RO114469B1 - Compus oligoribonucleotidic, procedeu de preparare si metoda de inactivare - Google Patents
Compus oligoribonucleotidic, procedeu de preparare si metoda de inactivare Download PDFInfo
- Publication number
- RO114469B1 RO114469B1 RO145344A RO14534488A RO114469B1 RO 114469 B1 RO114469 B1 RO 114469B1 RO 145344 A RO145344 A RO 145344A RO 14534488 A RO14534488 A RO 14534488A RO 114469 B1 RO114469 B1 RO 114469B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- rna
- sequence
- compound
- ribozyme
- target rna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 41
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 title claims description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 title description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 154
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 47
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 41
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 39
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 29
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 25
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 17
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 17
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 claims description 16
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 13
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 10
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 abstract description 193
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 abstract description 187
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 abstract description 185
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 46
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 34
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 14
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 abstract description 8
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 83
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 75
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 68
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 47
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 18
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 17
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 16
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 8
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 8
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 7
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 6
- 241001428638 Tobacco ringspot virus satellite RNA Species 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 108020005543 Satellite RNA Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 4
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000726311 Citrus exocortis viroid Species 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 241000724705 Lucerne transient streak virus Species 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 3
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 101100268665 Caenorhabditis elegans acc-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 2
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 244000214911 Solanum americanum Species 0.000 description 2
- 235000019048 Solanum nodiflorum Nutrition 0.000 description 2
- 241000724703 Subterranean clover mottle virus Species 0.000 description 2
- 241000723677 Tobacco ringspot virus Species 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039602 ARF GTPase-activating protein GIT2 Human genes 0.000 description 1
- 101710186015 Acetyltransferase Pat Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical group C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100494773 Caenorhabditis elegans ctl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348617 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) NIK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000002494 Endoribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 1
- 240000000731 Fagus sylvatica Species 0.000 description 1
- 235000010099 Fagus sylvatica Nutrition 0.000 description 1
- 101100112369 Fasciola hepatica Cat-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- KWBISLAEQZUYIC-UWJYBYFXSA-N His-His-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N KWBISLAEQZUYIC-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100005271 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cat-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000208133 Nicotiana plumbaginifolia Species 0.000 description 1
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 1
- 235000008673 Persea americana Nutrition 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010046983 Ribonuclease T1 Proteins 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108091006231 SLC7A2 Proteins 0.000 description 1
- 101100007329 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000248384 Tetrahymena thermophila Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002358 autolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011449 brick Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 108090000446 ribonuclease T(2) Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
- A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
- A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/60—Isolated nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/121—Hammerhead
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/124—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes based on group I or II introns
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Prezenta invenție se referă la un compus oligoribonucleotidic care posedă o înaltă activitate specifică ribonucleazică, la un procedeu de preparare a acestui compus, precum și la o metodă de inactivare a ARN țintă într-o celulă, prin utilizarea acestui compus.
Este cunoscut un număr de molecule ARN existente în natură, ca de exemplu, virusul de avocadro pătat (ASBV), ARN-urile satelite din virusul cu spoturi inelare a tutunului (STObRV) și din virusul tranzitoriu striat al lucernei (sLTSV), care suferă o scindare autocatalizată. Astfel de scindări apar ca o parte esențială și unică a duratei ciclului acestor tipuri de ARN sau a altora.
Toate reacțiile de scindare autocatalitice ale ARN-ului necesită prezența unor ioni de metale bivalente și un pH neutru sau alcalin și aceste duc la obținerea de ARN cu grupări terminale 5'-hidroxi și 2',3'-fosfat ciclic (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Reacțiile sunt catalizate chiar de ARN-uri, probabil ca rezultat al conformației care aduce grupări reactive în imediata apropiere. Pozițiile scindării auto-catalitice a ARN-urilor de proveniență naturală sunt localizate în interiorul regiunilor celor mai bine conservate ale structurii secundare a ARN-ului (de asemneâ cunoscut din literatura de specialitate).
Experimentele făcute pe ARN-urile satelite din virusul cu spoturi inelare ale tutunului (sTobRV) au dus la desemnarea unor noi endoribonucleaze (pe care le vom denumi în cele ce urmează “ribozime”), acestea fiind enzime conținute în ARN, care catalizează scindarea catalitică a moleculelor țintă de ARN.
Termenul de ribozime, așa cum se specifică că este utilizat în descriere, se referă la moleculele cuprinzând în întregime ARN-ul sau derivații acestuia.
Ribozimele, din prezenta invenție, sunt diferite de ARN endoribonuclează care se găsește în mod normal în Tetrahymena Thermophila (cunoscută ca IVS, sau L-19 IVS ARN) și care a fost descrisă pe larg de Thomas Cech și colaboratori. Endoribonuclează Cech are un oc tet de baze perechi într-un situs activ care hibridizează într-o secvență de ARN țintă, după care are loc scindarea țintei ARN, cu o cerință pentru guanozină sau derivați de guanozină liberi. Fragmentele rezultate din scindare conțin grupări terminale 5-fosfat și 3'-hidroxil. Numărul limitat de nucleotide disponibile pentru hibridizarea la un substrat ARN limitează eficacitatea și eficiența endoribonucleazei Cech ca și în general, oligonucleotidele conținând mai puțin de douăsprezece nucleotide care hibridizează în mică măsură la secvențele țintă. De asemenea, reiese că situsul activ a endoribonucleazei Cech este necesar să fie conservat cu un număr de nucleotide pentru eficiența activității endoribonucleazei. Acest lucru restrânge numărul permutărilor secvențelor de situs activ care pot fi îndreptate spre efectuarea hibridizării la secvențele țintă, astfel restrângând seria secvențelor de ARN țintă scindabile de către endoribonuclează Cech. Endoribonucleaza Cech modifică, de asemenea ARN-ul, prin adăugarea unei guanozin nucleotide libere la poziția finală 5' a ARN-ului scindat.
Compusul oligoribonucleotidic din prezenta invenție are formula generală I: 3' (X>n A. X (X)' 5' \
I \ AU
G
X . x (X)b(I) în care: fiecare X reprezintă o ribonucleotidă care poate fi aceeași sau diferită; în care fiecare (X)n și (X)n. reprezintă o oligoribonucleotidă (a) aptă de hibridizare cu o secvență de scindare ARNțintă și (b) definită printr-o secvență predeterminată, care nu se leagă covalentîn mod firesc la secvențele A-A-A-G-C și, respec
RO 114469 Bl tiv, X-C-U-G-A-, o astfel de secvență ARN țintă nefiind prezentă în compus; în care fiecare dintre n și n’ reprezintă un număr întreg care definește numărul de ribonucleotide în oligonucleotidă cu condiția ca suma n+n'să fie suficientă pentru a permite compusului să interacționeze stabil cu secvența de ARN țintă prin împerecherea de baze; în care fiecare * reprezintă împerecherea de baze dintre ribonucleotidele localizate de fiecare parte a acestuia; în fiecare linie continuă reprezintă o legătură chimică ce realizează legături covalente între ribonucleotidele localizate pe oricare parte a acestuia; în care a reprezintă un număr întreg ce definește un număr de ribonucleotidele cu condiția că a poate fi O sau 1 și dacă este O, atunci A în poziția 5' față de (X]a este legat de G în poziția 3' față de (X)a; în care fiecare dintre m și m’ reprezintă un număr întreg care este mai mare sau egal cu 1; în care fiecare dintre liniile punctate reprezintă independent, fie o legătură chimică realizând legături covalente între ribonucleotidele dispuse de fiecare parte a acestuia, fie lipsa unei astfel de legături chimice; și în care (X)b reprezintă o oligoribonucleotidă ,care poate fi prezentă sau absentă, cu condiția că b reprezintă un număr întreg mai mare sau egal cu 2 dacă (X]b este prezent.
Compusul oligoribonucleotidic din prezenta invenție poate avea și formula generală II;
| 3 <X)nT~CA\ | x— (X)n· 5 |
| A | c |
| A | \ |
| r\ | U\ |
| G 1 | G\ 1 1 |
| C 1 | g ^4 i * |
| X | |
| 1 X I | X | |
| (X)m * 'l m | (*>m· |
| X | X |
| (X)b | (li) |
| în care: fiecare X reprezintă o ribonu- | |
| cleotidă care poate | fi aceeași sau dife- |
| rită; în care fiecare | (Xk, și (X)n., repre |
zintă o oligoribonucleotidă (a) aptă de hibridizare cu o secvență de scindare ARN țintă și (b] definită printr-o secvență predeterminată, care secvență nu poate forma firesc o legătură covalentă la secvențele C-A-A-A-G-C și, respectiv, X-C-UG-A-, o astfel de secvență ARN țintă nefiind prezentă în compus; în care fiecare dintre n și n’ reprezintă un număr întreg care definește numărul de ribonucleotide în oligonucleotidă cu condiția ca suma n+n' să fie suficientă pentru a permite compusului să interacționeze stabil cu secvența de ARN țintă prin împerecherea de baze; în care fiecare * reprezintă împerecherea de baze dintre ribonucleotidele localizate de fiecare parte a acestuia; în care fiecare linie continuă reprezintă o legătură chimică ce realizează legături covalente între ribonucleotidele localizate pe oricare parte a acestuia; în care a reprezintă un număr întreg ce definește un număr de ribonucleotidele cu condiția că a poate fi O sau 1 și dacă este O, atunci A în poziția 5' față de (X)a este legat de G în poziția 3' față de (X)a; în care fiecare dintre m și m’ reprezintă un număr întreg care este mai mare sau egal cu 1; în care fiecare dintre liniile punctate reprezintă independent, fie o legătură chimică, care realizează legături covalente între ribonucleotidele dispuse de oricare parte a acestuia, fie lipsa unei astfel de legături chimice; și în care [X]to reprezintă o oligoribonucleotidă, care poate fi prezentă sau absentă, cu condiția că, b reprezintă un număr întreg mai mare sau egal cu 2 dacă (X]b este prezent.
De asemenea, compusul oligoribonucleotidic din prezenta invenție poate avea și formula generală III:
| 3 <X>n~CA\ A I | x— \ c \ | - (X)n· |
| 1 A | \ G. | |
| G 1 | A. | \ μ |
| 1 | / | |
| c | G | |
| 1 | 1 | X |
| X | ||
| 1 X i | X | |
| (X)^ * \ 'm | <>% | |
| l X | X |
<x>b (III)
RO 114469 Bl în care: fiecare X reprezintă o ribonucleotidă care poate fi aceeași sau diferită; în care fiecare (X]n_7 și (X)n. .reprezintă o oligoribonucleotidă (a) aptă de hibridizare cu o secvență de scindare ARN țintă și (b) definită printr-o secvență predeterminată care secvență nu poate forma, în mod firesc, o legătură covalentă la secvențele C-A-A-A-G-C și, respectiv, X-C-U-g-A-, o astfel de secvență țintă ARN nefiind prezentă în compus; în care fiecare dintre n și n’ reprezintă un număr întreg, care definește numărul de ribonucleotide în oligonucleotidă cu condiția ca suma n+n'să fie suficientă pentru a permite compusului să interacționeze stabil cu secvența de ARN țintă prin împerecherea de baze; în care fiecare * reprezintă împerecherea de baze dintre ribonucleotidele localizate de fiecare parte a acestuia; în fiecare linie continuă reprezintă o legătură chimică ce realizează legături covalente între ribonucleotidele localizate pe oricare parte a acestuia; în care fiecare dintre m și m’ reprezintă un număr întreg, care este mai mare sau egal cu 1; în care fiecare dintre liniile punctate reprezintă independent, fie o legătură chimică realizând legături covalente între ribonucleotidele dispuse de fiecare parte a acestuia, fie lipsa unei astfel de legături chimice; și în care (X)fa reprezintă o oligoribonucleotidă, care poate fi prezentă sau absentă, cu condiția că b reprezintă un număr întreg ,mai mare sau egal cu 2, dacă (X]fa este prezent.
Suma n+n’ este mai mare sau egală cu 14 și fiecare n și n’ este mai mare decât 6. Secvența țintă ARN de scindare este o secvență virală.
Procedeul de obținere a compusului oligoribonucleotidic, conform invenției, cuprinde următoarele etape: a] legare într-un vector de transfer cuprins în ADN, ARN sau o combinație a acestora, a unei secvențe nucleotidice corespunzând compusului respectiv; b] transcripția secvenței nucleotidice din etapa (a) cu o ARN polimerază; și c) recuperarea compusului.
Metoda de inactivare a ARN țintă într-o celulă, în conformitate cu prezenta invenție, cuprinde contactarea ARN țintă din celulă cu compusul prezentat mai sus, compusul fiind capabil să interacționeze prin împerechere de baze cu secvența ARN țintă în astfel de condiții încât compusul interacționează stabil prin împerechere de baze cu ARN țintă este scindat.
ARN țintă este o transcripție a unei gene care este endogenă față de celulă sau este exogenă față de celulă. Celula este procariotă sau eucariotă și este o celulă vegetală sau animală. Celula vegetală este o componentă a unei plante și compusul este format în interiorul celulei sau în exteriorul celulei.
Prin contrast, ribozimele din prezenta invenție hibridizează eficient într-o mare varietate de secvențe ARN țintă, și nu modifică ținta ARN scindată.
Ribozimele din prezenta invenție conțin o porțiune de hibridizare care este complementară cu secvența nucleotidică, cu cel puțin o porțiune din ținta ARN și o zonă catalitică, care este adaptată pentru a scinda ținta ARN. Zona de hibridizare conține 9 sau mai multe nucleotide.
De preferință, ribozimele din prezenta invenție au o regiune de hibridizare cuprinzând unul sau mai multe brațe formate dintr-un unic fascicol de ARN și având o secvență complementară la cel puțin o parte a țintei ARN, respectivul braț sau respectivele brațe fiind asociate cu o zonă catalitică capabilă să scindeze respectiva țintă, și acolo unde regiunea de hibridizare cuprinde un singur braț de ARN, respectivul braț conține cel puțin 9 nucleotide, iar acolo unde regiunea de hibridizare cuprinde două sau mai multe brațe de ARN, totalul nucleotidelor în respectivele brațe este mai mare de 9 nucleotide.
Ribozimele, din prezenta invenție, pot fi preparate prin metode bine cunoscute în tehnica sintezei moleculelor ARN. în particular, ribozimele din această invenție pot fi preparate dintr-o secvență corespunzătoare de ARN (ADN care prin transcriere duce la obținerea unei ribo
RO 114469 Bl zime, și care poate fi sintetizată, conform metodelor bine cunoscute, în tehnica sintezei ADN) legat chimic de ARN polimerază, ca de exemplu, un promotor pentru T7 ARN polimerază sau SP6 ARN polimerază. O secvență ADN, corespunzând unei ribozime, din prezenta invenție, poate fi ligată dintr-un vector de transfer ADN, ca ADN plasmide sau ADN bacteriofag. Acolo unde vectorul de transfer conține un promotor ARN polimerază legat la ADN-ul corespunzător unei ribozime, ribozima poate fi obținută, în mod convenabil, prin incubare cu o ARN polimerază. Ribozimele pot fi prin urmare obținute, in vitro, prin incubarea ARN polimerazei cu un promotor ARN polimerază legat la ADN-ul corespunzător unei ribozime, în prezență de ribonucleotide. In vivo, celulele procariotice sau eucariotice (incluzând celulele mamifere și celulele de plante) pot fi transfectate cu un vector de transfer adecvat conținând material genetic corespunzând unei ribozime în concordanță cu prezenta invenție, legat la un promotor ARN polimerază astfel că, ribozima este transcrisă în celula gazdă. Vectorii de transfer pot fi: plasmide bacteriale sau ARN sau ADN viral. Secvențele nucleotidice corespunzând ribozimelor sunt, în general, plasate sub controlul unor promotori puternici ca, de exemplu, impur, SV40 întârziat, SV40 timpuriu, metalotionină, sau promotor λ. Ribozimele pot fi direct transcrise in vivo, de la un vector de transfer, sau la alegere pot fi transcrise ca parte a unei molecule ARN mai mari. De exemplu, ADN corespunzând secvenței de ribozimă poate fi legată la capătul 3' al unei gene purtătoare cum ar fi, de exemplu, după o translație stop-signal și moleculele ARN mai mari pot ajuta la stabilizarea moleculelor de ribozimă împotriva digestiei de nuclează în interiorul celulelor. La translație, gene purtătoare pot face să crească o proteină a cărei prezență poate fi direct analizată, de exemplu, prin reacția enzimatică. Gena purtătoare poate, de exemplu, codifica o enzimă.
Suplimentar, invenția prevede un vector de transfer ADN, care conține o secvență ADN corespunzând unei ribozime legate de un promotor pentru a preveni transcrierea ribozimei.
într-o metodă preferențială, pentru a produce o ribozimă, două oligonucleotide sintetice ale secvenței complementare sunt preparate prin procedee standard (care sunt cunoscute din literatura de specialitate), și hibridizează împreună. Una dintre oligonucleotide codifică o ribozimă dorită. Respectivele capete ale oligonucleotidelor hibridizate corespund la diferite situsuri restrictive enzimatice, fie EcoR1, la un cap, și Pst1, la celălalt capăt. După scindare cu enzimele restrictive potrivite (EcoR1 și Pst1 în exemplul de mai sus), fragmentul ADN dublu catenar poate fi donat într-un vector de transfer. Acolo unde vectorul plasmidic conține un promotor ARN polimerază, provenit din secvența ADN corespunzând unei ribozime din prezenta invenție, ARN-ul transcris corespunzând unei ribozime poate fi convenabil fie in vitro, fie in vivo. Acolo unde ribozima conține două jumătăți reținute împreună de împerecherea bazelor nucleotidelor complementare, fiecare jumătate a ribozimei poate fi obținută, conform metodelor de mai sus, și jumătățile incubate împreună formează ribozima.
Ribozimele preferate ale prezentei invenții scindează ținta ARN, care conține secvența X°UY unde X° este orice ribonucleotidă, U este uracil și Y este adenină, citozină sau uracil. X°U formează o parte dintr-o pereche bază a zonei de flancare, iar Y nu este împerecheat cu bază. De preferință, dar în nici un caz exclusiv, X° este guanidină și X°UY este GUC sau GUA. Orice moleculă ARN conținând aceste secvențe poate fi scindată cu ribozimele din prezenta invenție. 0 dată secvența unui ARN transcris conținând secvența X°UY fiind determinată, brațele secvenței de ribozimă pot fi sintetizate, astfel, încât să-i fie complementare, și astfel să-i producă hibridizarea, ARN-ul din secvența țintă flancând secvența X°UY. La hibridizarea brațelor ribozimei, cu secvența de ARN țintă flan
RO 114469 Bl când X°UY, regiunea catalitică a ribozimei scindează ARN-ul țintă în interiorul secvenței X°UY. Scindarea ARN-ului este facilitată în prezență de magneziu sau alt cation bivalent, la pH aproximativ 8,0.
în felul acesta, ribozimele preferențiale ale prezentei invenții pot fi proiectate pentru a scinda orice ARN a cărui secvență este cunoscută. înalta frecvență a reziduurilor scindate de ribozime în ARN (1:64 pentru GUC într-un ARN ,cu coincidență și frecvență egală a distribuției de bază) înseamnă că un număr potențial de situsuri pentru scindări cu ribozime poate fi prezis cu siguranță în orice ARN țintă dat.
Potrivit unui alt aspect al prezentei invenții este asigurată o metodă pentru inactivarea unei secvențe de ARN țintă care include reacția respectivei ținte ARN cu o ribozimă din prezenta invenție.
In vivo, adică în interiorul unei celule sau a unor celule ale unui organism, un vector de transfer, cum ar fi o plasmidă vectorială sau un ARN viral, codificând unul sau mai multe ribozime, poate fi transferat în celule de exemplu (fenomen care este cunoscut din literatura de specialitate). Odată aflat în interiorul celulei, vectorul de transfer poate replica, și să fie transcris de polimerazele celulare pentru a produce ARN-uri ribozimice care apoi, inactivează un ARN țintă dorit.
La alegere, un vector de transfer conținând, una sau mai multe secvențe de ribozimă, poate fi transferat în celule sau introdus în celule prin intermediul micromanipulării tehnice, cum ar fi, microinjecția, astfel ca vectorul de transfer sau o parte a acestuia să se integreze în genomul celulei gazdă. Transcrierea materialului genetic integrat duce la apariția ribozimelor, care acționează inactivând o anumită țintă ARN.
Ribozimerle din prezenta invenție au aplicații terapeutice și biologice extinse. De exemplu, virusurile cauzând bolile la om și animale pot fi inactivate prin administrarea la un subiect infectat cu un virus, a unei ribozime, conform prezentei invenții, adaptat să hibridizeze și să scindeze ARN-ul transcris al unui virus. Astfel de ribozime pot fi hibridizate prin administrarea parenterală sau alte mijloace de administrare. Unui subiect infectat cu un virus cauzând boală, i se poate adminsitra, la alegere, un virus non-virulent ca vaccinul sau un adenovirus, care a fost preparat, astfel, încât să conțină ADN corespunzător la o ribozimă legată de un promotor ARN, astfel, încât ribozimă este transcrisă în celulele animalului gazdă, transfectată cu virusul preparat, pentru a efectua scindarea și/sau inactivarea ARN-ului țintă transcris al virusului cauzând boala. Ribozimele din prezenta invenție au aplicație, în particular, la bolile virale cauzate de exemplu, de virusul Herpes simplex (HSV) sau virusul SIDA (HIV).
Ribozimele prezentei invenții au, de asemenea ,o importanță deoasebită la inactivarea ARN-ului transcris în bacterii și alte celule procariotice, plante și animale. în bacterii, ARN-ul transcris de exemplu, bacteriofagul, care cauzează moartea celulelor bacteriale, poate fi incativat prin transfectarea unei celule cu un vector de transfer al ADN, care este capabil să producă o ribozimă, conform prezentei invenții, și care inactivează ADN-fagul. în altă variantă, ribozimă însăși poate fi adăugată și absorbită de celula bacterială pentru a efectua scindarea ARN-ofagului.
ARN-ul transcris în plante poate fi inactivat utilizând ribozime codificate de către un vector ca Ti plasmida din Agrobacterium tumefaciens. Când astfel de vectori sunt transfectați, într-o celulă de plantă, ribozimele sunt produse sub acțiunea ARN polimerazei și poate duce la scindarea unei secvențe ARN țintă specifice. Asemănător virusurile de plante ale căror secvențe ARN sunt cunoscute, sau ARN-ul transcris al genelor de plante, pot fi inactivate utilizând ribozime.
Genele endogene transcrise în plante, animale sau alte tipuri de celule pot fi inactivate folosind ribozimele din prezenta invenție. Asemănător, fenotipurile nedorite sau caracteristice pot fi mo
RO 114469 Bl dulate. Poate fi posibil, de exemplu, utilizând ribozimele din prezenta invenție să se îndepărteze sâmburii din fructe sau se pot trata bolile ereditare umane cauzate de producția unei proteine pernicioase, sau supraproducția unei proteine particulare.
Se dau, în continuare, 5 exemple de realizare a invenției, în legătură cu fig. 1...17, care reprezintă:
-Fig. 1, prezintă situsurile autoscindabile ale ARN-ului de tip sălbatic și ale ARN-urilor de mutație și o reprezentare a unui profil electroforetic a produselor de scindare auto-catalitică a ARN-ului:
(a) . Cuprinde structurile conservate asociate cu situsurile de scindare ale ARN natural în ASBV, ADN satelit transcris din triton și ARN-uri satelite ale sTobRV, LTSV, virusul pestriț de Solanum nodiflorum, virusul pestriț de tutun și virusul pestriț de trifoi subteran. Sunt reprezentate secvențele nucleotidice care sunt conservate între aceste structuri, pe când, altele sunt reprezentate cu X. împerecherea pe baze este reprezentată prin și situsul pentru scindarea ARN este indicat cu săgeată.
(b) . Reprezintă secvențele de nucleotide conservate asociate cu scindarea catenei (+) a sTobRV ARN. Situsul de scindare este indicat cu săgeată.
(c) . Este prezentat un mutant in vitro al sTobRV conținând o inserție de opt nucleotide (reprezentată încercuit] împreună cu o duplicație pe flanc de trei nucleotide (UGU cu resturi de la 7 și 9], (d) . Fragmente sub-clonate de Haelll de tip sălbatic sTobRV și mutantul D-51 in vitro au fost fiecare transcrise în ambele orientări (+) și (-) și fracționate prin transcriere radiomarcată și electroforeză pe gel de poliacrilamidă. Pozițiile bazelor 159 și 170 nescindate transcrise din secvențele de tip sălbatic (WT) și de mutant (D-51) sunt indicate cu săgeată și se evidențiază cantitățile de produse scindate.
-Fig. 2, reprezintă secvența de nucleotidă a unei ribozime și produsele de scindare ale ribozimei separate prin electroforeză pe gel:
(a) . Nucleotidele inserate în mutantul D-51 (fig. 1c) conțin un situs al endonucleazei de restricție BamHI. BamHI a fost utilizat pentru a scinda ADN-ul mutant și cele două secvențe au fost subclonate și transcrise separat in vitro, ARN-ul transcris este reprezentat schematic cu bazele potențial împerechiabile între ARN-urile indicate, cu Fragmentul conținând situsul pentru scindare arătat cu săgeată este desemnat ,ca SARN, fragmente conținând ribozima este desemnată, ca Rz-ARN.
(b) . (32P)-Rz-ARN (101 baze] a fost incubat singur (coloana 1), și cu SARN nemarcat (coloana 2). (32P)-S-ARN a fost incubat singur (coloana 3), și cu Rz-ARN-uri nemarcate sau marcate, cu 32P (coloanele 4 și, respectiv, 5).
-Fig. 3 , reprezintă schematic un model de ribozimă, conform unuia dintre obiectele prezentei invenții. Zona A reprezintă secvența de scindare din interiorul ARN țintă. Zona B reprezintă zona catalitică, iar zona C reprezintă brațele ribozimei.
-Fig. 4, prezintă schema ribozimelor ațintite împotriva genei transcrise CAT (cloramfenicol acetil transferază). Ribozimele, denumite RzCAT-1,2 și 3, au fost ațintite către trei situsuri ale genei CAT, dintr-o bază 835 transcrisă in vitro. Localizările relative ale situsurilor de scindare pe transcris sunt reprezentate schematic cu bazele numerotate de pe flancuri (a). Cele trei secvențe de ribozime sunt reprezentate (de la (b) la (d)) cu secvențele lor țintă. Secvențele de aminoacid ale genei CAT sunt numerotate și situsurile prezise pentru scindarea ARN sunt indicate cu săgeată. RzCAT-1 și 3 conțin 24 de secvențe de baze derivate din catena (+) a sTobRV (regiunea B, fig. 3), pe când RzCAT-2 conține o singură schimbare U-A în această zonă.
-Fig. 5, prezintă rezultatul scindării CAT ARN cu ribozime RzCAT-1 la 3.
(a). ARN-urile [32P]-CAT au fost fracționate pe gel după incubare, numai (-) sau cu una dintre cele trei ribozime,
RO 114469 Bl
RzCAT-1 la 3 (coloanele 1,2 și respectiv 3). Localizarea întregului transcris este indicat cu săgeată.
(b). Analiza bazei terminale 5'. Fragmentele 3' produse prin scindarea cu ribozimă a CAT mARN au fost [5'-32P]kinazate, purificate pe gel, supuse la digestie completă de nuclează, iar reziduurile terminale eliberate au fost fracționate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă, la pH=3,5. Nucleotidele terminale 5', determinate prin referire la markeri (coloana M), unde A, U și G sunt din fragmentele produse de RzCAT, de la 1 la 3 (coloanele 1, 2 și, respectiv, 3).
-Fig. 6, este reprezentată curba activității catalitice a ribozimei RzCAT-1 asupra CAT ARN. Cantitățile de produse de scindare ale nucleotidei 139 au fost stabilite cantitativ și reprezentate grafic. Reprezentarea suplimentară arată acumularea de fragment de bază 139 în timp, după electroforeză pe gel de poliacrilamidă.
-Fig. 7, prezintă viteza relativă de scindare a CAT ARN în diferite condiții de temperatură. Substratul ARN este reprezentat prin linie continuă. în fiecare caz, produsul de scindare este reprezentat printr-o linie punctată.
-Fig. 8, reprezintă trei ribozime (corespund pentru RzCAT-2) având brațe sau secvențe de flanc de diferite mărimi.
-Fig. 9, prezintă schema de obținere a unei ribozime cuprinzând ARN antisens catalitic, conținând în fiecare domeniu de scindare RzCAT, de la 1 la 3.
-Fig. 10, arată hibridizarea ribozimelor la secvențe tintă conținând motive GUA (10a) și GUU(10b) în CAT mARN.
-Fig. 11, arată situsurile pentru scindarea autocatalitică a ARN-ului din virusul Citrus exocortis (CEV] ARN și complementul acestuia.
-Fig. 12, este reprezentată ribozima RzCEV25x (+) hibridizată la ținta CEV ARN(a), și o imagine a electroforezei pe gel a (+)CEV ARN și (-)CEV ARN complementar, incubat cu RzCEV25x(+) (b, coloanele 1 și, respectiv, 2. Produsul de scindare este indicat cu săgeată).
-Fig. 13, prezintă ribozimă RzCAT hibridizând la secvența sa țintă (a) și ribozima RzSCMoV (b). Domeniul catalitic al fiecărei ribozime este încercuit. Sunt marcate și diferențele între zonele catalitice ale RzSCMoV,comparativ cu RzCAT-2.
-Fig. 14, prezintă ribozimă RzCEV2 hibridizând la o secvență țintă din ARN-ul virusului Citrus exocortis (CEV). Situsul de scindare corespunde nucleotidei-336 în secvența CEV ARN. Alterarea la secvența nucleotidică în domeniul catalitic al sTobRV este încercuită (a). Fig. 14(b) prezintă o imagine electroforetică a unui ARN de control (catena (-) a CEV) ARN, coloana 7 și catena (+) a CEV ARN coloana 8, după incubare cu RzCEV2.
-Fig. 15, prezintă ribozimă RzCAT2 (a) comparată cu ribozimă RzCAT-2B (b). Domeniile catalitice sunt încercuite. Schimbările în domeniul catalitic al RzCAT-2B comparativ cu RzCAT-2 sunt, de asemenea, încercuite.
-Fig. 16, reprezintă o schemă a plasmidei pJ35SN.
-Fig. 17, este o prezentare grafică a unei medii a patru experimente asupra inhibiției expresiei CAT la plante (protoplaste de tutun).
în exemplele de realizare care urmează, reacțiile și manipulările împlicând ADN,ca ligări, reducerea digestiei enzimei, transformări bacteriale, secvențierea ADN, etc, au fost conduse după tehnici standard, ca cele descrise în literatura de specilaitate (de exemplu, de Maniatis și al.). Manipulările de ARN au fost, de asemenea, conduse conform tehnicilor standard ca cele descrise de Uhlenbeck.
Exemplul 1. Scindarea auto-catalitică a sTobRV ARN de mutație
Un consens al domeniilor asociate cu scindarea situsurilor ARN-ului produs natural în ASBV, ADN datelit de triton transcris, și ARN-urile satelite ale sTobRV, LTSV, virusul pestriț al tabacului catifelat (VMoV) virusul pestriț din Solanum nodiflorum (SNMV) și virusul pestriț de trifoi subteran (SCMoV) este așa cum este reprezentat în fig. 1a. Sunt prezentate secvențele de nucleo
RO 114469 Bl tide, care sunt conservate între aceste structuri, pe când secvențele non-conservate sunt reprezentate cu X. Un U suplimentar este poziționat după reziduul 1Aîn catena LTSV(+).
Domeniul asociat cu scindarea auto-catalizată a catenei (+) a sTobRV a fost studiat pentru a evidenția activitatea enzimatică a substratului în acest domeniu. Mai întâi, sTobRV cADN-urile donate au fost supuse mutagenezei utilizând o oligonucleotidă linker de redactare a inserției (BamH1).
Construirea unui vector pentru exprimarea sTobRV in vitro
Un fragment 160 Taq 1-Spe 1 de sTobRV cADN a fost izolat din pSP653 (după metodele cunoscute din literatura de specialitate) și ligat la restul Acc 1Spe 1 ,pGEM 4 tratat cu fosfatază pentru a reforma situsul Acc 1. Un clon rezultat a fost linearizat cu Acc 1 tratat cu fosfatază și un fragment 359 bp Taq 1, din sTobRV cADN a fost linearizat. Clonele rezultate au fost protejate de prezența unei secvențe 520 bp sTobRV cADN permutată circular, conținând reziduuri terminale excesive, de la 277 la 81 (pTTS). Secvența sTobRV este flancată de promotori pentru T7 și SP6 ARN polimeraze, și transcrierea, dă o creștere de ARN de orientare (+) sau (-) care conține două situsuri pentru autoscindare.
Mutageneza in vitro
Plasmida pTTS (50 pg) a fost linearizată cu BamH1, tratată cu nuclează S1 și religată pentru a îndepărta un unic situs BamH1. Compusul rezultat, pTTSB, a fost tratat cu 2 x 1O4 unități de DNază 1, în 20 mM Tris-HCI, pH= 7 și 0,15 mM MgCI2, pe o perioadă de 10 min și la temperatura, de 37°C. ADNurile lineare rezultate au fost orientate și/sau blocate la capăt, utilizând T4 ADN polimerază și au fost purificate prin electroforeză cu gel 0,7% de LGT agaroză și extracție. Secvențele de linker kinază BamHI (CGGATCCG) au fost ligate, pentru a lineariza plasmida, peste noapte la temperatura camerei, în prezență de polietilenglicol 5%. Apoi, reacțiile au fost asimilate de BamHI, și ADN urile plasmidice lineare au fost repurificate prin electroforeză pe gel 0,7% de LGT agaroză (acest lucru s-a găsit că este necesar pentru a îndepărta ultimele urme de plasmidă circulară împreună cu linkerii nelegați). Plasmidele au fost recirculate utilizând T4 ADN ligază și transformate în E.coli DH-1. Colonii (mai mari de 1000) au fost răzuite de pe plăcile de agar, crescute în cultură lichidă până la saturare și s-au preparat populații mixte de ADN-uri plasmidice. Amestecul de inserții sTobRV cADN a fost excizat prin restricția enzimei de asimilare la EcoR1 flancator și la situsurile Pst1, purificat prin electroforeză pe gel 1% de LGT agaroză și sub-clonat la capătul EcoR1Pst1 ,pGEM-4 tratat cu fosfat. Rezultantele au fost din nou comasate, crescute în cultură lichidă și s-a preparat ADN plasmidic. ADN-urile plasmidice au fost tratate cu BamHI, pentru a scinda numai acele plasmide conținând o secvență linker BamHI și formele liniare au fost din nou purificate prin electroforeză în două rânduri pe gel 0,7% de AGT agaroză, recirculare cu T4ADN ligază și transformare în E.coli DH-1. Transformanții individuali au fost protejați pentru poziția aproximativă a linkerului BamHI inserat în secvența sTobRV, prin restricția enzimei de asimilare, sub-clonați la M13 mp 19 și secvențiați prin tehnica lanțului terminal dideoxinucleotidic.
A rezultat o multitudine de mutanți sTobRV și analiza secvenței de nucleotide a arătat că fiecare mutant a conținut o secvență linker (CGGATCCG] de BamHI inserată împreună cu duplicarea flancurilor sau eliminarea secvențelor sTobRV. Mutanții au fost transcriși in vitro și ARN-urile au fost testate în privința capacității de a suferi scindarea. Din acest experiment a fost identificată o secvență 52-nucleotidă conținând, atât porțiuni de substrat, cât și de scindare a sTobRV ARN. Această secvență 52nucleotidă, reprezentată în fig. 1b, a conținut domeniul de secvență conservată cerut pentru auto-scindarea altor ARN-uri (fig. 1a). Un mutant, desemnat D-51, a conținut o secvență opt-nucleoti
RO 114469 Bl dică de linker BamH1 inserată între trei nucleotide sTobRV duplicate numerotate de la 7 la 9. Acest mutant a suferit scindare auto-catalitică a ARN-ului.
Perechile de baze 97 și 108 din fragmentele Haelll conținând secvența de scindare 52-nucleotidă de tipul sălbatic și ARN-urile D-51 (așa cum sunt prezentate în fig. 1b și 1c) au fost excizate din clonele plasmidice secvențiate. Fragmentele au fost ligate la situsul Smal al pGEM4 și protejate pentru a obține ambele orientări ale inserției. Plasmidele au fost linearizate utilizând EcoR1 și catena (+) și (-) a ARN-urilor cu bucăți de baze 159 și 170 au fost transcrise utilizând 200 unități/ml de T7 ARN polimerază la pH=7,5, în 50 mM Tris-HCI, 10 mM NaCI, 6 mM MgCI2, 2mM spermidină, 1000 unități/ml RNazină, 500 pM ATP, CTP și GTPcu 200 pM (a32P)UTP. ARN-urile au fost fracționate prin electroforeză pe poliacrilamidă 10%, uree 7 molar, gel de formamidă 25% și autoradiografiată.
Așa cum s-a prezentat în fig. 1 d, nu s-a observat scindarea catenei (-) a ARN transcris. Acest lucru era de așteptat întrucât catena (-) nu conține un situs de scindare auto-catalitică. La catenele (+) atât ale tipului sălbatic cât și ale secvențelor D-51, a avut loc scindarea, iar scindarea D-51 ARN-ului fiind întrucâtva mai puțin eficientă decât cea a tipului sălbatic (fig. 1d). Acest experiment indică că regiunea cu o buclă unicatenară, pe partea dreaptă a secvenței 52nucleotidice, la scindarea auto-catalitică a ARN-ului, nu este esențială.
Separarea activităților enzimatice și de substrat
Utilizând situsul endonucleazei BamH1 de restricție inserat în D-51, au fost obținute fragmente de flanc HaelllBamH1 și BamH1 -Haelll și fiecare a fost sub-clonat într-o palsmidă de E. coli convenabilă pentru transcrierea in vitro. Acest lucru a condus la eliminarea buclei unicatenare mutate din domeniul de auto-scindare, scindând regiunea în două segmente de ARN (fig. 2a). Fragmentul mai mic Haelll-BamH1 conținea nucleo tide de la 321 la 9, incluzând actualul situs de scindare și a fost denumit fragmentul S. Fragmentul BamH1 -Haelll conținând nucleotide de la 7 la 48 din sTobRV a fost denumit ribozimă sau fragment Rz. Plasmidele E.coli folosite pentru transcrierea in vivo au fost pGEM4 și pGEM3 (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Aceste plasmide de expresie conțin:
(a) , o origine a replicării;
(b) . gena selectabilă la rezistența la medicamente (Ampr);
(c) . un situs de donare multiplă flancat de promotori ARN polimerază care pot fi utilizați pentru obținerea transcrierii in vitro.
T7 ADN polimeraza tratată, RzpGEM3 digerată cu Kpn1 și S-pGEM4 digerat cu Xbal au fost transcrise utilizând SP6 ARN polimerază în aceleași condiții cu cele descrise mai sus. Așa cum se prezintă în fig. 2, atât S.cât și Rz-ARNurile nu au prezentat degradare semnificativă când au fost incubate singure (fig. 2b, coloanele 1 și 3) în condiții potrivite pentru auto-scindare de înaltă eficiență (50°C, 20 mM MgCI2, pH=8,0). Rz-ARN marcat apare.de asemenea, nealterat după incubare cu S-ARN (fig. 2b, coloanele 2 și 5). Totuși, când S-ARN a fost amestecat cu Rz-ARN, a avut loc scindarea eficientă a S-ARN (fig. 2b, coloanele 4 și 5) rezultând două fragmente. Dimensiunile produsului au fost coordonate cu scinadrea S-ARN-ului (84 de baze) la situsul normal între nucleotidele #359 și #1, pentru a da fragmente învecinate pozițiilor 5' și 3' ale nucleotidelor 67 și, respectiv, 17. Acest lucru arată că SARN-ul acționează ca un substrat pentru scindarea ribonucleotidică cu Rz-ARN, care acționează de o manieră catalitică.
Un model al unei ribozime bazat pe regiunea catalitică a sTobRV ARN este prezentat în fig. 3. Ribozimă are două brațe sau secvențe pe flancuri, de ARN unicatenar, prezentat la C, hibridizând la secvențele complementare pe un substrat ARN, iar ARN-ul este scindat. Fiecare secvență de flanc prezentată la C, conține 8 ribonucleotide. Numărul ri
RO 114469 Bl bonucleotidelor conținut în regiunea C nu este critic. Totuși este necesar să fie prezente suficiente nucleotide pentru a permite ribozimei să hibridizeze la o țintă ARN. Reiese că patru nucleotide în fiecare regiune C este necesar să fie prezente, cel puțin, pentru hibridizare.
Regiunea catalitică B conține secvențe care sunt foarte bine în domeniile în care are loc scinadrea pe cale naturală (în mod spontan) (de văzut fig. 1a). Din compararea domeniilor de scindare ale secvențelor cunoscute, reiese că porțiunea de pereche bază din II, nu este importantă, ca și prezența unei bucle asociate la unul din capetele acesteia.
Situsul de scindare din interiorul țintei ARN este reprezentat la A (în fig. 3) ca GUC. Pe baza experimentelor noastre (neprezentate), și a altora din domeniul de specialitate, asupra situsurilor de scindare în ARN-urile de proveniență naturală, a rezultat că și secvențele GUA, GUC, CUC, AUC și UUC acționează ca situsuri de scindare, în interiorul ARN.
Exemplul 2. Demonstrarea designului, sintezei și activității ribo-zimelor, cu o nouă și înaltă activitate de endoribonuclează
Ca o ilustrare a acestei invenții au fost proiectate trei ribozime, care sunt ațintite împotriva transcrisului unei gene folosite în mod obișnuit ca indicator, derivate din bacterii, Tn9 Cloramfenicol Acetil Transferază (CAT), care poate dezvolta rezistență la bacterii, plante și animale și poate fi testată cu ușurință. Aceste ribozime, desemnate Rz-CAT de la 1 la 3 corespund la scindări potențiale de situsuri GUC în CAT ARN la pozițiile 139-140, 494-495 și 662-663, respectiv. Secvențele acestor ribozime sunt reprezentate în fig. 4. în fiecare caz, secvențele de pe flanc care hibridizează ARN-ul CAT țintă au conținut 8 nucleotide. Zona catalitică a fost astfel aleasă, încât să corespundă aceleia a sTobRV ARN, prezentate în fig. 3.
Gena CAT care a fost obținută din pCM4, a fost sub-clonată ca un frag ment BamH1 în pGEM-32. Acest plasmid a fost linearizat cu Hindlll și transcrisurile genei CAT au fost obținute utilizând T7 ARN polimerază cu 220 μΜ (a32P) UTP. Au fost sintetizate secvențe de ribozime ca oligodezoxinucleotide, Rz CAT1,2 și,respectiv, 3. Acestea au fost kinazate, ligate cu o porțiune EcoRI-Pstl de pGEM4 tratat cu fosfatază și a fost incubat cu fragmentul Klenow al ADN polimerazei 1, înainte de transformare bacterială. Plasmidele EcoRI linearizate au fost transcrise cu T7 ARN polimerază pentru a produce ARN-uri ribozimice. Ribozimele au fost incubate cu transcris CAT,în mM Tris-HCI, pH= 8,0, 20 mM MgCI2, la temperatura de 50°C, timp de 60 min, iar produsele au fost fracționate prin electroforeză pe gel conținând 5% poliacrilamidă, 7 M uree, formamidă 25% înainte de autoradiografie.
Când transcrisul CAT 840-nucleotidic a fost incubat cu oricare dintre cele trei ribozime, a avut loc o scindare eficientă și de înaltă specificitate a secvenței (fig. 5] rezultând două fragmente de ARN,din fiecare reacție. Mărimile fragmentelor au fost compatibile cu situsurile prezise pentru scindare (fragmentele de baze 139 și 696, 494 și 341, 662 și 173 au fost produsele scindării catalitice 5' și 3' din RzCAT-1,2 și, respectiv, 3). Condițiile cerute pentru scindări catalitice cu ribozime au fost similare acelora observate pentru reacțiile de scindare, care au loc pe cale naturală (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate), scindarea mai eficientă având loc, la pH-uri ridicate, temperatură și concentrații de cation bivalent (nu sunt prezentate date). Când sunt prezente în exces molar, cele trei ribozime catalizează scindarea aproape completă a CAT ARN substrat, după 60 min, în 50 mM Tris-HCI, pH=8,0, 20 mM MgCI2,la temperatura de 50°C. în condiții similare, cu 0,1 pM substrat și 3 μΜ ribozime, T1/2 al substratului CAT mARN au fost 3,5 și 2,5 min, în prezența RzCAT1,2 și, respectiv, 3. Secvențele de ribozime au fost inactive față de complementul substratului ARN (catena (+)), și în
RO 114469 Bl forma oligodeoxiribonucleotidelor (nu sunt prezentate date). Fragmentele terminale 3' de scindare ale fiecărei reacții catalizate cu ribozimă au fost izolate și poziția 5' kinazată-32P (50 mM Tris-HCI, pH=9, 10 mM MgCI2,10 mM DTT, cu uCi γ32-Ρ ATP și 5 unități T4 polinucleotid kinază, timp de 30 min, la temperatura,de 37°C). Prin kinazarea eficientă a fragmentelor, se indică că ele posedă grupări 5' terminale, similar celor rezultate în urma scindării, care are loc în mod natural.
Au fost determinate nucleotidele fragmentelor obținute prin scindarea secvențelor CAT, de către RzCAT, de la 1 la 3. Pe scurt, fragmentele radiomarcate au fost purificate pe un gel de poliacrilamidă 5% și supuse digestiei,cu un volum egal de 500 unități/ml RNază T1, 25 unități/ml RNază T2 și 0,125 mg/ml RNază, în 50 mM acetat de amoniu pH=4,5, timp de 120 min, la temperatura de 37°C. Produsele au fost fracționate pe un gel de poliacrilamidă 20% conținând 25 mM citrat de sodiu, pH=3,5 și uree 7 molar. Fig. 5b arată că scindarea secvențelor CAT de către RzCAT-1 la 3 are loc cu precizie în fața nucleotidelor A, U și respectiv G.
Secvențele terminale a fragmentelor de genă CAT au fost determinate direct utilizând tehnica asimilării parțiale enzimatice (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate), utilizând scindarea specifică pe bază,parțial, nucleotidică. Secvența de fragment confirmă că scindarea are loc la localizările așteptate din interiorul CAT ARN (nu sunt arătate).
Cataliza enzimatică
Pentru a demonstra că ribozimele provoacă scindarea substratului CAT mARN într-o manieră catalitică, fiecare a fost incubat cu un exces molar de substrat, în condiții care ar favoriza, atât scindarea, cât și disocierea de produs.
Fig. 6 arată rezultatele unui experiment, în care, după 75 min, la temperatura de 50°C, pH=8,0, în 20 mM MgCI2, 10 pmol de RzCAT-1 au catalizat scindarea specifică a unui substrat trunchiat de 163 pmol CAT mARN (173 baze) pentru a da fragmente 5' și 3' a bazelor 139 și, respectiv, 34. în medie, fiecare ribozimă a participat la mai mult de zece reacții de scindare. După 75 min, la temperatura de 50°C a fost remarcată o proporție de scindare nespecifică a ARN-ului datorită condițiilor extreme, dar 70% din ARN-urile rămase intacte (163 mol) s-a acumulat ca fragment de bază 139. Rezultatele similare s-au obținut pentru RzCAT-2 și 3 (nu sunt prezentate date), și,astfel, rezultă că fiecare acționează ca o enzimă ARN.
Exemplul 3. Efectul temperaturii asupra activității ribozimei
A fost examinat efectul temperaturii asupra vitezei activității ribozimei in vitro.
A fost urmărit mersul reacțiilor pentru ribozimele RzCAT-1, 2 și,respectiv, 3, substraturi, la 37°C și 50°C.
în acest experiment, reacțiile pentru fiecare ribozimă au fost făcute în dublu exemplar, utilizând condițiile de reacție din exemplul 2. O probă a fost incubată la temperatura de 37°C, celaltă la temperatura de 50°C. Probele la timpul de reacție, până la 90 min și desfășurarea reacției a fost analizată prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă denaturată. Fig. 7 prezintă mersul reacției pentru fiecare dintre ribozimele, de la 1 la 3, la temperatura de 37°C și temperatura de 50°C. Viteza de reacție a fiecărei ribozime crește cu creșterea temperaturii de reacție.
Timpul de reacție necesar pentru scindare a 50% (t1/2) din CAT ARN este prezentat în tabelul 1:
RO 114469 Bl
Tabelul 1
| Temperatura, °C | RzCAT-1 | RzCAT-2 | RzCAT-3 /P(minute) |
| 50 | 3,5 | 3,5 | 2,5 |
| 37 | 55,0 | 70,0 | 65,0 |
Așa cum se arată în tabelul 1, vi- io teza de reacție a ribozimelor la temperatura de 37°C este de aproximativ 20 de ori mai mică, decât viteza de reacție la temperatura de 50°C.
Exemplul 4. Efectul variației lungi- 15 mii brațelor ribozimelor (sau a secvenței de flanc) asupra activității catalitice a ribozimei
Brațele sau secvențele de flanc ale unei ribozime hibridizează ribozima la 20 o țintă ARN, după care are loc scindarea ARN. în acest experiment a fost investigat efectul asupra vitezei de scindare a unei secvențe țintă, obținut prin alterarea dimensiunilor complementarității 25 și, prin urmare, a lungimii bazelor care înperechează, ale brațelor ribozimei, la secvența țintă.
Ribozimele au fost produse cu 4, 8 și 12 baze complementare a secvenței 3 o țintă RzCAT-2, pe fiecare braț (fig. 8a). Ribozimele au fost preparate, conform metodelor din exemplul 2. Activitatea ribozimei a fost determinată prin incubarea ribozimei ARN,cu CAT ARN, așa 35 cum a fost descris mai înainte.
Ribozima având o compelmentaritate de 4 baze, pe fiecare braț, nu scindează substratul ARN. Ribozima având o compelmentaritate de 8 baze pe 40 fiecare braț a scindat substratul CAT, ca și ribozima având o compelmentaritate de 12 baze. Ribozimele cu o compelmentaritate de 12 baze au scindat mai eficient ținta ARN, așa cum se poate ju- 45 deca după viteza de reacție in vitro, decât ribozimele având un număr mai mic de baze complmentare. Prin urmare, apare necesar să existe o compelmentaritate mai mare de patru baze, mărind 50 dimensiunile zonei de hibridizare a ribozimelor când crește viteza lor de reacție.
într-un experiment secund, a fost investigată eficiența reacției unei ribozime având compelmentaritate (a) la întreaga lungime a țintei transcrise CAT ARN și domenii catalitice multiple (b).
Patru situsuri țintă GUC, în secvențele CAT ARN, au fost alese. Domeniile catalitice ale ribozimei împotriva acestor situsuri au fost “inserate” într-o secvență completă anti-sens (-] pentru transcrisul CAT și a fost testată activitatea catalitică.
Cele patru situsuri alese au fost cele trei desemnate prin RzCAT-1, 2 și 3, descrise mai înainte și un situs suplimentar, care poate fi descris după cum urmează:
Situs CAT nou #192
His His Ala Val C y s Asp Gly
5' 3’
CAU CAU GCC GUC UGU GAU GGC în care: “192 se referă la aminoacidul 192 din polipeptida CAT și se referă la situsul de clivaj.
Oligodeoxiribonucleotidele conținând domenii catalitice ale ribozimei și rotirile fiecărui dintre aceste situsuri de scindare, au fost folosite pentru experimente în mutageneză M13, pentru a produce o secvență conținând întregul complement al secvenței CAT, dar cu cele patru domenii catalitice ale ribozimei, înserat în acesta. Mutageneza M13 a fost executată prin legarea oligonucleotidelor conținând inserții de ribozimă la ADN-urile unicatenare, conținând uracil, urmată de sinteza ADNurilor complementare, conținând inserția. ADN-urile complementare au fost recuperate ca urmare a donării într-o specie potrivită de E. coli (așa cum este cunoscut din literatura de specilitate].
RO 114469 Bl
CADN-ul rezultant dublu catenar a fost donat într-un vector de expresie in vitro pentru a produce ribozima ARN, utilizând sistemul de transcripție T7. Activitatea ribozimei a fost determinată prin incubarea ARN ribozimei cu transcripția SAT urmată de electroforeza pe gel a amestecului de reacție, după tratare cu glicoxal pentru a denatura acizii nucleici.
Scindarea autolitică a avut loc la toate situsurile așteptate pe transcrisul CAT. în consecință, secvențele de flancuri ale brațelor sau a ribozimei se pot extinde, de-a lungul întregii lungimi a transcrisului ARN, care trebuie scindat.
Fig. 9, prezintă schematic un ARN anti-sens catalitic conținând fiecare dintre cele patru ribozime. ARN-ul antisens catalitic conține aproximativ 9OO de baze.
în condițiile de mai sus, ribozima și secvențele țintă formează complecși înalt moleculari probabil prin împerechere de baze extensive. Pentru a resolubiliza produsele de reacție este necesar un tratament puternic denaturizant, ca, de exemplu, tratament cu glioxal, în timpul electroforezei.
Exemplul 5. Secvențe țintă pentru scindarea ribozimelor
Motivul GUA din mARN a fost testat pentru a vedea dacă o ribozimă va afecta scindarea ARN la această secvență.
A fost ales un situs specific din CAT mARN, incluzând motivul GUA (fig. 1Oa) și a fost preparată o secvență ribozimică potrivită și testată, din punct de vedere al activității. Ribozima conținea brațele a 8 ribonucleotide.
□ligonucleotidele sintetice corespunzând ribozimei din fig. 10, au fost preparate conform exemplului 2 și cADN-ul dublu catenar a fost donat întrun vector de expresie in vitro din E.coli, cu scopul de a produce ribozimă ARN utilizând sistemul de transcriere T7 polimeraza. Activitatea ribozimei a fost determinată prin incubarea ribozimei ARN,cu CAT mARN, urmată de electroforeza pe gel a amestecului de reacție cum a fost descris.
Ribozima efectuează scindarea la situsul țintă GUA (nu este arătat). în consecință, motivul GUA în ARN este un substrat pentru ribozimele din prezenta invenție. Acest lucru nu este complet neașteptat, întrucât un situs de proveniență naturală din ARN-ul satelit al virusului tranzitoriu striat al lucernei necesită recunoașterea unui situs GUA.
în mod similar, un motiv GUU din secvența țintă CAT ARN a fost testat cu o ribozimă potrivită (vezi fig. 10b) și a fost efectuată scindarea.
Exemplul 6. Scindarea ribozimei ARN-ului viral
ARN-ul viroid, în formă de ARN viroid din Citrus exocortis, a fost scindat utilizând o ribozimă din prezenta invenție, în ARN viroid din Citrus exocortis (CEV) au fost alese două situsuri GUC țintă. A fost ales, de asemenea,un situs în secvența catenară complementară. Au fost preparate ribozime împotriva tuturor acestor situsuri și li s-a testat activitatea. Ribozimele au fost denumite CEV9x(+), CEV9x(-) și CEV25x(+). Fig. 11 prezintă cele trei situsuri de scindare în CEV ARN pentru fiecare din aceste ribozime.
Ribozimele au fost preparate conform metodelor precedente. Ribozima RzCEV25x(+] este prezentată în fig. 12. Această ribozimă scindează motivul GUC la nucleotida 116a CEV ARN.
Fig. 12b prezintă scindarea CEV ARN cu ribozima RzCEV9x(+). Cu ribozima RzCEV9x[-) nu s-a observat scindare.
Acest experiment indică că ribozimele sunt active împotriva secvențelor țintă ARN din diverse surse. Acest lucru este de așteptat, întrucât toate ARNurile sunt formate din cărămizile de bază ribonucleotidice conținând adenină, guanină, citozină și uracil, indiferent de originea lor, din animale, din plante sau din microbi.
Exemplul 7. Exemple de ribozime având domenii catalitice variabile
O ribozimă ațintită împotriva unui situs CAT-2 a fost preparată utilizând secvența de domeniu catalitic din ARN
RO 114469 Bl satelit al virusului de trifoi pestriț subteran (SCMoV). 0 complementaritate de douăsprezece baze ale secvenței de flanc a brațului ribozimei a fost încorporată în proiectul ribozimei RzSCMoV. Ribozimele RzCAT-2 și RzSCMoV sunt prezentate în fig. 13a și, respectiv, 13b. Regiunea de buclă a RzSCMoV conține 5 nucleotide conținând secvența AAAUC. Aceasta este în contrast cu regiunea de buclă a RzCAT-2, care conține 4 nucleotide cuprinzând secvența AGAG. în plus, RzSCMoV conține un C, în zona catalitică în loc de U* în RzCAT-2. Sunt marcate secvențele diferite din RzSCMoV comparativ cu RzCAT-2.
RzSCMoV a fost produs conform exemplului 2. RzSCMoV s-a dovedit a fi activ ducând la obținerea a două produse de scindare, așa cum se aștepta.
într-un alt experiment, situsul țintă de Citrus exocortis viroid (CEV) la nucleotida -336 în ARN-ul său complementar a fost scindat utilizând o ribozimă (RzCEV-2] având secvența redată în fig. 14a. Regiunea de buclă desemnată cu litera “L” în fig. 14 cuprinde șase nucleotide având secvența 3'-CCTATA-5'. Aceasta este distinctă de regiunea de buclă a sTobRV care cuprinde patru nucleotide cu secvența 3'-AGAG-5'. Această ribozimă scindează ținta CEV complementară a ARN la poziția -336, așa cum se prezintă în profilul electroforetic din fig. 14b.
Acest experiment indică că numărul de nucleotide și secvențe de nucleotidă din zona de buclă nu este important în activitatea ribozimei. în aceste experimente, ribozimă a fost produsă conform metodelor descrise mai înainte în invenție.
în alt experiment, a fost investigat efectul împerecherii de baze în domeniul catalitic (regiunea trunchiului).
A fost preparată și testată o ribozimă modificată conținând patru perechi de baze suplimentare. In fig. 15a, este prezentată secvența de ribozimă RzCAT-2 hibridizată la CAT ARN țintă. Ribozimă test este prezentată în fig. 15b, cu perechile de baze adiționale încer cuite. Ribozimă test are activitate comparabilă cu aceea a RzCAT-2. Aceasta indică că zona împerecherii de baze a domeniului catalitic a ribozimei poate fi de lungime variabilă fără a afecta activitatea catalitică.
S-a observat (nu sunt prezentate date) că forma stabilă in vivo a transcriselor sTobRV ARN exprimate în plantele transgenice este la început circulară, probabil datorită ligării grupelor 5' și 3' terminale. Prin urmare, utilizarea a două situsuri de scindare autolitică flancând o secvență de interes într-un ARN transcris in vivo este probabil să conducă la un produs circularizat care poate avea o stabilitate mai mare, decât transcrisul linear. Acest lucru pare să proiecteze o nouă metodă pentru stabilizarea in vivo a secvențelor de ribozime. Această operație este denumită circularizare.
Exemplul 8. Activitatea in vivo a ribozimelor în acest exemplu este investigată activitatea in vivo a ribozimelor din celulele de plante.
Protocol experimental
Plasmide conținând gene de construcție anti-CAT (CAT = cloramfenicol acetil transferază) sau anti-CAT/ribozimă combinate (vezi mai jos) au fost introduse în protoplaste de tutun, în aceiași cantitate și proporție una față de cealaltă, împreună cu altă plasmidă, care conținea o genă funcțională CAT de construcție. Activitățile CAT au fost măsurate și comparate cu nivelul de bază a activității genei.
Materiale și metode [a], Electroporări și teste CAT
Acestea au fost executate așa cum este descris în literatura de specialitate. Pe scurt, protoplastele de Nicotiana plumbaginifolia linia T5 au fost preparate dintr-o suspensie de două zile după subcultură, suspendate în 10 mM HEPES, pH=7,2, 150 mM NaCI, 0,2 M manitol și ajustate la o densitate de 3 x 106/ml. Electroporarea a fost condusă utilizând un singur puls de 50 ms la 250 V. Protoplastele au fost diluate de 10 ori și cultivate, timp de 20 h, la tempera
RO 114469 Bl tura de 26°C și în întuneric. Acestea au fost scindate prin sonicare și s-au obținut extractele. Extractele normalizate pentru conținutul de proteină, au fost testate din punct de vedere a activității CAT in vitro utilizând 14C-cloramfenicol și acetil CoA. Produsele de reacție au fost separate, prin cromatografie pe strat subțire și autoradiografie. Gradul de desfășurare a reacției a fost calculat prin obținerea de derivați radioactivi a produsului din modelul 14C-cloramfenicol.
(b). Gene de construcție
Genele de construcție au fost introduse în 0,1 ml suspensii de protoplaste ca ADN-uri plasmidice, care au fost purificate din bacterii, prin extracțieșicentrifugare la echilibru de gradient de densitate în două cicluri (CsCI echilibru). Acestea au fost resuspendate în 10 mM Tris/1 mM EDTA/, pH=7,5 pentru utilizare.
Gene de construcție CAT activă s-a născut pe plasmida desemnată pCAT7+. Ea a derivat prin fuziunea unei secvențe de genă CAT (din plasmida pCM4, așa cum este cunoscut din literatura de specialitate) în plasmida pJ35SN (derivată din p35SN, de asemenea, cunoscută din literatura de specialitate), astfel, încât, genele de construcție au fost:
5' 3' în interiorul plasmidelor cu următoarele denumiri:
pJ35SN = Acest vector plasmidic, a cărui schiță este prezentată în fig. 16, conține un promotor 355 CaMV și un semnal de nopalin sintetază 3' adenilare din plantă, care poate fi reprezentat după cum urmează:
5' 3'
| 35S | SN0 |
pCAT7- = Aceasta conține secvența de genă CAT inserată în pJ35 SN, astfel, încât transcripția va duce la obținerea CAT ARN antisens, care poate fi reprezentat după cum urmează:
5' 3'
| 35S | 'cat | NOS |
pCAT19- = Aceasta conține gena CAT cu patru domenii catalitice ribozimice incluse în ea, (vezi exemplul 4 și fig. 9), inserată în pJ35SN, astfel, încât transcripția va duce la producerea de CAT ARN antisens, care poate fi reprezentată după cum urmează:
5' 3’
| 35S | CAT * | NOS |
| 35S | CAT | NOS |
35S se referă la CaMV 35S (virusul de conopidă mozaicat) promotor, NOS la semnalul de nopalin sintetază poliadenilare, T/C la transcris.
împreună cu 0,2 pg de pCAT7+ au fost adăugate diverse gene de construcție în exces, așa cum este descris mai jos. Genele de construcție s-au găsit inserțiile domeniului catalitic
Rezultate
Următorul tabel prezintă activitățile relative ale CAT în celule, după 20 h, de la electroporare. Activitatea este exprimată ca o conversie procentuală a substratului de cloramfenicol într-un test de o oră.
RO 114469 Bl
| Tratament | pg de plasmidă electroporată | Conversie % | |||
| pCAT7+ | pJ35SN | pCAT7- | pCAT19- | ||
| 1A | - | - | - | - | 0 |
| 1B | - | - | - | - | 0 |
| 2A | 0,2 | 18 | - | - | 21 |
| 2B | 0,2 | 18 | - | - | 46 |
| 3A | 0,2 | 9 | 9 | - | 28 |
| 3B | 0,2 | 9 | 9 | - | 32 |
| 4A | 0,2 | - | 18 | - | 26 |
| 4B | 0,2 | - | 18 | - | 19 |
| 5A | 0,2 | 9 | - | 9 | 19 |
| 5B | 0,2 | - | - | 9 | 22 |
| 6A | 0,2 | - | - | 18 | 14 |
| 6B | 0,2 | - | - | 18 | 16 |
(pentru fiecare tratament A” și “B, sunt duplicate).
Următoarele concluzii pot fi trase 25 din aceste rezultate:
(a) . Introducerea genei CAT de construcție conduce la o activitate CAT nesemnificativă - de comparat 2A,B cu 1A,B. între duplicate există o variație. 30 Din tendințele observate în celelalte probe (vezi “b” și “c” mai jos) este probabil că 2A prezintă o activitate anormal de scăzută.
(b) . Introducerea concomitentă a 35 unei gene de construcție antisens duce la o descreștere a nivelului activității - de comparat 3A,B și 4A,B. Mărimea descreșterii este în directă relație cu nivelul genei antisens adăugate ca plasmidă - de 4 o comparat 3A,B și 4A,B.
(c) .Introducerea concomitentă a genei de construcție combinate antisens/ribozimă conduce la o descreștere a activității genei - de comparat 5A,B și 45 6A,B. în afară de aceasta, descreșterea este mai marcată decât pentru nivelurile corespunzătoare ale genei de construcție antisens - de comparat 5A,B cu 3A,B și 6A,B cu 4A,B. 50
Rezultatele medii pentru patru experimente in vivo sunt prezentate în fig. 17. în această figură, “control” înseamnă tratament 2. Antisens” semnifică tratament 4. Catalitic” reprezintă tratament 6 și “fundament” reprezintă tratament 1.
Ribozima catalitică inhibă activitatea CAT într-o proporție de 47%, comparativ cu o proporție de 34% pentru o ribozimă antisens.
Introducerea genelor purtătoare de ribozime în celulele de plantă inhibă activitatea genelor împotriva cărora au fost ațintite. în plus, inhibarea este mai mare pentru moleculele ARN antisens corespunzătoare.
Aceste rezultate arată că ribozimele vor fi active în celule, la animale, la plante sau microbi împotriva unui șir de molecule ARN țintă.
Mecanismul acțiunii ribozimelor în acest exemplu este neclar. De exemplu, ribozima antisens poate hibridiza ireversibil la o țintă ARN și cataliza scindarea legăturii fosfodiester la unul sau mai multe situsuri țintă selectate de-a lungul
RO 114469 Bl țintei ARN. Alternativ, enzimele celulare pot desface ARN antisens de secvența sa țintă, astfel, încât ținta ARN este scindată în două sau mai multe fragmente. 5
Exemplul 9. Activitatea ribozimelor in vivo În celulele animale în acest exemplu este demonstrată activitatea ribozimelor în inactivarea unei ținte ARN din celulele mamifere, io
Materiale și metode
Genele active de construcție codificând ribozime au fost transfectate întro linie de celule din rinichi de maimuță larg accesibile. în această metodă, au 15 fost contactate 3 x 1OB/ml celule COS1 suspendate într-o soluție tampon salină cu 10% ser de vițel fetal, cu diferite gene de construcție. Pentru a efectua electroporarea ADN-ului din celule a fost 20 aplicată o descărcare electrică. Celulele transfectate au fost incubate la temperatura de 37°C, timp de 48 h, în mediu de cultură și înainte de testare pentru activitatea CAT și a luciferazei. 25
Genele CAT de construcție au apărut în plasmida desemnată pTK CAT (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Această plasmidă este derivată prin introducerea unei secvențe de genă CAT, în plasmida pSV2, astfel, încât este sub controlul promotorului timidinchinază al virusului Herpes simplex.
Gena de construcție codificând a apărut în plasmida pSV232A (cunoscut din literatura de specialitate) conținând gena luciferază fuzionată cu promotorul timpuriu SV40. ADN-ul codificând ribozimele a fost ligat în situsul Xbal la capătul 3' al genei luciferază, conform metodelor standard, care sunt cunoscute din literatura de specialitate (Maniatis si al.).
Următoarele constructe au fost preparate utilizând tehnicile standard cunoscute (Maniatis și al.):
PFC58 = Acest vector plasmidic conține ADN codificând ribozima RzCAT1 fuzionată la capătul 3' al genei luciferază într-o orientare nefuncțională.
Acesta poate fi descris după cum urmează:
unde: 232A se referă la secvența 35 pSV232A, SV40 timpuriu se referă la promotorul timpuriu SV40 și T mic este ADN, codificând secvența T mic de intervenție a SV4D. Acest construct rezultă în producerea unei molecule codificând 40 luciferază și ribozima RzCAT-1, ultima fiind într-o astfel de orientare încât, nu se așteaptă să fie catalitică.
pFC4 = Acest plasmid este același ca pFC58, cu excepția că RzCAT-1 45 este înlocuit cu RzCAT-3.
pFC1-6 = Acest plasmid este același ca pFC58,cu excepția că RzCAT-1 este înlocuit cu RzCAT-3, în sensul orientării (5'-3'). 50 pFC2D = Acest plasmid este același ca pFC1-6 cu excepția că,RzCAT-3 este înlocuit cu RzCAT-2 secvențe de flanc de opt nucleotide.
pFC12 = Acest plasmid este același ca și pFC2D,cu excepția că ribozima RzCAT-2 conține secvențe de flanc de douăsprezece nucleotide.
pFC5D = Acest plasmid conține gena CAT cu patru domenii catalitice de ribozimă incluse în el (vezi exemplul 4 și fig. 9) în sensul orientării (5'-3'J, care pe transcris dă naștere unei ribozime inactive. Acest plasmid poate fi descris cum urmează:
| SV40 timpuriu | Genă CAT conținând domenii de ribozimă | Poli A+ |
♦
ARN necatalitic
RO 114469 Bl pFC54 = Acest plasmid este același ca și pFC5O, cu excepția că gena CAT și domeniile ribozimei sunt în orientarea antisens(3'-5').
pFC64 = Acest plasmid împarte 5 promotorul SV40 și semnalele poliadenilării cu pFC5O și conține gena CAT de tip sălbatic cu domenii de ribozimă neinserate. Această genă este într-o orientare antisens si astfel, nu produce proteină io CAT.
pFC65 = Acest plasmid este același ca și pFC64, cu excepția că gena CAT de tip sălbatic este în sensul (5’-3') de orientare și, astfel, este producă- 15 toare de proteină CAT.
Teste
Activitatea luciferazei a fost testată conform metodelor cunoscute din literatura de specialitate. Pe scurt, ce- 20 lulele COS au fost lizate, la 48 h, după transfectare și lizatul de celulă a fost incubat cu luciferină, substratul liciferazei, și liminiscența detectată utilizând un contor de scintilație. 25
Activitatea CAT a fost măsurată, de asemenea, utilizând lizate de celule COS (lizatele de celule au fost divizate în două, și fiecare porțiune testată pentru activitatea luciferazei sau a CAT], conform metodei care este cunoscută din literatura de specialitate.
în testele in vivo, pFC58 și pFC4 nu a efectuat activitatea CAT în celulele transfectate. Această activitate a fost desemnată ca, activitate CAT 100% și 0% supresie CAT. Activitatea CAT în celulele transfectate cu alte plasmide a fost măsurată relativ la pFC58. Procentul de supresie CAT a fost măsurat ca:
(. test — x 100 catz control normalizat la producția de lucîferază. CATtest-CAT testează rezultatul pentru constructe test. CATcontrO|-CAT testează pentru controlul constructelor (pFC4 si pFC58).
Producția de luciferează este un control intern pentru electroporare și dă o măsură a producției de ribozimă în interiorul fiecărei plăci de cultură de țesut electroporată individual.
Rezultate
Experimentul (i) pg plasmid electroporat/1,5 x 1CT celule
| Tratament | pTKCAT | pFC58 | pFC20 | pFC1-6 | pFC12 | Supresia % CAT |
| 1 | 5 | 2 | 56 | |||
| 2 | 5 | 1 | 1 | 53 | ||
| 3 | 5 | 2 | 40 | |||
| 4 | 5 | 2 | - | - | 0 |
Toate tratamentele experimentale au fost conduse în dublu exemplar și s-a dat o valoare medie.
Experimentul (ii)
| pg plasmid electroporat/' | ’,5 x 1CP celule | |||||
| Tratament | pTKCAT | pFC1-6 | pFC20 | pFC12 | pFC4 | Supresia % CAT |
| 5 | 5 | 2 | 75 | |||
| 6 | 5 | - | 2 | - | 75 | |
| 7 | 5 | 4 | 62 | |||
| 8 | 5 | 1 | 1 | 70 | ||
| 9 | 5 | 4 | 51 | |||
| 10 | 5 | - | - | 2 | 0 |
RO 114469 Bl
Tratamentele de la 5 la 10 au fost efectuate în dublu exemplar, și s-a dat o valoare medie.
Experimentul [iii] pg plasmid electroporat/1,5 x 1CP celule
| Tratament | pTKCAT | pFC1-6 | pFC4 | Supresia % CAT |
| 11 | 5 | 2 | 66 | |
| 12 | 5 | 2 | 0 |
Tratamentele au fost efectuate în dublu exemplar și s-a dat o valoare medie. Experimentul [iv] pg plasmid electroporat
| Tratament | pTKCAT | pFC50 | pFC54 | pFC64 | pFC65 | Supresia % CAT |
| 13 | 5 | 2 | 0 | |||
| 14 | 5 | 2 | - | 26 | ||
| 15 | 5 | 2 | 2 | |||
| 16 | 0 | 2 | NA |
Fiecare din tratamentele de la 13 la 16 20 au fost efectuate în patru exemplare.
Constructul de sens CAT (tratamentul 16) a produs niveluri înalte ale activității CAT. Prin urmare, % de supresie nu este aplicabil (NA). 25
Un număr de experimente au fost conduse înlocuind promotorul TK al pTKCAT cu promotor metalotionein uman. Când acest construct a fost cotransfectat în celule C0S1 cu plasmide 30 codificând una sau mai multe ribozime, s-a observat o marcată descreștere a activității CAT.
Rezultatele de mai sus demonstrează clar inactivitatea activității in vivo 35 a ribozimelor în celulele umane.
Pe când eficiența ribozimelor in vivo se crede că ar fi cauzată de una sau mai multe regiuni catalitice, care sunt capabile de scindarea unei ținte ARN, 40 prezența de astfel de regiuni în ribozimele de tip ARN “Antisens” poate să nu conducă, de fapt,la scindarea in vivo dacă întreaga moleculă ARN/ARN-antisens nu se prăbușește. Totuși, indiferent 45 dacă molecula se prăbușește sau nu, exemplele precedente demonstrează eficacitatea ribozimei în inactivarea țintei ARN. Astfel, invenția este aplicabilă pentru toate ribozimele având o zonă catali- 5o tică capabilă să producă scindarea și o zonă de hibridizare, indiferent unde are de fapt loc scindarea în ținta ARN. Zona de hibridizare poate fi, atât de largă, încât să facă ca, combinația ARN/ribozimă să stea împreună și să prevină scindarea țintei ARN în componente separate, chiar dacă zona catalitică, ea însăși, este capabilă să producă scindare.
Claims (15)
- Revendicări1. Compus oligoribonucleotidic, caracterizat prin aceea că are formula
generală: 3' (X)n— \ X----(X)n. 5' A 1 c I \ A u \ G G T-A i >3 | C 1 ? X ( X 1 X 1 X 1 (xr ‘ \ ;m (X)m· 1 X X (X)b (1) în care: fiecare X reprezintă o ribonucleotidă care poate fi aceeași sau diferită; în care fiecare (X]n și (X)n. reprezintă o oligoribonucleotidă (a) aptă de hibridizare cu o secvență de scindare ARNRO 114469 Bl țintă și (b) definită printr-o secvență predeterminată, care nu se leagă covalent în mod firesc la secvențele A-A-A-G-C și, respectiv, X-C-U-G-A-, o astfel de secvență ARN țintă nefiind prezentă în compus; în care fiecare dintre n și n‘ reprezintă un număr întreg care definește numărul de ribonucleotide în oligonucleotidă cu condiția ca suma n+n’să fie suficientă pentru a permite compusului să interacționeze stabil cu secvența de ARN țintă prin împerecherea de baze; în care fiecare * reprezintă împerecherea de baze dintre ribonucleotidele localizate de fiecare parte a acestuia; în care fiecare linie continuă reprezintă o legătură chimică ce realizează legături covalente între ribonucleotidele localizate pe oricare parte a acestuia; în care a, reprezintă un număr întreg ce definește un număr de ribonucleotidele cu condiția că a poate fi □ sau 1 și dacă este O, atunci A în poziția 5' față de (X)a este legat de G, în poziția 3',față de (X)a; în care fiecare dintre m și m’ reprezintă un număr întreg, care este mai mare sau egal cu 1; în care fiecare dintre liniile punctate reprezintă independent, fie o legătură chimică realizând legături covalente între ribonucleotidele dispuse de fiecare parte a acestuia, fie lipsa unei astfel de legături chimice; și în care (X]b reprezintă o oligoribonucleotidă.care poate fi prezentă sau absentă, cu condiția că b reprezintă un număr întreg, mai mare sau egal cu 2, dacă (X]b este prezent. - 2. Compus oligoribonucleotidic, caracterizat prin aceea că are formula generală:
- 3 X-Mn 5A CI . \A U, * <k· X . X (X)b (II) în care: fiecare X reprezintă o ribonucleotidă, care poate fi aceeași sau diferită; în care fiecare (X)n_, și (X)n, reprezintă o40 oligoribonucleotidă (a) aptă de hibridizare cu o secvență de scindare ARN țintă și (b) definită printr-o secvență predeterminată, care secvență nu poate forma firesc o legătură covalentă la secvențele C-A-A-A-G-C și, respectiv, X-C-U-G-A-, o astfel de secvență ARN țintă nefiind prezentă în compus; în care fiecare dintre n și n’reprezintă un număr întreg, care definește numărul de ribonucleotide în oligonucleotidă cu condiția ca suma n+n'să fie suficientă pentru a permite compusului să interacționeze stabil cu secvența de ARN țintă prin împerecherea de baze; în care fiecare * reprezintă împerecherea de baze dintre ribonucleoti-dele localizate de fiecare parte a acestuia; în care fiecare linie continuă reprezintă o legătură chimică ce realizează legături covalente între ribonucleotidele localizate pe oricare parte a acestuia; în care a,reprezintă un număr întreg ce definește un număr de ribonucleotidele cu condiția că a poate fi O sau 1 și dacă este O, atunci A în poziția 5' față de (X)a este legat de G în poziția 3' față de (X)a; în care fiecare dintre m și m' reprezintă un număr întreg, care este mai mare sau egal cu 1; în care fiecare dintre liniile punctate reprezintă independent, fie o legătură chimică care realizează legături covalente între ribonucleotidele dispuse de oricare parte a acestuia, fie lipsa unei astfel de legături chimice; și în care (X)b reprezintă o oligoribonucleotidă, care poate fi prezentă sau absentă, cu condiția că b repre-zintă un număr întreg,mai mare sau egal cu 2, dacă (X)b este prezent.3. Compus oligoribonucleotidic, caracterizat prin aceea că are formula generală:A U (X)b (III)XRO 114469 Bl41 42 în care: fiecare X reprezintă o ribonucleotidă care poate fi aceeași sau diferită; în care fiecare (X]n_7 și (X)n-, reprezintă o oligoribonucleotidă (a) aptă de hibridizare cu o secvență de scindare ARN țintă și 5 (b) definită printr-o secvență predeterminată, care secvență, nu poate forma, în mod firesc, o legătură covalentă la secvențele C-A-A-A-G-C și, respectiv, X-C-U-G-Â-, o astfel de secvență io țintă ARN nefiind prezentă în compus; în care, fiecare dintre n și n reprezintă un număr întreg, care definește numărul de ribonucleotide în oligonucleotidă cu condiția ca, suma n+n’să fie suficientă pentru 15 a permite compusului să interacționeze stabil cu secvența de ARN țintă prin împerecherea de baze; în care fiecare * reprezintă împerecherea de baze dintre ribonucleotidele localizate de fiecare parte 20 a acestuia; în care fiecare linie continuă reprezintă o legătură chimică ce realizează legături covalente între ribonucleotidele localizate pe oricare parte a acestuia; în care fiecare dintre m și m’repre- 25 zintă un număr întreg, care este mai mare sau egal cu 1; în care fiecare dintre liniile punctate reprezintă independent, fie o legătură chimică realizând legături covalente între ribonucleotidele dis- 30 puse de fiecare parte a acestuia, fie lipsa unei astfel de legături chimice; și în care (X)b reprezintă o oligoribonucleotidă, care poate fi prezentă sau absentă, cu condiția că b reprezintă un număr întreg, mai 35 mare sau egal cu 2, dacă (X)fc este prezent.
- 4. Compus oligoribonucleotidic, conform cu oricare dintre revendicările 1,2 sau 3, caracterizat prin aceea că 40 suma n+n’ este mai mare sau egală cu 14.
- 5. Compus oligoribonucleotidic, conform cu oricare dintre revendicările 1,2, 3 sau 4, caracterizat prin aceea că 45 fiecare n și n'este mai mare decât 6.
- 6. Compus oligoribonucleotidic, conform cu oricare dintre revendicările 1, 2, 3, 4 sau 5, caracterizat prin aceea că secvența tintă ARN de scindare este 50 o secvență virală.
- 7. Procedeu de obținere a compusului, conform cu oricare dintre revendicările 1, 2, 3, 4, 5 sau 6, caracterizat prin aceea că .cuprinde etapele de: a) legare într-un vector de transfer cuprins în ADN, ARN sau o combinație a acestora, a unei secvențe nucleotidice corespunzând compusului respectiv; b] transcripția secvenței nucleotidice din etapa (a) cu o ARN polimerază; și c) recuperarea compusului.
- 8. Metodă de inactivare a ARN țintă într-o celulă, caracterizată prin aceea că, cuprinde contactarea ARN țintă din celulă cu compusul conform cu oricare dintre revendicările 1, 2, 3, 4, 5 sau 6, compusul fiind capabil să interacționeze prin împerechere de baze cu secvența ARN țintă în astfel de condiții, încât compusul interacționează stabil prin împerechere de baze cu ARN țintă, iar ARN țintă este scindat.
- 9. Metodă, conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că ARN țintă este o transcripție a unei gene care este endogenă față de celulă.
- 10. Metodă, conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că ARN țintă este o transcripție a unei gene care este exogenă față de celulă.
- 11. Metodă, conform cu oricare dintre revendicările 8, 9 sau 10, caracterizată prin aceea că,celula este procariotă sau eucariotă .
- 12. Metodă, conform revendicării11, caracterizată prin aceea că celula este o celulă vegetală sau animală.
- 13. Metodă, conform revendicării12, caracterizată prin aceea că.celula vegetală este o componentă a unei plante.
- 14. Metodă, conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că .compusul este format în interiorul celulei.
- 15. Metodă, conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că .compusul este format în exteriorul celulei.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPI591187 | 1987-12-15 | ||
| AUPI995088 | 1988-08-19 | ||
| AUPJ035388 | 1988-09-09 | ||
| AUPJ130488 | 1988-11-04 | ||
| AUPJ133388 | 1988-11-07 | ||
| PCT/AU1988/000478 WO1989005852A1 (en) | 1987-12-15 | 1988-12-14 | Ribozymes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO114469B1 true RO114469B1 (ro) | 1999-04-30 |
Family
ID=27507391
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO145344A RO114469B1 (ro) | 1987-12-15 | 1988-12-14 | Compus oligoribonucleotidic, procedeu de preparare si metoda de inactivare |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0321201B2 (ro) |
| JP (1) | JP3046318B2 (ro) |
| KR (1) | KR970010758B1 (ro) |
| CN (1) | CN1102174C (ro) |
| AR (1) | AR243935A1 (ro) |
| AT (1) | ATE115999T1 (ro) |
| AU (1) | AU632993B2 (ro) |
| CA (1) | CA1340831C (ro) |
| DE (1) | DE3852539T3 (ro) |
| DK (1) | DK175956B1 (ro) |
| ES (1) | ES2065919T5 (ro) |
| FI (1) | FI104562B (ro) |
| GR (1) | GR3015374T3 (ro) |
| HU (2) | HUT54407A (ro) |
| MC (1) | MC2115A1 (ro) |
| NO (2) | NO308610B1 (ro) |
| NZ (1) | NZ227332A (ro) |
| RO (1) | RO114469B1 (ro) |
| WO (1) | WO1989005852A1 (ro) |
Families Citing this family (200)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5019556A (en) * | 1987-04-14 | 1991-05-28 | President And Fellows Of Harvard College | Inhibitors of angiogenin |
| CA1340323C (en) * | 1988-09-20 | 1999-01-19 | Arnold E. Hampel | Rna catalyst for cleaving specific rna sequences |
| US5866701A (en) * | 1988-09-20 | 1999-02-02 | The Board Of Regents For Northern Illinois University Of Dekalb | HIV targeted hairpin ribozymes |
| US5624824A (en) * | 1989-03-24 | 1997-04-29 | Yale University | Targeted cleavage of RNA using eukaryotic ribonuclease P and external guide sequence |
| US5168053A (en) * | 1989-03-24 | 1992-12-01 | Yale University | Cleavage of targeted RNA by RNAase P |
| DE4091533T (ro) * | 1989-08-31 | 1992-01-30 | ||
| US5225347A (en) * | 1989-09-25 | 1993-07-06 | Innovir Laboratories, Inc. | Therapeutic ribozyme compositions and expression vectors |
| US5225337A (en) * | 1989-09-25 | 1993-07-06 | Innovir Laboratories, Inc. | Ribozyme compositions and methods for use |
| DE3933384A1 (de) * | 1989-10-06 | 1991-04-18 | Hoechst Ag | Multifunktionelle rna mit selbstprozessierungsaktivitaet, ihre herstellung und ihre verwendung |
| DE3935473A1 (de) * | 1989-10-25 | 1991-05-02 | Hoechst Ag | Rna mit endonuclease- und antisense-aktivitaet, ihre herstellung und ihre verwendung |
| AU651569B2 (en) * | 1990-01-11 | 1994-07-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for detecting and modulating RNA activity and gene expression |
| DE4002885A1 (de) * | 1990-02-01 | 1991-08-08 | Hoechst Ag | Expression einer multigen rna mit self-splicing aktivitaet |
| US5519164A (en) * | 1990-02-01 | 1996-05-21 | Hoechst Aktiengesellschaft | Expression of a multigene RNA having self-splicing activity |
| US5180818A (en) * | 1990-03-21 | 1993-01-19 | The University Of Colorado Foundation, Inc. | Site specific cleavage of single-stranded dna |
| WO1991018913A1 (en) * | 1990-06-07 | 1991-12-12 | City Of Hope | Ribozyme mediated reversal of transformation by cleavage of the hras oncogene rna |
| WO1991018625A1 (en) * | 1990-06-07 | 1991-12-12 | City Of Hope | Ribozyme mediated reversal of transformation by cleavage of the hras oncogene rna |
| WO1991019789A1 (en) * | 1990-06-19 | 1991-12-26 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Endonucleases |
| US6008343A (en) * | 1990-06-19 | 1999-12-28 | Gene Shears Pty. Ltd. | Nucleotide based endonucleases |
| US5246921A (en) * | 1990-06-26 | 1993-09-21 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Method for treating leukemias |
| EP0639226A1 (en) * | 1990-06-26 | 1995-02-22 | The Wistar Institute | Rna molecule for use in treating leukemias |
| CA2088154A1 (en) * | 1990-07-26 | 1992-01-27 | Martin Tabler | Portable ribozyme cassettes, dna sequences containing them, ribozyme encoded by these dna sequences, and compositions containing these ribozymes |
| JP3257675B2 (ja) | 1990-10-12 | 2002-02-18 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フェルデルング デル ビッセンシャフテン エー．ファウ． | 修飾リボザイム |
| NZ314630A (en) * | 1991-01-17 | 2000-11-24 | Harvard College | Use of trans-splicing ribozymes for genetic modification and cell ablation in a host cell |
| NZ314629A (en) * | 1991-01-17 | 2000-08-25 | Gen Hospital Corp | Use trans-splicing ribozymes to prepare medicaments for gene therapies |
| FR2675803B1 (fr) | 1991-04-25 | 1996-09-06 | Genset Sa | Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications. |
| FI913197A0 (fi) | 1991-07-01 | 1991-07-01 | Xyrofin Oy | Nya jaeststammar med reducerad foermaoga att metabolisera xylitol, foerfarande foer bildande av dessa och deras anvaendning vid framstaellning av xylitol. |
| WO1993014218A1 (en) * | 1992-01-13 | 1993-07-22 | Duke University | Enzymatic rna molecules |
| KR100260483B1 (ko) * | 1992-04-17 | 2000-07-01 | 마나배 게이사꾸 | Rna 비루스에 대하여 저항성을 갖는 식물 제조방법 |
| ES2255703T3 (es) * | 1992-06-29 | 2006-07-01 | Gene Shears Pty Limited | Acidos nucleicos y procedimientos para la utilizacion de los mismos para el control de patogenos viricos. |
| DE69332856D1 (de) * | 1992-07-02 | 2003-05-15 | Sankyo Co | Haarnadelförmiges ribozym |
| US5409823A (en) * | 1992-09-24 | 1995-04-25 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for the production of hybrid seed |
| US5864028A (en) * | 1992-11-03 | 1999-01-26 | Gene Shears Pty. Limited | Degradation resistant mRNA derivatives linked to TNF-α ribozymes |
| IL107480A0 (en) * | 1992-11-03 | 1994-02-27 | Gene Shears Pty Ltd | Tnf-x ribozymes and degradation resistant mrna derivatives linked to tnf-x ribozymes |
| JPH08507203A (ja) * | 1992-12-04 | 1996-08-06 | イノーバー ラボラトリーズ，インコーポレイテッド | 調節可能な核酸治療およびそれらの使用方法 |
| JPH08506724A (ja) * | 1992-12-04 | 1996-07-23 | アポロン・インコーポレーテッド | 白血病治療のための化合物および方法 |
| ATE217347T1 (de) * | 1992-12-04 | 2002-05-15 | Univ Yale | Diagnose mittels signalverstärkung durch ein ribozym |
| FR2701960B1 (fr) * | 1993-02-26 | 2002-09-13 | Gene Shears Pty Ltd | Polyribozyme apte à conférer, aux plantes, une résistance aux virus et plantes résistantes produisant ce polyribozyme. |
| US5817635A (en) * | 1993-08-09 | 1998-10-06 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Modified ribozymes |
| AU5334294A (en) * | 1993-10-15 | 1995-05-04 | Dkfz Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts | Asymmetric hammerhead ribozymes and nucleotide sequences for their construction |
| US5869248A (en) * | 1994-03-07 | 1999-02-09 | Yale University | Targeted cleavage of RNA using ribonuclease P targeting and cleavage sequences |
| US5998193A (en) * | 1994-06-24 | 1999-12-07 | Gene Shears Pty., Ltd. | Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof |
| US6350934B1 (en) | 1994-09-02 | 2002-02-26 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid encoding delta-9 desaturase |
| US5683873A (en) * | 1995-01-13 | 1997-11-04 | Innovir Laboratories, Inc. | EGS-mediated inactivation of target RNA |
| US6057153A (en) * | 1995-01-13 | 2000-05-02 | Yale University | Stabilized external guide sequences |
| FR2730637B1 (fr) | 1995-02-17 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
| IL122428A0 (en) | 1995-06-07 | 1998-06-15 | Commw Scient Ind Res Org | Minizymes and minribozymes and uses thereof |
| US6010904A (en) * | 1995-06-07 | 2000-01-04 | The General Hospital Corporation | Cell ablation using trans-splicing ribozymes |
| US6004806A (en) * | 1995-06-07 | 1999-12-21 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization | Optimized minizymes and miniribozymes and uses thereof |
| BR9610402A (pt) * | 1995-07-13 | 2000-01-11 | Ribozyme Pharm Inc | Composições e método para a modulação da expressão do gen em plantas. |
| US5824519A (en) * | 1995-11-08 | 1998-10-20 | Medical University Of South Carolina | Tissue-specific and target RNA-specific ribozymes |
| US6620805B1 (en) | 1996-03-14 | 2003-09-16 | Yale University | Delivery of nucleic acids by porphyrins |
| US5877162A (en) * | 1996-03-14 | 1999-03-02 | Innovir Laboratories, Inc. | Short external guide sequences |
| US5976874A (en) * | 1996-08-16 | 1999-11-02 | Yale University | Phenotypic conversion of drug-resistant bacteria to drug-sensitivity |
| US6610478B1 (en) | 1996-08-16 | 2003-08-26 | Yale University | Phenotypic conversion of cells mediated by external guide sequences |
| US6884430B1 (en) | 1997-02-10 | 2005-04-26 | Aventis Pharma S.A. | Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles |
| US6969601B2 (en) | 1997-04-03 | 2005-11-29 | Jensenius Jens Chr | MASP-2, a complement-fixing enzyme, and uses for it |
| EA004568B1 (ru) | 1997-04-15 | 2004-06-24 | Коммонвелт Сайентифик Энд Индастриал Рисерч Организейшн | Полипептиды монооксигеназы со смешанными функциями, способные катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, кодирующие их нуклеиновые кислоты, способы применения полипептидов и нуклеиновых кислот и трансгенные растения |
| US7589253B2 (en) | 1997-04-15 | 2009-09-15 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism |
| HUP0004589A3 (en) | 1997-06-30 | 2003-08-28 | Centre Nat Rech Scient | Improved method for transferring nucleic acid into the striped muscle and combination therefor |
| CA2303759A1 (en) | 1997-09-16 | 1999-03-25 | Cropdesign N.V. | Cyclin-dependent kinase inhibitors and uses thereof |
| DE19741375C2 (de) * | 1997-09-19 | 1999-10-21 | Max Planck Gesellschaft | Transgene Pflanzen, deren oberirdische Teile früher reifen und vollständig absterben |
| DE69821011T3 (de) | 1997-10-02 | 2009-01-08 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Verfahren zur Modulierung der Neovaskularisierung und/oder des Wachstums kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen |
| ATE509947T1 (de) | 1997-11-18 | 2011-06-15 | Max Planck Gesellschaft | Nukleinsäure involviert im responder phenotyp und deren verwendung |
| US6013447A (en) * | 1997-11-21 | 2000-01-11 | Innovir Laboratories, Inc. | Random intracellular method for obtaining optimally active nucleic acid molecules |
| AUPP249298A0 (en) | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
| KR20010042069A (ko) | 1998-03-20 | 2001-05-25 | 베니텍 오스트레일리아 리미티드 | 유전자 발현 조절방법 |
| US6248525B1 (en) | 1998-03-30 | 2001-06-19 | Yale University | Method for identifying essential or functional genes |
| WO1999067400A1 (en) | 1998-06-24 | 1999-12-29 | Musc Foundation For Research Development | Tissue-specific and target rna-specific ribozymes |
| DE19836098A1 (de) | 1998-07-31 | 2000-02-03 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke |
| ATE386804T1 (de) | 1998-10-15 | 2008-03-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Gene mit veränderter expression in metastatischen brust- oder dickdarm- krebszellen |
| CA2348366C (en) | 1998-11-09 | 2012-05-15 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Nucleic acid molecules from rice and their use for the production of modified starch |
| US8013138B1 (en) | 1998-11-12 | 2011-09-06 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. | Chimeric promoters capable of mediating gene expression in plants upon pathogen infection and uses thereof |
| JP2003524389A (ja) | 1998-12-16 | 2003-08-19 | カイロン コーポレイション | ヒトサイクリン依存的キナーゼ（ｈＰＮＱＡＬＲＥ） |
| US6271359B1 (en) | 1999-04-14 | 2001-08-07 | Musc Foundation For Research Development | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes |
| JP2002541822A (ja) | 1999-04-14 | 2002-12-10 | エム ユー エス シー ファンデーション フォー リサーチ ディベロップメント | 組織特異的および病原体特異的毒性物質ならびにリボザイム |
| AUPQ005299A0 (en) | 1999-04-29 | 1999-05-27 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Novel genes encoding wheat starch synthases and uses therefor |
| DK1196024T3 (da) | 1999-07-20 | 2006-02-13 | Gvs Ges F R Erwerb Und Verwert | Hidtil ukendt Fremgangsmåde til generering og selektion af transgene horfro/horplanter |
| US6423885B1 (en) | 1999-08-13 | 2002-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) | Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells |
| EP2364734B1 (en) | 2000-07-21 | 2017-09-06 | ReVance Therapeutics, Inc. | Multi-component biological transport systems |
| DK1331845T3 (da) | 2000-11-09 | 2012-04-23 | Commw Scient Ind Res Org | Byg med reduceret SSII-aktivitet og stivelsesholdige produkter med et reduceret indhold af amylopectin |
| ITMI20011364A1 (it) * | 2001-06-28 | 2002-12-28 | Metapontum Agrobios S C R L | Robozima hammerhead specifico per la stearoyl-acp desaturesi di piante oleaginose differenti |
| ES2358187T3 (es) | 2001-07-10 | 2011-05-06 | JOHNSON & JOHNSON RESEARCH PTY LIMITED | Procedimientos para la modificación genética de las células progenitoras hematopoyéticas y utilizaciones de las células modificadas. |
| DK1414996T3 (da) | 2001-07-10 | 2011-03-21 | Johnson & Johnson Res Pty Ltd | Fremgangsmåder til genetisk modifikation af hæmatopoetiske progenitorceller og anvendelser af modificerede celler |
| US8022272B2 (en) | 2001-07-13 | 2011-09-20 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids |
| FR2829136B1 (fr) | 2001-08-29 | 2006-11-17 | Aventis Pharma Sa | Derives lipidiques d'aminoglycosides |
| US7456335B2 (en) | 2001-09-03 | 2008-11-25 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences and their use in methods for achieving pathogen resistance in plants |
| EP1427856B1 (en) | 2001-09-18 | 2011-05-11 | Carnegie Institution Of Washington | Fusion proteins useful for detecting analytes |
| AU2002359761A1 (en) | 2001-12-18 | 2003-06-30 | Invenux, Inc. | Antibiotic compounds |
| WO2003067286A2 (en) | 2002-02-07 | 2003-08-14 | Covalent Partners, Llc | Nanofilm and membrane compositions |
| US20040005546A1 (en) | 2002-02-28 | 2004-01-08 | Oncolytics Biotech Inc. | Use of ribozymes in the detection of adventitious agents |
| DE10212892A1 (de) | 2002-03-20 | 2003-10-09 | Basf Plant Science Gmbh | Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression |
| EP1365034A3 (en) | 2002-05-21 | 2004-02-18 | Bayer HealthCare AG | Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of malignant neoplasia |
| CA2542171C (en) | 2002-06-26 | 2015-12-15 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Modulators and modulation of the interaction between rgm and neogenin |
| ATE405658T1 (de) | 2002-07-26 | 2008-09-15 | Basf Plant Science Gmbh | Neue selektionsverfahren |
| DE60334246D1 (de) | 2002-11-21 | 2010-10-28 | Celltech R & D Inc | Modulieren von immunantworten |
| US7714186B2 (en) | 2002-12-19 | 2010-05-11 | Bayer Cropscience Ag | Plant cells and plants which synthesize a starch with an increased final viscosity |
| ES2541134T3 (es) | 2003-05-12 | 2015-07-16 | Helion Biotech Aps | Anticuerpos de MASP-2 |
| NZ544439A (en) | 2003-06-30 | 2009-11-27 | Limagrain Cereales Ingredients | Wheat with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products derived therefrom |
| EP1892306A3 (en) | 2003-10-06 | 2008-06-11 | Bayer HealthCare AG | Methods and kits for investigating cancer |
| EP1602926A1 (en) | 2004-06-04 | 2005-12-07 | University of Geneva | Novel means and methods for the treatment of hearing loss and phantom hearing |
| US7604947B2 (en) | 2004-06-09 | 2009-10-20 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection and modulation of cancer stem cells |
| US8840893B2 (en) | 2004-06-10 | 2014-09-23 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
| PL2465534T3 (pl) | 2004-06-10 | 2017-08-31 | Omeros Corporation | Sposoby leczenia stanów związanych z aktywacją dopełniacza zależną od masp-2 |
| US7919094B2 (en) | 2004-06-10 | 2011-04-05 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
| US8951522B2 (en) | 2011-04-08 | 2015-02-10 | University Of Leicester | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
| AU2005261871B2 (en) | 2004-07-08 | 2011-05-26 | Dlf Seeds A/S | Means and methods for controlling flowering in plants |
| AU2005268917B2 (en) | 2004-08-02 | 2010-05-20 | Basf Plant Science Gmbh | Method for isolation of transcription termination sequences |
| CA2579927A1 (en) | 2004-09-24 | 2006-03-30 | Basf Plant Science Gmbh | Plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress |
| JP5638736B2 (ja) | 2004-12-30 | 2014-12-10 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション | 腸の健康を改善する方法および手段 |
| EP1707632A1 (de) | 2005-04-01 | 2006-10-04 | Bayer CropScience GmbH | Phosphorylierte waxy-Kartoffelstärke |
| US8906864B2 (en) | 2005-09-30 | 2014-12-09 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (RGM) protein family and functional fragments thereof, and their use |
| US8362323B2 (en) | 2005-11-08 | 2013-01-29 | Basf Plant Science Gmbh | Use of armadillo repeat (ARM1) polynucleotides for obtaining pathogen resistance in plants |
| EP1979484B1 (en) | 2006-01-12 | 2014-03-19 | BASF Plant Science GmbH | Use of stomatin (stm1) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants |
| CA2644273A1 (en) | 2006-04-05 | 2008-03-27 | Metanomics Gmbh | Process for the production of a fine chemical |
| EP2030021B1 (en) | 2006-05-18 | 2012-11-21 | Andreas Reichert | Method for diagnosing mitochondrial dysfunction |
| US8383597B2 (en) | 2006-05-25 | 2013-02-26 | Cornell Research Foundation, Inc. | G proteins in tumor growth and angiogenesis |
| EP2066817B1 (en) | 2006-10-06 | 2014-07-30 | SpeeDx Pty Ltd | Molecular switches and methods for their use |
| EP2202314B1 (en) | 2007-01-15 | 2014-03-12 | BASF Plant Science GmbH | Use of subtilisin (RNR9) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants |
| CN101631868B (zh) | 2007-02-16 | 2016-02-10 | 巴斯福植物科学有限公司 | 用于在单子叶植物中调节胚特异性表达的核酸序列 |
| WO2008119057A2 (en) | 2007-03-27 | 2008-10-02 | Omeros Corporation | The use of pde7 inhibitors for the treatment of movement disorders |
| BRPI0811843A2 (pt) | 2007-05-22 | 2014-10-07 | Basf Plant Science Gmbh | Métodos para a produção de uma planta transgênica, e para seleção de antagonistas, molécula, iniciador, mutante dominante negativo de um polipeptídeo, construto de ácido nucleico, vetor, célula de planta transgênica, planta ou uma parte da mesma, polipeptídeo isolado, anticorpo, tecido de planta, planta, material de planta colhido ou material de propagação de uma planta, processos para a produção de um polipeptídeo, e para a identificação de um composto, composição, e, uso da molécula de ácido nucleico, do construto de ácido nucleico e do vetor |
| CL2008002775A1 (es) | 2007-09-17 | 2008-11-07 | Amgen Inc | Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea. |
| EP2040075A1 (en) | 2007-09-24 | 2009-03-25 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Compounds and markers for surface-enhanced raman scattering |
| EP2628486A3 (en) | 2007-12-14 | 2013-10-30 | Amgen, Inc. | Method for treating bone fracture with anti-sclerostin antibodies |
| DE112008003433T5 (de) | 2007-12-21 | 2010-11-04 | Basf Plant Science Gmbh | Pflanzen mit erhöhtem Ertrag (KO NUE) |
| US8962803B2 (en) | 2008-02-29 | 2015-02-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Antibodies against the RGM A protein and uses thereof |
| EP2100962A1 (en) | 2008-03-12 | 2009-09-16 | Biogemma | Plants having improved resistance to pathogens |
| US10517839B2 (en) | 2008-06-09 | 2019-12-31 | Cornell University | Mast cell inhibition in diseases of the retina and vitreous |
| US8790664B2 (en) | 2008-09-05 | 2014-07-29 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Multimodular assembly useful for intracellular delivery |
| EP2184351A1 (en) | 2008-10-30 | 2010-05-12 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Polynucleotides encoding caryophyllene synthase and uses thereof |
| ES2363358B1 (es) | 2009-04-03 | 2012-06-21 | FUNDACIÓ INSTITUT DE RECERCA HOSPITAL UNIVERSITARI VALL D'HEBRON (Titular al | Agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades asociadas con una proliferación celular indeseable. |
| DE112010003162T5 (de) | 2009-04-22 | 2012-08-16 | Basf Plant Science Company Gmbh | Gesamtsamen-spezifischer Promotor |
| US20130012709A1 (en) | 2009-09-10 | 2013-01-10 | Centre National De La Recherche Scientifique | NOVEL INHIBITORS OF STEAROYL-CoA-DESATURASE-1 AND THEIR USES |
| EP2305285A1 (en) | 2009-09-29 | 2011-04-06 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Means and methods for treating ischemic conditions |
| AU2010306581B2 (en) | 2009-10-16 | 2015-03-19 | Omeros Corporation | Methods for treating disseminated intravascular coagulation by inhibiting MASP-2 dependent complement activation |
| DK2493871T3 (da) | 2009-10-30 | 2014-11-10 | Prestwick Chemical Sas | Nye oximderivater samt deres anvendelse som allosteriske modulatorer af metabotropiske glutamatreceptorer |
| EP2322149A1 (en) | 2009-11-03 | 2011-05-18 | Universidad del Pais Vasco | Methods and compositions for the treatment of ischemia |
| MX2012006560A (es) | 2009-12-08 | 2012-10-05 | Abbott Gmbh & Co Kg | Anticuerpos monoclonales contra la proteina rgm a para utilizarse en el tratamiento de degeneracion de capa de fibra de nervio retinal. |
| EP2338492A1 (en) | 2009-12-24 | 2011-06-29 | Universidad del Pais Vasco | Methods and compositions for the treatment of alzheimer |
| US8476485B2 (en) | 2010-06-24 | 2013-07-02 | Academia Sinica | Non-human animal model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) with loss-of-TDP-43 function |
| US9220715B2 (en) | 2010-11-08 | 2015-12-29 | Omeros Corporation | Treatment of addiction and impulse-control disorders using PDE7 inhibitors |
| KR20160105948A (ko) | 2010-11-08 | 2016-09-07 | 오메로스 코포레이션 | Pde7 억제제를 사용한 중독 및 충동-조절 장애의 치료 |
| US9644035B2 (en) | 2011-04-08 | 2017-05-09 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
| EP2734621B1 (en) | 2011-07-22 | 2019-09-04 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| US20150017091A1 (en) | 2011-08-18 | 2015-01-15 | Cornell University | Detection and treatment of metastatic disease |
| WO2013039880A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Biomarkers and therapeutic targets of hepatocellular cancer |
| WO2013090814A2 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-20 | Board Of Trustees Of Michigan State University | p-Coumaroyl-CoA:Monolignol Transferase |
| PE20190907A1 (es) | 2012-01-27 | 2019-06-26 | AbbVie Deutschland GmbH and Co KG | Composicion y metodo para el diagnostico y el tratamiento de las enfermedades asociadas a la degeneracion de las neuritas |
| WO2013138456A1 (en) | 2012-03-14 | 2013-09-19 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Lim kinasemodulating agents for neurofibromatoses therapy and methods for screening for same |
| EP2666775A1 (en) | 2012-05-21 | 2013-11-27 | Domain Therapeutics | Substituted pyrazoloquinazolinones and pyrroloquinazolinones as allosteric modulators of group II metabotropic glutamate receptors |
| WO2014127835A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-08-28 | Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel | Plant-derived resistance gene |
| US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
| US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
| US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
| LT3057993T (lt) | 2013-10-17 | 2020-11-25 | Omeros Corporation | Gydymo būdai būklių, susijusių su nuo masp-2 priklausomu komplemento aktyvinimu |
| US20150165054A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting caspase-9 point mutations |
| CA2933909C (en) | 2013-12-18 | 2024-07-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids |
| EP3160482A4 (en) | 2014-06-27 | 2018-02-14 | Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation | Lipid comprising docosapentaenoic acid |
| CA2956224A1 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| EP3000814A1 (en) | 2014-09-26 | 2016-03-30 | Domain Therapeutics | Substituted pyrazoloquinazolinones and pyrroloquinazolinones as allosteric modulators of group II metabotropic glutamate receptors |
| EP4434589A3 (en) | 2015-10-23 | 2025-05-14 | President and Fellows of Harvard College | Evolved cas9 proteins for gene editing |
| US20170137537A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | Omeros Corporation | Methods for Treating Conditions Associated with MASP-2 Dependent Complement Activation |
| CA3010593C (en) | 2016-01-05 | 2024-02-13 | University Of Leicester | Methods for inhibiting fibrosis in a subject in need thereof |
| CN109152834A (zh) | 2016-03-31 | 2019-01-04 | 奥默罗斯公司 | 抑制有需要的受试者的血管发生的方法 |
| EA201892624A1 (ru) | 2016-05-26 | 2019-06-28 | Нунхемс Б.В. | Растения, дающие бессемянные плоды |
| JP7231935B2 (ja) | 2016-08-03 | 2023-03-08 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | アデノシン核酸塩基編集因子およびそれらの使用 |
| US11661590B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
| FI3565891T3 (fi) | 2017-01-09 | 2023-07-04 | Whitehead Inst Biomedical Res | Menetelmiä geeniekspression muuttamiseksi häiritsemällä säätelysilmukoita muodostavia transkriptiotekijämultimeerejä |
| US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| CN110662556A (zh) | 2017-03-09 | 2020-01-07 | 哈佛大学的校长及成员们 | 癌症疫苗 |
| JP2020510439A (ja) | 2017-03-10 | 2020-04-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | シトシンからグアニンへの塩基編集因子 |
| US10883089B2 (en) | 2017-04-04 | 2021-01-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Feruloyl-CoA:monolignol transferases |
| US10883090B2 (en) | 2017-04-18 | 2021-01-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | P-coumaroyl-CoA:monolignol transferases |
| EP3655015B1 (en) | 2017-07-17 | 2024-02-21 | The Regents of the University of Colorado | Compositions and methods for preventing and treating radiation-induced bystander effects caused by radiation or radiotherapy |
| US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
| TWI818919B (zh) | 2017-08-15 | 2023-10-21 | 美商歐米諾斯公司 | 用於治療和／ 或預防與造血幹細胞移植有關的移植物抗宿主病和／ 或瀰漫性肺泡出血和／ 或靜脈閉塞性病的方法 |
| WO2019139645A2 (en) | 2017-08-30 | 2019-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| KR20200121782A (ko) | 2017-10-16 | 2020-10-26 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 아데노신 염기 편집제의 용도 |
| US12406749B2 (en) | 2017-12-15 | 2025-09-02 | The Broad Institute, Inc. | Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering |
| US12157760B2 (en) | 2018-05-23 | 2024-12-03 | The Broad Institute, Inc. | Base editors and uses thereof |
| KR20210016545A (ko) | 2018-05-29 | 2021-02-16 | 오메로스 코포레이션 | Masp-2 억제제 및 사용 방법 |
| US11584714B2 (en) | 2018-05-29 | 2023-02-21 | Omeros Corporation | MASP-2 inhibitors and methods of use |
| EP3806619A1 (en) | 2018-06-15 | 2021-04-21 | Nunhems B.V. | Seedless watermelon plants comprising modifications in an abc transporter gene |
| US12522807B2 (en) | 2018-07-09 | 2026-01-13 | The Broad Institute, Inc. | RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof |
| WO2020092453A1 (en) | 2018-10-29 | 2020-05-07 | The Broad Institute, Inc. | Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof |
| US11981904B2 (en) | 2018-11-09 | 2024-05-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation | BAHD acyltransferases |
| WO2020154500A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-07-30 | The Broad Institute, Inc. | Supernegatively charged proteins and uses thereof |
| MX2021011426A (es) | 2019-03-19 | 2022-03-11 | Broad Inst Inc | Metodos y composiciones para editar secuencias de nucleótidos. |
| WO2020214842A1 (en) | 2019-04-17 | 2020-10-22 | The Broad Institute, Inc. | Adenine base editors with reduced off-target effects |
| US12435330B2 (en) | 2019-10-10 | 2025-10-07 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing RNA |
| WO2021113686A1 (en) | 2019-12-04 | 2021-06-10 | Omeros Corporation | Masp-2 inhibitors and methods of use |
| EP4069676A1 (en) | 2019-12-04 | 2022-10-12 | Omeros Corporation | Masp-2 inhibitors and methods of use |
| WO2021113682A1 (en) | 2019-12-04 | 2021-06-10 | Omeros Corporation | Masp-2 inhibitors and methods of use |
| TWI867422B (zh) | 2020-03-06 | 2024-12-21 | 美商奥默羅斯公司 | 用於治療和/或預防流感病毒誘導的急性呼吸窘迫症候群、肺炎或者流感病毒感染的一些其它肺部表現的抑制masp-2的方法 |
| WO2021226558A1 (en) | 2020-05-08 | 2021-11-11 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
| US20240011030A1 (en) | 2020-08-10 | 2024-01-11 | Novartis Ag | Treatments for retinal degenerative diseases |
| CN119768172A (zh) | 2022-08-18 | 2025-04-04 | 米托迪治愈有限责任公司 | 具有磷酸二酯酶-7抑制活性的治疗剂在治疗和预防与慢性疲劳、衰竭和/或劳累不耐受有关的疾病中的用途 |
| WO2024042160A1 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-29 | Mitodicure Gmbh | Use of a therapeutic agent with sodium-hydrogen antiporter 1 inhibitory activity for the treatment and prevention of diseases associated with chronic fatigue, exhaustion and/or exertional intolerance |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4987071A (en) * | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
| US5116742A (en) * | 1986-12-03 | 1992-05-26 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods |
| DE3642623A1 (de) * | 1986-12-13 | 1988-06-23 | Burbach & Bender Ohg | Gasspuelstein fuer metallurgische gefaesse |
| DE3939771A1 (de) * | 1989-12-01 | 1991-06-06 | Behringwerke Ag | Verfahren zur biologischen inaktivierung von nukleinsaeuren |
-
1988
- 1988-12-14 AT AT88311816T patent/ATE115999T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-12-14 MC MC882115D patent/MC2115A1/xx unknown
- 1988-12-14 AR AR88312737A patent/AR243935A1/es active
- 1988-12-14 ES ES88311816T patent/ES2065919T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-14 CA CA000585845A patent/CA1340831C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-14 HU HU89382A patent/HUT54407A/hu unknown
- 1988-12-14 EP EP88311816A patent/EP0321201B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-14 KR KR1019890701528A patent/KR970010758B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-14 EP EP94107862A patent/EP0640688A1/en not_active Withdrawn
- 1988-12-14 WO PCT/AU1988/000478 patent/WO1989005852A1/en not_active Ceased
- 1988-12-14 AU AU28007/89A patent/AU632993B2/en not_active Expired
- 1988-12-14 RO RO145344A patent/RO114469B1/ro unknown
- 1988-12-14 DE DE3852539T patent/DE3852539T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-14 JP JP1500279A patent/JP3046318B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-14 NZ NZ227332A patent/NZ227332A/xx unknown
- 1988-12-15 CN CN88108572A patent/CN1102174C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-06-12 FI FI902923A patent/FI104562B/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-06-12 DK DK199001433A patent/DK175956B1/da not_active IP Right Cessation
- 1990-06-14 NO NO902661A patent/NO308610B1/no unknown
-
1995
- 1995-03-13 GR GR940403895T patent/GR3015374T3/el unknown
- 1995-06-22 HU HU95P/P00362P patent/HU211891A9/hu unknown
-
2000
- 2000-01-25 NO NO20000369A patent/NO312105B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RO114469B1 (ro) | Compus oligoribonucleotidic, procedeu de preparare si metoda de inactivare | |
| US6127114A (en) | Ribozymes | |
| US5543508A (en) | Ribozymes | |
| JP7074827B2 (ja) | 遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ | |
| JP7306696B2 (ja) | Ｒｎａ誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法 | |
| US5998193A (en) | Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof | |
| AU2017335890B2 (en) | RNA-guided nucleic acid modifying enzymes and methods of use thereof | |
| Steinecke et al. | Expression of a chimeric ribozyme gene results in endonucleolytic cleavage of target mRNA and a concomitant reduction of gene expression in vivo. | |
| AU2016359629A1 (en) | Tracking and manipulating cellular RNA via nuclear delivery of CRISPR/Cas9 | |
| JPH1052264A (ja) | Ｎ‐ｒａｓ発現阻害剤およびその方法 | |
| RU2144080C1 (ru) | Рибозим, способ инактивации рнк-мишени, способ получения рибозима | |
| Tewari | Replication of plant organelle DNA | |
| IL88683A (en) | Ribozymes their production and pharmaceutical compositions containing them | |
| BG51160A3 (bg) | Метод за получаване на рибозоми | |
| WO1997043404A2 (en) | Ribozyme variants with improved catalytic activity under low magnesium conditions | |
| US20020155454A1 (en) | Miniribozymes active at low magnesium ion concentrations | |
| KR20010074634A (ko) | 외인성 디엔에이에 텔로미어 반복단위의 생체내 부가에의한 진균류 페스탈로티옵시스에서의 염색체외 디엔에이의생성 방법 | |
| KR20010083085A (ko) | 진균류 페스탈로티옵시스에서의 염색체외 디엔에이의생성에 의한 탁솔 생산방법 |