DE69930629T2

DE69930629T2 - Induzierbare promotoren

Info

Publication number: DE69930629T2
Application number: DE69930629T
Authority: DE
Inventors: University of Wales John DRAPER; University of Wales Paul KENTON; Biogemma UK Limited Wyatt PAUL
Original assignee: Biogemma UK Ltd
Current assignee: Biogemma UK Ltd
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1999-06-21
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2019-06-22
Also published as: AU4519199A; GB9813345D0; DK1088090T3; CA2331884C; AU772203B2; ATE321872T1; HUP0102911A3; DE69930629D1; WO1999066057A3; WO1999066057A2; EP1088090B1; HUP0102911A2; EP1088090A2; US6841720B1; CA2331884A1; PL345348A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue induzierbare Promotoren von Pflanzen sowie ihre Verwendung bei der gesteuerten Expression von heterologen Genen.
Das Ziel gentechnischer Arbeiten bei Kulturpflanzen besteht darin, ein Gen, das die Eigenschaften einer Pflanze verändert (bzw. mehrere Gene, die die Eigenschaften einer Pflanze verändern), zu insertieren, ohne daß andere, wünschenswerte Elemente des Genotyps der ursprünglichen Pflanze verändert werden. Auf diese Weise läßt sich das Erbgut von Kulturpflanzen vergrößern, so daß es auch Gene beinhaltet, die nicht Bestandteil des ursprünglichen Gen-Pools sind und die mit traditionellen Pflanzenzüchtungsmethoden nicht verfügbar sind. Ein wichtiger Aspekt von solch einer Modifikation ist die Wahl des Promotors. Im Prinzip ermöglicht die Identifikation und Charakterisierung von Promotoren, chimäre Gene zu konstruieren, in denen ein Promotor von einem Gen für das Vorantreiben der Expression eines von einem anderen Gen codierten Proteins unter Bedingungen und an Orten innerhalb der Pflanze, die vom Promotor bestimmt werden, verwendet werden kann.
Promotoren enthalten häufig Elemente, die von induzierbaren Faktoren, welche die zeit- und gewebespezifischen Expression von Genen regulieren, erkannt werden. Bei diesen Elementen handelt es sich typischerweise um kurze Sequenzen, die in den Promotoren von vielen, ja vielleicht sogar allen, Genen, die auf das gleiche Signal reagieren, vorkommen. So wurde in Pflanzen dadurch, daß Promotoren von Genen, die durch das Pflanzenhormon Abszillinsäure hinauf reguliert werden, analysiert wurden, ein Element CCACGTT identifiziert, das diesen Promotoren gemeinsam ist (Marcotte et al., Plant Cell 1 969–976 (1989) und Pla et al., Plant Mol. Biol. 21 259–266 (1993)). Ähnlich enthalten Promotoren, die auf Ethylen reagieren, die PR-Box AGCCGCC (Broglie et al., Plant Cell 1 599–607 (1989) und Deickman et al., Plant Physiol. 100 2013–2017 (1992)). Weiterhin kann man dadurch, daß man über eine Auswahl von solchen Reaktionselementen verfügt, einem Promotor entweder die Fähigkeit, die Genexpression als Reaktion auf ein beliebiges Signal von mehreren Signalen voranzutreiben, oder das Vorliegen einer synergistischen Verstärkung der Expression als Reaktion auf mehrere Signale verleihen. In Tabelle 1 sind verschiedene Consense-Reaktionselementsequenzen, die bei Pflanzen identifiziert wurden, angeführt. Promotor-Reaktionselemente Tabelle 1
Es ist daher aus der DNA-Sequenz von Promotoren möglich, die Umstände, unter denen ein Promotor exprimiert werden wird, dadurch vorherzusagen, daß man nach bereits identifizierten Reaktionselementen innerhalb der Sequenz sucht. Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit solchen induzierbaren Promotoren.
Bis jetzt wurde die Expression von Fremdproteinen in transgenen Pflanzen von einem "konstitutiven" Promotor, wie Cauliflower mosaic virus 35S (CaMV 35S), vorangetrieben. Die Verwendung solch eines Promotors für kommerzielle Zwecke ist dann eingeschränkt, wenn der Promotor für das Vorantreiben der Synthese eines toxischen Proteins oder von Proteinen, die die Pflanze stoffwechselmäßig stark belasten, verwendet wird. Diese Probleme können dann überwunden werden, wenn sich die Expression des Zielproteins unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors befindet, und zwar entweder kurz vor oder kurz nach der Ernte.
Es sind bereits verschiedene pflanzliche Promotoren vorgeschlagen worden, die sich für die chemisch regulierte Expression von Transgenen eignen sollen (Gatz, C (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 48, 89–108). Diese Promotoren können durch Safener oder Elizitoren oder Chemikalien, die eine Wundreaktion vermitteln, oder Chemikalien, die die systemische erworbene Resistenz (systemic acquired resistance, SAR) induzieren, induziert werden. Am intensivsten untersucht sind Promotoren, die durch Safener oder durch Chemikalien, die die SAR induzieren, induziert werden. So beschreiben z.B. WO 93/01 294 und Jepson et al., (1994) Plant Mol. Biol. 26, 1855–1866 die Isolation eines Glutathion-S-Transferasegens (GST-27), das durch den Safener N,N-Diallyl-2,2-dichloracetimid induziert werden kann. Die Anwendungen dieses Promotors sind jedoch insofern beschränkt, als der Promotor konstitutiv in Wurzeln exprimiert wird.
Das Phänomen der systemischen erworbenen Resistenz (SAR) nach Infektion einer Pflanze mit pathogenen Mikroorganismen ist seit langem anerkannt. Wird eine Pflanze von einem möglichen Pathogen, das von der Pflanze erkannt werden kann, befallen, so wird eine Resistenzreaktion aktiviert. Bei dieser Reaktion, die als inkompatible Interaktion bekannt ist, treten typischerweise durch Hypersensitivität verursachter Zelltod an der Stelle des Eindringens des Pathogens, Phytoalexinsynthese, die Produktion aktiver Sauerstoffspezies, Verstärkung der Zellwand, lokale Induktion von Abwehrgenen sowie die Anhäufung von Salicylsäure (SA) auf. Ausgehend von dieser lokalen Reaktion etabliert sich die SAR überall in der Pflanze. Die SAR ermöglicht es nichtinfiziertem Gewebe, rascher auf weitere Infektionen zu reagieren, und diese Resistenz wirkt gegen verschiedene mögliche Pathogene. Das erste Auftreten und die Etablierung der SAR werden von der Synthese mehrerer relativ unverwandter Proteine, die unter der Bezeichnung PR-Proteine (pathogenesis-related proteins) bekannt sind, begleitet.
Es ist seit langem bekannt, daß die Behandlung von Pflanzen mit SA oder Acetyl-SA (Aspirin) eine Resistenz gegen Pathogene induzieren kann (White, R.F. (1979), Virology 99, 410–412). Die neuesten Forschungsergebnisse haben gezeigt, daß die SA sowohl bei der lokalen als auch bei der systemischen Induktion von PR-Proteinen und der Etablierung der SAR eine Schlüsselrolle spielt (Malamy et al., (1990) Science 250, 1002–1004; Metraux et al., (1990) Science 250, 1004–1006; Yalpani et al., (1991): Plant Cell 3, 809–818). Außerdem sind die SAR und die Anhäufung von PR-Protein bei Pflanzen kompromittiert, die eine bakterielle Salicylat-Hydroxylase (die SA in Catechol umwandelt) konstitutiv exprimieren, was ebenfalls für eine Rolle der endogenen SA bei diesen Vorgängen spricht (Gaffney et al., (1993) Science 261, 754–756). Die Spritzbehandlung, Injektion oder Ernährung von Pflanzen über das Wurzelsystem mit SA induziert die Expression von PR-Gen-Promotoren stark über das 50–1000-fache der Basalaktivität (z.B. Mur et al., (1996) Plant J. 9, 559–571). Da die für diese Untersuchungen verwendete SA-Konzentration jedoch cytotoxisch ist (typischerweise 1–2 mM), wurden zahlreiche Versuche unternommen, um weniger schädigende Verbindungen zu identifizieren, die die SA nachahmen.
Eine bestimmte Verbindung, nämlich BTH (Benzo(1,2,3)thiadiazol-7-carbothionsäure-S-methylester), ist bereits als "Kulturpflanzen-Enhancer" im Handel erhältlich und für die großflächige Ausbringung auf dem Feld verfügbar (Gorlach et al., (1996) Plant Cell 8, 629–643). Eine wäßrige Lösung von 1,2 μm BTH reicht aus, um die PR-Gen-Expression zu induzieren (Friedrich et al., (1996) Plant J. 10, 61–70). Im Handel erhältliche BTH-Präparate reichen aus, um bei allen geprüften Pflanzen, darunter auch Arabidopsis und Weizen, eine sehr starke PR-Gen-Expression zu induzieren.
Die Geninduktion nach BTH-Spritzung erreicht zwei Tage nach der Ausbringung ein Maximum und hält mindestens 10 Tage lang an. Obwohl dadurch eine verstärkte Resistenz in dem behandelten Gewebe induziert wird, ist der Wirkungsmechanismus unbekannt, und man weiß auch nicht, ob diese Verbindung alle Auswirkungen der SA, wie Potenzierung der Geninduktion oder den pathogeninduzierten "oxidative burst" nachahmen kann.
Eine mögliche Quelle für induzierbare Promotoren ist daher die mit der Pathogenese in Zusammenhang stehende (pathogenesis-related, PR) "Familie" von mit der Abwehr in Zusammenhang stehenden Genen. Bei den PR-Genen handelt es sich um eine vielfältige Gruppe von Proteinen, von denen einige (z.B. die Klassen PR-2 und PR-3) bekante Funktionen als Chitinasen oder Beta-1,3-glucanase ausüben. Andere (z.B. die Klassen PR-1 und PR-5) werden während der Pflanzen-Pathogen-Reaktion induziert, üben jedoch keine klar identifizierbare Funktion aus. Typischerweise gehören zu den PR-Proteinen von jeder Klasse solche mit saurem pH und solche mit basischem pH. Obwohl es Ausnahmen zu dieser Regel gibt, sind die basischen PR-Proteine tendenziell an einer Stelle innerhalb der Zelle lokalisiert (z.B. der Vakuole), während die sauren PR-Proteine sezerniert werden.
Pflanzen müssen auch auf verschiedene andere Arten von Umweltstreß reagieren, darunter Wasserstreß, mechanische Verwundung und Verwundung durch Pflanzenfresser, UV-Licht- und Oxidationsstreß sowie hohe und niedrige Temperaturen. Bei manchen dieser Bedingungen werden die PR-Gene hinauf reguliert. So wird die Expression des Tabak-Osmotins (eines basischen, in der Vakuole lokalisierten PR-5-Gens) nicht nur durch Provokation durch Pathogene induziert, auch durch Salzstreß (Grillo et al., Physiologia Plantarum 93 498–504 (1995)). Die Expression von PR-1a wird im Anschluß an Behandlung mit Wasserstoffperoxid (das Oxidationsstreß induziert) und in Pflanzen, die unter UV-Streß leiden, induziert (Yalpani et al., Planta 193 372–376 (1994)). Den Reaktionen auf Verwundung und auf Provokation durch Pathogene sind mehrere ähnliche Merkmale gemeinsam, darunter die Expression von Abwehrgenen und das Auftreten einer systemischen Reaktion, die durch bewegliche Signale vermittelt wird. Im allgemeinen reagieren die basischen PR-Proteine auch auf Reize, die durch Verwundung ausgeübt werden.
Es wurden verschiedene Elemente, die in den PR-Gen-Promotoren vorliegen, identifiziert. Das PR-2d-Gen (das für eine b-1,3-Glucanase codiert) aus Tabak wird nach Provokation des Tabakmosaikvirus (TMV) in Gewebe, in dem eine Hypersensitivitätsreaktion (HR) stattfindet, exprimiert und wird durch exogene SA induziert (Shah et al., Plant J. 10 1089–1101 (1996)). Die Region –364 bis –288 in dem PR-2d-Promotor vermittelt Ansprechen auf SA, und ein 25 Bp Element in dieser Region wird von Zellkernfaktoren des Tabaks erkannt. Ein auf SA reaktionsfähiges Element wurde auch vom CaMV-35S-Promotor in Position –90 bis –46 isoliert. Das Element entspricht einer as-l1-Stelle (Qin et al., Plant Cell 6 863–874 (1994)). Im β-1,3-Glucanasepromotor der Gerste ist die Sequenz TCATCTTCTT mehrmals wiederholt; sie liegt in über 30 streßinduzierten Genen vor (Goldsbrough et al., Plant J., 3(4):563–571 (1993b)). Diese Region bindet 40 kDa Zellkernproteine des Tabaks, deren Bindung in mit SA behandelten Pflanzen erhöht ist. Von Buttner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 5961–5966 (1997) haben gezeigt, daß Arabidopsis-Proteine, die ein auf Ethylen reaktionsfähiges Element binden, an die PR-Box binden und daß die PR-Box und die G-Box synergistisch wirken.
Die PR-1-Gene wurden ziemlich genau untersucht, und der Promotor eines dieser Gene, nämlich PR-1a aus Tabak, wurde als geeigneter induzierbarer Promotor vorgeschlagen (EP 0 332 104-A2). Tabak-PR-1a wird sowohl in lokal infiziertem Gewebe als auch später während des Auftretens der SAR exprimiert. Die Infektion von Tabakpflanzen der Sorte Samsun NN führt daher zur Anhäufung von endogenen PR-1-Proteinen, und zwar sowohl in inokulierten Blättern (ungefähr 4 Tage nach der Infektion) als auch später (ungefähr 8 Tage später) in oberen, nicht infizierten Blättern an der gleichen Pflanze. Es wurde auch über die lokale (ungefähr 12 Stunden nach der Inokulation) und systemische (3–7 Tage) Induktion der PR-1a-GUS-Expression in mit Pseudomonas syringae p.v. syringae infiziertem Tabak berichtet (Bi et al., (1995) Plant J. 8:235-245; Mur et al., (1996) Plant J. 9:559–571). Die direkte Behandlung mit SA induziert eine starke PR-1a-Promotor GUS-Expression in transgenem Tabak (Bi et al., supra). Die SAR-Induktoren BTH und INA induzieren ebenfalls eine starke endogene PR-1a- sowie PR-1a-GUS-Expression.
Verwunden induziert ebenfalls eine leichte Steigerung der PR-1a-GUS-Expression (Darby, R., Unpublished observations. Ohshima et al., (1990) Plant Cell 2, 95–106). Wie auch bei anderen PR-1-Proteinen der Fall findet bei PR-1a eine entwicklungsregulierte Expression statt. So wird die PR-1a-GUS also in den Blättern, Petiolen, der Stengelrinde, den Pollen und den Sepalen von blühendem Tabak exprimiert (Uknes et al., Plant Cell 5(2):159–169 (1993)). Die PR-1a-GUS wird auch in Wurzeln exprimiert (Kenton, P; persönliche Mitteilung).
Der PR-1a-Promotor wurde intensiv untersucht. Van de Rhee und Bol (Plant Mol. Biol., 21(3):451–461 (1993b)) haben vier Regulationselemente im PR-1a-Promotor identifiziert, die alle für eine maximale Aktivität erforderlich waren und von denen kein Element allein fähig war, eine Promotoraktivität zu vermitteln. Der PR-1a-Promotor enthält mehrere Elemente, die GT-1-artige sowie Mybl-Transkriptionsfaktoren binden (Buchel et al., Plant Mol. Biol., 30(3):493–504 (1996)). Außerdem induzieren die SA und aktive Analoga nicht nur die Expression von PR-Genen, sondern auch von mybl.
Die Tatsache, daß das PR-1a-Gen stark auf SA anspricht und daß eine Behandlung oder eine Infektion mit SA zu sehr hohen PR-1α-GUS-Expressionsniveaus führt, könnte zur unerwünschten Expression einer Fusion zwischen einem PR-1a-Promotor und einem Gen führen, und zwar deshalb, weil die endogenen SA-Spiegel gestört werden, (z.B. durch eine Veränderung im Redox-Status). Das könnte seine Nützlichkeit für das Vorantreiben von Genen, deren Produkte entweder in großen Mengen toxisch sind oder den pflanzlichen Stoffwechsel stark belasten, einschränken. Schließlich weisen die PR-1-Gene im allgemeinen und PR-1a im besonderen eine starke konstitutive/entwicklungsregulierte Expression auf, insbesondere während der Blüte. Auch hier könnte dies zu einer starken unplanmäßigen Expression von Transgenen, die von PR-1a-Promotor vorangetrieben werden, führen.
Die PR5-Proteine, eine weitere Klasse der PR-Proteine, lassen sich in zwei Gruppen unterteilen, nämlich die sauren extrazellulären thaumatinartigen Proteine und die basischen intrazellulären Osmotine. Traditio nellerweise sind die Osmotine mit abiotischem Streß assoziiert worden. Diese osmotisch induzierte Expression ist jedoch typischerweise zusätzlich zu einer starken konstitutiven Expression (Stintzi et al., Biochimie, 75:687–706 (1993); Leone et al., Plant Physiol., 106:703–712 (1994); Van Kan et al., Plant Mol. Biol., 27:1205–1213 (1995)) und einer starken entwicklungsregulierten Expression (Linthorst, Crit. Rev. Plant Sci., 10:123–150 (1991); Stintzi et al., Physiol. Mol. Plant Pathol. 38 137–146 (1991); Raghothama et al., Plant Mol. Biol. 34:393–402 (1997)). Die Expression der Osmotine ist ebenfalls als Reaktion auf Streß wie Austrocknen, Verwunden, niedrige Temperaturen (Raghothama et al., Plant Mol. Biol. 23:1117–1128 (1993); Grillo et al., (1995) supra; Zhu et al., Plant Mol. Biol., 28:17–26 (1995b)) sowie chemische Faktoren wie Ethylen (beim Tabak, Raghothama et al., 1993, supra; Chang et al., Physiologia-Plantarum, 100:341–352 (1997)) und Cytokinine (Thomas & Bohnert, Plant Physiol., 103:1299–1304 (1993)) erhöht. Eine Provokation durch Pathogene induziert ebenfalls die Expression von Osmotinen (Zhu et al., Plant Physiol., 108:929–937 (1995a); (1995b), supra; Chang et al., (1997), supra), die bei einigen Osmotinen systemisch (Zhu et al., (1995b), supra) bzw. für andere lokal sein kann (Zhu et al., (1995a), supra). Bei den Osmotingenen handelt es sich offenbar nicht um ideale Ausgangsmaterialien für induzierbare Promotoren.
Im Gegensatz zu den Osmotinen, die in der Vakuole lokalisiert sind, werden die sauren PR-5s (aPR-5) sezerniert, und es fehlt ihnen die Verlängerung am C-terminalen Ende, bei der es sich um ein Targeting-Signal für die Vakuole handeln kann (Linthorst, (1991), supra; Stintzi et al., (1993), supra). Es wurde gezeigt, daß die aPR5-Proteine bei Angriff durch Pathogene angehäuft werden, so z.B. bei der Gerste (Bryngelsson & Green, Plant Mol. Plant Path., 35:45–52 (1989): Boyd et al., Plant Mol. Plant Path., 45:47–58 (1994); Reiss & Bryngelsson, Physiol. Mol. Plant Path., 43:331–341 (1996); Schweizer et al., Plant Physiol., 114:73–88 (1997); Vale et al., Physiol. Mol. Plant Path., 44:207–215 (1994)) und beim Weizen (Rebmann et al., Plant Mol. Biol., 17:283–285 (1991)). Mit Western-Blots konnten Stintzi et al. (1991) keine aPR-5 an gesunden Tabakblättern nachweisen, während Osmotin quantitativ exprimiert wurde. Nach Provokation mit TMV tritt aPR-5 nach 4–6 Stunden auf, während Osmotin 2–4 Stunden nach der Inokulation in Mengen über dem Basalniveau angehäuft wird (Stintzi et al., 1991). Bei mit TMV infiziertem Tabak wurde aPR-5 in extrazellulären taschenartigen Strukturen zwischen den Mesophyllzellen nahe der Infektionsstelle lokalisiert (Dore et al., Arch. Virol., 120:97–107 (1991)).
Auch mit zahlreichen anderen Behandlungen wurde die Expression von extrazellulären aPR-5-Proteinen induziert. Bei der Sonnenblume werden extrazelluläre aPR-5-Proteine in Blattscheiben durch 5 mM Aspirin, 10 mM Ethephon, 10 mM NAA, 10 mM 2,4-D, UV-Licht, 5 mM MnCl₂, 5 mM HgCl₃, 5 mM Citronensäure und 5 mM Oxalsäure induziert (Jung et al., Journal of Plant Physiol., 145:153–160 (1995)). 1 ppm INA induziert Expression eines Gersten-Homologs des thaumatinartigen Proteins aus Reis und JA die Expression einer Gerste-aPR5 (Schweizer et al., (1997), supra). aPR-5s werden auch in gegen niedrige Temperaturen abgehärtetem Winterroggen exprimiert, wo sie eventuell eine Rolle bei der Vorbeugung von Eisschädigung spielen (Hon et al., Plant Physiol., 109:879–889 (1995)).
Es gibt jedoch nur wenige Informationen über die Entwicklungsregulierungsexpression von aPR-5s. Beim Mais ist die konstitutive Expression hauptsächlich auf nichtembryonales Gewebe des sich entwickelnden Samens beschränkt und erreicht 2 bis 4 Wochen nach der Bestäubung ein Maximum, ist jedoch noch in ausgetrocknetem Samen nachweisbar. In Maisblättern wurde nur eine leichte Expression nachgewiesen (Malehorn et al., Plant Physiol., 106:1471–1481 (1994)). Ein thaumatinartiges Protein mit einer Größe von 29 kDa wurde in reifen Kirschenfrüchten nachgewiesen (Fils-Lycaon et al., Plant Physiol., 111:269–273 (1996)).
Über aPR-5-Promotoren ist nur wenig bekannt, da nur ein Tabak-aPR-5-Promotor vom E2-Gen isoliert, mit dem GUS-Reportergen fusioniert und analysiert worden ist (Albrecht et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18, 155–158). In dieser Untersuchung wurde gezeigt, daß TMV sowohl eine lokale als auch eine systemische GUS-Aktivität induzierte, wobei die lokale Reaktion die systemische Reaktion übertraf. Das bzw. die für die TMV-Induktion dieses aPR-5 verantwortliche(n) Element(e) wurde(n) in der Promotorregion –1364 bis –718 entdeckt. Mittels Nukleinsäure-Hybridisierung wurde keine signifikante Homologie zwischen diesem PR-5-Promotor von Tabak und PR-1a-Promotor gefunden.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung von neuen, nützlichen induzierbaren Promotoren, mit denen manche oder alle Probleme des Stands der Technik überwunden werden, und zwar dadurch, daß ein induzierbarer Promotor bereitgestellt wird, der auf niedrige Mengen eines umweltfreundlichen nichtcytotoxischen Induktionsmittels, welches sowohl unter Feldbedingungen als auch unter in-vitro-Bedingungen verwendet werden kann, anspricht und der im Vergleich zu ähnlichen Promotoren auch nur eine schwache umwelt- oder entwicklungsinduzierte Expression und eine schwache pathogeninduzierte systemische Aktivierung aufweist.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird also ein rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül bereitgestellt, das einen induzierbaren Genpromotor enthält, der

i) durch Induktion mit pflanzlichen Regulatoren die Expression eines 21,3 kDa großen Proteins in Asparagus officinalis auf natürliche Weise vorantreibt; oder
ii) die Expression von Proteinen, die dem 21,3 kDa großen Protein von Asparagus officinalis, von den Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae entsprechen, auf natürliche Weise vorantreibt; oder
iii) die Expression von Proteinen, die den Proteinen von i) oder ii) im wesentlichen homolog sind, auf natürliche Weise vorantreibt; oder
iv) unter stringenten Bedingungen mit einem beliebigen der Promotoren i), ii) oder iii) hybridisiert.

Der in i) definierte Promotor stammt von einem thaumatinartigen mit PR-5 verwandten Gen aus Asparagus officinalis (AoPRT-L) und ist fähig, die Expression von heterologen Genen in ein- und zweikeimblättrigen Pflanzen voranzutreiben. pAoPRT-L weist über die Verwendung der zuvor beschriebenen Promotoren bei der Expression von heterologen Genen verschiedene Vorteile auf. In Tabelle 2 werden die Eigenschaften des AoPRT-L Promotors mit den Eigenschaften von PR1a und Osmotin verglichen. Tabelle 2 - Vergleich der Expressionsmuster von PR-1a, Osmotin und AoPRT-L
Aus diesen Werten sowie in den Beispielen angeführten Werten sieht man, daß

1) pAoPRT-L eine minimale entwicklungsregulierte Expression aufweist,
2) pAoPRT-L im Gegensatz zu Tabak-pPR1a und aPR5-E2, durch Pathogeninfektion nichtsystemisch aktiviert wird,
3) pAoPRT-L nicht auf ABA, Ethylen, Oxidationsstreß und osmotischen Streß sowie Verwundung anspricht,
4) pAoPRT-L-Expression durch SA und BTH (Novartis), einer Chemikalie, die für die Verwendung im Feld freigegeben ist, induziert wird.

Aufgrund dieser Eigenschaften ist der pAoPRT-L-Promotor eine aussichtsreiche Möglichkeit für die Expression von Fremdproteinen in transgenen Pflanzen. Außerdem können auch geeignete Promotoren gemäß ii) oder iii) identifiziert werden, die die Expression von PR-Proteinen auf äquivalente oder homologe Art und Weise wie das pAoPRT-L-Protein von Asparagus officinalis in der Familie Liliaceae oder Amaryllidaceae oder überhaupt in anderen Pflanzenfamilien vorantreiben.
Der Fachmann kann mit fachbekannten Techniken, wie z.B. im vorliegenden Text beschrieben, leicht Proteine identifizieren, die zu dem AoPRT-L-Protein von Asparagus officinalis oder äquivalenten Proteinen von den Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae im wesentlichen homolog sind. Bei solchen Proteinen handelt es sich um Proteine, die dem AoPRT-L-Protein funktionell äquivalent sind. Im wesentlichen homologe Proteine sind daher vorzugsweise induzierbare PR-Proteine, die im wesentlichen frei von systemisch aktivierter Expression und entwicklungsregulierter Expression sind.
Ein wichtiger Vorteil der induzierbaren Promotoren der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie keine entwicklungsregulierte und systemisch aktivierte Expression aufweisen. Dies steht im Gegensatz zu den konstitutiven Promotoren, die üblicherweise zum Vorantreiben der Expression von heterologen Genen in transgenen Pflanzen verwendet werden, bzw. den induzierbaren Promotoren, die ebenfalls entwicklungsmäßig oder aufgrund von Pathogenbefall in der ganzen Pflanze aktiviert werden. Die Verwendung eines induzierbaren Promotors, der nicht entwicklungsmäßig oder systemisch aktiviert wird, ist ganz besonders für die Produktion von transgenen Genprodukten von Pflanzen unter Feldbedingungen nützlich, da dadurch das gewünschte Produkt auf kontrollierte Art und Weise geerntet werden kann. Ein Promotor, der nicht entwicklungsmäßig reguliert ist, ermöglicht nämlich die Expression von Genen, deren Produkte für die Pflanze schädlich sein können bzw. die Wüchsigkeit der Pflanze verringern. Würden solche Produkte konstitutiv exprimiert werden, und zwar entweder in der gesamten Pflanze oder in einem Großteil der Pflanze, oder zu wichtigen Entwicklungsstadien, so kann dann die Pflanze Schaden nehmen, sich abnormal entwickeln oder absterben. So existiert z.B. bei Promotoren wie GST 27 und PR1a eine beträchtliche entwicklungsregulierte Expression, die die Reihe der Transgene, die mit Hilfe dieser Promotoren exprimiert werden können, einschränkt. Wo jedoch ein indizierbarer Promotor der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jedoch ein beliebiges Gen exprimiert werden, da die Gefahr der Genexpression zu ungünstigen Entwicklungsstadien vermieden wird. Die Verwendung eines erfindungsgemäßen Promotors, der weiterhin nicht durch Pathogenbefall systemisch aktiviert wird, vergrößert auch das Spektrum der Gene, die von diesem Promotor aus exprimiert werden können, da eine ungeeignete Expression, die für die Pflanze schädigend sein kann, unter Freilandbedingungen, wo die Pflanzen einem starken Befallsdruck durch Pathogene ausgesetzt sind, vermieden wird. Kurz gesagt, und zusätzlich auch aufgrund mangelnder Aktivierung als Reaktion auf Reize wie Oxidationsstreß und osmotischem Streß, ABA, Ethylen und Verwundung, ermöglicht der AoPRT-L-Promotor eine verbesserte Kontrollierbarkeit der Expression im Vergleich zu derzeit vorhandenen, von Pflanzen stammenden Promotoren, die für die chemisch induzierte Expression von Transgenen derzeit verwendet werden bzw. eventuell in der Zukunft verwendet werden. Die Induzierbarkeit des Promotors mit einer Chemikalie, die für die Verwendung in Freiland freigegeben ist, ist ein weiteres Indiz für die Eignung des AoPRT-L-Promotors für die Expression von heterologen Genen in Freilandpflanzen.
PR-Proteine (pathogenesis related proteins) können im Rahmen der vorliegenden Erfindung als diejenigen Proteine definiert werden, die in Pflanzen als Reaktion auf Pathogene exprimiert werden. Eine Hypersensitivität gegenüber einem Pathogen ist durch eine Lokalreaktion gekennzeichnet, zu der auch die Nekrose der Gewebe, die die Infektionsstelle unmittelbar umgeben, beinhaltet. Zu weiteren Merkmalen einer lokalen Hypersensitivitätsreaktion zählen die Synthese von Phytoalexinen, die Produktion von aktiven Sauerstoffspezies, die Stärkung der Zellwand, die lokale Induktion von Abwehrgenen sowie die Anhäufung von Salicylsäure. Dies steht im Gegensatz zu einer Sensitivitätsreaktion, bei der sich das Pathogen in der ganzen Pflanze ausbreitet. Auf die lokale Hypersensitivitätsreaktion kann sich die Induktion einer systemischen erworbenen Resistenz (SAR) anschließen. Diese Reaktion ermöglicht es nicht-infiziertem Gewebe, rasch auf erneute Invasion eines Pathogens zu reagieren. PR-Proteine können während der Hypersensitivitätsreaktion und zu Beginn der SAR exprimiert werden. Zu den Pathogenen, die zur Expression von einem oder mehreren der PR-Proteine führen können, zählen z.B. Viren oder Viroide, z.B. das Tabak- oder Gurkenmosaikvirus, Ringspotvirus, Nekrosevirus, Pelargonium-Blattrollvirus, Rotklee-Mottle-Virus und ähnliche Viren, Pilze, z.B. Phythopophthora parasitica oder Peronospora tabacina, Bakterien wie z.B. Pseudomonas syringae oder Pseudomonas tabaci, oder Blattläuse wie Mycus persicae. Diese Aufzählung ist jedoch nicht als vollständig anzusehen, und die Hypersensitivitätsreaktion und SAR können durch verschiedene andere Pathogene, die hier nicht erwähnt wurden, induziert werden.
Ein PR-Protein kann mit Hilfe von beliebigen bekannten Vorgehensweisen identifiziert werden. So kann z.B. ein PR-Protein dadurch identifiziert werden, daß man Proteine, die vor bzw. während unterschiedlichen Stadien sowie nach der Infektion mit einem Pathogen isoliert werden, vergleicht. PR-Proteine können auch aufgrund ihrer Homologie mit bekannten PR-Proteinen, durch Promotoranalyse oder durch Funktionsanalyse der Expressionsprodukte einer cDNA-Bibliothek identifiziert werden. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wäre mit diesen Techniken sowie mit anderen geeigneten Techniken vertraut.
Für die vorliegende Erfindung kann die systemische Aktivierung eines Gens als Aktivierung eines Gens vor oder während der systemischen erworbenen Resistenzreaktion einer Pflanze zur Pathogenresistenz definiert werden. Wie oben diskutiert werden solche Gene typischerweise in nichtinfizierten Teilen einer Pflanze exprimiert, genauer gesagt überall in der Pflanze infolge der lokalen Reaktion einer Pflanze aufgrund einer Infektion mit einem Pathogen. Solche Gene codieren üblicherweise für Produkte, die an der systemisch erworbenen Resistenz einer Pflanze gegen Pathogenbefall beteiligt sind, z.B. PR-Proteine. Im Gegensatz dazu wird sich ein Gen, das im wesentlichen frei von systemischer Aktivierung ist, unter der Kontrolle eines Promotors befinden, der keine Expression des Gens innerhalb der ganzen Pflanze in nichtinfizierten Geweben, die weit von der Befallsstelle mit dem Pathogen entfernt liegen, aktiviert. Die Expression solcher Gene ist auf die Infektionsstelle oder die unmittelbare Umgebung der Infektionsstelle beschränkt. Promotoren, die im wesentlichen frei von einer systemisch aktivierten Expression sind, führen nicht zu Expressionsniveaus innerhalb der ganzen Pflanze, während oder nach der systemischen erworbenen Resistenzreaktion, die wesentlich oberhalb der Basalexpression liegen und führen nicht zu einer Expression innerhalb der ganzen Pflanze, die einer. beträchtlichen Teil des lokal bei oder in der Umgebung der Infektionsstelle erreichten Expressionsniveaus ausmacht. Diese Basalniveaus können von Pflanze zu Pflanze schwanken, sollten jedoch im Idealfall Null oder ungefähr Null ausmachen.
Alle Zellen einer bestimmten Pflanze enthalten das gleiche Genom und verhalten sich daher gleich. Die Zellen einer Pflanze können jedoch in verschiedenen unterschiedlichen Zuständen vorliegen, je nach dem Entwicklungsweg, den sie eingeschlagen haben. An der Kontrolle der Entwicklungsmöglichkeiten, die von den Pflanzenzellen gewählt werden, sind verschiedene Gene beteiligt. Diese Gene, die als Entwicklungskontrollgene bekannt sind, werden entwicklungsmäßig reguliert und typischerweise nur in einem bestimmten Pflanzengewebe oder Organ zu einem bestimmten Entwicklungsstadium exprimiert. So wird z.B. ein Gen, das an der Kontrolle der Entwicklung der Blütenorgane einer Pflanze beteiligt ist, nur in denjenigen Geweben exprimiert werden, aus denen sich die Blütenorgane vor oder während der Blüte entwickeln. Ein Gen, das im wesentlichen frei von einer entwicklungsregulierten Expression ist, kann als Gen definiert werden, das nicht nur in einem bestimmten Organ oder Gewebe zu einem bestimmten Entwicklungsstadium exprimiert wird oder das in solchen Geweben zu diesen Zeitpunkten nur auf dem Basalniveau exprimiert wird. Gene, die im wesentlichen frei von einer entwicklungsregulierten Expression sind, können in den meisten Geweben während der gesamten Lebenszeit der Pflanze exprimiert werden, z.B. diejenigen Gene, die an der Produktion, am Transport und an der Speicherung von Nährstoffen beteiligt sind. Andere Gene, die im wesentlichen frei von einer entwicklungsregulierten Expression sind, können nur als Reaktion auf externe Reize, wie Umweltreize und chemische Reize exprimiert werden. Entwicklungsregulierte Gene und ihre Promotoren können auf unterschiedliche Art und weise identifiziert werden. So ermöglicht z.B. eine Mutationsanalyse die Identifikation von Mutationen, die die Entwicklung eines bestimmten Organs oder Gewebes einer Pflanze, und daher die entsprechenden Promotoren und Gene, die an der Regulationsentwicklung beteiligt sein müssen, verhindern oder hemmen. Solche Promotoren und Gene können auch aus cDNA-, genomischen DNS- oder mRNA-Bibliotheken oder aufgrund von Nukleotid- oder Aminosäuresequenzhomologien mit bekannten entwicklungsregulierten Genen, oder aufgrund von Homologie zwischen den stromaufwärts gelegenen Regulationssequenzen identifiziert werden.
Ein erfindungsgemäßer Promotor, der im wesentlichen frei von entwicklungsregulierter Expression ist, kann auf verschiedene Art und Weise identifiziert werden. So führt z.B. die Mutation oder Deletion eines Promotors, der im wesentlichen frei von entwicklungsregulierter Expression ist, zu keiner Hemmung oder Hinderung der Entwicklung oder Störung der pflanzlichen Anatomie.
Vorzugsweise codiert die rekombinante oder isolierte DNA der vorliegenden Erfindung für einen Promotor, der des weiteren im wesentlichen frei von Aktivierung als Reaktion auf Umweltreize und hormonale Reize, wie ABA, Ethylen, Oxidationsstreß, osmotischen Streß und Verwundung ist. Aufgrund dessen wird eine ungünstige Expression eines Gens unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors als Reaktion auf die oben genannten Reize vermieden. Auf diese Weise wird eine kontrollierte Expression eines Gens ermöglicht. Promotoren, die im wesentlichen frei von Aktivierung als Reaktion auf Umweltreize oder hormonale Reize sind, können auf verschiedene Art und Weise identifiziert werden, z.B. durch Verknüpfung der interessierenden Promotorsequenzen mit einem Reportergen, Transfektion einer Pflanze mit dem Promotor/Reportergen-Konstrukt und Analyse der Expression des Reportergens nach Ausübung eines hormonellen Reizes oder eines Umweltreizes. Promotoren, die keine Expression des Reportergens als Reaktion auf die oben genannten Reize aktivieren, oder die nur niedrige Niveaus bzw.
Basalniveaus des Reportergens verursachen, können als im wesentlichen frei von chemischer Stimulation oder Umweltstimulation identifiziert werden. Ob niedrige Niveaus bzw. Basalniveaus annehmbar sind, hängt völlig von dem exprimierten Gen ab. Codiert das Gen für ein harmloses Produkt, so wird ein niedriges konstitutives Expressionsniveau kaum eine große Stoffwechselbelastung der Pflanze darstellen. Ist das Produkt jedoch cytotoxisch, so kann auch nur ein geringes Expressionsniveau schädlich sein.
Vorzugsweise codiert die erfindungsgemäße rekombinante oder isolierte DNA für einen Promotor, der als Reaktion auf Pflanzenregulatoren induzierbar ist. Bei den Pflanzenregulatoren handelt es sich vorzugsweise um SAR-Induktoren, die natürlich oder synthetisch sein können. Zu solchen SAR-Induktoren zählen z.B. Salicylsäure (SA) und BTH (Novartis) sowie die Analoge wie 4-Chlor-SA, 5-Chlor-SA und 3,5-Chlor-SA, Benzoesäure (BA), 2,3-Dihydro-BA, Dichlorisonikotinsäure (INA) und verschiedene Halogenide dieser Verbindung (Sanchez-Casas & Klessig, Plant Physiol. 106 1675–1679 (1994); Conrath et al., PNAS 92 7143–7147 (1995)).
In der vorliegenden Erfindung wird das Gen, das für das 21,3 kDa große PR-Protein in Asparagus officinalis und äquivalente Proteine in den Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae codiert, als AoPRT-L-Gen bezeichnet werden. Dem AoPRT-L ist eine gewisse Homologie mit anderen PR-Proteinen gemeinsam, insbesondere mit denjenigen der PR-5-Familie, wie Tabak-Osmotin und osmotinartiges Protein. Verschiedene Proteine der PR-5-Familie sind charakterisiert worden, und bei manchen, z.B. bei Osmotin, hat sich gezeigt, daß bei Pathogenbefall eine lokale und systemische Aktivierung und eine entwicklungsregulierte Expression stattfindet. Im Gegensatz dazu scheinen die sauren PR-5-Genprodukte eine lokale Aktivierung als Reaktion auf Pathogene aufzuweisen. Bezüglich der entwicklungsregulierten Expression dieser Gene sind sehr wenig Informationen verfügbar, obwohl es Hinweise darauf gibt, daß auch sie entwicklungsmäßig reguliert werden. So wurde z.B. eine konstitutive Expression in nichtembryonalem Gewebe des sich entwickelnden Samens bei Mais beobachtet (Malehorn et al., 1994 Plant Physiol., 106: 1471–1481), und die Anhäufung eines thaumatinartigen Proteins wurde in reifenden Kirschenfrüchten beobachtet (Fils-Lycaon et al., 1996). Das Transkriptionsprofil des AoPRT-L-Gens unterscheidet sich von diesen Genen insofern, als es bei der systemischen Reaktion auf Pathogenbefall nicht aktiviert wird und eine minimale entwicklungsregulierte Expression aufweist. Weiterhin wird im Gegensatz zu den PR-5-Genen AoPRT-L nicht als Reaktion auf verschiedenste Reize wie ABA und Ethylen induziert. Sowohl Salicylsäure als auch ihr synthetisches Analog BTH sind fähig, eine Expression vom AoPRT-L-Promotor aus zu induzieren.
Das im vorliegenden Text angegebene Molekulargewicht des AoPRT-L-Proteins ist lediglich mutmaßlich und beruht auf der Anzahl der Aminosäuren, die in dem Protein vorkommen. Das von dem AoPRT-L-Gen codierte 21,3 kDa große Protein weist 223 Aminosäuren auf. Die Molekulargewichte beziehen sich auf das nichtmodifizierte Protein und berücksichtigen keine Veränderungen aufgrund von Modifikationen nach der Translation.
Das oben angegebene Molekulargewicht bezieht sich nur auf dasjenige des AoPRT-L-Gens von Asparagus officinalis. Der Fachmann wird mit fachbekannten Standardmethoden leicht äquivalente Proteine aus den Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae identifizieren können. So können z.B. Gene, die für die Proteine, die AoPRT-L äquivalent sind, codieren, durch Nukleinsäure-Hybridisierungsstudien, Kartierung mit Hilfe des "Restriction Fragment Length Polymorphism", PCR-Clonierung und andere bekannte Verfahren identifiziert werden. Das AoPRT-L-Gen oder dessen Fragmente können als Sonde für die Identifikation von Genen oder DNA-Sequenzen, die für äquivalente Proteine codieren, verwendet werden. Ein Fragment des AoPRT-L-Gens kann 10, 20, 30, 50, 75 oder 100 Nukleotide sein. Vorzugsweise wird ein Fragment von 15 bis 20 Nukleotiden als Sonde verwendet. Typischerweise wird die Sonde für die Hybridisierung von Genen, die für äquivalente Proteine codieren, unter stringenten Bedingungen verwendet werden. Bei den geeigneten Bedingungen kann es sich um diejenigen handeln, die in Plant Genetic Transformation and Gene Expression: A Laboratory Manual, Hrsg. Draper, J et al., 1988, Blackwell Scientific Publications, S. 252–255 beschrieben sind und die folgendermaßen abgewandelt werden: Vorhybridisierung, Hybridisierung und Waschen bei 55–65°C, letzte Waschschritte mit 0,5X SSC, 0,1% SDS wird weggelassen.
Bevorzugte erfindungsgemäße Promotoren sind solche, die die Expression des 21,3 kDa schweren Proteins oder von äquivalenten Proteinen der Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae vorantreiben. Die Sequenz des A. officinalis-Promotors ist in 6 dargestellt. Es wird vorgesehen, daß die gesamte in 6 gezeigte Promotorsequenz bzw. Fragmente davon verwendet werden kann/können. Die Fragmente können 20, 50, 100 oder 150 Nukleotide lang sein. Bei diesen Fragmenten handelt es sich um Fragmente, die die Eigenschaften der nativen Promotorsequenz beibehalten, nämlich, im wesentlichen frei von einer systemisch aktivierten oder entwicklungsregulierten Expression sind. vorzugsweise werden solche Fragmente auch durch SA oder BTH induzierbar sein. Die Isolation der in den Figuren gezeigten Promotorsequenzen wird in den Beispielen beschrieben werden.
Der Promotor des AoPRT-L-Gens aus Asparagus officinalis kann nach fachbekannten Techniken aus einer Pflanze isoliert werden. So kann der Promotor z.B. dadurch isoliert werden, daß man i) cDNA aus der in kulturbefindlichen mechanisch isolierten Asparagus officinalis-Zellen isolierten mRNA synthetisiert, ii) die cDNA differentiell durchmustert, um diejenigen Klone zu identifizieren, die bei Adaptierung an Zellkulturbedingungen induziert werden, iii) eine differentiell exprimierte cDNA, die für ein interessierendes Gen codiert, isoliert, iv) mit dieser cDNA als Probe genomische DNA von Asparagus officinalis auf die Sequenz, die für das intressierende Gen codiert, behandelt, v) die stomaufwärts gelegenen Regulationsregionen des interessierenden Gens, darunter den Promotor des Gens, identifiziert. Die Promotoren von äquivalenten Proteinen aus den Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae sowie Promotoren von Proteinen, die zu den Proteinen des ersten Aspekts der Erfindung im wesentlichen homolog sind, können nach fachbekannten Standardtechniken identifiziert werden. So kann der Promotor z.B. dadurch isoliert werden, daß man i) cDNA aus der mRNA einer interessierenden Pflanzenzelle synthetisiert; ii) die cDNA-Bibliothek durchmustert, um Klone mit dem entsprechenden Expressionsmuster zu identifizieren; iii) den interessierenden cDNA-Klon isoliert; iv) mit dieser cDNA das Gen durch Durchmustern einer genomischen Bibliothek isoliert; v) die stromaufwärts gelegenen Regulationselemente des Gens identifiziert.
Die bei den oben genannten Schritten genannten Techniken sind fachbekannt. Die Isolation von lebensfähigen Zellen aus einer Pflanze gemäß Schritt i) ist in der internationalen Patentanmeldung WO 93/05164 beschrieben. Kurz gesagt können lebende Zellen von einer beliebigen ein- oder zweikeimblättrigen Pflanze abgeschabt werden. Zellen, die auf diese Art und Weise von Asparagus officinalis isoliert werden und in Wachstumsmedium gegeben werden, werden, wenn sie in Zellkultur gegeben werden, entdifferenzieren und mit der Zellteilung beginnen. Die Anpassung an die Kulturbedingungen führt zur Expression von vielen Genen, die üblicherweise vielleicht nicht exprimiert werden. Da bei zweikeimblättrigen Pflanzen die Induktion der Zellteilung und die Entdifferenzierung üblicherweise mit der Wundreaktion assoziiert sind, wird vorgesehen, daß die erfindungsgemäßen, aus der einkeimblättrigen Pflanze Asparagus officinalis isolierten Promotoren für die Induktion der Genexpression sowohl bei zweikeimblättrigen als auch bei einkeimblättrigen Pflanzen verwendet werden können.
Die veränderte Genexpression bei der Kultivierung der mechanisch isolierten Zellen macht diese zu einer reichhaltigen Quelle an Gentranskripten und daher geeignet für die Erstellung einer cDNA-Bibliothek. Die Herstellung und das differentielle Durchmustern einer cDNA-Bibliothek ist in WO 93/05164 beschrieben.
Die Eignung von Promotoren, die zu den oben genannten Promotoren der vorliegenden Erfindung hybridisieren, kann gegebenenfalls noch weiter mittels Funktionsanalyse beurteilt werden. Beliebte Promotoren, die mit den oben genannten Promotoren hybridisieren, sind also solche, bei denen keine wesentliche systemische oder entwicklungsregulierte Aktivierung stattfindet. Promotorsequenzen, die unter stringenten Bedingungen zu allen oder einem Teil der Promotorsequenzen von pAoPRT-L aus Asparagus officinalis, äquivalenten Proteinen aus den Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae oder Proteinen, die dazu im wesentlichen homolog sind, hybridisieren, fallen ebenfalls unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Für die Identifikation von im wesentlichen homologen Proteinen und Promotoren kann man Spezial-Computerprogramme verwenden. So kann man z.B. die Grundeinstellung der Parameter des GAP-Programms des GCG-Pakets verwenden, das von der SEQNET Computational Molecular Biology Facility, SERC, Daresbury, Großbritannien, verfügbar ist. Bei diesem Programm gibt es "Treffer" für %-Identität und %-Ähnlichkeit. Vorzugsweise fallen Sequenzen mit 60% oder mehr Identität bzw. 65% oder mehr Ähnlichkeit unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. So fallen z.B. Sequenzen mit 70%, 80%, 90%, 95% oder sogar 99% Identität unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Dem Fachmann wird klar, daß diese Grenzen sowohl auf Nukleinsäuresequenzen als auch auf Aminosäuresequenzen zutreffen (wenn man z.B. ein Protein identifiziert, das zu dem in der vorliegenden Erfindung identifizierten Protein analog ist). Betrachtet man Sequenzen auf Nukleinsäureebene, ist der Normalfall die Beurteilung der Identität/Ähnlichkeit der Codiersequenz und/oder des Promotors.
Solche Promotorsequenzen können nach fachbekannten Standardtechniken identifiziert werden. So können z.B. der pAoPRT-L-Promotor oder Promotoren von äquivalenten Proteinen aus den Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae oder Fragmente davon als Sonden für die Identifikation von Promotoren, die damit hybridisieren, verwendet werden. Typischerweise umfaßt ein geeignetes Fragment 20, 30 oder 40 Nukleotide. Geeignete stringente Bedingungen sind oben diskutiert.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Promotor bereitgestellt, der mindestens das auf SA ansprechende Element von –247 Bp bis –132 Bp in 6 umfaßt. Insbesondere können chimäre Promotoren hergestellt werden, die die gewünschten Expressionseigenschaften des nativen Pflanzenpromotors sowie die Fähigkeit, die Expression als Reaktion auf SA aufgrund des Vorhandenseins des auf SA ansprechenden Elements von 6 zu induzieren, aufweisen.
Solche chimären Promotoren können nach Standardtechniken oder in DNA-Rekombinationstechnik hergestellt werden.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden zwei oder mehr induzierbare PR-Proteinpromotorsequenzen gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung bereitgestellt, die hintereinander geschaltet sind. Das erhaltene Promotor-Multimer kann eine Kombination von zwei oder mehr der bevorzugten Promotorsequenzen des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung umfassen. Es können je nach den Größen- und Stabilitätsbeschränkungen des Expressionssystems sowie dem gewünschten Niveau der Genexpression eine beliebige Anzahl von Promotorsequenzen in Serie geschaltet werden, um zu einem Multimer zu gelangen. Vorzugsweise umfaßt das Multimer mindestens 2, mindestens 5 bzw. am stärksten bevorzugt mindestens 7 Promotorsequenzen. Die Promotorsequenzen des Multimers können direkt oder durch dazwischen liegende Linkersequenzen miteinander verbunden sein. Die dazwischen liegenden Linkersequenzen können eine beliebige Länge aufweisen, so daß ein wirksames Funktionieren des Multimers ermöglicht wird, und können von Fremd-DNA stammen. Das Multimer beinhaltet vorzugsweise mindestens eine Promotorsequenz, die die –132 Bp Minimalpromotorsequenz, die in 6 dargestellt ist, umfaßt. Umfaßt nur eine der zwei oder mehr Promotorsequenzen die in 6 dargestellte –132 Bp-Minimalsequenz, so wird bevorzugt, daß diese Sequenz am nächsten zu dem zu exprimierenden Gen zu liegen kommt. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wird eine Reihe von Fragmenten der in 6 gezeigten Promotorsequenz in operativer Verknüpfung mit der –132 Bp Minimalpromotorsequenz von 6 dargestellt. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform beinhalten die Fragmente das auf SA ansprechende Element von –247 bis –132 Bp.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Amplifikationssystem bereitgestellt, das eine PR-Proteinpromotorsequenz gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt. Vorzugsweise ist der Promotor der vorliegenden Erfindung operativ mit einer Transaktivatorsequenz und einer zweiten Promotorsequenz, bei der es sich vorzugsweise um den Angriffspunkt der Transaktivatorsequenz handelt und die mit der DNA, die für das interessierende Produkt codiert, verbunden ist, verbunden. Systeme, die für die Amplifikation der Genexpression verwendet werden können, sind in WO 98/05 789 und Moore et al., PNAS 95, 379–381 (1997) beschrieben worden. Zu den Amplifikationssystemen, die keine Transaktivatoren beinhalten, zählen z.B. das System auf mRNA-Virusreplicase-Grundlage (Mori et al., FEBS Letters, 336:171–174 (1993)), bei dem der erfindungsgemäße Promotor operativ mit einer Virusreplicase und einem zweiten Gen verknüpft ist, wobei das Gentranskript von der Replicase amplifiziert wird. Das zweite Gen kann ein Antisense-Gen sein. Umfaßt das Amplifikationssystem eine Transaktivatorsequenz, so wird es vorzugsweise stromabwärts der erfindungsgemäßen Promotorsequenz plaziert, und die Transkriptionsrichtung des erfindungsgemäßen Promotors und der zweiten Promotorsequenz ist vorzugsweise in Serie oder divergierend. Ein bevorzugtes Konstrukt ist in 16 dargestellt, obwohl dem Fachmann klar ist, daß Variationen solch eines Konstrukts möglich sind, die dahingehend wirken, daß die Expression des erfindungsgemäßen Promotors amplifiziert wird. Bei dem Amplifikationskonstrukt dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird vorgesehen, daß der Promotor nach dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung die Expression des Transaktivators vorantreibt. Das Transaktivatorprodukt kann dann über den zweiten Promotor mehrfache Transkriptionszyklen des gewünschten Gens initiieren. Auf diese Weise wird eine Amplifikation des ursprünglichen Signals, das den erfindungsgemäßen PR-Proteinpromotor aktiviert hat, stattfinden. Ein Amplifikationskonstrukt kann daher die Verwendung von geringeren Mengen an Aktivatorsubstanzen wie SA oder BTH unter Beibehaltung der starken Expression des gewünschten Gens ermöglichen. Bei einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß das Multimer gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung einen Teil eines Amplifikationssystems umfaßt.
Transaktivatorsequenzen sind in der Fachwelt bekannt; für die vorliegende Erfindung können beliebige geeignete Transaktivatorsequenzen verwendet werden. Die Transaktivatorsequenzen können natürlich oder künstlich sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Transaktivator LhG4, der aus dem mutierten Lac I Gen aus E. coli in Fusion mit der Transkriptionsaktivatordomäne von Gal4 aus der Hefe besteht. Bei der zweiten Promotorsequenz kann es sich um eine beliebige von dem Transaktivator aktivierbare Promotorsequenz handeln. Ist der Transaktivator LhG4, so ist der bevorzugte Promotor pOP910. Dabei handelt es sich um einen CaMV-Minimalpromotor mit zwei Rundungen von Bindungsstellen für das LhG4-Protein. Zu weiteren Transaktivatoren zählen der Tet-Transaktivator in Kombination mit dem pTop10-Promotor (Wienmann et al., Plant Journal 5 559–569 (1994)).
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Promotor, ein Multimer oder ein Amplifikationssystem nach den vorhergehenden Aspekten bereitgestellt, das operativ mit einer DNA-Sequenz, die für ein interessierendes Produkt codiert, verbunden sind. Die DNA kann für ein interessierendes Protein oder für ein Produkt, das die Produktion eines interessierenden Proteins regulieren kann, codieren. Zu interessierenden Proteinen zählen Produkte, die von einer Pflanze oder von Pflanzenzellen in Kultur geerntet werden sollen, Produkte, die in der Pflanze exprimiert werden können und die die Eigenschaften der Pflanze oder der Pflanzenzellen in Kultur verändern, Produkte, die an der Regulation von gewissen Merkmalen von Pflanzen beteiligt sind, sowie Produkte wie Markergene. Insbesondere bevorzugt sind Produkte, die für DNA codieren, die ein positives Merkmal der transgenen Pflanze bereitstellen oder verstärken. So kann z.B. die Nukleinsäure für Proteine oder Antisens-RNA-Transkripte codieren, durch die verbesserte ernährungsphysiologische Eigenschaften, höhere Ernten, Schädlingsresistenz, Krankheitsresistenz, künstliche Pollensterilität (z.B.: Barnase oder PR-Glucanase), weibliche Sterilität oder eine Kontrolle der Blüten- und Fruchtreifung gefördert werden. Zu typischen interessierenden Nukleinsäuren zählen z.B. ein bakterielles dap-A-Gen für erhöhten Lysingehalt; ein Bt-Endotoxin-Gen oder Proteasehemmer für Insektenresistenz; Gene für lysierende Peptide für Krankheitsresistenz, bakterielle oder pflanzliche EPSP für Resistenz gegen das Herbizid Glyphosate ( US 4 940 835 ; US 5 188 642 ; US 4 971 908 ; US 5 145 783 ; US 5 312 910 ; US 5 633 435 , US 5 627 061 , US 5 310 667 ; WO 97/04 103), bakterielle oder pflanzliche HPPD (WO 96/38 567, WO 98/02 562) für Resistenz gegen HPPD-Hemmer-Herbizide (z.B. Diketol oder Isoxazole), Chitinase oder Glucan-Endo-1,3-B-glucosidase für fungizide Eigenschaften. weiterhin kann eine DNA-Sequenz eingebracht werden, die als genetisches Werkzeug für die Erzeugung von Mutanten oder für die Unterstützung der Identifikation, der genetischen Markierung oder der Isolation von Gensequenzen dient. Nukleinsäuren, die sich für die Modifikation der Qualität eignen, beinhalten z.B. Gene für die Stärkebiosynthese oder für abbauende Enzyme (z.B. Stärkesynthasen, Stärkeverzweigungsenzyme), Kornspeicherproteingene (z.B. Proteinuntereinheiten von Glutenin, Gliadinen oder Hordeinen) oder Gene, die mit der Kornhärte in Zusammenhang stehen.
Das Promotor/Genkonstrukt des fünften Aspekts der Erfindung kann weiterhin ein Markergen umfassen, das die Verfolgung der Expression der heterologen DNA ermöglicht. Ein Markergen ist vorzugsweise mit dem Promotor, Multimer oder Amplifikationssystem der Erfindung operativ in Serie mit der heterologen DNA, die für ein interessierendes Produkt codiert, verknüpft. Die Induktion des Promotors, Multimers oder Amplifikationssystems führt zur Expression des Markergens in der transformierten Zelle oder Pflanze, wodurch man das Induktionsniveau des interessierenden Produkts einfach beurteilen kann, ohne daß die ganze Pflanze oder ein Teil davon oder eine Kultur von Pflanzenzellen geerntet oder zerstört werden braucht. Es kann jedes geeignete Markergen verwendet werden. Dazu zählen z.B. die beta-Glucurnidase, Luciferase oder das "Green Fluorescent Protein".
Das Promotor-Gen-Konstrukt kann auch noch weitere Regulationssequenzen umfassen, die für die wirksame Expression oder Zielsteuerung des Genprodukts erforderlich sind. So können z.B. 3'-Transkriptionsregulationssignale wie Polyadenylierungssignale bereitgestellt werden, ebenso beliebige andere Regulationssequenzen, wie z.B. Enhancer. Bevorzugte 3'-Polyadenylierungssignale stammen vom Blumenkohlmosaikvirus-35S-Gen ab, obwohl dem Fachmann klar sein wird, daß auch andere 3'-Polyadenylierungssignale verwendet werden könnten. Soll das Produkt aus der Zelle sezerniert werden, so kann die Hinzufügung einer Übergangspeptidsequenz erwünscht sein.
Die rekombinante oder isolierte DNA nach einem der Aspekte der vorliegenden Erfindung kann in Form eines Vektors vorliegen. Bei dem Vektor kann es sich um ein Plasmid, ein Cosmid oder einen Phagen handeln. Die Vektoren können nach fachbekannten Methoden direkt in Pflanzenzellen eingeführt werden oder zuerst in Bakterien wie E. coli kloniert werden und erst dann in die Pflanzenzelle eingeführt werden. Sollen die Vektoren in Mikrorganismen/Wirtszellen kloniert werden, so umfaßt der Vektor vorzugsweise weiterhin ein oder mehrere Markergene, die die Selektion von transformierten oder transfizierten Mikroorganismenzellen, die das Vektorkonstrukt mit der heterologen DNA umfassen, ermöglichen. Ausreichende Start- und Stopp-Signale sowie Regulationssequenzen für die Expression der heterologen DNA und/oder der Markergene in der Mikroorganismenzelle können ebenfalls mitverwendet werden.
Gemäß einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit der oben beschriebenen DNA transfiziert oder transformiert ist. Bei der Wirtszelle kann es sich um eine Pflanzenzelle oder eine Mikroorganismenzelle handeln. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine transgene Pflanzenzellkultur einer ein- oder zweikeimblättrigen Pflanze bereit, die mit einem Promotor, Multimer oder Amplifikationssystem der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einem heterologen Gen, transformiert ist. Transformationsmethoden werden unten beschrieben. Mit der transgenen Pflanzenzellkultur können ganze Pflanzen erzeugt werden, und gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können transgene Pflanzen, Samen und Vermehrungsmaterial, z.B. vermehrte Sprosse, die erfindungsgemäße DNA umfassen, bereitgestellt werden. Zu für die Transformation bevorzugten Pflanzen oder Teilen oder Zellen davon zählen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Sorghum, Zuckerrohr, Tabak, Raps, Sonnenblume, Sojabohne, Baumwolle, Klee und Bohnen sowie Zuckerrübe, Kartoffel, Gemüse wie Tomate, Melone, Kohlarten, Salat, Karotte, Bohnen, Paprika und Pfefferschoten.
Die erfindungsgemäße DNA kann nach einem beliebigen bequemen Verfahren hergestellt werden, bei dem aufeinanderfolgende Nukleotide miteinander verknüpft werden und/oder Oligo- und/oder Polynukleotide ligiert werden, wobei diese Verfahren in-vitro-Verfahren beinhalten. Das Verfahren der Wahl ist die DNA- Rekombinationstechnik.
Die erfindungsgemäße DNA kann nach üblichen fachbekannten Verfahren in Pflanzenzellen eingeführt werden. Vorzugsweise wird die DNA in die Pflanzenzellen mit einem entwaffneten Ti-Plasmid-Vektor und mit Agrobacterium-Träger nach fachbekannten Verfahren hineintransformiert. Die Fremd-DNA kann jedoch auch in die Pflanzenzellen direkt mit der Genkanone oder mit einem beliebigen anderen physikalischen Abgabesystem eingeführt werden. Die zuletzt genannten Techniken werden dann bevorzugt, wenn Agrobacterium für eine stabile Transformation unwirksam ist, z.B. bei der Transformation von Getreidepflanzenzellen. Vorzugsweise umfaßt der Transformationsvektor eine einfache oder mehrfache Klonierungsstelle für die Insertion von Genen oder sonstiger DNA (die im vorliegenden Zusammenhang als Passagier-Gene bezeichnet werden), die in die Pflanzenzellen einzuführen sind. Die Passagier-Gene oder die sonstige DNA können unter der Kontrolle eines Promotors stehen, dessen Expressionseigenschaften sich von dem erfindungsgemäßen Promotor unterscheiden. So kann es sich bei dem Passagier-Gen z.B. um ein Markergen unter der Kontrolle eines Promotors, der sich von dem erfindungsgemäßen Promotor unterscheidet, handeln, so daß, wenn das Konstrukt in der Pflanze exprimiert wird, das Markergen entsprechend den Eigenschaften des Promotors, mit dem es verbunden ist, exprimiert werden kann und nicht auf das Expressionsmuster des erfindungsgemäßen Promotors beschränkt ist. Jegliche geeignete Technik, mit der die erfindungsgemäße DNA stabil in die Zellkern-DNA einer Pflanzenzelle eingebaut werden kann, würde sich ebenfalls eignen.
Gemäß einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Identifikation eines Mittels bereitgestellt, das zur Regulation der Expression von heterologen Genen, die operativ mit dem AoPRT-L- Promotor verbunden sind, fähig ist. Das Verfahren kann die Schritte umfassen, daß man ein mutmaßliches Mittel auf eine DNA-Probe, die den AoPRT-L-Promotor in operativer Verknüpfung mit einem heterologen Genanteil umfaßt, einwirken läflt, das Expressionsniveau des Gens bestimmt und die Expressionsniveaus mit einem Kontrollsystem vergleicht. Hierdurch erhält man einen Hinweis auf die Fähigkeit des Mittels, die Genexpression mit Hilfe des AoPRT-L-Promotors zu regulieren. Mutmaßliche Mittel von Interesse können auf eine transformierte Pflanze, Zellkultur, Gewebeprobe oder ein in-vitro-System, die bzw. das die DNA-Probe enthält, aufgetragen werden. Auf diese Art und Weise identifizierte Mittel von Interesse sind vorzugsweise solche, die die Expression eines Gens, das operativ mit dem AoPRT-L-Promotor verknüpft ist, induzieren.
Bei dem Mittel kann es sich um ein beliebiges natürliches oder synthetisches Produkt handeln, z.B. um Chemikalien wie Proteine, Peptide, DNA- oder RNA-Sequenzen oder Hormone und deren Analoge. Das heterologe Gen, mit dem der Promotor verknüpft ist, kann ein beliebiges Gen sein, vorzugsweise ein Gen, das ein quantitativ bestimmbares Produkt exprimiert. Zu bevorzugten heterologen Genen für diesen Zweck zählen Gene, die für Durchmusterungsmarker codieren, z.B. für die beta-Glucoronidase des "Green Fluorescent Protein".
Mittel, die nach dem oben genannten Verfahren identifiziert wurden, können auch bei der Regulation der Expression des AoPRT-L-Gens selbst oder von Genen, die für PR-Proteine codieren, die dem AoPRT-L-Protein von Asparagus officinalis äquivalent sind bzw. dazu homolog sind, wirksam sein. Zu den letztgenannten Proteinen können auch die PR-Proteine der Familie Liliaceae oder Amaryllidaceae, ja sogar von anderen Pflanzenfamilien, gehören. Diese Mittel können bei der Regulation oder Induktion einer vollen oder teilweisen SAR-Reaktion wirksam sein, wodurch sie zu nützlichen "Pflanzenschutzmitteln" für die Anwendung im Freiland werden.
Die vorliegende Erfindung soll nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht werden, in denen auf die beigelegten Zeichnungen verwiesen wird.
1 ist eine Darstellung der Nukleotidsequenz der AoPRT-L-cDNA mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz von AoPRT-L. Die Sequenzen und Positionen, an denen die Primer für die IPCR gebunden werden, sind oberhalb der cDNA-Sequenz eingezeichnet, und entsprechende Enzymrestriktionsstellen sind unterstrichen.
2 ist eine Darstellung der Homologien zwischen AoPRT-L und anderen PR-5-Proteinen.
3 ist eine Darstellung der Anhäufung der mRNA für AoPRT-L in Asparagus. In 3(a) ist die Induktion der AoPRT-L-Expression nach mechanischer Isolation von Mesophyllzellen aus den Kladodien von Asparagus dargestellt. In 3(b) ist die Induktion der AoPRT-L-Expression in zerschnittenen etiolierten Asparagus-Keimlingen dargestellt, und in 3(c) ist die Expression von AoPRT-L in mit SA behandeltem Asparagus dargestellt.
4 ist eine Darstellung der Expression der AoPRT-L-mRNA nach Infektion von Asparagus mit Stemphyllium versicarium.
5 ist eine Darstellung einer Strategie für die Isolation des AoPRT-L-Promotors mittels IPCR.
6 ist eine Darstellung der Nukleotidsequenz des AoPRT-L-Promotors. Sequenzen mit Homologie zu den charakterisierten Promotorelementen sind eingerahmt.
7 ist eine Darstellung der Konstruktion von AoPRT- L-GUS-Konstrukten.
8 ist eine Darstellung der Expression von AoPRT-L-GUS in der Sproßachse von transgenem Tabak im Vergleich zu PR-1a-GUS.
9 ist eine Darstellung der Expression von pAoPRT-L-GUS in lokalen und systemischen Geweben von transgenem Tabak, der mit dem Tabakmosaikvirus (TMV) oder mit Pseudomonas syringae pv. phaseolicola infiziert ist. Die GUS-Aktivität wurde fluorimetrisch anhand der Menge an 4-Methylumbellifernon (4-MU), das pro Minute pro mg Proteinextrakt gebildet wurde, gemessen.
10 ist eine Darstellung der Induktion der pAoPRT-L-GUS- und PR-1a-GUS-Expression in transgenen Tabak, der mit exogenarer SA bzw. expgenem BTH behandelt wurde.
11 ist eine Darstellung der Expression von (a) pAoPRT-1-GUS und (b) pAoPRT-L-GUS in verwundetem transgenem Tabak bzw. (c) der Expression von pAoPRT-L-GUS in transgenen Tabak-Blattscheibchen nach Behandlung mit exogenem Jasmonat.
12 ist eine Darstellung der pAoPRT-L-GUS-Expression in den Blättern von transgenem Tabak, der über die Wurzeln entweder mit NaCl oder mit PEG 8000 versorgt wurde der Wasserstreß ausgesetzt wurde bzw. von Blattscheibchen, die mit ABA behandelt wurden.
13 ist eine Darstellung der pAoPRT-L-GUS-Expression in transgenen Tabakblättern, die mit Wasserstoffperoxid oder mit t-Butylhydroperoxid infiltriert wurden.
14 ist eine Darstellung der Expression von pAoPRT-L-GUS und PR1a-GUS in transgenen T0-Blattscheibchen B. napus, die drei Tage lang auf Wasser 1 mM SA oder 250 μM BTH schwimmen gelassen wurden. Die Werte sind der Durchschnitt von 6 unabhängigen Transformanten/Transgen.
15(a) ist eine schematische Darstellung der AoPRT-L-Promotordeletionen der Fusion mit dem GUS-Reportergen, und 15(b) zeigt ihre Reaktion auf exogene SA in transgenem T0-Tabak. 15(c) ist eine schematische Darstellung, die die Anordnung von mutmaßlichen auf SA ansprechenden Elementen im pMultiAoPRT-L-Promotor zeigt.
16 ist eine schematische Darstellung des pAoPRT-L-Expressionsamplifikationskonstrukts pGB24.
In den Beispielen wurden, falls nicht anders erwähnt, alle Vorgehensweisen für die Herstellung und Handhabung von rekombinanter DNA gemäß den in Sambrook J., Fritsch EF & Maniatis T et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory 1989 beschriebenen Standardtechniken und -protokollen durchgeführt.
BEISPIELE
Beispiel 1 - Isolation einer AoPRT-L-cDNA und Charakterisierung der Expression von AoPRT-L in Asparagus officinalis
Aus Asparagus officinalis isolierte Mesophyll-Einzelzellen sind in einem geeigneten Kulturmedium zu Entdifferenzierung und Initiierung der Zellteilung fähig (Harikrishna et al., (1991) J. Exp. Bot. 42:791–799). In diesen isolierten Zellen treten während der Anpassung an die Zellkulturbedingungen starke Veränderungen bezüglich der Genexpression auf, und mit Hilfe von aus solchen Zellen isolierter mRNA kann man Gene erhalten, die spezifisch während dieser Anpassung induziert werden. Zu diesen Genen zählen Gene, die durch Verwundung und Streß hinauf reguliert werden. Die Konstruktion und das Durchmustern einer cDNA-Bibliothek aus mechanisch isolierten A. officinalis-Zellen ist bereits beschrieben (WO 93/05 164: Warner et al., (1992) Plant Molecular Biology 19:555–561). Es wurde gefunden, daß ein cDNA-Klon, der eine differentiell exprimierte mRNA darstellte, bis zu 0,2% der cDNA-Bibliothek ausmachte. Die DNA-Sequenzanalyse (1) zeigte, daß die mRNA für ein mutmaßliches Protein mit einer prognostizierten Masse von 21,3 kDa codiert, die zu den thaumatinartigen Genen homolog ist (2) und es sich daher um ein Mitglied der PR5-Genfamilie handelt. Dieses Gen wurde also AoPRT-L genannt.
Eine Analyse der mutmaßlichen AoPRT-L-Proteinsequenz zeigte, daß es am nächsten mit sauren sezernierten PR5 (a-PR5) Proteinen verwandt ist. Das AoPRT-L-Genprodukt wird von einem polyklonalen Antiserum gegen PR-5 erkannt und wird sezerniert, da es in Kulturmedium von Asparagus-Zellen vorkommt.
Durch Northern-Hybridisierungsanalyse mit aus mechanisch isolierten A. officinalis-Zellen isolierter RNA erhielt man Hinweise darauf, daß AoPRT-L in mechanisch isolierten Kladodienzellen hinauf reguliert wird (3a). In zerschnittenen etiolierten A. officinalis-Keimlingen (Länge < = 0,5 cm) war das AoPRT-L-Transkript ab 3 Tage nach der Verwundung nachweisbar (3b).
AoPRT-L verhält sich jedoch nicht wie das durch Verwundung induzierbare Gen AoPR1 (WO 93/05 164; Warner et al., (1992) Plant Molecular Biology 19:555–561), und zwar insofern, als seine Expression nicht in Abschnitten von zerschnittenen etiolierten Keimlingen mit einer Länge von mehr als 0,5 cm beobachtet wird und daß sich die Expression von AoPRT-L in Abschnitten mit einer Länge von < = 0,5 cm über den gesamten Abschnitt erstreckt und nicht auf die Verwundungsstelle begrenzt ist (3b).
Nach Behandlung mit SA (3c) und nach Infektion mit dem pilzlichen Pathogen Stemphyllium versicarium (4) wurde die Anhäufung von AoPRT-L-mRNA beobachtet, diese wurde jedoch durch die ethylenerzeugende Verbindung Ethephon nicht induziert.
Beispiel 2 - Isolation der stromaufwärts gelegenen Promotorregionen des AoPRT-L-Gens mittels inverser Polymerase-Kettenreaktion (IPCR)
Aus A. officinalis wurde eine AoPRT-L-Promotorregion mittels inverser Polymerase-Kettenreaktion (IPCR) isoliert (5). Man ging im wesentlichen wie bei (WO 93/05 164; Warner et al., (1993) Plant Journal 3:191–201) beschrieben vor.
Die genomische DNA aus A. officinalis wurde mit EcoRI verdaut, anschließend erneut ligiert, um die Restriktionsfragmente zu einem Ring zusammenzuschließen, und mit den AoPRT-L-spezifischen Primern
P1 5'-CGCGGAATTCGGTGTAGGTGCATTTGTTGG-3' (105-86 Bp)
EcoRI
und
P2 5'-CGCCTGCAGCCAATCCTGGACCCTCACCG-3' (152-172 Bp)
PstI
wurde eine PCR durchgeführt. Man erhielt ein 0,8 kB DNA-Fragment, das mit der dem 5'-Ende am nächsten liegenden Region der AoPRT-L-cDNA hybridisierte. Dieses PCR-Produkt wurde nach den Vorschriften, die mit dem TA-Kloning Kit von Invitrogen bereitgestellt wurden, direkt in Vektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Das erhaltene Konstrukt wurde pIPCR-TA genannt. Mittels DNA-Sequenzanalyse des PCR-Produkts wurde bestätigt, daß das Fragment tatsächlich die korrekte stromaufwärts gelegene Promotorsequenz enthielt (6).
Bei einer Untersuchung der AoPRT-L-Promotorsequenz (6) gelangt man zu Regionen mit Homologie zu anderen PR-Promotoren sind identifiziert worden, darunter eine Tabak-PR-2 und Karotten-PR-3 und PR-4-artige Sequenzen. Außerdem scheint eine c-myc-Konsensussequenz bei –344 bis –339 aufzutreten. Der Promotor enthält jedoch keine Konsensus-G-Box, PR-Box oder ABRE, was ein Hinweis darauf ist, daß pAoPRT-L nicht durch ABA oder Ethylen induziert werden wird.
Beispiel 3 - Konstruktion eines chimären AoPRT-L-Promotor/GUS-Gens
Der AoPRT-L-Promotor wurde aus pIPCR-TA mittels PCR unter Verwendung von Primern gegen sowohl das 5'- als auch das 3'-Ende des Promotors mit Verlängerungen für geeignete Restriktionsstellen für weitere Klonierungsschritte erhalten:
5'-GGGTACCAAGCTTCTTATTGCGACCTGACTCTC-3'
KpnI HindIII
5'-CGCGGATCCGTCGACCTGCAGGATTGGTTGTGTGTTGTTTT-3'
BamHI SalI PstI
Dieses PCR-Produkt wurde anschließend mit KpnI und PstI verdaut und in den Vektor pJIT60 (identisch mit pJIT30 (Guerineau et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15, 127–136), jedoch mit einem doppelten, nicht einfachen, 35S-CaMV-Promotor), der mit dem gleichen Enzym verdaut worden war, ligiert. Das Produkt wurde p22-JIT60 genannt. Die Sequenz, die für das β-Glucuronidase-Reporterenzym, mit einem Intron (GUS(INT) in pBluescript SK- (Firek et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22: 129–142: Jefferson et al., (1987) EMBO J. 6:397–3907; Vancanneyt et al., (1990) Mol. Gen. Genet. 220: 245–250) codiert, wurde durch Restriktionsspaltung mit BamHI und EcoRI in p22-JIT60 hinter die AoPRT-L-Promotorsequenz kloniert, wodurch man das Konstrukt p22-GUS(INT)JIT60 erhielt. Schließlich wurde das gesamte AoPRT-L-Promotor/GUS-Fragment mittels KpnI und XhoI aus p22-GUS(INT)JIT60 herausgeschnitten und in den binären Vektor pBIN 19 (Bevan (1984) NUC. Acids RES. 22:8711–8721), der mit KpnI und SalI verdaut worden war, ligiert, wodurch man p22-GUS(INT)Binl9 erhielt (7).
Das GUS-Gen ist ein bequemes Reportergen, dessen Expression leicht verfolgt werden kann. Es ist anzumerken, daß in diesem Beispiel sowie in den folgenden Beispielen GUS durch ein beliebiges Gen von Interesse ersetzt werden kann, um eine chemische Induktion des interessierenden Gens zu ermöglichen.
Beispiel 4 - Entwicklungsregulierte Expression des AoPRT-L-Promotors in transgenem Tabak
Das AoPRT-L-Promotorkonstrukt (p22-GUS(INT)Binl9) wurde nach üblichen Techniken der Agrobacterium tumefaciensvermittelten Transformation in Nicotiana tabacum der Sorte Samsun hineintransformiert (Draper et al., (1988): Plant Genetic Transformation and Gene Expression – A Laboratory Manual, Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK). Die Expression des vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebenen GUS-Gens wurde unter Verwendung bereits beschriebener Assays analysiert (Draper et al., (1988) supra).
Eine histochemische Analyse zeigte, daß das vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebene GUS nur in Sepalen und an der Übergangszone zwischen Petiolen und Stengel (Blattachseln) exprimiert wird (8). Außerdem wird gelegentlich eine histochemische Färbung der Wurzeln in der Nähe der Krone (Stengelbasis) beobachtet. Der Promotor weist daher im Vergleich zu anderen veröffentlichten Promotoren eine minimale entwicklungsregulierte Aktivität auf.
Beispiel 5 - Nichtsystemische Induktion der vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebenen GUS-Expression in transgenem Tabak mit Pathogenprovokation
Mit AoPRT-L-GUS transformierte Samsun-Tabakpflanzen wurden mit dem Tabakmosaikvirus (TMV) infiziert, und zwar dadurch, daß man die Oberfläche eines einzelnen Blattes mit einer Mischung aus Virus und Verwundung wie beschrieben (Bi et al., (1995) Plant J. 8:235–245) abrieb. Das TMV induziert eine N-Gen-abhängige Hypersensitivitätsreaktion, die durch das Auftreten von Läsionen (Zonen mit auf Hypersensitivität beruhendem Zelltod) aus dem infizierten Blatt gekennzeichnet ist. Die Inokulation von Samsun-Tabak mit TMV induziert auch die SAR und die systemische Anhäufung von endogenem PR-1a (Bi et al., (1995), supra). Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurden Blattscheibchen von den Läsionen ausgestanzt (diese ausgestanzten Scheibchen enthielten auch direkt an die Läsion angrenzendes Nicht-HR-Gewebe, Nicht-HR-Gewebe von nicht infiziertem Gewebe zwischen den Läsionen aus demselben Blatt sowie von einem nicht infizierten systemischen Blatt an derselben Pflanze). Die GUS-Aktivität in diesen Scheibchen wurde fluorimetrisch gemessen. Es wurde gefunden, daß GUS-Aktivität im inokulierten Blatt in Gewebe, das gerade eine HR durchmacht (oder Gewebe direkt neben den HR-Läsionen), erhöht ist, jedoch in Gewebe zwischen den Läsionen bzw. systemischem Gewebe nicht erhöht ist (9).
Samsun-Tabakpflanzen, die die Fusion zwischen dem AoPRT-L-Promotor und GUS bergen, wurden mit Pseudomonas syringae pv phaseolicola (2 × 10⁸ pro ml) infiziert, und zwar dadurch, daß man die interzellulären Blatträume in einem einzelnen Blatt wie oben beschrieben inokulierte (Bi et al., (1995), supra). Pseudomonas syringae pv phaseolicola induziert an der Infiltrationsstelle eine Nicht-Host-Hypersensitivitätsreaktion. Diese Behandlung induziert auch die systemische Anhäufung von endogenen PR-1-Proteinen (Bi et al., (1995), supra). Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion wurden Blattscheibchen aus infizierten Blättern und aus nichtinfizierten systemischen Blättern an derselben Pflanze herausgestanzt. Zu den Proben aus den infizierten Blättern zählten auch Proben von der Infiltrationsstelle (die durch Hypersenstivität hervorgerufenen Zelltod erleiden sollten bzw. im Absterben begriffen waren) sowie von nicht infiltriertem Gewebe nahe der Inokulationsstelle am selben Blatt. Es wurde die GUS-Aktivität an diesen Scheibchen gemessen. Hier wurde eine GUS-Aktivität nur in Proben von Gewebe neben der HR-Läsion nachgewiesen (9). Innerhalb des Gewebes, das eine HR durchmachte, bzw. in systemischem Gewebe wurde keine Aktivität nachgewiesen. Hieraus läßt sich schließen, daß die in mit TMV infizierten Tabak beobachtete Aktivität nicht auf die Läsion selbst, sondern auf das Gewebe, das die TMV-Läsionen umgibt, zurückzuführen ist. Die höhere Aktivität, die im Anschluß an TMV-Infektion beobachtet wurde, beruht möglicherweise auf den ungefähr zehnmal höheren SA-Spiegeln, die nach TMV-Provokation im Vergleich zu Pseudomonas syringae pv phaseolicola beobachtet wurden.
Aus diesen Daten kann geschlossen werden, daß der AoPRT-L-Promotor im Gegensatz zu PR-1a nur in Gewebe in der Nähe der Hypersensitivitätsreaktion-Läsionen aktiviert wird und nicht systemisch induziert wird.
Beispiel 6 - Induktion der vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebenen GUS-Expression in mit SA und BTH behandeltem transgenem Tabak
Mit AoPRT-L-GUS-transformierte Samsun-Tabakpflanzen wurden drei Tage lang über die Wurzeln mit ansteigenden SA-Konzentrationen versorgt, wonach Blattkerne ausgestanzt wurden und die GUS-Aktivität fluorimetrisch gemessen wurde. Bei 1 mM SA wurde eine beträchtliche Induktion der AoPRT-L-Promotor/GUS-Fusion beobachtet und bei 0,1 mM SA wenig (10a). Die AoPRT-L-Promotor/GUS-Fusion ist daher um eine Größenordnung weniger gegenüber SA empfindlich als PR-1a-GUS, die bei 10–100 μM SA deutlich induziert wird (Bi et al., (1995), supra; Mur et al., (1996) Plant J. 9:559–571). Eine Behandlung mit 1 mM SA zeigte eine deutliche zeitabhängige Induktion der AoPRT-L-Promotor/GUS-Fusionen im Vergleich zu dem inaktiven SA-Analog 4-Hydroxybenzoesäure (4hBA), die einen Tag nach Beginn der Behandlung einsetzte (10b). Die Induktion von mit AoPRT-L-GUS transformierten Pflanzen mit SA ergibt ungefähr 1/3 der bei mit pPR-1a-GUS transformiertem Tabak beobachteten GUS-Aktivität (10c).
Mit AoPRT-L-GUS transformierte Samsun-Tabakpflanzen wurden mit 1 mM SA oder 20 μM BTH besprüht (Ausbringung in 0,01%iger Sapogenat-Lösung als Netzmittel). Die Pflanzen wurden einmal besprüht, trocknen gelassen und anschließend nochmals am selben Tag besprüht (Tag 0). Nach 3 oder 6 Tagen wurden Blattkerne entnommen und die GUS-Aktivität wurde mit Hilfe eines fluorimetrischen Standard-Assays gemessen. BTH erwies sich als gleich wirksam wie SA als Induktionsmittel für die vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebene GUS-Expression (10d). Blattkerne von Tabak, der die Fusion des AoPRT-L-Promotors mit GUS barg, wurden 3 oder 6 Tage lang auf Wasser mit ansteigenden BTH-Konzentrationen schwimmen gelassen, wonach die GUS-Aktivität in den Blattscheibchen fluorimetrisch gemessen wurde. Bei Verwendung von 1,25 μM BTH wird eine BTH-induzierte GUS-Aktivität beobachtet (10e).
Aus diesen Daten geht folgendes hervor:

1) die AoPRT-L-Promotor/GUS-Fusion ist in transgenem Tabak durch SA induzierbar.
2) die pAoPRT-L-Promotor/GUS-Fusion ist um eine Größenordnung weniger empfindlich gegen SA-Konzentration und weist im Vergleich einen PR-1a-Promotor/GUS-Konstrukt ungefähr 1/3 der Induktion auf.
3) BTH als Blattspray oder in vitro ist ein wirksames Induktionsmittel für die AoPRT-L-Promotor/GUS-Fusion.

Beispiel 7 - Reine Induktion der vom AoPRT-L-Promotor angetriebenen GUS-Expression in transgenem Tabak durch Verwundung oder das Wundsignal Jasmonsäure, ABA und osmotischen Streß
Tabakpflanzen, die entweder die AoPRT-L-Promotorfusion mit GUS oder ein AoPRT-1-GUS-Konstrukt bargen, wurden mit Hilfe von einer von drei Methoden verbunden. Entweder wurde die Blattspreite mit einer Zange zerdrückt, oder sie wurde mit einer Schere zerschnitten oder sie wurde durch eine Kombination von Zerdrücken und Durchlöchern dadurch, daß das Blatt mit einem Fleischhammer geschlagen wurde, behandelt. Nach 1, 2, 3, 6 oder 8 Tagen wurden von dem beschädigten Gewebe Blattkerne entnommen und die GUS-Aktivität wurde gemessen. Bei AoPR-1 handelt es sich um ein wundinfiziertes Gen, das in zerschnittenen etiolierten A. officinalis-Keimlingen an den Verwundungsstellen exprimiert wird. Wird das AoPR-1-Promotor/GUS-Konstrukt in Tabak eingebracht, so ist es ebenfalls durch Verwundung infizierbar (Warner et al., (1994) Plant J. 6:31–43; Mur et al., (1996) Plant J. 9:559–571). Die vom AoPR-1-Promotor vorangetriebene GUS-Aktivität ist bei allen drei Verwundungsbehandlungen erhöht, wobei eine verstärkte GUS-Aktivität 1–2 Tage nach der Behandlung beobachtet werden kann (11a). Im Gegensatz dazu wurde bei der vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebenen GUS-Expression bei keiner Verwundungs behandlung eine Erhöhung beobachtet, außer einem schwachen Anstieg am B. Tag nach dem Unterdrücken mit einer Zange, was wahrscheinlich nicht auf Verwundung beruht, da das Gewebe zu diesem Zeitpunkt äußerst ausgetrocknet ist (11b).
Die Verwundung von Tabakblättern (mit der Hammermethode) bzw. die Infektion von Tabak mit Pseudomonas syringae p.v. phaseolicola induziert eine lokale Anhäufung des mit Verwundung in Zusammenhang stehenden Cytohormons Jasmonsäure (JA) (Kenton et al., submitted; Mar et al., (1997) Trends in Microbiol. 5:297–300). Blattkerne von Tabak, die die AoPRT-L-Promotorfusion zusammen mit GUS bargen, wurden 3 Tage lang auf Wasser, das ansteigende JA-Konzentrationen enthielt, schwimmen gelassen, wonach die GUS-Aktivität in den Blattscheibchen mit einem fluorimetrischen Standard-Assay gemessen wurde. Im Vergleich mit dem Schwimmenlassen auf 1 mM SA konnte JA in keiner der geprüften Konzentrationen irgendeinen Anstieg in der vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebenen GUS-Aktivität induzieren (11c).
Aus diesen Werten geht hervor, daß im Vergleich zu einer durch Verwundung induzierbaren Promotor-GUS-Fusion (AoPR-1-Promotor/GUS), das AoPRT-L-Promotor/GUS-Konstrukt im wesentlichen unempfindlich gegen mechanische Schädigung ist. Außerdem wird AoPRT-L-Promotor/GUS nicht durch das bekannte Verwundungssignal JA und nicht durch Ethylen induziert.
Beispiel 8 – Bei transgenem Tabak wird durch Salz- und Wasserstreß sowie durch das mit Wasserstreß in Zusammenhang stehende Hormon Abscisinsäure (ABA) keine wesentliche Expression der AoPRT-L-Promotor/GUS-Aktivität induziert
Da AoPRT-L zu der PR.-Proteinfamilie der Klasse 5 zählt, die auch trockenheitsindizierte Gene wie solche, die für Osmotine codieren, enthält, wurde die Reaktion auf verschiedene Arten von Wasserstreß untersucht. Bei transgenem Tabak führte weder eine hohe Salzkonzentration noch 20% PEG 8000, die beide in mehreren Pflanzenarten die Expression von Osmitingenen bzw. osmotinartigen Genen induzieren, zu einer Induktion einer Expression des AoPRT-L-Promotor/GUS-Konstrukts (12a und 12b). Wurde Tabak, der das AoPRT-L-Promotor/GUS-Konstrukt barg, 20 Tage lang nicht mit Wasser versorgt, wurde ein leichter Anstieg der Expression beobachtet, zu diesem Zeitpunkt waren die Pflanzen jedoch bereits stark verwelkt (12c). Ähnlich induzierte eine hohe ABA-Konzentration in Blattscheibchen in transgenem Tabak einen leichten Anstieg des AoPRT-L-Promotor/GUS (12d). Es sind zweierlei Dinge zu betonen. 1) Das Niveau der Induktion durch Trockenheit oder ABA ist typischerweise um eine Größenordnung niedriger als bei der Verwendung von SA. 2) Sowohl Wasserarmut als auch Behandeln mit ABA induzieren beim Tabak einen beträchtlichen Proteinverlust, und der scheinbare Anstieg der GUS-Aktivität könnte ein Artefakt eines differentiellen Ansprechens der GUS (im Vergleich zu anderen wichtigen Blattproteinen) auf den Mechanismus des Proteinverlusts sein.
Aus diesen Werten kann geschlossen werden, daß der AoPRT-L-Promotor im wesentlichen nicht auf verschiedene Arten von Wasserstreß anspricht und daß eine gegebenenfalls auftretende schwache Expression nur in schwer geschädigten Pflanzen auftreten dürfte.
Beispiel 9 - Das AoPRT-L-Promotor/GUS-Konstrukt spricht nicht auf Prooxidantien an
Die Beobachtung, daß die vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebene GUS-Aktivität in Gewebe in der Nähe des Orts der Pathogenprovokation erhöht ist, legt nahe, daß der SA eine Rolle als induktionsverursachendem Agens zukommt. In den letzten Jahren hat man sich jedoch sehr für die Produktion von reaktionsfähigen Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) während Pflanzen-Pathogen-Interaktionen interessiert. Kurz gesagt führt die Erkennung eines Pathogens zur Produktion eines H₂O₂-"Burst". Das Modell für diesen "oxidativen Burst", das zur Zeit am beliebtesten ist, ist, daß H₂O₂ von der Dismutation von von einer Zelloberflächen-NADPH-Oxidase produziertem Superoxid stammt. Mehrere mit der Abwehr in Zusammenhang stehende Gene (darunter auch AoPR1) sprechen direkt auf das H₂O₂ an (Bi et al., (1995) supra). Außerdem können große H₂O₂-Mengen die SA-Synthese induzieren (Neuenschwander et al., (1995) Plant Journal 8:227–233; Summermatter et al., (1995) Plant Physiology 108:1379–1385). Schließlich und endlich ist die Anhäufung von ROS auch ein Phänomen von Kälte-, Ozon- und UV-Streß, und erhöhte ROS-Spiegel finden sich auch in alterndem Gewebe.
Um die Wahrscheinlichkeit, daß Oxidationsstreß eine starke vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebene Genexpression induziert, zu prüfen, wurden Blattabschnitte von transgenem Tabak, der das AoPRT-L-Promotor/GUS-Konstrukt barg, mit H₂O₂ infiltriert (13a). Es ist bereits gezeigt worden, daß die verwendeten H₂O₂-Konzentrationen die AoPR1-GUS-Expression in Tabak induzieren (Bi et al., (1995) – siehe Beispiel 5). In dem geprüften Konzentrationsbereich konnte H₂O₂ keine AoPRT-L-Promotor/GUS-Expression induzieren. H₂O₂ weist jedoch im Apoplasten nur eine begrenzte Halbwertzeit auf (nur ungefähr 10 min.-Levine et al., (1994) Cell 79: 583–593), daher wurde der Versuch mit einem stabilen Peroxid, nämlich t-Butyl-hydroperoxid, wiederholt (13b). Wiederum war trotz der schweren sichtbaren Gewebeschädigung, die bei höheren t-Butyl-hydroperoxidkonzentrationen (im Gegensatz zu H₂O₂, der keine sichtbaren Symptome verursachte) auftrat, keine GUS-Expression nachzuweisen.
Diese Daten legen nahe, daß es im Gegensatz zu PR-1a (Bi et al., (1995) – siehe Beispiel 5: Neuenschwander et al., (1995) Plant Journal 8:227–233) unwahrscheinlich ist, daß eine von AoPRT-L-Promotor vorangetriebene Genexpression auftreten wird, nicht einmal unter hohen ROS-Streßbedingungen oder bei Vorliegen von ROS-vermittelter Gewebeschädigung.
Beispiel 10 - In Brassica napus wird der AoPRT-L-Promotor durch SA und BTH induziert
Die AoPRT-L-GUS-Fusion in pJIT60-P22-GUS-int wurde als SstI-XhoI-Fragment in das mit SstI, SalI geschnittene Plasmid pTZl9 (Pharmacia) übertragen, wodurch man pGB4 erhielt. Dann wurde das AoPRT-L-GUS-Gen als HindIII-Fragment in die HindIII-Restriktionsstelle des binären Vektors SCV-nos nptII (WO 96/30 529) kloniert, wodurch man zu pGB4-SCV gelangte, in dem die Transkriptionsrichtung vom AoPRT-L gleich ist wie diejenige des nptII-Gens. pGB4-SCV wurde in den Agrobakterienstamm pGV2260 übertragen, und transformierte B. napus Pflanzen wurden durch Agrobakterien-Transformation hergestellt, wobei im wesentlichen wie bei Moloney et al., (1989) Plant Cell Reports 8:238–242 beschrieben vorgegangen wurde. Wurden die transformierten Pflanzen mit 1 mM SA oder 250 μM BTH behandelt, so traten ähnliche GUS-Aktivitätsniveaus auf (14). AoPRT-L-GUS- und PR1a-Pflanzen wiesen ebenfalls bei Induktion mit SA oder BTH ähnliche GUS-Aktivitätenniveaus auf (14).
Beispiel 11 - Bei Zea mays wird der AoPRT-L-Promotor durch SA und BTH induziert
Maispflanzen, die AoPRT-L-GUS enthielten, wurden durch biolistische Transformation von Callusmaterial mit pJIT60-P22-GUS hergestellt. Wurden die transformierten Pflanzen mit SA oder BTH behandelt, so trat eine GUS- Aktivität auf.
Beispiel 12 - Identifikation und Multimerisation eines auf SA/BTH ansprechenden Elements im AoPRT-L-Promotor
Eine Reihe von 3 AoPRT-L-5'-Promotordeletion-GUS-Fusionskonstrukte wurden mit den folgenden Primern, die für Regionen des AoPRT-L-Promotors entwickelt wurden, konstruiert, (15a):
5'-GCGAAGCTTCCATGTCATGRGAGAAGCAC-3' (–361 Bp)
HindIII
5'-GCGAAGCTTTTGGAAACTGAATACCTACA-3' (–247 Bp)
HindIII
5'-GCGAAGCTTACAAAGGCTTRGACTTTCCA-3' (–132 Bp)
HindIII
Mit jedem der genannten Primer wurde zusammen mit dem unten angeführten Primer eine PCR-Reaktion mit p22-JIT60 als Matrize durchgeführt:
5'-GGGATCCGTCGACCTGCAGATTGGTTGTGTGTTGTTTTTG-3'
BamHI SalI PstI
Die PCR-Produkte wurden in Form von HindIII-, BamHI-Fragmenten in das mit HindIII, BamHI geschnittene Plasmid p22-GUS-(INT)-JIT60 kloniert. Die erhaltenen chimären pAoPRT-L-GUS-CaMV polyA-Gene wurden als KpnI, XhoI-Fragmente in das mit KpnI, SalI geschnittene Plasmid pBin19 kloniert und in Samsun-Tabak hineintransformiert. Die GUS-Aktivität der Transformanten wurde nach Induktion von Blattscheibchen mit 1 mM SA bestimmt. Nach Deletion von bis zu –132 Bp wurde eine wesentliche Aktivitätsverringerung beobachtet (15b). Das auf SA ansprechende Element liegt also zwischen –247 Bp und der mutmaßlichen CAT (–50 –47) und TATA-Box bei –64 bis –57 Bp.
Um einen AoPRT-L-Promotor mit höherer Expression zu konstruieren, wurde die Region –247 Bp bis –133 Bp aus p22-JIT60 amplifiziert und zweimal vor einen AoPRT-L-Promotor bei –247 Bp gestellt. Dieser AoPRT-Lx3-Promotor wurde folgendermaßen konstruiert: mit den unten angeführten Primern wurde mit dem AoPRT-L-Promotor aus 22p-JIT60 von 0 Bp bis –247 Bp eine PCR durchgeführt.
5'-TCTAGGTACCCTTTGCGTGGTCGACTTGGAAACTGAATACCTAC-3'
KpnI SalI
5'-GGGATCCGTCGACCTGCAGATTGGTTGTGTGTTGTTTTTG-3'
BamHI SalI PstI
Dieses Produkt wurde als KpnI, PstI-Fragment in pUCl9 kloniert. Die pAoPRT-L-Region von –133 Bp bis –247 Bp wurde mit den Primern
5'-TCTAGGTACCCTTTGCGTGGTCGACTTGGAAACTGAATACCTAC-3'
KpnI SalI
5'-GAAAGTCTAAGCCTCGAGGGAATAAGGTACGAGTTCGTGGAC-3'
XhoI
amplifiziert. Dieses Fragment wurde als KpnI, XhoI-Fragment zwischen die KpnI- und die SalI-Restriktionsstelle des von pUC19 abgeleiteten Plasmids kloniert, wodurch man zu pAoPRT-Lx2 gelangte. Das pAoPRT-L-Fragment von –133 Bp bis –247 BP wurde anschließend als KpnI-, XhoI-Fragment zwischen die KpnI- und die SalI-Restriktionsstellen von pAoPRT-Lx2 kloniert, wodurch man pAoPRT-Lx3 erhielt (15c). Als nächstes wurde der AoPRT-Lx3-Promotor in Form eines KpnI, PstI-Fragments in das mit KpnI, PstI geschnittene Plasmid p22-JIT60 kloniert, wodurch man zu pAoPRT-Lx3-JIT60 gelangte. pAoPRT-Lx3 wurde von pAoPRT-L-x-JIT60 in Form eines KpnI, BamHI-Fragments in das mit KpnI, BamHI geschnittene Plasmid p22-GUS-(INT)-JIT60 übertragen. Schließlich wurde das erhaltene chimäre pAoPRT-Lx3-GUS-CaMV-polyA Gen in Form von KpnI, XhoI-Fragmenten in das mit KpnI, SalI geschnittene Plasmid pBin19 kloniert und in Samsun-Tabak hineintranformiert. Die entstandenen Pflanzen wiesen bei Induktion mit SA oder BTH eine signifikant höhere GUS-Aktivität auf als die entsprechenden AoPRT-L-GUS-Pflanzen.
Beispiel 13 - Amplifikation des AoPRT-L-Promotors mit Hilfe eines Transaktivierungssystems
Eine Möglichkeit, die Aktivität des AoPRT-L-Promotors zu erhöhen und trotzdem eine enge Regulation des Promotors beizubehalten, besteht darin, daß ein System verwendet wird, das die Expression des AoPRT-L-Promotors amplifiziert. Es wurde ein Amplifikationssystem mit einem Transaktivator erzeugt (beschrieben in WO 98/05 789 und Moore et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 379–381). Der AoPRT-L-Promotor wird mit einem synthetischen Transaktivator (LhG4) und der Zielpromotor des Transaktivators (pOP) wird mit dem zu exprimierenden Gen gekoppelt. LhG4 besteht aus einem mutierten lacI-Gen aus E. coli in Fusion mit der Transkriptionsaktivatordomäne von GAL4 aus der Hefe. pOP910 ist ein CaMV-35S-Minimalpromotor mit zwei Bindungsstellen des LhG4-Proteins. Da der Transaktivator multiple Transkriptionszyklen von pOP aus initieren kann, findet eine Amplifikation des ursprünglichen Signals, das den AoPRT-L-Promotor aktivierte, statt.
Das Amplifikationssystem wurde mit Hilfe der folgenden Schritte konstruiert. Der pOP910-Promotor wurde aus pX-910TAG (K. Palme, Max Planck Institut für Züchtungsforschung, Köln, Deutschland) in Form eines SstI-NcoI-Fragments herausgeschnitten und in das mit SstI, NcoI geschnittene Plasmid pDH68 kloniert (pDH68 besteht aus einem Plastocyaninpromotor aus der Erbse (Pwee und Gray (1993) Plant J. 3, 437–449), der mit einem Intron-GUS-Gen gekoppelt ist (D. Twell, Leicester University) und zwischen die SstI- und EcoRI-Stelle des Vektors pJIT30 kloniert wurde (Guerineau et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15, 127–136)). Das erhaltene chimäre pOP-GUS int-CaMV polyA Gen wurde als (stumpfendig gemachtes) SstI, XhoI-Fragment in den mit EcoRV, XhoI geschnittenen Klonierungsvektor pIC19H (Marsh et al., (1984) Gene 32, 481–485) übertragen. Von diesem Plasmid wurde das chimäre Gen in Form eines SalI, XhoI-Fragments gewonnen und in das mit SalI geschnittene Plasmid pNos nptII-SCV kloniert, wodurch man pWP320-SCVA erhielt. Um eine Fusion von pAoPRT-L mit LhG4 zu konstruieren, wurde der AoPRT-L-Promotor erst in Form eines HindIII, PstI-Fragments aus pGB4 in das mit HindIII, PstI geschnittene Plasmid pBluescript KS+ übertragen, wodurch man pGB21 erhielt. pGALA (I. Moore, Universität Oxford, GB) enthält das LhG4-Gen in Verknüpfung mit einem polyA-Terminator aus CaMV. Dieses Gen wurde in Form eines KpnI, PstI-Fragments herausgeschnitten und zwischen die KpnI und die PstI-Restriktionsstelle des Vektors pT7Blue2 (Novagen) kloniert, wodurch man zu pGB22 gelangte. Das (stumpfendig gemachte) Kpn, NotI-Fragment von pGB22 wurde anschließend in die SmaI, NotI-Restriktionsstellen von pGB21 kloniert, wodurch man pGB23 erhielt. Die erhaltene pAoPRT-L-LhG4-Fusion wurde als Sal-Fragment in das mit SalI geschnittene Plasmid pWP320-SCVA übertragen, wodurch man zu pGB24 gelangte (16).
Tabak- und B. napus-Pflanzen, die die pGB24-T-DNA-Region enthalten, weisen bei Induktion mit SA oder BTH eine signifikant höhere GUS-Aktivität als äquivalente AoPRT-L-GUS-Pflanzen auf. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül, das einen induzierbaren Promotor für ein mit Pathogenese in Zusammenhang stehendes Gen enthält, wobei der Promotor aus der aus folgendem bestehenden Gruppe stammt: i) Nukleinsäuremolekül, das die Expression eines 21,3 kDa großen thaumatinartigen PR-5-Proteins in Asparagus officinalis natürlich vorantreibt und die in 6 dargestellte Sequenz aufweist, ii) Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die mit der in 6 dargestellten Sequenz zu 70% identisch ist, wobei das Molekül als induzierbarer Promotor wirkt, dessen Expression durch Salicylsäure (SA) und durch BTH (Benzo(1,2,3)thiadiazol-7-carbothionsäure-S-methylester) induziert wird, durch Pathogeninfektion nicht systemisch aktiviert wird und eine minimale entwicklungsregulierte Expression aufweist; iii) Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen (Hybridisierung und Waschen bei 55–65°C, abschließendes Waschen mit 0,5X SSC, ohne 0,1% SDS) mit einem der Promotoren von i) oder ii) hybridisiert, wobei das Molekül als induzierbarer Promotor wirkt, dessen Expression durch SA und durch BTH induziert wird, durch Pathogeninfektion nicht systemisch aktiviert wird und eine minimale entwicklungsregulierte Expression aufweist; iv) mindestens 100 Nukleotide langes Fragment des Nukleinsäuremoleküls von i), wobei das Fragment als induzierbarer Promotor wirkt, dessen Expression durch SA und durch BTH induziert wird, durch Pathogeninfektion nicht systemisch aktiviert wird und eine minimale entwicklungsregulierte Expression aufweist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 mit einer Sequenz, die mit der in 6 dargestellten Sequenz zu 80% identisch ist, wobei das Molekül als induzierbarer Promotor wirkt, dessen Expression durch Salicylsäure (SA) und durch BTH (Benzo(1,2,3)thiadiazol-7-carbothionsäure-S-methylester) induziert wird, durch Pathogeninfektion nicht systemisch aktiviert wird und eine minimale entwicklungsregulierte Expression aufweist.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Fragment zumindest das auf SA ansprechende Element von –247 Bp bis –132 Bp in 6 enthält.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül, das einen chimären Promotor enthält, der mindestens einen Pomotor eines Gens, das nicht natürlicherweise unter der Kontrolle des Nukleinsäuremoleküls von 6 steht sowie das auf SA ansprechende Element nach Anspruch 3 beinhaltet.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül, das mindestens zwei Pomotorsequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Serie geschaltet enthält.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 5, das zwischen Promotorsequenzen Linkersequenzen enthält.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 5 oder 6, wobei mindestens einer der Promotoren das auf SA ansprechende Element nach Anspruch 3 enthält.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül, das ein Amplifikationssystem enthält, wobei das Amplifikationssystem operativ mit einem Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 7 verbunden ist.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 8, wobei das Amplifikationssystem eine Transaktivatorsequenz eines mRNA-Virusreplikasesystems enthält.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 9, wobei das Amplifikationssystem eine Transaktivatorsequenz und eine zweite Promotorsequenz enthält, wobei die zweite Promotorsequenz der Angriffspunkt des Transaktivators ist.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das operativ mit einer DNA-Sequenz, die für ein interessierendes Produkt codiert, verbunden ist.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 11, wobei das interessierende Produkt ein Protein oder ein Produkt, das zur Regulation der Expression eines Proteins fähig ist, ist.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, wobei das Produkt bei seiner Expression ein pflanzliches Merkmal beeinflußt.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 13, wobei das beeinflußte pflanzliche Merkmal ein Merkmal aus der Reihe Pathogenresistenz, Krankheitsbekämpfung, Sterilität, Fertilität oder Fruchtreifung ist.
Rekombinantes oder isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 11 oder Anspruch 14, das weiterhin ein Markergen enthält.
Vektor, der das rekombinante oder isolierte DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 15 enthält.
Wirtszelle, die ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder einen Vektor nach Anspruch 16 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 17, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle oder eine Mikroorganismenzelle ist.
Transgene Pflanze, die mindestens eine Zelle nach Anspruch 18 enthält.
Verfahren zur Identifikation eines Mittels, das zur Regulation der Expression von heterologen Genen, die operativ mit dem Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 7 verbunden sind, fähig ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, daß man ein mutmaßliches Mittel auf die Probe, die den Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in operativer Verknüpfung mit einem Gen enthält, einwirken läßt und das Expressionsniveau des Gens bestimmt.