mit den pilzlichen CTB-Genen hat. Beispielsweise kann die Nukleinsäure gegen das pilzliche CbCTB2-Gen gerichtet sein. Bei Expression in einer pflanzlichen Zelle wird ein RNA-Transkript gebildet, welches sich aufgrund der Homologie zwischen den sense und antisense Sequenzbereichen zu einer dsRNA zusammenlagern kann. Durch die fehlende Basenpaarung im Bereich des Introns bildet die dsRNA eine hairpin-Struktur aus. Eine dsRNA mit einer hairpin-Struktur kann auch durch eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NOS: 1–12 in sense und einer zweiten in antisense Orientierung unterschiedlicher Länge bereitgestellt werden. Dabei kann die Nukleotidsequenz in sense Orientierung beispielsweise um 190 Nukleotide länger sein als die Nukleotidsequenz in antisense Orientierung oder vice versa.
Der Begriff ”Gen-Silencing” oder Silencing beschreibt Prozesse zur Stilllegung von Genen. Silencing kann z. B. auf transkriptioneller Ebene oder post-transkriptioneller Ebene ansetzen.
Der Silencing-Mechanismus geht von dsRNA wie beispielsweise hairpin RNA-Strukturen oder Genduplexen aus. Die dsRNA wird mittels einer dsRNA-spezifischen Endonuklease (Dicer) zu kurzen dsRNAs führen, die bei Einsatz längerer Nukleotidsequenzen zu kurzen dsRNAs von vorzugsweise zu 21–25 Basenpaaren prozessiert werden, ein Prozess der sowohl für stem-loop” (Prä-miRNA) als auch für lange komplementäre dsRNA-Vorstufen ähnlich abläuft. Argonaut-Proteine als zentrale Komponenten des RNA-induzierten Silencing Complexes (RISC) binden und entwinden siRNA und miRNA, so dass der Leitstrang des Duplexes mittels Basenpaarung gezielt an die mRNA bindet und zu deren Abbau führt. RNAi mittels miRNA bezieht sich auf einen vergleichsweise ähnlichen Prozess, mit dem Unterschied, dass die produzierte miRNA auch partiell Regionen umfasst, die nicht identisch zu den Zielgenen sind.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung handelt es sich bei der gebildeten RNA um miRNA oder siRNA.
Nach Befall einer Wirtspflanze mit Cercospora kann ein Austausch von in der Pflanze gebildeter RNA zwischen der Wirtspflanze und dem pathogenen Pilz stattfinden. In dem Pilz können diese RNAs zu einem Sequenz-spezifischen Gen-Silencing eines oder mehrere Gene des Cercosporin-Biosynthese-Genclusters führen. An diesem Prozess können auch Proteine und Proteinkomplexe wie Dicer, RISC (RNA-induzierter Silencing-Komplex) sowie die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRP) beteiligt sein.
Es ist bekannt, dass in Pflanzen der siRNA-Effekt fortgeführt werden kann, wenn die RdRP neue siRNAs aus den abgebauten mRNA-Fragmenten synthetisiert. Diese sekundäre oder transitive RNAi kann das Silencing verstärken und auch zum Silencing verschiedener Transkripte führen, wenn diese hochkonservierte Sequenzen teilen (systemisches Silencing).
In einer weiteren bevorzugten Ausführung handelt es sich bei der Nukleotidsequenz um DNA, die mit einem Promotor operativ verknüpft ist.
Ein ”Promotor” ist eine nicht-translatierte DNA-Sequenz, typischerweise stromaufwärts einer kodierenden Region, welche die Bindestelle für die RNA-Polymerase beinhaltet und die Transkription der DNA initiiert. Ein Promotor enthält spezielle Elemente, die als Regulatoren der Genexpression fungieren (z. B. cis-regulatorische Elemente). Mit operativ verknüpft ist gemeint, dass die DNA, welche die integrierte Nukleotidsequenz umfasst, verbunden ist mit einem Promotor in einer Weise, die eine Expression dieser Nukleotidsequenz erlaubt. Als weitere Komponente kann die integrierte Nukleotidsequenz stromabwärts mit einem Terminator-Signal verknüpft sein.
Der Promotor kann pflanzlichen, tierischen oder mikrobiellen Ursprungs oder synthetisch hergestellt sein und kann beispielsweise aus einer der folgenden Gruppe von Promotoren ausgewählt werden: konstitutiv, induzierbar, entwicklungsspezifisch, zelltypspezifisch, gewebespezifisch oder organspezifisch. Während konstitutive Promotoren unter den meisten Bedingungen aktiv sind, zeigen induzierbare Promotoren Expression infolge eines induzierenden Signals, welches beispielsweise von biotischen Stressoren wie Pathogenen oder abiotischen Stressoren wie Kälte oder Trockenheit oder Chemikalien ausgehen kann.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Promotor um einen konstitutiven Promotor wie z. B. den CaMV 35S-Promotor. Es kann auch ein gewebespezifischer Promotor wie der C1-Promotor verwendet werden ( US 7,767,801 B2 , EP 2 298 917 A2 ).
Die Verwendung von zwei Promotoren, die jeweils das 3'- und das 5'-Ende des Nukleinsäuremoleküls flankieren, ermöglicht die Expression des jeweiligen individuellen DNA-Strangs, wobei zwei komplementäre RNAs gebildet werden, die hybridisieren und eine dsRNA bilden. Zudem können die zwei Promotoren derart eingesetzt werden, dass der eine Promotor auf die Transkription einer ausgewählten Nukleotidsequenz und der zweite Promotor auf die Transkription einer zu der ersten Nukleotidsequenz komplementären Nukleotidsequenz gerichtet ist. Sofern beide Nukleotidsequenzen transkribiert werden, entsteht eine dsRNA. Ferner kann ein bidirektionaler Promotor eingesetzt werden, der eine Expression von zwei Nukleotidsequenzen in zwei Richtungen ermöglicht, wobei eine Nukleotidsequenz in 3'-Richtung und eine zweite Nukleotidsequenz in 5'-Richtung abgelesen wird. Sofern die beiden Nukleotidsequenzen komplementär zueinander sind, kann eine dsRNA gebildet werden.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden transgene Teile der transgenen Pflanze, insbesondere transgenen Samen und transgenen Zellen bereitgestellt.
Im Sinne dieser Anmeldung sind mit transgenen ”Teilen” der transgenen Pflanze insbesondere Samen, Wurzeln, Blätter, Blüten sowie Zellen der erfindungsgemäßen Pflanze gemeint. Dabei sind unter ”Zellen” beispielsweise isolierte Zellen mit einer Zellwand oder Aggregate davon oder Protoplasten zu verstehen. Bei den transgenen Teilen der transgenen Pflanze handelt es sich auch um solche, die geerntet werden können, wie etwa der Rübenkörper bei Zuckerrübe.
Zur Produktion von transgenen Samen, welche die integrierte Nukleinsäure tragen, kann die transgene Pflanze geselbstet werden. Die transgene Pflanze kann aber auch mit einer gleichen transgenen Pflanzen oder mit einer transgenen Pflanze, die eine oder mehrer andere von der Erfindung verschiedene Nukleinsäuren trägt, oder mit einer nicht-transgenen Pflanze über bekannte Methoden der Pflanzenzüchtung gekreuzt werden, um transgene Samen zu produzieren. Diese Samen können eingesetzt werden, um Nachkommengenerationen der transgenen Pflanzen der Erfindung anzuziehen, welche die integrierte Nukleinsäure umfassen. Sofern die erfindungsgemäßen Pflanzen mit anderen transgenen Pflanzen, die statt der gesteigerten Resistenz gegenüber Cercospora beispielsweise eine Herbizidresistenz aufweisen, gekreuzt werden, kann in den Nachkommen ein Stack von Transgenen geschaffen werden. Auch die Erstellung von Hybriden ist möglich.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, Samen und Teilen einer Pflanze der Art Beta vulgaris, wobei die Pflanze im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber einem Befall von einem Pilz der Gattung Cercospora aufweist,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle einer Pflanze der Art Beta vulgaris mit einer Nukleinsäure transformiert und die transgenen Pflanze daraus regeneriert wird, wobei von der Nukleinsäure in der Pflanze RNA transkribiert wird und gebildete RNA im Falle eines Befalls der Pflanze mit einem Pilz der Gattung Cercospora von diesem aufgenommen werden kann, so dass eine Cercosporin-Biosynthese in dem Pilz derart beeinträchtigt wird, dass der Pilz in seiner biotrophen Wachstumsphase gehemmt wird und die Pflanze im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber dem Pilz aufweist.
Geeignete Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen sind in der Pflanzenbiotechnologie bekannt. Jedes dieser Verfahren kann genutzt werden, um eine ausgewählte Nukleinsäure vorzugsweise in einem Vektor in eine Pflanzenzelle einzubringen, um eine transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Transformationsverfahren können direkte und indirekte Verfahren der Transformation beinhalten und sind für dikotyle und zumeist auch für monokotyle Pflanzen anwendbar. Geeignete direkte Transformationsverfahren schließen PEG-induzierte DNA-Aufnahme, Liposomen-vermittelte Transformation, biolistische Methoden mittels Particle Bombardement, Elektroporation oder Mikroinjektion ein. Zu den indirekten Verfahren zählen beispielsweise die Agrobakterium-vermittelte Transformationstechnik oder die virale Infektion mittels viraler Vektoren.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst den Agrobakterium-vermittelten DNA-Transfer unter Verwendung binärer Vektoren. Nach der Transformation der Pflanzenzellen, werden die Zellen auf einen oder mehrere Marker selektiert, die mit der Nukleinsäure der Erfindung in die Pflanze transformiert wurden und Gene umfassen, die vorzugsweise Antibiotika-Resistenz vermitteln, wie z. B. das Neomycinphosphotransferase II-Gen NPTII, welches Kanamycinresistenz vermittelt. Im Anschluss werden die transformierten Zellen zu vollständigen Pflanzen regeneriert. Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können die erhaltenen Pflanzen beispielsweise über quantitative PCR auf das Vorhandensein der Nukleinsäure der Erfindung überprüft werden. Resistenzprüfungen dieser Pflanzen gegenüber Cercospora in vitro und im Gewächshaus schließen sich an. Weitere phänotypische Untersuchungen können im Gewächshaus oder im Freiland routinemäßig von entsprechend geschulten Personen durchgeführt werden. Die auf diese Weise untersuchten transformierten Pflanzen können direkt angezogen werden. Häufig werden sie als Elterlinien in der Züchtung neuer Sorten oder in der Erzeugung von Hybriden genutzt.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die Figuren und Sequenzen beschrieben:
1 Gendisruptionsstrategie für CbCTB2 in den C. beticola Isolaten Ahlburg und Ferrara. Das CbCTB2-Disruptionskonstrukt ist schematisch dargestellt. Die 800 bp 5'- und 3'-Fragmente von CbCTB2 wurden jeweils mit den Primern 1 (CTB2 1F), 2 (CTB2 2R) und 3 (CTB2 3F), 4 (CTB2 4R) amplifiziert und über überlappende Sequenzbereiche mit der Hygromycin-Resistenzkassette fusioniert. Das daraus resultierende Konstrukt wurde mit Primern amplifiziert, welche die Schnittstellen NotI und ApaI an das Konstrukt anfügten, so dass es nach entsprechendem Verdau in den Vektor pGEMT kloniert werden konnte. Durch zweifache homologe Rekombination der CbCTB2-Fragmente am Genlokus des CbCTB2-Gens kann es zur Integration der Hygromycin-Resistenzkassette in das CbCTB2-Gen kommen, so dass die Gensequenz unterbrochen wird und nicht mehr für ein funktionales CTB2-Protein kodieren kann.
2 Keine nachweisliche Toxin-Produktion in C. beticola Δctb2-Disruptionsmutanten. Das aggressivere Isolat von C. beticola, Ahlburg, produziert mehr Toxin als das Isolat Ferrara. Infolge der Disruption des CbCTB2-Gens konnte in den Δctb2-Disruptionsmutanten von beiden Isolaten keine Toxinproduktion mehr detektiert werden. Kontrollstamm mit hygB-Vektor (pGEMThyg): Ferrara hyg.
3 In vitro-kultivierte Zuckerrübenpflanzen nach Behandlung mit Toxin-Extrakt von C. beticola Δctb2-Disruptionsmutanten und Wildtyp. Die Zuckerrübenpflanzen zeigen verschieden starke Krankheitssymptome einen Tag nach Inokulation mit dem Toxinextrakt, welches aus Pilzmyzel von C. beticola, das auf Agarplatten kultiviert wurde, gewonnen wurde. Die Inokulation mit dem Extrakt von Wildtyp-Platten der Isolate Ahlburg und Ferrara resultiert in schwarzen nekrotischen Pflanzen, während Pflanzen nach Inokulation mit dem Extrakt gewonnen von Platten des Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamms grün und gesund aussehen. Wasser: Negativ-Kontrolle.
4 Der Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm verursacht keine Krankheitssymptome auf Zuckerrübenblättern. Die Bilder zeigen Ausschnitte von infizierten Zuckerrübenblättern. Während der Wildtyp des Isolats Ahlburg nach 21 Tagen charakteristische nekrotische Blattflecken verursacht, zeigen die Zuckerrübenblätter infiziert mit dem Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm keine Krankheitssymptome. Kontrollstamm mit hygB-Vektor (pGEMThyg): Ahlburg hyg.
5 Krankheitsindex von Zuckerrüben. Zuckerrübenpflanzen wurden mit Konidiosporen vom Wildtyp des Isolats Ahlburg und vom Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm infiziert und die Stärke der Krankheit nach 21 Tage ausgewertet. Die Zuckerrübenpflanzen infiziert mit Konidiosporen der Δctb2-Disruptionsmutante zeigten keine Krankheitssymptome. Kontrollstamm mit hygB-Vektor (pGEMThyg): Ahlburg hyg.
6 Licht- und fluoreszenzmikroskopische Analyse des Infektionsvorgangs vom Wildtyp und vom Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm.
A und B: Die Hellfeldaufnahme zeigt einen von dem Wildtyp 21 Tage nach der Infektion hervorgerufenen nekrotischen Blattfleck wie er für die Blattfleckenkrankheit typisch ist (A). Der Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm ruft nach 21 Tagen keine sichtbaren Blattsymptome hervor (B).
C and D: Nachweis des rot fluoreszierenden Myzels des dsRed exprimierenden Wildtyps in dem Blattfleck (C), während der mit dem dsRed Konstrukt transformierte Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm nur schwach auf der Blattoberfläche wächst (D). Fluoreszenznachweis mit dem dsRed-Filtersatz des Leica MZ FL III Mikroskops. Größenbalken: 250 μm.
7 Infektionsprozess dokumentiert durch Fluoreszenzmikroskopie. Für die Fluoreszenzaufnahmen wurden dsRed-Stämme vom Wildtyp und von der Δctb2-Disruptionsmutante genutzt. Fluoreszenzmikroskop: Zeiss, Hellfeld: DIC, dsRed-Fluoreszenz: dsRed-Filter, Zellwand-Autofluoreszenz: UV-Filter.
A und B: Am Tag 4 nach der Inokulation waren sowohl vom Wildtyp als auch von der Disruptionsmutante Myzel und Konidiosporen auf der Blattoberfläche sichtbar.
C und D: Am Tag 4 nach der Inokulation hatte der Wildtyp (C) die Stomata erreicht und begann zu penetrieren, während die Δctb2-Disrutptionsmutante (D) immer nur an der Blattoberfläche zu sehen war.
E: Ein Blattquerschnitt zeigt 21 Tage nach der Inokulation Hyphen des Wildtyps, die zwischen den Blattparenchymzellen im Blatt wachsen.
F: Ein Blattquerschnitt zeigt 21 Tage nach der Inokulation mit Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm, dass die Hyphen der Cercosporin-defizienten Transformante lediglich auf der Epidermis aber nicht im Parenchym nachweisbar sind. Die Hyphen des Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm waren nicht fest mit der Cuticula assoziert und konnten leicht verschoben werden.
G: Ein Querschnitt durch eine vom Wildtyp hervorgerufene Läsion 21 Tage nach der Inokulation. Zahlreiche Hyphen wachsen in der Nekrose. Die Abnahme der blauen Autofluoreszenz der Zellwand weist auf den Abbau des Wirtsgewebes hin.
H: Ein Querschnitt durch ein mit dem Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm inokuliertes Blatt 21 Tage nach der Inokulation zeigt eine starke blaue Autofluoreszenz der pflanzlichen Zellwand aber keine kolonisierenden Pilzhyphen. Größenbalken: A und B = 100 μm, C – H = 20 μm. Abkürzungen: e extracellular space, ec epidermis cell, ew epidermal cell wall, h hyphae, mc mesophyll cell, s stomata, sp stomatal pore.
8 Schematische Darstellung des Cercosporin-Biosynthese-Genclusters aus C. beticola.
9 pABM_70Sluci-Vektor (9A) und der darauf basierende pABM_70Sluci-dsRNA.CTB8 (9B) zur Expression eines Fusions-Konstrukts bestehend aus einem Luciferase-Reportergen und dem zu testenden Gen-Fragment.
10 Binäres Ti-Plasmid p95N_RNAi_CTB2, das für die Agrobakterien-vermittelte Transformation eingesetzt wurde.
11 Binäres Ti-Plasmid p95N_RNAi_CTB8, das für die Agrobakterien-vermittelte Transformation eingesetzt wurde.
12 Binäres Ti-Plasmid p95N_RNAi_CoCTB2/8, das für die Agrobakterien-vermittelte Transformation eingesetzt werden kann.
13 Plasmid pRNAi, das für die Konstruktion der sense-intron-antisense-Fragmente eingesetzt wurde.
14 Transgene Zuckerrüben-Sprosse auf Selektionsmedium nach Transformation mit dem Vektor p95N_CTB2 (14A) und mit dem Vektor p95N_CTB8 (14B) in verschiedenen Stadien der Regeneration.
15 Diagnostische PCR zur Überprüfung der Transgenität der Zuckerrüben (PR203) nach Transformation mit dem binären Vektor_p95N_CTB8.
A: Nachweis des NPTII-Gens (553 bp) (Primer Bo2299x Bo2300)
B: Nachweis des sense-Fragments (655 bp) (Primer S334 5'-ATCCCACTATCCTTCGCAAG-3' × S359 5'-CAACTTCACATAATATTTGCATCGCTTG-3') und des antisense_Fragments (817 bp) (S329 5'-CTAAGGGTTTCTTATATGCTCAAC-3' × S362 5'-TCTCTTGGAGTTTTCTCTTTGTCCTCACC-3'). Marker: Tracklt^TM 1 Kb DNA Ladder, Invitrogen. 3DC4156/Ko: Negativ-Kontrolle DNA aus untransformierter Zuckerrübe Genotyp 3DC4156.
Bevorzugte Nukleinsäuren weisen Nukleotidsequenzen oder Fragmente hiervon aus der folgenden Gruppe auf:
SEQ ID NO: 1 Nukleotidsequenz der Polyketid-Synthase (CbCTB1)
SEQ ID NO: 2 Nukleotidsequenz der O-Methyltransferase (CbCTB2)
SEQ ID NO: 3 Nukleotidsequenz, die für ein Protein mit dualer Funktion einer O-Methyltransferase (N-Terminus) und einer Monooxygenase (C-Terminus) kodiert (CbCTB3)
SEQ ID NO: 4 Nukleotidsequenz des MFS-Transporter (CbCTB4)
SEQ ID NO: 5 Nukleotidsequenz der FAD/FMN-abhängigen Oxidoreduktase (CbCTB5)
SEQ ID NO: 6 Nukleotidsequenz der NADPH-abhängige Oxidoreduktase (CbCTB6)
SEQ ID NO: 7 Nukleotidsequenz der FAD/FMN-abhängigen Oxidoreduktase (CbCTB7)
SEQ ID NO: 8 Nukleotidsequenz des Zinkfinger-Transkriptionsfaktor (CbCTB8)
SEQ ID NO: 9 Fragment der Nukleotidsequenz der O-Methyltransferase (CbCTB2_555-810)
SEQ ID NO: 10 Fragment der Nukleotidsequenz des Zinkfinger-Transkriptionsfaktors (CbCTB81651-1979)
SEQ ID NO: 11 Fragment der Nukleotidsequenz der O-Methytransferase (CbCTB2_1483-1841)
SEQ ID NO: 12 Fragment der Nukleotidsequenz des Zinkfinger-Transkriptionsfaktors (CbCTB8_2066-2645)
Gendisruption von CbCTB2 im C. beticola-Isolat Ahlburg
Das Gen CbCTB2 wurde über Gendisruption mit Hilfe des Fusions-PCR-Ansatzes über doppelte homologe Rekombination zerstört (1). Mittels Fusions-PCR wurde ein Konstrukt generiert, das ca. 800 bp des 3'-Endes des CbCTB2-Gens, die Hygromycin-Resistenzkassette und ca. 800 bp des 5'-Endes des CbCTB2-Gens enthält. Fusions-PCR ist eine Methode zur Klonierung mehrerer Fragmente (Szewczyk et al. 2006). Die Hygromycin-Resistenzkassette wurde mit dem Restriktionsenzym SmaI aus dem Vektor pGEMThyg (Le Thi Thu Giang, Universität Hamburg) geschnitten, die CbCTB2-Fragmente wurden mit den Primern CTB2 1F (5'-CGCTAGATTTAGGTGTTGGA-3'), CTB2 2R (5'-agatgccgaccgaacaagagctgtcccccGCAATCTTTCTTCCTATGCT-3'), und CTB2 3F (5'-caatgctacatcacccacctcgctcccccCGTTTCCAAGTCCAAGATCTG-3'), CTB2 4R (5'-CTCTTTCGTCCCTCGTATCTC-3') aus genomischer DNA von C. beticola amplifiziert. Primer wurden anhand der Sequenz von C. nicotiana (accession number DQ991505) entworfen. In der Fusion-PCR-Reaktion wurden ohne Primer gleiche Mengen der CbCTB2-Fragmente und der Hygromycin-Resistenzkassette fusioniert. Das PCR-Programm umfasste: Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten, Denaturierung bei 95°C für 1 Minute, Annealing im Gradient von 55°C bis 60°C für 1 Minute, Extension bei 72°C für 5 Minuten, 20-fache Wiederholung der Schritte 2–4, finale Extension bei 72°C für 10 Minuten. Das entstandene PCR-Produkt wurde mit Hilfe der Primer CTB2 5F (5'-AACCTCCTTTGCGTATTCTC-3') und CTB2 6R (5'-ATGTTTCCGAGTTCTTGATGTG-3') amplifiziert, in den Vektor pGEMT kloniert und mittels der Restriktionsenzyme NotI und ApaI herausgeschnitten, deren Schnittstellen mit Hilfe der Primer an das Fragment angehängt wurden. Für Klonierungsarbeiten wurde der E. coli Stamm XL1-blue (Stratagene, LaJolla, CA) genutzt.
Zur Transformation von C. beticola wurden Protoplasten vorbereitet wie beschrieben in Jenczmionka et al. 2003 und die PEG-vermittelte Transformation wurde durchgeführt wie zuvor beschrieben (Proctor et al. 1995). Puffer wurden angefertigt wie im Protokoll für die Transformation von C. nicotiana beschrieben (Chung et al. 2002). Zwei Transformanten (1070.4 und 1070.8) wurden für weitere Analysen ausgewählt. Die Δctb2-Transformanten sind überraschenderweise weiß, während der Wildtyp graues Myzel bildet. Die Transformante 1070.4 wurde für die Transformation mit dem Vektor pII99dsRed (Nakimi et al. 2001) genutzt, welche in fluoreszierende Transformanten resultiert. Aus diesen wurde die fluoreszierende Transformante 1080.1 für weitere Analysen ausgewählt.
Gendisruption von CbCTB2 im C. beticola-Isolat Ferrara
Das Gen CbCTB2 des C. beticola-Isolates Ferrara wurde, wie für das Isolat Ahlburg beschrieben, mittels Gendisruption mit Hilfe des Fusions-PCR-Ansatzes über doppelte homologe Rekombination zerstört. Zwei Transformanten (1029.16 und 1029.27) wurden für weitere Analysen ausgewählt. Die Transformante 1029.16 wurde für die Transformation mit dem Vektor pII99dsRed genutzt, welche in fluoreszierende Transfomanten resultiert. Aus diesen wurde die fluoreszierende Transformante 1071.9 für weitere Analysen ausgewählt.
Die Δctb2-Disruptionsmutante zeigt eine reduzierte Toxin-Produktion
Die Toxinproduktion wurde auf PDA-Platten (Potato Dextrose Agar) pH 5,6 im Licht gemessen. Cercosporin wurde in 5 N KOH extrahiert wie beschrieben in Chung (2003). Die Platten wurden mit C. beticola-Konidiosporen inokuliert und unter Tageslicht für 2 Wochen bei Raumtemperatur inkubiert. Der Agar wurde in kleine Stücke geschnitten und mit KOH in einem Becherglas über Nacht überdeckt. Die Agarstücke wurde abgefiltert. Die Absorption des Filtrat wurde spektroskopisch gemessen (Ultrospec 3000, Pharmacia Biotech) bei 480 nm. Eine Standardkurve diente zur Berechnung der Cercosporin-Konzentration. Ausgehend von einer 5 mM Cercosporin Stammlösung konnte die Cercosporin-Konzentration anhand des Molekulargewichtes von 534,51 g/Mol berechnet werden. Jede Messung wurde 3x mit drei verschiedenen Extraktionen durchgeführt. Wie in 2 ersichtlich, zeigt Ahlburg höhere Toxin-Konzentrationen als Ferrara, was die stärkere Aggressivität dieses Isolats erklären mag. Im Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm wurde kein Toxin gebildet. Transformanten mit dem Leervektor pGEMThyg, (Le Thi Thu Giang, Universität Hamburg) dienten als Kontrollstämme.
CbCTB2 ist essentiell für die Pathogenität von Cercospora beticola
In vitro-Zuckerrübenpflanzen, die in das Wildtyp-Extrakt aus C. beticola getaucht worden waren, starben nach einem Tag, während in vitro-Zuckerrübenpflanzen, die in Wasser oder in das Extrakt des Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamms getaucht worden waren, keine Krankheitssymptome aufwiesen (3). Diese Daten zeigen, dass dem Kulturextrakt des Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamms eine Schlüsselkomponente fehlt, die den Zelltod der Wirtspflanze auslöst. Das Experiment wurde 3x mit jeweils fünf Pflanzen pro Kulturextrakt durchgeführt.
Für weitere Infektionsanalysen wurden Zuckerrübenpflanzen in Kulturschränken bei 18°C unter Langtagbedingungen (16 h Licht) angezogen. Zur Konidiosporenproduktion wurden PDA-Platten (pH 5,6) mit gleichen Teilen Myzel inokuliert, das zuvor im Waring-Mixer zerkleinert worden war, und für zwei Wochen im Tageslicht inkubiert. Ungefähr eine Platte wurde zur Infektion von einer Zuckerrübenpflanze genutzt. Die Konidien wurden vorsichtig von der Myzeloberfläche unter Zugabe von sterilem Wasser mit Hilfe eines Spatels abgekratzt. Das abgekratzte Material wurde nacheinander durch ein Haushaltsieb, eine Lage Miracloth und einem 200 μm Wilson-Sieb filtriert, um das gesamte Agarmaterial abzutrennen. Der Konidientiter wurde auf 20.000 Konidien/ml mit Hilfe des Fuchs-Rosenthal Hemocytometer eingestellt. Zehn Wochen alte Zuckerrübenpflanzen wurden sowohl von der Blattoberseite als auch von der Blattunterseite komplett mit der Konidiosporensuspension eingesprüht. Auf jede Pflanze wurden 50 ml Suspension gesprüht. Die Pflanzen wurden für zehn Tage mit einem Folienzelt abgedeckt und inkubiert bei 18 h Licht (20000 lux, 400–600 nm = 4000–6000 K) mit 24°C Tages- und 18°C Nachttemperatur. Die Folie wurde nach 10 Tagen entfernt. Die Analysen zeigten, dass der Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm keinen Läsionen auf Blättern hervorrief und die gesamte Pflanze auch drei Wochen nach der Infektion noch gesund wirkte. Beide Wildtyp-Stämme der Isolate Ferrara und Ahlburg hingegen riefen starke Infektionen und Nekrosen hervor, die schließlich zum Tod der Pflanzen führten (4). Diese Ergebnisse zeigen, dass CbCTB2 essentiell für die Pathogenität von C. beticola ist. Dieses Ergebnis war unerwartet, da Cercosporin als photoaktiviertes ROS-produzierendes Toxin bislang als ursächlich für das Auftreten von Nekrosen in der nekrotischen Phase der Infektion diskutiert wurde nicht jedoch als Voraussetzung für die frühe, biotrophe Phase.
Der Krankheitsindex von Zuckerrübenpflanzen wurde durch Zählung der prozentualen befallenen Blattoberfläche berechnet (Rossi und Battilani 1989). Für jeden Pilzstamm wurden 25 drei Monate alte Zuckerrübenpflanzen für den Infektionstest eingesetzt. Die Stärke der Krankheit wurde nach 21 Tagen ausgewertet. Pflanzen infiziert mit Konidiosporen der Δctb2-Disruptionsmutante zeigten keine Krankheitssymptome, während Pflanzen nach Infektion mit dem Wildtypstamm einen Krankheitsindex von 4 auf einer Skala von 1–9 aufwiesen (5). Nach 24 Tagen zeigten aber auch 12% der Blätter, die mit dem Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm infiziert worden waren, vereinzelt Läsionen (Krankheitsindex 1). Histologische Analysen dieser Läsionen zeigten, dass sich der Stamm allerdings noch nicht im pflanzlichen Gewebe ausgebreitet hatte. Die Läsionen waren im Durchmesser 2–3 mm groß und wurden auch 21 Tage nach Inokulation nicht größer.
Der Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm ist in der Penetration der Wirtspflanzenblätter beeinträchtigt
Zur Fluoreszenzmikrospkopie wurde der Δctb2-dsRed-Reporterstamm aus der Transformation des Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamms mit pII99dsRed (Namiki et al. 2001) genutzt. Mikroskopiebilder wurden mit Hilfe des Stereofluoreszenz-Mikroskops (Leica MZ FLIII) mit dem Filter für DSRed (556 nm) durchgeführt (6). Diese histologischen Analysen wurden durchgeführt, um den Infektionsprozess im Δctb2-Disruptionsmutanten-Stamm auf Zellebene zu beobachten. Unter Ausnutzung fluoreszierenden Reportergene wurden pilzliche Hyphen unter dem Mikroskop detektiert. Die Δctb2-Disruptionsmutanten-Stämme 1070.4 and 1029.16 der Isolate Ahlburg und Ferrara wurden zur Transformation mit dem dsRed-Gen ausgewählt. Δctb2-dsRed 1080.1 Ahlburg wurde für weitere Analysen genutzt. Der C. beticola-DsRed-Reporterstamm diente als Wildtyp-Kontrollstamm. Fluoreszenz-Mikroskopie der adaxialen und abaxialen Blattoberfläche sowie Dünnschnitt-Präparate zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion zeigten, dass der Wildtyp nach 4 Tagen begann, durch die Stomata in das Blatt einzudringen und im Folgenden interzellulär zu wachsen, um 14 Tage nach der Infektion Nekrosen zu verursachen. Δctb2-dsRed 1080.1 Ahlburg hingegen stoppte an der Epidermis und hat das Wirtsgewebe nicht penetriert. Der Wildtyp hatte sich nach 21 Tagen schon stark im Blattgewebe ausgebreitet als nekrotische Läsionen auf der Blattoberfläche sichtbar wurden. Der Δctb2-Stamm hatte das Wachstum zu diesem Zeitpunkt bereits eingestellt und starb offenbar an der Blattoberfläche (6 und 7). Dieser frühe Einfluss eines Sekundärmetabolitclustergens auf die Infektion eines hemibiotrophen Pilzes ist unerwartet, da die Toxinproduktion in direktem Zusammenhang mit der Abtötung des Wirtsgewebes und somit mit der nekrotrophen Wachstumsphase steht. Die Wirkung der von CbCTB2 kodierten O-Methyltransferase auf die erfolgreiche Penetration des Wirtsgewebes liegt somit darin, die Abwehrreaktion der Pflanze auf das Pathogen abzuschwächen, um dessen Eindringen zu ermöglichen. Dies könnte durch ein Intermediat der Cercosporin-Biosynthese gewährleistet werden, welches als Effektor die Abwehrreaktion des Wirts herunterreguliert. Außerdem könnte die O-Methyltransferase auf weitere Signalkaskaden einwirken, die eine Suppression der pflanzlichen Abwehr bewirken und somit das biotrophe Wachstum ins Wirtsgewebe ermöglichen. Des Weiteren mag die Cercosporin-Biosynthese Einfluss auf die oxidative Stressantwort des Pilzes haben: Wenn die Expression Redox-regulierender Gene (in)direkt durch die Cercosporin-Biosynthese hochreguliert wird, ist der Pilz zu Beginn der Infektion in „Alarmbereitschaft” und kann so potentiellen Schäden des Toxins und besonders Schäden durch die Abwehrreaktionen der Pflanze entgegenwirken.
Transientes Testsystem für die RNAi-Vektoren in Zuckerrübenblättern
Es wurde ein transientes Testsystem nach Birch et al. (2010) für die RNAi-Vektoren, welche für RNA kodieren, die gegen die pilzlichen Cercosporin-Biosynthesegene gerichtete ist und die im Fall eines Befalls der Zuckerrübenpflanzen von C. beticola aufgenommen werden, entwickelt. Mittels Co-Bombardement werden ein auf ein Cercosporin-Biosynthesegen abzielender RNAi-Vektor zusammen mit einem Fusion-Konstrukt bestehend aus einem Luciferase-Reportergen und dem zu testenden Cercosporin-Biosynthesegen-Fragment transient in Zuckerrübenblättern exprimiert. Wird das im RNAi-Vektor kodierte dsRNA-Konstrukt prozessiert, sollte die Bildung von dsRNA und daraus resultierend die Bildung von siRNAs gewährleistet sein. Diese siRNAs sollen nicht nur den Abbau des Cercosporin-Biosynthesegen-Fragment-Transkripts sondern auch des daran fusionierten Reportergen-Transkripts bewirken, so dass bei einem funktionalen RNAi-Konstrukt eine Reduktion der Luciferaseaktivität beobachtet werden kann. Das Plasmid pABM-70Sluci umfasst einen CaMV 35S-Promotor, eine multiple Klonierungsstelle, die kodierende Sequenz des Gens LUC aus Photinus pyralis, das für eine Luciferase kodiert, getrennt von einem modifizierten Intron PIV2 aus dem Kartoffel-Gen St-LS1 (Eckes et al. 1986, Vancanneyt et al. 1990), eine weitere multiple Klonierungsstelle sowie einen CaMV 35S-Terminator. In dieses Plasmid pABM-70Sluci wird das mittels PCR amplifizierte Fragment des kodierenden Sequenzbereiches des CbCTB8-Gens kloniert, das auch zur Herstellung des dsRNA-Konstruktes in den pRNAi-Vektor kloniert wurde. Als PCR-Template dient der Vektor pRNAi_CTB8-3, der nur das sense-Fragment enthält. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen HindIII und SalI geschnitten und in den Vektor pABM-70Sluci (9A) kloniert. Dieser wird ebenfalls mit den Restriktionsenzymen HindIII und SalI geschnitten und der 5.9 kb große Vektoranteil über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und anschließend isoliert. Der Ligationsansatz wird in E. coli Stamm XL1-blue (Stratagene, LaJolla, CA) transformiert. Der Vektor pABM_70Sluci-dsRNA.CTB8 (9B) kann zur transienten Zuckerrübentransformation mittels Partikelbeschuss genutzt werden. Dieses transiente Testsystem kann nicht nur zur Validierung der generellen Funktionalität der RNAi-Konstrukte dienen, sondern außerdem genutzt werden, um verschiedene Sequenzbereiche eines Genes auf deren Silencing-Effekt zu untersuchen und schließlich die besten Sequenzbereiche eines Gens für ein optimales Silencing auszuwählen.
Die Luciferase-Aktivitätsbestimmungen werden mit Hilfe des Dual Luciferase^® Reporter Assays (Promega, Mannheim) durchgeführt (Schmidt et al. 2004).
Erstellung der binären Vektoren zur Transformation von Zuckerrübe Ausgehend von dem Plasmid pCBCTB2_1-246, in das mittels PCR amplifizierte kodierende Sequenzbereiche des CbCTB2-Gens kloniert wurden, wurde ein Sequenzbereich (Position 555–810 bp; vgl. SEQ ID NO: 9) von 256 bp über die im Vektor enthaltenen XhoI und SmaI Restriktionsenzymschnittstellen ausgeschnitten und in den Vektor pRNAi (13) kloniert. Dieser Vektor enthält einen CaMV 35S-Promotor, eine multiple Klonierungsstelle, das zweite Intron aus dem Gen AtAAP6, das in Arabidopsis thaliana für eine Aminosäurepermease kodiert, eine weitere multiple Klonierungsstelle sowie einen CaMV 35S-Terminator. Der Vektor wurde mit XhoI und Ecl136II geschnitten und der 4.098 kb große Vektoranteil über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und anschließend isoliert. Der Ligationsansatz wurde in E. coli Stamm XL1-blue (Stratagene, LaJolla, CA) transformiert. In das Plasmid pRNAi_CTB2_sense wurde das CbCTB2-Fragment von 256 bp nun in antisense Orientierung kloniert. Dazu wurde das Fragment erneut aus dem Plasmid pCBCTB2_1-246 mit XhoI und SmaI geschnitten und in den mit SmaI-SalI geschnittenen und damit folglich linearisierten Vektor pRNAi_CTB2_sense ligiert. Das Genfragment sense-intron-antisense CbCTB2 (RNAi-CTB2) wurde aus dem Vektor pRNAi-CTB2 geschnitten und in den Vektor pAM kloniert. Dazu wurden sowohl pAM als auch pRNAi-CTB2 mit HindIII geschnitten und ligiert, so dass das Plasmid pAM_CTB2 entsteht. Aus dem Vektor pAM wurde das RNAi-CTB2-Fragment mittels Sfil-Verdau und Ligation in der Vektor p95N integriert, der zur Zuckerrübentransformation genutzt wurde (10).
Ausgehend von dem Plasmid pCBCTB8_1-1262-A5, in das über PCR amplifizierte kodierende Sequenzbereiche des CbCTB8-Gens kloniert wurden, wurde ein Sequenzbereich (Position 1651–1979 bp; vgl. SEQ ID NO: 10) von 329 bp mittels PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und SmaI geschnitten und in den Vektor pRNAi (13) kloniert. Dieser Vektor enthält einen CaMV 35S-Promotor, eine multiple Klonierungsstelle, das zweite Intron aus dem Gen AtAAP6, das in Arabidopsis thaliana für eine Aminosäurepermease kodiert, eine weitere multiple Klonierungsstelle sowie einen CaMV 35S-Terminator. Dieser wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und Ecl136II geschnitten und der 4.098 kb große Vektoranteil über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und anschließend isoliert. Der Ligationsansatz wurde in E. coli Stamm XL1-blue (Stratagene, LaJolla, CA) transformiert. In das Plasmid pRNAi_CTB8-3 wurde das CbCTB8-Fragment von 329 bp nun in antisense Orientierung kloniert. Dazu wurde das Fragment erneut aus dem Plasmid pCBCTB8_1-1262-A5 mit XhoI und SmaI geschnitten und in den mit SmaI-SalI geschnittenen und damit folglich linearisierten Vektor pRNAi-CTB8-3 ligiert. Das Genfragment sense-intron-antisense CbCTB8 (RNAi-CTB8) wurde aus dem Vektor pRNAi-CTB8 geschnitten und in den Vektor pAM kloniert. Dazu wurden sowohl pAM als auch pRNAi-CTB8 mit HindIII geschnitten und ligiert, so dass das Plasmid pAM_CTB8 entsteht. Aus dem Vektor pAM wurde das RNAi-CTB8-Fragment mittels Sfil-Verdau und Ligation in der Vektor p95N integriert, so dass der Vektor p95N_CTB8 entsteht, der zur Zuckerrübentransformation genutzt wurde (11).
Ausgehend von dem synthetisch hergestellten Vektor pCR2.1_CoCTB2/8 (MWG), der kodierende Sequenzbereiche des CbCTB2-Gens (Position 1483–1841 bp; SEQ ID NO: 11) und des CbCTB8-Gens (Position 2066–2645 bp; SEQ ID NO: 12) enthält, kann ein Sequenzbereich von 939 bp über die im Vektor enthaltenen XhoI und EcoRV Restriktionsenzymschnittstellen ausgeschnitten und in den Vektor pRNAi (13) kloniert werden. Dieser Vektor enthält einen CaMV 35S-Promotor, eine multiple Klonierungsstelle, das zweite Intron aus dem Gen AtAAP6, das in Arabidopsis thaliana für eine Aminosäurepermease kodiert, eine weitere multiple Klonierungsstelle sowie einen CaMV 355-Terminator. Dieser kann mit XhoI und Ecl136II geschnitten und der 4.098 kb große Vektoranteil über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und anschließend isoliert werden. Der Ligationsansatz kann in den E. coli Stamm XL1-blue (Stratagene, LaJolla, CA) transformiert werden. In das Plasmid pRNAi_CoCTB2/8_sense kann das CoCTB2/8-Fragment anschließend in antisense Orientierung kloniert werden. Dazu wird das Fragment erneut aus dem Plasmid pCR2.1_CoCTB2/8 (MWG) mit XhoI und EcoRV geschnitten und in den mit SmaI-SalI geschnittenen und damit folglich linearisierten Vektor pRNAi_CTB2_sense ligiert. Das Genfragment sense-intron-antisense CoCTB2/8 (RNAi-CaCTB2/8) wird aus dem Vektor pRNAi-CoCTB2/8 geschnitten und in den Vektor pAM kloniert. Dazu werden sowohl pAM als auch pRNAi-CTB2 mit HindIII geschnitten und ligiert, so dass das Plasmid pAM_CoCTB2/8 entsteht. Aus dem Vektor pAM wird das RNAi-CoCTB2/8-Fragment mittels Sfil-Verdau und Ligation in den Vektor p95N integriert, der zur Zuckerrübentransformation genutzt werden kann (12).
Transformation und Regeneration der transgenen Zuckerrübenpflanzen
Die binären Vektoren wurden in den Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 nach An (1987) transformiert. Die Selektion rekombinanter A. tumefaciens Klone erfolgte unter Verwendung des Antibiotikums Kanamycin (50 mg/l).
Die Transformation der Zuckerrüben erfolgte nach Lindsey et al. (1991) unter Verwendung des Antibiotikums Kanamycin. Nach ca. 12–16 Wochen können die regenerierten Sprosse (14) mittels PCR auf die Anwesenheit des transformierten Konstrukts überprüft und so auf das Vorhandensein der Nukleinsäure der Erfindung überprüft werden. Die Verwendung der Primer Bo2299 (5'-GTGGAGAGGCTATTCGGTA-3') und Bo2300 (5'-CCACCATGATATTCGGCAAG-3') führte zu der Amplifikation eines 553 bp großen DNA-Fragments aus dem bakteriellen NPTII-Gen, das für die Neomycinphosphotransferase kodiert, welche die Resistenz der Pflanzen gegenüber Kanamycin ermöglicht (15A). Die PCR wurde unter Verwendung von 10 ng genomischer DNA, einer Primerkonzentration von 0,2 μM bei einer Annealingtemperatur von 55°C in einem Multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA) durchgeführt. Die Vermehrung der nach PCR positiv-getesteten Sprosse erfolgt auf MS + 0,1 mg/l BAP + 250 (500) mg/l Timentin + 200 mg/l Paromomycin. Zur Bewurzelung werden die Sprosse auf MS + 6,25 mg/l NAA umgesetzt.
Messung der Resistenzsteigerung in den transgenen Pflanzen
Um die Resistenzsteigerung zu analysieren, werden die transgenen Zuckerrüben zum einen unter in vitro Bedingungen mit einem transgenen Stamm des Blattfleckenerregers C. beticola der Zuckerrübe infiziert. Dieser Stamm exprimiert ein Gen, welches für das Grün fluoreszierende Protein GFP kodiert, das fluorimetrisch nachgewiesen werden kann und so zur Quantifizierung der pilzlichen Biomasse dient. Jeweils 4 Pflanzen einer transgenen Zuckerrübenlinie werden in eine Suspension von C. beticola Myzelfragmenten (400.000 Fragmente/ml) und 4 Pflanzen zu Kontrollzwecken in verdünnten Albani-Gemüsesaft getaucht. Infizierte Pflanzen und Kontrollpflanzen werden anschließend bei 25°C und 16 h Beleuchtung in einem Kulturschrank inkubiert. Infiziertes und nichtinfiziertes Blattmaterial wird 1, 2, 3, 4 und 6–7 Tage nach der Inokulation abgenommen und die GFP-Fluoreszenz mit dem GFP Quantification Kit (Cell Biolabs Inc., CA) wie oben beschrieben quantifiziert.
Die erhöhte Pilzresistenz der transgenen Pflanzen wird zum anderen bei Pilzresistenzprüfungen unter Gewächshausbedingungen, wie sie nachfolgend für die Resistenzprüfung der Zuckerrüben gegenüber C. beticola beschrieben wird, beobachtet. Für die Infektion von Zuckerrüben mit dem Blattfleckenerreger C. beticola werden neben den transgenen Zuckerrübenpflanzen Zuckerrüben des für die Transformation verwendeten Genotyps 3DC4156 als Kontrollpflanzen im Gewächshaus angezogen. Zwei Wochen vor der geplanten Inokulation werden Gemüsesaftplatten (40% Albani-Gemüsesaft) mit dem aggressiven C. beticola Isolat Ahlburg beimpft und bei 25°C inkubiert. Unmittelbar vor der Inokulation wird der pilzbewachsene Agar mit Hilfe eines Objektträgers und etwas Wasser abgekratzt. Die Konzentration an Myzelfragmenten und Pilzsporen wird mit Hilfe einer Zählkammer bestimmt. Die Inokulumdichte wird durch Verdünnen mit Wasser auf eine Konzentration von 20.000 Fragmente/ml eingestellt. Pro zu untersuchender Linie werden 30 Pflanzen durch Besprühen mit der Myzelsuspension inokuliert und die Pflanzen randomisiert im Gewächshaus aufgestellt. Die Resistenzprüfung erfolgt zum einen über eine optische Bonitur, wobei Boniturnoten von 1 (nicht anfällig)–9 (sehr anfällig) vergeben werden, zum anderen über eine Quantifizierung der pilzlichen Biomasse mit Hilfe der quantitativen PCR, bei der der Anteil der pilzlichen DNA im Vergleich zur pflanzlichen DNA im befallenen pflanzlichen Gewebe gemessen wird.
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Zitierte Patentliteratur

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Claims

Transgene Pflanze der Art Beta vulgaris, in deren Genom eine Nukleinsäure stabil integriert wurde, von der in der Pflanze RNA transkribiert wird, wobei gebildete RNA im Falle eines Befalls der Pflanze mit einem Pilz der Gattung Cercospora von diesem aufgenommen werden kann, so dass die Cercosporin-Biosynthese in dem Pilz derart beeinträchtigt wird, dass der Pilz in seiner biotrophen Wachstumsphase gehemmt wird und die Pflanze im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber dem Pilz aufweist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Pilz um Cercospora beticola handelt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure: (a) eine Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NOS: 1–12 oder (b) mindestens ein Fragment von mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer oder mehrerer der Nukleotidsequenzen gemäß den SEQ ID NOS: 1–12 oder (c) eine Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer der Nukleotidsequenzen nach (a) oder (b) aufweist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der gebildeten RNA um doppelsträngige RNA zum Gen-Silencing handelt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der gebildeten RNA um miRNA oder siRNA handelt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Nukleotidsequenz um DNA handelt, die mit einem Promotor operativ verknüpft ist.
Transgene Teile der transgenen Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere transgene Samen und transgene Zellen.
Verfahren zu Herstellung einer transgenen Pflanze, Samen und Teilen einer Pflanze der Art Beta vulgaris, wobei die Pflanze im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber einem Befall von einem Pilz der Gattung Cercospora aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle einer Pflanze der Art Beta vulgaris mit einer Nukleinsäure transformiert und die transgene Pflanze daraus regeneriert wird, wobei von der Nukleinsäure in der Pflanze RNA transkribiert wird und gebildete RNA im Falle eines Befalls der Pflanze mit einem Pilz der Gattung Cercospora von diesem aufgenommen werden kann, so dass eine Cercosporin-Biosynthese in dem Pilz derart beeinträchtigt wird, dass der Pilz in seiner biotrophen Wachstumsphase gehemmt wird und die Pflanze im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber dem Pilz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Pilz um Cercospora beticola handelt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure: (a) eine Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NOS: 1–12 oder (b) mindestens ein Fragment von mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer oder mehrerer der Nukleotidsequenzen gemäß den SEQ ID NOS: 1–12 oder (c) eine Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer der Nukleotidsequenzen nach (a) oder (b) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der gebildeten RNA um doppelsträngige RNA zum Gen-Silencing handelt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der gebildeten RNA um miRNA oder siRNA handelt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Nukleotidsequenz um DNA handelt, die mit einem Promotor operativ verknüpft ist.