EP1948806A2 - Verwendung von armadillo-repeat (arm1)-polynukleotiden zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen - Google Patents

Verwendung von armadillo-repeat (arm1)-polynukleotiden zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen

Info

Publication number
EP1948806A2
EP1948806A2 EP06819167A EP06819167A EP1948806A2 EP 1948806 A2 EP1948806 A2 EP 1948806A2 EP 06819167 A EP06819167 A EP 06819167A EP 06819167 A EP06819167 A EP 06819167A EP 1948806 A2 EP1948806 A2 EP 1948806A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
polypeptide
plant
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06819167A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dimitar Douchkov
Patrick Schweizer
Uwe Zierold
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Plant Science GmbH filed Critical BASF Plant Science GmbH
Priority to EP06819167A priority Critical patent/EP1948806A2/de
Publication of EP1948806A2 publication Critical patent/EP1948806A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance

Definitions

  • ARM1 Armadillo repeat
  • the invention relates to a method for producing or increasing a pathogen resistance in plants by reducing the expression of at least one Armadillo Repeat polypeptide or a functional equivalent thereof.
  • the invention relates to novel nucleic acid sequences coding for a Hordeum vulgar Armadillo Repeat (HvARM) polynucleotide and describes homologous sequences (ARM1) thereof and their use in methods for achieving a pathogen resistance in plants, as well as nucleic acid constructs, expression cassettes and vectors comprising these sequences, and which are capable of mediating a fungus resistance in plants.
  • the invention further relates to these expression cassettes or vectors transformed transgenic organisms, in particular plants, derived cultures, parts or transgenic propagation material.
  • fungi invade the host tissue via the stomata (e.g., rust fungi, Septoria, Fusarium species) and penetrate the mesophyll tissue, while others penetrate via the cuticle the underlying epidermal cells (e.g., Blumeria species).
  • stomata e.g., rust fungi, Septoria, Fusarium species
  • mesophyll tissue e.g., rust fungi, Septoria, Fusarium species
  • others penetrate via the cuticle the underlying epidermal cells (e.g., Blumeria species).
  • the invention relates to a method for increasing the resistance to one or more penetrating pathogen (s) in a monocot or dicotyledonous plant, or a part of a plant, e.g. in an organ, tissue, cell or part of a plant cell, e.g. in an organelle, characterized in that activity or amount of an Armadillo Repeat ARM1 protein in the plant, or part of the plant, e.g. in an organ, tissue, cell or part of a cell, e.g. in a cell compartment, e.g. in an organelle, compared to a control plant or part of a control plant, e.g. their organ, tissue, cell or part of a cell, e.g. is reduced or reduced in a cell compartment, for example in an organelle.
  • race-specific resistance is achieved in the method according to the invention.
  • a broad spectrum resistance against obligate biotrophic and / or hemibiotrohpe and / or necrotrophic fungi of plants, in particular against mesophyll, epidermis or into the mesophyll-penetrating pathogens can be achieved.
  • Armadillo Repeat motif was originally discovered in the segment polarity gene Armadil-Io from Drosophila melanogaster. It codes for a beta-catenin, which plays an important role in cell-cell adhesion as well as for cell differentiation.
  • Armadillo (Arm) Repeat proteins contain tandem copies of a degenerate sequence of approximately 42 amino acids, which encodes a three-dimensional structure for mediating protein-protein interactions (Azevedo et al. (2001) Trends Plant Sci. 6, 354- 358). Most of these proteins are involved in intracellular signal transduction or in the regulation of gene expression in cellular development processes.
  • Armadillo repeat proteins In contrast to animals, only two plant-derived Armadillo repeat proteins have been functionally characterized: one gene is PHOR1 (photoperiod-responsive 1) from potato, for which a role in gibberellic acid signal transduction could be demonstrated (Amador V, Cell 10; 106 (3): 343-54.)
  • the second armadillo repeat protein is ARC1 (Armadillo Repeat Containing Protein 1) from rapeseed, which interacts with the receptor kinase SRK1 (Gu et al. 1998) Proc. Natl. Acad., USA 95, 382-387).
  • ARC1 Armadillo Repeat Containing Protein 1
  • ARC1 belongs to the U-box subclass of Armadillo repeat proteins, which includes 18 genes in Arabidopsis (Azevedo et al. (2001) Trends Plant Sci., 6, 354-358).
  • the U-box is a motif consisting of about 70 amino acid residues.
  • HECT and RING finger proteins they presumably form a third class of ubiquitin E3 ligases whose primary function is to establish the substrate specificity of the ubiquitination machinery (Hatakeyama et al., (2001) J. Biol. Chem. 76, 331 11-33120).
  • the genes or the nucleic acids used or the expressed proteins whose experession is diminished have an identity of 40% or more, preferably 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% or more compared to the respective sequence of HvARM (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively).
  • HvArm The highest homology genes to HvArm from rice (Acc #: XM_479734.1, XM_463544, AP003561, or XM_506432), Tobacco (AY219234) and Arabidopsis (Acc # NM_127878, AC004401, BT020206, AB007645, NM_115336, AK118613 , AL138650, AL133314, AC010870, AY125543, AY087360, AB016888, AK175585, AL049655, AY096530 and AK1 18730) thus presumably perform functions similar to HvARM in the plant. In the following, therefore, these are under the term "Aimadillo repeat ARM1" or "ARM1" protein summarized. In contrast, HvARM and HvARMI refer to such a protein from barley.
  • the invention consequently relates to a process for the production of a plant with increased resistance to one or more plant pathogens, preferably with a broad-spectrum resistance, in particular against piocathogens, for example the classes Ascomycetes, Basidiomycetes, Chytridiomyces or Oomycetes, preferably from powdery mildews of the family Erysiphaceae, and most preferably the genus Blumeria, by reducing the expression of a protein characterized by containing at least one armadillo repeat.
  • the protein contains two, more preferably more than two armadillo repeats.
  • the activity of an armadillo repeat polypeptide is reduced, e.g. blocked or off, which essentially does not include a U-box, i. either does not include a U-box or does not include a functional U-box.
  • the activity of a polypeptide is reduced, for example switched off, which is encoded by a polynucleotide comprising at least one nucleic acid molecule selected from the group consisting of: (a) a nucleic acid molecule which encodes at least one polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 or 62 sequence shown;
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide recognized by a monoclonal antibody directed against a polypeptide encoded by the nucleic acid molecules of (a) to (c);
  • nucleic acid molecule which consists of a DNA library using a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments of at least 15 nt, preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt can be isolated as a probe under stringent hybridization conditions;
  • the resistance to mesophyll and / or epidermal cell-penetrating pathogens is preferably increased.
  • resistance is achieved by expressing the expression of a polypeptide, preferably a polypeptide, encoded by the above-described nucleic acid molecule, for example, an ARM1 from rice (Acc #: XM_479734.1, XM_463544, AP003561, or XM_506432 ), Tobacco (AY219234) and Arabidopsis (Acc.-No.
  • a polypeptide preferably a polypeptide, encoded by the above-described nucleic acid molecule
  • an ARM1 from rice Acc #: XM_479734.1, XM_463544, AP003561, or XM_506432
  • Tobacco AY219234
  • Arabidopsis Acc.-No.
  • the endogenous activity of one of these polypeptides can also be reduced, reduced or blocked by methods known to those skilled in the art, for example by mutation of a genomic coding region for the active site, for binding sites, for localization signals, for domains, clusters, etc., such as codie Coordinating Regions for HEAT, FBOX, LRR, IBIB, C2, WD40, Beach, U-Box, or AND domains.
  • the activity can be reduced according to the invention by mutations which influence the secondary, tertiary, or quaternary structure of the protein.
  • Mutations can e.g. be introduced by EMS mutagenesis. Domains can be identified by suitable computer programs, such as e.g. SMART, or InterPRO, e.g. as in Andersen P., The Journal of Biol. Chemistry, 279, 38, pp. 40053-40061, 2004 or Y. Mudgil, Plant Physiology, 134, 59-66, 2004, and references therein.
  • the suitable mutants can then be e.g. by TiLing (Henikoff et al., Plant Physiol. 2004 Jun; 135 (2): 630-6).
  • the reduction in the polypeptide level, activity or function of an Armadillo Repeat ARM1 protein in a plant is combined with an increase in the polypeptide level, activity or function of other resistance factors, preferably a Bax inhibitor 1 protein (BI-1), preferably the Bax Hordeum vulgare inhibitor 1 (GenBank Acc. No .: AJ290421), from Nicotiana tabacum (GenBank Acc. No .: AF390556), rice (GenBank Acc. No .: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc.- No .: AB025927) or tobacco and oilseed rape (GenBank Acc. No .: AF390555, Bolduc N et al.
  • BI-1 Bax inhibitor 1 protein
  • An increase can e.g. et al by mutagenesis or overexpression of a transgene.
  • a reduction in the protein amount or activity of the proteins RacB eg from barley (GenBank Acc. No .: AJ344223)
  • CSL1 eg from Arabidopsis (GenBank Acc. No .: NM116593)
  • HvNaOX eg from barley (GenBank Acc. No .: AJ251717)
  • MLO eg from barley (GenBank Acc. No. Z83834).
  • the activity or function of MLO, BI-1 and / or NaOX can be carried out analogously as for MLO in WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552 and the other writings mentioned below are reduced or inhibited, the content of which is hereby expressly and expressis verbis with recorded, in particular to describe the activity and inhibition of MLO.
  • the description of the cited documents describes methods, methods and particularly preferred embodiments for reducing or inhibiting the activity or function of MLO; the examples concretely indicate how this can be carried out.
  • the reduction of the activity or function and, if appropriate, the expression of BI-1 is described in detail in WO 2003020939, which is hereby expressly and expressly taken as included in the present description.
  • the specification of the cited document describes methods and methods for reducing or inhibiting the activity or function of BI-1, the examples specifically indicating how this can be carried out.
  • the reduction or inhibition of the activity or function of BI-1 is particularly preferably carried out according to the embodiments and the examples particularly preferred in WO 2003020939 and in the organisms shown there as particularly preferred, in particular in a plant, eg constitutively, or in one part thereof, eg in a tissue, but especially at least in the epidermis or a substantial part of the epidermal cells.
  • the reduction of the activity or function and optionally the expression of BI-1 is described in detail in WO 2003020939.
  • the person skilled in the art will find in WO 2003020939 the sequences which code for BI-1 proteins and can also identify BI-1 with the method provided in WO 2003020939.
  • the activity in the plant is lower than in a control plant or in a part of a plant is lower than in a corresponding part of a control plant, eg in an organ, an organelle, a tissue, or a cell
  • the activity of said polypeptide is 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% %, 97%, 99%, or even less than in the control.
  • essentially no or particularly preferably no expression of said polypeptide takes place at all.
  • these terms also encompass complete inhibition or blocking of an activity, eg, by knocking out a gene.
  • Reduction encompasses the partial or substantially complete suppression or blocking of the functionality of a protein based on different cell biological mechanisms.
  • a reduction in the meaning of the invention also includes a reduction in the amount of a protein to a substantially complete (i.e., lack of detectability of activity or lack of immunological detectability of the protein) or complete absence of the protein.
  • the expression of a particular protein or the activity or function in a cell or an organism is preferably reduced by more than 50%, particularly preferably by more than 80%, and in particular by more than 90%.
  • expression of a nucleic acid molecule encoding an ARM1 protein e.g. in combination with a tissue-specific increase in the activity of a Bax inhibitor-1 protein, in the mesophyll tissue.
  • Reduction of the Armadillo-Repeat ARM1 protein level in a transgenic plant, e.g. BI-1 overexpressed in mesophyll tissue offers the opportunity to generate complete and complete fungal resistance in the plant.
  • the amount of polypeptide, activity or function of the Bax inhibitor 1 protein is increased from Hordeum vulgare (Gevtäank Acc. No .: AJ290421), from Nlcotlana tabacum ⁇ GenBank Acc. No .: AF390556), rice (GenBank Acc.-No .: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc.-No .: AB025927) or tobacco and oilseed rape (GenBank Acc. No .: AF390555, Bolduc N et al. (2003) Planta 216: 377-386) or of ROR2 (eg from barley (GenBank Acc.
  • SnAP34 eg from barley (GenBank Acc. No .: AY247208) and / or the lumenal binding protein BiP eg from rice (GenBank Acc. No AF006825) combined with the reduction in the protein amount or activity or function of the proteins RacB (eg from barley (GenBank Acc. No .: AJ344223), CSL1 (eg from Arabidopsis (GenBank Acc.
  • At least one of the above mentioned is used for the purposes of ex activating or overexpressing appropriate genes and / or diminishing at least one of the abovementioned genes for reduction.
  • An increase in expression can be achieved as described herein.
  • both activation and ascending understood expression or function of the endogenous protein including a de novo expression as well as an increase or increase by the expression of a transgenic protein or factor.
  • Organism in the context of the invention means “non-human organisms” as long as the term refers to a viable multicellular organism.
  • Plants in the context of the invention means all dicotyledonous or monocyledonous plants Preferred plants are those which can be subsumed under the class of the Liliatae (monocotyledoneae or monocotyledonous plants) The term includes the mature plants, seeds, shoots and seedlings, as well as derived parts, reproductive material, plant organs, tissues, protoplasts, callus and other cultures, for example cell cultures, as well as all other types of groupings of plant cells into functional or structural units.Red plants means plants at any stage of development beyond the seedling young, immature plant at an early stage of development.
  • Plant also includes annual and perennial dicotyledonous or monocotyledonous plants and includes, by way of example but not limitation, those of the genera, Bromus, Asparagus, Pennisetum, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Tritiumum, Sorghum and Saccharum one.
  • the method is applied to monocotyledonous plants, for example from the family Poaceae, more preferably to the genera Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, and saccharum, most preferably to plants of agricultural importance, such as eg Hordeum vulgare (barley), Triticum aestivum (wheat), Triticum aestivum subsp.spelta (spelled), triticale, Avena sative (oats), Seeale cereale (rye), sorghum bicolor (millet), Zea mays (maize), Saccharum officinarum ( Sugarcane) or Oryza sative (rice).
  • the family Poaceae more preferably to the genera Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, and saccharum, most preferably to plants of agricultural importance, such as eg Hordeum vulgare (barley), Triticum
  • Epidermis tissue or epidermis means the outer layers of tissues of the plants, it can be one-layered to multi-layered, there is epidermis-enriched gene expression, such as: Cer3, which can serve as a marker; Hannoufa.A. (1996) Plant J. 10 (3), 459-467.
  • the term "epidermis” is understood to mean the predominant terminating tissue of primary aboveground plant parts, such as the shoot, the leaves, flowers, fruits and seeds, to the outside the epidermis cells shed a water-repellent layer, the cuticle
  • the roots are surrounded by the rhizodermis which is similar in many respects to the epidermis, but also has marked differences from it Derivation of the rhizodermis, however, is less clear. Depending on the species, it can be attributed to development history either the root cap or the primary bark.
  • the epidermis can be attributed numerous functions: It provides the plant protection against dehydration and regulates the transpiration rate It protects the plant from various chemical and physical external influences as well as animal and infestation by parasites.
  • the epidermis contains a number of differently differentiated cells. There are also species-specific variants and different organization of the epidermes in the individual parts of a plant. Essentially, it consists of three categories of cells: the "true" epidermal cells, the cells of the stomata (stomata) and the trichomes (Greek: trichoma, hair), epidermal appendages of various shapes, structures and functions.
  • epidermal cells make up the bulk of the cells of the terminal tissue. They are either polygonal (of plate or tabular shape) or stretched in plan. The trained between them walls are often wavy or booked. What induces this form during development is unknown; the present hypotheses explain the situation only unsatisfactorily. Elongated epidermal cells are found on organs or organ parts which are self-stretched, e.g. on stems, petioles and leaf ribs as well as on the leaves of most monocotyledons.
  • leaf blades can be covered by differently structured epiderms, whereby both the shape of the cells, the thickness of the walls and the distribution and number of specialized cells (stomata and / or trichomes) per unit area can vary.
  • epiderms Most of the epidermis is single-layered, but in species from several families (Moraceae: here most Ficus species, Piperaceae: Peperonia [Pepe- ronie], Begoniaceae, Malvaceae, etc.) multi-layered water-storing epi- derms have been detected.
  • Epidermis cells but on the outside of a cutin layer (cuticle), which covers all epidermal surfaces as a continuous film. It can be either smooth or structured by protrusions, ridges, folds and furrows. However, a folding of the cuticle that is visible by viewing the surface is not always based on the formation of cuticular strips. There are certainly cases where a kutikulafaltung is only the expression of the underlying protuberances of the cell wall. Epidermal appendages of various shapes, structures and functions are referred to as trichomes and are also understood here by the term "epidermis". They occur as protective, supporting and glandular hairs
  • epidermis also includes papillae, papillae are protuberances of the epidermis surface, the papillae on flower surfaces of the pansy (viola tricolor) and the leaf surfaces of many species in tropical rainforest give the surface a velvety consistency.
  • Some cells of epidermis can be designed as water reservoirs.A typical example are the bladder cells on surfaces of many midday flower species and other succulents. In some plants, such as the campanula (Campanula persicifolia), the outer walls of the epidermis are thickened lens-shaped
  • parenchymatous tissues The bulk of all tissues forms the ground tissue or parenchyma.
  • the parenchymatous tissues is the mesophyll, which may be differentiated in leaves in the palisade parenchyma and sponge parenchyma.
  • mesophyll the mesophyll
  • Parenchymatous cells are all living, mostly isodiametric, rarely elongated.
  • the pith of the shoots, the storage tissues of the fruits, seeds, the root and other subterranean organs are to be regarded as parenchyma as well as the mesophyll.
  • “Medullary tissue” means the leaf tissue lying between the epidermis layers, consisting of the palisade tissue, the sponge tissue and the leaf veins.
  • the mesophyll is subdivided into palisade and sponge parenchyma in the leaves of most ferns and phanerogams, especially in the dicotyledons and many monocotyledons.
  • a "typical" leaf is dorsiventral built.
  • the palisade parenchyma is usually located on the upper side of the leaf just below the epidermis.
  • the sponge parenchyma fills the underlying space. It is interspersed with a voluminous intercellular system whose gas space is in direct contact with the outside world via the stomata.
  • the palisade parenchyma consists of elongated, cylindrical cells. In some species, the cells are irregular, sometimes they are forked (Y-shaped: armpalisadenparenchym). Such variants occur in ferns, conifers and a few angiosperms (for example in some ranunculaceae and caprifoliaceen species [example: elderberry]). In addition to the most widely used form of organization just described, the following variants have been demonstrated: Palisade parenchyma on the underside of the leaf. Especially noticeable in scale leaves. Example: Tree of Life (Thuja), as well as the leaves of wild garlic (Allium ursinum)
  • the variability of the sponge parenchyma cells and the formation of the sponge parenchyma itself are even more diverse than those of the palisade parenchyma. It is usually referred to as Autolskyungsgewebe, because it contains a variety of interconnected intercellular spaces.
  • the mesophyll may comprise the so-called assimilation tissue, but the terms mesophyll and assimilation tissue are not to be used as synonyms.
  • Further aids for the characterization of epidermis and medley are found by the person skilled in the art, e.g. in v. GUTTENBERG, H .: Textbook of General Botany. Berlin: Akademie-Verlag 1955 (5th ed.), HABERLANDT, G .: Physiological plant anatomy.
  • epidermis or epidermis cells can be characterized histologically or biochemically, including molecular biology.
  • the epidermis is biochemically characterized.
  • the epidermis may in one embodiment be characterized by the activity of one or more of the following promoters:
  • WIR5 GstA1
  • acc. X56012 Dudler & Swiss, unopened GLP4, acc. AJ310534; Wei.Y .; (1998) Plant Molecular Biology 36, 101-112.
  • GLP2a acc. AJ237942, Schweizer.P., (1999). Plant J 20, 541-552.
  • the epidermis is characterized in that only a part of the promoters is active, for example 2, 3, 5 or 7 or more, but at least one of the above enumerated is active. In one embodiment, the epidermis is characterized in that all said promoters are active in the tissue or cell. Consequently, mesophyll or mesophyll cells can be biochemically characterized, including molecular biology or histology. In one embodiment, the mesophyll is biochemically characterized. In one embodiment, the mesophyll can be characterized by the activity of one or more of the following promoters:
  • TaFBPase acc. X53957 ;.
  • the mesophyll is characterized in that only a part of the promoters is active, e.g. 2, 3, 5 or 7 or more, but at least one of those enumerated above. In one embodiment, the mesophyll is characterized in that all of the promoters mentioned are active in the tissue or cell.
  • all the promoters mentioned are active in the epidermis of a plant used or produced according to the invention or a plant according to the invention in the epidermis and mesophyll. In one embodiment, only a portion of the promoters mentioned are active, e.g. 2, 5, 7 or more, but at least one of the promoters enumerated above is active in each case.
  • Nucleic acids means biopolymers of nucleotides which are linked together via phosphodiester bonds (polynucleotides, polynucleic acids) Depending on the type of sugar in the nucleotides (ribose or deoxyribose), a distinction is made between the two classes of ribonucleic acids (RNA) and deoxyribonucleic acids ( DNA).
  • RNA ribonucleic acids
  • DNA deoxyribonucleic acids
  • slaughter means all parts of plants obtained by agricultural cultivation of plants and collected during the harvesting process.
  • “Resistance” means preventing, repressing, reducing or attenuating disease symptoms of a plant as a result of being infested by a pathogen.
  • the symptoms can be of a variety of types, but preferably include those which directly or indirectly lead to impairment of the quality of the plant, the quantity of the crop, the suitability for use as feed or food or even sowing, cultivation, harvesting or processing of the Harvest difficult.
  • the following disease symptoms are attenuated, reduced or prevented: formation of pustules and spore beds on the surfaces of the affected tissues, maceration of the tissues, spreading necrosis of the tissue, accumulation of mycotoxins, e.g. from Fusarium graminearum or F. culmorum, penetration of the epidermis and / or mesophyll, etc.
  • control plant By “conferring,” “passing,” “generating,” or “increasing,” pathogen resistance, or the like, it is meant that the defense mechanisms of a particular plant or part of a plant, e.g. in an organ, tissue, cell or organelle by application of the method of the invention in comparison with a suitable control, e.g. the wild type of the plant ("control plant", “starting crop"), to which the method according to the invention was not applied, under otherwise identical conditions (such as climatic or growing conditions, pathogen type, etc.) an increased resistance to one or more Has pathogens.
  • control plant the wild type of the plant
  • At least the epidermis and / or mesophylic tissue or organs possessing an epidermal and / or mesophylic tissue have increased resistance to the pathogen (s).
  • the resistance in the leaves is increased.
  • resistance is increased in the lemma, palea, and / or glume.
  • the activity of the protein Armadillo-repeat ARM1 according to the invention is reduced.
  • the increased resistance expresses preference in a reduced expression of the disease symptoms, wherein disease symptoms - in addition to the above-mentioned impairments - also includes, for example, the penetration efficiency of a pathogen into the plant or plant cell or the proliferation in or on the same.
  • Changes in the cell wall structure may constitute a fundamental mechanism of pathogen resistance, e.g. shown in Jacobs AK et al. (2003) Plant Cell, 15 (11): 2503-13.
  • the disease symptoms are preferably at least 10% or at least 20%, particularly preferably at least 40% or 60%, very particularly preferably reduced by at least 70% or 80%, most preferably by at least 90% or 95% or more.
  • Pathogen in the context of the invention means organisms whose interactions with a plant lead to the symptoms of the ailment described above, in particular pathogens refers to organisms from the kingdom of fungi. Pathogens are preferably understood to mean an epidermis or mesophyll cell-penetrating pathogen, particularly preferably pathogens which penetrate via stomata in plants and subsequently penetrate mesophyll cells. Organisms of the strains Ascomycota and Basidomycota are preferred. Particularly preferred are the families Blumeriaceae, Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae and Hypocreaceae.
  • HvARM its activity or function also causes resistance to other pathogens.
  • Ascomycota such as e.g. Fusarium oxysporum (Fusarium wilt on tomato), Septoria nodorum and Septoria tritici (spelled tuber on wheat), Basidiomycetes such as Puccinia graminis (black rust on wheat, barley, rye, oats), Puccinia recondita (brown rust on wheat), Puccinia dispersa (Brown rust on rye), Puccinia hordei (brown rust on barley), Puccinia coronata (crown rust on oats),
  • Ascomycota such as e.g. Fusarium oxysporum (Fusarium wilt on tomato), Septoria nodorum and Septoria tritici (spelled tuber on wheat), Basidiomycetes such as Puccinia graminis (black rust on
  • the method according to the invention contributes to resistance
  • Puccinia graminis f.sp. hordei barley stem rust
  • Puccinia graminis f.sp. tritici Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Blumeria graminis f.sp. tritici (powdery mildew, Bgt) or Puccinia graminis f.sp. tritici (Wheat stem rust),
  • Puccinia purpurea Fusarium monilifonne, Fusarium graminearum or Fusarium oxysporum.
  • Armadillo Repeat Arm1 Polypeptide or "Armadillo Repeat ARM1 Protein” or “Arm” or “Arm1” and their modifications means in the context of the invention a protein with one or more Armadillo repeats.
  • an Armadillo Repeat ARM1 protein is understood as meaning a protein with a homology to one of the amino acids shown in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 or amino acid sequence shown in the figures, eg an armadillo repeat ARM1 polypeptide from barley (HvARM) according to SEQ ID NO: 2 and / or Rice (Oryza sative) according to SEQ ID NO: 4, 6, 8, and / or 10, and / or from tobacco (Nicotiana tabacum) according to SEQ ID NO .: 12 and / or from A.
  • HvARM barley
  • Rice Oryza sative
  • the invention relates to functional equivalents of the aforementioned polypeptide sequences.
  • polypeptide amount means the number of molecules or moles of Armadillo Repeat ARM1 polypeptide molecules in an organism, tissue, cell or cell compartment.
  • “Reduction” of the polypeptide amount means the molar reduction in the number of Armadillo-Repeat ARM1 polypeptides, in particular those in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 , 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62, in an organism, tissue, cell or cell compartment, for example by one of the methods described below, as compared to a suitable control, eg the wild type (control plant) of the same genus and species to which this method was not applied, under otherwise identical conditions (such as, for example, culture conditions, age of the plants, etc.).
  • a suitable control eg the wild type (control plant) of the same genus and species to which this method was not applied, under otherwise identical conditions (such as, for example, culture conditions, age of the plants, etc.).
  • the reduction is at least 5%, preferably at least 10% or at least 20%, particularly preferably at least 40% or 60%, very particularly preferably at least 70% or 80%, most preferably at least 90%, 95% or 99%, and especially 100%.
  • Another object of the present invention is the generation of a pathogen resistance by reducing the function or activity of an Armadillo repeat ARM1 polypeptide comprising the sequences shown in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 or a homo log thereof and / or a polypeptide which has a homology of at least 40% and / or a functional equivalent of the aforementioned polypeptides.
  • GAP Garnier et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389ff) is calculated by setting the following parameters:
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3
  • Homology between two polypeptides is understood to mean the identity of the amino acid sequence over the entire sequence length, as compared with the aid of the GAP program algorithm (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) with the following parameters is calculated:
  • Gap Weight 8 Length Weight: 2
  • a sequence having a polypeptide-based homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 2 is understood as meaning a homology of, in a comparison with the sequence SEQ ID NO: 2 according to the above program algorithm with the above parameter set at least 80%.
  • a plant organ, plant tissue, a plant cell, or a part of a plant cell for example in a plant organ, plant tissue, a plant cell, or a part of a plant cell, eg a plant cell specific organelle that reduces Armadillo repeat ARM1 protein activity, function or polypeptide level.
  • the activity of a polypeptide containing at least one, preferably two or more Armadillo re- peats is reduced.
  • the polypeptide diminished in a plant or part of the plant has no U box in the 5'UTR.
  • armadillo repeat is meant a sequence containing tandem copies of a degenerate sequence of about 42 amino acids which encodes a three-dimensional structure for mediating protein-protein interactions (Azevedo et al. (2001) Trends Plant Sei.
  • the polypeptide used in the method of the invention or the polypeptide of the present invention has an activity involved in intracellular signal transduction or in the regulation of gene expression in cellular development processes.
  • the Armadillo repeat ARM1 protein is encoded, for example, by a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecule which encodes a polypeptide having the sequence shown in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62;
  • Nucleic acid molecule which contains at least one polynucleotide of the sequence according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 , 35, 37, 39, 41, or 43;
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide whose sequence has an identity of 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% or more to the sequences SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 ;
  • nucleic acid molecule according to (a) to (c) which is responsible for a functional fragment or an epitope of the sequences according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 , 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 encodes;
  • nucleic acid molecule which encodes a polypeptide which is derived from a monoclonal antibody directed against a polypeptide which is blocked by the nucleic acid molecule. is coded according to (a) to (c) is recognized;
  • nucleic acid molecule which under stringent conditions with a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments consisting of at least 15 nucleotides (nt), preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt hybridized;
  • nucleic acid molecule which consists of a DNA library using a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments of at least 15 nt, preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt as a probe under stringent hybridization conditions can be isolated;
  • the activity of said polypeptides is reduced in a plant or part of a plant, preferably in the epidermis and / or mesophyll cells of a plant, as explained above.
  • the activity of ARM1 in lemma, palea, and / or gums is reduced.
  • epitope is meant the specificity of antibody-determining regions of an antigen (the antigenic determinant).
  • An epitope is therefore the part of an antigen that actually comes into contact with the antibody.
  • antigenic determinants are the regions of an antigen to which the T-cell receptors respond and subsequently produce antibodies that specifically bind the antigenic determinant / epitope of an antigen. Accordingly, antigens or their epitopes are able to induce the immune response of an organism with the consequence of the formation of specific antibodies directed against the epitope.
  • epitopes consist of linear sequences of amino acids in the primary structure of proteins, or complex secondary or tertiary protein structures.
  • a hapten is an epitope released from the context of the antigenic environment. Although haptens have by definition directed an antibody against themselves, haptens may not be able to induce an immune response after, for example, injection into an organism. For this purpose, haptens are coupled to carrier molecules.
  • DNP dinitrophenol
  • BSA bovine serum albumine
  • antibodies thus produced are also those which can bind the hapten alone.
  • the present invention relates to an antibody to a polypeptide characterized herein, more particularly to a monoclonal antibody that binds a polypeptide comprising or consisting of an AA sequence according to the sequences set forth in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 or 62 are shown.
  • Antibodies in the context of the present invention can be used for the identification and isolation of polypeptides disclosed according to the invention from organisms, preferably plants, particularly preferably monocotyledonous plants.
  • the antibodies may be monoclonal, polyclonal, or synthetic in nature, or may consist of antibody fragments such as Fab, Fv, or scFv fragments resulting from proteolytic degradation.
  • Single chain Fv (scFv) fragments are single-chain fragments which, linked by a flexible linker sequence, contain only the variable regions of the heavy and light antibody chains. Such scFv fragments can also be produced as recombinant antibody derivatives.
  • a presentation of such antibody fragments on the surface of filamentous phage allows the direct selection of highly affine scFv molecules from combinatorial phage libraries.
  • Monoclonal antibodies can be obtained according to the method described by Kohler and Milstein (Nature 256 (1975), 495).
  • “Functional equivalents" of an Armadillo-Repeat ARM1 protein preferably means such polypeptides as those represented by the sequences SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 , 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 have homology of at least 40% and have substantially the same properties or functions. Preferably, the homology is 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, most preferably 95%, 97%, 98%, 99% or more.
  • Functional equivalence can be determined, for example, by comparing the phenotypes of test organisms after expression of the respective polypeptides under as identical conditions as possible or after reducing the expression or activity of the polypeptides to be compared in the respective original organisms.
  • "Substantially equivalent properties" of a functional equivalent means, above all, conferring a pathogen-resistant phenotype or conferring or increasing pathogen resistance to at least one pathogen while reducing the polypeptide amount, activity or function of said functional armadillo repeat ARM1 protein equivalent in a plant, organ , Tissue, part or cells, especially in epidermis or mesophyll cells thereof, preferably as measured by the penetration efficiency of a pathogen as shown in the examples.
  • Alkaline conditions means that all framework conditions such as culture or breeding conditions, assay conditions (such as buffer, temperature, substrates, pathogen concentration, etc.) are kept substantially identical between the experiments to be compared, and the approaches are to be compared only by the sequence of the experiments to be compared Armadillo repeat ARM1 polypeptides, their source organism and optionally the pathogen differ.
  • “Functional equivalents” also means natural or artificial mutation variants of the Armadillo-Repeat ARM 1 polypeptides according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 as well as homologous polypeptides from other monocotyledonous and dicotyledonous plants which further have substantially similar properties. Preferred are homologous polypeptides from preferred plants described herein. The sequences from other plants homologous to the Armadillo-Repeat ARM1 protein sequences disclosed in the context of this invention may be e.g. by database searching or screening of gene banks - using the Armadillo-Repeat ARM1 protein sequences as a search sequence or probe, respectively - are easily found.
  • Functional equivalents may e.g. also of one of the polypeptides according to the invention according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 , 42, 44, 60, 61 or 62 are derived by substitution, insertion or deletion and to these polypeptides a homology of at least 40%, 50, 60%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%, most preferably at least 98% and are characterized by substantially the same functional properties as the polypeptides according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62.
  • Functional equivalents are also those of the nucleic acid sequences according to the invention according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 nucleic acid molecules derived by substitution, insertion or deletion, and have a homology of at least 40%, 50, 60%, preferred 80%, preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%, very particularly preferably at least 98% to one of the polynucleotides according to the invention according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 and encode polypeptides having substantially identical functional properties as polypeptides according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62.
  • Examples of the functional equivalents of the Armadillo-Repeat ARM1 proteins to be reduced in the method according to the invention according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 can be found, for example, from organisms whose genomic sequence is known by homology comparisons from databases.
  • those of the nucleic acid sequence according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 , 39, 41, or 43 derived probes have a length of at least 20 bp, preferably at least 50 bp, more preferably at least 100 bp, most preferably at least 200 bp, most preferably at least 400 bp.
  • the probe may also be one or more kilobases long, e.g. 1 Kb, 1, 5 Kb or 3 Kb.
  • For the screening of the libraries can also be one of the under SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23 , 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 sequences complementary DNA strand, or a fragment thereof of a length between 20 bp and several kilobases.
  • DNA molecules which, under standard conditions, have the amino acids represented by SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 described and for Armadillo Repeat ARM 1 proteins encoding nucleic acid molecules that hybridize to these complementary nucleic acid molecules or parts of the above and encode as complete sequences for polypeptides substantially via the same properties, preferably functional properties, as in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 , 38, 42, 44, 60, 61 or 62 polypeptides.
  • Standard hybridization conditions is to be understood broadly and means stringent as well as less stringent hybridization conditions depending on the application. Such hybridization conditions include Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., In Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57) or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. described.
  • the conditions during the washing step can be selected from low stringency (with about 2X SSC at 50 ° C) and high stringency (with about 0.2X SSC at 50 ° C preferably at 65 ° C) (2OX SSC: 0 , 3M sodium citrate, 3M NaCl, pH 7.0).
  • the temperature may be raised from low stringency conditions at room temperature, about 22 ° C, to more stringent conditions at about 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously or individually, keeping the other parameter constant.
  • denaturing agents such as formamide or SDS may also be used. In the presence of 50% formamide, hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • Hybridization conditions may be selected, for example, from the following conditions:
  • the hybridization conditions are chosen as follows:
  • a hybridization buffer containing formamide, NaCl and PEG 6000 is chosen.
  • the presence of formamide in the hybridization buffer destabilizes double-stranded nucleic acid molecules, allowing the hybridization temperature to be lowered to 42 ° C without thereby lowering the stringency.
  • the use of salt in the hybridization buffer increases the renaturation rate of a duplex DNA, or the hybridization efficiency.
  • PEG increases the viscosity of the solution, which has a negative influence on renaturation rates, the presence of the polymer in the solution increases the concentration of the probe in the remaining medium, which increases the rate of hybridization.
  • the composition of the buffer is:
  • the hybridizations are carried out at 42 ° C overnight.
  • the filters are changed the next morning 3x with 2 ⁇ SSC + 0.1% SDS for about 10 min. washed.
  • an increase in the resistance in the process according to the invention is achieved in that
  • Gene expression and “expression” are to be used synonymously and mean the realization of the information stored in a nucleic acid molecule.
  • the reduction in the expression of a gene therefore involves the reduction of the polypeptide amount of the encoded protein, e.g. of the Armadillo-Repeat ARM 1 polypeptide or the Armadillo-Repeat ARM1 protein function.
  • Reduction of gene expression of an Armadillo-Repeat ARM1 protein gene can be accomplished in a variety of ways, for example, by one of the methods listed below.
  • Reduction is to be construed broadly in the context of an Armadillo repeat ARM1 protein or Armadillo-Repeat ARM1 protein function and includes the partial or substantially complete inhibition or blocking of functionality based on different cell biological mechanisms an Armadillo repeat ARM1 polypeptide in a plant or its derived part, tissue, organ, cells or seeds.
  • a reduction within the meaning of the invention also includes a reduction in the amount of an Armadillo-Repeat ARM1 polypeptide to a substantially complete absence of the Armadillo-Repeat ARM1 polypeptide (ie lack of detectability of Armadillo-Repeat ARM1 protein function or lack of immuno-detectability of the Armadillo Repeat ARM1 protein).
  • the expression of a particular armadillo repeat ARM1 polypeptide or the armadillo repeat ARM1 protein function in a cell or an organism is preferably increased by more than 50%, more preferably by more than 80%, most preferably by more than 90%, compared to a suitable control, ie to the wild-type of the same type, e.g. of the same genus, species, variety, cultivar, etc. ("control plant”) to which this method has not been applied, under otherwise substantially identical conditions (such as, for example, culture conditions, age of the plants, etc.).
  • a reduction in Armadillo-Repeat ARM1 protein function is achieved by employing at least one method selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecule coding for an antisense ribonucleic acid molecule which has at least a 30% homology to the non-coding strand of one of the nucleic acid molecules of the invention, for example a nucleic acid molecule according to S SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 or coding for a conse- nus sequence as shown in SEQ ID NO .: 60, 61 or 62 or comprises a fragment of at least 15 base pairs which has at least a 50% homology to a noncoding strand of a nucleic acid molecule according to the invention, for example according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 or encoding a consensus sequence as shown in SEQ ID NO: 60, 61, or 62 or a functional equivalent has the same.
  • antisense nucleic acid sequence is directed against an armadillo repeat ARM1 protein gene (ie genomic DNA sequences) or an armadillo repeat ARM1 protein gene transcript (ie RNA sequences). Also included are ⁇ -anomeric nucleic acid sequences.
  • a ribozyme which specifically contains the nucleic acid molecule according to the invention, for example according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 or encoding a consensus sequence as shown in SEQ ID NO .: 60, 61, or 62, or ribonucleic acid molecules encoded by their functional equivalents, eg, catalytically , or an expression cassette ensuring its expression.
  • nucleic acid molecules coding for sense ribonucleic acid molecules of a polypeptide according to the invention for example according to the sequences SEQ ID SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 for polypeptides having at least a 40% homology to the amino acid sequence of a subject invention
  • ARM1 proteins encoding genes to produce a loss of function e.g., generation of stop codons, in-frame shifts, etc.
  • any one of these methods may cause a reduction in Armadillo-Repeat ARM1 protein expression or Armadillo-Repeat ARM1 protein function within the meaning of the invention. Even a combined application is conceivable. Further methods are known to the person skilled in the art and can hinder or prevent the processing of the Armadillo-Repeat ARM1 polypeptide, the transport of the Armadillo repeat ARM1 polypeptide or its mRNA, inhibition of ribosome attachment, inhibition of RNA splicing, induction of an Armadillo repeat ARM 1 Protein RNA degrading enzyme and / or inhibiting translation elongation or termination. Reduction in armadillo repeat ARM1 protein function or polypeptide level is preferably achieved by decreased expression of an endogenous armadillo repeat ARM1 protein gene.
  • dsRNAi double stranded RNA interference
  • dsRNAi methods are based on the phenomenon that the simultaneous introduction of complementary strand and counterstrand of a gene transcripts a highly efficient suppression of the expression of the gene concerned is effected.
  • the phenotype produced is very close to that of a corresponding knock-out mutant (Waterhouse PM et al. (1998) Proc. Natl Acad., USA 95: 13959-64).
  • the dsRNAi method has proven to be particularly efficient and advantageous in reducing protein expression (WO 99/32619).
  • Armadillo-Repeat ARM1 protein nucleic acid sequence preferably means one of the sequences according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 or coding for a consensus sequence as shown in SEQ ID NO .: 60, 61, or 62, or sequences identical thereto in the Substantially identical, preferably at least 50%, 60%, 70%, 80% or 90% or more, for example about 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more, or fragments thereof, at least 17 base pairs long are.
  • the homology as defined above is at least 50%, for example, about 80%, or about 90%, or about 100% between the "sense" strand of an inhibitory dsRNA and a portion of an Armadillo-Repeat ARM1 protein nucleic acid sequence. between the "antisense" strand and the complementary strand of an Armadillo repeat ARM1 protein nucleic acid sequence).
  • the length of the subsection is about 17 bases or more, for example about 25 bases, or about 50 Bases, about 100 bases, about 200 bases or about 300 bases.
  • a "substantially identical" dsRNA may also be defined as a nucleic acid sequence capable of hybridizing to a portion of an Armadillo repeat ARM1 protein gene transcript under stringent conditions.
  • the "antisense" RNA strand may have insertions, deletions as well as single point mutations compared to the complement of the "sense” RNA strand.
  • the homology is at least 80%, for example, about 90%, or about 95%, or about 100% between the "antisense” RNA strand and the complement of the "sense” RNA strand.
  • the fragments preferably have a sequence length of about 20 bases or more, for example about 50 bases, or about 100 bases, or about 200 bases, or about 500 bases. Also included is the complete transcribed RNA or mRNA.
  • the dsRNA may consist of one or more strands of polymerized ribonucleotides.
  • modifications to both the sugar-phosphate backbone and the nucleosides may also be modifications to both the sugar-phosphate backbone and the nucleosides.
  • the phosphodiester bonds of the natural RNA may be modified to include at least one nitrogen or sulfur heteroatom.
  • Bases can be modified to limit the activity of, for example, adenosine deaminase. Such and other modifications are described below in the methods for stabilizing antisense RNA.
  • dsRNA molecules each comprising one of the ribonucleotide sequence portions defined above, may also be introduced into the cell or organism.
  • the dsRNA can be prepared enzymatically or in whole or in part chemically-synthetically.
  • the formation of the RNA duplex can be initiated either outside the cell or within it.
  • the dsRNA may also comprise a hairpin structure by joining "sense” and "antisense” strands through a "linker” (for example, an intron).
  • linker for example, an intron.
  • the self-complementary dsRNA structures are preferred because they only require the expression of a construct and always comprise the complementary strands in an equimolar ratio.
  • the expression cassettes coding for the "antisense” or “sense” strand of a dsRNA or for the self-complementary strand of the dsRNA are preferably inserted into a vector and stably (for example using selection markers) into the vector by the methods described below Genome of a plant inserted to ensure a permanent expression of the dsRNA.
  • the dsRNA can be introduced using an amount that allows at least one copy per cell. Higher levels (e.g., at least 5, 10, 100, 500, or 1000 copies per cell) may provide more efficient reduction, if desired.
  • the dsRNA preferably comprises sequence regions of Armadillo repeat ARM1 protein gene transcripts which correspond to conserved regions. Said conserved regions can be easily derived from sequence comparisons, e.g. As shown in Fiquren.
  • dsRNA sequences are derived from the conserved regions of the consensus sequence indicated in the figures. Particularly conserved ranges are: AA702 to AA739, AA742 to AA752, AA760 to AA762, AA771 to 779, AA789 to AA790, AA799 to AA821, AA829 to AA843, AA879 to AA905, AA924 to AA939 of the consensus sequence shown in the figures.
  • a dsRNA can be synthesized chemically or enzymatically.
  • cellular RNA polymerases or bacteriophage RNA polymerases such as T3, T7 or SP6 RNA polymerase
  • a dsRNA synthesized chemically or enzymatically in vitro can be completely or partially purified from the reaction mixture before introduction into a cell, tissue or organism, for example by extraction, precipitation, electrophoresis, chromatography or combinations of these methods.
  • the dsRNA can be introduced directly into the cell or it can also be applied extracellularly (for example in the interstitial space).
  • the plant is preferably stably transformed with an expression construct which implements the expression of the dsRNA. Corresponding methods are described below.
  • the hybrids Disruption can occur in a conventional manner via the formation of a stable duplex or, in the case of genomic DNA, by binding of the antisense nucleic acid molecule with the duplex of the genomic DNA by specific interaction in the major groove of the DNA helix.
  • An antisense nucleic acid molecule suitable for reducing an armadillo repeat ARM1 polypeptide can be prepared by using the nucleic acid sequence coding for this polypeptide, for example the nucleic acid molecule according to the invention according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43, or a nucleic acid molecule encoding a functional equivalent thereof, according to the Watson and Crick base pairing rules.
  • the antisense nucleic acid molecule may be complementary to the entire transcribed mRNA of said polypeptide, confined to the coding region or consist of only one oligonucleotide complementary to a portion of the mRNA coding or non-coding sequence.
  • the oligonucleotide may be complementary to the region comprising translation initiation for said polypeptide.
  • Antisense nucleic acid molecules may have a length of, for example, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 nucleotides, but may be longer and comprise 100, 200, 500, 1000, 2000 or 5000 nucleotides.
  • Antisense nucleic acid molecules can be expressed recombinantly or synthesized chemically or enzymatically using methods known to those skilled in the art. In the chemical synthesis, natural or modified nucleotides can be used.
  • Modified nucleotides may impart increased biochemical stability to the antisense nucleic acid molecule and result in increased physical stability of the duplex formed from antisense nucleic acid sequence and sense target sequence.
  • phosphorothioate derivatives and acridine-substituted nucleotides such as 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-lodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2- can be used.
  • thiouridine 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, ⁇ -D-galactosylqueosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methyl-guanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylamino-methyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, ⁇ -D-mannosyl queosine, 5'-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenine, Uracil-5-oxyacetic acid, pseudouracil, quinines, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyacetic acid
  • an armadillo repeat ARM1 polypeptide can be inhibited by nucleic acid molecules which are complementary to a conserved (for example as described above) or a regulatory An armadillo repeat ARM1 protein gene (eg, an armadillo repeat ARM1 protein promoter and / or enhancer) and form triple helical structures with the local DNA double helix, so that the transcription of the armadillo repeat ARM1 protein gene is reduced.
  • a conserved for example as described above
  • An armadillo repeat ARM1 protein gene eg, an armadillo repeat ARM1 protein promoter and / or enhancer
  • Corresponding methods are described (Helene C (1991) Anticancer Drug Res 6 (6): 569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sci 660: 27-36; Mower LJ (1992) Bioassays 14 (1992); 12): 807-815).
  • the antisense nucleic acid molecule may be an ⁇ -anomeric nucleic acid.
  • ⁇ -anomeric nucleic acid molecules form specific double-stranded hybrids with complementary RNA in which - in contrast to the conventional ⁇ -nucleic acids - the two strands run parallel to one another (Gautier C et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6625-6641).
  • the antisense nucleic acid molecule may further include 2'-O-methylribonucleotides (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6131-6148) or chimeric RNA-DNA analogs (Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215: 327- 330).
  • Catalytic RNA molecules or ribozymes can be adapted to any target RNA and cleave the phosphodiester scaffold at specific positions, thereby functionally deactivating the target RNA (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23 (3): 257) -275).
  • the ribozyme is not thereby modified itself, but is able to analogously cleave further target RNA molecules, thereby obtaining the properties of an enzyme.
  • ribozymes eg headammerhead "ribozymes, Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591
  • ribozymes can be used to cleave the mRNA of an enzyme to be suppressed-for example, callose synthases-and to prevent translation
  • Methods for the expression of ribozymes for the reduction of certain polypeptides are described (in EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257).
  • ribozyme expression has also been described (Steinecke P et al (1992) EM - BO J 11 (4): 1525-1530; de Feyter R et al. (1996) Mol Gen Gen.
  • Ribozymes can be identified via a selection process from a library of diverse ribozymes (Bartel D and Szostak JW (1993) Science 261: 141 1-1418).
  • the binding regions of the ribozyme hybridize to the conserved regions of the ARM protein as described above.
  • ribozyme technology can increase the efficiency of an antisense strategy.
  • Suitable target sequences and ribozymes can be prepared, for example, by secondary structure calculations as described in "Steinecke P, Riobzymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al., Eds, Academic Press, Inc. (1995), pp. 449-460" of ribozyme and target RNA and their interaction (Bayley CC et al (1992) Plant Mol Biol. 18 (2): 353-361; Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol Gen Genet. 242 (6): 653-657).
  • Tetrahymena L-19 IVS RNA can be constructed which have complementary regions to the mRNA of the Armadillo Repeat ARM1 protein to be suppressed (see also US 4,987,071 and US 5,116,742).
  • the introduced construct can represent the homologous gene to be diminished completely or only partially. The possibility for translation is not required. The application of this technology to plants is described, for example, in Napoli et al. (1990) The Plant Cell 2: 279-289 and in US 5,034,323.
  • Cosuppression is preferably realized using a sequence which is essentially identical to at least part of the nucleic acid sequence coding for an Armadillo repeat ARM1 protein or a functional equivalent thereof, for example the nucleic acid molecule according to the invention, for example the nucleic acid sequence according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 or the nucleic acid sequence encoding a functional equivalent thereof.
  • Reduction of the activity of an Armadillo-Repeat ARM1 protein may also be realized by expression of a dominant-negative variant of this Armadillo-Repeat ARM1 protein.
  • Methods for reducing the function or activity of a polypeptide by means of coexpression of its dominant-negative form are known to the person skilled in the art (Lagna G and Hemmati-Brivanlou A (1998) Current Topics in Developmental Biology 36: 75-98; Perlmutter RM and Alberola Ila J (1996) Current Opinion in Immunology 8 (2): 285-90; Sheppard D (1994) American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology. 1 1 (1): 1-6; Herskowitz I (1987) Nature 329 (6136): 219-22).
  • a dominant-negative armadillo-repeat ARM1 protein variant can be made by altering amino acid residues that are part of the armadillo repeat ARM1 and, as a result of their mutation, the polypeptide loses its function.
  • Preferred amino acid residues to be mutated are those conserved in the Armadillo repeat ARM1 proteins of various organisms. Such conserved regions can be determined, for example, by means of computer-aided comparison ("alignment").
  • These mutations to achieve a dominant-negative Armadillo-Repeat ARM1 protein variant are preferably carried out at the level of the nucleic acid sequence coding for Armadillo-Repeat ARM1 proteins.
  • a corresponding mutation can be realized, for example, by PCR-mediated in vitro mutagenesis using corresponding oligonucleotide primers, by means of which the desired mutation is introduced.
  • methods familiar to the person skilled in the art are used.
  • the "LA PCR in vitro Mutagenesis Kit” (Takara Shuzo, Kyoto) can be used for this purpose.
  • Armadillo-Repeat ARM1 protein / gene expression is also possible with specific DNA-binding factors eg with factors of the type of zinc finger transcription factors. These factors attach to the genomic sequence of the endogenous target gene, preferably in the regulatory regions, and cause repression of the endogenous gene.
  • the use of such a method makes it possible to reduce the expression of an endogenous Armadillo repeat ARM1 protein gene, without having to genetically manipulate its sequence.
  • Corresponding methods for preparing such factors are described (Dreier B et al. (2001) J Biol Chem 276 (31): 29466-78; Dreier B et al.
  • armadillo repeat ARM1 protein gene This section is preferably in the region of the promoter region. For gene suppression, however, it can also be in the area of coding exons or introns.
  • the corresponding sections are available to the person skilled in the art by means of a database query from the gene bank or, starting from an Armadillo repeat ARM1 protein cDNA whose gene is not present in the gene bank, by screening a genomic library for corresponding genomic clones. The necessary procedures are familiar to the person skilled in the art.
  • the polypeptide binding factors can be e.g. Aptamers (Famulok M and Mayer G (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243: 123-36) or antibodies or antibody fragments. The recovery of these factors is described and known to those skilled in the art.
  • cytoplasmic scFv antibody has been used to modulate the activity of the phytochrome A protein in genetically engineered tobacco plants (Owen M et al., (1992) Biotechnology (NY) 10 (7): 790-794, Franken E et (1997) Curr Opin Biotechnol 8 (4): 41 1-416, Whitelam (1996) Trend Plant Se 1: 286-272).
  • Gene expression can also be suppressed by tailored, low molecular weight synthetic compounds, for example of the polyamide type (Dervan PB and Bürli RW (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3: 688-693; Gottesfeld JM et al. (2000) Gene Expr 9 (1-2): 77-91).
  • These oligomers consist of the building blocks 3- (dimethylamino) propylamine, N-methyl-3-hydroxypyrrole, N-methylimidazole and N-methylpyrroles and can be adapted to any piece of double-stranded DNA to bind sequence-specifically to the major groove and expression block the gene sequences there.
  • Corresponding methods have been described (see, inter alia, Bremer RE et al (2001) Bioorg Med Chem.
  • Armadillo repeat ARM1 protein expression can also be effectively induced by induction of the specific armadillo repeat ARM1 protein RNA degradation by the plant by means of a viral expression system (amplicon) (Angell, SM et al. (1999) Plant J. 20 (3) : 357-362).
  • amplicon Angell, SM et al. (1999) Plant J. 20 (3) : 357-362).
  • VIPGS viral induced gene silencing
  • dsRNAi the cosuppression by means of sense RNA and the "VIGS" ("virus-induced gene silencing") are also referred to as “post-transcriptional gene silencing” (PTGS).
  • PTGS methods are particularly advantageous because the requirements for homology between the endogenous gene to be suppressed and the transgenically expressed sense or dsRNA nucleic acid sequence are lower than, for example, in a classical antisense approach.
  • Corresponding homology criteria are mentioned in the description of the dsRNAI method and are generally applicable to PTGS methods or dominant-negative approaches.
  • nucleic acid construct suitable for inducing homologous recombination to genes encoding armadillo repeat ARM1 proteins - for example for the generation of knockout mutants.
  • nucleic acid construct which contains at least part of an endogenous armadillo repeat ARM1 protein gene which has been deleted, added or substituted by at least one Nucleotides - for example, in the preserved regions - is changed so that the functionality is reduced or eliminated altogether.
  • the primary, secondary, tertiary, or quaternary structure can be disturbed, for example, such that the binding ability of one or more armadillo repeats no longer exists.
  • a disorder can be effected, for example, by the mutation of one or more residues which are marked as conserved or highly conserved in the consensus sequence.
  • the alteration may also involve the regulatory elements (e.g., the promoter) of the gene such that the coding sequence remains unaltered but expression (transcription and / or translation) is omitted and diminished.
  • the regulatory elements e.g., the promoter
  • the altered region is flanked at its 5 'and 3' ends by additional nucleic acid sequences which must be of sufficient length to allow recombination.
  • the length is typically in the range of several hundred or more bases to several kilobases (Thomas KR and Capecchi MR (1987) Cell 51: 503; Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad. 4368-4373).
  • the host organism - for example a plant - is transformed with the recombination construct using the methods described below, and successfully recombined clones are selected using, for example, antibiotic or herbicide resistance.
  • Suitable methods for reducing the Armadillo-Repeat ARM1 protein function are the introduction of nonsense mutations into endogenous Armadillo-Repeat ARM1 protein genes, for example by generating knockout mutants with the aid of eg T-DNA mutagenesis (Koncz et al. (1992) Plant Mol Biol 20 (5): 963-976), ENU- (N-ethyl-N-nitrosourea) mutagenesis or homoge- neous recombination (Hohn B and Puchta (1999) H Proc Natl Acad Sci USA 96: 8321- 8323) or EMS mutagenesis (Birchler JA, Schwartz D.
  • Point mutations can also be generated using DNA-RNA hybrid oligonucleotides, also known as "chimeraplasty” (Zhu et al., (2000) Nat Biotechnol 18 (5): 555-558, Cole-Strauss et al., (1999) Nucl Acids Res 27 (5): 1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87 (3): 240-247).
  • the cell- or tissue-specific reduction of the activity of a sARM1 can be carried out, for example, by expressing a corresponding construct which, for example, an abovementioned nucleic acid molecule, eg the antisense RNA, dsRNA, RNAi, ribozyme, with a suitable tissue-specific promoter, for example, a promoter as described herein as specific for epidermis or mesophyll.
  • a tissue-specific promoter for example, a promoter as described herein as specific for epidermis or mesophyll.
  • “Mutations” in the sense of the present invention means the alteration of the nucleic acid sequence of a gene variant in a plasmid or in the genome of an organism Mutations can arise eg as a consequence of errors in the replication or caused by mutagens Organisms are very low, but a variety of biological, chemical or physical mutagens are known to those skilled in the art.
  • Mutations include substitutions, additions, deletions of one or more nucleic acid residues. Substitutions are understood to mean the exchange of individual nucleic acid bases, a distinction being made between transitions (substitution of a purine for a purine base or a pyrimidine for a pyrimidine base) and transversions (substitution of a purine for a pyrimidine base (or vice versa).
  • Addition or insertion means the incorporation of additional nucleic acid residues into the DNA, which may lead to shifts in the reading frame.
  • frameshifting distinguishes between "in frame” insertions / additions and “out of frame” insertions.
  • in-frame insertions / additions the reading frame is retained and a polypeptide increased by the number of amino acids encoded by the inserted nucleic acids is formed.
  • out of frame insertions / additions the original reading frame is lost and the formation of a complete and functional polypeptide is in many cases, of course, depending on the location of the mutation, no longer possible.
  • Deletions describe the loss of one or more base pairs, which also result in "in frame” or “out of frame” shifts of the reading frame and the consequent consequences on the formation of an intact protein.
  • mutagenic agents that can be used to generate random or targeted mutations and the methods and techniques that can be used are
  • Chemical mutagens can be subdivided according to their mechanism of action.
  • base analogues eg 5-bromouracil, 2-aminopurine
  • monofunctional and bifunctional alkylating agents eg monofunctional such as ethyl methyl sulfonate, dimethyl sulfate or bifunctional such as dichloroethyl sulfite, mitomycin, nitrosoguanidine dialkylnitrosamine, N-nitrosoguanidine derivatives
  • intercalating agents eg acridine, ethidium bromide.
  • Ionizing radiations are electromagnetic waves or particle radiations capable of ionizing molecules, i. to remove from these electrons. The remaining ions are usually very reactive, so that if they arise in living tissue, they can cause great damage, for example to the DNA and (at low intensity) thereby induce mutations.
  • Ionizing radiations are e.g. Gamma radiation (photon energy of about one megaelectron volt MeV), X-rays (photon energy of several or many kiloelectron volts keV) or ultraviolet light (UV light, photon energy of more than 3.1 eV). UV light causes the formation of dimers between bases, the most common being thymidine dimers, which give rise to mutations.
  • EMS Ethyl methyl sulfonate
  • ionizing Radiation is by the use of biological mutagens eg Transposons (eg Tn5, Tn903, Tn916, Tn1000, Balcells et al., 1991, May BP et al. (2003) Proc Natl Acad.
  • polypeptides for the process according to the invention which are obtained as a result of a mutation of a polypeptide according to the invention, e.g. according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 receives.
  • anti-armadillo repeat ARM1 protein compounds All substances and compounds which directly or indirectly bring about a reduction in the polypeptide amount, RNA amount, gene activity or polypeptide activity of an Armadillo repeat ARM1 protein are summarized in this application under the name "anti-armadillo repeat ARM1 protein compounds".
  • anti-armadillo repeat ARM1 protein compound explicitly includes the nucleic acid sequences, peptides, proteins or other factors used in the above-described methods.
  • an increase in the resistance to pathogens from the families of Blumeriaceae, Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae and Hypocreaceae in a monocotyledonous or dicotyledonous plant, or an organ, tissue or a cell thereof, is achieved by:
  • transgene is meant, for example, with respect to a nucleic acid sequence, an expression cassette or a vector containing said nucleic acid sequence or an organism transformed with said nucleic acid sequence, expression cassette or vector, all such genetically engineered constructions or organisms in which either
  • Natural genetic environment means the natural chromosomal locus in the lineage or the presence in a genomic library. In the case of a genomic library, the natural, genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, particularly preferably at least 1000 bp, very particularly preferably at least 5000 bp.
  • a naturally occurring expression cassette for example, the naturally occurring combination of the Armadillo repeat ARM1 protein promoter with the corresponding Armadillo repeat ARM1 protein gene - becomes a transgenic expression cassette when expressed by non-natural, synthetic ("artificial") methods such as For example, a mutagenization is changed.
  • non-natural, synthetic synthetic
  • Delivery in the context of the invention includes all methods which are suitable for introducing or adding an "anti-Armadillo Repeat ARM1 Protein Compound", directly or indirectly, into a plant or cell, compartment, tissue, organ or semen to generate. Direct and indirect procedures are included. The introduction can lead to a transient presence of an "anti-armadillo repeat ARM1 protein compound” (for example a dsRNA) or else to a permanent (stable) one.
  • an anti-armadillo repeat ARM1 protein compound for example a dsRNA
  • the "anti-armadillo-repeat ARM1 protein compound” can exert its function directly (for example, by insertion into an endogenous armadillo repeat ARM1 protein gene).
  • the function can also be carried out indirectly after transcription into an RNA (for example in the case of antisense approaches) or after transcription and translation into a protein (for example in binding factors). Both direct and indirect "anti-callose synthase compounds" are included in the invention.
  • “Introduction” in the context of the present description generally includes, for example, methods such as transfection, transduction or transformation.
  • anti-armadillo repeat ARM1 compound also comprises recombinant expression constructs which "antisense” an expression (ie transcription and, if appropriate, translation) of, for example, an armadillo repeat ARM1 protein dsRNA or an armadillo repeat ARM1 protein.
  • RNA - preferably in a plant or a part, tissue, organ or seeds thereof - condition.
  • Said expression constructs / expression cassettes contain a nucleic acid molecule whose expression (transcription and possibly translation) generates an "anti-armadillo-repeat ARM1 protein compound", preferably in functional linkage with at least one genetic control element (for example a promoter) which expresses guaranteed in plants.
  • the expression construct is to be introduced directly into the plant and the "anti-armadillo repeat ARM1 protein compound" (for example the Armadillo repeat ARM1 protein dsRNA) is generated there in planta
  • plant-specific genetic control elements for example promoters
  • the "anti-armadillo repeat ARM1 protein compound” can also be produced in other organisms or in vitro and then introduced into the plant. All prokaryotic or eukaryotic genetic control elements (for example promoters) which permit expression in the particular plant chosen for the production are preferred in this.
  • a “functional” link is meant, for example, the sequential arrangement of a promoter with the nucleic acid sequence to be expressed (for example, an "anti-armadillo repeat ARM1 protein compound") and optionally further regulatory elements such as a terminator such that each of the Regulatory (or regulatory) elements may fulfill their function in the transgenic expression of the nucleic acid sequence, depending on the arrangement of the nucleic acid sequences to sense or antisense RNA.This does not necessarily require a direct linkage in the chemical sense.
  • Geneetic control sequences, such as Enhancer sequences may also perform their function from more distant positions or even from other DNA molecules on the target sequence, Preferred arrangements are those in which the nucleic acid sequence to be transgenically expressed is positioned behind the promoter sequence, so that both sequences are covalent With are connected to each other.
  • the distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is preferably less than 200 base pairs, more preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.
  • sequences can be positio- ned.
  • insertion of sequences may result in the expression of fusion proteins.
  • the expression cassette consisting of a linkage of promoter and nucleic acid sequence to be expressed, can be integrated in a vector and inserted by, for example, transformation into a plant genome.
  • an element for example an "anti-armadillo-repeat ARM1 protein compound” (for example a nucleic acid sequence coding for an armadillo repeat ARM1 protein dsRNA or an armadillo repeat ARM1 protein antisense RNA) can be placed behind an endogenous promoter be that the same effect occurs. Both approaches lead to expression cassettes in the context of the invention.
  • Plant-specific promoters basically means any promoter that can control the expression of genes, especially foreign genes, in plants or plant parts, cells, tissues, cultures.
  • the expression may be, for example, constitutive, inducible or developmentally dependent.
  • Preferred promoters are:
  • Promoters which ensure expression in numerous, preferably all, tissues over a longer period of plant development, preferably at all times in plant development.
  • a plant promoter or a promoter derived from a plant virus is particularly preferred.
  • the promoter of the 35S transcript of CaMV cauliflower mosaic virus (Franck et al., (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Shewmaker et al. 1985 Virology 140: 281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6: 221-228) or the 19S CaMV promoter (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al.
  • Another suitable constitutive promoter is the "Rubisco small subunit (SSU)" promoter (US Pat. No. 4,962,028), the Agrobacterium nopaline synthase promoter, the TR double promoter, the Agrobacterium OCS (octopine synthase) promoter, the ubiquitin promoter (US Pat. Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-649), the ubiquitin 1 promoter (Christensen et al., (1992) Plant Mol Biol 18: 675-689, Bruce et al.
  • SSU Rostorf S et al.
  • nitrilase-1 nit1 gene from A. thalia (GenBank Acc. No .: Y07648.2, nucleotides 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170: 197 -200).
  • promoters having specificity for anthers, ovaries, flowers, leaves, stems, roots or seeds are used.
  • Seed-specific promoters such as the promoter of phaseolin (US 5,504,200, Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9): 839-53), 2S albumining (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), the legume (Shirsat A et al., (1989) Mol Gen Genet 215 (2): 326-331), the USP (unknown seed protein, Baumlein H et al., (1991) Mol Gen Genet 225 (3 ): 459-67), the napin gene (US 5,608,152, Stalberg K et al.
  • phaseolin US 5,504,200, Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9): 839-53
  • 2S albumining Jaseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201
  • the legume Shirsat A et al., (1989) Mol Gen Gene
  • seed-specific promoters are those of the genes coding for high molecular weight glutenin (HMWG), gliadin, branching enzyme, ADPglucose pyrophosphatase (AGPase) or starch synthase. Also preferred are promoters which allow seed-specific expression in monocotyledons such as corn, barley, wheat, rye, rice, etc.
  • HMWG high molecular weight glutenin
  • AGPase ADPglucose pyrophosphatase
  • starch synthase starch synthase.
  • promoters which allow seed-specific expression in monocotyledons such as corn, barley, wheat, rye, rice, etc.
  • the promoter of the lpt2 or lpt1 gene (WO 95/15389, WO 95/23230) or the promoters described in WO 99/16890 (promoters of the hordein gene, the glutelin gene, the oryzine gene, of the Prolamin gene, the gliadin gene, the zein gene, the kasirin gene or the secalin gene).
  • Tuber, storage-root or root-specific promoters such as the patatin promoter class I (B33), and the promoter of the cathepsin D inhibitor from potato.
  • Leaf-specific promoters such as the potato cytosolic FBPase promoter (WO 97/05900), the Rubisco (ribulose-1, 5-bis-phosphate carboxylase) SSU promoter (small subunit) or the potato ST-LSI promoter (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8: 2445-2451).
  • Epidermis-specific promoters such as the promoter of the OXLP gene ("oxalate oxidase like protein"; Wei et al. (1998) Plant Mol. Biol. 36: 101-112).
  • tissue-specific promoters are, for example:
  • Flower specific promoters such as the phytoene synthase promoter (WO 92/16635) or the promoter of the P-rr gene (WO 98/22593).
  • Anther-specific promoters such as the 5126 promoter (US 5,689,049, US 5,689,051), the globbl promoter and the fa
  • the expression cassettes may also contain a chemically inducible promoter (reviewed in Gatz et al., (1997) Annu., Rev. Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89-108), which expresses the expression of the exogenous gene in the plant Timing can be controlled.
  • a chemically inducible promoter as e.g. the PRP1 promoter (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a benzenesulfonamide-inducible promoter (EP 0 388 186), a tetracycline inducible promoter (Gatz et al.
  • a scisinic acid-inducible promoter (EP 0 335 528) or an ethanol- or cyclohexanone-inducible promoter (WO 93/21334) may also be used become.
  • an Armadillo Repeat ARM1 protein function reducing or inhibiting molecule such as e.g. the above enumerated dsRNA, ribozymes, antisense nucleic acid molecules, etc. are induced at appropriate times.
  • RNAi constructs used to reduce the callose synthase polypeptide amount, activity or function, which, for example when using pathogen-inducible promoters, allows expression only in case of need (ie pathogen attack) ,
  • promoters which are active in plants and which are pathogen-inducible promoters are used in plants.
  • Pathogen-inducible promoters include the promoters of genes induced by pathogen attack, such as genes of PR proteins, SAR proteins, ⁇ -1,3-glucanase, chitinase, etc. (for example, Redolfi et al., (1983) Neth J Plant Pathol 89: 245-254; Uknes, et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4: 11 1-1 16; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9: 335-342; Matton et al.
  • wound inducible promoters such as the pinll gene (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28: 425-449, Duan et al (1996) Nat Biotech 14: 494-498), the WUN1 and WUN2 genes (US 5,428,148), the win1 and win2 genes (Stanford et al., (1989) Mol Gen Genet 215: 200-208), the systemin (McGurl et al., (1992) Science 225: 1570-1573), the WIP1 gene (Rohmeier et al., (1993) Plant Mol Biol 22: 783-792, Eckelkamp et al (1993) FEBS Letters 323: 73-76), the MPI gene (Corderok et al., (1994) Plant J 6 (2 ): 141-150) and the like.
  • the pinll gene Rost al., (1990) Ann Rev Phytopath 28: 425-449, Duan et al (1996) Nat Biotech 14: 4
  • a source of further pathogen-inducible promoters is the PR gene family.
  • a number of elements in these promoters have proven to be advantageous.
  • region -364 to -288 in the promoter of PR-2d mediates salicylate specificity (Buchel et al. (1996) Plant Mol Biol 30, 493-504).
  • the sequence 5'-TCATCTTCTT-3 'appears repeatedly in the promoter of the barley ß-1, 3-glucanase and in more than 30 other stress-induced genes. This region binds to tobacco a nuclear protein whose abundance is increased by salicylate.
  • the PR-1 promoters from tobacco and Arabidopsis are likewise suitable as pathogen-inducible promoters.
  • the "aeidie P /? 5" (aPR5) promoters are from barley (Schweizer et al. (1997) Plant Physiol 1 14: 79-88) and wheat (Rebmann et (1991) Plant Mol Biol 16: 329-331). aPR5 proteins accumulate in about 4 to 6 hours after pathogen attack and show only a very low background expression (WO 99/66057).
  • pathogen-induced specificity is the production of synthetic promoters from combinations of known pathogen-responsive elements (Rushton et al. (2002) Plant Cell 14, 749-762; WO 00/01830; 99/66057). Further pathogen-inducible promoters of various types are known to the person skilled in the art (EP-A 1 165 794, EP-A 1 062 356, EP-A 1 041 148, EP-A 1 032 684).
  • pathogen-inducible promoters include the flax Fis / promoter (WO 96/34949), the Vst1 promoter (Schubert et al. (1997) Plant Mol Biol 34: 417-426) and the tobacco EAS4 sesquiterpene cyclase promoter (US 6,100,451).
  • promoters which are induced by biotic or abiotic stress for example the pathogen-inducible promoter of the PRP1 gene (or gst1 promoter), for example from potato (WO 96/28561, Ward et al., (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), the heat-inducible hsp70 or hsp80 promoter from tomato (US 5,187,267), the cold-inducing alpha-amylase promoter from the potato
  • mesophyll tissue-specific promoters such as, for example, the promoter of the wheat germ 9f-3.8 gene (GenBank Acc. No .: M63224) or the barley GerA promoter (WO 02/057412) are used. Said promoters are particularly advantageous since they are both medley-specific and pathogen-inducible. Also suitable is the mesophyll tissue-specific Arabidopsis CAB-2 promoter (GenBank Acc. No .: X15222), and the Zea mays PPCZmI promoter (GenBank Acc. No .: X63869) or homologs thereof.
  • Mesophyll tissue-specific means a restriction of the transcription of a gene caused by the specific interaction of cis elements present in the promoter sequence and transcription factors binding thereto to as few mesophyll tissue-containing plant tissues as possible, preferably a transcription restricted to the mesophyll tissue.
  • suitable promoters are, for example, fruiting-specific promoters, such as, for example, the fruit maturation-specific promoter from tomato (WO 94/21794, EP 409 625).
  • Fruiting-specific promoters such as, for example, the fruit maturation-specific promoter from tomato (WO 94/21794, EP 409 625).
  • “Development-dependent promoters” includes in part the tissue-specific promoters, since the formation of individual tissues is naturally development-dependent.
  • promoters may be functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which may be expressed in further plant tissues or in other organisms, such as E.c ⁇ // allow bacteria.
  • E.c ⁇ any promoters described above are suitable as plant promoters.
  • the nucleic acid sequences contained in the expression cassettes or vectors according to the invention can be functionally linked to further genetic control sequences in addition to a promoter.
  • the term "genetic control sequences" is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the production or the function of the expression cassette according to the invention. Genetic control sequences, for example, modify transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the expression cassettes according to the invention 5'-upstream of the respective transgenic nucleic acid sequence comprise a promoter with one of the specificity described above and 3'-downstream terminator sequence as additional genetic control sequence, and optionally further conventional regulatory elements, in each case functionally linked to the transgenic nucleic acid sequence to be expressed.
  • Genetic control sequences also include other promoters, promoter elements or minimal promoters that can modify the expression-controlling properties.
  • the tissue-specific expression can be additionally dependent on certain stress factors.
  • Corresponding elements are, for example, water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH J Biol Chem 1991, 266 (26): 17131-17135) and heat stress (Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217 (2-3): 246-53, 1989).
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated regions, introns or non-coding 3' regions of genes such as the actin-1 intron, or the adh1-s introns 1, 2 and 6 (commonly: The Maize Handbook, Chapter 1 16, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). These have been shown to play a significant role in the regulation of gene expression. It has been shown that 5'-untranslated sequences can enhance the transient expression of heterologous genes.
  • An example of translational amplifiers is the 5 'leader sequence from the tobacco mosaic virus (GaIMe et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) and the like. They may also promote tissue specificity (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440).
  • the expression cassette may advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which allow increased transgenic expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences can also be inserted at the 3 'end of the nucleic acid sequences to be expressed transgenically, such as further regulatory elements or terminators.
  • the transgenic nucleic acid sequences to be expressed may be contained in one or more copies in the gene construct.
  • Polyadenylation signals which are suitable as control sequences are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of the T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835 ff) or functional equivalents thereof.
  • particularly suitable terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopaline synthase) terminator.
  • Control sequences are furthermore to be understood as meaning those which permit homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or permit removal from the genome.
  • the natural promoter of a particular gene may be replaced with a promoter having specificity for the embryonic epidermis and / or the flower.
  • an expression cassette and the vectors derived from it may contain further functional elements.
  • the term functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, multiplication or function of the expression cassettes, vectors or transgenic organisms according to the invention.
  • functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, multiplication or function of the expression cassettes, vectors or transgenic organisms according to the invention.
  • Selection markers which confer resistance to a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456), antibiotics or biocides, preferably herbicides such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin etc.
  • herbicides such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin etc.
  • Particularly preferred selection markers are those which confer resistance to herbicides.
  • DNA sequences which encode phosphinothricin (PAT) and inactivate glutamin synthase inhibitors bar and pat genes
  • PAT phosphinothricin
  • EPP synthase genes 5-Enolpyruvyl- shikimate-3-phosphate
  • glyphosate ® N- ( phosphonomethyl) glycine
  • the glyphosate-degrading enzymes encoding ® gox gene glyphosate oxidoreductase
  • the deh gene encoding a dehalogenase which inactivates dalapon
  • sulfonylurea- and Imidazolinone inactivating acetolactate synthases and bxn genes encoding bromoxynil degrading nitrilase enzymes
  • the aasa gene conferring resistance to the antibiotic apectinomycin
  • streptomycin phosphotransferase (SPT) gene conferring resistance to strept
  • HPT hygromycin phosphotransferase
  • ALS acetolactate synthase gene
  • Reporter genes which code for easily quantifiable proteins and ensure an evaluation of the transformation efficiency or of the expression site or time point via intrinsic color or enzyme activity. Reporter proteins (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol 1999, 13 (1): 29-44) such as the "green fluorescence protein” (GFP) (Sheen et al. (1995) Plant
  • Replication origins that ensure an increase of the expression cassettes or vectors according to the invention in, for example, E. coli.
  • examples include ORI (origin of DNA replication), pBR322 ori or P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 ⁇ d Ed., Colard Spring Harbor Laboratory Press, ColD Spring Harbor, NY, 1989).
  • a selectable marker that successfully transforms Cells confers resistance to a biocide (for example a herbicide), a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or an antibiotic.
  • a biocide for example a herbicide
  • a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or an antibiotic.
  • the selection marker allows the selection of the transformed cells from untransformed (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
  • an expression cassette according to the invention into an organism or cells, tissues, organs, parts or seeds thereof (preferably in plants or plant cells, tissues, organs, parts or seeds) can advantageously be realized using vectors in which the Expression cassettes are contained.
  • the expression cassette can be introduced into the vector (for example a plasmid) via a suitable restriction site.
  • the resulting plasmid is first introduced into E. coli. Correctly transformed E. coli are selected, grown and recovered the recombinant plasmid by methods familiar to those skilled in the art. Restriction analysis and sequencing may serve to verify the cloning step.
  • Vectors may be, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses or else agrobacteria.
  • the introduction of the expression cassette is realized by means of plasmid vectors. Preference is given to those vectors which enable a stable integration of the expression cassette into the host genome.
  • RNA molecules or proteins formed as a result of its gene expression be introduced into the corresponding host cell.
  • transformation a variety of methods are available (Keown et al., (1990) Methods in Enzymology 185: 527-537).
  • the DNA or RNA can be introduced directly by microinjection or by bombardment with DNA-coated microparticles.
  • the cell can be permeabilized chemically, for example with polyethylene glycol, so that the DNA can enter the cell by diffusion.
  • the DNA can also be made by protoplast fusion with other DNA-containing moieties such as minicells, cells, lysosomes or liposomes. Electroporation is another suitable method for introducing DNA, in which the cells are reversibly permeabilized by an electrical pulse.
  • Suitable methods are in particular the protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene gun, i. the so-called “particle bombardment” method, the electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution and the microinjection.
  • transformation can also be carried out by bacterial infection, for example by means of Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • the methods are described, for example, in Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f).
  • the expression cassette is to be integrated into special plasmids, either into an intermediate vector (shuttle or intermediate vector) or a binary vector. If a Ti or Ri plasmid is used for the transformation, preferably at least the right border, but most preferably the right and the left border of the Ti or Ri plasmid T-DNA is connected as flanking region with the expression cassette to be introduced.
  • binary vectors are used.
  • Binary vectors can replicate both in E.colia and in Agrobacterium. They usually contain a selection marker gene and a linker or polylinker flanked by the right and left T-DNA restriction sequence. They can be transformed directly into Agrobacterium (Holsters et al., (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187).
  • the selection marker gene allows for selection of transformed agrobacteria and is, for example, the nptll gene conferring resistance to kanamycin.
  • the Agrobacterium acting as a host organism in this case should already contain a plasmid with the vir region. This is required for the transfer of T-DNA to the plant cell.
  • Such transformed Agrobacterium can be used to transform plant cells.
  • T-DNA T-DNA to transform plant cells has been extensively studied and described (Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam, Chapter V. An et al., (1985) EMBO J 4: 277-287).
  • Various binary vectors are known and partially commercially available such as pBI101.2 or pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
  • Stably transformed cells i. those containing the introduced DNA integrated into the DNA of the host cell can be selected from untransformed if a selectable marker is part of the introduced DNA.
  • a selectable marker is part of the introduced DNA.
  • any gene that can confer resistance to antibiotics or herbicides such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin, etc.
  • Transformed cells expressing such a marker gene are capable of surviving in the presence of concentrations of a corresponding antibiotic or herbicide that kill an untransformed wild-type. Examples are mentioned above and preferably include the bar gene conferring resistance to the herbicide phosphinotricin (Rathore KS et al.
  • the construct to be expressed is cloned into a vector suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 87111).
  • Plant can be obtained using methods known in the art. This is an example of callus cultures. From these still undifferentiated cell masses, the formation of shoot and root can be induced in a known manner. The obtained sprouts can be planted out and bred.
  • the person skilled in the art also knows methods for regenerating plant cells, plant parts and whole plants. For example, methods for this are described by Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 1 1: 567-570; Stoeger et al. (1995) Plant Cell Rep. 14: 273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89: 525-533.
  • the method according to the invention can advantageously be combined with further methods which bring about a pathogen resistance (for example against insects, fungi, bacteria, nematodes, etc.), stress resistance or another improvement of the plant properties. Examples include Dunwell JM, Transgenic ap- proaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; Page 487-96.
  • the reduction in the function of an Armadillo-Repeat ARM1 protein in a plant is combined with an increase in the activity of a Bax inhibitor 1 protein.
  • This can be accomplished, for example, by expression of a nucleic acid sequence encoding a Bax inhibitor-1 protein, e.g. in mesophyll tissue and / or root tissue.
  • the Bax inhibitor-1 proteins from Hordeum vulgaric or Nicotiana tabacum are particularly preferred.
  • the invention further relates to nucleic acid molecules which encode nucleic acid molecules encoding armadillo repeat ARM1 proteins from barley according to the polynucleotides SEQ. ID No: 1, as well as the complementary nucleic acid sequences, and the sequences derived by degeneracy of the genetic code and those for functional equivalents of the polypeptides according to SEQ. ID No. 1 nucleic acid molecules, wherein the nucleic acid molecules do not consist of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 exist.
  • Another object of the invention relates to the armadillo repeat ARM1 protein from barley according to SEQ. ID No .: 2 or one comprising these sequences, as well as functional equivalents thereof which are not one of the sequences of SEQ ID Nos. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, or 44, respectively.
  • dsRNA molecule double-stranded RNA nucleic acid molecules
  • dsRNA molecule double-stranded RNA nucleic acid molecules
  • the scythe Strand of said dsRNA molecule at least one homology of 30%, preferably at least 40%, 50%, 60%, 70% or 80%, more preferably at least 90%, most preferably 100% to a nucleic acid molecule according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43, or a fragment of at least 17 base pairs, preferably at least 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 base pairs, more preferably at least 40, 50, 60, 70, 80 or 90 base pairs, all more preferably at least 100, 200, 300 or 400 base pairs, most preferably at least 500, 600, 700, 800, 900 at least 1000 base pairs n and at least 50%, 60%, 70% or
  • the double-stranded structure can be formed starting from a single, self-complementary strand or from two complementary strands.
  • "sense” and “antisense” sequences are linked by a linking sequence ("linker") and may, for example, form a hairpin structure.
  • the joining sequence may be an intron that is spliced out after synthesis of the dsRNA.
  • the nucleic acid sequence encoding a dsRNA may include other elements, such as transcription termination signals or polyadenylation signals.
  • transgenic expression cassettes comprising one of the nucleic acid sequences according to the invention.
  • the nucleic acid sequence encoding the Armadillo-Repeat ARM1 proteins from barley, wheat and maize is linked to at least one genetic control element as defined above in such a way that expression (transcription and optionally translation) in any organism - preferably in monocotyledonous plants - can be realized. Suitable genetic control elements are described above.
  • the transgenic expression cassettes may also contain other functional elements as defined above.
  • Such expression cassettes contain, for example, a nucleic acid sequence according to the invention, e.g. one which is essentially identical to a nucleic acid molecule according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 , 37, 39, 41, or 43 or a fragment according to the invention thereof, wherein said nucleic acid sequence is preferably in sense orientation or in antisense orientation to a promoter and thus can lead to the expression of sense or antisense RNA, wherein said promoter is an active promoter in plants, preferably a pathogen-inducible promoter.
  • transgenic vectors are also included which include the said transgenic expression cassettes.
  • Another subject matter of the invention relates to plants which by natural processes or induced artificially contain one or more mutations in a nucleic acid molecule which has the nucleic acid sequence according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43, wherein said mutation is a decrease in the activity, function or polypeptide amount of one of the nucleic acid molecules according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 coded polypeptide causes. For example, one made by Tilling and identified mutation.
  • Preferred plants are those belonging to the family Poaceae, particularly preferred are plants selected from the plant genera Hordeum, Avena, Seeale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum and Oryza, most preferably plants selected from the species Hordeum vulgare (barley), Triticum aestivum (wheat), Triticum aestivum subsp.spelta (spelled), triticale, Avena sative (oats), Seccale cereale (rye), Sorghum bicolor (millet), Zea mays (corn), Saccharum officinum (sugar cane) and Oryza sative (rice).
  • the invention relates to a monocotyledonous organism comprising a nucleic acid sequence according to the invention which contains a mutation which brings about a reduction in the activity of one of the proteins encoded by the nucleic acid molecules according to the invention in the organisms or parts thereof.
  • the mutation relates to one or more amino acid residues that are labeled conserved or highly conserved in the consensus sequence shown in the figures.
  • a further subject of the invention therefore relates to transgenic plants transformed with at least
  • nucleic acid molecules according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 , 39, 41, or 43, contain the nucleic acid sequences complementary thereto, and those for functional equivalents of the polypeptides according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 or 62 encoding nucleic acid molecules
  • dsRNA molecule double-stranded RNA nucleic acid molecules
  • dsRNA molecule double-stranded RNA nucleic acid molecules
  • the sense strand of said dsRNA molecule at least a homology of 30%, preferably at least 40%, 50%, 60 %, 70% or 80%, more preferably at least 90%, most preferably 100% to a nucleic acid molecule according to S SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17 , 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43, or a fragment of at least 17 base pairs, preferably at least 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 base pairs, more preferably at least 40, 50, 60, 70, 80 or 90 base pairs, most preferably at least 100, 200, 300 or 400
  • Base pairs most preferably at least 500, 600, 700, 800, 900 or more base pairs comprising at least a 50%, 60%, 70% or 80%, particularly preferably at least 90%, very particularly preferably 100% homology to a nucleic acid molecule according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43,
  • transgenic expression cassette which comprises one of the nucleic acid sequences according to the invention, or a vector according to the invention, and also cells, cell cultures, tissues, parts, such as leaves, roots, etc. in the case of plant organisms, or propagation material derived from such organisms,
  • nucleic acid molecules do not have the structure shown in SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43, and in one embodiment does not consist of the nucleic acid molecules shown in SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 or 62 are polypeptide molecules and
  • the plant according to the invention or the plant used according to the invention is not Arabidopsis thaliana.
  • transgenic organisms are preferred as “transgenic organisms.”
  • the transgenic organism is a mature plant, seed, shoot, and seedling, as well as derived parts, propagation material, and cultures, for example “Mature plant” means plants at any stage of development beyond the seedling.
  • the plant is a monocotyledonous plant such as wheat, oats, millet, barley, rye, corn, rice, buckwheat, sorghum, triticale, spelled or sugarcane, in particular selected from the species Hordeum vulgare (barley), Triticum aestivum (wheat), Triticum aestivum subsp.spelta (spelled ), Triticale, Avena sative (oats), Seeale cereale (rye), Sorghum bicolor (millet), Zea mays (corn), Saccharum officinarum (sugar cane) or Oryza sativa (rice).
  • a monocotyledonous plant such as wheat, oats, millet, barley, rye, corn, rice, buckwheat, sorghum, triticale, spelled or sugarcane, in particular selected from the species Hordeum vulgare (barley), Triticum aestivum
  • the production of the transgenic organisms can be accomplished by the above-described methods of transforming or transfecting organisms.
  • the invention further relates to the transgenic plants described according to the invention, which additionally have increased Bax inhibitor 1 activity; plants which have increased Bax inhibitor 1 activity in mesophyll cells or root cells are preferred, and transgenic plants are particularly preferred belong to the family of Poaceae and increased Bax inhibitor 1 activity in mesophyll cells or root cells, most preferably transgenic plants selected from the plant genera Hordeum, Avena, Seeale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum and Oryza, most preferably the plant species are Hordeum vulgaris (barley), Triticum aestivum (wheat), Triticum aestivum subsp.spelta (spelled), triticale, Avena sative (oats), Seeale cereale (rye), Sorghum bicolor (millet), Zea mays (corn), Saccharum officinarum (sugarcane) and Oryza sative (rice).
  • transgenic plants selected from the plant genera Hordeum, Avena
  • Another object of the invention relates to the use of the inventive, transgenic organisms and derived from them cells, cell cultures, parts - such as transgenic plant organisms roots, leaves, etc.-, and transgenic propagation material such as seeds or fruits, for the production of food or feed, pharmaceuticals or fine chemicals.
  • the invention also relates to a process for the recombinant production of pharmaceuticals or fine chemicals in host organisms wherein a host organism or a part thereof is transformed with one of the above-described nucleic acid expression cassette molecules and this expression cassette contains one or more structural genes which are suitable for the desired fine chemical or catalyze the biosynthesis of the desired fine chemical, the transformed host organism is grown and the desired fine chemical is isolated from the culture medium.
  • This process is widely applicable to fine chemicals such as enzymes, vitamins, amino acids, sugars, fatty acids, natural and synthetic flavorings, flavorings and dyes. Particularly preferred is the production of tocopherols and tocotrienols and carotenoids.
  • the expression of a structural gene can also be effected or influenced independently of the execution of the method according to the invention or the use of the articles according to the invention.
  • SEQ ID NO: 60, 61, 63 consensus sequences of the polynucleotide SEQ ID NO. from 1st to 22nd
  • FIG. 1 (12 pages): Nucleic acid sequences of ARM1 from barley, rice, and Arabidopsis thaliana.
  • FIG. 2 (6 pages): polypeptide sequences of ARM1 from barley, rice, and Arabidopsis thaliana.
  • Figure 3 (20 pages): Sequence Comparison of ARM1 Protein Sequences Polypeptides from barley, rice, and Arabidopsis thaliana.
  • Figure 5 (2 pages): Consensus Sequences of Sequence Comparison of ARM1 Protein Sequences Polypeptides from barley, rice, and Arabidopsis thaliana. Examples:
  • oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the cloning steps carried out in the context of the present invention e.g. Restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linkage of DNA fragments, transformation of E. coli cells, culture of bacteria, propagation of phages and sequence analysis of recombinant DNA are performed as described in Sambrook et al , (1989) CoId Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 described.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules is carried out using a laser fluorescence DNA sequencer from the company MWG-Licor according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad. USA 74: 5463-5467).
  • the golden variety Golden Promise comes from Patrick Schweizer, Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research Gatersleben.
  • the variety Pallas and the backcrossed line BCIngrid- / 77 / ⁇ 5 were provided by Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agricultural University, Copenhagen, Denmark. Their preparation has been described (Kistl P et al. (1986) crop 269: 903-907).
  • the seeds pre-germinated for 12 to 36 h in the dark on moist filter paper are laid out with 5 seeds each on the edge of a square pot (8x8cm) in type P spring soil, covered with soil and poured regularly with tap water. All plants are grown in climatic cabinets or chambers at 16 to 18 ° C, 50 to 60% relative humidity and a 16-hour light / 8-hour dark cycle with 3000 and 5000 lux (50 and 60 ⁇ mols- 1 m- 2 photons, respectively ) - flux density) cultivated for 5 to 8 days and used in the seedling stage in the experiments. In experiments where primary leaf applications are performed, they are fully developed.
  • the plants are cultivated in climatic cabinets or chambers at daytime 24 ° C, at night 20 ° C, 50 to 60% relative humidity and a 16 hours light / ⁇ stußen dark cycle with 30000 lux.
  • barley powdery mildew Blumeria graminis DC
  • Speer f.sp. hordeiEm Marchai of breed A6 (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89-148) (BghA6). This was provided by the Institute of Biometry, JLU G devisen.
  • Offspring of the inoculum are grown in climatic chambers at the same conditions described above for the plants by transferring the conidia of infested plant material to regularly grown 7-day-old barley plants cv. Golden Promise at a density of 100 conidia / mm 2 .
  • Inoculation with BghA6 is done using 7 day old seedlings by shaking the conidia of already infested plants in an inoculation tower at approximately 100 conidia / mm 2 (unless otherwise stated).
  • RNA Extraction Buffer AGS, Heidelberg, Germany
  • central primary leaf segments of 5 cm in length are harvested and homogenized in liquid nitrogen in mortars.
  • the homogenate is stored at -70 ° C until RNA extraction.
  • RNA extraction kit (AGS, Heidelberg). For this purpose, 200 mg of the frozen leaf material in a microcentrifuge tube (2 mL) is covered with 1.7 mL RNA extraction buffer (AGS) and immediately mixed thoroughly. After addition of 200 .mu.l of chloroform is mixed well again and shaken at room temperature for 45 min on a horizontal shaker at 200 U / min. The mixture is then centrifuged for 15 minutes at 20000 g and 4 ° C for phase separation, transferred the upper aqueous phase in a new microcentrifuge tube and the lower discarded.
  • AGS RNA extraction kit
  • the aqueous phase is again cleaned with 900 .mu.l of chloroform by homogenizing 3 times for 10 sec and centrifuging again (see above) and lifting off.
  • 850 ⁇ l of 2-propanol are then added, homogenized and placed on ice for 30 to 60 minutes. Centrifuge for 20 min (see above), carefully decant the supernatant, add 2 mL 70% ethanol (-20 ° C), mix and centrifuge again for 10 min. The supernatant is then decanted again and the pelet carefully freed with a pipette of liquid residues before it is dried at a clean air workplace in the clean air stream.
  • RNA is then dissolved in 50 ⁇ L DEPC water on ice, mixed and centrifuged for 5 min (see above). 40 ⁇ l of the supernatant are transferred as RNA solution to a new microcentrifuge tube and stored at -70 ° C.
  • RNA concentration is determined photometrically.
  • the concentrations of the RNA solutions are then adjusted with DEPC water to 1 ⁇ g / ⁇ L and checked in the agarose gel.
  • RNA concentrations in the horizontal agarose gel 1% agarose in 1 ⁇ MOPS buffer with 0.2 ⁇ g / mL ethidium bromide
  • 1 ⁇ l of RNA solution with 1 ⁇ L 10 ⁇ MOPS, 1 ⁇ l color marker and 7 ⁇ l DEPC water shifted according to their size at 120 V voltage in the gel in 1 x MOPS running buffer over 1, 5 h separated and photographed under UV light. Any concentration differences of the RNA extracts would be compensated with DEPC water and the adjustment again checked in the gel.
  • RNA from barley epidermis was used as template.
  • the RNA was isolated from epidermal cells of barley Ingrid + Bgt at 12 h and 24 h after infection.
  • the cDNA sequence of HvArm was extended by RACE technology using the GeneRacer Kit (INVITROGENE Life Technologies). For this purpose, 4000 ng total mRNA, 1 ⁇ L 10xCIP buffer, 10 units RNAse inhibitor, 10 units CIP ("calf intestinal phosphatase") and DEPC-treated water were treated up to a total volume of 10 ⁇ L for 1 h at 50 ° C. , To precipitate the RNA, a further 90 .mu.l of DEPC-water and 100 .mu.l of phenochloroform were added and thoroughly mixed for about 30 sec.
  • RNA CAP structures were removed by adding 1 ⁇ l of 1OxTAP buffer, 10 units of RNAsin and 1 unit of tobacco acid pyrophosphatase (TAP). The mixture was incubated for 1 h at 37 ° C and then cooled on ice. The RNA was again precipitated as described above and transferred to a reaction vessel containing 0.25 ⁇ g GeneRacer oligonucleotide primer. The oligonucleotide primer was resuspended in the RNA solution, the mixture incubated for 5 min at 70 ° C and then cooled on ice.
  • the reaction was incubated at 50 ° C for 50 minutes.
  • GR 5 ' primer (Invitrogen): 5 ' cgactggagcacgaggacactga 3 ' (Seq ID No .: 47)
  • the batch (total volume 50 ⁇ l) had the following composition:
  • the PCR gave a product of about 850bp.
  • the resulting PCR product was isolated on a 1% agarose gel, extracted from the gel and cloned into pCR4-Topo (Invitrogen Life Technologies) by T-overhang ligation and sequenced.
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 1 is thus identical to the armadillo sequence of barley.
  • the batch (total volume 50 ⁇ l) had the following composition:
  • PCR revealed a product of 1326bp.
  • the resulting PCR product was isolated on a 1% agarose gel, extracted from the gel and placed in pCR4-Topo (Invitrogen Life Technologies) using T-overhang ligation and sequenced.
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 1 is thus identical to the armadillo sequence of barley.
  • the batch (total volume 50 ⁇ l) had the following composition (the gene was divided into two parts for the PCR because of its size of 2775 bp):
  • the PCR gives a product of 1143bp and 1705bp, respectively.
  • the resulting PCR product is isolated on a 1% agarose gel, extracted from the gel and cloned into pCR4-Topo (Invitrogen Life Technologies) by T-overhang ligation and sequenced.
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 1 is therefore identical to the Arabidopsis thaliana Armadillo sequence.
  • the 1705bp PCR product is cloned into pUC18. This is followed by the cloning of AtArm 1 143bp into pUC18 AtArm 1705bp.
  • an antsense construct is generated.
  • HvArm antisense is cloned into the binary vector 1 bxSuperGus by excision of HvArm via Smal from pUC18 and cloned via the mentioned interfaces into the 1 bxSuperGus (SacI / SmaI) blunted at the 5 ' end.
  • the orientation is checked by means of test digestion.
  • NILs Barley near-isogenic lines of the cultivars cv Ingrid (MIo) and Ingrid BC 7 m / o ⁇ illustrated. Barley cv Golden Promise were grown in climatic chambers in pots of compost soil (IPK Gatersleben) (16 h light from metal halide lamps, 8 h dark, 70% relative humidity, 18 ° C constant temperature).
  • Blumeria graminis DC Speer f.sp. hordei (BgIi) isolates 4.8 containing AvrMla ⁇ was light transfected at 22 ° C and 16 h by weekly transfer to fresh barley leaves of the cultivar cv. Golden Promise cultivated.
  • the vector plPKTA38 was used as an entry vector for the Gateway TM cloning system (invitrogen).
  • the vector is a pENTRI a derivative in which the ccdB gene has been deleted and a novel multiple cloning site has been inserted.
  • the destination vector used was plPKTA30N, which is based on a pUC18 background and contains a costitive promoter, terminator and two gateway cassettes containing attR sites, ccdB gene and a chloramphenicol resistance gene. The two cassettes are arranged in reversed orientation and separated by a spacer of the wheat RGA2 gene (accession number AF326781). This vector system allows a single-step transfer of two copies of a PCR
  • PCR and primer design EST sequences of the target gene were amplified by PCR.
  • Purified DNA of the selected cDNA clones was used as a template for the PCR reaction.
  • the primers were derived using the software package "Primer3" in batch-file mode using the 5 'EST sequences Typically, the EST sequences were amplified with a universal forward primer and a reverse EST-specific primer.
  • the amplified product had a size of 400-700 bp.
  • the primers were 20-22 bp in length and had a T m of about 65 ° C.
  • PCR reactions were performed in 96-well microtiter plates using a DNA polymerase which produces blunt ends (ThermalAce; Invitrogen)
  • the PCR products were purified using the MinElute UF kit (Qiagen, Hilden, Germany) and eluted with 25 ⁇ l of water.
  • the PCR fragments were cloned into the Swal site of the vector plPKTA38.
  • the ligation was at 25 ° C in the presence of N U T4 DNA ligase (MBI Fermentas) and 5 U Swa ⁇ reaction.
  • MBI Fermentas N U T4 DNA ligase
  • the buffer was supplemented with NaCl to a final concentration of 0.05M. After 1 h, the reaction was stopped by heating to 65 ° C for 15 min. An additional 5 U of Swa I was then added to suppress re-ligation of the plasmid.
  • the Swa I buffer was supplemented with additional NaCl to a final concentration of 0.1M. Reaction enemas were further incubated for 1 h at 25 ° C.
  • the resulting recombinant plPKTA38-EST clones were used for the transformation of chemically competent E.c ⁇ // DH10B cells into 96-well PCR microtiter plates (5 ⁇ l Ligation Set on 20 ⁇ l competent cells) and incubated on LB agar plates with cannula. mycin plated. One colony of each cloning reaction was picked and taken up in 1.2 mL of LB + kanamycin liquid culture, distributed in 96-deep-well plates. The plates were covered with an air-permeable film and incubated at 37 ° C for 18 h on a shaker.
  • the deep-well plates were then at 750 g for 10 min centrifuged and the pellets were used for plasmid isolation using NucleoSpin Robot-96 Plasmid Kit (Macherey-Nagel).
  • the presence of the plPKTA38 plasmid was detected by restriction digestion with EccR ⁇ .
  • the positive plPKTA38 clones were used as donor vector in the LR reaction.
  • EST fragments in pIPKTA38 were cloned into the RNAi destination vector plPKTA30N as inverted repeats via a single LR recombination reaction.
  • the reaction volume was reduced to 6 ⁇ l and contained 1 ⁇ l of the plPKTA38 donor clone, 1 ⁇ l of the plPKTA30N Destination vector (150 ng / ⁇ L), 0.8 ⁇ l of the LR Clonase Enzyme Mix and 3.2 ⁇ l of H2O.
  • the reaction was incubated at room temperature overnight, and 5 ⁇ L of it was transformed into 20 ⁇ L of chemically competent E.coliZe ⁇ in 96-well PCR plates.
  • Two 96-deep-well plates with LB + ampicillin were half filled with half volume transformation approach, sealed with an air-permeable film and incubated at 37 ° C for 24 h on a plate shaker. Subsequently, the deep-well plates were centrifuged at 750 g for 10 min and the pellets of two duplicates of each clone were pooled and subjected to the Plasmind preparation. This was done using the NucleoSpin Robot-96 Plasmid Kit (Macherey-Nagel). The amount of DNA averaged 20-30 ⁇ g of DNA per clone.
  • the stock solution contained 25 mg mL -1 gold, the supernatant was completely removed after coating, and the particles were resuspended in 30 ⁇ l pure ethanol 2.18 mg gold microcarriers were used per bombardment Four hours after bombardment the leaf segments were opened 1% w / v Phytoagar (Ducheva) in water containing 20 ppm benzimidazole, stored in 20 x 20 cm plates and fixed at both ends with weights.
  • the leaf segments were inoculated with Sporenb from Bgt and Bgh 48 h or 96 h after particle bombardment.
  • the reporter construct for transformed epidermal cells was the plasmid pUbiGUS, which contains the ⁇ -glucuronidase (GUS) gene under the control of the maize ubiquitin promoter.
  • the leaf segments were stained for GUS activity 40 h after inoculation and decolorized with 7.5% w / v trichloroacetic acid and 50% methanol for 5 minutes.
  • the GUS staining solution is described in Schweizer et al. Described in 1999.
  • GUS-stained cells were counted by light microscopy and the number of haustoria in these transformed cells was determined, from which the haustorial index was derived. Alternatively, the number of GUS stained cells containing at least one haustorium was determined and from this the Susceptibility Index was calculated.

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung einer Pathogenresistenz in Pflanzen durch Verminderung der Expression mindestens eines Armadillo Repeat Polypeptids oder eines funktionellen Äquivalentes desselben. Die Erfindung betrifft neue Nukleinsäuresequenzen codierend für ein Hordeum vulgare Armadillo-Repeat (HvARM)-Polynukleotid und beschreibt homologe Sequenzen (ARM1) davon sowie deren Verwendung in Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen e, sowie Nukleinsäurekonstrukte, Expressionskassetten und Vektoren, die diese Sequenzen umfassen, und die geeignet sind, eine -Pilzresistenz in Pflanzen zu vermitteln. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Organismen, insbesondere Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut.

Description

Verwendung von Armadillo-Repeat (ARM1 ^Polynukleotiden zum Erreichen einer Pa- thogenresistenz in Pflanzen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung einer Pathogenre- sistenz in Pflanzen durch Verminderung der Expression mindestens eines Armadillo Repeat Polypeptids oder eines funktionellen Äquivalentes desselben. Die Erfindung betrifft neue Nukleinsäuresequenzen codierend für ein Hordeum vulgäre Armadillo- Repeat (HvARM)-Polynukleotid und beschreibt homologe Sequenzen (ARM1) davon sowie deren Verwendung in Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen, sowie Nukleinsäurekonstrukte, Expressionskassetten und Vektoren, die diese Sequenzen umfassen, und die geeigntet sind, eine -Pilzresistenz in Pflanzen zu vermitteln. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Organismen, insbesondere Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut.
Es gibt nur wenige Ansätze die Pflanzen eine Resistenz gegen Pathogene, vor allem Pilzpathogene, verleihen. Dieser Mangel ist zum Teil in der Komplexität der betrachteten biologischen Systeme begründet. Dem Erreichen von Resistenzen gegenüber Pa- thogenen steht auch entgegen, dass über die Wechselwirkungen zwischen Pathogen und Pflanze wenig bekannt ist. Die große Anzahl unterschiedlicher Pathogene, die von diesen Organismen entwickelten Infektionsmechanismen und die von den Pflanzen- stammen, Familien und Arten entwickelten Abwehrmechanismen wechselwirken vielfältig miteinander.
Pilzpathogene haben im Wesentlichen zwei Infektionsstrategien entwickelt. Manche Pilze dringen über die Spaltöffnungen in das Wirtsgewebe ein (z.B. Rostpilze, Septoria- , Fusarium-Arten) und penetrieren das Mesophyllgewebe, während andere über die Cuticula die darunterliegenden Epidermiszellen penetrieren (z.B. Blumeria Arten).
Die durch die Pilzpathogene verursachten Infektionen führen in den befallen Pflanzen zur Aktivierung der pflanzlichen Abwehrmechanismen. So konnte gezeigt werden, dass Abwehrreaktionen gegen Epidermis penetrierende Pilze häufig mit der Ausbildung einer Penetrationsresistenz (Papillenbildung, Zellwandverdickungen mit Kallose als Hauptbestandteil) unterhalb der pilzlichen Penetrationshyphe beginnen, (Elliott et al. Mol Plant Microbe Interact. 15: 1069-77; 2002).
Die pflanzlichen Abwehrmechanismen vermitteln jedoch in vielen Fällen nur einen unzureichenden Schutzmechnismus gegen Pathogenbefall. Die Ausbildung einer Penetrationsresistenz gegenüber Pathogenen, deren Infektionsmechanismus eine Penetration der Epidermis- oder Mesophyllzellen beinhaltet, ist sowohl für monokotyledone als auch dikotyledone Pflanzen von grosser Bedeutung. Sie kann vermutlich im Gegensatz zur beschriebenen mlo-vermittelten Resistenz die Aus- bildung einer Breitspektrum-Resistenz gegen obligat-biotrophe, hemibiotrophe und nekrotrophe Pilze ermöglichen.
Daher lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Erzeugung einer Resistenz von Pflanzen gegen penetrierende Pathogene bereitzustellen.
Die Lösung der Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Folglich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Resistenz gegenüber einem oder mehreren penetrierenden Pathogen(en) in einer monokotyledonen oder dikotyledonen Pflanze, oder einem Teil einer Pflanze, z.B. in einem Organ, Gewebe, einer Zelle oder einem Teil einer pflanzlichen Zelle, z.B. in einem Organell, dadurch gekennzeichnet, dass Aktivität oder Menge eines Armadillo Repeat ARM1 Proteins in der Pflanze, oder einem Teil der Pflanze, z.B. in einem Organ, Gewebe, einer Zelle oder einem Teil einer Zelle, z.B. in einem Zellkompartiment, z.B. in einem Organell, im Vergleich zu einer Kontrollpflanze oder einem Teil einer Kontrollpflanze, z.B. deren Organ, Gewebe, Zelle oder einem Teil einer Zelle, z.B. in einem Zellkompartiment, beispielsweise in einem Organell, vermindert oder reduziert wird.
Vorzugsweise wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine rasseunspezifische Resistenz erreicht. So kann z.B. durch das erfindungsgemäße Verfahren eine Breitspektrumresistenz gegen obligat biotrophe und/oder hemibiotrohpe und/oder nekrotrophe Pilze von Pflanzen, insbesondere gegen Mesophyll-, Epidermis oder bis in das Mesophyll- penetrierende Pathogene erreicht werden.
Überraschend wurde einerseits beobachtet, dass Gene Silencing mittels dsRNAi eines Gens, das für ein Armadillo Repeat Protein HvARM der Gerste codiert, eine Erhöhung der Resistenz von monokotyledonen und dikotyledonen Pflanzen gegenüber PiIz- pathogenen zur Folge hat. So konnte für das Armadillo Repeat ARM1 Protein aus Gerste (Hordeum vulgäre) (HvARMI ), Weizen (Triticum aestivum) und Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) diese negative Kontrollfunktion bei einem Befall durch Pilzpathogene gezeigt werden.
Im Rahmen einer TIGS (=Transient Induced Gene Silencing)-Analyse in Gerste nach der Methode von Schweizer et al. (Plant J. 2000 Dec;24(6):895-903.) wurde festgestellt, dass durch ein dsRNAi-vermitteltes Silencing des Gens HvARM die Resistenz gegen Blumeria graminis f. sp. hordei (auch Erysiphe graminis DC. f. sp. hordei) stark erhöht. Dieser Effekt konnte zudem durch Induktion des Post Transcriptional Gene Silencings (PTGS) in dikotylen Spezies wie z.B. Arabidopsis thaliana erreicht werden. Dies unterstreicht die universelle Bedeutung des loss of function von HvARMI- homologen Genen für die Ausbildung einer Breitspektrum-Pathogenresistenz der Pflanze.
Das Armadillo Repeat-Motiv war ursprünglich in dem Segment-Polaritäts-Gen Armadil- Io aus Drosophila melanogaster entdeckt worden. Es kodiert für ein beta-Catenin, welches in der Zell-Zell-Adhäsion sowie für die Zelldifferenzierung eine wichtige Rolle spielt. Armadillo (Arm) Repeat Proteine enthalten tandemartig angeordnete Kopien einer degenerierten Sequenz von ca. 42 Aminosäuren, welche eine drei-dimensionale Struktur zur Vermittlung von Protein-Protein-Interaktionen kodiert (Azevedo et al. (2001 ) Trends Plant Sei. 6, 354-358). Die meisten dieser Proteine sind in die intrazelluläre Signaltransduktion oder in die Regulation der Genexpression im Rahmen zellulärer Entwicklungsprozesse involviert. Im Gegensatz zu Tieren sind erst zwei pflanzliche Armadillo-Repeat-Proteine funktionell charakterisiert worden: Bei einem Gen handelt es sich um PHOR1 (photoperiod-responsive 1 ) aus Kartoffel, für welches eine Rolle in der Gibberellinsäure-Signaltransduktion demonstriert werden konnte (Amador V, Cell 10;106(3):343-54.) Bei dem zweiten Armadillo-Repeat Protein handelt es sich um ARC1 (Armadillo-Repeat Containing Protein 1 ) aus Raps, das mit der Rezeptor-Kinase SRK1 interagiert (Gu et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 382-387). Damit spielt es bei der Regulation der Selbstinkompatibilität von Raps eine große Rolle. Transgene Pflanzen, in denen die Expression von ARC1 durch Silencing herabgesetzt ist, zeigen eine reduzierte Selbstinkomptibilität. Interessanterweise zählt ARC1 zu der U-Box enthaltenden Subklasse der Armadillo-Repeat Proteine, zu der in Arabidopsis 18 Gene zählen (Azevedo et al. (2001) Trends Plant Sei. 6, 354-358). Die U-box ist ein Motiv bestehend aus ca. 70 Aminosäure-Resten. Neben den HECT- und den RING- Finger-Proteinen bilden sie vermutlich eine dritte Klasse an Ubiquitin E3-Ligasen, deren primäre Funktion darin besteht, die Substratspezifität der Ubiquitinierungsmaschi- nerie festzulegen (Hatakeyama et al. (2001) J. Biol. Chem. 76, 331 11-33120).
Vorzugsweise haben die Gene oder die verwendeten Nukleinsäuren oder die expri- mierten Proteine, deren Experession vermindert wird, eine Identität von 40% oder mehr, vorzugweise 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%,98%, 99% oder mehr verglichen mit der jeweiligen Sequenz von HvARM (SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2). Die Gene mit den höchsten Homolgien zu HvArm aus Reis (Acc. Nr.: XM_479734.1 , XM_463544, AP003561 , oder XM_506432), Tabak (AY219234) und Arabidopsis (Acc- No. NM_127878, AC004401 , BT020206 , AB007645, NM_115336 , AK118613, AL138650, AL133314, AC010870, AY125543, AY087360, AB016888, AK175585, AL049655, AY096530 und AK1 18730) nehmen somit vermutlich ähnliche Funktionen wie HvARM in der Pflanze wahr. Im folgenden werden daher diese unter dem Begriff „Aimadillo Repeat ARM1 " oder „ARM1 " Protein zusammengefasst. HvARM bzw. HvARMI beziehen sich hingegen auf ein solches Protein aus Gerste.
Kürzlich wurde in Mais mit SpH 1 ein weiteres pflanzliches Armadillo-Repeat Protein beschrieben, für das eine Regulation der pflanzlichen Zelltodantwort im Rahmen der abiotischen Stressantwort nachgewiesen wurde. Der Funktionsverlust des entsprechenden Gens führt zu einem sog. Lesion M/77/c-Phänotyp, der die agronomische Leistungsfähigkeit der Pflanze beeinträchtigt (Zeng LR, (2004) Plant Cell. 16(10):2795- 808). Interessanterweise beträgt die Sequenzhomologie von SpH 1 zu HvARM lediglich 23,4% auf Aminosäure-Ebene. Ohne durch Theorie eine Festlegung oder Einschränkung herbeizuführen deutet neben den unterschiedlichen Funktionen auch die geringe Sequenzhomologie auf die Zugehörigkeit von HvARM und SpH 1 zu verschiedenen Subklassen von Armadillo-Repeat Proteinen hin.
Es war folglich überraschend, dass die Reduktion der Genexpression von HvARMI durch RNAi-vermitteltes Silencing zu einer Erhöhung der Resistenz von Gerste gegen Gerstenmehltau führt und dass in Weizen (Triticum aestivum) und Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) diese negative Kontrollfunktion bei einem Befall durch PiIz- pathogene ebenfalls gezeigt werden konnte.
In einer weitere Ausführungsform betrifft die Erfindung folglich ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhter Resistenz gegen ein oder mehrere pflanzliche Pa- thogen(e), vorzugweise mit einer Breitspektrumresistenz, insbesondere gegen PiIz- pathogene, beispielsweise der Klassen Ascomycetes, Basidiomycetes, Chytridiomyce- tes oder Oomycetes, bevorzugt von Mehltaupilzen der Familie Erysiphaceae, und besonders bevorzugt der Gattung Blumeria, und zwar durch Reduzierung der Expression eines Proteins, das dadurch charakterisiert ist, dass es mindestens ein Armadillo- Repeat enthält. Vorzugsweise enthält das Protein zwei, besonders bevorzugt mehr als zwei Armadillo-Repeats.
In einer weiteren Ausführungsform wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Aktivität eines Armadillo-Repeat-Polypeptids vermindert, z.B. blockiert oder ausgeschaltet, das im Wesentlichen keine U-Box umfasst, d.h. entweder keine U-Box umfasst oder keine funktionelle U-Box umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Aktivität eines Polypeptids vermindert, z.B. ausgeschaltet, das kodiert wird von einem Polynukleotid umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Nukleinsäuremolekül, das mindestens ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 or 62 gezeigte Sequenz;
(b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in
SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 umfasst;
(c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 50% zu den Sequenzen SEQ ID No: 2 aufweist;
(d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 or 62 kodiert;
(e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremo- leküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird;
(f) Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und
(g) Nukleinsäuremolekül, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nuklein- säuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann;
oder eine komplementäre Sequenz davon umfasst.
Vorzugsweise wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere die Resistenz gegen Mesophyll und/ oder Epidermiszellen penetrierende Pathogene erhöht.
In einer Ausführungsform wird die Resistenz dadurch erreicht, dass die Expression eines Polypeptids, vorzugweise eines Polypeptides das von dem oben beschriebenen Nukleinsäuremolekül kodiert wird, zum Beispiel die eines ARM1 aus Reis (Acc. Nr.: XM_479734.1 , XM_463544, AP003561 , oder XM_506432), Tabak (AY219234) und Arabidopsis (Acc.-No. NM_127878, AC004401 , BT020206 , AB007645, NM_1 15336 , AK118613, AL138650, AL133314, AC010870, AY125543, AY087360, AB016888, AK175585, AL049655, AY096530 und AK118730) vermindert, reduziert oder blockiert wird. Anderseits kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren auch die endogene Aktivität eines dieser Polypeptide reduziert, vermindert oder blockiert werden, z.B. durch Mutation einer genomischen codierenden Region für das aktive Zentrum, für Bindungsstellen, für Lokalisationssignalen, für Domainen, Cluster, etc. wie z.B. von codie- renden Regionen für coiled coil, HEAT, FBOX, LRR, IBIB, C2, WD40, Beach, U-Box, oder UND-Domänen. Die Aktivität kann erfindungsgemäß reduziert werden durch Mutationen, die die Sekundär-, Tertiär-, oder Quartärstruktur des Proteins beinflussen.
Mutationen können z.B. durch eine EMS-Mutagenese eingeführt werden. Domainen können durch geeignete Computerprogramme identifiziert werden, wie z.B. SMART, oder InterPRO, z.B. wie in Andersen P., The Journal of Biol. Chemistry, 279, 38, pp. 40053-40061 , 2004 oder Y. Mudgil, Plant Physiology, 134, 59-66, 2004, und darin genannten Schriften beschrieben. Die geeigneten Mutanten können dann z.B. durch TiI- ling (Henikoff et al. Plant Physiol. 2004 Jun;135(2):630-6) identifiziert werden.
In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Verminderung der Polypeptidmenge, Aktivität oder Funktion eines Armadillo Repeat ARM1 Proteins in einer Pflanze kombiniert mit einer Erhöhung der Polypeptidmenge, Aktivität oder Funktion anderer Resistenzfaktoren, bevorzugt eines Bax Inhibitor 1 -Proteins (BI-1), bevorzugt des Bax Inhibitor 1- Proteins aus Hordeum vulgäre (GenBank Acc.-No.: AJ290421), aus Nicotiana tabacum (GenBank Acc.-No.: AF390556), Reis (GenBank Acc.-No.: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: AB025927) bzw. Tabak und Raps (GenBank Acc.-No.: AF390555, Bolduc N et al. (2003) Planta 216:377-386) oder von ROR2 (z.b. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AY246906), SnAP34 (z.b aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AY247208) und/oder des Lumenal Binding Protein BiP z.B. aus Reis (GenBank Acc.-No.
AF006825). Eine Erhöhung kann z.B. u.a. durch Mutagenese oder Überexpression eines Transgens erreicht werden.
In einer Ausführungsform wird eine Verminderung der Proteinmenge oder Aktivität oder Funktion der Proteine RacB (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AJ344223)), CSL1 (z.B. aus Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: NM116593), HvNaOX (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AJ251717), MLO (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No. Z83834) erreicht.
Die Aktivität oder Funktion von MLO, BI-1 und/oder NaOX kann analog wie für MLO in WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552 und den weiteren unten genannten Schriften beschrieben reduziert oder inhibiert werden, deren Inhalt hiermit ausdrücklich und expressis verbis mit aufgenommen gilt, insbesondere um die Aktivität und Inhibierung von MLO zu beschreiben. Die Beschreibung der genannten Schriften beschreibt Ver- fahren, Methoden und besonders bevorzugte Ausführungsformen zur Verminderung oder Inhibierung der Aktivität oder Funktion von MLO, die Beispiele geben konkret an, wie dies ausgeführt werden kann. Die Reduzierung der Aktivität oder Funktion und ggf. der Expression von BI-1 ist in der WO 2003020939 ausführlich beschrieben, die hiermit ausdrücklich und expressis ver- bis mit als in die vorliegenden Beschreibung aufgenommen gilt. Die Beschreibung der genannten Schrift beschreibt Verfahren und Methoden zur Verminderung oder Inhibierung der Aktivität oder Funktion von BI-1 , die Beispiele geben konkret an, wie dies ausgeführt werden kann. Besonders bevorzugt wird die Reduktion oder Inhibierung der Aktivität oder Funktion von BI-1 gemäß der in der WO 2003020939 besonders bevorzugten Ausführungsformen und der Beispiele und in den dort als besonders bevorzugt dargestellten Organismen durchgeführt, insbesondere in einer Pflanze, z.B. konstitutiv, oder in einem Teil davon, z.B. in einem Gewebe, besonders jedoch mindestens in der Epidermis oder einem wesentlichen Teil der Epidermiszellen. Die Reduzierung der Aktivität oder Funktion und ggf. der Expression von BI-1 ist in der WO 2003020939 ausführlich beschrieben. Der Fachmann findet in der WO 2003020939 die Sequenzen, die für BI-1 Proteine codieren, und kann mit dem in der WO 2003020939 zur Verfügung gestellten Verfahren auch BI-1 identifizieren.
Die Reduzierung der Aktivität oder Funktion und ggf. der Expression von NaOX ist in der PCT/EP/03/07589 ausführlich beschrieben, die hiermit ausdrücklich und expressis verbis als in die vorliegenden Beschreibung mit aufgenommen gilt. Die Beschreibung der genannten Schrift beschreibt Verfahren und Methoden zur Erniedrigung oder Inhibierung der Aktivität oder Funktion von NaOx, die Beispiele geben konkret an, wie dies ausgeführt werden kann. Besonders bevorzugt wird die Reduktion oder Inhibierung der Aktivität oder Funktion von NaOx gemäß der in der PCT/E P/03/07589 besonders be- vorzugten Ausführungsformen und der Beispiele und in den dort als besonders bevorzugt dargestellten Organismen durchgeführt insbesondere in einer Pflanze, z.B. konstitutiv, oder einem Teil davon, z.B. in einem Gewebe, besonders vorteilhaft jedoch mindestens in der Epidermis oder einem wesentlichen Teil der Epidermiszellen. Der Fachmann findet in der PCT/EP/03/07589 die Sequenzen, die für NaOx Proteine co- dieren und kann mit dem in der PCT/EP/03/07589 zur Verfügung gestellten Verfahren auch NaOx identifizieren.
Die Begriffe „vermindern", „reduzieren" oder „repremieren" oder deren Substantive werden hierein synonym verwendet.
Unter „Verminderung", „Reduzierung" oder „Reprimierung" oder deren Verben wird erfindungsgemäß verstanden, dass die Aktivität in der Pflanze geringer ist als in einer Kontrollpflanze bzw. in einem Teil einer Pflanze geringer ist als in einem entsprechenden Teil einer Kontrollpflanze, z.B. in einem Organ, einem Organell, einem Gewebe, oder einer Zelle. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Aktivität des genannten Polypeptids 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% oder noch geringer als in der Kontrolle. In einer Ausführungsform findet im Wesentlichen keine oder besonders bevorzugt überhaupt keine Expression des genannten Polypeptids statt. Folglich umfassen diese Begriffe auch die vollständige Inhibierung oder Blockierung einer Aktivität, z.B. durch einen knock out eines Gens.
„Reduzierung", „reduzieren", "Verminderung" oder "vermindern", „Reprimierung" oder „reprimieren" umfasst die teilweise oder im Wesentlichen vollständige, auf unterschiedlichen zellbiologischen Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung der Funktionalität eines Proteins.
Eine Verminderung im Sinne der Erfindung umfasst auch eine mengenmäßige Verringerung eines Proteins bis hin zu einem im Wesentlichen vollständigen (d.h. fehlende Nachweisbarkeit von Aktivität bzw. Funktion oder fehlende immunologische Nachweisbarkeit des Proteins) oder vollständigen Fehlen des Proteins. Dabei wird die Expression eines bestimmten Proteins oder die Aktivität bzw. Funktion in einer Zelle oder einem Organismus bevorzugt um mehr als 50 %, besonders bevorzugt um mehr als 80 %, und insbesondere um mehr als 90% vermindert.
In einer weiteren Ausführungsform kann durch Expression eines für ein ARM1 Proteinkodierenden Nukleinsäuremoleküls, z.B. in Kombination mit einer gewebespezifischen Erhöhung der Aktivität eines Bax lnhibitor-1 Proteins, im Mesophyllgewebe erfolgen. Die Reduktion der Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Menge in einer transgenen Pflanze, die z.B. BI-1 im Mesophyllgewebe überexprimiert, bietet die Chance, eine vollständige und umfassende Pilzresistenz in der Pflanze zu generieren.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Polypeptidmenge, Aktivität oder Funktion des Bax Inhibitor 1-Proteins aus Hordeum vulgäre (Gevtäank Acc.-No.: AJ290421 ), aus Nlcotlana tabacum {GenBank Acc.-No.: AF390556), Reis (GenBank Acc.-No.: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: AB025927) bzw. Tabak und Raps (GenBank Acc.-No.: AF390555, Bolduc N et al. (2003) Planta 216:377-386) oder von ROR2 (z.b. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AY246906), SnAP34 (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AY247208) und/oder des Lumenal Binding Protein BiP z.B. aus Reis (GenBank Acc.-No. AF006825) kombiniert mit der Verminderung der Proteinmenge oder Aktivität oder Funktion der Proteine RacB (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.- No.: AJ344223), CSL1 (z.B. aus Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: NM116593), HvNa- OX (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AJ251717), und/oder MLO (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No. Z83834). Folglich wird in einer Ausführungsform mindestens eins der oben genannten zur Überexpression oder erhöhten Aktivität geeigneten Gene aktiviert oder überexprimiert und/oder mindestens eins der oben genannten zur Verminderung geeigneten Gene vermindert.
Eine Erhöhung der Expression kann wie hierin beschrieben erreicht werden. Unter Erhöhung der Expression oder Funktion wird hierein sowohl die Aktivierung oder Steige- rung der Expression oder Funktion des endogenen Proteins einschließlich einer de novo Expression als auch eine Erhöhung oder Steigerung durch die Expression eines transgenen Proteins oder Faktors verstanden.
„Organismus" im Rahmen der Erfindung meint „nicht humane Organismen" solange sich der Begriff auf einen lebensfähigen vielzelligen Organismus bezieht.
„Pflanzen" im Rahmen der Erfindung meint alle dicotyledonen oder monokyledonen Pflanzen. Bevorzugt sind Pflanzen die unter der Klasse der Liliatae (Monocotyledoneae bzw. einkeimblättrige Pflanzen) subsumiert werden können. Eingeschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut, Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
"Pflanze" umfasst auch einjährige und mehrjährige dicotyledone oder monokotyledone Pflanzen und schließt, beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, solche der Gattungen, Bromus, Asparagus, Pennisetum, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triti- cum, Sorghum und Saccharum ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren auf monokotyle Pflanzen, beispielsweise aus der Familie der Poaceae, besonders bevorzugt auf die Gattungen Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, und Saccharum, ganz besonders bevorzugt auf Pflanzen mit landwirtschaftlicher Bedeutung, wie z.B. Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Seeale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) oder Oryza sative (Reis) angewen- det.
„Epidermisgewebe" oder Epidermis meint die äußeren Gewebeschichten der Pflanzen. Sie kann ein- bis mehrschichtig sein; es gibt Epidermis-„angereicherte" Genexpression, wie z.b. Cer3 , die als Marker dienen kann; Hannoufa.A. (1996) Plant J. 10 (3), 459- 467.
Unter „Epidermis" versteht der Fachmann vorzugsweise das vorherrschende Abschlussgewebe primärer oberirdischer Pflanzenteile, so des Sprosses, der Blätter, Blüten, Früchte und Samen. Nach außen scheiden die Epidermiszellen eine wasserabsto- ßende Schicht, die Kutikula ab. Die Wurzeln sind von der Rhizodermis umgeben, welche der Epidermis in vieler Hinsicht ähnelt, jedoch auch markante Unterschiede zu ihr aufweist. Die Epidermis entsteht aus der äußersten Schicht des Apikaimeristems. Die Ableitung der Rhizodermis hingegen ist weniger klar. Je nach Art kann sie entwicklungsgeschichtlich entweder der Wurzelhaube oder der primären Rinde zugerechnet werden. Der Epidermis können zahlreiche Funktionen zugeschrieben werden: Sie bietet der Pflanze Schutz vor Austrocknung und regelt die Transpirationsrate Sie schützt die Pflanze vor den verschiedensten chemischen und physikalischen Fremdeinflüssen sowie vor Tierfraß und Befall durch Parasiten. Sie ist am Gasaustausch, an der Sekretion bestimmter Stoffwechselprodukte und an der Absorption von Wasser beteiligt. In ihr sind Rezeptoren für Licht und mechanische Reize enthalten. Sie wirkt damit als ein Signalwandler zwischen Umwelt und Pflanze. Entsprechend den verschiedenen Funk- tionen enthält die Epidermis eine Anzahl unterschiedlich differenzierter Zellen. Hinzu kommen artspezifische Varianten und unterschiedliche Organisation der Epidermen in den einzelnen Teilen einer Pflanze. Im Wesentlichen besteht sie aus drei Kategorien von Zellen: den "eigentlichen" Epidermiszellen, den Zellen der Stomata (Spaltöffnungen) und den Trichomen (griech.: Trichoma, Haar), epidermalen Anhangs- gebilden verschiedener Form, Struktur und Funktion.
Die "eigentlichen", d.h., die am wenigsten spezialisierten Epidermiszellen machen die Hauptmasse der Zellen des Abschlußgewebes aus. Sie sind in der Aufsicht entweder polygonal (von platten- oder tafelförmiger Gestalt) oder gestreckt. Die zwischen ihnen ausgebildeten Wände sind vielfach gewellt oder gebuchtet. Wodurch diese Form während der Entwicklung induziert wird, ist unbekannt, die vorliegenden Hypothesen erklären den Sachverhalt nur unbefriedigend. Gestreckte Epidermiszellen findet man an Organen oder Organteilen, die selbst gestreckt sind, so z.B. an Stengeln, Blattstielen und Blattrippen sowie an den Blättern der meisten Monokotyledonen. Ober- und Unter- seite von Blattspreiten können von unterschiedlich strukturierten Epidermen bedeckt sein wobei sowohl die Form der Zellen, die Dicke der Wände als auch die Verteilung und Zahl spezialisierter Zellen (Stomata und/oder Trichome) pro Flächeneinheit variieren kann. Große Variationen findet man auch innerhalb einzelner Familien, z. B. bei den Crassulaceen. Meist ist die Epidermis einschichtig, jedoch sind bei Arten aus meh- reren Familien (Moraceae: hier die meisten Ficus-Arten, Piperaceae: Peperonia [Pepe- ronie], Begoniaceae, Malvaceae u.a.) mehrschichtige wasserspeichernde Epidermen nachgewiesen worden. Epidermiszellen sondern nach außen eine Cutinschicht (Kutikula) ab, die als ein ununterbrochener Film alle epidermalen Oberflächen überzieht. Sie kann entweder glatt oder durch Vorwölbungen, Leisten, Falten und Furchen strukturiert sein. Doch nicht immer beruht eine durch Betrachtung der Oberfläche sichtbare Faltung der Kutikula auf der Ausbildung von Kutikularleisten. Es gibt durchaus Fälle, wo eine Kutikulafaltung nur der Ausdruck der darunterliegenden Ausstülpungen der Zellwand ist. Epidermale Anhangsgebilde verschiedener Form, Struktur und Funktion werden als Trichome bezeichnet und hierin ebenfalls unter dem Begriff „Epidermis" verstanden.. Sie treten als Schutz-, Stütz- und Drüsenhaare in
Form von Schuppen, verschiedenen Papillen und bei Wurzeln als absorbierende Haare auf. An ihrer Bildung sind allein Epidermiszellen beteiligt. Oft entsteht ein Trichom aus nur einer solchen Zelle, manchmal sind an der Entstehung mehrere beteiligt.
Ebenfalls umfasst unter dem Begriff „Epidermis" sind Papillen. Papillen sind Ausstül- pungen der Epidermisoberfläche. Das Lehrbuchbeispiel hierfür sind die Papillen auf Blütenoberflächen des Stiefmütterchens (Viola tricolor) sowie die Blattoberflächen vieler Arten im tropischen Regenwald. Sie verleihen der Oberfläche eine samtartige Konsistenz. Einige Zellen von Epidermen können als Wasserspeicher ausgebildet sein. Ein typisches Beispiel stellen die Blasenzellen an Oberflächen vieler Mittagsblumenarten und anderer Sukkulenten dar. Bei manchen Pflanzen, z.B. bei der Glockenblume (Campanula persicifolia) sind die Außenwände der Epidermis linsenförmig verdickt
Die Hauptmasse aller Gewebe bildet das Grundgewebe oder Parenchym. Zu den pa- renchymatischen Geweben gehört das Mesophyll, das in Blättern in Palisadenparenchym und Schwammparenchym differenziert sein kann. Folglich versteht der Fachmann unter Mesophyll ein parenchymatisches Gewebe. Parenchymati- sche Zellen sind durchweg lebend, meist isodiametrisch, seltener gestreckt. Das Mark der Sprosse, die Speichergewebe der Früchte, Samen, der Wurzel und anderer unterirdischer Organe sind ebenso als Parenchyme zu betrachten wie das Mesophyll. „Me- sophyllgewebe" meint das zwischen den Epidermisschichten liegende Blattgewebe, bestehend aus dem Palisadengewebe, dem Schwammgewebe und den Blattadern.
Das Mesophyll ist in den Blättern der meisten Farne und Phanerogamen, besonders ausgeprägt bei den Dikotyledonen und vielen Monokotyledonen, in Palisaden- und Schwammparenchym untergliedert. Ein "typisches" Blatt ist dorsiventral gebaut. Das Palisadenparenchym liegt dabei meist an der Blattoberseite unmittelbar unter der Epidermis. Das Schwammparenchym füllt den darunterliegenden Raum aus. Es ist von einem voluminösen Interzellularsystem durchsetzt, dessen Gasraum über die Spaltöffnungen in direktem Kontakt zur Außenwelt steht.
Das Palisadenparenchym besteht aus langgestreckten, zylindrischen Zellen. Bei einigen Arten sind die Zellen irregulär, gelegentlich sind sie gegabelt (Y-förmig: Armpalisadenparenchym). Solche Varianten kommen bei Farnen, Coniferen und einigen wenigen Angiospermen (z.B. bei einigen Ranunculaceen- und Caprifoliaceenarten [Beispiel: Holunder]) vor. Neben der eben beschriebenen, am weitesten verbreiteten Organisationsform sind die folgenden Varianten nachgewiesen worden: Palisadenparenchym an der Blattunterseite. Besonders auffällig bei Schuppenblättern. Beispiel: Lebensbaum (Thuja), sowie bei den Blättern des Bärlauchs (Allium ursinum)
Palisadenparenchym an beiden Blattseiten (Ober- und Unterseite). Häufig bei Pflanzen trockener Standorte (Xerophyten). Beispiel: Kompaßpflanze (Lactuca serriola); Ringförmig geschlossenes Palisadenparenchym: In zylindrisch organisierten Blättern und in Nadeln der Koniferen.
Die Variabilität der Schwammparenchymzellen und die Ausbildung des Schwammpa- renchyms selbst sind noch vielgestaltiger als die des Palisadenparenchyms. Es wird meist als Durchlüftungsgewebe bezeichnet, denn es enthält eine Vielzahl untereinander verbundener Interzellularen.
Das Mesophyll kann das so genannte Assimilationsgewebe umfassen, jedoch sind die Begriffe Mesophyll und Assimilationsgewebe nicht als Synonyme zu verwenden. Es gibt chloroplastenfreie Blätter, die sich in ihrem Aufbau nur unwesentlich von vergleichbaren, grünen Blättern unterscheiden. Folglich enthalten sie Mesophyll, doch eine Assimilation unterbleibt; umgekehrt findet eine Assimilation z.B. auch in Sproßabschnitten statt. Weitere Hilfsmittel zur Charakterisierung von Epidermis und Me- sophyll findet der Fachmann z.B. in v. GUTTENBERG, H.: Lehrbuch der Allgemeinen Botanik. Berlin: Akademie-Verlag 1955 (5. Aufl.), HABERLANDT, G.: Physiologische Pflanzenanatomie. Leipzig: W. Engelmann 1924 (6. Aufl.); TROLL, W.: Morphologie der Pflanzen. Band 1 : Vegetationsorgane. Berlin: Gebr. Borntraeger, 1937; TROLL, W. Praktische Einführung in die Pflanzenmorphologie. Jena: VEB G. Thieme Verlag 1954/1957; TROLL, W., HÖHN, K.: Allgemeine Botanik. Stuttgart: F. Enke Verlag, 1973 (4. Aufl.)
Folglich können Epidermis oder Epidmermiszellen histologisch oder biochemisch, einschließlich molekularbiologisch, charakterisiert werden. In einer Ausführungsform wird die Epidermis biochemisch charakterisiert. Die Epidermis kann in einer Ausführungsform durch die Aktivität eines oder mehrer der folgenden Promotoren gekennzeichnet werden:
WIR5 (=GstA1), acc. X56012, Dudler & Schweizer, unveröff. GLP4, acc. AJ310534; Wei.Y.; (1998) Plant Molecular Biology 36, 101-112.
GLP2a, acc. AJ237942, Schweizer.P., (1999). Plant J 20, 541-552.
Prx7, acc. AJ003141 , Kristensen BK, 2001. Molecular Plant Pathology, 2(6), 31 1-317
GerA, acc. AF250933 ; Wu S, 2000. Plant Phys Biochem 38, 685-698
OsROCI , acc. AP004656 RTBV, acc. AAV62708, AAV62707 ; Klöti, A, 1999, PMB 40, 249-266
Cer3; Hannoufa A (1996), Plant J. 10 (3), 459-467.
In einer anderen Ausführungsform wird die Epidermis dadurch gekennzeichnet, dass nur ein Teil der Promotoren aktiv ist, z.B. 2, 3, 5 oder 7 oder mehr, mindestens jedoch ist einer der oben aufgezählten aktiv. In einer Ausführungsform wird die Epidermis dadurch gekennzeichnet, dass alle genannten Promoter in dem Gewebe oder der Zelle aktiv sind. Folglich können Mesophyll oder Mesophyllzellen biochemisch einschließlich molekularbiologisch oder histologisch charakterisiert werden. In einer Ausführungsform wird das Mesophyll biochemisch charakterisiert. Das Mesophyll kann in einer Ausführungs- form durch die Aktivität eines oder mehrer der folgenden Promotoren gekennzeichnet werden:
PPCZmI (=PEPC); Kausch.A.P., (2001) Plant Mol. Biol. 45, 1-15
OsrbcS, Kyozuka et al PIaNT Phys: 1993 102: Kyozuka J, 1993. Plant Phys 102, 991- 1000
OsPPDK, acc. AC099041.
TaGF-2.8, acc. M63223; Schweizer.P., (1999). Plant J 20, 541-552.
TaFBPase, acc. X53957;.
TaWISI , acc. AF467542; US 200220115849 HvBISI , acc. AF467539; US 200220115849
ZmMISI , acc. AF467514; US 200220115849
HvPRI a, acc. X74939 ; Bryngelsson et al. Molecular Plant-Microbe Interactions (1994)
HvPRI b, acc. X74940; Bryngelsson et al. Molecular Plant-Microbe Interactions (1994)
HvB1 ,3gluc; acc. AF479647 HvPrxδ, acc. AJ276227; Kristensen et al MPP 2001 (siehe oben)
HvPAL, acc. X97313 ; Wei,Y.; (1998) Plant Molecular Biology 36, 101-1 12.
In einer anderen Ausführungsform wird das Mesophyll dadurch gekennzeichnet, dass nur ein Teil der Promotoren aktiv ist, z.B. 2, 3, 5 oder 7 oder mehr, mindestens jedoch einer der oben aufgezählten. In einer Ausführungsform wird das Mesophyll dadurch gekennzeichnet, dass alle genannten Promotoren in dem Gewebe oder der Zelle aktiv sind.
In einer Ausführungsform sind in der Epidermis einer erfindungsgemäß verwendeten oder hergestellten Pflanze oder einer erfindungsgemäßen Pflanze in der Epidermis und im Mesophyll alle genannten Promotoren aktiv. In einer Ausführungsform sind nur ein Teil der genannten Promotoren aktiv, z.B. 2, 5, 7 oder mehr, mindestens ist jedoch einer der oben aufgezählten Promotoren jeweils aktiv.
„Nukleinsäuren" meint Biopolymere aus Nukleotiden, die über Phosphodiesterbindun- gen miteinander verknüpft sind (Polynukleotide, Polynukleinsäuren). Je nach dem Zuckertyp in den Nukleotiden (Ribose oder Desoxyribose), unterscheidet man zwischen den beiden Klassen der Ribonukleinsäuren (RNA) und den Desoxyribonukleinsäuren (DNA).
Der Begriff „Ernte" meint alle durch landwirtschaftlichen Anbau von Pflanzen gewonnenen und im Rahmen des Erntevorgangs gesammelten Pflanzenteile. "Resistenz" meint das Verhindern, das Reprimieren, das Vermindern oder Abschwächen von Krankheitssymptomen einer Pflanze infolge eines Befalls durch ein Pathogen. Die Symptome können vielfältiger Art sein, umfassen aber bevorzugt solche, die direkt oder indirekt zu einer Beeinträchtigung der Qualität der Pflanze, der Quantität des Ertrages, der Eignung zur Verwendung als Futter- oder Nahrungsmittel führen oder aber auch Aussaat, Anbau, Ernte oder Prozessierung des Erntegutes erschweren.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die folgenden Krankheitssymptome abgeschwächt, vermindert oder verhindert: Bildung von Pusteln und Sporenlagern auf den Oberflächen der befallenen Gewebe, Mazeration der Gewebe, spreitende Nekrosen des Gewebes, Akkumulation von Mykotoxinen, z.B. aus Fusarium graminearum oder F. culmorum, Penetration der Epidermis und/oder des Mesophylls, usw.
"Verleihen", "Bestehen", "Erzeugen" oder "Erhöhen" einer Pathogenresistenz oder Ähnliches meint, dass die Abwehrmechanismen einer bestimmten Pflanze oder in einem Teil einer Pflanze, z.B. in einem Organ, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Orga- nell durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu einer geeigneten Kontrolle, z.B. dem Wildtyp der Pflanze („Kontrollpflanze", „Ausgangspflan- ze"), auf den das erfindungsgemäße Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonsten gleichen Bedingungen (wie beispielsweise Klima- oder Anbaubedingungen, Patho- genart etc.) eine erhöhte Resistenz gegen ein oder mehr Pathogene aufweist. Vorzugsweise besitzen in einer Pflanze mindestens die Epidermis und/oder Mesophyl- Gewebe oder die Organe, die ein Epidermis- und/oder Mesophyl-Gewebe besitzen, eine erhöhte Resistenz gegen das oder die Pathogen(e). Beispielsweise ist die Resistenz in den Blättern erhöht.
In einer Ausführungsform wird die Resistenz in Lemma (Deckspelze), Palea (Vorspelze), und/oder Glume (Antherenanlage) erhöht.
Folglich wird in einer Ausführungsform in den vorgenannten Organen und Geweben die Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins Armadillo-repeat ARM1 vermindert.
Dabei äußert sich die erhöhte Resistenz bevorzugt in einer verminderten Ausprägung der Krankheitssymptome, wobei Krankheitssymptome - neben den oben erwähnten Beeinträchtigungen - auch beispielsweise die Penetrationseffizienz eines Pathogens in die Pflanze oder pflanzliche Zelle oder die Proliferationseffizienz in oder auf denselben umfasst. Veränderungen in der Zellwandstruktur können beispielsweise einen grundlegenden Mechanismus der Pathogenresistenz darstellen, wie z.B. gezeigt in Jacobs AK et al. (2003) Plant Cell, 15(11 ):2503-13.
Vorliegend sind die Krankheitssymptome bevorzugt um mindestens 10 % oder mindestens 20 %, besonders bevorzugt um mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt um mindestens 90 % oder 95 % oder mehr vermindert.
"Pathogen" meint im Rahmen der Erfindung Organismen, deren Interaktionen mit einer Pflanze zu den oben beschriebenen Kranheitssymptomen führen, insbesondere meint Pathogene Organismen aus dem Reich der Pilze. Vorzugsweise wird unter Pathogen ein Epidermis- bzw. Mesophyllzellen- penetrierendes Pathogen verstanden, besonders bevorzugt Pathogene, die über Spaltöffnungen in Pflanzen eindringen und anschließend Mesophyllzellen penetrieren. Bevorzugt sind dabei Organismen der Stämme Ascomycota und Basidomycota genannt. Besonders bevorzugt sind dabei die Familien Blumeriaceae, Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae und Hypocreaceae.
Besonders bevorzugt sind Organismen dieser Familien, die zu den Gattungen Blumeria, Puccinia, Fusarium oder Mycosphaerella zählen.
Ganz besonders bevorzugt sind die Arten Blumeria graminis, Puccinia triticina, Puccinia striiformis, Mycosphaerella graminicola, Stagonospora nodorum, Fusarium grami- nearum, Fusarium culmorum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae und Microdochium nivale.
Es ist jedoch anzunehmen, dass die Verminderung der Expression von HvARM, seiner Aktivität oder Funktion auch eine Resistenz gegen weitere Pathogene bewirkt. Besonders bevorzugt sind Ascomycota wie z.B. Fusarium oxysporum (Fusarium-Welke an Tomate), Septoria nodorum und Septoria tritici (Spelzenbräune an Weizen), Basidi- omyceten wie z.B Puccinia graminis (Schwarzrost an Weizen, Gerste, Roggen, Hafer), Puccinia recondita (Braunrost an Weizen), Puccinia dispersa (Braunrost an Roggen), Puccinia hordei (Braunrost an Gerste), Puccinia coronata (Kronenrost an Hafer),
In bevorzugten Ausführungsformen führt das erfindungsgemäße Verfahren zu einer Resistenz bei
Gerste gegen das Pathogen:
Puccinia graminis f.sp. hordei (barley stem rust), Blumeria graminis f.sp. hordei
(Gerstenmehltau, Bgh);
bei Weizen gegen die Pathogene:
Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Blumeria graminis f.sp. tritici (Gers- tenmehltau, Bgt) oder Puccinia graminis f.sp. tritici (Wheat stem rust),
bei Mais gegen die Pathogene: Fusarium moniliforme var. subglutinans, Puccinia sorghi oder Puccinia polysora,
bei Sorghum gegen die Pathogene:
Puccinia purpurea, Fusarium monilifonne, Fusarium graminearum oder Fusarium oxysporum.
bei Soja gegen die Pathogene
Phakopsora pachyrhizi und Phakopsora meibromae.
"Armadillo Repeat Arm1 Polypeptid" oder "Armadillo Repeat ARM1 Protein" oder „Arm" oder „Arm1 " und deren Abwandlungen meint im Rahmen der Erfindung ein Protein mit einem oder mehr Armadillo repeats..
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Armadillo- Repeat ARM1 Polypeptid, dass die in den Beispielen gezeigte Aktivität hat. In einer Ausführungsform wird unter einem Armadillo Repeat ARM1 Protein ein Protein verstanden mit einer Homologie zu einer der in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 oder in den Figuren gezeigten Aminosäuresequenz, z.B ein Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptid aus Gerste (HvARM) gemäß SEQ ID NO: 2 und/oder aus Reis (Oryza sative) gemäß SEQ ID NO: 4, 6, 8, und/oder 10, und/oder aus Tabak (Nicotiana tabacum) gemäß SEQ ID NO.: 12 und/oder aus A.thaliana gemäß SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, und/oder 44, oder gemäß einer der Consensussequenzen gemäß SEQ ID NO.: 60, 61 oder 62 oder ein funktionelles Fragment davon. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung funktionelle Äquivalente der vorgenannten Polypeptidsequenzen.
"Polypeptidmenge" meint beispielsweise Molekülzahl oder Mol an Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptidmolekülen in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment. "Verminderung" der Polypeptidmenge meint die molare Ver- minderung der Anzahl an Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptiden, insbesondere der in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 gezeigten, in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment - beispielsweise durch eines der unten beschriebenen Verfahren - im Vergleich zu einer geeigneten Kontrolle, z.B. dem Wildtyp (Kontrollpflanze) derselben Gattung und Art auf den dieses Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonst gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter der Pflanzen etc.). Die Verminderung beträgt dabei mindestens 5 %, bevorzugt mindestens 10 % oder mindestens 20 %, besonders bevorzugt mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt mindestens 90 %, 95 % oder 99 %, und insbesondere 100 %. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Erzeugung einer Patho- genresistenz durch Verminderung der Funktion oder Aktivität eines Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptids umfassend die Sequenzen gezeigt in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 oder eines Homo- logs davon und/oder eines Polypeptids, das zu diesen eine Homologie von mindestens 40% aufweist und/oder eines funktionellen Äquivalentes der vorgenannten Polypeptide.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die Identität der Nuklein- säuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10 Average Mismatch: 0
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz ver- standen, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.
Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 8 Length Weight: 2
Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2,003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Polypeptidbasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in der Pflanze oder in einem Teil einer Pflanze, z.B. in einem pflanzlichen Organ, pflanzlichen Gewebe, einer pflanzlichen Zelle, oder einem Teil einer pflanzlichen Zelle, z.B. einem pflan- zenspezifischen Organell, die Armadillo-Repeat ARM1 Protein Aktivität, Funktion oder Polypeptidmenge reduziert.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Aktivität eines Polypeptids enthaltend mindestens ein, vorzugsweise zwei oder mehr Armadillo re- peats reduziert.
In einer Ausführungsform besitzt das Polypeptid, das in einer Pflanze oder in einem Teil der Pflanze vermindert ist, keine U box im 5'-UTR.
Unter „Armadillo repeat" wird eine Sequenz verstanden die tandemartig angeordnete Kopien einer degenerierten Sequenz von ca. 42 Aminosäuren enthält, welche eine drei-dimensionale Struktur zur Vermittlung von Protein-Protein-Interaktionen kodiert (Azevedo et al. (2001 ) Trends Plant Sei. 6, 354-358). Beispielsweise hat das Polypep- tid, das im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, oder das erfindungsgemäße Polypeptid eine Aktivität, die in die intrazelluläre Signaltransduktion oder in die Regulation der Genexpression im Rahmen zellulärer Entwicklungsprozesse involviert ist.
Das Armadillo-Repeat ARM1 Protein wird beispielsweise kodiert von einem Nuklein- säuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, das die in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 ge- zeigte Sequenz umfasst;
b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz nach der SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 umfaßt;
c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu den Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 aufweist;
d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein funktionelle Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 kodiert;
e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremo- leküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird; und
f) Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäu- remolekül gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente bestehend aus mindestens 15 Nukleotiden (nt), vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt hybridisiert;
g) Nukleinsäuremolekül, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nuklein- säuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungs-bedingungen isoliert werden kann;
oder eine komplementäre Sequenz davon umfasst, oder ein funktionelles Äquivalent davon darstellt.
Erfindungsgemäß wird die Aktivität der genannten Polypeptide in einer Pflanze oder einem Teil einer Pflanze, vorzugsweise in den Epidermis- und/oder Mesophyllzellen einer Pflanze, wie oben erläutert, reduziert.
In einer Ausführungsform wird die Aktivität von ARM1 in Lemma, Palea und/oder GIu- me vermindert.
Unter Εpitop" versteht man die die Spezifität der Antikörper bestimmenden Bereiche eines Antigens (die antigene Determinante).
Ein Epitop ist demnach der Teil eines Antigens, der tatsächlich mit dem Antikörper in Kontakt tritt.
Solche antigenischen Determinaten sind die Bereiche eines Anitgens, auf welches die T-ZeII Rezeptoren reagieren und in der Folge Antikörper produzieren, die spezifisch die Antigene- Determinante/ das Epitop eines Antigens binden. Antigene bzw. deren Epi- tope sind demnach in der Lage, die Immunantwort eines Organismus mit der Folge der Bildung spezifischer - gegen das Epitop gerichteter - Antikörper zu induzieren. Epitope bestehen z.B. aus linearen Abfolgen von Aminosäuren in der Primärstruktur von Prote- inen, oder aus komplexen sekundären oder tertiären Proteinstrukturen. Unter einem Hapten versteht man ein aus dem Kontext der Antigenumgebung herausgelöstes Epitop. Obwohl Haptene per Definition einen Antikörper gegen sich gerichtet haben, sind Haptene unter Umständen nicht in der Lage nach z.B. Injektion in einen Organismus eine Immunantwort zu induzieren. Zu diesem Zweck werden Haptene an Trägermole- küle gekoppelt. Als Beispiel sei Dinitrophenol (DNP) genannt, welches nach Kopplung an BSA (bovine serum albumine) zur Herstellung von Antikörpern gerichtet gegen DNP verwendet wurde. (Bohn, A., König, W. 1982). Haptene sind daher insbesondere (oft niedermolekulare bzw. kleine) Substanzen, die selbst keine Immunreaktion auslösen, aber sehr wohl, wenn sie an einen großmolekularen Träger gekoppelt wurden.
Unter den so erzeugten Antikörpern finden sich auch solche, die das Hapten alleine binden können.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper gegen ein hierin charakterisiertes Polypeptid, insbesondere einen monoklonalen Antikörper der ein Polypeptid bindet, das eine AA-Sequenz umfasst oder daraus besteht gemäß den Sequenzen, die in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 gezeigt sind.
Antikörper im Rahmen der vorliegenden Erfindung können zur Identifikation und Isolierung von erfindungsgemäß offenbarten Polypeptiden aus Organismen, bevorzugt Pflanzen, besonders bevorzugt monokotyledonen Pflanzen, verwendet werden. Die Antikörper können sowohl monoklonal, polyklonal, als auch synthetischer Natur sein, oder aus Antikörperfragmenten wie Fab, Fv oder scFv Fragmenten bestehen, die durch proteolytischen Abbau entstehen. "Single chain" Fv (scFv) Fragmente sind einkettige Fragmente, die verbunden über eine flexible Linkersequenz nur die variablen Bereiche der schweren und leichten Antikörperketten enthalten. Solche scFv Fragmente können auch als rekombinante Antikörperderivate produziert werden. Eine Präsentation solcher Antikörperfragmente auf der Oberfläche filamentöser Phagen ermöglicht die direk- te Selektion hochaffin bindender scFv-Moleküle aus kombinatorischen Phagenbiblio- theken.
Monoklonale Antikörper können gemäß der von Köhler und Milstein beschriebenen Methode gewonnen werden (Nature 256 (1975), 495).
"Funktionelle Äquivalente" eines Armadillo-Repeat ARM1 Proteins meint bevorzugt solche Polypeptide, die zu den durch die Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 beschriebenen Polypeptiden eine Homologie von mindestens 40% aufweisen und im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften aufweisen oder Funktionen besitzen. Vorzugsweise beträgt die Homologie 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, besonders bevorzugt 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr.
Funktionelle Äquivalenz kann zum Beispiel durch Vergleich der Phänotypen von Test- Organismen nach Expression der jeweiligen Polypeptide unter möglichst identischen Bedingungen bestimmt werden oder nach Reduzierung der Expression oder Aktivität der zu vergleichenden Polypeptide in den jeweiligen Ursprungsorganismen. "Im Wesentlichen gleiche Eigenschaften" eines funktionellen Äquivalentes meint vor allem die Verleihung eines pathogenresistenten Phänotypes oder die Verleihung oder Steigerung der Pathogenresistenz gegen zumindest ein Pathogen bei Verminderung der Polypeptidmenge, Aktivität oder Funktion des besagten funktionellen Armadillo- Repeat ARM1 Protein Äquivalentes in einer Pflanze, Organ, Gewebe, Teil oder Zellen, insbesondere in Epidermis- oder Mesophyllzellen derselben, vorzugsweise gemessen an der Penetrationseffizienz eines Pathogens wie in den Beispielen gezeigt.
"Analoge Bedingungen" bedeutet, dass alle Rahmenbedingungen wie beispielsweise Kultur- oder Zuchtbedingungen, Assaybedingungen (wie Puffer, Temperatur, Substrate, Pathogenkonzentration etc.) zwischen den zu vergleichenden Versuchen im Wesentlichen identisch gehalten werden und die Ansätze sich allein durch die Sequenz der zu vergleichenden Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptide, ihrem Ursprungs- Organismus und gegebenenfalls dem Pathogen unterscheiden.
"Funktionelle Äquivalente" meint auch natürliche oder künstliche Mutationsvarianten der Armadillo-Repeat ARM 1 Polypeptide gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 sowie homologe Polypeptide aus anderen monokotyledonen und dikotyledonen Pflanzen, welche weiterhin im Wesentlichen gleiche Eigenschaften aufweisen. Bevorzugt sind homologe Polypeptide aus hierin beschriebenen bevorzugten Pflanzen. Die zu den im Rahmen dieser Erfindung offenbarten Armadillo-Repeat ARM1 Proteinsequenzen homologen Sequen- zen aus anderen Pflanzen können z.B. durch Datenbanksuche oder Durchmustern von Gen-Banken - unter Verwendung der Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Sequenzen als Suchsequenz bzw. Sonde - leicht aufgefunden werden.
Funktionelle Äquivalente können z.B. auch von einem der erfindungsgemäßen PoIy- peptide gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitet sein und zu diesen Polypeptiden eine Homologie von mindestens 40 %, 50 , 60 %, bevorzugt mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 98 % aufweisen und zeichnen sich durch im Wesentlichen gleiche funktionelle Eigenschaften wie die Polypeptide gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 oder 62 aus.
Funktionelle Äquivalente sind auch jene von den erfindungsgemäßen Nukleinsäurese- quenzen gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitete Nuklein- säuremoleküle, und haben eine Homologie von mindestens 40 %, 50 , 60 %, bevorzugt 80 %, vorzugsweise mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 98 % zu einem der erfindungsgemäßen Polynukleotide gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 und kodieren für Polypeptide mit im Wesentlichen identischen funk- tionellen Eigenschaften wie Polypeptide gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62.
Beispiele für die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu vermindernden funktionellen Äquivalente der Armadillo-Repeat ARM1 Proteine gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 lassen sich beispielsweise aus Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Homologievergleiche aus Datenbanken auffinden.
Auch die Durchmusterung von cDNA- oder genomischen Bibliotheken anderer Orga- nismen, bevorzugt von den weiter unten genannten als Wirt zur Transformation geeigneten Pflanzenarten, unter Verwendung der unter SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 beschriebene Nukleinsäure- sequenzen oder Teilen derselben als Sonde, ist ein dem Fachmann geläufiges Verfahren, um Homologe in anderen Arten zu identifizieren. Dabei haben die von der Nuk- leinsäuresequenz gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 abgeleiteten Sonden eine Länge von mindestens 20 bp, bevorzugt mindestens 50 bp, besonders bevorzugt mindestens 100 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 bp, am meisten bevorzugt mindestens 400 bp. Die Sonde kann auch ein oder mehrere Kilobasen lang sein, z.b. 1 Kb, 1 ,5 Kb oder 3 Kb. Für die Durchmusterung der Bibliotheken kann auch ein zu den unter SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 beschriebenen Sequenzen komplementärer DNA-Strang, oder ein Fragment desselben mit einer Länge zwischen 20 bp und mehreren Kilobasen eingesetzt werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können auch solche DNA Moleküle verwendet werden, die unter Standardbedingungen mit den durch SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 beschriebenen und für Armadillo-Repeat ARM 1 Proteine kodierenden Nukleinsäuremoleküle, der zu diesen komplementären Nukleinsäuremolekülen oder Teilen der vorgenannten hybridisieren und als vollständige Sequenzen für Polypeptide kodieren, die im Wesentlichen über die gleichen Eigenschaften, bevorzugt funktionellen Eigenschaften, wie die unter SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 beschriebenen Polypeptide verfügen.
"Standardhybridisierungsbedingungen" ist breit zu verstehen und meint je nach Anwendung stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Bio- logy, John Wiley &Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Der Fachmann wird aus seinem Fachwissen heraus Hybridisierungsbedingungen auswählen, die es ihm ermöglichen, spezifische von unspezifischen Hybridisierungen zu unterscheiden.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus Bedingungen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (2OX SSC: 0,3M Natriumeitrat, 3M NaCI, pH 7.0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben wer- den. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig oder auch einzeln variiert werden, wobei der jeweils andere Parameter konstant gehalten wird. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige bevorzugte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind nachstehend angegeben:
(1) Hybridisierungbedingungen können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
a) 4X SSC bei 65°C, b) 6X SSC bei 45°C, c) 6X SSC, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Fischsperma-DNA bei 68°C, d) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierter, Lachssperma-DNA bei 68°C, e) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma- DNA, 50 % Formamid bei 42°C. f) 50 % Formamid, 4XSSC bei 42°C, oder g) 50 % (vol/vol) Formamid, 0,1 % Rinderserumalbumin, 0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCI, 75 mM Natriumeitrate bei 42°C, oder h) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), i) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung). j) 500 mN Natriumphosphatpuffer pH 7,2, 7% SDS (g/V), 1 mM EDTA, 10μg/ml Single stranded DNA, 0,5% BSA (g/V) (Church und Gilbert, Geno- mic sequencing. Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A.81 :1991. 1984) (2) Waschschritte können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
a) 0,015 M NaCI/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % SDS bei 50°C. b) 0.1X SSC bei 65°C. c) 0,1 X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C. d) 0,1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C. e) 0,2X SSC, 0,1 % SDS bei 42°C. f) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).
In einer Ausführungsform werden die Hybridisierungsbedingungen wie folgt gewählt:
Es wird ein Hybridisierungspuffer gewählt, der Formamid, NaCI und PEG 6000 enthält. Die Anwesenheit von Formamid im Hybridisierungspuffer destabilisiert Doppelstrang- Nukleinsäuremoleküle, wodurch die Hybridisierungstemperatur auf 42°C gesenkt werden kann, ohne dadurch die Stringenz zu erniedrigen. Die Verwendung von Salz im Hybridisierungspuffer erhöht die Renaturierungsrate einer Duplex-DNA, bzw. die Hybridisierungseffizienz. Obwohl PEG die Viskosität der Lösung erhöht, was einen negativen Einfluß auf Renaturierungsraten besitzt, wird durch die Anwesenheit des Polymers in der Lösung die Konzentration der Sonde im verbleibenden Medium erhöht, was die Hybridisierungsrate steigert. Die Zusammensetzung des Puffers ist:
I Hybridisierungspuffer 250 mM Natriumphosphat-Puffer pH 7,2 1 mM EDTA 7 % SDS (g/v) 250 mM NaCI 10 μg/ml ssDNA
5 % Polyethylenglykol (PEG) 6000 40 % Formamid
Die Hybridisierungen werden bei 42°C über Nacht durchgeführt. Die Filter werden am nächsten Morgen 3x mit 2χSSC + 0,1 % SDS für jeweils ca. 10 min. gewaschen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Erhöhung der Resistenz in dem erfindungs-gemäßen Verfahren, dadurch erzielt, dass
(a) die Expression mindestens eines Armadillo-Repeat ARM1 Proteins reduziert wird;
(b) die Stabilität mindestens eines Armadillo-Repeat ARM1 Proteins oder der zu diesem Armadillo-Repeat ARM1 Proteins korrespondierenden mRNA Moleküle reduziert wird;
(c) die Aktivität mindestens eines Armadillo-Repeat ARM1 Proteins reduziert wird; (d) die Transkription mindestens eines der für ein Armadillo-Repeat ARM1 Proteins kodierenden Gene durch Expression eines endogenen oder artifiziellen Transkriptions-Faktors reduziert wird; oder
(e) ein exogener die Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Aktivität reduzierender Faktor zu der Nahrung oder dem Medium hinzugegeben wird.
„Genexpression" und „Expression" sind synomym zu verwenden und meinen das Realisieren der Information, die in einem Nukleinsäuremolekül gespeichert ist. Die Verminderung der Expression eines Gens umfaßt daher die Reduktion der Polypeptidmenge des codierten Proteins, z.B. des Armadillo-Repeat ARM 1 -Polypeptids oder der Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Funktion. Die Reduktion der Genexpression eines Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Gens kann auf vielfältige Art und Weise -beispielsweise durch eine der unten aufgeführten Methoden- realisiert werden.
"Reduktion", „Verminderung" oder "vermindern" ist im Zusammenhang mit einem Armadillo-Repeat ARM1 Proteins oder Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Funktion weit auszulegen und umfasst die teilweise oder im Wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung der Funktionalität eines Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptids in einer Pflanze oder ei- nem davon abgeleiteten Teil, Gewebe, Organ, Zellen oder Samen.
Eine Verminderung im Sinne der Erfindung umfasst auch eine mengenmäßige Verringerung eines Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptids bis hin zu einem im Wesentlichen vollständigen Fehlen des Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptids (d.h. fehlende Nach- weisbarkeit von Armadillo-Repeat ARM1 Protein Funktion oder fehlende immunologische Nachweisbarkeit des Armadillo-Repeat ARM1 Proteins). Dabei wird die Expression eines bestimmten Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptids oder die Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Funktion in einer Zelle oder einem Organismus bevorzugt um mehr als 50 %, besonders bevorzugt um mehr als 80 %, ganz besonders bevorzugt um mehr als 90%, im Vergleich zu einer geeigneten Kontrolle, d.h. zu dem Wildtyp desselben Typs, z.B. derselben Gattung, Art, Sorte, Kultivar etc. („Kontrollpflanze") auf den dieses Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonsten im Wesentlichen gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter der Pflanzen etc.), vermindert.
Erfindungsgemäß sind verschiedene Strategien zur Verminderung der Expression eines Armadillo-Repeat ARM1 Protein oder Armadillo-Repeat ARM1 Protein- Funktion beschrieben. Der Fachmann erkennt, dass eine Reihe weiterer Methoden zur Verfügung stehen, um die Expression eines Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptids oder die Armadillo-Repeat ARM1 Protein- Funktion in der gewünschten Weise zu beeinflussen. In einer Ausführungsform wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Verminderung der Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Funktion erreicht durch Anwendung mindestens eines Verfahrens aus der Gruppe ausgewählt aus:
a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für Ribonukleinsäuremoleküle geeignet zur Bildung von Doppelstrang-Ribonukleinsäuremolekülen (dsRNA), wobei der Sense-Strang des dsRNA-Moleküls mindestens eine Homologie von 30% zu dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, beispielsweise zu einem der Nukleinsäuremoleküle gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 oder codierend für eine Consesnusse- quenz wie gezeigt in SEQ ID NO.: 60, 61 , oder 62 aufweist oder ein Fragment von mindestens 17 Basenpaaren umfasst, welches mindestens eine 50% Homologie zu einem erfindungsgemäßen Nukleinsäure-molekül, beispielsweise gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 oder codierend für eine Consenussequenz wie gezeigt in SEQ ID
NO.: 60, 61 , oder 62 oder einem funktionellen Äquivalent derselben aufweist, oder einer deren Expression gewährleistende Expressions-kassette oder Expressionskassetten.
b) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein Antisense-Ribonuklein- säuremolekül welches zumindest eine Homologie von 30% zum nicht kodierenden Strang eines der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, beispielsweise einem Nukleinsäuremolekül gemäß S SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 oder codierend für eine Conse- nussequenz wie gezeigt in SEQ ID NO.: 60, 61 , oder 62 aufweist oder ein Fragment von mindestens 15 Basenpaaren umfasst, welches mindestens eine 50% Homologie zu einem nicht kodierenden Strang eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, beispielsweise gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 oder codierend für eine Consenussequenz wie gezeigt in SEQ ID NO.: 60, 61 , oder 62oder einem funktionellen Äquivalent derselben aufweist. Umfasst sind solche Verfahren, bei denen die antisense-Nukleinsäuresequenz gegen ein Armadillo-Repeat ARM1 Protein- Gen (also genomische DNA-Sequenzen) oder ein Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Gentranskript (also RNA-Sequenzen) gerichtet ist. Umfasst sind auch α- anomere Nukleinsäuresequenzen.
c) Einbringen eines Ribozyms welches spezifisch die von einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, beispiels-weise gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 oder codierend für eine Consenussequenz wie gezeigt in SEQ ID NO.: 60, 61 , oder 62 oder von deren funktionellen Äquivaltenten kodierten Ribonukleinsäure-moleküle spaltet, z.B. ka- talytisch, oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressions-kassette. d) Einbringen eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls wie in b) spezifiziert, kombiniert mit einem Ribozym oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette.
e) Einbringen von Nukleinsäuremolekülen kodierend für Sense- Ribonukleinsäuremoleküle eines erfindungsgemäßen Polypeptides, beispielsweise gemäß den Sequenzen SEQ ID SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 für Polypeptide, die zumin- dest eine 40% Homologie zu der Aminosäure-sequenz eines erfindungsgemäßen
Proteins aufweisen, oder ein funktionelles Äquivalent desselben darstellt.
f) Einbringen einer Nukleinsäuresequenz kodierend für ein dominant-negatives Polypeptid geeignet zur Unterdrückung der Armadillo-Repeat ARM1 Protein- Funktion oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette.
g) Einbringen eines Faktors, der spezifisch Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptide oder die für diese kodierenden DNA- oder RNA-Moleküle binden kann oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette.
h) Einbringen eines viralen Nukleinsäuresmoleküls, das einen Abbau von für Armadillo-Repeat ARM1 Protein kodierende mRNA Moleküle bewirkt oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette.
i) Einbringen eines Nukleinsäurekonstrukts geeignet zur Induktion einer homologen Rekombination an Genen kodierend für Armadillo-Repeat ARM1 Protein.
j) Einführung einer oder mehrerer Mutationen in ein oder mehr für Armadillo-Repeat
ARM1 Proteine kodierende Gene zur Erzeugung eines Funktionsverlustes (z.B. Generierung von Stopp-Kodons, Verschiebungen im Leseraster etc.)
Jedes einzelne dieser Verfahren kann eine Verminderung der Armadillo-Repeat ARM1 Protein Expression oder Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Funktion im Sinne der Erfindung bewirken. Auch eine kombinierte Anwendung ist denkbar. Weitere Methoden sind dem Fachmann bekannt und können die Behinderung oder Unterbindung der Prozessierung des Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptids, des Transports des Armadillo- Repeat ARM1 Polypeptids oder dessen mRNA, Hemmung der Ribosomenanlagerung, Hemmung des RNA-Spleißens, Induktion eines Armadillo-Repeat ARM 1 Protein RNA abbauenden Enzyms und/oder Hemmung der Translationselongation oder -termination umfassen. Eine Verminderung der Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Funktion oder - Polypeptidemenge wird bevorzugt durch eine verminderte Expression eines endogenen Armadillo-Repeat ARM1 Protein Gens erreicht.
Die einzelnen bevorzugten Verfahren sind nachstehend kurz beschrieben:
a) Einbringung einer doppelsträngigen Armadillo-Repeat ARM1 Protein RNA- Nukleinsäuresequenz (Armadillo-Repeat ARM1 Protein dsRNA)
Das Verfahren der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ("double-stranded RNA interference"; dsRNAi) ist vielfach in tierischen und pflanzlichen Organismen beschrieben (z.B. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43:401-415; Fire A. et al (1998) Na- ture 391 :806-81 1 ; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Eine effiziente Gensuppression kann auch bei transienter Expression oder nach transienter Transformation beispielsweise infolge einer biolistischen Transformation gezeigt werden (Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). dsRNAi-Verfahren beruhen auf dem Phänomen, dass durch gleichzeitiges Einbringen von komplementären Strang- und Gegenstrang eines Gentranskrip- tes eine hocheffiziente Unterdrückung der Expression des entsprechenden Gens be- wirkt wird. Der bewirkte Phänotyp kommt dem einer entsprechenden knock-out Mutanten sehr nahe (Waterhouse PM et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95:13959-64).
Das dsRNAi-Verfahren hat sich bei der Verminderung der Protein-Expression als besonders effizient und vorteilhaft erwiesen (WO 99/32619).
In Bezug auf die doppelsträngigen RNA-Moleküle meint Armadillo-Repeat ARM1 Pro- tein-Nukleinsäuresequenz bevorzugt eine der Sequenzen gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 oder codierend für eine Consenussequenz wie gezeigt in SEQ ID NO.: 60, 61 , oder 62 oder Se- quenzen, die zu diesen im Wesentlichenidentisch sind, vorzugsweise mindestens 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% oder mehr, beispielsweise ungefähr 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr, oder Fragmente davon, die mindestens 17 Basenpaare lang sind. "Im Wesentlichen identisch" meint hier, dass die dsRNA Sequenz auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu der Armadillo-Repeat ARM1 Protein Zielsequenz aufweisen kann und dennoch eine effizient Verminderung der Expression bewirkt. In einer Ausführungsform beträgt die Homologie nach obiger Definition mindestens 50 %, beispielsweise ungefähr 80 %, oder ungefähr 90 %, oder ungefähr 100 % zwischen dem "sense"-Strang einer inhibitorischen dsRNA und einem Teilabschnitt einer Armadillo-Repeat ARM1 Protein Nukleinsäuresequenz (bzw. zwi- sehen dem "antisense"-Strang und dem komplementären Strang einer Armadillo- Repeat ARM1 Protein Nukleinsäuresequenz). Die Länge des Teilabschnittes beträgt ungefähr 17 Basen oder mehr, beispielsweise ungefähr 25 Basen, oder ungefähr 50 Basen, ungefähr 100 Basen, ungefähr 200 Basen oder ungefähr 300 Basen. Alternativ, kann eine "im Wesentlichen identische" dsRNA auch als Nukleinsäuresequenz definiert werden, die befähigt ist, mit einem Teil eines Armadillo-Repeat ARM1 Protein Gentranskriptes unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren.
Auch der "antisense"-RNA-Strang kann Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu dem Komplement des "sense"-RNA-Stranges aufweisen. Bevorzugt beträgt die Homologie mindestens 80 %, beispielsweise ungefähr 90 %, oder ungefähr 95 %, oder ungefähr 100% zwischen dem "antisense"-RNA-Strang und dem Komplement des "sense"-RNA-Strangs.
"Teilabschnitt des "sense"-RNA-Transkriptes" eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptid oder ein funktionelles Äquivalent desselben meint Fragmente einer RNA oder mRNA transkibiert von einer für ein Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptid oder ein funktionelles Äquivalent desselben kodierenden Nukleinsäuremoleküls, bevorzugt von einem Armadillo-Repeat ARM 1 Protein Gen. Dabei haben die Fragmente bevorzugt eine Sequenzlänge von ungefähr 20 Basen oder mehr, beispielsweise ungefähr 50 Basen, oder ungefähr 100 Basen, oder ungefähr 200 Basen, oder ungefähr 500 Basen. Umfasst ist auch die vollständige transkribierte RNA oder mRNA.
Die dsRNA kann aus einem oder mehreren Strängen polymerisierter Ribonukleotide bestehen. Es können ferner Modifikationen sowohl des Zucker-Phosphat-Gerüstes als auch der Nukleoside vorliegen. Beispielsweise können die Phosphodiesterbindungen der natürlichen RNA dahingehend modifiziert sein, dass sie zumindest ein Stickstoff oder Schwefel-Heteroatom umfassen. Basen können dahingehend modifiziert werden, dass die Aktivität beispielsweise von Adenosindeaminase eingeschränkt wird. Solche und weitere Modifikationen sind weiter unten bei den Verfahren zur Stabilisierung von antisense-RNA beschrieben.
Natürlich können, um den gleichen Zweck zu erreichen, auch mehrere individuelle dsRNA Moleküle, die jeweils einen der oben definierten Ribonukleotidsequen- zabschnitte umfassen, in die Zelle oder den Organismus eingebracht werden.
Die dsRNA kann enzymatisch oder ganz oder teilweise chemisch-synthetisch hergestellt werden.
Sollen die zwei Stränge der dsRNA in einer Zelle oder Pflanze zusammengebracht werden, so kann dies auf verschiedene Art geschehen:
a) Transformation der Zelle oder Pflanze mit einem Vektor, der beide Expressionskassetten umfasst, b) Cotransformation der Zelle oder Pflanze mit zwei Vektoren, wobei der eine die Expressionskassetten mit dem "sense"-Strang, der andere die Expressionskassetten mit dem "antisense"-Strang umfasst, und/oder
c) Kreuzung von zwei Pflanzen, die mit jeweils einem Vektor transformiert wurden, wobei der eine die Expressionskassetten mit dem "sense"-Strang, der andere die Expressionskassetten mit dem "antisense"-Strang umfasst.
Die Bildung der RNA Duplex kann entweder außerhalb der Zelle oder innerhalb derselben initiiert werden. Wie in WO 99/53050 beschrieben, kann die dsRNA auch eine Haarnadelstruktur umfassen, indem "sense"- und "antisense"-Strang durch einen "Linker" (beispielsweise ein Intron) verbunden werden. Die selbstkomplementären dsRNA- Strukturen sind bevorzugt, da sie lediglich die Expression eines Konstruktes erfordern und die komplementären Stränge stets in einem äquimolaren Verhältnis umfassen.
Die Expressionskassetten kodierend für den "antisense"- oder "sense"-Strang einer dsRNA oder für den selbstkomplementären-Strang der dsRNA, werden bevorzugt in einen Vektor insertiert und mit den unten beschriebenen Verfahren stabil (beispielswei- se unter Verwendung von Selektionsmarkern) in das Genom einer Pflanze insertiert, um eine dauerhafte Expression der dsRNA zu gewährleisten.
Die dsRNA kann unter Verwendung einer Menge eingeführt werden, die zumindest eine Kopie pro Zelle ermöglicht. Höhere Mengen (z.B. mindestens 5, 10, 100, 500 oder 1000 Kopien pro Zelle) können ggf. eine effizientere Verminderung bewirken.
Eine 100%ige Sequenzidentität zwischen dsRNA und einem Armadillo-Repeat ARM1 Protein Gentranskript oder dem Gentranskript eines funktionell äquivalenten Gens ist eine mögliche Ausführungsform, aber nicht zwingend erforderlich, um eine effiziente Verminderung der Armadillo-Repeat ARM1 Protein Expression zu bewirken. Demzufolge besteht der Vorteil, dass das Verfahren tolerant ist gegenüber Sequenzabweichungen, wie sie infolge genetischer Mutationen, Polymorphismen oder evolutionärer Divergenzen vorliegen können. Die große Anzahl an stark konservierten Aminosäureresten zwischen verschiedenen Armadillo-Repeat ARM1 Proteinsequenzen verschie- dener Pflanzen - wie in den Figuren anhand der Consensussequenzen gezeigt - lässt auf einen hohen Konservierungsgrad dieses Polypeptids innerhalb von Pflanzen schließen, so dass die Expression einer dsRNA abgeleitet von einer der offenbarten Armadillo-Repeat ARM1 Proteinsequenzen gemäß SEQ SEQ. ID No: SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 auch einen vorteilhaften Effekt in anderen Pflanzenarten haben wird. Auch kann es aufgrund der hohen Zahl konservierter Reste und der Homologie zwischen den einzelnen Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptiden und ihren funktionellen Äquivalenten möglich sein, mit einer einzigen dsRNA-Sequenz, die ausgehend von einer bestimmten Armadillo-Repeat ARM1 Proteinsequenz eines Organismus generiert wurde, die Expression weiterer homologer Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptide und/oder deren funktioneller Äquivalente des gleichen Organismus oder aber auch die Expression von Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptiden in anderen verwandten Arten zu unterdrücken. Zu diesem Zweck umfasst die dsRNA bevorzugt Sequenzbereiche von Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Gentranskripten, die konservierten Bereichen ent- sprechen. Besagte konservierte Bereiche können aus Sequenzvergleichen leicht abgeleitet werden, z. B. wie in den Fiquren gezeigt. Vorzugsweise werden von den in den Figuren angezeigten konservierten Bereichen der Consensussequenz dsRNA- Sequenzen abgeleitet. Als besonders konservierte Bereiche gelten: AA702 bis AA739, AA742 bis AA752, AA760 bis AA762, AA771 bis 779, AA789 bis AA790, AA799 bis AA821 , AA829 bis AA843, AA879 bis AA905, AA924 bis AA939 der in den Figuren gezeigten Consensussequenz.
Eine dsRNA kann chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden. Dazu können zelluläre RNA Polymerasen oder Bakteriophagen RNA Polymerasen (wie z.B. T3-, T7- oder SP6 RNA-Polymerase) verwendet werden. Entsprechende Verfahren zu in vitro Expression von RNA sind beschrieben (WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693). Eine chemisch oder enzymatisch in vitro synthetisierte dsRNA kann vor der Einführung in eine Zelle, Gewebe oder Organismus aus dem Reaktionsgemisch beispielsweise durch Extraktion, Präzipitation, Elektropho- rese, Chromatographie oder Kombinationen dieser Verfahren ganz oder teilweise aufgereinigt werden. Die dsRNA kann unmittelbar in die Zelle eingeführt werden oder aber auch extrazellulär (z.B. in den interstitialen Raum) appliziert werden.
Bevorzugt wird die Pflanze jedoch stabil mit einem Expressionskonstrukt, das die Ex- pression der dsRNA realisiert, transformiert. Entsprechende Verfahren sind weiter unten beschrieben.
b) Einbringung einer Armadillo-Repeat ARM1 Protein antisense- Nukleinsäuresequenz
Verfahren zur Suppression eines bestimmten Polypeptids durch Verhinderung der Akkumulation seiner mRNA durch die "antisense"-Technologie sind vielfach - auch in Pflanzen - beschrieben (Sheehy et al. (1988) Proc Natl Acad Sei USA 85: 8805-8809; US 4,801 ,340; Mol JN et al. (1990) FEBS Lett 268(2):427-430). Das antisense Nuk- leinsäuremolekül hybridisiert bzw. bindet an die zelluläre mRNA und/oder genomischen DNA kodierend für das zu supprimierende Kallose-Synthase Zielpolypeptid. Dadurch wird die Transkription und/oder Translation des Zielpolypeptids unterdrückt. Die Hybri- disierung kann auf konventionelle Art über die Bildung einer stabilen Duplex oder - im Fall von genomischer DNA - durch Bindung des antisense Nukleinsäuremoleküls mit der Duplex der genomischen DNA durch spezifische Wechselwirkung in der großen Furche der DNA-Helix entstehen.
Ein antisense Nukleinsäuremolekül geeignet zur Verminderung eines Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptids kann unter Verwendung der für dieses Polypeptid kodierenden Nuk- leinsäuresequenz, beispielsweise des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 oder eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein funktionelles Äquivalent derselben, nach den Basenpaarregeln von Watson und Crick abgeleitet werden. Das antisense Nukleinsäuremolekül kann zu der gesamten transkribierten mRNA des besagten Polypeptids komplementär sein, sich auf die kodierende Region beschränken oder nur aus einem Oligonukleotid bestehen, das zu einem Teil der kodierenden oder nicht-kodierenden Sequenz der mRNA komplementär ist. So kann das Oligonukleotid beispielsweise komplementär zu der Region sein, die den Translationsstart für das besagte Polypeptid umfasst. Antisense-Nukleinsäuremoleküle können eine Länge von zum Beispiel 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden haben, können aber auch länger sein und 100, 200, 500, 1000, 2000 oder 5000 Nukleotide umfassen. Antisense- Nukleinsäuremoleküle können rekombinant exprimiert oder chemisch bzw. enzyma- tisch unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren synthetisiert werden. Bei der chemischen Synthese können natürliche oder modifizierte Nukleotide verwendet werden. Modifizierte Nukleotide können dem antisense Nukleinsäuremolekül eine erhöhte biochemische Stabilität verleihen und zu einer erhöhten physikali- sehen Stabilität der Duplex gebildet aus antisense-Nukleinsäuresequenz und sense- Zielsequenz führen. Verwendet werden können beispielsweise Phosphorthioatderivate und Acridin-substitierte Nukleotide wie 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Chlorouracil, 5- lodouracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxy-hydroxylmethyl)uracil, 5- Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Di- hydrouracil, ß-D-Galactosylqueosin, Inosine, N6-Isopentenyladenin, 1-Methyl-guanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylamino-methyluracil, 5- Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, ß-D-mannosyl queosin, 5'- Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure, Pseudouracil, Queosine, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5- oxyessigsäure, 5-Methyl- 2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil und 2,6- Diaminopurin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Expression eines Armadillo- Repeat ARM1 Polypeptids durch Nukleinsäuremoleküle inhibiert werden, die komplementär zu einer konservierten (beispielsweise wie oben beschrieben) oder einer regu- latorischen Region eines Armadillo-Repeat ARM1 Protein Gens (z.B. einem Armadillo- Repeat ARM1 Protein Promotor und/oder Enhancer) sind und tripelhelikale Strukturen mit der dortigen DNA-Doppelhelix ausbilden, so dass die Transkription des Armadillo- Repeat ARM1 Protein Gens vermindert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrie- ben (Helene C (1991 ) Anticancer Drug Res 6(6):569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sei 660:27-36; Mäher LJ (1992) Bioassays 14(12):807-815).
In einer weiteren Ausführungsform kann das antisense Nukleinsäuremolekül eine α- anomere Nukleinsäure sein. Derartige α-anomere Nukleinsäuremoleküle bilden spezi- fische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in denen - im Unterschied zu den konventionellen ß-Nukleinsäuren - die beiden Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier C et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:6625-6641). Das antisense Nukleinsäuremolekül kann ferner auch 2'-O-Methylribonukleotide (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:6131-6148) oder chimäre RNA-DNA Analoge beinhalten (Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215:327-330).
c) Einbringen eines Ribozyms welches spezifisch die für Armadillo Repeat-Protein kodierenden Ribonukleinsäuremoleküle spaltet, beispielsweise katalytisch.
Katalytische RNA-Moleküle oder Ribozyme können an jede beliebige Ziel-RNA ange- passt werden und spalten das Phosphodiester-Gerüst an spezifischen Positionen, wodurch die Ziel-RNA funktionell deaktiviert wird (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23(3):257-275). Das Ribozym wird dadurch nicht selber modifiziert, sondern ist in der Lage, weitere Ziel-RNA-Moleküle analog zu spalten, wodurch es die Eigenschaften eines Enzyms erhält.
Auf diese Art können Ribozyme (z.B. Ηammerhead"-Ribozyme; Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334:585-591) verwendet werden, um die mRNA eines zu supprimieren- den Enzyms - z.B. Kallose-Synthasen - zu spalten und die Translation zu verhindern. Verfahren zur Expression von Ribozymen zur Verminderung bestimmter Polypeptide sind beschrieben (in EP 0 291 533, EP 0 321 201 , EP 0 360 257). In pflanzlichen Zellen ist eine Ribozym-Expression ebenfalls beschrieben (Steinecke P et al. (1992) EM- BO J 11 (4): 1525-1530; de Feyter R et al. (1996) Mol Gen Genet. 250(3):329-338). Ribozyme können über einen Selektionsprozess aus einer Bibliothek diverser Ribozyme identifiziert werden (Bartel D und Szostak JW (1993) Science 261 :141 1-1418). Vorzugsweise hybridisieren die Bindungsregionen des Ribozyms mit den konservierten Bereichen des ARM-Proteins wie oben beschrieben.
d) Einbringung einer Armadillo-Repeat ARM 1 Protein antisense-Nukleinsäure- sequenz kombiniert mit einem Ribozym. Vorteilhaft kann die oben beschriebene antisense-Strategie mit einem Ribozym- Verfahren gekoppelt werden. Der Einbau von Ribozymsequenzen in "antisense"-RNAs verleiht eben diesen "antisense"-RNAs diese enzymähnliche, RNA-spaltende Eigenschaft und steigert so deren Effizienz bei der Inaktivierung der Ziel-RNA. Die Herstel- lung und Verwendung entsprechender Ribozym-"antisense"-RNA-Moleküle ist beispielsweise beschrieben bei Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591.
Die Ribozym-Technologie kann die Effizienz einer antisense-Strategie erhöhen. Ge- eignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei "Steinecke P, Ri- bozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds, Academic Press, Inc. (1995), S. 449-460" beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al. (1992) Plant Mol Biol. 18(2):353-361 ; Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol Gen Genet. 242(6):653-657). Beispielsweise können Derivate der Tetrahymena L-19 IVS RNA konstruiert werden, die komplementäre Bereiche zu der mRNA des zu supprimieren- den Armadillo-Repeat ARM1 Proteins aufweisen (siehe auch US 4,987,071 und US 5,116,742).
e) Einbringung einer Armadillo-Repeat ARM1 Protein sense-Nukleinsäuresequenz zur Induktion einer Cosuppression
Die Expression einer Armadillo-Repeat ARM1 Protein Nukleinsäuresequenz in sense- Orientierung kann zu einer Cosuppression des entsprechenden homologen, endoge- nen Gens führen. Die Expression von sense-RNA mit Homologie zu einem endogenen Gen kann die Expression desselben vermindern oder ausschalten, ähnlich wie es für antisense Ansätze beschrieben wurde (Jorgensen et al. (1996) Plant Mol Biol 31 (5):957-973; Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88:1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224:447-481 ; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2:291-99). Dabei kann das eingeführte Konstrukt das zu vermindernde homologe Gen ganz oder nur teilweise repräsentieren. Die Möglichkeit zur Translation ist nicht erforderlich. Die Anwendung dieser Technologie auf Pflanzen ist beispielsweise beschrieben bei Napoli et al. (1990) The Plant Cell 2: 279-289 und in US 5,034,323.
Bevorzugt wird die Cosuppression unter Verwendung einer Sequenz realisiert, die im Wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil der Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Armadillo-Repeat ARM1 Protein oder ein funktionelles Äquivalent desselben, beispielsweise des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, z.B. der Nuklein- säuresequenz gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 oder der Nukleinsäuresequenz kodierend für ein funktionelles Äquivalent derselben. f) Einbringung von Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein dominant-negatives Armadillo-Repeat ARM1 Protein.
Die Verminderung der Aktivität eines Armadillo-Repeat ARM1 Proteins kann vermutlich auch durch Expression einer dominant-negativen Variante dieses Armadillo-Repeat ARM1 Proteins realisiert werden. Verfahren zur Verminderung der Funktion bzw. Aktivität eines Polypeptids mittels Coexpression seiner dominant-negativen Form sind dem Fachmann bekannt (Lagna G und Hemmati-Brivanlou A (1998) Current Topics in De- velopmental Biology 36:75-98; Perlmutter RM und Alberola-Ila J (1996) Current Opini- on in Immunology 8(2):285-90; Sheppard D (1994) American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology. 1 1 (1 ):1-6; Herskowitz I (1987) Nature 329(6136):219-22).
Eine dominant-negative Armadillo-Repeat ARM1 Protein Variante kann beispielsweise durch Veränderung von Aminosäureresten erfolgen, die Bestandteil des Armadillo- Repeat ARM1 sind und infolge deren Mutation das Polypeptid seine Funktion verliert. Bevorzugt zu mutierende Aminosäurereste sind solche, die in den Armadillo-Repeat ARM1 Proteinen verschiedener Organismen konserviert sind. Solche konservierten Bereiche können beispielsweise mittels Computer-unterstütztem Vergleich ("A- lignment") ermittelt werden. Diese Mutationen zum Erreichen einer dominant-negativen Armadillo-Repeat ARM1 Protein Variante werden bevorzugt auf der Ebene der Nuk- leinsäuresequenz kodierend für Armadillo-Repeat ARM1 Proteine durchgeführt. Eine entsprechende Mutation kann beispielsweise durch PCR vermittelte in vitro M utagenese unter Verwendung entsprechender Oligonukleotidprimer, durch welche die ge- wünschte Mutation eingeführt wird, realisiert werden. Dazu werden dem Fachmann geläufige Verfahren verwendet. Beispielsweise kann zu diesem Zweck der "LA PCR in vitro Mutagenesis Kit" (Takara Shuzo, Kyoto) verwendet werden.
g) Einbringung von Armadillo-Repeat ARM1 Protein Genen, RNAs oder Polypeptid- bindende Faktoren.
Eine Verminderung einer Armadillo-Repeat ARM1 Protein-/ Genexpression ist auch mit spezifischen DNA-bindenden Faktoren z.B. mit Faktoren vom Typus der Zinkfin- gertranskriptionsfaktoren möglich. Diese Faktoren lagern sich an die genomische Se- quenz des endogenen Zielgens, bevorzugt in den regulatorischen Bereichen, an und bewirken eine Repression des endogenen Gens. Die Verwendung eines solchen Verfahrens ermöglicht die Verminderung der Expression eines endogenen Armadillo- Repeat ARM1 Protein Gens, ohne dass dessen Sequenz gentechnisch manipuliert werden muss. Entsprechende Verfahren zur Herstellung entsprechender Faktoren sind beschrieben (Dreier B et al. (2001 ) J Biol Chem 276(31 ):29466-78; Dreier B et al. (2000) J Mol Biol 303(4):489-502; Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97 (4):1495-1500; Beerli RR et al. (2000) J Biol Chem 275(42):32617-32627; Segal DJ and Barbas CF 3rd. (2000) Cum Opin Chem Biol 4(1 ):34-39; Kang JS and Kim JS (2000) J Biol Chem 275(12):8742-8748; Beerli RR et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95(25):14628- 14633; Kim JS et al. (1997) Proc Natl Acad Sei USA 94(8):3616 - 3620; Klug A (1999) J Mol Biol 293(2):215-218; Tsai SY et al. (1998) Adv Drug DeNv Rev 30(1-3):23-31 ; Mapp AK et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97(8):3930-3935; Sharrocks AD et al. (1997) Int J Biochem Cell Biol 29(12):1371-1387; Zhang L et al. (2000) J Biol Chem 275(43):33850-33860).
Die Selektion dieser Faktoren kann unter Verwendung eines geeigneten Stückes eines Armadillo-Repeat ARM1 Protein Gens erfolgen. Bevorzugt liegt dieser Abschnitt im Bereich der Promotorregion. Für eine Genunterdrückung kann er aber auch im Bereich der kodierenden Exons oder Introns liegen. Die entsprechenden Abschnitte sind für den Fachmann mittels Datenbankabfrage aus der Genbank oder - ausgehend von einer Armadillo-Repeat ARM1 Protein cDNA, deren Gen nicht in der Genbank vorhanden ist - durch Durchmusterung einer genomischen Bibliothek nach korrespondierenden genomischen Klonen erhältlich. Die dazu erforderlichen Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
Ferner können Faktoren in eine Zelle eingebracht werden, die das Armadillo-Repeat ARM1 Protein Zielpolypeptid selber inhibieren. Die Polypeptidbindenden Faktoren können z.B. Aptamere (Famulok M und Mayer G (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243:123-36) oder Antikörper bzw. Antikörperfragmente sein. Die Gewinnung dieser Faktoren ist beschrieben und dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wurde ein cy- toplasmatischer scFv Antikörper eingesetzt, um die Aktivität des Phytochrom A Prote- ins in gentechnisch veränderten Tabakpflanzen zu modulieren (Owen M et al. (1992) Biotechnology (N Y) 10(7):790-794; Franken E et al. (1997) Curr Opin Biotechnol 8(4):41 1-416; Whitelam (1996) Trend Plant Sei 1 :286-272).
Die Genexpression kann auch durch maßgeschneiderte, niedermolekulare syntheti- sehe Verbindungen unterdrückt werden, beispielsweise vom Polyamid-Typ (Dervan PB und Bürli RW (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3:688-693; Gottesfeld JM et al. (2000) Gene Expr 9(1-2):77-91). Diese Oligomere bestehen aus den Bausteinen 3- (Dimethylamino)propylamin, N-Methyl-3-hydroxypyrrol, N-Methylimidazol und N- Methylpyrrole und können an jedes Stück doppelsträngiger DNA so angepasst werden, dass sie sequenzspezifisch in die große Furche binden und die Expression der dortigen Genesequenzen blockieren. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (siehe unter anderem Bremer RE et al. (2001) Bioorg Med Chem. 9(8):2093-103; Ansari AZ et al. (2001 ) Chem Biol. 8(6):583-92; Gottesfeld JM et al. (2001) J Mol Biol. 309(3):615-29; Wurtz NR et al. (2001 ) Org Lett 3(8):1201-3; Wang CC et al. (2001 ) Bioorg Med Chem 9(3):653-7; Urbach AR und Dervan PB (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98(8):4343-8; Chiang SY et al. (2000) J Biol Chem. 275(32) :24246-54). h) Einbringung von den Armadillo-Repeat ARM1 Protein RNA-Abbau bewirkenden viralen Nukleinsäuremolekülen und Expressionskonstrukten.
Die Armadillo-Repeat ARM1 Protein Expression kann effektiv auch durch Induktion des spezifischen Armadillo-Repeat ARM1 Protein RNA-Abbaus durch die Pflanze mit Hilfe eines viralen Expressionssystems (Amplikon) (Angell, SM et al. (1999) Plant J. 20(3):357-362) realisiert werden. Diese Systeme - auch als "VIGS" (viral induced gene silencing) bezeichnet - bringen Nukleinsäuresequenzen mit Homologie zu den zu supprimierenden Transkripten mittels viraler Vektoren in die Pflanze ein. Die Transkrip- tion wird sodann - vermutlich vermittelt durch pflanzliche Abwehrmechanismen gegen Viren - abgeschaltet. Entsprechende Techniken und Verfahren sind beschrieben (Ratc- liff F et al. (2001 ) Plant J 25(2):237-45; Fagard M und Vaucheret H (2000) Plant Mol Biol 43(2-3):285-93; Anandalakshmi R et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95(22): 13079-84; Ruiz MT (1998) Plant Cell 10(6): 937-46).
Die Methoden der dsRNAi, der Cosuppression mittels sense-RNA und der "VIGS" ("virus induced gene silencing") werden auch als "post-transcriptional gene silencing" (PTGS) bezeichnet. PTGS-Verfahren sind besonders vorteilhaft, weil die Anforderungen an die Homologie zwischen dem zu supprimierenden endogenem Gen und der transgen exprimierten sense- oder dsRNA-Nukleinsäuresequenz geringer sind als beispielsweise bei einem klassischen antisense-Ansatz. Entsprechende Homologie- Kriterien sind bei der Beschreibung des dsRNAI-Verfahrens genannt und allgemein für PTGS-Verfahren oder dominant-negative Ansätze übertragbar. Aufgrund der hohen Homologie zwischen den Armadillo-Repeat ARM1 Proteinen aus Mais, Weizen, Reis und Gerste kann auf einen hohen Konservierungsgrad dieses Polypeptid bei Pflanzen geschlossen werden. So kann man voraussichtlich unter Verwendung von Armadillo- Repeat ARM1 Protein-Nukleinsäuremolekülen, wie sie hierein gezeigt werden, insbesondere durch von den Consensussequenzen abgeleiteten Nukleinsäuremolekülen, oder auch z.B. von den Nukleinsäuremolekülen aus Arabidopsis, Gerste, Mais oder Reis auch die Expression von homologen Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptiden in anderen Arten effektiv supprimieren, ohne dass die Isolierung und Strukturaufklärung der dort vorkommenden Armadillo-Repeat ARM1 Protein Homologen zwingend erforderlich wäre. Dies erleichtert erheblich den Arbeitsaufwand.
i) Einbringen eines Nukleinsäurekonstrukts geeignet zur Induktion einer homologen Rekombination an Genen kodierend für Armadillo-Repeat ARM1 Proteine - beispielsweise zur Erzeugung von Knockout-Mutanten.
Zur Herstellung eines homolog rekombinanten Organismus mit verminderter Armadillo- Repeat ARM1 Protein Funktion verwendet man beispielsweise ein Nukleinsäurekon- strukt, das zumindest einen Teil eines endogenen Armadillo-Repeat ARM1 Protein Gens enthält, das durch eine Deletion, Addition oder Substitution mindestens eines Nukleotids - beipielsweise in den Konservierten Regionen - so verändert wird, dass die Funktionalität vermindert oder gänzlich aufgehoben wird.
Beispielsweise kann die Primär-, Sekundär-, Tertiär-, oder Quartär-Struktur gestört werden, beispielsweise so, dass die Bindungsfähikgeit eines oder mehrerer Armadillo- repeats nicht mehr gegeben ist. Eine solche Störung kann beispielsweise durch die Mutation eines oder mehrerer Reste erfolgen, die in der Consensussequenz als konserviert oder hochkonserviert markiert sind.
Die Veränderung kann auch die regulativen Elemente (z.B. den Promotor) des Gens betreffen, so dass die kodierende Sequenz unverändert bleibt, eine Expression (Transkription und/oder Translation) jedoch unterbleibt und vermindert wird.
Bei der konventionellen homologen Rekombination ist die veränderte Region an ihrem 5'- und 3'-Ende von weiteren Nukleinsäuresequenzen flankiert, die eine ausreichende Länge für die Ermöglichung der Rekombination aufweisen müssen. Die Länge liegt in der Regel in einem Bereich von mehreren einhundert oder mehr Basen bis zu mehreren Kilobasen (Thomas KR und Capecchi MR (1987) Cell 51 :503; Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95(8):4368-4373). Für die homologe Rekombination wird der Wirtsorganismus - zum Beispiel eine Pflanze - mit dem Rekombinationskonstrukt unter Verwendung der unten beschriebenen Verfahren transformiert und erfolgreich rekombinierte Klone unter Verwendung zum Beispiel einer Antibiotika- oder Herbizidresistenz selektioniert.
j) Einführung von Mutationen in endogene Armadillo-Repeat ARM1 Protein Gene zur Erzeugung eines Funktionsverlustes (z.B. Generierung von Stopp-Kodons, Verschiebungen im Leseraster etc.)
Weitere geeignete Methoden zur Verminderung der Armadillo-Repeat ARM1 Protein Funktion sind die Einführung von Nonsense-Mutationen in endogene Armadillo-Repeat ARM1 Protein Gene, zum Beispiel mittels Generierung von Knockout-Mutanten mit Hilfe von z.B. T-DNA-Mutagenese (Koncz et al. (1992) Plant Mol Biol 20(5):963-976), ENU-(N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff) - Mutagenese oder homoiger Rekombination (Hohn B und Puchta (1999) H Proc Natl Acad Sei USA 96:8321-8323.) oder EMS Mutagene- se (Birchler JA, Schwartz D. Biochem Genet. 1979 Dec;17(11-12): 1 173-80; Hoffmann GR. Mutat Res. 1980 Jan;75(1 ):63-129). Punktmutationen können auch mittels DNA- RNA Hybrid Oligonukleotiden erzeugt werden, die auch als "chimeraplasty" bekannt sind (Zhu et al. (2000) Nat Biotechnol 18(5):555-558, Cole-Strauss et al. (1999) Nucl Acids Res 27(5): 1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87(3):240- 247). Die Zell- oder Gewebe-spezifische Verminderung der Aktivität eine sARM1 kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass ein ensprechendes Konstrukt, das z.B. ein obengenanntes Nukleinsäuremolekül, z.B. die Antisense-RNA, dsRNA, RNAi, Ribozym, mit einem geeigneten Gewebe-spezifischen Promotor exprimiert wird, z.B. einem Promotor wie hierin als spezifisch für Epidermis oder Mesophyll beschrieben.
„Mutationen" im Sinne der vorliegenden Erfindung meint die Veränderung der Nuklein- säureabfolge einer Genvariante in einem Plasmid oder im Genom eines Organismus. Mutationen können z.B als Folge von Fehlern bei der Replikation entstehen oder durch Mutagene hervorgerufen werden. Die Rate der Spontanmutationen im Zellgenom von Organismen ist sehr gering, allerdings sind dem kundigen Fachmann eine Vielzahl von biologischen, chemischen oder physikalischen Mutagenen bekannt.
Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen eines oder mehrerer Nuk- leinsäurereste. Unter Substitutionen versteht man den Austausch von einzelnen Nuk- leinsäurebasen, dabei unterscheidet man zwischen Transitionen (Substitution einer Purin- gegen eine Purinbase bzw. einer Pyrimidin- gegen eine Pyrimidinbase) und Transversionen (Substitution einer Purin- gegen eine Pyrimidinbase (oder umgekehrt).
Unter Addition bzw. Insertion versteht man den Einbau von zusätzlichen Nukleinsäure- resten in die DNA, wobei es zu Verschiebungen des Leserahmens kommen kann. Bei derartigen Leserahmenverschiebungen unterscheidet man zwischen „in frame" Inserti- onen/Additionen und „out of frame" Insertionen. Bei den „in-frame" Insertio- nen/Additionen bleibt der Leserahmen erhalten und ein um die Anzahl der von den inserierten Nukleinsäuren kodierten Aminosäuren vergrößertes Polypeptid entsteht. Bei „out of frame" Insertionen/Additionen geht der ursprüngliche Leserahmen verloren und die Bildung eines vollständigen und funktionstüchtigen Polypeptids ist in vielen Fällen, natürlich abhängig vom Ort der Mutation, nicht mehr möglich.
Deletionen beschreiben den Verlust von einem oder mehreren Basenpaaren, die ebenfalls zu „in frame" oder „out of frame" Verschiebungen des Leserahmens und den damit verbundenen Folgen bezüglich der Bildung eines intakten Proteins führen.
Die zur Erzeugung von zufälligen oder gezielten Mutationen verwendbaren mutagenen Agenzien (Mutagene) und die anwendbaren Methoden und Techniken sind dem
Fachmann bekannt. Deratige Methoden und Mutagene sind z.B. beschrieben bei A. M. van Harten [(1998), "Mutation breeding: theory and practical applications", Cambridge University Press, Cambridge, UK], E Friedberg, G Walker, W Siede [(1995), „DNA Re- pair and Mutagenesis", Blackwell Publishing], oder K. Sankaranarayanan, J. M. Genti- Ie, L. R. Ferguson [(2000) „Protocols in Mutagenesis", Elsevier Health Sciences]. Für die Einführung von gezielten Mutationen können geläufige molekulabiologische Methoden und Verfahren wie z.B der vitro Mutagenese Kits, LA PCR in vitro Mutage- nesis Kit" (Takara Shuzo, Kyoto), oder PCR Mutagenesen unter Verwendung geeigen- ter Primer verwendet werden.
Wie bereits oben aufgeführt, gibt es eine Vielzahl von chemischen physikalischen und biologischen Mutagenen.
Die im folgenden aufgeführten seien beispielhaft aber nicht einschränkend genannt.
Chemische Mutagene können gemäß ihres Wirkmechanismus unterteilt werden. So gibt es Basenanaloga (z.B.5-Bromuracil, 2-Aminopurin), mono- und bifunktionale alky- lierende Agentien (z.B. monfunktionale wie Ethylmethylsulfonat, Dimethylsulfat, oder bifunktionale wie Dichlorethylsulfit, Mitomycin, Nitrosoguanidin - dialkylnitrosamin, N- Nitrosoguanidin-Derivate) oder interkalierende Substanzen (z.B. Acridin, Ethidiumbro- mid).
Physikalische Mutagene sind zum Beispiel ionisierende Strahlungen. Ionisierende Strahlungen sind elektromagnetische Wellen oder Teilchenstrahlungen die in der Lage sind, Moleküle zu ionisieren, d.h. aus diesen Elektronen zu entfernen. Die zurückbleibenden Ionen sind meist sehr reaktiv, so dass sie, falls sie in lebendem Gewebe entstehen, großen Schaden z.B an der DNA anrichten können und (bei geringer Intensität) dadurch Mutationen induzieren. Ionisierende Strahlungen sind z.B. Gammastrahlung (Photonenenergie von etwa einem Megaelektronenvolt MeV), Röntgenstrahlung (Pho- tonenenergie von mehreren oder vielen Kiloelektronenvolt keV) oder auch Ultraviolettes Licht (UV-Licht, Photonenenergie von über 3,1 eV). UV Licht bewirkt die Bildung von Dimeren zwischen Basen, am häufigsten sind Thymidindimere, durch die Mutationen entstehen.
Die klassische Erzeugung von Mutanten durch Behandlung der Samen mit mutageni- sierenden Agentien wie z.B. Ethylmethylsulfonat (EMS) (Birchler JA, Schwartz D. Bio- chem Genet. 1979 Dec;17(11-12):1173-80; Hoffmann GR. Mutat Res. 1980 Jan;75(1 ):63-129) oder ionosierender Strahlung ist durch die Verwendung biologischer Mutagene z.B. Transposons (z.B. Tn5, Tn903, Tn916, Tn1000, Balcells et al.,1991 , May BP et al. (2003) Proc Natl Acad Sei U S A. Sep 30;100(20):1 1541-6.) oder molekularbiologischer Methoden wie der Mutagense durch T-DNA Insertion (Feldman, K.A. Plant J. 1 :71-82.1991 , Koncz et al. (1992) Plant Mol Biol 20(5) :963-976) erweitert worden.
Bevorzugt ist die Verwendung von chemischen oder biologischen Mutagenen zur Erzeugung von mutierten Genvarianten. Bei den chemischen Agenzien ist besonders bevorzugt die Erzeugung von Mutanten durch Verwendung der EMS (Ethylmethyl- sulfonat)Mutagenese genannt. Bei der Erzeugung von Mutanten unter Verwendung biologischer Mutagene sei bevorzugt die T-DNA-Mutagenese oder Transposonmuta- genese genannt.
Somit können beispielsweise auch solche Polypeptide für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden, welche man in Folge einer Mutation eines erfindungsgemäßen Polypeptides z.B. gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 erhält.
Alle Substanzen und Verbindungen die direkt oder indirekt eine Verminderung der Po- lypeptidmenge, RNA-Menge, Genaktivität oder Polypeptidaktivität eines Armadillo- Repeat ARM1 Proteins bewirken, sind in dieser Anmeldung unter der Bezeichnung "anti Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindungen" zusammengefasst. Der Begriff "anti Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung" schließt explizit die in den oben be- schriebenen Verfahren zum Einsatz kommenden Nukleinsäuresequenzen, Peptide, Proteine oder andere Faktoren ein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Erhöhung der Resistenz gegenüber Pathogenen aus den Familien der Blumeriaceae, Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae und Hypocreaceae in einer mono- oder dicotyledo- nen Pflanze, oder einem Organ, Gewebe oder einer Zelle davon, erreicht durch:
a) Einbringung einer rekombinanten Expressionskassette enthaltend in funktioneller Verknüpfung mit einem in Pflanzen aktiven Promotor eine „anti- Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung" in eine pflanzliche Zelle;
b) Regeneration der Pflanze aus der pflanzlichen Zelle, und
c) Expression besagter „anti- Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung" in einer Menge und für eine Zeit, hinreichend um eine Pathogenresistenz in besagter
Pflanze zu erzeugen oder zu erhöhen.
"Transgen" meint zum Beispiel bezüglich einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette oder einem Vektor enthaltend besagte Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette oder Vektor, alle solche durch gentechnische Methoden zustande gekommenen Konstruktionen oder Organismen, in denen sich entweder
a) die Armadillo-Repeat ARM1 Protein Nukleinsäuresequenz, oder b) eine mit der Armadillo-Repeat ARM1 Protein Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder c) (a) und (b) nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Deletion, oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste(s) sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäurese- quenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nuk- leinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindes- tens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des Armadillo- Repeat ARM1 Protein-Promotors mit dem entsprechenden Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Gen - wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht- natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise einer Mutagenisie- rung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (US 5,565,350; WO 00/15815).
"Einbringung" umfasst im Rahmen der Erfindung alle Verfahren, die dazu geeignet eine "anti-Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung", direkt oder indirekt, in eine Pflanze oder eine Zelle, ein Kompartiment, Gewebe, Organ oder Samen derselben einzuführen oder dort zu generieren. Direkte und indirekte Verfahren sind umfasst. Die Einbringung kann zu einer vorübergehenden (transienten) Präsenz einer "anti-Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung"" (beispielsweise einer dsRNA) führen oder aber auch zu einer dauerhaften (stabilen).
Gemäß der unterschiedlichen Natur der oben beschriebenen Ansätze kann die "anti Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung" ihre Funktion direkt ausüben (zum Beispiel durch Insertion in ein endogenes Armadillo-Repeat ARM1 Protein Gen). Die Funktion kann aber auch indirekt nach Transkription in eine RNA (zum Beispiel bei antisense Ansätzen) oder nach Transkription und Translation in ein Protein (zum Beispiel bei Bindungsfaktoren) ausgeübt werden. Sowohl direkte als auch indirekt wirkende "anti Kallose-Synthase Verbindungen" sind erfindungsgemäß umfasst.
„Einbringung" umfasst im Rahmen der vorliegenden Beschreibung allgemein beispielsweise Verfahren wie Transfektion, Transduktion oder Transformation.
"Anti Armadillo-Repeat ARM1-Verbindung" umfasst somit beispielsweise auch rekom- binante Expressionskonstrukte, die eine Expression (d.h. Transkription und ggf. Trans- lation) beispielsweise einer Armadillo-Repeat ARM1 Protein dsRNA oder einer Armadillo-Repeat ARM1 Protein "antisense"-RNA - bevorzugt in einer Pflanze oder einem Teil, Gewebe, Organ oder Samen derselben - bedingen. In besagten Expressionskonstrukten/Expressionskassetten steht ein Nukleinsäuremo- lekül, dessen Expression (Transkription und ggf. Translation) eine "anti Armadillo- Repeat ARM1 Protein Verbindung" generiert, bevorzugt in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise einem Promotor), das eine Expression in Pflanzen gewährleistet. Soll das Expressionskonstrukt direkt in die Pflanze eingeführt und die "anti Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung" (beispielsweise die Armadillo-Repeat ARM1 Proteins dsRNA) dort in planta erzeugt werden, so sind pflanzenspezifische genetische Kontrollelemente (beispielsweise Promo- toren) bevorzugt. Die "anti Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung" kann jedoch auch in anderen Organismen oder in vitro erzeugt und dann in die Pflanze eingebracht werden. In diesem sind alle prokaryotischen oder eukaryotischen genetischen Kontrollelemente (beispielsweise Promotoren) bevorzugt, die die Expression in der jeweils für die Herstellung gewählte Pflanze erlauben.
Unter einer „funktionellen" Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz (zum Beispiel einer "anti Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung") und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen (bzw. regulatorischen) Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promotor fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung als auch die Herstellung einer Expres- sionskassette kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor (NY), in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience und bei Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positio- niert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promotor und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.
Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen ein Promotor - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - hinter ein Element der Wahl, beispielsweise ein endogenes Armadillo-Repeat ARM1 Protein Gen platziert wird, und, in diesem Beispiel, durch Expression einer antisense Armadillo- Repeat ARM1 Protein RNA die erfindungsgemäße Verminderung eines Armadillo- Repeat ARM1 Proteins bewirkt wird. Analog kann auch ein Element, beispielsweise eine "anti Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung" (zum Beispiel eine Nukleinsäu- resequenz kodierend für eine Armadillo-Repeat ARM1 Protein dsRNA oder eine Armadillo-Repeat ARM 1 Protein antisense RNA) derart hinter einen endogenen Promotor platziert werden, dass der gleiche Effekt auftritt. Beide Ansätze führen zu Expressionskassetten im Sinne der Erfindung.
Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, - geweben, -kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitu- tiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein.
Bevorzugte Promotoren sind:
a) Konstitutive Promotoren
Bevorzugt sind Vektoren, die eine konstitutive Expression in Pflanzen ermöglichen (Benfey et al.(1989) EMBO J 8:2195-2202). "Konstitutiver" Promotor meint solche
Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Ins- besondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkript.es des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21 :285-294; Odell et al. (1985) Nature 313:810- 812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6:221- 228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco small subunit (SSU)"-Promotor (US 4,962,028), der Promotor der Nopa- linsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), der Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:9692-9696), der Smas Promotor, den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren vaskuolärer ATPase-Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991 ), sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist. Als konstitutiver Promotor insbesondere bevorzugt ist der Promotor des Nitrilase-1 (nit1) Gens aus A. thali- ana (GenBank Acc.-No.: Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170:197-200).
b) Gewebespezifische Promotoren
In einigen Ausführungsform werden Promotoren mit Spezifität für Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln oder Samen verwendet.
Samenspezifische Promotoren wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9):839-53), des 2S Albumingens (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262:12196-12201 ), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3):459-67), des Napin Gens (US 5,608,152; Stal- berg K et al. (1996) L Planta 199:515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(10):1090f), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980). Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophospha- tase (AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promotor des lpt2 oder lpt1 -Gens (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin-Gens, des Zein-Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin- Gens).
Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), und der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.
Blattspezifische Promotoren wie der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1 ,5- bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8:2445-2451). Epidermis-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der Promotor des OXLP-Gens ("Oxalat-Oxidase like protein"; Wei et al. (1998) Plant Mol. Biol. 36:101-112).
Andere Gewebespezifische Promotoren sind z.B.:
Blütenspezifische Promotoren wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).
Antheren-spezifische Promotoren wie den 5126-Promotor (US 5,689,049, US 5,689,051), den globl Promotor und den fä-
Zein Promotor.
c) Chemisch induzierbare Promotoren
Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbare Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al. (1997) Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89- 108), durch welche die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem be- stimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), ein durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2:397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden. So kann beispielsweise die Expression eines die Armadillo-Repeat ARM1 Protein Funktion reduzierenden oder inhibierenden Moleküls, wie z.B. die oben aufgezählten dsRNA, Ribozyme, Antisense-Nukleinsäuremoleküle etc. zu geeigneten Zeitpunkten induziert werden.
d) Stress- oder Pathogen-induzierbare Promotoren
Ganz besonders vorteilhaft ist die Verwendung von induzierbaren Promotoren zur Expression der zur Verminderung der Kallose-Synthase Polypeptidmenge, Aktivität oder Funktion eingesetzten RNAi Konstrukte, was beispielsweise bei Verwendung von pa- thogen-induzierbaren Promotoren eine Expression nur im Bedarfsfall (d.h. Pathogen- befall) ermöglicht.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden daher in einer Ausführungsform in Pflanzen aktive Promotoren verwendet, bei denen es sich um Pathogen-induzierbare Promotor handelt. Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die Promotoren von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden, wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, ß-1 ,3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes, et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:11 1-1 16; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Mat- ton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342; Somssich et al. (1986) Proc Natl Acad Sei USA 83:2427-2430; Somssich et al. (1988) Mol Gen Gene- tics 2:93-98; Chen et al. (1996) Plant J 10:955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91 :2507-2511 ; Warner, et al. (1993) Plant J 3:191-201 ; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1 :961-968(1989).
Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinll Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14:494-498), des wun1 und wun2-Gens (US 5,428,148), des win1- und win2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215:200-208), des Systemin (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573), des WIP1-Gens (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994) Plant J 6(2):141-150) und dergleichen.
Eine Quelle für weitere pathogen-induzierbare Promotoren stellt die PR-Genfamilie dar. Eine Reihe von Elementen in diesen Promotoren haben sich als vorteilhaft erwiesen. So vermittelt die Region -364 bis -288 im Promotor von PR-2d Salicylat-Spezifität (Bu- chel et al. (1996) Plant Mol Biol 30, 493-504). Die Sequenz 5'-TCATCTTCTT-3' taucht im Promotor der Gersten ß-1 ,3-Glucanase und in mehr als 30 weiteren stress- induzierten Genen wiederholt auf. Diese Region bindet in Tabak ein nukleares Protein, dessen Abundanz durch Salicylat erhöht wird. Die PR-1 -Promotoren aus Tabak und Arabidopsis (EP-A 0 332 104, WO 98/03536) eignen sich ebenfalls als pathogen- induzierbare Promotoren. Bevorzugt, da besonders spezifisch durch Pathogen- induziert, sind die "aeidie P/?-5"-(aPR5)-Promotoren aus Gerste (Schweizer et al. (1997) Plant Physiol 1 14:79-88) und Weizen (Rebmann et al. (1991) Plant Mol Biol 16:329-331). aPR5-Proteine akkumulieren in ca. 4 bis 6 Stunden nach Pathogenbefall und zeigen nur eine sehr geringe Hintergrundsexpression (WO 99/66057). Ein Ansatz, um eine erhöhte pathogen-induzierte Spezifität zu erreichen, bildet die Herstellung synthetischer Promotoren aus Kombinationen von bekannten pathogen-responsiven EIe- menten (Rushton et al. (2002) Plant Cell 14, 749-762; WO 00/01830; WO 99/66057). Weitere pathogen-induzierbare Promotoren aus verschiedenen Arten sind dem Fachmann bekannt (EP-A 1 165 794; EP-A 1 062 356; EP-A 1 041 148; EP-A 1 032 684).
Weitere pathogen-induzierbare Promtoren umfassen den Flachs Fis /-Promotor (WO 96/34949), den Vst1 -Promotor (Schubert et al. (1997) Plant Mol Biol 34:417-426) sowie den EAS4 Sesquiterpen-Cyclase-Promotor aus Tabak (US 6,100,451 ). Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abiotischen Stress induziert werden, wie beispielsweise der pathogen-induzierbare Promotor des PRP1-Gens (bzw. gst1 Promotor) z.B. aus Kartoffel (WO 96/28561 ; Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), der hitzeinduzierbare hsp70- oder hsp80-Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierare alpha-Amylase Promotor aus der Kartoffel
(WO 96/12814), der licht-induzierbare PPDK Promotor oder der verwundungsinduzier- te pinll-Promotor (EP-A 0 375 091 ).
e) Mesophyllgewebe spezifische Promotoren
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden in einer Ausführungsform Mesophyllgewebespezifische Promotoren wie beispielsweise der Promotor des Weizen Germin 9f-3.8 Gens (GenBank Acc.-No.: M63224) oder der Gerste GerA Promotor (WO 02/057412) verwendet. Besagte Promotoren sind insbesondere vorteilhaft, da sie sowohl Me- sophyllgewebe-spezifisch und pathogen-induzierbar sind. Ferner geeignet ist der Mesophyllgewebe-spezifische Arabidopsis CAB-2 Promotor (GenBank Acc.-No.: X15222), sowie der Zea mays PPCZmI Promotor (GenBank Acc.-No.: X63869) oder Homologe davon. Mesophyllgewebe-spezifisch meint eine durch die spezifische Wechselwirkung von in der Promotorsequenz vorhandenen Cis-Elementen und an diese bindende Transkriptionsfaktoren hervorgerufene Einschränkung der Transkription eines Gens auf möglichst wenige, das Mesophyllgewebe enthaltende Pflanzengewebe, vorzugsweise ist eine auf das Mesophyllgewebe beschränkte Transkription gemeint.
Für weitere Promotoren, die im Wesentlichen im Mesophyll oder in der Epidermis exprimiert werden, siehe die weiter oben eingefügte Aufzählung.
f) Entwicklungsabhängige Promotoren
Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise fruchtreifungsspezifische Promoto- ren, wie beispielsweise der fruchtreifungs-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP 409 625). „Entwicklungsabhängige Promotoren" schließt zum Teil die gewebespezifischen Promotoren ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt.
Besonders bevorzugt sind konstitutive, sowie Blatt und/oder Stengel-spezifische, pathogen-induzierbare, Wurzel-spezifische, Mesophyllgewebe-spezifische Promotoren, wobei konstitutive, pathogen-induzierbare, Mesophyllgewebe-spezifische und Wurzelspezifische Promotoren am meisten bevorzugt sind.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nuklein- säuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E.cσ//Bakterien ermöglichen. Als Pflanzen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage.
Weitere zur Expression in Pflanzen geeignete Promotoren sind beschrieben (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61 :1-11 ; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:8402-8406).
Die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nuk- leinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promotor funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen Promotor mit einer der vorab beschriebenenen Spezifität und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nuk- leinsäuresequenz.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionssteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifi- sehe Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH. J Biol Chem 1991 ; 266(26): 17131 -17135) und Hitzestress (Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217(2-3):246-53, 1989) beschrieben.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhi- naus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierten Regionen, Introns oder nicht kodierende 3'-Regionen von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adh1-S Introns 1 , 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 1 16, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expressi- on heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (GaIMe et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711 ) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15:435-440).
Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "En- hancer-Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen insertiert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehre- ren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny- lierungssignale, vorzugsweise solche, die im Wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al. (1984) EMBO J 3:835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin- Synthase)-Terminator.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen einen Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte ausgetauscht werden.
Eine Expressionskassette und die von ihr abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassetten, Vektoren oder transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2- Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456), Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphinotricin etc. verleihen. Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft seien genannt: DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren und Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren (bar und pat Gen), 5-Enolpyruvyl- shikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz ge- gen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen, das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase), das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert), Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie bxn Gene, die für Bromo- xynil degradierende Nitrilaseenzyme kodieren, das aasa-Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectinomycin verleih, das Streptomycinphosphotransfe- rase (SPT) Gen, das eine Resistenz gegen Streptomycin gewährt, das Neomy- cinphosphotransferas (NPTII) Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin oder
Geneticidin verleiht, das Hygromycinphosphotransferase (HPT) Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt, das Acetolactatsynthas Gen (ALS), das eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleiht (z.B. mutierte ALS- Varianten mit z.B. der S4 und/oder Hra Mutation).
b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -Zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Sheen et al.(1995) Plant
Journal 8(5):777-784; Haseloff et al.(1997) Proc Natl Acad Sei USA 94(6):2122- 2127; Reichel et al.(1996) Proc Natl Acad Sei USA 93(12):5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271 ; WO 97/41228; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques. 23(5):912-8), die Chloramphe- nicoltransferase, eine Luziferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-859; Miliar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414), das Aequoringen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268), die ß-Galactosidase, R- Locus Gen (kodieren ein Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht; Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11 :263-282, 1988), ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907).
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2πd ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
Zur Selektion erfolgreich transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von un- transformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84).
Die Einführung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen), kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die Expressionskassetten ent- halten sind. Die Expressionskassette kann in den Vektor (zum Beispiel ein Plasmid) über eine geeignete Restriktions-schnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E. coli eingeführt. Korrekt transformierte E. coli werden selekti- oniert, gezüchtet und das rekombinante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.
Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacte- rien sein. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle) erfordert, dass das entsprechende DNA-Moleküle und somit die in Folge von dessen Genexpression gebildeten RNA-Molekülen oder Proteinen in die entsprechende Wirts- zelle eingebracht werden.
Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991 ) Gene 100:247-250; Scheid et al. (1991 ) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52:111-1 16; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al. (1987) Nature 327:70- 73 ; Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al.(1985) Science 227:1229-
1231 ; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91 :694-701 ; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Re- generation von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation bevorzugt genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, d.h. die sogenannte "particle bombardment" Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion, beispielsweisemittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Die Verfahren sind beispielsweise beschrieben bei Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f).
Werden Agrobacterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: Shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation ver- wendet, ist vorzugsweise zumindest die rechte Begrenzung, meistens bevorzugt jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden.
Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E.colia\s auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektions- markergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T- DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakterien und ist zum Beispiel das nptll Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4:277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA bzw. RNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflan- zen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist es erforderlich, dass sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Stabil transformierte Zellen d.h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide (wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc.) zu verleihen vermag (s.o.). Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiele sind oben genannt und umfassen bevorzugt das bar Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21 (5):871- 884), das nptll Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Re- sistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81- 84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten bevorzugt kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Die oben genannten Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Jenes B et al.(1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilizati- on, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S. 128-143 sowie in Potrykus (1991 ) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225). Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobac- terium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12:87111).
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige
Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.
Dem Fachmann sind auch Verfahren bekannt, um aus Pflanzenzellen, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu regenerieren. Beispielsweise werden hierzu Verfahren beschrieben von Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 1 1 : 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89:525-533 verwen- det. Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhaft mit weiteren Verfahren, die eine Pathogenresistenz (beispielsweise gegen Insekten, Pilze, Bakterien, Nematoden etc.), Stressresistenz oder eine andere Verbesserung der pflanzlichen Eigenschaften bewirken, kombiniert werden. Beispiele sind u.a. genannt bei Dunwell JM, Transgenic ap- proaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000;51 Spec No; Seite 487-96.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verminderung der Funktion eines Armadillo-Repeat ARM1 Proteins in einer Pflanze kombiniert mit einer Erhöhung der Aktivität eines Bax Inhibitor 1 -Proteins. Dies kann beispielsweise durch Expression einer für ein Bax-lnhibitor-1 Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz, z.B. im Mesophyllgewebe und/oder Wurzelgewebe erfolgen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren sind die Bax-lnhibitor-1 Proteine aus Hordeum vul- gare oder Nicotiana tabacum besonders bevorzugt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die Nukleinsäu- remoleküle kodierend für Armadillo-Repeat ARM1 Proteine aus Gerste gemäß den Polynukleotiden SEQ. ID No: 1 umfassen, sowie die dazu komplementären Nuklein- säuresequenzen, und die durch Entartung (Degeneration) des genetischen Codes ab- geleiteten Sequenzen und die für funktionelle Äquivalente der Polypeptide gemäß SEQ. ID No.: 1 kodierenden Nukleinsäuremoleküle, wobei die Nukleinsäuremoleküle nicht aus der SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 bestehen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft das Armadillo-Repeat ARM1 Protein aus Gerste gemäß SEQ. ID No.: 2 oder eines, das diese Sequenzen umfasst, sowie funktionelle Äquivalente davon, die nicht einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, oder 44, entsprechen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft doppelsträngige RNA-Nukleinsäure- moleküle (dsRNA-Molekül), die bei Einführung in eine Pflanze (oder einer davon abgeleiteten Zelle, Gewebe, Organ oder Samen) die Verminderung eines Armadillo-Repeat ARM1 Proteins bewirken, wobei der Sense-Strang des besagten dsRNA-Moleküls mindestens eine Homologie von 30%, bevorzugt mindestens 40%, 50%, 60%, 70% oder 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt 100 % zu einem Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 aufweist, oder ein Fragment von mindestens 17 Basenpaaren, bevorzugt mindestens 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 Basenpaaren, besonders bevorzugt mindestens 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Basenpaaren, ganz besonders bevorzugt mindestens 100, 200, 300 oder 400 Basenpaaren, am allermeisten bevorzugt mindestens 500, 600, 700, 800, 900 mindestens 1000 Basenpaaren umfaßt, und welches mindestens 50%, 60%, 70% oder 80%, be- sonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt 100% Homologie zu einem Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 aufweist, aber nicht der SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 entsprechen.
Die doppelsträngige Struktur kann ausgehend von einem einzelnen, selbstkomplementären Strang oder ausgehend von zwei komplementären Strängen gebildet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind "sense"- und "antisense"-Sequenz durch eine verbindende Sequenz ("Linker") verknüpft und können beispielsweise eine Haarnadelstruktur ausbilden. Ganz besonderes bevorzugt kann die verbindende Sequenz ein Intron sein, das nach Synthese der dsRNA herausgespleißt wird.
Die Nukleinsäuresequenz kodierend für eine dsRNA kann weitere Elemente beinhalten, wie beispielsweise Transkriptionsterminationssignale oder Polyadenylierungs- Signale.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskassetten, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen umfassen. In den erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten ist die Nukleinsäuresequenz kodierend für die Armadillo-Repeat ARM1 Proteine aus Gerste, Weizen und Mais mit mindestens einem genetischen Kontrollelement nach obiger Definition derart verknüpft, dass die Expression (Transkription und ggf. Translation) in einem beliebigen Organismus - bevorzugt in monokotyledonen Pflanzen - realisiert werden kann. Dazu geeignete genetische Kontrollelemente sind oben beschrieben. Die transgenen Expressionskassetten können auch weitere Funktionselemente gemäß obiger Definition enthalten.
Derartige Expressionskassetten enthalten beispielsweise eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, z.B. eine die im Wesentlichen identisch ist zu einem Nukleinsäuremolekül nach SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 oder einem erfindungsgemäßen Fragment davon, wobei besagte Nukleinsäuresequenz bevorzugt in Sense-Orientierung oder in Antisense-Orientrierung zu einem Promotor vorliegt und damit zur Expression von sense- oder antisense-RNA führen kann, wobei es sich bei dem besagten Promotor um einen in Pflanzen aktiven, bevorzugt um einen durch Pathogen befall induzierbaren Promotor handelt. Erfin- dungsgemäß sind auch transgene Vektoren umfaßt, die die besagten transgenen Expressionskassetten beinhalten.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft Pflanzen, die durch natürliche Vorgänge oder künstlich induziert eine oder mehrere Mutationen in einem Nukleinsäuremolekül enthalten, das die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 umfaßt, wobei besagte Mutation eine Verminderung der Aktivität, Funktion oder Polypeptidmenge eines der durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 kodierten Polypeptids bewirkt. Beispielsweise eine durch Tilling hergestellte und identifizierte Mutation.
Bevorzugt sind dabei Pflanzen die zu der Familie der Poaceae gehören, besonders bevorzugt sind Pflanzen ausgewählt aus den Pflanzengattungen Hordeum, Avena, Seeale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum und Oryza, ganz besonders bevorzugt Pflanzen ausgewählt aus den Arten Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Se- cale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officina- rum (Zuckerrohr) und Oryza sative (Reis).
Folglich betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform einen monokotyledonen Organismus enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, welche eine Mutati- on enthält, die eine Verminderung der Aktivität eines der durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodierten Proteine in den Organismen oder Teilen davon bewirkt. Beispielsweise betrifft die Mutation einen oder mehr Aminosäurereste, die in der in den Fiquren gezeigten Consensussequenz als konserviert oder hochkonserviert markiert ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft folglich transgene Pflanzen, transformiert mit wenigstens
a) einer Nukleinsäuresequenz, die Nukleinsäuremoleküle gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 um- fasst, enthalten, die dazu komplementären Nukleinsäuresequenzen, und die für funktionelle Äquivalente der Polypeptide gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 kodierenden Nukleinsäuremoleküle
b) einem Doppelsträngigen RNA-Nukleinsäuremoleküle (dsRNA-Molekül), welches eine Verminderung eines Armadillo-Repeat ARM1 Proteins bewirkt, wobei der Sense-Strang des besagten dsRNA-Moleküls mindstens eine Homologie von 30%, bevorzugt mindestens 40%, 50%, 60%, 70% oder 80%, besonders bevor- zugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt 100 % zu einem Nukleinsäure- molekül gemäß S SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 aufweist, oder ein Fragment von mindestens 17 Basenpaaren, bevorzugt mindestens 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 Basenpaaren, besonders bevorzugt mindestens 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Basenpaaren, ganz besonders bevorzugt mindestens 100, 200, 300 or 400
Basenpaaren, am allermeisten bevorzugt mindestens 500, 600, 700, 800, 900 oder mehr Basenpaaren umfaßt, welches mindestens eine 50%, 60%, 70% oder 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt 100% Homologie zu einem Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 aufweist,
c) einer transgenen Expressionskassette, die eine der erfindungsgemäßen Nuklein- säuresequenzen umfaßt, oder einem erfindungsgemäßen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw.- oder Vermehrungsgut abgeleitet von solchen Organismen,
wobei die Nukleinsäuremoleküle in einer Ausführungsform nicht den aus in SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 gezeigten Nukleinsäuremolekülen bestehen und in einer Ausführungsform nicht aus den in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 gezeigten Polypeptidmolekülen bestehen und
In einer Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Pflanze oder die erfindungsgemäß verwendete Pflanze keine Arabidopsis thaliana.
Als „transgene Organismen" bevorzugte Wirts- oder Ausgangs-organismen sind vor allem Pflanzen gemäß der oben genannten Definition. In einer Ausführungsform ist der transgene Organismus eine reife Pflanze, Saatgut, Spross und Keimling, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. „Reife Pflanze" meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. „Keimling" meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadi- um. Insbesondere als Wirtsorganismen bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen, auf die der erfindungsgemäße Verfahren zum Erzielen einer Pathogenresistenz gemäß oben genannten Kriterien angewendet werden kann. In einer Ausführungsform ist die Pflanze eine monokotyle Pflanze wie z.B. Weizen, Hafer, Hirse, Gerste, Roggen, Mais, Reis, Buchweizen, Sorghum, Triticale, Dinkel oder Zuckerrohr, insbesondere ausgewählt aus den Arten Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Seeale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) oder Oryza sativa (Reis).
Die Herstellung der transgenen Organismen kann mit den oben beschriebenen Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Organismen realisiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die erfindungsgemäß beschriebenen transgenen Pflanzen, die zusätzlich über eine erhöhte Bax Inhibitor 1 Aktivität verfü- gen, bevorzugt sind dabei Pflanzen, die eine erhöhte Bax Inhibitor 1 Aktivität in Mesophyllzellen oder Wurzelzellen aufweisen, besonders bevorzugt sind transgene Pflanzen die zu der Familie der Poaceae gehören und eine erhöhte Bax Inhibitor 1 Aktivität in Mesophyllzellen oder Wurzelzellen aufweisen, am meisten bevorzugt sind transgene Pflanzen ausgewählt aus den Pflanzengattungen Hordeum, Avena, Seeale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum und Oryza, am allermeisten bevorzugt sind die Pflanzenarten Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Seeale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) und Oryza sative (Reis).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemä- ßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.-, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungsoder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung zudem ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen wobei ein Wirtsorganismus oder ein Teil davon mit einer der oben beschriebenen Nukleinsäure- moleküle Expressionskassetten transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Feinchemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Feinchemikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungsmedium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Die Züchtung der transformierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakkzinen ist beschrieben bei Hood EE, Jilka JM (1999). Curr Opin Biotechnol.10(4):382-6; Ma JK, Vine ND (1999). Curr Top Microbiol Immunol. 236:275-92.
Erfindungsgemäß kann die Expression eines Strukturgens natürlich auch unabhängig von der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände erfolgen oder beeinflusst werden.
Sequenzen
1. SEQ ID NO:1 und 2: HvArm
2 . SEQ ID NO: 3 und 4: OS_1_XM_479734.1 3. SEQ ID NO: 5 und 6 Os_2_XM_463544
4 . SEQ ID NO: 7 und 8 Os_3_AP003561
5. SEQ ID NO:9 und 10 Os_4_XM_506432 6. SEQ ID NO:11 und 12 NTJ _AY219234
7. SEQIDNO: 13 und 14 AtJ _NM_127878
8. SEQ ID NO: 15 und 16 At_2_AC004401
9. SEQIDNO: 17 und 18 At_3_BT020206 10. SEQIDNO:19und20At_4_AB007645
11. SEQ ID NO: 21 und 22 At_5_NMJ 15336 (At3g54790)
12. SEQIDNO:23und24At_6_AK118613
13. SEQIDNO:25und26At_7_AL138650
14. SEQIDNO:27und28At_8_AL133314 15. SEQIDNO:29und30At_9_AC010870
16. SEQ ID NO: 31 und 32 At J 0_AY125543 (At3g01400)
17. SEQ ID NO:33 und 34 AtJ 1_AY087360
18. SEQ ID NO: 35 und 36 AtJ 2_AB016888
19. SEQ ID NO: 37 und 38 At J 3_AK175585 20. SEQIDNO:39und40AtJ4_AL049655
21. SEQ ID NO: 41 und 42 At J 5_AY096530 (At3g54850)
22. SEQ ID NO:43 und 44 AtJ 6_AK118730 (At4g 16490)
23. SEQ ID NO: 45 bis 59: Primer
24. SEQ ID NO: 60, 61 , 63: Consensussequenzen der Polynukleotid SEQ ID NO. aus 1. bis 22.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 (12 Seiten): Nukleinsäuresequenzen von ARM1 aus Gerste, Reis, und Ara- bidopsis thaliana. Figur 2 (6 Seiten): Polypeptidsequenzen von ARM1 aus Gerste, Reis, und Arabi- dopsis thaliana.
Figur 3 (20 Seiten): Sequenzvergleich von ARM1 Proteinsequenzen Polypeptiden aus Gerste, Reis, und Arabidopsis thaliana.
Figur 4 (1 Seite): Erhöhung der Mehltau resistenz von Gerste durch RNAi von ARM-Repeat Proteinen
Figur 5 (2 Seiten): Consensussequenzen des Sequenzvergleich von ARM1 Proteinsequenzen Polypeptiden aus Gerste, Reis, und Arabidopsis thaliana. Beispiele:
Allgemeine Methoden:
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reini- gung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) CoId Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma MWG- Licor nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74:5463-5467).
Beispiel 1 : Pflanzen, Pathogene und Inokulation
Die Gerstensorte Golden Promise stammt von Patrick Schweizer, Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Gatersleben. Die Sorte Pallas und die rückgekreuzte Linie BCIngrid-/77/σ5wurde von Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agriculturai University, Kopenhagen, Dänemark zur Verfügung gestellt. Ihre Herstellung ist beschrieben (Kθlster P et al. (1986)Crop Sei 26: 903-907).
Das 12 bis 36 h im Dunkeln auf feuchtem Filterpapier vorgekeimte Saatgut wird, wenn nicht anders beschrieben, zu je 5 Körnern an den Rand eines Vierkanttopfes (8x8cm) in Fruhstorfer Erde vom Typ P ausgelegt, mit Erde bedeckt und regelmäßig mit Lei- tungswasser gegossen. Alle Pflanzen werden in Klimaschränken oder -kammern bei 16 bis 18°C, 50 bis 60 % relativer Luftfeuchte und einem 16-stündigen Licht / 8- stündigen Dunkelheitszyklus mit 3000 bzw. 5000 lux (50 bzw. 60 μmols-1m-2 Photonen- flussdichte) 5 bis 8 Tage lang kultiviert und im Keimlingsstadium in den Versuchen verwendet. Bei Experimenten, in denen Applikationen an Primärblättern durchgeführt werden, sind diese vollständig entwickelt.
Vor Durchführung der transienten Transfektionsexperimente werden die Pflanzen in Klimaschränken oder -kammern bei tagsüber 24°C, nachts 20°C, 50 bis 60 % relativer Luftfeuchte und einem 16stündigen Licht / δstündigen Dunkelheitszyklus mit 30000 lux kultiviert. Für die Inokulation von Gerstenpflanzen wird Echte Gerstenmehltau Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. hordeiEm. Marchai der Rasse A6 (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89- 148) (BghA6) verwendet. Dieser wurde vom Institut für Biometrie, JLU Gießen bereitgestellt. Die Nachzucht des Inokulums erfolgt in Klimakammern zu den gleichen Be- dingungen, wie sie oben für die Pflanzen beschrieben sind, durch Übertragung der Konidien von befallenem Pflanzenmaterial auf regelmäßig angezogene, 7 Tage alte Gerstenpflanzen cv. Golden Promise bei einer Dichte von 100 Konidia/mm2.
Die Inokulation mit BghA6 erfolgt unter Verwendung von 7 Tagen alten Keimlingen durch Abschütteln der Konidien bereits befallener Pflanzen in einem Inokulationsturm mit ca. 100 Konidien/mm2 (soweit nicht anders angegeben).
Beispiel 2: RNA-Extraktion
Gesamt RNA wird aus 8 bis 10 primären Blattsegmenten (Länge 5 cm) mittels "RNA Extraction Buffer" (AGS, Heidelberg, Germany) extrahiert.
Dazu werden zentrale Primärblattsegmente von 5 cm Länge geerntet und in flüssigem Stickstoff in Mörsern homogenisiert. Das Homogenisat wird bis zur RNA-Extraktion bei -70°C gelagert.
Aus dem tiefgefrorenen Blattmaterial wird mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kits (AGS, Heidelberg) Gesamt-RNA extrahiert. Dazu wird 200 mg des tiefgefrorenen Blattmaterials in einem Mikrozentrifugenröhrchen (2 mL) mit 1 ,7 mL RNA-Extraktionspuffer (AGS) überschichtet und sofort gut durchmischt. Nach Zugabe von 200 μL Chloroform wird erneut gut gemischt und bei Raumtemperatur 45 min auf einem Horizontalschüttler bei 200 U/min geschüttelt. Anschließend wird zur Phasentrennung 15 min bei 20000 g und 4°C zentrifugiert, die obere wäsige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die untere verworfen. Die wässrige Phase wird erneut mit 900 μL Chloroform gereinigt, indem 3 mal für 10 sec homogenisiert und erneut zentrifugiert (s.o.) und abgehoben wird. Zur Fällung der RNA wird dann 850 μL 2-Propanol hinzugegeben, homogenisiert und für 30 bis 60 min auf Eis gestellt. Im Anschluss daran wird für 20 min zentrifugiert (s.o), vorsichtig der Überstand dekantiert, 2 mL 70 %iges Ethanol (-20°C) hinzu pipettiert, durchmischt und erneut 10 min zentrifugiert. Der Überstand wird dann wiederum dekantiert und das Pelet vorsichtig mit einer Pipette von Flüssigkeitsresten befreit, bevor es an einem Reinluftarbeitsplatz im Reinluftstrom getrocknet wird. Danach wird die RNA in 50 μL DEPC-Wasser auf Eis gelöst, durchmischt und 5 min zentrifugiert (s.o.). 40 μl des Überstandes werden als RNA-Lösung in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei -70°C gelagert.
Die Konzentration der RNA wird photometrisch bestimmt. Dazu wird die RNA-Lösung 1 :99 (v/v) mit destilliertem Wasser verdünnt und die Extinktion (Photometer DU 7400, Beckman) bei 260 nm gemessen (E260 πm = 1 bei 40 iϊg RNA/mL). Gemäß der errechneten RNA-Gehalte werden die Konzentrationen der RNA-Lösungen anschließend mit DEPC-Wasser auf 1 μg/μL angeglichen und im Agarosegel überprüft.
Zur Überprüfung der RNA-Konzentrationen im horizontalen Agarosegel (1 % Agarose in 1 x MOPS-Puffer mit 0,2 μg/mL Ethidiumbromid) wird 1 μl_ RNA-Lösung mit 1 μL 10 x MOPS, 1 μl_ Farbmarker und 7 μl_ DEPC-Wasser versetzt, nach Ihrer Größe bei 120 V Spannung im Gel in 1 x MOPS-Laufpuffer über 1 ,5 h aufgetrennt und unter UV- Licht fotographiert. Eventuelle Konzentrationsunterschiede der RNA-Extrakte wrden mit DEPC-Wasser ausgeglichen und die Anpassung erneut im Gel überprüft.
Beipiel 3: Klonierung der HvARM-cDNA-Sequenz aus Gerste
Die zur Isolation der Armadillo cDNA, ihrer Klonierung, Sequenzierung benötigten cDNA Fragmente wurden mittles RT-PCR unter Verwendung des GeneRacer Kit (Fa. Invitrogen Life Technologies) erhalten. Dazu wurde Gesamt-RNA aus Gerstenepider- mis als Matrize verwendet. Die RNA wurde aus Epidermiszellen von Gerste Ingrid +Bgt 12h und 24h nach Infektion isoliert.
Die cDNA-Sequenz von HvArm wurde mittels der RACE-Technologie unter Verwendung des "GeneRacer Kit" (INVITROGENE Life Technologies) verlängert. Dazu wurden 4000 ng Gesamt-mRNA, 1 μL 10xCIP-Puffer, 10 Units RNAse-lnhibitor, 10 Units CIP ("calf intestinal Phosphatase") und DEPC-behandeltes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10 μL für 1 h bei 50°C behandelt. Zur Präzipitation der RNA wurden weitere 90 μL DEPC-Wasser und 100 μL Phenokchloroform hinzugegeben und intensiv für ca. 30 sec durchmischt. Nach 5 min Zentrifugation bei 20.000 g wurde die obere Phase mit 2 μl 10 mg/ml Mussei Glycogen, 10 μl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) in einem neuen Mikroreaktionsgefäß versetzt. 220 μl 95 % Ethanol wurden hinzugegeben und die Mischung auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die RNA durch Zentrifugation für 20 min bei 20.000 g und 4°C präzipitiert. Der Überstand wurde verworfen, 500 μl 75 % Ethanol hinzugegeben, kurz gevortext und wieder für 2 min zentrifugiert (20000 g). Der Überstand wurde wiederum verworfen, das Präzipitat für 2 min bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet und anschließend in 6 μl DEPC-Wasser suspendiert. mRNA CAP- Strukturen wurden durch Zugage von 1 μl 1OxTAP Puffer, 10 Units RNAsin und 1 Unit TAP ("tobacco acid pyrophosphatase") entfernt. Die Mischung wurde für 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend auf Eis gekühlt. Die RNA wurde wiederum- wie oben beschrieben - präzipitiert und in ein Reaktionsgefäß mit 0,25 μg GeneRacer Oligonukleo- tid-Primer überführt. Der Oligonukleotid-Primer wurde in der RNA-Lösung resuspendiert, die Mischung für 5 min bei 70°C inkubiert und dann auf Eis gekühlt. 1 μl 10xLigasepuffer, 10 mM ATP, 1 Unit RNAsin und 5 Units T4 RNA-Ligase wurden hinzugegeben und der Reaktionsansatz für 1 h bei 37°C inkubiert. Die RNA wurde wiederum - wie oben beschrieben - präzipitiert und in 7 μl DEPC-Wasser resuspendiert. 10 pMol GeneRacer Oligo-dT Primer und 2 μl_ jeder dNTP-Lösung (25 mM) wurden zu der RNA gegeben, für 10 min auf 70°C erhitzt und wieder auf Eis gekühlt. Anschließend wurde ein Mix aus 2 μl_ 1OxRT buffer, 4μl 25mM MgCI2, 2μl 0,1 M DTT, 5LJ (1 μl) Su- perscriptlll Transkriptase (200U/μl) und 1 μl RNAse Out (40U/μl) hinzugegeben, die Reaktionslösung für 50 min bei 50°C inkubiert und anschließend für 5 min bei 85°C inaktiviert. Nach einer Inkubation von 20 min bei 37°C mit 1 μl RNAse H (2U/μl) wurde die so hergestellte Erststrang-cDNA bei -20°C gelagert.
Für die RT-PCR wurden folgende Primer verwendet:
GeneRacer Oligo-dT-Primer (Fa. Invitrogen Life Technologies):
GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T) 18 (Seq ID No.: 45)
Für die Reaktion (20 μL-Ansatz) wurden je 4000 ng Gesamt-RNA, 10 mM dNTPs, 50μM GeneRacer Oligo-dT-Primer (Fa. Invitrogen Life Technologies), 1 μl RNase- Inhibitor und 1 μl Enzymmix in 1x RT-Puffer {GeneRacer Kit Invitrogen) eingesetzt.
Die Reaktion wurde für 50 Minuten bei 50°C inkubiert.
Zur Amplifikation der 5'-cDNA-Enden wurden nachfolgende Primer verwendet:
MWG 1 :
5 'GCAGACATGACCCAATCTTGGCAGG 3' (Seq ID No.: 46)
GR 5'Primer (Invitrogen): 5'cgactggagcacgaggacactga 3' (Seq ID No.: 47)
MWG 2: 5'CCACGGTCAGCAACCTCTCCAGACG 3' (Seq ID No.: 48)
GeneRacer 5'nested Primer (Invitrogen): 5'ggacactgacatggactgaaggagta 3' (Seq ID No.: 49)
MWG 3:
5' cagatgatagttattgttgttgactgg 3' (Seq ID No.: 50)
GR 3'Primer (Invitrogen):
5' GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG 3' (Seq ID No.: 51 )
MWG 4:
5'ctcatcttctcaagctactggtgg 3' (Seq ID No.: 52) GeneRacer 3'nested Primer (Invitrogen): 5'CGCTACGTAACGGCATGACAGTG 3' (Seq ID No.: 53)
Der Ansatz (Gesamtvolumen 50μl_) hatte nachfolgende Zusammensetzung:
4μl MWG1 (10pmol/μL) 4,5μl 5'Gene Racer (10pmol/μL) 5μl 1 Ox Puffer Roche 1 ,5μl 1 OmM dNTPs i μl cDNA 1 μl Taq (Roche) 33μl H2O
Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet (GeneAmp PCR System 9700; Applied Biosystems):
94°C 2 min Denaturierung
5 Zyklen mit 94°C 30sek (Denaturierung)
72°C 2min (Extension)
5 Zyklen mit 94°C 30sek (Denaturierung)
70°C 2min (Extension)
30 Zyklen mit 94°C 30sek (Denaturierung)
65°C 30sek (Annealing)
68°C 2min (Extension)
68°C 7min abschließende Extension
4°C Kühlung bis zu Weiterverarbeitung
Die PCR ergab kein Produkt. Davon ausgehend wurde eine „nested"-RACE mit MWG2, dem Armadillo-spezifischen Oligonukleotidprimer und dem „GeneRacer Nested 5'Primer" durchgeführt:
94°C 2min Denaturierung
30 Zyklen mit 94°C 30sek (Denaturierung) 65°C 30sek (Annealing)
68°C 2min (Extension) 68°C 7min abschließende Extension 4°C Kühlung bis zur Weiterverarbeitung
Die PCR ergab ein Produkt von ca. 850bp. Das erhaltene PCR-Produkt wurde über ein 1 % Agarosegel isoliert, aus dem Gel extrahiert und in pCR4-Topo (Fa. Invitrogen Life Technologies) mittels T-Überhang-Ligation kloniert und sequenziert. Die unter SEQ ID NO: wiedergegebene Sequenz ist also identisch mit der Armadillo-Sequenz aus Gerste.
Zur Amplifikation der Volllängensequenz von HvArm wurden nachfolgende Primer verwendet:
MWG 29:
5'atatgcaaatggctctgctag 3' (Seq ID No.: 54)
MWG 30:
5TATCATCTCCTTCCCGAGTTC 3' (Seq ID No.: 55)
Der Ansatz (Gesamtvolumen 50μl_) hatte nachfolgende Zusammensetzung:
4μl MWG29 (10pmol/μL)
4μl MWG30 (10pmol/μL)
5μl 1 Ox Pfu Ultra Puffer (Stratagene)
1 ,5μl 1 OmM dNTPs i μl cDNA
1 μl Pfu Ultra (Stratagene)
33μl H2O
Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet (GeneAmp PCR System 9700; Applied Biosystems):
94°C 2 min Denaturierung
30 Zyklen mit 94°C 30sek (Denaturierung) 55°C 30sek (Annealing)
72°C 1 ,5min (Extension)
72°C 7min abschließende Extension 4°C Kühlung bis zu Weiterverarbeitung
Die PCR ergab ein Produkt von 1326bp. Das erhaltene PCR-Produkt wurde über ein 1 % Agarosegel isoliert, aus dem Gel extrahiert und in pCR4-Topo (Fa. Invitrogen Life Technologies) mittels T-Überhang-Ligation kloniert und sequenziert. Die unter SEQ ID NO: wiedergegebene Sequenz ist also identisch mit der Armadillo-Sequenz aus Gerste.
Beispiel 4: Klonierung der Volllängen-CDNA-sequenz von AtARM (At2g23140) aus Arabidopsis thaliana.
Zur Amplifikation der Volllängensequenz von AtArm wurden nachfolgende Primer verwendet:
MWG 31 :
5' cccgggatgattttgcggttttggcgg 3' (Seq ID No.: 56)
MWG 32: 5' CCCGGGTCACAAGACAAAACATAAAAATAGG 3' (Seq ID No.: 57)
MWG 32b:
5'gactcacactactctaatacc 3' (Seq ID No.: 58)
MWG 33:
5'GACATCGTTTGTCTCACACC 3' (Seq ID No.: 59)
Der Ansatz (Gesamtvolumen 50μl_) hatte nachfolgende Zusammensetzung (das Gen wurde aufgrund seiner Größe von 2775bp für die PCR in zwei Teile geteilt):
4μl MWG31 (10pmol/μL)
4μl MWG34 (10pmol/μL)
5μl 1 Ox Pfu Ultra Puffer (Stratagene)
1 ,5μl 1 OmM dNTPs i μl cDNA
1 μl Pfu Ultra (Stratagene)
33μl H2O
bzw.
4μl MWG32 (10pmol/μL)
4μl MWG33 (10pmol/μL)
5μl 1 Ox Pfu Ultra Puffer (Stratagene)
1 ,5μl 1 OmM dNTPs I μl cDNA
1 μl Pfu Ultra (Stratagene)
33μl H2O Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet (GeneAmp PCR System 9700; Applied Biosystems):
94°C 2 min Denaturierung
30 Zyklen mit 94°C 30sek (Denaturierung)
59°C 30sek (Annealing)
72°C 1 ,5min (Extension)
72°C 7min abschließende Extension 4°C Kühlung bis zu Weiterverarbeitung
Die PCR ergibt ein Produkt von 1143bp bzw. 1705bp. Das erhaltene PCR-Produkt wird über ein 1 % Agarosegel isoliert, aus dem Gel extrahiert und in pCR4-Topo (Fa. Invitro- gen Life Technologies) mittels T-Überhang-Ligation kloniert und sequenziert. Die unter SEQ ID NO: wiedergegebene Sequenz ist also identisch mit der Armadillo-Sequenz aus Arabidopsis thaliana.
Um das Gen zusammenzufügen, wird das PCR-Produkt von 1705bp in pUC18 kloniert. Hiernach erfolgt die Klonierung von AtArm 1 143bp in pUC18-AtArm 1705bp.
Zur konstitutiven Expression wird ein Antsensekonstrukt generiert. Hierfür wird HvArm antisense in den binären Vektor 1 bxSuperGus kloniert, indem HvArm über Smal aus pUC18 herausgeschnitten wird und über die genannte Schnittstellen in den am 5'- Ende geblunteten 1 bxSuperGus (Sacl/Smal) kloniert. Die Orientierung wird mittels Testverdau überprüft.
Beispiel 5: Durchführung der transienten Einzelzell-RNAi-Analyse
Biologisches Material
Gerste near-isogenic lines (NILs) der Kultivare cv Ingrid (MIo) und Ingrid BC7 m/oδbzw. Gerste cv Golden Promise wurden in Töpfen mit Komposterde (des IPK Gatersleben) in Klimakammern angezogen (16 h Licht von Metallhalogen-Lampen; 8 h Dunkelheit, 70 % rel. Luftfeuchte, 18°C konstante Temperatur). Blumeria graminis DC Speer f.sp. hordei (BgIi) (Isolate 4.8 enthaltend AvrMlaθ) wurde bei 22°C und 16 h Licht durch wöchentlichen Transfer auf frische Gerstenblätter des Kultivars cv. Golden Promise kultiviert. Blumeria graminis OC Speer f.sp. tritici Εm Marchai (Bgt) des Schwezier lsoltes FAL (Reckenholz) wurde bei 22°C und 16 h Licht durch wöcnetlichen Transfer auf frische Blätter von Weizen des Kultivars cv. Kanzler propagiert. Plasmid Vektoren
Der Vektor plPKTA38 wurde als Entry Vector für das Gateway™ Cloning System (In- vitrogen) verwendet. Bei dem Vektor handelt es sich um ein pENTRI a-Derivat, bei dem das ccdB-Gen entfernt wurde und eine neuartige Multiple Cloning Site eingefügt wurde. Als Destination Vektor diente plPKTA30N, der auf einem pUC18-Hintergrund basiert und einen kostitutiven Promoter, Terminator und zwei Gateway-Cassetten enthaltend attR sites, ccdB-Gen sowie ein Chloramphenicol-Resistenz-Gen, enthält. Die zwei Cassetten sind in umgekhrter Ausrichtung angeordnet und durch einen Spacer des Weizen RGA2-Gens (Akzession-Nummer AF326781 ) voneinander getrennt. Die- ses Vektorsystem erlaubt eine Einzelschritt-Transfer von zwei Kopien eines PCR-
Fragments via Entry-Vektor in den dsRNAi-Vektor durch Gateway LR Clonase Reaktion (Invitrogen).
PCR und Primer-Design EST-Sequenzen des Target-Gens wurden über PCR amplifiziert. Gereinigte DNA der ausgewählten cDNA-Klone wurde als Template für die PCR-Reaktion verwendet. Die Primer wurden mit Hilfe des Software-Paketes „Primer3" im batch-file-Modus unter Verwendung der 5'-EST-Sequenzen abgeleitet. Typischweise wurden die EST- Sequenzen mit einem Universal Forward-Primer und einem reversen EST-specifischen Primer amplifiziert. Die amplifizierten Produkt hatten eine Größenordnung von 400-700 bp. 'Die Primer waren 20-22 bp lang und wiesen eine Tm von ca. 65 °C auf. Die PCR- Reaktionen wurden in 96-well Mikrotiterplatten unter Verwendung einer DNA- Polymerase, welche stumpfe Enden produziert, durchgeführt (ThermalAce; Invitrogen). Die PCR-Produkte wurden gereinigt mit Hilfe des MinElute UF-Kits (Qiagen, Hilden, Germany) und mit 25 μl_ Wasser eluiert.
Ligation in den Entry-Vektor
Die PCR-Fragmente wurden in die Swal-Schnittstelle dese Vektors plPKTA38 kloniert.
Die Ligation wurde bei 25 °C in Gegenwart der N U T4 DNA ligase (MBI Fermentas) und 5 U Swa\ per Reaktion. Um die Reaktionsbedingungen für Swa I zu optimieren, wurde der Puffer mit NaCI auf eine Endkonzentration von 0.05 M supplementiert. Nach 1 h wurde die Reaktion durch Erhitzen auf 65 °C für 15 min beendet. Darauf wurden zusätzliche 5 U Swa I zugefügt, um eine Re-Iigation des Plasmids zu unterdrücken. Der Swa I-Puffer wurde mit zusätzlichem NaCI auf eine finale Konzentration von 0.1 M supplementiert. Die Reaktionanasätze wurden weiter für 1 h inkubiert bei 25 °C.
Die resultierenden rekombinanten plPKTA38-EST Klone wurden für die Transformation chemisch-kompetent E.cσ//DH10B-Zellen in 96-well PCR-Mikrotiterplatten (5μL Ligati- onanasatz auf 20 μL kompetente Zellen) eingesetzt und auf LB-Ag arplatten mit Kana- mycin ausplattiert. Eine Kolonie jeder Klonierungsreaktion wurde gepickt und in 1.2 mL LB+Kanamycin Flüssigkultur aufgenommen, in 96-deep-well Platten verteilt. Dier Platten wurden mit einer luftdurchlässigen Folie abgedeckt und bei 37 °C für 18 h auf einem Schüttler inkubiert. Die deep-well Platten wurden daraufhin bei 750 g for 10 min zentrifugert und die Pellets zur Plasmidisolation mittels NucleoSpin Robot-96 Plasmid Kit (Macherey-Nagel) genutzt. Das Vorliegen des plPKTA38-Plasmids wurde über Restriktiosverdau mit EccR\ nachgewiesen. Die positiven plPKTA38-Klone wurden als Donor-Vektor in der LR-Reaktion eingesetzt.
LR-Reaktion und Präparation von RNAi-Konstrukten
EST-Fragmente in plPKTA38 wurden in den RNAi Destination-Vekor plPKTA30N als inverted repeats über eine einzige LR-Rekombinationsreaktion kloniert. Das Reaktionsvolumen wurde auf 6 μl_ reduziert und enthielt 1 μl_ des plPKTA38 Donor-Klons, 1 μL plPKTA30N Destination-Vektor (150 ng/μL), 0.8 μl_ LR Clonase Enzyme Mix und 3.2 μL H2O. Die Reaktion wurde übrer Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, und 5 μL davon wurden in 20 μL chemisch-kompetente E. colhZe\\ev\ in 96-well PCR Platten transformiert. Zwei 96-deep-well Platten mit LB + Ampicillin wurden zur Hälfte mit dem halben Volumen Transformationsansatz gefüllt, mit einer luftdurchlässigen Folie abge- schlössen und bei 37 °C für 24 h auf einem Plattenschüttler inkubiert. Daraufhin wurden die deep-well Platten bei 750 g für 10 min zentrifgueiert und die Pellets von zwei Duplikaten eines jeden Klons vereinigt und der Plasmind-Präparation unterzogen. Dazu diente das NucleoSpin Robot-96 Plasmid Kit (Macherey-Nagel). Die DNA-Menge betrug durchschnittlich 20-30 μg DNA pro Klon.
Partikelbeschuss und Inokulation mit Pilzsporen
Segmente von Primärblättern von 7 Tage alten Gerstekeimlinge wurden auf 0.5% w/v Phytoagar (Ducheva) in Wasser, welches 20 ppm Benzimidazol enthielt, gelegt und bombardiert mit Goldpartikeln (Durchmesser 1 μm) in einem PDS-1000/He System (Bio-Rad, München, Germany) unter Verwendung des Hepta Adaptors mit einem Helium-Druck von 900 psi. Sieben Blattsegmente wurden pro Bombardment eingesetzt. Die Partikelbeschichtung mit 0.5 M Ca(NOs)2 wurde gemäß Schweizer et al., 1999 durchgerführt. Allerdings enthielt die Stammlösung 25 mg mL"1 Gold. Der Überstand wurde nach der Beschichtung vollständig entfernt, und die Partikel wurden in 30 μl pu- rem Ethanol resuspendiert. 2.18 mg Gold Microcarrier wurden pro Bombardment eingesetzt. Vier Stunden nach Beschüß wurden die Blattsegmente auf 1 % w/v Phytoagar (Ducheva) in Wasser, welches 20 ppm Benzimidazol enthielt, in 20 x 20 cm Platten gelagert und an beiden Ende mit Gewichten fixiert.
Die Blattsegmente wurden mit Sporenb von Bgt und Bgh 48 h bzw. 96 h nach Partikel- beschuß inokuliert. Als Reporterkonstrukt für transformierte Epidermiszellen wurde das Plasmid pUbiGUS, welches das ß-glucuronidase (GUS)-Gen unter Kontrolle des Mais- Ubiquitinpromotors enthält, eingesetzt. Die Blattsegmente wurden 40 h nach Inokulation auf GUS-Aktivität gefärbt und mit 7.5% w/v Trichloressigsäure und 50 % Methanol für 5 Minuten entfärbt. Die GUS-Färbelösug ist in Schweizer et al. 1999 beschrieben worden. Zur Auswertung der Interaktionsphänotypen wurden lichtmikroskopisch GUS-gefärbte Zellen ausgezählt und die Anzahl an Haustorien in diesen tranformierten Zellen bestimmt, woraus sich der haustoriale Index ableitet. Alternativ dazu wurde die Anzahl an GUS-gefärbten Zellen, die mindestans ein Haustorium enthielten, bestimmt und daraus der Suszeptibilitätsindex errechnet.
Ergebnisse: Erhöhung der Mehltauresistenz von Gerste durch RNAi von ARM-Repeat Proteinen
Anfälligkeit Sporen/mm2
0,07 200 0,13 0,01 0,02 0,01 0,07 0,07
Anfälligkeit Sporen/mm2
0,1 200 0,06 0,01 0,05 0,06 0,08
S. auch Figur 4

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erhöhung der Resistenz gegenüber Pathogenen in einer Pflanze oder in einem Teil einer Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität ei- nes Armadillo repeat ARM1 Proteins in einer Pflanze oder in einem Teil der
Pflanze vermindert ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Aktivität in Mesophyll- und/oder Epider- miszellen vermindert ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid kodiert wird von einem Polynukleotid umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) Nukleinsäuremolekül, das mindestens ein Polypeptid kodiert umfassend die in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 50% zu den Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, oder 44, aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,
26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird; f) Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann;
oder eine komplementäre Sequenz davon umfasst.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aktivität in Lemma (Deckspelze), palea (Vorspelze), Glume (Antherenanlage) reduziert ist.
1 Seq/41 Seiten Rg.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Resistenz durch die Reduzierung der Expression eines Polypeptids, das zwei oder mehr Armadillo re- peats enthält, erreicht wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die endogene Sequenz einer Nukleinsäure codierend für ein Armadillo repeat ARM1 Polypeptid mutiert ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Pathogene ausgewählt sind aus den Familien der Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae und Hypocrea- ceae.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 wobei
a) die Expression des in den Ansprüchen 1 bis 7 charakterisierten Polypeptids reduziert wird; b) die Stabilität des in den Ansprüchen 1 bis 7 charakterisierten Polypeptids oder der zu diesem korrespondierenden mRNA Moleküle reduziert wird; c) die Aktivität des in den Ansprüchen 1 bis 7 charakterisierten Polypeptids reduziert wird; d) die Transkription eines Gens kodierendend für das in den Ansprüchen 1 bis
7 charakterisierten Polypeptids durch Expression eines endogenen oder ar- tifiziellen Transkriptionsfaktors reduziert wird; oder e) ein exogener die Aktivität des in den Ansprüchen 1 bis 7 charakterisierten Polypeptids reduzierender Faktor zu der Nahrung oder dem Medium hinzu- gegeben wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verminderung der Aktivität des in den Ansprüchen 1 bis 7 charakterisierten Polypeptids erreicht wird durch Anwendung mindestens eines Verfahrens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für Ribonukleinsäuremoleküle geeignet zur Bildung von Doppelstrang-Ribonukleinsäuremolekülen (dsRNA), wobei der Sense-Strang des dsRNA-Moleküls eine Homologie von mindestens 30 % zu einem in Anspruch 2 charakterisierten Nukleinsäuremoleküls aufweist oder ein Fragment von mindestens 17 Basenpaaren umfasst, welches mindestens 50 % Homologie zu einem in Anspruch 2(a) oder (b) charakterisierten Nukleinsäuremolekül aufweist, b) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein Antisense- Ribonukleinsäuremolekül welches zumindest eine Homologie von 30 % zum nicht kodierenden Strang eines in Anspruch 2 charakterisierten Nukleinsäuremoleküls aufweist oder ein Fragment von mindestens 15 Basen- paaren umfasst, welches mindestens 50 % Homologie zu einem nicht kodierenden Strang eines in Anspruch 2 (a) oder (b) charakterisierten Nuk- leinsäuremoleküls aufweist, c) Einbringen eines Ribozyms welches spezifisch die von einem der in An- spruch 2 benannten Nukleinsäuremoleküle kodierten Ribonukleinsäuremoleküle spaltet oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette, d) Einbringen eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls wie in (b) spezifiziert, kombiniert mit einem Ribozym oder einer deren Expression gewährleisten- den Expressionskassette, e) Einbringen von Nukleinsäuremolekülen kodierend für Sense-Ribonukleinsäuremoleküle kodierend für ein Polypeptid welches durch ein in Anspruch 2 charakterisiertes Nukleinsäuremolekϋl kodiert wird, insbesondere der Proteine gemäß der Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62, oder für
Polypeptide die zumindest 40% Homologie zu der Aminosäuresequenz eines Polypeptids aufweisen, die durch die in Anspruch 2 benannten Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, f) Einbringen eines Nukleiπsäuremoleküls kodierend für ein dominant- negatives Polypeptid geeignet zur Unterdrückung der Aktivität des in den
Ansprüchen 1 bis 7 charakterisierten Polypeptids oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette, g) Einbringen eines Faktors, der spezifisch das in den Ansprüchen 1 bis 7 charakterisierte Polypeptid oder die für dieses Polypeptid kodierenden DNA- oder RNA-Moleküle binden kann oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette, h) Einbringen eines viralen Nukleinsäuremoleküls, das einen Abbau von mRNA Molekülen bewirkt, die für das in den Ansprüchen 1 bis 7 charakterisierte Polypeptid kodieren, oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette, i) Einbringen eines Nukleinsäurekonstrukts geeignet zur Induktion einer homologen Rekombination an Genen kodierend für das in den Ansprüchen 1 bis 7 charakterisierte Polypeptid; und j) Einführung einer oder mehrerer inaktivierender Mutationen in ein oder mehr Gene kodierend für das in den Ansprüchen 1 bis 7 charakterisierte Polypeptid.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend
a) die Einbringung einer rekombinanten Expressionskassette enthaltend in funktioneller Verknüpfung mit einem in Pflanzen aktiven Promotor eine Nukleinsäuresequenz wie charakterisiert in Anspruch 9 (a-i) in eine pflanzliche Zelle; b) Regeneration der Pflanze aus der pflanzlichen Zelle, und c) Expression besagter Nukleinsäuresequenz in einer Menge und für eine Zeit, hinreichend um eine Pathogenresistenz in besagter Pflanze zu erzeugen oder zu erhöhen.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem in Pflanzen aktiven Promotor um einen Pathogen-induzierbaren Promotor handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem in Pflanzen aktiven Promotor um einen Epidermis- oder Mesophyll- spezifischen Promotor handelt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass in der Pflanze, dem pflanzlichen Organ, pflanzlichen Gewebe oder der pflanzlichen Zelle die Aktivität eines Polypeptids codierend für Bax Inhibitor 1 , ROR2, SnAP34, und/oder Lumenal Binding Protein BiP erhöht ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass in der Pflanze, dem pflanzlichen Organ, pflanzlichen Gewebe oder der pflanzlichen Zelle die Aktivität eine Polypeptides codierend für RacB, CSL1, HvNaOX und/oder MLO vermindert wird.
15. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Bax-Inhibitor 1 unter Kontrolle eines Mesophyll und/oder Wurzel spezifischen Promotors exprimiert wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Pathogen ausgewählt ist aus den Arten Puccinia triticina, Puccinia striiformis,
Mycosphaerella graminicola, Stagonospora nodorum, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae oder Microdochium nivale.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze aus den Pflanzengattungen Hordeum, Avena, Seeale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum und Oryza ausgewählt ist.
18. Nukleinsäuremolekül codierend für ein Armadillo-repeat ARM1 Protein, umfas- send mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekül, das mindestens ein Polypeptid kodiert umfassend die in SEQ ID No: 2 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID No: 1 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 50% zu den Sequenzen SEQ ID No: 2 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ. ID No.: 2 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches von einem mo- noklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die
Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird; f) Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann;
oder eine komplementäre Sequenz davon umfasst; oder ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz codiert von dem Nukleinsäuremolekül;
wobei das Nukleinsäuremolekül nicht aus der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO.: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 be- steht;
19. Nukleinsäure-Konstrukt enthaltend ein Nukleinsäuremolekül enthaltend mindestens ein Fragment eines Nukleinsäuremolekül antisense oder sense zu einem Nukleinsäuremolekül kodierend für Armadillo repeat ARM1 Polypeptid funktionell verknüpft mit einem pathogen-induzierbaren Promoter oder einem Epidermis- und/oder Mesophyll-spezifischen Promoter.
20. Konstrukt nach Anspruch 19, wobei das Aramdillo repeat ARM1 Polypeptid kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in
SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz nach der SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine I- dentität von mindestens 40 % zu den Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, oder 44, aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird; und f) Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; oder g) Nukleinsäuremolekül, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann;
oder komplementär dazu ist.
21. Doppelsträngiges RNA-Nukleinsäuremolekül (dsRNA-Molekül) wobei der Sense- Strang des besagten dsRNA-Moleküls mindestens eine Homologie von 30 % zu dem Nukleinsäuremolekülmolekül wie in Anspruch 3 charakterisiert aufweist, oder ein Fragment von mindestens 50 Basenpaaren umfasst, welches mindes- tens eine 50 % Homologie zu dem Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 3 charakterisiert besitzt.
22. dsRNA-Molekül nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die beiden RNA-Stränge kovalent miteinander verbunden sind.
23. DNA Expressionskassette umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das im wesentlichen identisch ist zu einem Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 3 charakterisiert, wobei besagtes Nukleinsäuremolekül in Sense-Orientierung zu einem Promotor vorliegt.
24. DNA Expressionskassette umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das im wesentlichen identisch ist zu einem Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 3 charakterisiert, wobei besagtes Nukleinsäuremolekül in Antisense-Orientierung zu einem Promotor vorliegt.
25. DNA Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein dsRNA-Molekül gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei besagte Nukleinsäuresequenz mit einem Promotor verknüpft ist.
26. DNA Expressionskassette nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit einem in Pflanzen funktionellen Promotor verknüpft ist.
27. DNA Expressionskassette nach Anspruch 26, wobei der in Pflanzen funktionelle Promotor ein pathogen-induzierbarer oder einem Epidermis- und/oder Mesophyllspezifischer Promotor ist.
28. Vektor enthaltend eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27.
29. Zelle, enthaltend eine Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 3 charakterisiert, ein dsRNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 21 oder 22, eine DNA- Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26, ein Nukleinsäuremolekül oder ein Polypeptid nach Anspruch 18, oder einen Vektor gemäß An- Spruch 28 oder bei der die endogene Aktivität eines Polypeptids codiert durch ein
Nukleinsäuremolekül charakterisiert wie in Anspruch 3 vermindert oder ausgeschaltet ist.
30. Transgener nicht-humaner Organismus enthaltend eine Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 3 charakterisiert, ein Nukleinsäuremolekül oder ein Polypeptid nach
Anspruch 18, ein dsRNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 21 oder 22, eine DNA-Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26, eine Zelle nach Anspruch 29 oder einen Vektor gemäß Anspruch 28.
31. Transgener nicht-humaner Organismus nach Anspruch 30 der ein monokotyle- doner Organismus ist.
32. Transgener nicht-humaner Organismus enthaltend eine Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 3 charakterisiert, ein Nukleinsäuremolekül oder ein Polypeptid nach Anspruch 18, ein dsRNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 21 oder 22, eine
DNA-Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26, eine Zelle nach Anspruch 29 oder einen Vektor gemäß Anspruch 28, der über eine erhöhte Bax Inhibitor 1 -Protein-, ein ROR2-, und/oder SnAP34- Aktivität verfügt und/oder eine verminderte RacB-, CSL1-, und/oder HvRBOHF -Aktivität .
33. Nicht-humander Organismus enthaltend eine Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 3 charakterisiert, ein Nukleinsäuremolekül oder ein Polypeptid nach An- spruch 18, ein dsRNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 21 oder 22, eine DNA-Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26, eine Zelle nach Anspruch 29 oder einen Vektor gemäß Anspruch 28, der eine erhöhte Bax Inhibitor 1-, ein ROR2-, und/oder SnAP34- Aktivität und/oder eine verminderte RacB-, CSL1-, und/oder HvRBOHF -Aktivität in Mesophyllzellen und/oder Wurzelzellen besitzt.
34. Organismus gemäß einem der Ansprüche 30 bis 33, ausgewählt aus den Arten Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Seeale cereale (Roggen),
Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) und Oryza sative (Reis).
35. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls wie in Anspruch 3 charakterisiert, eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids nach Anspruch 18, eines dsRNA-
Moleküls gemäß einem der Ansprüche 21 oder 22, einer DNA-Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26, einer Zelle nach Anspruch 29 oder eines Vektors gemäß Anspruch 28 zur Herstellung einer Pflanze, die resistent gegen Mesophyllzellen penetrierende Pathogene ist.
36. Ernte, Vermehrungsmaterial oder Zusammensetzung enthaltend d eine Nuklein- säuremolekül wie in Anspruch 3 charakterisiert, ein Nukleinsäuremolekül oder ein Polypeptid nach Anspruch 18, ein dsRNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 21 oder 22, eine DNA-Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26, eine Zelle nach Anspruch 29 oder einen Vektor gemäß Anspruch 28.
EP06819167A 2005-11-08 2006-10-27 Verwendung von armadillo-repeat (arm1)-polynukleotiden zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen Withdrawn EP1948806A2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06819167A EP1948806A2 (de) 2005-11-08 2006-10-27 Verwendung von armadillo-repeat (arm1)-polynukleotiden zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05110468 2005-11-08
PCT/EP2006/067865 WO2007054441A2 (de) 2005-11-08 2006-10-27 Verwendung von armadillo-repeat (arm1)-polynukleotiden zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen
EP06819167A EP1948806A2 (de) 2005-11-08 2006-10-27 Verwendung von armadillo-repeat (arm1)-polynukleotiden zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1948806A2 true EP1948806A2 (de) 2008-07-30

Family

ID=37820815

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP06819167A Withdrawn EP1948806A2 (de) 2005-11-08 2006-10-27 Verwendung von armadillo-repeat (arm1)-polynukleotiden zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen

Country Status (6)

Country Link
US (2) US8362323B2 (de)
EP (1) EP1948806A2 (de)
AR (1) AR056782A1 (de)
AU (1) AU2006311089C1 (de)
CA (1) CA2628505A1 (de)
WO (1) WO2007054441A2 (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007054441A2 (de) * 2005-11-08 2007-05-18 Basf Plant Science Gmbh Verwendung von armadillo-repeat (arm1)-polynukleotiden zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen
EP2078087A1 (de) * 2006-10-12 2009-07-15 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur erhöhung der pathogenresistenz in transgenen pflanzen
GB201818715D0 (en) * 2018-11-16 2019-01-02 British American Tobacco Investments Ltd Method
CN117947055B (zh) * 2024-03-27 2024-07-16 西北农林科技大学深圳研究院 一种小麦条锈菌效应蛋白及其应用

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
EP0131623B2 (de) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimärische gene geeignet zur expression in pflanzenzellen
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
JPS62291904A (ja) 1986-06-12 1987-12-18 Namiki Precision Jewel Co Ltd 永久磁石の製造方法
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
RO114469B1 (ro) 1987-12-15 1999-04-30 Gene Shears Pty Ltd Compus oligoribonucleotidic, procedeu de preparare si metoda de inactivare
EP0332104A3 (de) 1988-03-08 1991-03-20 Ciba-Geigy Ag Chemisch regulierte Sequenzen und Gene, und ihre Verwendungen
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
US5789214A (en) 1988-03-08 1998-08-04 Novartis Finance Corporation Method of inducing gene transcription in a plant
NZ228320A (en) 1988-03-29 1991-06-25 Du Pont Nucleic acid promoter fragments of the promoter region homologous to the em gene of wheat, dna constructs therefrom and plants thereof
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
DE3843628A1 (de) 1988-12-21 1990-07-05 Inst Genbiologische Forschung Wundinduzierbare und kartoffelknollenspezifische transkriptionale regulation
EP0388186A1 (de) 1989-03-17 1990-09-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company Externe Regulierung der Genexpression
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
EP0409625A1 (de) 1989-07-19 1991-01-23 Calgene, Inc. Obstspezifische Transkriptionsfaktoren
GB9005772D0 (en) 1990-03-14 1990-05-09 Cambridge Advanced Tech Plant promoter
WO1991013980A1 (en) 1990-03-16 1991-09-19 Calgene, Inc. Novel sequences preferentially expressed in early seed development and methods related thereto
US5187267A (en) 1990-06-19 1993-02-16 Calgene, Inc. Plant proteins, promoters, coding sequences and use
US5639949A (en) 1990-08-20 1997-06-17 Ciba-Geigy Corporation Genes for the synthesis of antipathogenic substances
DE69133512T2 (de) 1990-11-23 2006-09-28 Bayer Bioscience N.V. Verfahren zur Transformation monokotyler Pflanzen
GB9105420D0 (en) 1991-03-14 1991-05-01 Ici Plc Expression of genes in transgenic plants
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
WO1993021334A1 (en) 1992-04-13 1993-10-28 Zeneca Limited Dna constructs and plants incorporating them
US5428148A (en) 1992-04-24 1995-06-27 Beckman Instruments, Inc. N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis
US5908973A (en) 1993-03-22 1999-06-01 Zeneca Limited DNA encoding fruit-ripening-related proteins, DNA constructs, cells and plants derived therefrom
US5470353A (en) 1993-10-20 1995-11-28 Hollister Incorporated Post-operative thermal blanket
GB9324707D0 (en) 1993-12-02 1994-01-19 Olsen Odd Arne Promoter
CN1048254C (zh) 1993-12-09 2000-01-12 托马斯杰弗逊大学 用于将预定的改变引入靶基因中的化合物
GB9403512D0 (en) 1994-02-24 1994-04-13 Olsen Odd Arne Promoter
GB9421286D0 (en) 1994-10-21 1994-12-07 Danisco Promoter
US5750868A (en) 1994-12-08 1998-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants
AU716814B2 (en) 1995-03-09 2000-03-09 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Chimeric genes comprising a fungus-responsive element
AUPN283495A0 (en) 1995-05-05 1995-06-01 Australian National University, The Plant promoter activated by fungal infection
US6100451A (en) 1995-05-18 2000-08-08 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Pathogen-inducible regulatory element
ATE319477T1 (de) 1995-08-03 2006-03-15 Univ Leiden Antigen presentierende bläschen, die von zellen ableiten
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
AR006928A1 (es) 1996-05-01 1999-09-29 Pioneer Hi Bred Int Una molecula de adn aislada que codifica una proteina fluorescente verde como marcador rastreable para la transformacion de plantas, un metodo para laproduccion de plantas transgenicas, un vector de expresion, una planta transgenica y celulas de dichas plantas.
EP0868426A4 (de) 1996-07-23 2002-04-17 Syngenta Participations Ag Chemisch induzierbarer arabidopsis-pr-1-promoter
CN1231673B (zh) 1996-07-29 2012-05-02 基根奈公司 在植物中调节防御反应的多核苷酸及其用途
US5955361A (en) 1996-11-20 1999-09-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. P gene promoter constructs for floral-tissue preferred gene expression
EP0870836A1 (de) 1997-04-09 1998-10-14 IPK Gatersleben 2-Desoxyglucose-6-Phosphat (2-DOG-6-P) Phosphatase DNA-Sequenzen als Selektionsmarker in Pflanzen
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
ES2276475T5 (es) 1997-09-30 2014-07-11 The Regents Of The University Of California Producción de proteínas en semillas de plantas
US6072103A (en) 1997-11-21 2000-06-06 Calgene Llc Pathogen and stress-responsive promoter for gene expression
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
EP1064304A2 (de) 1998-03-17 2001-01-03 Novartis AG Gene welche für mlo proteine kodieren und pilzresistenz in pflanzen vermitteln
WO1999050428A2 (en) 1998-04-01 1999-10-07 Mogen International N.V. Pathogen-inducible promoter
SI1068311T1 (sl) 1998-04-08 2011-07-29 Commw Scient Ind Res Org Postopki in sredstva za pridobivanje modificiranih fenotipov
GB9813345D0 (en) 1998-06-19 1998-08-19 Nickerson Biocem Ltd Promoters
DE19882583D2 (de) 1998-07-01 2000-10-12 Kws Saat Ag Promotoren und Promotorelemente zur Erhöhung der Pathogen-Induzierbarkeit von Genen in Pflanzen
US6576814B1 (en) 1998-07-07 2003-06-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Manipulation of Mlo genes to enhance disease resistance in plants
US6555732B1 (en) 1998-09-14 2003-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes and methods of use
DE19852195C2 (de) 1998-11-04 2000-11-02 Inst Pflanzengenetik & Kultur Neue Expressionskassette zur Expression von beliebigen Genen in Pflanzensamen
CA2361201A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
WO2000049035A1 (en) 1999-02-19 2000-08-24 The General Hospital Corporation Gene silencing
EP1041148A1 (de) 1999-04-02 2000-10-04 Mogen International N.V. Pathogen-induzierbarer Promotor
BR0009884A (pt) 1999-04-21 2002-01-08 American Home Prod Processos e composições para a inibição da função das sequências de polinucleotìdeos
CZ20014028A3 (cs) 1999-05-10 2002-02-13 Syngenta Participations Ag Způsob regulace exprese virových genů
AU2001234160A1 (en) * 2000-02-25 2001-09-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Novel armadillo repeat-containing protein alex1
AU2002246585A1 (en) 2000-11-09 2002-07-30 Washington State University Research Foundation Plant promoters, and methods of use
US7456335B2 (en) 2001-09-03 2008-11-25 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences and their use in methods for achieving pathogen resistance in plants
JP2005185101A (ja) 2002-05-30 2005-07-14 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用
DE10233327A1 (de) 2002-07-22 2004-02-05 Basf Ag Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen
WO2007054441A2 (de) 2005-11-08 2007-05-18 Basf Plant Science Gmbh Verwendung von armadillo-repeat (arm1)-polynukleotiden zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2007054441A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20090241215A1 (en) 2009-09-24
AU2006311089A1 (en) 2007-05-18
CA2628505A1 (en) 2007-05-18
US8735654B2 (en) 2014-05-27
WO2007054441A2 (de) 2007-05-18
AU2006311089C1 (en) 2012-11-08
AR056782A1 (es) 2007-10-24
US20130104260A1 (en) 2013-04-25
WO2007054441A3 (de) 2007-07-26
AU2006311089B2 (en) 2012-06-07
US8362323B2 (en) 2013-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1525315B1 (de) Verfahren zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen
EP1427833B1 (de) Neue nukleinsaeuresequenzen und deren verwendung in verfahren zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen
EP2059600B1 (de) Verfahren zur erhöhung der pathogenresistenz in transgenen pflanzen
US8735654B2 (en) Use of Armadillo repeat (ARM1) polynucleotides for obtaining pathogen resistance in plants
EP2487245A2 (de) Verfahren zur Erhöhung der Pathogenresistenz in transgenen Pflanzen
WO2004081217A2 (de) Verfahren zur erhöhung der resistenz gegen stressfaktoren in pflanzen
DE102004024184A1 (de) Neue Nukleinsäuresequenzen und deren Verwendung in Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen
EP2202314B1 (de) Pathogenresistente Pflanzen durch Verwendung von für Subtilisin (RNR9) kodierende Nukleinsäuren
AU2007204341B2 (en) Use of stomatin (STM1) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants
AU2012216838A1 (en) Use of stomatin (STM1) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants
DE10142579A1 (de) Neue Nukleinsäuresequenzen und deren Verwendung in Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen
DE10229729A1 (de) Neue Nukleinsäuresequenzen und deren Verwendung in Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20080609

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR

17Q First examination report despatched

Effective date: 20090312

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

INTG Intention to grant announced

Effective date: 20140806

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20141217