DE69133512T2 - Verfahren zur Transformation monokotyler Pflanzen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein rasches, wirksames Verfahren für die Transformation von monokotylen Pflanzen im allgemeinen, insbesondere Gramineen-Pflanzen, ganz besonders Mais und andere Hauptgetreidearten. Die Erfindung betrifft ganz besonders die Verwendung von entweder intaktem Gewebe, das zur Bildung von kompaktem embryogenem Callus fähig ist, oder kompaktem embryogenem Callus, der von solch einem Gewebe erhalten wurde, zur Herstellung von transgenen monokotylen Pflanzen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch neue transgene Gramineen-Pflanzen, die mit dem erfindungsgemäßen Transformationsverfahren hergestellt werden können.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • In den letzten Jahren haben die Möglichkeiten der Gentechnik bei Pflanzen enorm zugenommen. Es sind viele transgene dikotyle Pflanzenarten hergestellt worden. Es hat sich jedoch erwiesen, daß viele Pflanzenarten, insbesondere diejenigen, die zu den Monocotyledonae, ganz besonders den Gramineae, zählen, darunter wirtschaftlich wichtige Arten wie Mais, Weizen und Reis, sehr schlecht stabil genetisch transformiert werden können.
  • Sowohl bei der Erzielung von a) einer integrativen Transformation von monokotylen Pflanzenzellen mit DNA (also bei der stabilen Insertion von DNA in das nucleäre Genom der monokotylen Pflanzenzellen) als auch bei b) der Regeneration von phänotypisch normalen monokotylen Pflanzen, wie phänotypisch normalen, fruchtbaren, adulten monokotylen Pflanzen, aus transformierten Zellen ist man auf Probleme gestoßen. Es wurde vorgeschlagen, daß diese Probleme in erster Linie auf einer fehlenden Verfügbarkeit von Monocot-Zellen, die in bezug auf folgendes kompetent sind, beruhten: 1) DNA-Aufnahme, 2) integrative Transformation mit der aufgenommenen DNA, sowie 3) Regeneration von phänotypisch normalen monokotylen Pflanzen aus den transformierten Zellen (Potrykus (1990) Bio/Technology 9:535). Im allgemeinen schien es, daß der direkte Gentransfer in Protoplasten (mittels Polyethylenglykolbehandlung und/oder Elektroporation) die größten Erfolgschancen aufwies. Die bei diesen direkten Gentransfermethoden verwendeten Protoplasten wurden sehr häufig aus embryogenen Zellsuspensionskulturen erhalten (Lazzeri und Lörz (1988) Advances in Cell Culture, Band 6, Academic press, S. 291; Ozias-Akins und Lörz (1984) Trends in Biotechnology 2:119). Diese Methoden waren jedoch nur insofern begrenzt erfolgreich, als die Regeneration von phänotypisch normalen Pflanzen aus Protoplasten bei den meisten Genotypen schwierig war.
  • In jüngster Zeit wurde über Erfolge bei der Transformation von bzw. der Regeneration von phänotypisch normalen Pflanzen aus gewissen Linien von Reis (Shimamoto et al. (1989) Nature 338:274; Datta et al. (1990) Bio/Technology 8:736; und Hayashimoto et al. (1990) Plant Physiol. 93:857) und Mais (Gordon-Kamm et al. (1990) Bio/Technology 2:603; Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833; Gould et al. (1991) Plant Physiology 95:426); und PCT-Veröffentlichungen WO91/02071 und WO89/12102) berichtet. Es geht aus diesen Berichten jedoch nicht klar hervor, ob diese Transformations- und Regenerationsvorgänge auf Monokotyle allgemein, insbesondere Gramineen-Pflanzen, ganz besonders Getreide, anwendbar sind.
  • Darstellung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren für die wirksame, reproduzierbare Transformation des Genoms einer monokotylen Pflanze, insbesondere einer Gramineen-Pflanze wie einer Hauptgetreideart (z.B. Mais, Weizen, Reis, Roggen usw.), bereit. Das Verfahren umfaßt die Transformation mit DNA von Zellen von entweder a) einem intakten Gewebe der monokotylen Pflanze, wobei dieses Gewebe zur Bildung von kompaktem embryogenem Callus fähig ist, oder b) einem kompakten embryogenen Callus, insbesondere seinen embryogenen Abschnitten, der bzw. die von solch einem intakten Gewebe stammen, wobei diese Zellen bezüglich folgendem kompetent sind: 1) DNA-Aufnahme, 2) integrative Transformation des Genoms der Pflanze, insbesondere ihres nucleären Genoms, mit der DNA, sowie 3) Regeneration der phänotypisch normalen Pflanze (z.B. der phänotypisch normalen, fruchtbaren adulten Pflanze) aus den Zellen nach Transformation ihres Genoms. Solche kompetente Zellen werden vorzugsweise durch Verwundung und/oder Abbau des intakten Gewebes oder des kompakten embryogenen Callus der Pflanze erhalten, z.B. durch a) Verwundung entweder des intakten Gewebes und deren Zellen oder des kompakten embryogenen Callus und dessen Zellen, der bzw. die von solch einem intakten Gewebe stammen; und/oder b) je nach der Art des intakten Gewebes oder des kompakten embryogenen Callus Behandeln des intakten Gewebes oder des kompakten embryogenen Callus mit einem Enzym, um die Zellwände des intakten Gewebes oder des kompakten embryogenen Callus abzubauen.
  • Das bzw. der erhaltene verwundete und/oder abgebaute intakte Gewebe oder kompakte embryogene Callus, das bzw. der die erfindungsgemäßen kompetenten Zellen enthält, kann nun vorzugsweise durch direkten Gentransfer, wie mittels Elektroporation, mit einem oder mehreren DNA-Fragmenten (z.B. Fremd-DNA-Fragmenten), vorzugsweise linearen DNA-Fragmenten, transformiert werden. Vorzugsweise enthält mindestens eines der DNA-Fragmente ein Gen, das als selektierbarer oder Screening-Marker, vorzugsweise als selektierbarer Marker, für transformierte Pflanzenzellen dienen kann. Solch ein Marker-DNA-Fragment kann auf dem gleichen DNA-Fragment oder auf einem anderen DNA-Fragment wie ein anderes interessierendes Gen bzw. andere interessierende Gene liegen.
  • Die transformierten Zellen können von nicht transformierten Zellen dadurch abgetrennt werden, daß man sie vorzugsweise über einen längeren Zeitraum auf einem Selektivmedium kultiviert, und die so selektierten transformierten Zellen können auf traditionelle Art und Weise zu phänotypisch normalen Pflanzen (z.B. reifen Pflanzen), die das interessierende Gen bzw. die interessierenden Gene stabil in ihre Genome, insbesondere in ihre nucleären Genome, integriert enthalten, regeneriert werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch folgendes bereit: neue kompetente Zellen von monokotylen Pflanzen, insbesondere Gramineen-Pflanzen, ganz besonders Getreidepflanzen, deren Genome stabil mit einem oder mehreren DNA-Fragmenten transformiert worden sind; Zellkulturen, die aus solchen tranformierten Zellen bestehen; phänotypisch normale Pflanzen (z.B. phänotypisch normale, fruchtbare Pflanzen), die aus solchen transformierten Zellen regeneriert wurden; sowie Samen von solchen transformierten Pflanzen. Zu solchen transformierten Zellen, Zellkulturen, Pflanzen und Samen zählen diejenigen, die mit einem DNA-Fragment transformiert wurden, das ein Gen enthält, das ein Protein, das zum Abtöten oder Behindern einer Pflanzenzelle, in der das Protein exprimiert wird und das sich unter der Kontrolle des tapetumspezifischen PTA29-Promotors befindet, wodurch die Pflanzen pollensteril sind, codiert. Die erfindungsgemäßen transformierten Gramineen-Pflanzen, insbesondere transformierter Mais und Reis, sind dadurch gekennzeichnet, daß sie von Pflanzenlinien stammen, von denen es bei traditionellen Techniken praktisch unmöglich ist, die transformierten Pflanzen als phänotypisch normale Pflanzen aus transformierten embryogenen Suspensionskulturen oder von transformierten Protoplasten zu regenerieren, insbesondere von Linien, wo auf 10.000 untransformierte Protoplasten nicht mehr als ungefähr 500, insbesondere nicht mehr als 100, ganz besonders nicht mehr als ungefähr 10, speziell nicht mehr als ungefähr 1, phänotypisch normale Pflanze(n) regeneriert werden kann bzw. können.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1: NPTII-Gel-Assays von Beispiel 2 von fünf Mais-Transformanten, die durch Elektroporation von unreifen zygotischen Embryonen erhalten wurden.
  • 2: Southern-Blots von Beispiel 2 von genomischer DNA von einer der Mais-Transformanten von Beispiel 1 (H99-M148-1) unter Verwendung der Sequenz mit der Seq. Id. Nr. 2 als Sonde. Die Längen der Standard-Fragmente sind angegeben. Der Origin ist durch 0 gekennzeichnet.
    Bahnen: 1: mit PstI verdaute DNA des Phagen lambda + mit HindIII verdautes pTTM1 (Positivkontrolle – Sonde sollte mit dem 2824 Bp großen pTTM1-Fragment hybridisieren)
    2: mit BglII verdaute genomische DNA
    3: mit EcoRI verdaute genomische DNA
    4: mit EcoRV verdaute genomische DNA
    5: mit HindIII verdaute genomische DNA
    6: mit BamHI verdaute genomische DNA
    7: mit PvuI verdaute genomische DNA
    8: mit PvuII verdaute genomische DNA
    9: mit PstI verdaute genomische DNA
    10: mit EcoRI verdaute genomische DNA einer nicht transformierten H99-Pflanze (Negativkontrolle)
  • 3: NptII-Gel-Assays von Beispiel 4 von sieben Transformanten, die durch Elektroporation von Fragmenten von kompaktem embryogenem Callus von unreifen zygotischen Embryonen erhalten wurden.
  • 4: Southern-Blots von Beispiel 4 von genomischer DNA von einer der Mais-Transformanten von Beispiel 3 (Pa91-M146-2) mit der Sequenz Seq. Id. Nr. 2 als Sonde. Die Längen der Standard-Fragmente sind angegeben. Der Origin ist durch 0 gekennzeichnet.
    Bahnen: 1: mit PstI verdaute DNA des Phagen lambda + mit HindIII verdautes pTTM1 (Positivkontrolle – Sonde sollte mit dem 2824 Bp großen pTTM1-Fragment hybridisieren)
    2: mit BglII verdaute genomische DNA
    3: mit EcoRI verdaute genomische DNA
    4: mit EcoRV verdaute genomische DNA
    5: mit HindIII verdaute genomische DNA
    6: mit BamHI verdaute genomische DNA
    7: mit PvuI verdaute genomische DNA
    8: mit PvuII verdaute genomische DNA
    9: mit PstI verdaute genomische DNA
    10: mit EcoRI verdaute genomische DNA (Negativkontrolle)
  • SEQUENZPROTOKOLL
    • Seq. Id. Nr. 1: Sequenz von pDE108
    • Seq. Id. Nr. 2: Sequenz der für den Nachweis des chimären neo-Gens bei Southern-Hybridisierungen verwendeten Sonde
    • Seq. Id. Nr. 3: Sequenz eines DNA-Fragments von Plasmid pTTM8, das bei der Konstruktion der Plasmide pVE107 und pVE108 verwendet wurde und den Promotor des TA29-Gens von Tabak sowie das Barnase-Gen enthält
    • Seq. Id. Nr. 4: Sequenz von pDE110
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Bei Monokotylen existiert embryogener Callus in zwei unterschiedlichen, gutbekannten Typen (siehe Vasil (1988) Bio/Technology 6:397; Armstrong und Green (1988) Crop Sci. 28:363). Ein Typ embryogener Callus kann am besten als kompakt und/oder knotig bezeichnet werden und gilt oft als strukturiert. Dieser Typ von Callus, der im vorliegenden Zusammenhang als "kompakter embryogener Callus" bezeichnet wird, wird erfindungsgemäß verwendet. Der andere, im allgemeinen weniger häufig auftretende Typ von embryogenem Callus kann am besten als weich, locker und stark embryogen beschrieben werden, und dieser Typ von Callus, im vorliegenden Zusammenhang "lockerer embryogener Callus" genannt, wächst im allgemeinen schneller als kompakter embryogener Callus. Aus beiden Callustypen können phänotypisch normale Pflanzen regeneriert werden, und bei beiden Callustypen sind somatische Embryonen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien vorhanden. Das Aussehen und die schlußendliche Morphologie der beiden Callustypen kann je nach der monokotylen Pflanzenart unterschiedlich sein, insbesondere bei unterschiedlichen Getreidearten. Trotzdem können die beiden Callustypen vom Fachmann auf dem Gebiet der Bildung und Handhabung von Gewebekulturen von unterschiedlichen monokotylen Arten leicht voneinander unterschieden werden.
  • Bei Mais sind kompakter embryogener Callus und lockerer embryogener Callus besser als Typ-I-Callus bzw. Typ-II-Callus bekannt. Verschiedene kennzeichnende Merkmale bezüglich der Struktur und Eigenschaften von Typ-I- und Typ-II-Maiscalli werden in Publikationen wie Armstrong und Phillips (1988) Crop. Sci. 28:363; Springer et al. (1979) Protoplasma 101:269; Fransz (1988) "Cytodifferentiation during callus initiation and somatic embryogenesis in Zea mays L. [Zelldifferenzierung während der Callus Initiation und somatischen Embryogenese bei Zea mays L.]", Dissertation, Universität Wageningen, Niederlande; Ozias-Akins et al. (1982) Protoplasma 110:95; Novak et al. (1983) Maydica 28:381; Ho et al. (1983) Protoplasma 118:169; Green et al. (1975) Crop Sci. 15:417; Freeling et al. (1976) Maydica 21:97; Lu et al. (1982) Theor. Appl. Genet. 62:109; Vasil et al. (1985) Protoplasma 127:1; Dunstan et al. (1978) Protoplasma 97:251; Vasil et al. (1982) Bot. Gaz. 143:454; Green (1983) in: Basic biology of new developments in biotechnology, Hollaender et al. (Hrsg.) Plenum Press, New York, S. 195-209; Vasil et al. (1984) Am. J. Bot. 71:158; und Kamo et al. (1985) Bot. Gaz. 146:327 beschrieben.
  • Typ-I-Maiscallus ist im wesentlichen weiß, weißlich oder gelblich und sieht kompakt aus, weist häufig eine knotige Oberfläche auf und stellt die Bildung und Vermehrung einer strukturierten Gruppe von Geweben dar, was sich in seinem knotigen Aussehen ausdrückt. Er ist durch starke Zellassoziation und -differenzierung sowie durch unterschiedliche Strukturen wie Wurzeln, Blattstrukturen und Gefäßelemente gekennzeichnet. Im allgemeinen sind somatische Embryonen wahrnehmbar. Wie regenerierte Sprosse entstehen, ist nicht immer klar; dies kann offenbar sowohl durch somatische Embryogenese als auch durch Organogenese erfolgen. Während der Entwicklung von somatischen Embryonen können Embryoide miteinander fusionieren, wodurch harter, weißer Callus entsteht, oder sie können sich zu sekundären somatischen Embryonen weiter entwickeln.
  • Typ-II-Maiscallus ist im wesentlichen weich, locker, weiß oder hellgelb, sieht gewissermaßen durchsichtig aus und ist stark embryogen. Er wächst rasch und enthält keine Gefäßelemente. Typ-II-Callus unterscheidet sich von nichtembryogenem lockerem Callus dadurch, daß er zahlreiche glatte, kugelförmige Embryoide enthält, die eine suspensorartige Struktur aufweisen können, über die die Embryoide mit dem Callus verbunden sind. Die Embryoide können sich zu gut strukturierten somatischen Embryonen weiterentwickeln.
  • Ungefähr die gleichen kennzeichnenden Merkmale, die bei den zwei Maiscallitypen auftreten, können auch zur Unterscheidung zwischen kompaktem embryogenem Callus und lockerem embryogenem Callus bei anderen monokotylen Arten, insbesondere Getreidearten wie dem Reis (Kyozuka et al. (1988) Theor. Appl. Genet. 76:887), Weizen (Redway et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 76:609); Redway et al. (1990) Plant Cell Reports 8:714) sowie Gerste verwendet werden.
  • Der erfindungsgemäße kompakte embryogene Callus kann im allgemeinen von monokotylen Pflanzen durch in-vitro-Kultur von Explantat-Ausgangsmaterial wie unreifen zygotischen Embryonen, reifen Samen, der Blattbasis, Antheren, Mikrosporen, jungen Blüten usw. erhalten werden. Bei Mais wird Typ-I-Callus am günstigsten aus unreifen zygotischen Embryonen erzeugt. Der kompakte embryogene Callus kann aus entsprechenden Explantaten induziert und nach gut etablierten Verfahren weiter kultiviert werden (siehe Hodges et al. (1986) Bio/Technology 4:219). Während der Weitererhaltung der Calluskultur muß achtgegeben werden, daß nur die embryogenen Teile des Callus, in denen sich die embryogenen Zellen befinden, gewählt und subkultiviert werden. Solche Zellen können allgemein als klein, dicht gedrängt, dünnwandig, cytoplasmareich, stark basophil mit vielen kleinen Vakuolen, Lipidtröpfchen und Stärkekörnern (Vasil (1988), Zitat oben) beschrieben werden. Am bequemsten entfernt man von einer Pflanze diejenigen Gewebe, von denen bekannt ist, daß sie kompakten embryogenen Callus bilden können, durch Zerschneiden.
  • Die erfindungsgemäßen kompetenten Zellen können direkt von einer monokotylen Pflanze dadurch erhalten werden, daß man aus der Pflanze auf traditionelle Art und Weise intaktes Gewebe, das zur Bildung von kompaktem embryogenem Callus fähig ist, herausschneidet. Die Zellen von diesem verwundeten intakten Gewebe können anschließend stabil transformiert werden. Bevorzugt werden jedoch diese verwundeten intakten Gewebe in kleinere Stücke geschnitten, um das Gewebe stärker zu verwunden und mehr kompetente Zellen für die Transformation bereitzustellen. Die maximale durchschnittliche Abmessung der Gewebestücke ist vorzugsweise eine Länge von 0,1 bis 5 mm, insbesondere eine Länge von 1 bis 2,5 mm, ganz besonders eine Länge von 1,25 bis 1,75 mm. Diesbezüglich kann es sich bei dem erfindungsgemäßen verwundeten intakten Gewebe um ein beliebiges Gewebestück handeln, das aus der Pflanze herausgeschnitten wurde, bzw. beliebige Stücke davon (z.B. abgeschnittene Stücke). Der Begriff "intaktes Gewebe" ist also so zu verstehen, daß er Aggregate von Zellen monokotyler Pflanzen, die von einem natürlich vorkommenden Pflanzenteil ohne Gewebekultur-Zwischenschritt erhalten werden.
  • Man ist der Meinung, daß das mechanische Aufbrechen oder Verwunden des intakten Gewebes und seiner einzelnen Zellen durch Herausschneiden des intakten Gewebes aus der Pflanze und gegebenenfalls dessen weiteres zerschneiden, um es weiter aufzubrechen oder zu verwunden, im allgemeinen ausreicht, die kompetenten Zellen der vorliegenden Erfindung zu erzeugen.
  • Diesbezüglich sollen die Begriffe "mechanisches Aufbrechen" und "Verwunden" die wesentliche Schädigung der Zellwand von einer oder mehreren Zellen des intakten Gewebes umfassen, um die Zelle(n) offenzulegen und die Zelle(n) für die Insertion eines erfindungsgemäßen DNA-Fragments bereitzumachen. "Mechanisches Aufbrechen" oder "Verwunden" ist erfindungsgemäß also nicht auf das Zerschneiden der Zellwand beschränkt, sondern beinhaltet auch andere Verfahren zur physikalischen Entfernung von einem oder mehreren Teilen der Zellwand oder zur Unterbrechung der Zellwand an einer oder mehreren Stellen, wie z.B. durch Abreiben, Drücken oder Zerschlagen der Zellwand.
  • Das mechanische Aufbrechen oder Verwunden des erfindungsgemäßen intakten Gewebes kann jedoch auch durch Behandlung des intakten Gewebes mit einem Enzym oder einer Enzymmischung zum Abbau der pflanzlichen Zellwände ergänzt oder sogar ersetzt werden, insbesondere dann, wenn das intakte Gewebe relativ groß ist. Die Enzymbehandlung kann auf traditionelle Art und Weise durchgeführt werden. Vorzugsweise wird das Enzym auf das intakte Gewebe in erster Linie dazu aufgetragen, um Poren in der Zellwand zu erzeugen. Die Enzymbehandlung ist daher vorzugsweise relativ kurz (und dauert z.B. 1 bis 10 Minuten, je nach der Art und Konsistenz des intakten Gewebes), um das Gewebe nicht vollständig zu zerstören. Je nach der Art der Pflanze können verschiedene Enzyme oder Enzymlösungen verwendet werden, wie sie zum Beispiel von Powell und Chapman (1985) "Plant Cell Culture, A Practical Approach", R.A. Dixon (Hrsg.), Kapitel 3 angeführt werden.
  • Wenn das von der Pflanze entnehmbare intakte Gewebe zu klein ist, um verwundet (z.B. zerschnitten) zu werden, oder wenn das verwundete intakte Gewebe zu klein ist, um weiter verwundet zu werden (z.B. in kleinere Stücke zerschnitten zu werden), so können mit der Enzymbehandlung zusätzliche kompetente Zellen erzeugt werden. Solch eine Enzymbehandlung kann auch als solche besonders nützlich sein, um kompetente Zellen der vorliegenden Erfindung in Embryonen, insbesondere in unreifen zygotischen Embryonen, die aus sich entwickelnden Samen herausseziert wurden, sowie in reifen zygotischen Embryonen, die aus reifen (z.B. trockenen) Samen von z.B. Mais herausseziert wurden, zu bilden. Embryonen werden im allgemeinen nicht aus Samen herausgeschnitten und können im allgemeinen nicht in wesentlich kleinere Stücke geschnitten werden, ohne ihre Fähigkeit, kompakten embryogenen Callus zu bilden, zu zerstören. Unreife Embryonen sind insofern bei Mais besonders wichtig, als sie das einzige praktische und verläßliche Ausgangsmaterial für kompakten embryogenen Callus darstellen. Bei Reis und anderen Monokotylen können auch reife Embryonen verwendet werden. Diesbezüglich ist es bei Pflanzen wie Mais bevorzugt, daß das intakte Gewebe (z.B. unreife Maisembryonen) eine maximale Länge von ungefähr 0,5 bis 2 mm, vorzugsweise 0,5 bis 1,5 mm, aufweisen, obwohl kürzere Längen von 0,5 bis 1 mm verwendet werden können.
  • Erfindungsgemäß wird das intakte Gewebe auch vorzugsweise ungefähr 15 Minuten oder länger, vorzugsweise ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 5 Stunden, insbesondere 2 bis 3 Stunden, einer Vorplasmolyse unterworfen, bei der das Gewebe in eine traditionelle hypertonische Lösung wie den unten beschriebenen Elektroporationspuffer gegeben wird. Der Zweck dieser Vorplasmolysebehandlung besteht darin, die Zellen des intakten Gewebes, ihre Protoplasten, vorzugsweise alle bzw. zumindest einen Teil ihrer Zellmembranen teilweise von ihren Zellwänden zu trennen. Diese Vorplasmolyse wird vorzugsweise nach einer gegebenenfalls vorgenommenen Verwundung des intakten Gewebes, jedoch vor einer gegebenenfalls vorgenommenen Enzymbehandlung des intakten Gewebes, durchgeführt. Ist das intakte Gewebe bereits durch eine Enzymbehandlung abgebaut worden, so wird eine gegebenenfalls vorgenommene anschließende Vorplasmolyse vorzugsweise nur kurz vorgenommen, und nach der Enzymbehandlung von unreifen Maisembryonen wie oben beschrieben wird solch eine Vorplasmolyse vorzugsweise überhaupt nicht durchgeführt.
  • Die kompetenten Zellen der vorliegenden Erfindung können auch folgendermaßen erhalten werden: in-vitro-Kultur des intakten Gewebes der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung von kompaktem embryogenem Callus und anschließendes Zerschneiden des Callus in kleinere Stücke. Die erhaltenen Callusstücke sollten ganz oder zumindest teilweise die embryogenen Abschnitte oder Teile des Callus enthalten. Die Callusstücke sollte vorzugsweise auch eine durchschnittliche Maximallänge von 0,5 bis 2,5 mm, insbesondere 1 bis 2 mm, ganz besonders 1,25 bis 1,75 mm, sowie vorzugsweise eine Minimallänge von ungefähr 0,1 mm aufweisen. Um eine ausreichende Menge an kompaktem embryogenem Callus zu erhalten, wird der Primärcallus, der von den Gewebeexplantaten erhalten wird, vorzugsweise mindestens einen Monat lang vermehrt und die embryogenen Abschnitte solch eines Primärcallus werden mindestens einmal während dieses Zeitraums subkultiviert. Man ist der Meinung, daß das mechanische Aufbrechen oder Verwunden der embryogenen Abschnitte des kompakten embryogenen Callus und ihrer Zellen, z.B. dadurch, daß man sie zerschneidet, im allgemeinen ausreicht, um die kompetenten Zellen der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Das mechanische Aufbrechen des Callus kann jedoch auch durch eine Enzymbehandlung zwecks Abbau der Calluszellwände ergänzt oder dadurch ersetzt werden, insbesondere dann, wenn die kompakten embryogenen Callusstücke relativ groß bleiben. Vorzugsweise wird das Enzym auf das intakte Gewebe in erster Linie dazu aufgetragen, um Poren in der Zellwand der Zellen der Callusstücke zu erzeugen. Die Enzymbehandlung ist daher vorzugsweise relativ kurz und dauert z.B. 1 bis 10 Minuten, je nach der Art und Konsistenz der Callusstücke, um das Gewebe nicht vollständig zu zerstören. Je nach der Art der monokoten Pflanze können verschiedene Enzyme oder Enzymlösungen verwendet werden, wie sie zum Beispiel von Powell und Chapman (1985) aufgezählt wurden, Zitat oben. Vorzugsweise werden die kompakten embryogenen Callusstücke auch eine zeitlang (z.B. 2 bis 3 Stunden) einer Vorplasmolyse unterworden, wie dies oben beschrieben wurde.
  • Die aufgebrochenen und/oder abgebauten intakten Gewebe bzw. kompakten embryogenen Callusstücke, insbesondere ihre embryogenen Abschnitte, die wie oben beschrieben erhalten wurden, werden dann mit einem oder mehreren DNA-Fragmenten, die ein interessierendes Gen bzw. interessierende Gene enthalten, in Kontakt gebracht, um ihre kompetenten monokotylen Pflanzenzellen der vorliegenden Erfindung zu transformieren. Vorzugsweise wird mindestens eines der interessierenden Gene so angepaßt, daß es als selektierbarer Marker bei den erhaltenen transformierten monokotylen Pflanzenzellen dient. Man ist der Meinung, daß beim direkten Gentransfer, insbesondere bei der Elektroporation, die Transformationseffizienz optimal ist. Es können jedoch auch andere bekannte DNA-Transfer-Techniken verwendet werden, wie der direkte Gentransfer mit Polyethylenglykol, der Beschuß mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen (d.h. die biolistische Transformation, z.B. mit der Genkanone), sowie die Agrobacterium-vermittelte Transformation.
  • Der kompakte embryogene Callus, der für die Durchführung des erfindungsgemäßen Pflanzentransformationsverfahrens verwendet wird, kann gewisse Eigenschaften eines lockeren embryogenen Callus aufweisen. Hier kann sich ein kompakter embryogener Callus oder ein lockerer embryogener Callus in einen Callustyp verwandeln bzw. in solch einen umgewandelt werden, der manche Eigenschaften von kompaktem embryogenem Callus und manche Eigenschaften von lockerem embryogenem Callus aufweist. Daher kann solch ein Callus-Zwischentyp und embryogene Abschnitte davon manchmal erfindungsgemäß transformiert werden. Es können nämlich somatische Embryonen, die sich auf solch einem Callus-Zwischentyp sowie auf lockerem embryogenem Callus entwickeln, isoliert und verwundet und/oder abgebaut werden und anschließend wie oben transformiert werden. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind solche somatischen Embryonen, die von einem Callus-Zwischentyp oder einem lockeren embryogenen Callus stammen, als gleichwertig mit unreifen oder reifen zygotischen Embryonen, die von sich entwickelnden oder von reifen Samen stammen, als gleichwertig anzusehen, insbesondere dann, wenn als Mittel für die Transformation von Zellen der somatischen Embryonen die Elektroporation verwendet wird.
  • Erfindungsgemäß kann die Elektroporation auf traditionelle Art und Weise durchgeführt werden. Hier können das verwundete bzw. abgebaute intakte Gewebe oder die verwundeten bzw. abgebauten Callusstücke, insbesondere deren meristematische oder embryogene Abschnitte, ganz besonders deren embryogene Abschnitte, in eine Küvette, die sich für ein Elektroporationsgerät eignet, transferiert werden (z.B. gemäß Dekeyser et al. (1990) The Plant Cell 2:591). Vorzugsweise werden ungefähr 10 bis 500 mg, insbesondere ungefähr 50 bis 200 mg, ganz besonders ungefähr 100 bis 150 mg, intaktes Gewebe oder Callusstücke pro 200 μl Elektroporationspuffer in die Küvette transferiert. Bei Getreide, wie dem Mais (wo bevorzugt intakte enzymbehandelte unreife Embryonen verwendet werden), werden vorzugsweise ungefähr 10 bis 500 Embryonen, insbesondere ungefähr 50 bis 150 Embryonen, ganz besonders ungefähr 75 bis 125 Embryonen, in 200 μl Elektroporationspuffer in die Küvette transferiert. Dann wird die DNA in die Küvette gegeben und die Elektroporation durchgeführt. Vorzugsweise wird die DNA mit dem intakten Gewebe oder den Callusstücken vor der Elektroporation koinkubiert (z.B. ungefähr 1 Stunde lang). Man ist der Meinung, daß die besten Ergebnisse mit linearer, nicht ringförmiger, DNA mit einer relativ kleinen Größe, und zwar vorzugsweise mit einer Größe von weniger als ungefähr 20 kB, insbesondere weniger als 15 kB, ganz besonders weniger als 10 kB, besonders bevorzugt weniger als 6 kB (z.B. bis ungefähr 2-3 kB), erzielt werden können. Hier können multiple lineare DNA-Fragmente unterschiedlicher Zusammensetzung für die Transformation der kompetenten Zellen der vorliegenden Erfindung mit multiplen interessierenden Genen verwendet werden. Vorzugsweise werden in die Küvette, die das intakte Gewebe oder die Callusstücke enthält, ungefähr 5 bis 30 μg, insbesondere ungefähr 10-15 μg, ganz besonders ungefähr 20 μg, DNA gegeben. Die jeweiligen Elektroporationsbedingungen werden als nicht kritisch erachtet und gute Ergebnisse können zum Beispiel mit einer Entladung von einem Impuls mit einer Feldstärke von 375 V/cm von einem Kondensator mit 900 μF unter Verwendung eines Elektroporationspuffers, der 150 mM NaCl oder 80 mM KCl (Dekeyser et al. (1990), Zitat oben) enthält, erzielt werden.
  • Nach Beendigung der Transformation (z.B. durch Elektroporation) wird bzw. werden das intakte Gewebe oder die Callusstücke, das bzw. die die transformierten Monocot-Zellen enthält/enthalten, auf ein geeignetes Kulturmedium transferiert, vorzugsweise ein Selektivmedium, wenn die transformierten Zellen einen selektierbaren Marker enthalten. Dieses Transferieren sollte so bald wie möglich nach dem Transformationsereignis, vorzugsweise unmittelbar danach, insbesondere innerhalb von ein bis drei Tagen nach dem Transformationsereignis, erfolgen. Vorzugsweise wird bzw. werden das intakte Gewebe oder die Callusstücke, das bzw. die mit einem selektierbaren Marker transformiert wurde(n) unter traditionellen Kulturbedingungen mit traditionellen Kulturmedien (siehe z.B. Literaturstellen bei Vasil (1988), Zitat oben) unter Zugabe eines Selektionsmittels kultiviert. Die Auswahl des Selektionsmittels hängt von dem selektierbaren Marker ab, der in den DNA-Fragmenten für die Transformation der Zellen des intakten Gewebes oder der Callusstücke wie unten beschrieben verwendet wurde. Die Konzentration des Selektionsmittels sollte so hoch sein, daß ein sehr starker Selektionsdruck auf die transformierten Zellen ausgeübt wird, so daß nur stabile Transformanten, in die die den selektierbaren Marker enthaltenden DNA-Fragmente in das Genom der Zellen integriert, vorzugsweise vollständig integriert, sind, überleben und isoliert werden können. Obwohl solch transformierte(s) intaktes Gewebe oder Callusstücke einige Tage lang auf Nichtselektionsmedium kultiviert werden kann/können, werden sie vorzugsweise sobald wie möglich auf das Selektionsmittel umgesetzt und verbleiben dort längere Zeit (z.B. bis zu 6 Monaten), vorzugsweise mindestens einen Monat, insbesondere zwei bis drei Monate, um ausreichende Mengen an transformiertem morphogenem Callus, wie transformiertem kompaktem embryogenem Callus, zu produzieren, der für die Regeneration einer phänotypisch normalen Pflanze verwendet werden kann. Außerdem wird bevorzugt, daß der erhöhte osmotische Druck des Mediums über einen begrenzten Zeitraum (z.B. bis zu zwei bis drei Wochen lang) aufrechterhalten wird, zum Beispiel dadurch, daß man dem Medium Mannit zusetzt.
  • Erfindungsgemäß kann jedes beliebige DNA-Fragment in das Genom, insbesondere das nucleäre Genom, einer monokotylen Pflanze integriert werden. Im allgemeinen enthält das DNA-Fragment ein Fremdgen, bzw. endogenes Gen, oder eine andere DNA-Sequenz, die in den transformierten Pflanzenzellen funktionsfähig ist und diesen Zellen, sowie Pflanzen, die aus diesen Zellen regeneriert werden, eine zusätzliche Eigenschaft verleiht. Zu diesem Zweck umfaßt das DNA-Fragment vorzugsweise ein oder mehrere chimäre Gene, die die folgenden operativ verbundenen DNA-Sequenzen enthalten: 1) eine Promotorsequenz, die die Expression einer Codiersequenz in der Pflanzenzelle steuern kann ("Promotor"); 2) eine Sequenz ("Codiersequenz"), die für ein Protein mit einer bestimmten Aktivität innerhalb der Pflanzenzelle ("interessierendes Protein") codiert; sowie 3) geeignete 3'-Transkriptionsregulationssignale. Für die erforderliche Funktionsfähigkeit des Proteins kann es auch erforderlich sein, das Protein an ein oder mehrere bestimmte Kompartimente der Pflanzenzelle, wie das Cytosol, die Mitochondrien, die Chloroplasten oder das endoplasmatische Retikulum, zu adressieren. Für eine Adressierung an das Cytosol kann das wie oben beschriebene chimäre Gen als solches verwendet werden. Für eine Adressierung an andere Kompartimente muß sich jedoch zwischen den DNA-Fragmenten 1) und 2) des chimären Gens eine zusätzliche Sequenz ("Targeting-Sequenz") befinden. Falls erforderlich kann das chimäre Gen auch Transkriptions- und/oder Translations-Enhancer enthalten und die Codon-Nutzung der DNA-Sequenzen kann für die Expression in Pflanzenzellen optimiert werden.
  • Chimäre Gene gemäß der vorliegenden Erfindung können nach gutbekannten Prinzipien und Verfahren konstruiert werden. Hier sollten die verschiedenen DNA-Sequenzen so verbunden sein, daß die Translation am Initiationscodon der Codiersequenz des Proteins (oder, falls vorhanden, der Targeting-Sequenz) initiiert wird.
  • Man ist der Meinung, daß die verschiedenen konstitutiven und organ- und gewebespezifischen Promotoren, die derzeit für die direkte Expression von Genen in transformierten dikotylen Pflanzen verwendet werden, auch für transformierte Monokotyle der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Hier können bestimmte Pflanzenzellen mit einem chimären Gen transformiert werden, das folgendes umfaßt: eine Codiersequenz, die für ein interessierende Protein codiert; sowie davon stromaufwärts gelegen (also in 5'-Richtung) entweder ein Fremdpromotor oder ein endogener Promotor, der sich für die Expression der Codiersequenz eignet. Zu geeigneten konstitutiven Fremdpromotoren zählen: der Protomotor der Blumenkohlmosaikvirus ("CaMV")-Isolate CM1841 (Gardner et al. (1981) Nucl. Acids. Res. 9:2871) und CabbB-S (Franck et al. (1980) Cell, 21:285) (der "35S-Promotor"), der die konstitutive Expression von heterologen Genen steuert (Odell et al. (1983) Nature 313:810); ein verwandter Promotor ("35S3-Promotor"), der aus dem CaMV-Isolat CabbB-JI (Hull und Howell (1978) Virology 86:482) isoliert werde kann und der sich vom 35S-Promotor in bezug auf seine Sequenz (die Sequenz des 35S3-Promotors ist in der europäischen Patentveröffentlichung ("EP") 359617 beschrieben) und seiner höheren Aktivität in transgenen Pflanzen (Harpster et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 212:182) unterscheidet; sowie der TR1'- und der TR2'-Promotor, der die Expression des 1'- bzw. des 2'-Gens der T-DNA von Agrobacterium vorantreibt (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723), wobei es sich um wundinduzierte Promotoren handelt. Ebenfalls bekannt sind geeignete organspezifische, gewebespezifische und/oder induzierbare Fremdpromotoren (siehe z.B. die in Kuhlemeier et al. (1987) Ann. Rev. Plant Physiol. 38:221) zitierten Literaturstellen), wie die Promotoren der Gene für die kleine Untereinheit (z.B. das 1A-Gen) der 1,5-Ribulosebisphosphat-Carboxylase von Arabidopsis thaliana ("ssu"-Promotor), bei denen es sich um 1ichtinduzierbare Promotoren handelt (Krebbers et al (1988) Plant Mol. Biol. 11:745), die nur in Photosynthese betreibendem Gewebe aktiv sind; die in EP 344029 beschriebenen antherenspezifischen Promotoren; sowie die samenspezifischen Promotoren von z.B. Arabidopsis thaliana (Krebbers et al. (1988) Plant Physiol. 87:859). Promotoren, die sich besonders für die Transformation von Monokotylen eignen, um diese pollensteril zu machen, wie dies in EP344029 beschrieben ist, sind die tapetumspezifischen Promotoren PTA29, PTA26 und PTA13, insbesondere PTA29, von EP 344029 .
  • Auch ist man der Meinung, daß bei transformierten Monokotylen der vorliegenden Erfindung bekannte 3'-Transkriptionsregulationssequenzen und Polyadenylierungssignale, die bei transformierten dikotyledonen Pflanzen verwendet werden, verwendet werden können. Solche 3'-Transkriptionsregulationssignale können stromabwärts (also in 3'-Richtung) der Codiersequenz bereitgestellt werden. Hier kann eine entsprechende Pflanzenzelle mit einem chimären Gen transformiert werden, das entweder fremde oder endogene Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignale, die sich für die Erzielung der Expression des chimären Gens eignen, enthält. So können zum Beispiel die fremden 3'-nichttranslatierten Enden von Genen wie Gen 7 (Velten und Schell (1985) Nucl. Acids Res. 13:6998), das Octopinsynthasegen (Gielen et al. (1983) EMBO J. 3:835) und das Nopalinsynthasegen der T-DNA-Region des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens verwendet werden.
  • Für die Konstruktion eines chimären Gens, das in einer transformierten Pflanzenzelle, vorzugsweise in deren Cytoplasma, exprimiert werden kann, woran sich die Translokation seines interessierenden Proteins an die Zellmitochondrien, Chloroplasten und/oder der Lumen des endoplasmatischen Retikulums anschließt, sind geeignete Targeting-Sequenzen bekannt. Man ist der Meinung, daß die Auswahl dieser Targeting-Sequenzen nicht kritisch ist und daß eine entsprechende Pflanzenzelle mit einem chimären Gen transformiert werden kann, das entweder eine fremde oder eine endogene Targeting-Sequenz enthält, die für ein Targeting-Peptid codiert, das die Translokation des Expressionsprodukts des Gens gewährleistet. Unter "Targeting-Peptid" versteht man ein Polypeptidfragment, das normalerweise in einer eukaryontischen Zelle mit einem Chloroplasten- oder Mitochondrienprotein oder einer Untereinheit des Proteins oder mit einem Protein, das an das endoplasmatische Retikulum lokalisiert wird und das in der Zelle als Teil eines Vorstufenproteins, das von der nucleären DNA der Zelle codiert wird, produziert wird. Das Targeting-Peptid ist für den Translokationsvorgang des vom Zellkern codierten Chloroplasten- oder Mitochondrienproteins oder dessen Untereinheit in den Chloroplasten oder die Mitochondrien oder das Lumen des endoplasmatischen Retikulums verantwortlich. Während des Translokationsvorgangs wird das Targeting-Peptid von dem Protein oder der Untereinheit abgetrennt oder proteolytisch entfernt. Es kann in dem chimären Gen eine Targeting-Sequenz bereitgestellt werden, um ein Targeting-Peptid zu exprimieren, das ein exprimiertes interessierendes Protein innerhalb einer transformierten Pflanzenzelle wie allgemein in den europäischen Patentanmeldungen ("EPA") 85402596.2 und 88402222.9 beschrieben lokalisieren kann. Ein für den Transport in die Chloroplasten geeignetes Targeting-Peptid ist das Leitpeptid der kleinen Untereinheit des Enzyms 1,5-Ribulosebisphosphatcarboxylase (Krebbers et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11:745; EPA 85402596.2), es können jedoch auch andere Chloroplasten-Transitpeptide, wie sie bei Watson (1984) Nucl. Acids Res. 12:5145 und Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. 9:104 angeführt sind, verwendet werden. Geeignete Mitochondrien-Targeting-Peptide sind die Mitochondrien-Transitpeptide, wie sie bei Schatz (1987) Eur. J. Biochem. 165:1 beschrieben und bei Watson (1984), Zitat oben, angeführt sind. Geeignete Targeting-Peptide, die ein interessierendes Protein in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums einer Pflanzenzelle lokalisieren können, sind zum Beispiel die von Von Heijne (1988) Biochem. Biophys. Acta 947:307 und bei Watson (1984), Zitat oben, angeführten Signalpeptide.
  • Codiersequenzen, die für die Herstellung von transgenen dikotylen Pflanzen verwendet werden können, sind gut bekannt (siehe zum Beispiel die bei Weising et al (1988) Annual Rev. Genet. 22:421) angeführten Codiersequenzen), und man ist der Meinung, daß diese Codiersequenzen gleich gut bei transformierten monokotylen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Hier können die Codiersequenzen entweder fremd oder endogen in bezug auf die Pflanzen sein und können zum Beispiel für Proteine codieren, die: für Insektenarten toxisch sind und so die Pflanzen gegen Insektenbefall schützen ( EP 193259 , EP 305275 und EP 358557 ); die Pflanzen gegen Streßbedingungen schützen ( EP 359617 ); den Pflanzen eine Resistenz oder Toleranz gegen bestimmte Herbizide verleihen ( EP 242236 ); Pflanzenzellen, in denen die Proteine exprimiert werden, abtöten oder so stark schädigen, daß wenn die Codiersequenzen unter der Kontrolle eine; für männliche oder weibliche Organe spezifischen Promotors stehen, die Proteine die Pflanzen pollensteril ( EP 344029 ) bzw. weiblich-steril ( EP 412006 ) machen können; aus den Pflanzen oder ausgewählten Pflanzenorganen extrahiert werden können und gegebenenfalls weiter verarbeitet werden können, so daß die Pflanzen als Ausgangsmaterial für ökonomisch wichtige Peptide oder Proteine verwendet werden können ( EP 319353 ); oder die einen höheren Gehalt an diätetisch wichtigen Aminosäuren aufweisen, so daß transformierte Pflanzen oder ihre Organe, in denen die Proteine exprimiert werden können, als Nahrungsmittel mit einem erhöhten Nährwert für Tiere oder den Menschen verwendet werden können ( EP 318341 ).
  • Bei den Codiersequenzen, die sich besonders für die Transformation von Monokotylen eignen, um sie insektenresistent zu machen, handelt es sich um die Gene, die von Bacillus thuringiensis ("Bt")-Stämmen isoliert wurden und um verkürzte Abschnitte davon, die für insektizide Kristallproteine um ihre insektiziden Polypeptidtoxine codieren (siehe Übersichtsartikel von: Höfte und Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242). Es wird angenommen, daß die folgenden Bt-Gene besonders wichtig für die Bekämpfung von Insekten bei Getreide (z.B. Mais, Reis, Weizen und Gerste) sind: das CrylAb-Gen ( EP 193259 ) und das CrylAc-Gen für die Bekämpfung von Helicoverpa-Arten (z.B. H. zea und H. armigera); das CrylAb-Gen und das Crylb-Gen ( EP 358557 ) für die Bekämpfung von Ostrinia-Arten (z.B. O. nubilalis) bei Mais; das CrylAc-Gen für die Bekämpfung von Agrotis-Arten bei Mais und Weizen; sowie die Gene CrylD und CrylE ( EP 358557 ) für die Bekämpfung von Spodoptera-Arten (z.B. S. frugiperda) bei Mais. Um eine ausreichende Expression dieser Gene in Geweben von transgenen Pflanzen zu erreichen, wird bevorzugt, daß die Gene wie in PCT-Anmeldung PCT/EP 91/00733 (PCT-Veröffentlichung WO 91/16432) beschrieben modifiziert werden.
  • Selektierbare Marker gemäß der vorliegenden Erfindung sind chimäre Gene, in denen die Codiersequenzen für Proteine codieren, die den Pflanzenzellen, in denen sie exprimiert werden, Resistenz gegen ein Selektionsmittel wie ein Antibiotikum und/oder Herbizid verleihen. Screening-Marker gemäß der vorliegenden Erfindung sind chimäre Gene, in denen die Codiersequenzen für Proteine codieren, die den Pflanzenzellen, in denen sie exprimiert werden, ein anderes Erscheinungsbild wie eine andere Farbe verleihen, wodurch die mit dem Screening-Marker transformierten Pflanzen manuell abgetrennt werden können. Man ist der Meinung, daß die Auswahl eines selektierbaren oder Screening-Markers, vorzugsweise eines selektierbaren Markers, für die Transformation einer monokotylen Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung nicht kritisch ist und daß traditionelle selektierbare und Screening-Marker verwendet werden können (siehe z.B. die bei Weisung et al. (1988), Zitat oben, angeführten Marker). Beispiele für geeignete Codiersequenzen für selektierbare Marker sind: das neo-Gen (Beck et al. (1982) Gene 19:327), das für das Enzym Neomycin-Phosphotransferase, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin verleiht, codiert; das hyg-Gen (Gritz und Davies (1983) Gene 25:179), das für das Enzym Hygromycin-Phosphotransferase, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht, codiert; sowie das bar-Gen ( EP 242236 ), das für die Phosphinothricin-Acetyltransferase, die eine Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht, codiert. Bei der Verwendung eines selektierbaren Markergens, das für ein Protein codiert, das eine Toleranz oder Resistenz gegen ein Herbizid oder ein Selektionsmittel, das auf den Chloroplastenstoffwechsel einwirkt, codiert, wie das bar-Gen, ist es bevorzugt, daß das Markergen Bestandteil eines chimären Gens in Kombination mit einer wie oben beschriebenen Chloroplasten-Targeting-Sequenz ist. Beispiele für geeignete Codiersequenzen für Screening-Marker sind das gus-Gen (Jefferson et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6:3901), das für die beta-Glucuronidase codiert, und das Luciferase-Gen (Ow et al. (1986) Science 234:856).
  • Wie oben diskutiert sollte der durch das Vorhandensein eines Selektionsmittels ausgeübte Selektionsdruck während der Kultur von erfindungsgemäßen transformierten Pflanzenzellen, die selektierbare Marker enthalten, relativ hoch sein. Wird zum Beispiel das neo-Gen als Selektionsmarker verwendet, so sollte Kanamycin in Konzentrationen von mindestens ungefähr 100-200 mg pro Liter, vorzugsweise mindestens ungefähr 200 mg pro Liter, im Kulturmedium verwendet werden. Solch ein hoher Selektionsdruck sollte auch über längere Zeit, zum Beispiel zwei bis vier Monate lang, aufrechterhalten werden. Man ist jedoch der Meinung, daß bestimmte Selektionsdrücke und -zeiträume nicht kritisch sind und daß die Selektionsdrücke und ihre Zeiträume auf traditionelle Weise gewählt werden können. Wird jedoch das bar-Gen als selektierbares Markergen verwendet, so wird Phosphinothricin (PPT) vorzugsweise in Konzentrationen von 0,5 bis 50, insbesondere 2 bis 20, mg pro Liter Kulturmedium verwendet.
  • Morphogene Abschnitte, vorzugsweise embryogene Abschnitte, von morphogenem Callus, vorzugsweise kompaktem embryogenem Callus, die in einer Kultur von transformierten Zellen von verwundetem und/oder abgebautem intaktem Gewebe oder verwundeten und/oder abgebauten embryogenen Abschnitten von kompaktem embryogenem Callus der vorliegenden Erfindung gebildet wurden, können anschließend auf traditionelle Art und Weise zu phänotypisch normalen (z.B. reifen und fruchtbaren) Pflanzen regeneriert werden (siehe zum Beispiel die Literaturangaben bei Vasil (1988), Zitat oben, und Lazzeri und Lörz (1988), Zitat oben). Die so erhaltenen regenerierten Pflanzen sind transgen und enthalten zumindest den selektierbaren Marker bzw. Screening-Marker, vorzugsweise den selektierbaren Marker, stabil in ihr nucleäres Genom integriert. Das Vorhandensein und die Expression von anderen interessierenden Genen kann anschließend auf traditionelle Art und Weise ausgewertet werden, wie zum Beispiel mittels Southern-Blotting und/oder mit der Polymerasekettenreaktion (Sambrook et al. (1990), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory).
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist eine phänotypisch normale Pflanze, wie sie mit Hilfe der Transformations- und Regenerationsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, als eine Pflanze zu verstehen, die sich von einer nichttransformierten Pflanze derselben Linie nicht wesentlich in bezug auf beliebige phänotypische Eigenschaften unterscheidet, mit Ausnahme derjenigen Eigenschaften, die aufgrund der Expression der während der Transformation des Pflanzengenoms eingebrachten DNA-Fragmente hinzugefügt oder verändert wurden. Jedes Verfahren zur Transformation von Pflanzen führt natürlich üblicherweise zu einer Mehrzahl von transgenen Pflanzen, die verschiedene Phänotypen aufweisen, von denen nur manche im oben definierten Sinn phänotypisch normal sind.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf alle monokotylen Pflanzenarten angewandt werden, von denen kompakter morphogener Callus, wie kompakter embryogener Callus, während der in-vitro-Kultur von Explantaten, die von verschiedenen Explantat-Ausgangsmaterialien wie unreifen und reifen zygotischen Embryonen, Blattbasen, jungen Blüten usw. stammen, erhalten werden kann. Das Verfahren wird sich besonders für die Transformation von wirtschaftlich wichtigen Gramineen-Kulturen, insbesondere den Hauptgetreidearten wie Mais, Weizen, Reis, Hafer, Gerste, Sorghum, Roggen und Hirse eignen. Die erhaltenen transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung können für die rasche und schlagkräftige Erzeugung von neuen Linien und/oder Sorten mit hohem agronomischem Wert verwendet werden. Diesbezüglich können transgene Pflanzen erfindungsgemäß erzeugt werden, die als Bestäuberpflanzen, zum Beispiel als weiblich-sterile Bestäuberpflanzen für die Erzeugung von Hybridsaatgut, wie dies in der Schrift EP 412006 (die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird) beschrieben ist, verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein rasches, schlagkräftiges und reproduzierbares Verfahren für die Transformation von monokotylen Pflanzen bereit, bei dem intaktes Gewebe oder kompakter embryogener Callus verwendet wird, um zu Kulturen von transformiertem morphogenem Callus, vorzugsweise kompaktem embryogenem Callus, zu gelangen. Dies ist insofern überraschend, als weder intaktes Gewebe noch kompakter embryogener Callus allgemein als geeignetes Ausgangsmaterial für die Herstellung von stabilen Transformanten angesehen wurde (siehe Vasil (1990) Bio/Technology 8:797). Die Verwendung von intaktem Gewebe oder kompaktem embryogenem Callus gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine deutliche Verbesserung der existierenden Transformationsverfahren für Monokotyle, bei denen die Verwendung von lockerem embryogenem Callus, embryogenen Zellsuspensionskulturen und/oder Protoplasten, die für 1) DNA-Aufnahme, 2) eine integrative Transformation sowie 3) eine schlagkräftige und reproduzierbare Regeneration von monokotylen Pflanzen kompetent sind, erforderlich war. Diese Kompetenzanforderungen haben bis jetzt stabile Transformationen von Monokotylen auf Pflanzenlinien mit ganz bestimmten Gewebekultureigenschaften beschränkt. Beim Mais zum Beispiel haben nur gewisse Linien, wie die Inzuchtlinie A188, über die Fähigkeit, genug Typ-II-Callus zu bilden (also Typ II-Callus mit einer Frequenz von mehr als 10% bis zu z.B. 80% oder darüber), woraus kompetente Suspensionskulturen und/oder Protoplasten mit annehmbarer Häufigkeit erhalten werden konnten, verfügt. Alle diese Maislinien waren jedoch agronomisch minderwertig, so daß Transformationen von wirtschaftlich wichtigen Maislinien nur mit Hilfe von arbeitsintensiven Zuchtprogrammen ermöglicht wurden, in denen geeignete Gewebekultureigenschaften von den transformierbaren minderwertigen Linien auf die wertvollen Maislinien übertragen wurden.
  • Da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nur ein relativ kurzer in-vitro-Kulturzeitraum erforderlich ist, ist dieses Verfahren wesentlich weniger zeit- und arbeitsaufwendig als existierende Verfahren. Der kurze Gewebekulturzeitraum gewährleistet auch, daß weniger somaklonale Variation auftritt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren stellt neue, phänotypisch normale (z.B. fruchtbare), transgene monokotyle Pflanzen, insbesondere Gramineen-Pflanzen, ganz besonders Getreide, insbesondere Mais und Reis bereit, die mit mindestens einem (z.B. fremden) interessierenden Gen, das stabil in ihr nucleäres Genom integriert ist, transformiert sind. Man ist der Meinung, daß das Verfahren unabhängig vom Genotyp der Pflanze, die transformiert wird, ist und daß damit Zellen einer beliebigen Pflanze, von der kompakter embryogener Callus von mindestens einem seiner Gewebe erhalten werden kann, transformiert werden können. Dies ermöglicht die Transformation der meisten Monokotylen-Arten und einer beträchtlichen Anzahl von Linien innerhalb jeder Art. Außerdem kann die Fähigkeit, kompaktes embryogenes Gewebe zu bilden, mit Hilfe von traditionellen Zuchtprogrammen von einer Linie, die solch eine Fähigkeit aufweist, auf eine andere Linie, bei der dies nicht der Fall ist, übertragen werden.
  • Die aus transformiertem morphogenem Callus, insbesondere transformiertem kompaktem embryogenem Callus, regenerierten neuen transgenen monokotylen Pflanzen der vorliegenden Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, daß es bei diesen Monokotylen unter Verwendung von traditionellen Kulturbedingungen, wie sie zum Beispiel bei Datta et al. (1990), Zitat oben, Shimamoto et al. (1989), Zitat oben, Hayashimoto et al. (1990), Zitat oben, Gordon-Kamm et al. (1990), Zitat oben, und Fromm et al. (1990), Zitat oben, beschrieben sind, praktisch unmöglich ist, embryogene Suspensionskulturen und/oder Protoplasten zu erhalten bzw. daß es praktisch unmöglich ist, embryogene Suspensionskulturen und/oder Protoplasten mit einer ausreichenden Fähigkeit, stabil transformiert und anschließend als phänotypisch normale (z.B. fruchtbare) transgene Pflanzen regeneriert zu werden, zu erhalten. Was diese zweite Art der Unmöglichkeit betrifft, ist man der Meinung, daß es nicht praktisch ist, embryogene Suspensionskulturen oder Protoplasten von solchen Monokotylen zu erhalten, die 1) mit hoher Wahrscheinlichkeit zu phänotypisch normalen Pflanzen regeneriert werden können; 2) mit hoher Wahrschein lichkeit in bezug auf die Aufnahme von DNA und integrativer Transformation der so aufgenommenen DNA kompetent sind; sowie 3) wenn sie auf diese Art und Weise transformiert sind, mit hoher Wahrscheinlichkeit zu phänotypisch normalen transgenen Pflanzen regeneriert werden können.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung neue transgene Reispflanzen von Reislinien bereit, von denen embryogene Suspensionskulturen (wenn erhältlich) im allgemeinen zum Beispiel nach den von Li et al. (1990) Plant Mol. Biol. Report. 8:276, Datta et al. (1990) Plant Sci. 67:83, und Datta et al. (1990) Plant Cell Rep. 9:253 beschriebenen Vorgehensweisen erhalten werden können, und Protoplasten (wenn erhältlich) im allgemeinen von den embryogenen Suspensionskulturen, zum Beispiel nach den von Li und Murai (1990) Plant Cell Rep. 9:216, beschriebenen Vorgehensweisen, erhalten werden können. Unter traditionellen Kulturbedingungen, wie sie zum Beispiel bei Shimamoto et al. (1989), Zitat oben, Datta et al. (1990), Zitat oben, und Hayashimoto et al. (1990), Zitat oben, beschrieben werden, ist es jedoch praktisch unmöglich, phänotypisch normale (z.B. fruchtbare) Pflanzen aus embryogenen Suspensionskulturen oder Protoplasten von solchen Reislinien zu regenerieren.
  • Außerdem stellt die vorliegende Erfindung neue transgene Maispflanzen von Maislinien, von denen embryogene Suspensionskulturen (wenn erhältlich) im allgemeinen zum Beispiel nach den von Shillito et al. (1989) Bio/Technology 7:581, Prioli und Söndahl (1989) Bio/Technology 7:589, Gordon-Kamm et al. (1990), Zitat oben, und Fromm et al. (1990), Zitat oben, beschriebenen Vorgehensweisen und Protoplasten (wenn erhältlich) im allgemeinen aus solchen embryogenen Supensionskulturen zum Beispiel nach den von Shillito et al. (1989), Zitat oben, und Prioli und Söndahl (1989), Zitat oben, beschriebenen Vorgehensweisen, erhalten werden können, bereit. Unter traditionellen Kulturbedingungen, wie sie zum Beispiel von Shillito et al. (1989), Zitat oben, Prioli und Söndahl (1989), Zitat oben, Gordon-Kamm et al. (1990), Zitat oben, und Fromm et al. (1990), Zitat oben, beschrieben werden, ist es jedoch praktisch unmöglich, phänotypisch normale (z.B. fruchtbare) Pflanzen aus embryogenen Suspensionskulturen oder Protoplasten solcher Maislinien zu regenerieren. Außerdem weisen solche Maislinien eine hohe Typ-I-Callusbildungsrate auf, ihre Typ-II-Callusbildungsrate ist jedoch nicht höher als 10%, insbesondere nicht höher als 1%, ganz besonders nicht höher als 0,1%, insbesondere nicht höher als 0,01%. Typ-II-Maiscallus ist die einzige Art von Maiscallusgewebe, aus dem embryogene Suspensionskulturen und regenerierbare Protoplasten auf geeignete Weise erhalten werden können und dann stabil transformiert werden können, was heißt, daß die Unmöglichkeit, Typ-II-Callus bei einer bestimmten Maislinie zu erhalten, bis jetzt bedeutet hat, daß es nicht möglich war, phänotypisch normale (z.B. reife) transgene Maispflanzen aus transformiertem Callus solch einer Maislinie zu regenerieren. Die praktische Möglichkeit, Typ-II-Callus von einer bestimmten Maislinie zu erhalten, kann aufgrund der allgemeinen Vorgehensweisen beurteilt werden, die von Gordon-Kamm et al. (1990), Zitat oben, und Fromm et al. (1990), Zitat oben, und in den dort erwähnten Literaturstellen beschrieben werden. Bei dieser Beurteilung können Calluskulturen von zum Beispiel 1000 unreifen Embryonen einer Maislinie angelegt werden, die Kulturen können durch Subkultivierung alle drei Wochen aufrechterhalten werden, und nur diejenigen Kulturen, die typischem Typ-II-Callus am ähnlichsten sind, können subkultiviert werden; schließlich kann nach 6 Monaten bestimmt werden, mit welcher Rate ein uniformer Typ-II-Callus erhalten wird.
  • Allgemeiner ausgedrückt kann nach den folgenden, gut bekannten Vorgehensweisen vorgegangen werden, um zu bestimmen, ob es praktisch ist, regenerationsfähige Protoplasten von einer bestimmten Linie einer Monokotylen-Art zu gewinnen. Diesbezüglich ist man der Meinung, daß regenerationsfähige Protoplasten am schlagkräftigsten und verläßlichsten aus embryogenen Suspensionskulturen erzeugt werden können, die auf traditionelle Art und Weise für eine bestimmte monokotyle Pflanze hergestellt und weiter erhalten werden können. Quantität und Qualität einer embryogenen Suspensionkultur hängen im allgemeinen von ihrem Genotyp ab, und es zahlt sich im allgemeinen nur dann aus, Protoplasten von einer Pflanzenlinie für Transformationszwecke zu erzeugen, wenn Pflanzen aus einer embryogenen Suspensionskultur der Pflanzenlinie regeneriert werden können. Embryogene Suspensionskulturen sind im allgemeinen dadurch gekennzeichnet, daß sie aus gut dispergierten, kleinen Gruppen von cytoplasmareichen embryogenen Zellen bestehen, frei von Callusgeweben oder strukturierten Meristemen sind, einen Zellzyklus von 27-32 Stunden aufweisen und zur Bildung von somatischen Embryonen und Pflanzen fähig sind (Vasil (1988) Bio/Technology 6:397). Ob sich eine embryogene Suspensionskultur einer bestimmten Linie einer Monokotylen-Art eignet, kann dadurch bestimmt werden, daß man Zellaggregate in großer Zahl (also mindestens 100) auf ein geeignetes Regenerationsmedium ausplattiert und den Prozentsatz der Aggregate, die phänotypisch normale, fruchtbare Pflanzen ergeben, bestimmt. Werden normale fruchtbare Pflanzen von 50% oder mehr der Zellaggregate erhalten, zahlt es sich nach allgemeiner Annahme aus, mit der Erzeugung von Protoplasten weiterzumachen. Eine bestimmte Monokotylen-Linie kann jedoch als nicht geeignet für die Bereitstellung von regenerationsfähigen Protoplasten, die sich für die Pflanzentransformation eignen, gelten, wenn mit traditionellen Protoplasten-Isolations-, -Kultur- und -Pflanzenregene rationstechniken nicht mehr als ungefähr 500, insbesondere nicht mehr als ungefähr 100, ganz besonders nicht mehr als ungefähr 10, insbesondere nicht mehr als ungefähr 1, phänotypisch normale (z.B. fruchtbare) Pflanze(n) pro 10.000 Protoplasten regeneriert werden können.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun an hand der Beispiele unten erläutert. Falls nicht anders angegeben, wurden alle Versuchstätigkeiten bei der Manipulation von rekombinanter DNA standardmäßig wie bei Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory beschrieben durchgeführt. Die Oligonucleotide wurden nach den von Kramer und Fritz (1968) Methods in Enzymology 154:350 umrissenen allgemeinen Regeln entwickelt und nach dem Phosphoramiditverfahren von Beaucage und Caruthers (1981) Tetrahedron Letters 22:1859 mit einem DNA-Synthesegerät von Applied Biosystems, Typ 380A (Applied Biosystems B.V., Maarssen, Niederlande) synthetisiert. Die folgenden Bakterienstämme und Plasmide, die in den Beispielen verwendet werden, stammen von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen ("DSM"), Mascheroder Weg 1B, Braunschweig, Deutschland:
    Figure 00320001
  • Beispiel 1: Transformation von Mais mit einem selektierbaren Markergen durch Elektroporation von DNA in zygotische unreife Embryonen
  • Es wurden zygotische unreife Embryonen mit einer Länge von ungefähr 0,5 bis 1 mm aus sich entwickelnden Samen von zwei Maisinzuchtlinien, nämlich Pa91 und H99, isoliert. Die frisch isolierten Embryonen wurden 1-2 Minuten enzymatisch mit einer Enzymlösung II (0,3% Macerozym (Kinki Yakult, Nishinomiya, Japan) in CPW-Salzen (Powell & Chapman (1985) "Plant Cell Culture, A Practical Approach", R.A. Dixon, Hrsg., Kapitel 3) mit einem Zusatz von 10% Mannit und 5 mM 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES), pH 5,6) behandelt. Nach 1-2 minütiger Inkubation in dieser Enzymlösung wurden die Embryonen vorsichtig mit N6aph-Lösung (Makro- und Mikroelemente des N6-Mediums (Chu et al. (1975) Sci. Sin. Peking 18:659) mit einem Zusatz von 6mM Asparagin, 12 mM Prolin, 1 mg/l Thiamin-HCl, 0,5 mg/l Nikotinsäure, 100 mg/l Caseinhydrolysat, 100 mg/l Inosit, 30 g/l Saccharose und 54 g/l Mannit) gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Embryonen in Mais-Elektroporationspuffer, EPM-NaCL (150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 10 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) und 0,425 M Mannit, pH 7,2) inkubiert. Es wurden ungefähr 100 Embryonen in 200 μl EPM-NaCl in jede Küvette gegeben. Pro Küvette wurden ungfähr 20 μg einer Plasmid-DNA, nämlich mit HindIII linearisiertes pDE108, zugegeben. Bei pDE108 handelt es sich um eine 5399 Bp großes Plasmid, dessen gesamte Sequenz in Seq. Id. Nr. 1 angegeben ist und das ein chimäres Gen, das das Kanamycinresistenzgen (neo) unter der Kontrolle des 35S3-Promotors ( EP 359617 ) enthält.
  • Nach 1 stündiger DNA-Inkubation mit den Explantaten wurden die Küvetten auf ein Eisbad umgestellt. Nach 10 minütiger Inkubation auf Eis wurde die Elektroporation durchgeführt: es wurde ein Puls mit einer Feldstärke von 375 V/cm von einem Kondensator mit 900 μF abgegeben. Das Elektroporationsgerät war gemäß Dekeyser et al. (1990) The Plant Cell 2:591. Unmittelbar nach der Elektroporation wurde frisches flüssiges N6aph-Substrat zu den Explantaten in der Küvette gegeben, wonach die Explantate noch 10 Minuten auf Eis inkubiert wurden.
  • Danach wurden die Embryonen auf Mahl-VII-Substrat (Makro- und Mikroelemente sowie Vitamine des N6-Mediums mit dem Zusatz von 100 mg/l Caseinhydrolysat, 6 mM Prolin, 0,5 g/l MES, 1 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und 2% Saccharose, verfestigt mit 0,75 g/l MgCl2 und 1,6 g/l Phytagel (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA), pH 5,8) mit einem Zusatz von 0,2 M Mannit. Nach 3 Tagen für die Linie H99 bzw. 2 Tagen für die Linie Pa91 wurden die Embryonen auf das gleiche Substrat, diesmal mit einem Zusatz von 200 mg/l Kanamycin, umgesetzt. Nach ungefähr 14 Tagen wurden die Embryonen auf Mahl-VII-Substrat ohne Mannit, jedoch mit einem Zusatz von Kanamycin, umgesetzt. Die Embryonen wurden auf diesem Selektivsubstrat noch ungefähr 2 Monate lang in Abständen von ungefähr 3 Wochen subkultiviert. Das induzierte embryogene Gewebe wurde vorsichtig isoliert und auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant 15:473) mit einem Zusatz von 5 mg/l 6-Benzylaminopurin für die Linie H99 und 5 mg/l Zeatin für die Linie Pa91 umgesetzt. Das embryogene Gewebe wurde auf diesem Medium ungefähr 14 Tage lang weiter erhalten und anschließend auf MS-Medium ohne Hormone und 6% Saccharose für die Linie H99 bzw. 3% Saccharose für die Linie Pa91 umgesetzt. Sich entwickelnde Sprosse wurden für die Weiterentwicklung zu normalen Pflänzchen auf 1/2 MS-Medium mit 1,5% Saccharose umgesetzt. Diese Pflänzchen wurden in Erde umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen.
  • Beispiel 2: Charakterisierung der transformierten Maispflanzen von Beispiel 1
  • Siebzehn Pflanzen aus Beispiel 1 wurden mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf das Vorhandensein des chimären neo-Gens analysiert. Die DNA wurde nach der von Dellaporta et al. (1983) Plant Mol. Biol. Reporter 1:19 beschriebenen Vorschrift, die für eine Anwendung auf Gewebemengen von ungefähr 10 bis 20 mg angepaßt wurde, präpariert. Solch eine Gewebemenge wurde für jede Pflanze in Extraktionspuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen mazeriert. Ein Fragment mit einer Größe von 706 Bp, das einem Teil der Codiersequenz des neo-Gens entspricht, wurde mit der Polymerase-Kettenreaktion nach der von Sambrook et al. (1990), Zitat oben, beschriebenen Vorschrift unter Verwendung von Oligonukleotidsonden, die zu den Sequenzen des Plasmids pDE108 von Nukleotid 1384 bis 1406 bzw. 2089 bis 2067 (Numerierung gemäß Seq. Id. Nr. 1) komplementär waren, amplifiziert. Insgesamt wurden 35 Zyklen mit einer Reassoziationstemperatur von 50°C durchgeführt. Die zum Schluß erhaltene DNA wurde mittels Elektrophorese auf einem 1,5%igen Agarosegel analysiert. Bei insbesamt 13 Pflanzen konnte ein Fragment mit einer Länge von 706 Bp identifiziert werden. Eine der positiven Pflanzen starb in einem späteren Stadium ab.
  • Die Aktivität des Expressionsprodukts des neo-Gens (also der Neomycin-Phosphortransferase II (NPTII)) wurde bei 9 der Pflanzen getestet, und zwar folgendermaßen: Es wurden durch Mahlen von Pflanzengewebe in Extraktionspuffer (McDonnell et al. (1987) Plant Molecular Biol. Reporter 5:380) Rohextrakte hergestellt. Mit diesen Extrakten wurde dann nach der von Reiss et al (1984) Gene 30:211 beschriebenen Vorgehensweise eine Elektrophorese auf nichtdenaturiertem Polyacrylamidgel durchgeführt. Anschließend wurde die NPTII-Aktivität durch in-situ-Phosphorylierung von Kanamycin mit (gamma-32p)ATP als Substrat (McDonnell et al. (1987), Zitat oben) getestet. Bei 8 der geprüften Pflanzen wurde eine NPTII-Aktivität gefunden (1).
  • Eine der Pflanzen (H99-M148-1), die sich sowohl im PCR- als auch im NPTII-Assay als positiv erwiesen hatte, wurde mittels Southern-Hybridisierung weiter analysiert. Es wurde genomische DNA aus Pflanzengewebe nach der von Dellaporta et al. (1983), Zitat oben, beschriebenen Vorgehensweise präpariert, wobei eine ergänzende Behandlung mit RNase zur Entfernung von verbleibender RNA durchgeführt wurde. Als Kontrolle wurde eine nichttransformierte H99-Pflanze verwendet. Proben der DNA wurden mit einem der folgenden Restriktionsenzyme verdaut: BglII, EcoRI, EcoRV, HindIII, BamHI, PvuI, PvuII bzw. PstI und in waagerechten Agarose-Elektrophoresen laufen gelassen. Der Southern-Transfer auf Membranen des Typs Hybond N+ (Amersham International PLC, Amersham, Großbritannien) mittels der "alkalischen DNA-Blotting"-Vorschrift und die anschließende Hybridisierung wurden gemäß der Empfehlung des Herstellers durchgeführt (Amersham Hybond-N+-Broschüre). Es wurden radioaktive Sonden mit dem "multi-prime" DNA-Markierungskit (Amersham) nach der vom Hersteller gelieferten Vorschrift, die sich von veröffentlichten Vorgehensweisen (Feinberg und Vogelstein (1983) Anal. Biochem. 132:6) ableitet, hergestellt. Als Sonde wurde ein 1184 Bp großes EcoRI-HindIII-Fragment, das von einem anderen Plasmid stammte, verwendet. Die Sequenz dieses Plasmids ist in Seq. Id. Nr. 2 angegeben. Die Bandenmuster (z.B. siehe 2) zeigten, daß mindestens das chimäre neo-Gen in die genomische DNA der Pflanze integriert war.
  • In einer weiteren Analyse dieser transformierten Pflanze (H99-m148-1) wurde gezeigt, daß diese zwei beinahe intakte Kopien des Plasmids pDE108 sowie einen Teil einer dritten, neugeordneten Kopie enthielt. Die beiden beinahe vollständigen Kopien sind scheinbar in einer Kopf-Schwanz-Concatamer-Anordnung in das Pflanzengenom insertiert. Es müssen jedoch gewisse Neuordnungen stattgefunden haben, da eine zusätzliche NcoI-Restriktionsstelle und eine zusätzliche BglII-Restriktionsstelle erzeugt worden waren, während die HindIII-Restriktionsstelle (die für die Linearisierung von pDE108 vor der Elektroporation verwendet worden war) an der Verbindungsstelle der beiden Kopien verloren gegangen war. Eine Sequenzierung der Verbindungsstelle der beiden Plasmidkopien in der Form, in der sie in dem pflanzlichen Genom integriert vorlagen, zeigte, daß nur die vorstehenden 5'-Enden der HindIII-Restriktionsstelle fehlen, wodurch eine NcoI-Stelle erzeugt wird, und zwar folgendermaßen:
    Figure 00370001
    (die verloren gegangenen Basen sind unterstrichen und die NcoI-Restriktionstelle, die an der Verbindungsstelle erzeugt wurde, ist hervorgehoben). Aus einer zusätzlichen Analyse ging hervor, daß keine oder nur sehr wenige Plasmid-DNA-Sequenzen und die HindIII-Restriktionstellen, die das pflanzliche Genom flankieren, verloren gegangen waren. Obwohl die anderen Pflanzen nicht auf diese Art und Weise geprüft worden waren, wurde in PCR- und NPTII-Assays gezeigt, daß die chimären Gene vorhanden waren und exprimiert wurden.
  • Die reifen transformierten Pflanzen waren fruchtbar und phänotypisch vollständig normal. Die Pflanze, die zuvor mittels Southern-Hybridisierung im Assay geprüft worden war, wurde in drei Kreuzungen mit nichttransformierten Pflanzen (zwei von der Maisinzuchtlinie H99 und eine von der Maisinzuchtlinie Pa91) als Pollenspenderpflanze verwendet. Insgesamt wurden 44 der F1-Nachkommenschaftspflanzen auf NPTII-Aktivität wie oben beschrieben im Assay geprüft, und zwanzig davon erwiesen sich als positiv. Nimmt man an, daß die transformierte Pollenspenderpflanze eine aktive Kopie (oder auch mehrere eng gekoppelte aktive Kopien) des chimären neo-Gens enthielt, unterscheidet sich dies nicht signifikant von dem 1:1-Spaltungsverhältnis, das bei normaler mendelnder Aufspaltung erwartet wird (χ2 = 0,36).
  • Beispiel 3: Transformation von Mais mit einem selektierbaren Markergen durch Elektroporation von DNA in Typ-I-Callus von unreifen zygotischen Embryonen
  • Unreife zygotische Embryonen mit einer Länge von ungefähr 0,5 bis 1 mm wurden aus sich entwickelnden Samen der Maisinzuchtlinie Pa91 isoliert und auf Mahl-VII-Substrat kultiviert, wobei anschließend alle 14 Tage subkultiviert wurde. Aus sich entwickelndem Typ-I-Callus wurde vorsichtig embryogenes Gewebe herausseziert. Das embryogene Gewebe in EPM (EP-NaCl ohne NaCl) wurde anschließend in kleine Fragmente mit einer maximalen Länge von ungefähr 1,5 mm geschnitten. Die erhaltenen Callusstücke wurden drei Stunden lang in diesem Puffer vorplasmolysiert. Nach drei Stunden wurden die Callusstücke auf EPM-NaCl umgesetzt. Ungefähr 100-150 mg Callusstücke wurden in 200 μl EPM-NaCl pro Küvette umgesetzt. Jede Küvette wurde mit 20 μg DNA aus mit HindIII linearisiertem Plasmid pDE108 (Seq. Id. Nr. 1) versetzt. Die DNA wurde eine Stunde lang mit den Callusstücken inkubiert, wonach die Küvetten auf ein Eisbad gestellt wurden.
  • Nach 10minütiger Inkubation auf Eis wurde die Elektroporation durchgeführt: von einem 900-μF-Kondensator wurde ein Puls mit einer Feldstärke von 375 V/cm abgegeben. Das Elektroporationsgerät war wie bei Dekeyser et al. (1990), Zitat oben, beschrieben. Unmittelbar nach der Elektroporation wurden die Callusstücke mit frischem flüssigem N6aph-Substrat mit einem Zusatz von 6mM Asparagin, 12 mM Prolin, 1 mg/l Thiamin-HCl, 0,5 mg/l Nikotinsäure, 100 mg/l Caseinhydrolysat, 100 mg/l Inosit, 30 g/l Saccharose und 54 g/l Mannit versetzt und anschließend noch 10 Minuten weiter auf Eis inkubiert.
  • Nach eintägiger Kultur in flüssigem N6aph-Substrat mit einem Zusatz von 1 mg/l 2,4-D wurden die Callusstücke auf Mahl-VII-Substrat mit einem Zusatz von 0,2 M Mannit und 200 mg/l Kanamycin umgesetzt. Vierzehn Tage später wurden die Callusstücke auf dem gleichen Selektivsubstrat, jedoch ohne Mannit, subkultiviert und auf diesem Substrat noch ungefähr 2 Monate weiter kultiviert, wobei ungefähr alle 3 Wochen subkultiviert wurde. Die embryogenen Abschnitte der erhaltenen Calli wurden aus dem schleimigen Gewebe herauspräpariert und zur Keimung auf MS-Substrat (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473) mit 3% Saccharose und einem Zusatz von 5 mg/l Zeatin umgesetzt. Auf diesem Medium wurde Gewebe ungefähr 2 Wochen lang weiter erhalten und anschließend auf MS-Medium mit 3% oder 6% Saccharose umgesetzt. Sprosse, die sich auf diesem Substrat entwickelten, wurden auf MS-Medium mit halber Stärke und einem Saccharosegehalt von 1,5% umgesetzt, um die Entwicklung zu normalen Pflänzchen zu begünstigen. Diese Pflänzchen wurden in Erde umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen.
  • Beispiel 4: Charakterisierung der transformierten Maispflanzen von Beispiel 3
  • Neunundzwanzig Pflanzen aus Beispiel 3 wurden mittels Polymerase-Kettenreaktion auf das Vorhandensein des chimären neo-Gens analysiert. Die DNA wurde nach der von Dellaporta et al. (1983) Plant Mol. Biol. Reporter 1:19 beschriebenen Vorschrift, die für eine Anwendung auf Gewebemengen von ungefähr 10 bis 20 mg angepaßt wurde, präpariert. Solch eine Gewebemenge wurde für jede Pflanze in Extraktionspuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen mazeriert. Ein Fragment mit einer Größe von 706 Bp, das einem Teil der Codiersequenz des neo-Gens entspricht, wurde mit der Polymerase-Kettenreaktion nach der von Sambrook et al. (1990), Zitat oben, beschriebenen Vorschrift unter Verwendung von Oligonukleotidsonden, die zu den Sequenzen des Plasmids pDE108 von Nukleotid 1384 bis 1406 bzw. 2089 bis 2067 (Numerierung gemäß Seq. Id. Nr. 1) komplementär waren, amplifiziert. Insgesamt wurden 35 Zyklen mit einer Reassoziationstemperatur von 50°C durchgeführt. Die zum Schluß erhaltene DNA wurde mittels Elektrophorese auf einem 1,5%igen Agarosegel analysiert. Bei insbesamt 14 Pflanzen konnte ein Fragment mit einer Länge von 706 Bp identifiziert werden. Eine der positiven Pflanzen starb in einem späteren Stadium ab.
  • Die Aktivität des Expressionsprodukts des neo-Gens wurde bei 24 der Pflanzen getestet, und zwar folgendermaßen: Es wurden durch Mahlen von Pflanzengewebe in Extraktionspuffer (McDonnell et al. (1987) Plant Molecular Biol. Reporter 5:380) Rohextrakte hergestellt. Mit diesen Extrakten wurde dann nach der von Reiss et al (1984) Gene 30:211 beschriebenen Vorgehensweise eine Elektrophorese auf nichtdenaturiertem Polyacrylamidgel durchgeführt. Anschließend wurde die NPTII-Aktivität durch in-situ-Phosphorylierung von Kanamycin mit (gamma-32p)ATP als Substrat (McDonnell et al. (1987), Zitat oben) getestet. Bei 14 der geprüften Pflanzen wurde eine NPTII-Aktivität gefunden (3). Zwei NPTII-positive Pflanzen waren im PCR-Assay negativ.
  • Zwei der Pflanzen (Pa91-M146-2 und Pa91-M149-1), die sich sowohl im PCR- als auch im NPTII-Assay als positiv erwiesen hatten, wurden mittels Southern-Hybridisierung weiter analysiert. Es wurde genomische DNA aus Pflanzengewebe nach der von Dellaporta et al. (1983), Zitat oben, beschriebenen Vorgehensweise präpariert, wobei eine ergänzende Behandlung mit Rnase zur Entfernung von verbleibender RNA durchgeführt wurde. Als Kontrolle wurde eine nicht transformierte Pa91-Pflanze verwendet. Proben der DNA wurden mit einem der folgenden Restriktionsenzyme verdaut: BglII, EcoRI, EcoRV, HindIII, BamHI, PvuI, PvuII bzw. PstI und in waagerechten Agarose-Elektrophoresen laufen gelassen. Der Southern-Transfer auf Membranen des Typs Hybond N+ (Amersham International PLC, Amersham, Großbritannien) mittels der "alkalischen DNA-Blotting"-Vorschrift und die anschließende Hybridisierung wurden gemäß der Empfehlung des Herstellers durchgeführt (Amersham). Es wurden radioaktive Sonden mit dem "multi-prime" DNA-Markierungskit (Amersham) nach der von Hersteller gelieferten Vorschrift, die sich vom veröffentlichten Vorgehensweisen (Feinberg und Vogelstein (1983) Anal. Biochem. 132:6) ableitet, hergestellt. Als Sonde wurde ein 1184 Bp großes EcoRI-HindIII-Fragment, das von einem anderen Plasmid stammte, verwendet. Die Sequenz dieses Plasmids ist in Seq. Id. Nr. 2 angegeben. Die Bandenmuster (z.B. siehe 4) zeigten, daß mindestens das chimäre neo-Gen in die genomische DNA der Pflanze integriert war.
  • In einer weiteren Analyse von einer der transformierten Pflanzen (Pa91-M146-2) wurde gezeigt, daß diese zwei beinahe intakte Kopien des Plasmids pDE108 in Kopf-Schwanz-Konfiguration enthielt. Die (für die Linearisierung von pDE108 vor der Elektroporation verwendete) HindIII-Restriktionsstelle an der Verbindungsstelle der beiden Kopien war verloren gegangen. Eine Sequenzierung der Verbindungsstelle der beiden Plasmidkopien in der Form, in der sie in dem pflanzlichen Genom integriert vorlagen, zeigte, daß die vorstehenden 5'-Enden der HindIII-Restriktionsstelle sowie eine Base stromabwärts von einer der HindIII-Restriktionsstellen fehlen, und zwar folgendermaßen:
    Figure 00410001
    (die verloren gegangenen Basen sind unterstrichen). Aus einer zusätzlichen Analyse ging hervor, daß keine oder nur sehr wenige Plasmid-DNA-Sequenzen um die HindIII-Restriktionstellen, die das pflanzliche Genom flankieren, verloren gegangen waren. Obwohl die anderen Pflanzen nicht auf diese Art und Weise geprüft worden waren, wurde in PCR- und NPTII-Assays gezeigt, daß die chimären Gene vorhanden waren und exprimiert wurden.
  • Die erwachsenen Pflanzen waren fruchtbar und phänotypisch vollständig normal. Eine der Pflanzen, die zuvor durch Southern-Hybridisierung getestet wurde, wurde als Pollenspenderpflanze in einer Kreuzung mit einer nichttransformierten Pflanze der Maisinzuchtlinie H99 verwendet. Insgesamt wurden 20 der F1-Nachkommenschaftspflanzen auf NPTII-Aktivität wie oben beschrieben im Assay geprüft, und sechs davon erwiesen sich als positiv. Nimmt man an, daß die transformierte Pollenspenderpflanze eine aktive Kopie (oder auch mehrere eng gekoppelte aktive Kopien) des chimären neo-Gens enthielt, unterscheidet sich dies nicht signifikant von dem 1:1-Spaltungsverhältnis, das bei normaler mendelnder Aufspaltung erwartet wird (χ2 = 3,2).
  • Beispiel 5: Transformation von Mais mit einem Pollensterilitätsgen und einem Selektionsmarker durch Genelektroporation von DNA in zygotische unreife Embryonen
  • Unreife zygotische Embryonen mit einer Länge von ungefähr 1 bis 1,5 mm wurden aus sich entwickelnden Samen der Maisinzuchtlinie H99 isoliert. Die frisch isolierten Embryonen wurden mit Enzym behandelt und gewaschen, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wurde. Nach dem Waschen wurden die Embryonen in den Maiselektroporationspuffer EPM-KCl (80 mM KCl, 5 mM CaCl2, 10 mM HEPES und 0,425 Mannit, pH 7,2) gegeben. Es wurden ungefähr 100 Embryonen in 200 μl EPM-NaCl in jede Küvette gegeben. Pro Küvette wurden ungfähr 20 μg einer Plasmid-DNA, nämlich mit HindIII linearisiertes pVE107, zugegeben. Bei pVE107 handelt es sich um ein 6659 Bp großes Plasmid, das durch Ligation des 1287 Bp großen EcoRV-EcoRI-Fragments von pTTM8 ( EP 344029 ; Seq. Id. Nr. 3) mit dem großen XbaI (mit Klenow aufgefüllt)-EcoRI-Fragment des Plasmids pDE108 (Seq. Id. Nr. 1) erhalten wird. pVE107 enthält folgendes: ein chimäres Gen, das das Kanamycinresistenzgen (neo) unter der Kontrolle des 35S3-Promotors enthält; sowie ein weiteres chimäres Gen, das das Barnase-Gen (Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202:913) unter der Kontrolle des tapetumspezifischen Promotors des TA29-Gens von Nicotiana tabacum enthält ( EP 344029 ).
  • Alle Vektorkonstruktionen, bei denen Fragmente des Barnase-Gens verwendet wurden, wurden im E. coli Stamm WK6, der das Plasmid pMc5BS enthält, durchgeführt. pMc5BS enthält das Barstar-Gen (das für einen Barnasehemmer codiert) unter der Kontrolle des tac-Promotors (De Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21). Dieses Plasmid wird folgendermaßen konstruiert: Clonieren des EcoRI-HindIII-Fragments von Plasmid pMT416 (siehe Hartley (1988), Zitat oben) in die EcoRI- und HindIII-Restriktionsstellen des Plasmids pMc5-8 (DSM 4566); anschließendes Deletieren der Sequenz, wobei mit dem Initiationscodon der phoA-Signalsequenz begonnen und mit dem letzten Nukleotid vor dem Translationsinitiationscodon der für Barstar codierenden Region abgeschlossen wird, und zwar mittels "Looping-Out"-Mutagenese wie sie allgemein bei Sollazo et al. (1985) Gene 37:199 beschrieben wird.
  • Nach 1 stündiger DNA-Inkubation mit den Explantaten wurden die Küvetten auf ein Eisbad gestellt. Nach 10 minütiger Inkubation auf Eis wurde die Elektroporation wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Unmittelbar nach der Elektroporation wurden die Explantate in der Küvette mit frischem flüssigem N6aph-Substrat versetzt, wonach die Explantate noch 10 Minuten auf Eis inkubiert wurden.
  • Danach wurden die Embryonen auf Mahl-VII-Substrat mit einem Zusatz von 0,2 M Mannit und 200 mg/l Kanamycin umgesetzt. Nach ungefähr 14 Tagen wurden die Embryonen auf Mahl-VII-Substrat ohne Mannit, jedoch mit demselben Selektionsmittel, nämlich Kanamycin, umgesetzt. Die Embryonen wurden noch ungefähr 2 Monate lang weiter auf diesem Selektionssubstrat im Abstand von ungefähr 3 bis 4 Wochen subkultiviert. Das induzierte embryogene Gewebe wurde vorsichtig isoliert und auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962), Zitat oben) mit einem Zusatz von 5 mg/l 6-Benzylaminopurin umgesetzt. Das embryogene Gewebe wurde auf diesem Medium ungefähr 14 Tage lang weiter erhalten und anschließend auf MS-Medium ohne Hormone und Saccharose umgesetzt. Sich entwickelnde Sprosse wurden für die Weiterentwicklung zu normalen Pflänzchen auf 1/2 MS-Medium mit 1,5% Saccharose umgesetzt. Diese Pflänzchen wurden in Erde umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen.
  • Beispiel 6: Charakterisierung der transformierten Maispflanzen von Beispiel 5
  • Sieben Pflanzen von Beispiel 5, die RZM19-2, RZM19-3, RZM19-4, RZM19-5, RZM19-6, RZM19-7 und RZM19-8 genannt wurden, stammten von dem gleichen embryogenen Callusklumpen. Sie wurden intensiv mittels Southern-Analyse getestet. Dabei wurde mit BamHI-NcolI verdaute genomische DNA der Pflanzen mit pVE107 sowie mit dem kleinen EcoRV-XbaI-Fragment von pTTM8 (das PTA29-Barnase enthält; siehe Seq. Id. Nr. 3), als Sonde geprüft. Bei allen Pflanzen handelte es sich bei der am deutlichsten nachgewiesenen Bande um das erwartete 1400 Bp große Fragment. Die Banden, die bei diesen sowie anderen Southern-Blots auftraten, waren jedoch äußerst komplex und zeigten, daß die Transformation zu vielen Insertionen von pVE107 in ganzer oder teilweiser Form in die Genome der Pflanzen geführt hatten. Einige der insertierten Kopien von pVE107 schienen unvollständig zu sein und/oder es waren Neuanordnungen aufgetreten. Es wurde jedoch bei allen sieben Pflanzen das gleiche komplexe Integrationsmuster beobachtet. Das ließ sich dadurch erklären, daß die sieben Transformanten alle von ein- und demselben embryogenen Callusklumpen stammten.
  • Die transformierten Pflanzen waren pollensteril, jedoch ansonsten phänotypisch vollständig normal; so war zum Beispiel die weibliche Fertilität normal. Die Ährchen der männlichen Blüten waren ungefähr normal lang, jedoch sehr dünn und schienen leer zu sein und öffneten sich nie. Eine ausführliche Untersuchung zeigte, daß die Antheren beinahe mikroskopisch klein waren. Dieser Phänotyp zeigt nicht nur, daß mindestens eine Kopie des Barnase-Gens exprimiert wurde, sondern auch, daß sie selektiv in manchen oder allen antheren Geweben exprimiert wurde.
  • Die Transformante RZM19-3 wurde mit Pollen einer nichttransformierten H99-Pflanze bestäubt, wodurch man 53 Nachkommenschaftspflänzchen erhielt. Von diesen 53 Pflänzchen waren 32 (60%) im NPTII-Assay positiv, während 21 (40%) NPTII-negativ waren. Nimmt man an, daß die transformierte Pollenspenderpflanze eine aktive Kopie (oder auch mehrere eng gekoppelte aktive Kopien) des chimären neo-Gens enthielt, unterscheidet sich dies nicht signifikant von dem 1:1-Spaltungsverhältnis, das bei normaler mendelnder Aufspaltung erwartet wird (χ2 = 2,28). Die NPTII-negative Nachkommenschaft war pollenfertil, währende die NPTII-positive Nachkommenschaft pollensteril war.
  • 31 NPTII-positive Nachkommenschaftspflanzen wurden mittels Southern-Analyse geprüft. Bei 28 dieser Pflanzen trat das gleiche Integrationsmuster wie bei der usprünglichen Transformante, nämlich RZM19-3, von der sie abstammten, auf. 3 Pflanzen wiesen ein leicht geändertes Muster auf.
  • Beispiel 7: Transformation von Mais mit einem Pollensterilitätsgen und einem Herbizidresistenzgen durch Genelektroporation von DNA in zygotische unreife Embryonen
  • Es wurden zygotische Embryonen der Maisinzuchtlinie H99 isoliert, mit Enzym behandelt, gewaschen und in Elektroporationspuffer gegeben, wie dies in Beispiel 5 beschrieben wurde. Es wurden ungefähr 100 Embryonen in 200 μl EPM-NaCl in jede Küvette gegeben. Pro Küvette wurden ungefähr 20 μg einer Plasmid-DNA, nämlich mit HindIII linearisiertes pVE108, zugegeben. Bei pVE108 handelt es sich um ein 5620 Bp großes Plasmid, das durch Ligation des 1287 Bp großen EcoRV-EcoRI-Fragments von pTTM8 ( EP 344029 ; Seq. Id. Nr. 3) mit dem großen EcoRI-StuI-Fragment des Plasmids pDE110 (Seq. Id. Nr. 4) erhalten wird. pVE108 enthält folgendes: ein chimäres Gen, das das bar-Gen ( EP 242236 ), das für die Phosphinothricinacetyltransferase (PAT) codiert und Resistenz gegen einen herbiziden Glutaminsynthetasehemmer wie Phosphinothricin (PPT) verleiht unter der Kontrolle des 35S3-Promotors enthält; sowie ein weiteres chimäres Gen, das das Barnase-Gen (Hartley (1988), Zitat oben) unter der Kontrolle des tapetumspezifischen Promotors des TA29-Gens von Nicotiana tabacum enthält ( EP 344029 ). Alle Vektorkonstruktionen, bei denen Fragmente des Barnase-Gens verwendet wurden, wurden im E. coli Stamm WK6, der das Plasmid pMc5BS gemäß Beispiel 5 enthält, durchgeführt.
  • Nach 1 stündiger DNA-Inkubation mit den Explantaten wurden die Küvetten auf ein Eisbad gestellt. Nach 10 minütiger Inkubation auf Eis wurde die Elektroporation wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Unmittelbar nach der Elektroporation wurden die Explantate in der Küvette mit frischem flüssigem N6aph-Substrat versetzt, wonach die Explantate noch 10 Minuten auf Eis inkubiert wurden.
  • Danach wurden die Embryonen von einem Elektroporationsversuch auf Mahl-VII-Substrat mit einem Zusatz von 0,2 M Mannit und 2 mg/l PPT umgesetzt. Nach ungefähr 14 Tagen wurden die Embryonen auf Mh1 VII Substrat (Mahl-VII-Substrat gemäß Beispiel 1, jedoch ohne Prolin und Caseinhydrolysat) mit einem Zusatz von 2 mg/l PPT, jedoch ohne Mannit umgesetzt. Nach ungefähr 4 Wochen wurden die Embryonen noch einen weiteren Monat lang auf Mh1-VII-Substrat mit einem Zusatz von 10 mg/l PPT subkultiviert. Das induzierte embryogene Gewebe wurde vorsichtig herauspräpariert und aus MS-Medium mit einem Zusatz von 5 mg/l 6-Benzylaminopurin umgesetzt. Das embryogene Gewebe wurde auf diesem Medium ungefähr 14 Tage lang weitererhalten und anschließend auf MS-Medium ohne Hormone und Saccharose umgesetzt. Sich entwickelnde Sprosse wurden zur Weiterentwicklung zu normalen Pflänzchen auf MS-Medium mit halber Stärke und einem Saccharosegehalt von 1,5% umgesetzt. Diese Pflänzchen überlebten eine in-vitro-Spritzbehandlung mit BastaR-Dosen (Hoechst AG, Frankfurt am Main, Deutschland), die 2 l/ha entsprachen. Diese Pflänzchen wurden anschließend in Erde umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen, und zwei der transformierten Pflänzchen mit der Bezeichnung RZM35-1 und RZM35-18 wurden näher charakterisiert (siehe Beispiel 8).
  • Die Embryonen von einem zweiten Elektroporationsversuch wurden auf Mh1-VII-Substrat mit einem Zusatz von 2 mg/l PPT und 0, 2 M Mannit umgesetzt. Nach ungefähr 14 Tagen wurden die Embryonen auf Mh1-VII-Substrat mit einem Zusatz von 2 mg/l PPT, jedoch ohne Mannit, umgesetzt. Nach ungefähr drei weiteren Wochen wurden die Embryonen auf Mh1-VII-Substrat mit einem Zusatz von 10 mg/l PPT, jedoch ohne Mannit, umgesetzt. Nach weiteren drei Wochen wurde das induzierte embryogene Gewebe vorsichtig herauspräpariert und auf MS-Medium mit einem Zusatz von 2 mg/l PPT und 5 mg/l 6-Benzylaminopurin umgesetzt. Auf diesem Medium wurde das embryogene Gewebe ungefähr 14 Tage lang weitererhalten und anschließend auf MS-Medium ohne Hormone, Saccharose oder PPT umgesetzt. Sich entwickelnde Sprosse wurden zur Weiterentwicklung zu normalen Pflänzchen auf MS-Medium mit halber Stärke und einem Saccharosegehalt von 1,5% umgesetzt. Die erhaltenen Pflänzchen wurden in Erde umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen, und drei der transformierten Pflänzchen mit der Bezeichnung RZM34-1, RZM34-12 und RZM34-14 wurden näher charakterisiert (siehe Beispiel 8).
  • Beispiel 8: Charakterisierung der transformierten Maispflanzen von Beispiel 7
  • RZM34-1, RZM34-12, RZM34-14, RZM35-1 und RZM35-18 von Beispiel 7 wurden im Gewächshaus herangezogen. Die Aktivität des Expressionsprodukts des bar-Gens in den Blättern der Pflanzen wurde folgendermaßen im "PAT-Assay" geprüft. 100 mg Blattgewebe von jeder Pflanze wurden zusammen mit 50 mg säurebehandeltem Meersand (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 5 mg Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) in einem Eppendorf-Röhrchen mit einem Glasstäbchen in 50 μl Extraktionspuffer (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM Na2-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz), 0,15 mg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSP), 0,3 mg/ml Dithiothreitol (DTT) sowie 0,3 mg/ml Rinderserumalbumin) zermahlen. Der Extrakt wurde 5 Minuten bei 16000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und zehnmal mit TE 25/1 (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM Na2-EDTA) verdünnt. Zwölf μl des verdünnten Extrakts wurden dann mit folgendem versetzt: 1 μl 1 mM PPT in TE 25/1, 1 μl 2 mM Acetyl-Coenzym A in TE 25/1 und 2 μl [14C]Acetyl-Coenzym A (60 mCi/mmol, 0,02 mCi/ml, [NEN Research Products, DUPONT, Wilmington, Delaware, USA]). Der Ansatz wurde 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert und es wurden Proben fleckenförmig auf eine Aluminium-Silicagel-60-TLC-Platte mit Konzentrationszone (Merck) aufgetragen. In einer 3:2-Mischung aus 1-Propanol und NH4OH (25% NH3) wurde aufsteigend chromatographiert. Die Sichtbarmachung des 14C erfolgte durch Rutoradiographie über Nacht (XAR-5-Film von Kodak).
  • Der Test auf Toleranz gegen das Herbizid BastaR erfolgte durch Bestreichen einer kleinen Fläche nahe der Spitze eines Blatts pro Pflanze mit einer 1%igen Lösung des Herbizids und Beobachten der Schadsymptome an bzw. in der Nähe der behandelten Stellen. RZM34-1, RZM35-1 und RZM35-18 wiesen keinerlei Schadsymptome auf, RZM34-12 und RZM34-14 jedoch wiesen leichte Verbräunungen und leichtes Austrocknen der [bestrichenen] Stelle auf.
  • RZM34-1, RZM34-12, RZM34-14, RZM35-1 und RZM35-18 erwiesen sich ebenfalls als pollensteril. Der Phänotyp jeder dieser Pflanzen war mit demjenigen, der für die Transformanten gemäß Beispiel 5 beschrieben und in Beispiel 6 analysiert wurden, identisch.
  • Die Southern-Analyse ergab, daß RZM35-1 und RZM35-18 ein identisches Integrationsmuster aufwiesen, wobei das Genom von jeder Linie nur eine Kopie des Plasmids pVE108 enthielt. In der integrierten Kopie schien ein kleiner Teil der Plasmid-DNA-Sequenz, die neben der (für die Linearisierung vor der Elektroporation verwendeten) HindIII-Restriktionsstelle lag, zu fehlen. Die Southern-Analyse von RZM34-1, RZM34-12 und RZM34-14 zeigte, daß jede dieser Pflanzen vermutlich zwei oder drei Kopien eines Teils von pVE108 bzw. des ganzen pVE108 in ihr Genom integriert enthalten. Die Kopien sind höchstwahrscheinlich nicht in Concatemer-Konfiguration intertiert.
  • Die Transformanten RZM35-1 und RZM34-1 wurden mit Pollen einer nichttransformierten H99-Pflanze bestäubt, wodurch man Nachkommenschaftspflänzchen erhielt. Von den von RZM35-1 gewonnenen 35 Pflänzchen waren 16 (46%) im PAT-Assay positiv, während 19 (54%) PAT-negativ waren. Dieser F1-Nachkommenschaftsanteil unterscheidet sich nicht signifikant von dem 1:1-Verhältnis, das bei normaler mendelnder Aufspaltung einer aktiven Kopie des chimären bar-Gens erwartet wird (χ2 = 0,26).
  • Von den von RZM34-1 gewonnenen 34 Pflänzchen waren 19 (56%) im PAT-Assay positiv, während 15 (44%) PAT-negativ waren. Nimmt man an, daß die transformierte weibliche Elternpflanze eine aktive Kopie (oder auch mehrere eng gekoppelte aktive Kopien) des chimären bar-Gens enthielt, unterscheidet sich dieser F1-Nachkommenschaftsanteil nicht signifikant von dem 1:1-Verhältnis, das bei normaler mendelnder Aufspaltung erwartet wird (χ2 = 0,47).
  • Beispiel 9: Transformation von Reis mit einem Herbizidresistenzgen durch Elektroporation von DNA in kompakten embryogenen Callus von trockenen Samen
  • Entspelzte reife Samen der Reissorte Nipponbare wurden oberflächensterilisiert, auf festes 2N6-Medium (N6-Medium (Chu et al. (1975), Zitat oben)) mit einem Zusatz von 0,5 mg/l Nikotinsäure, 0,5 mg/l Pyridoxin-HCl, 1,0 mg/l Thiamin-HCl, 2,0 mg/l 2,4-D, 30 g/l Saccharose und 2,0 g/l Phytagel, pH 5,8) ausgelegt und bei 27°C im Dunkeln kultiviert. Innerhalb 3-4 Wochen entwickelte sich aus den Schildchen der Embryonen Callus. Embryogene Abschnitte von Primärcallus wurden auf N67-Medium (N6-Medium (Chu et al. (1975), Zitat oben)) mit einem Zusatz von 0,5 mg/l Nikotinsäure, 0,5 mg/l Pyridoxin-HCl, 1,0 mg/l Thiamin-HCl, 2,0 g/l Casaminosäuren (Vitamin-Assay, Difco), 1,0 mg/l 2,4-D, 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurin, 20 g/l Saccharose, 30 g/l Sorbit und 2,0 g/l Phytagel, pH 5,8) zur Vermehrung zu kompaktem embryogenem Callus umgesetzt.
  • Drei bis vier Wochen nach der Subkultivierung wurde der embryogene Callus für die Transformationsversuche verwendet. Der Callus wurde in Stücke von einer Maximallänge von ungefähr 1,5 bis 2 mm geschnitten. Die Callusstücke wurden zweimal mit EPM gewaschen und in diesem Puffer anschließend 30 Minuten bis 3 Stunden lang bei Raumtemperatur (25°C) vorplasmolysiert. Anschließend wurden die Callusstücke zweimal mit EPM- KCl gewaschen und in Elektroporationsküvetten gegeben. Jede Küvette wurde mit ungefähr 150 bis 200 mg Callusstücken in 100 bis 200 μl EPB-KCl beschickt. Pro Küvette wurden 10 bis 20 μg einer Plasmid-DNA, und zwar entweder ringförmiger pDE110-DNA oder mit HindIII oder EcoRI linearisierte pDE110-DNA, zugegeben. Bei pDE110 handelt es sich um ein 4883 Bp großes Plasmid, dessen gesamte Sequenz in Seq. Id. Nr. 4 dargestellt ist und das ein chimäres Gen, das das bar-Gen unter der Kontrolle des 35S3-Promotors umfaßt, enthält.
  • Die DNA wurde ungefähr 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit den Callusstücken inkubiert. Anschließend wurde wie in Beispiel 1 beschrieben eine Elektroporation durchgeführt. Nach der Elektroporation wurden die Callusstücke mit flüssigem N67-Medium ohne Casaminosäuren versetzt. Die Callusstücke wurden anschließend auf festes N67-Medium ohne Casaminosäuren, jedoch mit einem Zusatz von 5, 10 bzw. 20 mg/l PPT ausplattiert und auf diesem Selektionsmedium ungefähr 4 Wochen lang bei 27°C im 16-Stunden-Tag kultiviert. Sich entwickelnde PPT-resistente Calli wurden herauspräpariert und ungefähr zwei bis drei Wochen lang auf frischem N67-Medium ohne Casaminosäuren, jedoch mit 5 mg/l PPT, subkultiviert. Danach wurden ausgewählte PPT-resistente Calli auf Pflanzenregenerationsmedium N6M25 (N6-Medium (Chu et al. (1975), Zitat oben)) mit einem Zusatz von 0,5 mg/l Nikotinsäure, 0,5 mg/l Pyridoxin-HCl, 1,0 mg/l Thiamin-HCl, 288 mg/l Asparaginsäure, 174 mg/l Arginin, 7,0 mg/l Glycin, 1,0 mg/l O-Naphthalinessigsäure (NAA), 5,0 mg/l Kinetin, 20 g/l Saccharose und 2,0 g/l Phytagel, pH 5,8) mit einem Zusatz von 5 mg/l PPT umgesetzt. Innerhalb von ungefähr 1 Monat entwickelten sich Pflänzchen, die anschließend auf hormonfreies N6-Medium (Chu et al. (1975), Zitat oben) mit einem Zusatz von 0,5 mg/l Nicotinsäure, 0,5 mg/l Pyridoxin-HCl, 1,0 mg/l Thiamin-HCl, 1,0 g/l Casaminosäuren, 20 g/l Saccharose und 2,0 g/l Phytagel, pH 5,8) umgesetzt wurden, auf dem sie noch 2 bis 3 Wochen lang weiter erhalten wurden, wonach sie in Erde umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen wurden.
  • Die Zusammensetzungen der oben beschriebenen Medien 2N6-Medium, N67-Medium, N6M25-Medium und hormonfreies N6-Medium wurden freundlicherweise von der Firma Japan Tobacco Inc., Plant Breeding and Genetics Research Laboratory, 700 Higashibara, Toyoda, Iwata, Shizuoka 438, Japan zur Verfügung gestellt.
  • Beispiel 10: Charakterisierung der transformierten Reispflanzen von Beispiel 9
  • Zwei transformierte Reispflanzen aus Beispiel 9, die in unterschiedlichen Transformationsversuchen erhalten wurden, wurden 4 Wochen lang in Erde herangezogen und anschließend mit BastaR in einer Dosis, die 2 l/ha entsprach, besprüht. Die beiden Pflanzen waren BastaR-resistent und überlebten die Herbizidbehandlung, während nichttransformierte Kontrollpflanzen innerhalb von 4 Tagen nach der Herbizidspritzbehandlung braun wurden und abstarben.
  • Diese beiden Pflanzen sowie vier weitere in-vitro-Pflänzchen, die aus zwei weiteren Transformationsversuchen gemäß Beispiel 9 stammten, wurden mittels Southern-Hybridisierung analysiert, wobei pflanzliche genomische DNA, die mit PvuII verdaut worden war, mit pDE110 als Sonde getestet wurde. Diese Analyse zeigte, daß bei allen analysierten Pflanzen zumindest ein Teil einer Kopie von pDE110 in das Reisgenom integriert worden war. Bei fünf von sechs Pflanzen konnte das 1,6 kB große Fragment, das dem pDE110-Fragment, das den Großteil des chimären 35S-bar-Gens enthielt, entsprach, eindeutig identifiziert werden.
  • Beispiel 11: Feldprüfungen mit den transformierten Maispflanzen von Beispiel 2 und 4
  • Die Nachkommenschaft der Maistransformante H99-M148-1 von Beispiel 2 und der Maistransformante Pa91-M146-2 von Beispiel 4 wurden am Versuchsbetrieb von Plant Genetic Systems, N.V., in Afsnee, Belgien, unter Feldbedingungen geprüft. Der Feldversuch war vom belgischen Landwirtschaftministerium unter der Registrationsnummer BIOT/91/M06 genehmigt worden. Es wurden F1-, F2- und F3-Nachkommenschaften von den in Tabelle 1 unten zusammengefaßten Kreuzungen erhalten. Überall wurde angenommen, daß es sich bei einer der Elternlinien um eine für das neo-Gen heterozygote Pflanze handelte.
  • Von jeder Saatgutcharge wurden bis zu 100 Samen in 5 parallelen Reihen, die jeweils eine Länge von 5 Metern aufwiesen, gepflanzt. Der Restand zwischen den einzelnen Pflanzen betrug 0,25 m und der Reihenabstand betrug 1 m. Es wurden immer abwechselnd 10 Reihen Versuchspflanzen und 1 Reihe nichttransformierte H99-Pflanzen sowie 1 Reihe nichttransformierte Pa91-Pflanzen als Kontrollen angelegt. Eine Parzelle bestand aus F1- und F2-Versuchspflanzen mit Kontrollen. Jede dieser Parzellen wurde von i) einem Weg mit einer Breite von 1 m sowie ii) 3 Reihen (im Abstand von 1 m) nichttransformierten Maispflanzen (Sorte Sanora) umgeben.
  • Die Versuchsparzellen wurden gemäß Tabelle 2 unten vorbereitet, besät und pflanzenbaulich behandelt. Für die Aussaat wurden mit einem Pflanzstock Löcher hergestellt und die Samen wurden händisch in eine Tiefe von 4 bis 5 cm ausgelegt.
  • Der Feldversuch wurde durch das händische Entfernen und anschließende Dampfbehandlung aller Kolben der Versuchspflanzen beendet. Die Pflanzenreste wurden mit einer Mähmaschine mechanisch zerkleinert.
  • Es wurden die folgenden Beobachtungen gemacht. Im 2-3-Blattstadium wurde pro Saatgutcharge die Gesamtzahl der aufgegangenen Samen gezählt. Wie aus Tabelle 3 unten ersichtlich schwankte die Keimungsrate zwischen 63% und 100%, mit Ausnahme der Saatgutcharge P4482, bei der nur 42% der Samen keimte. Die Keimung von Saatgutchargen von nichttransformierten H99- und Pa91-Pflanzen schwankte zwischen 25% und 75%.
  • Im 3-4-Blattstadium wurde der Phänotyp des transgenen neo-Gens folgendermaßen im Assay geprüft. Bei jeder Pflanze wurde in zwei Blättern mit einer kleinen Schere ein Schnitt bis zur Mittelrippe gemacht. Die Schnitte wurden anschließend mit einem Stück Watte, das in eine wäßrige 4%ige Kanamycinsuspension und 0,2% SDS getaucht worden war, bestrichen. Einige Pflanzen wurden mit einer 5%igen Kanamycinsuspension und 0,1% SDS behandelt. Eine Pflanze wurde dann als anfällig und defizient für ein aktives neo-Gen beurteilt, wenn die neugebildeten Blätter gelb waren. Eine Pflanze wurde als resistent und ein aktives neo-Gen enthaltend beurteilt, wenn die neugebildeten Blätter normal waren und keine Bleichsymptome aufwiesen. Die Verfärbung der neugebildeten Blätter wurde ungefähr 10 Tage nach dem Bestreichen beurteilt. 5-8% der geprüften Pflanzen wiesen einen intermediären Phänotyp auf, da sie nicht eindeutig als anfällig oder resistent beurteilt werden konnten. Dies beruhte vermutlich auf Schwankungen bei den Umweltbedingungen und/oder den Entwicklungsstadien der geprüften Pflanzen sowie einer suboptimalen Kanamycin-(und/oder SDS-)Konzentration.
  • Bei späteren Analysen wurden die intermediären Phänotypen mit den anfälligen Pflanzen vereinigt. Der Anteil der kanamycinresistenten Pflanzen im Vergleich zu kanamycinempfindlichen Pflanzen (darunter auch den intermediären Phänotypen) wurde für jede Kreuzung oder Selbstung mit Hilfe eines Chi-Quadrat-Anpassungstests (Snedecor und Cochran (1967) 'Statistical Methods', the Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA) geprüft, und zwar unter der Annahme, daß eine mendelnde Ein-Lokus-Aufspaltung des neo-Gens vorlag. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten zusammengefaßt.
  • Aus den in Tabelle 3 dargestellten Werten läßt sich schließen, daß das eingeführte neo-Gen über drei Generationen stabil blieb, unabhängig davon, ob die Nachkommenschaft durch Selbstung, Rückkreuzung oder Fremdbestäubung mit einer nicht verwandten Linie erhalten worden war. Das Aufspaltungsmuster entsprach dem Vorhandensein von nur einer aktiven Kopie bzw. von mehreren eng gekoppelten aktiven Kopien des neo-Gens in jeder ursprünglichen Transformante und dem Vorliegen einer normalen mendelnden Ein-Lokus-Vererbung des neo-Genmerkmals.
  • In allen Fällen schienen die Versuchspflanzen im Vergleich zu nichttransformierten Kontrollpflanzen morphologisch vollständig normal zu sein. Tabelle 1
    Figure 00550001
    Figure 00560001
    Tabelle 2
    Figure 00560002
    Tabelle 3
    Figure 00570001
    • Code = Saatgutcharge (siehe Tabelle 1); Aufgang = Anzahl Keimlinge pro Anzahl ausgesäte Samen; % = Kanamycingehalt der für den Bestreichversuch verwendeten Lösung in %; T = Gesamtzahl der geprüften Pflanzen; R = Anzahl der kanamycinresistenten Pflanzen; I = Anzahl der intermediären Phänotypen; S = Anzahl der kanamycinempfindlichen Pflanzen; N.B. = Anzahl der Testpflanzen, die aufgrund des Wachstumsstillstands und Absterbens der Keimlinge nicht beurteilt wurden; χ2 = Chi-Quadrat-Wert für das Aufspaltungsverhältnis von R zu I+S (bei den Fremdbestäubungen werden 50% R – 50% I+S erwartet; bei den Selbstungen werden 75% R – 25% I+S erwartet, wenn eine Ein-Lokus-Aufspaltung angenommen wird).
    SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00580001
    Figure 00590001
    Figure 00600001
    Figure 00610001
    Figure 00620001
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    Figure 00640001
    Figure 00650001
    Figure 00660001
    SEQUENZBESCHREIBUNG
    Figure 00660002
    Figure 00670001
    Figure 00680001
    Figure 00690001
    Figure 00700001
    Figure 00710001
    Figure 00720001
    Figure 00730001

Claims (18)

  1. Verfahren zur stabilen Integration einer DNA, die ein Gen enthält, das in einer Zelle einer Getreidepflanze funktioniert, in das nucleäre Genom einer Getreidepflanze, umfassend: (a) Bereitstellung eines kompakten embryogenen Callus einer Getreidepflanze; (b) Verwundung und/oder Abbau des kompakten embryogenen Callus und Transfer der DNA in das nukleäre Genom einer Zelle in dem kompakten embryogenen Callus mittels Elektroporation, Beschuß mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen oder Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfers, um eine transformierte Zelle herzustellen; und gegebenenfalls (c) Regeneration einer transformierten Getreidepflanze aus der transformierten Zelle.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der kompakte embryogene Callus dadurch verwundet wird, daß er geschnitten wird, vorzugsweise in Callusstücke.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der kompakte embryogene Callus durch Zerschneiden in Callusstücke mit einer maximalen Länge von 0,5 bis 2,5 mm verwundet wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der kompakte embryogene Callus durch Zerschneiden in Callusstücke mit einer maximalen Länge von 1 bis 2 mm verwundet wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der kompakte embryogene Callus durch Zerschneiden in Callusstücke mit einer maximalen Länge von 1,25 bis 1,75 mm verwundet wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der kompakte embryogene Callus oder die kompakten embryogenen Callusstücken verletzt werden durch Behandlung mit einem Enzym, das in der Lage ist, die Zellwände des Callus oder der Callusstücke abzubauen, für einen Zeitraum, innerhalb dessen keine komplette Zerstörung der Gewebe erfolgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der kompakte embryogene Callus oder die kompakten embryogenen Callusstücken mit dem Enzym für einen Zeitraum von etwa 1 bis 10 Minuten behandelt werden.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der kompakte embryogene Callus oder die kompakten embryogenen Callusstücken mit dem Enzym für einen Zeitraum von etwa 1 bis 2 Minuten behandelt werden.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der kompakte embryogene Callus oder die kompakten embryogenen Callusstücken vor dem Transfer der DNA eine Zeitlang einer Plasmolyse unterworfen werden.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, in dem die DNA in das nukleäre Genom einer Zelle in dem kompakten embryogenen Callus oder den kompakten embryogenen Callusstücken mittels Elektroporation transferiert wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (b) des Verfahrens durch Beschuß mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen ausgeführt wird.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die DNA in das nukleäre Genom einer Zelle in dem kompakten embryogenen Callus oder den kompakten embryogenen Callusstücken mittels Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfers transferiert wird.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Gen die Barnase codierende DNA unter der Kontrolle des Promotors des TA29-Gens von Tabak enthält.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Promotor die Sequenz der DNA zwischen den Nucleotiden 1 und 545 der SEQ ID No. 3 umfaßt.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Gen eine DNA enhält, die eine Phosphinotricin-Acetyltransferase oder eine Neomycin-Phosphotransferase codiert.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Getreidepflanze Reis ist.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Getreidepflanze Weizen ist.
  18. Verwendung von kompaktem embryogenem Callus einer Getreidepflanze als Ausgangsmaterial für den Transfer einer DNA, die ein Gen enthält, das in einer Zelle einer Getreidepflanze funktioniert, in das nucleäre Genom der Getreidepflanze mittels Elektroporation, Beschuß mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen oder Agrobacterium-vermittelten Transformation.
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