DE112008003433T5

DE112008003433T5 - Pflanzen mit erhöhtem Ertrag (KO NUE)

Info

Publication number: DE112008003433T5
Application number: DE112008003433T
Authority: DE
Inventors: Piotr Dr. Puzio; Oliver Dr. BLÄSING; Oliver Dr. THIMM
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2010-11-04
Also published as: US20100293665A1; CA2708499A1; AR069894A1; BRPI0821009A2; EP2240587A2; WO2009080743A2; WO2009080743A3; CN101952444A; AU2008340002A1

Abstract

Verfahren zur Erhöhung des Ertrags einer Pflanze im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyp-Pflanze, welches das Verringern von einer oder mehreren Aktivitäten, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und die SET-Domäne enthaltendem Protein besteht, in der Pflanze oder einem Teil davon umfasst.

Description

Diese Erfindung betrifft allgemein transformierte Pflanzenzellen und Pflanzen oder Teile davon, die ein inaktiviertes oder herunterreguliertes Gen umfassen, was zu einem erhöhten Ertrag, insbesondere einem mit erhöhtem Ertrag zusammenhängenden Merkmal bzw. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer erhöhten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion, verglichen mit, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Zellen, führt, sowie Verfahren zur Herstellung solcher Pflanzenzellen oder Pflanzen oder Teile davon.
Insbesondere betrifft diese Erfindung Pflanzen, die für das Wachstum unter Bedingungen eines Stickstoffmangels maßgeschneidert bzw. speziell angepasst sind, und/oder Pflanzenzellen und/oder Teile von Pflanzen, die einen erhöhten Ertrag zeigen, wenn sie unter Nicht-Stickstoffmangel-Bedingungen wachsen gelassen werden.
Die Erfindung befasst sich auch mit Verfahren zur Herstellung und zum Screening und zur Züchtung von solchen Pflanzenzellen, Pflanzen oder Teilen davon, insbesondere Pflanzen.
Agrarbiotechnologen verwenden auch Messungen anderer Parameter, die ein Indiz für die potentielle Auswirkung eines Transgens auf den Ernteertrag sind. Für Viehfutternutzpflanzen, wie Alfalfa bzw. Luzerne, Silagemais und Heu, korreliert die pflanzliche Biomasse mit dem Gesamtertrag. Für Korn- bzw. Getreidenutzpflanzen sind jedoch andere Parameter zur Bewertung des Ertrags, wie Pflanzengröße, angewandt worden, wie durch das Gesamtpflanzentrockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stängelvolumen, die Pflanzenhöhe, den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl gemessen. Die Pflanzengröße in einem frühen Entwicklungsstadium korreliert typischerweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann typischerweise mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze und erreicht daher wahrscheinlich ein größeres Gewicht während des gleichen Zeitraums. Es gibt eine starke genetische Komponente der Pflanzengröße und der Wachstumsrate, und daher korreliert für eine Auswahl diverser Genotypen die Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung wahrscheinlich mit der Größe unter einer anderen. Auf diese Weise wird eine Standardumgebung verwendet, um die verschiedenen und dynamischen Umgebungen anzunähern, die an unterschiedlichen Orten und zu unterschiedlichen Zeiten von den Nutz pflanzen auf dem Feld angetroffen werden. Einige Gene, die an Stressreaktionen, der Wassernutzung und/oder der Biomasse bei Pflanzen beteiligt sind, sind charakterisiert worden, doch bislang war der Erfolg der Entwicklung von transgenen Nutzpflanzen mit verbessertem Ertrag begrenzt und es sind keine derartigen Pflanzen kommerzialisiert worden. Aus diesem Grund besteht ein Bedarf an der Identifizierung weiterer Gene, die die Fähigkeit besitzen, den Ertrag von Nutzpflanzen zu steigern.
Die Pflanzenernährung ist für das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen und damit auch für die Menge und Qualität von Pflanzenprodukten von wesentlicher Bedeutung. Wegen des starken Einflusses der Effizienz der Nährstoffaufnahme sowie der Nährstoffverwertung auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität wird eine riesige Menge an Dünger auf Böden verteilt, um Pflanzenwachstum und -qualität zu optimieren.
Das Pflanzenwachstum ist hauptsächlich durch drei Nährstoffe begrenzt – Phosphor, Kalium und Stickstoff. Aus diesem Grund ist Stickstoff (N) eines der Hauptnährstoffelemente, die für das Pflanzenwachstum erforderlich sind, welcher in der Regel das die Geschwindigkeit beschränkende Element beim Pflanzenwachstum ist. Stickstoff ist ein Teil zahlreicher wichtiger Verbindungen, die in lebenden Zellen zu finden sind, wie Aminosäuren, Proteinen (z. B. Enzymen), Nukleinsäuren und Chlorophyll. Stickstoff macht 1,5% bis 2% der pflanzlichen Trockenmasse und ungefähr 16% des Gesamt-Pflanzenproteins aus. Somit hat die Verfügbarkeit von Stickstoff eine wesentliche Auswirkung auf die Aminosäuresynthese sowie die Aminosäurezusammensetzung, die Akkumulation von Aminosäuren, auf die Proteinsynthese und -akkumulation und ist darauf basierend ein bedeutender einschränkender Faktor für Pflanzenwachstum und -ertrag (Frinck, C. R., Proc. Natl. Sci. USA, 96, 1175 (1999)).
Wegen des hohen Stickstoffbedarfs für Nutzpflanzen ist die Stickstoffdüngung weltweit eine bedeutende Agrarinvestition mit 80 Millionen metrischen Tonnen an Stickstoffdüngern (wie Nitrat und/oder Ammonium), die jährlich ausgebracht werden (Frink, C. R., Proc. Natl. Acad Sci. USA 96, 1175 (1999)). Es gibt auch negative Konsequenzen für die Umwelt bei einem extensiven Einsatz von stickstoffhaltigen Düngern in der Nutzpflanzenproduktion, da die Nutzpflanzen nur etwa zwei Drittel des ausgebrachten Stickstoffs zurückbehalten. Daher folgen auf einen hohen Düngemitteleintrag große Abgaben durch Auswaschen, gasförmige Verluste und Entfernung der Nutzpflanzen. Der nicht absorbierte Stickstoff kann anschließend in den Erdboden ausgewaschen werden und die Wasservorrate kontaminieren (Frink C. R., Proc. Natl. Acad Sci. USA 96, 1175 (1999)). Aufgrund der hohen Auswaschverluste von Stickstoff aus landwirtschaftlichen Ökosystemen zum Oberflächenwasser und Grundwasser ist Stickstoff auch als ein Schadstoff anerkannt. Die Stickstoffauswaschung, das heißt als Nitrat aus Agrarland, beeinträchtigt die Trinkwasserqualität und bewirkt die Eutrophierung von Seen und Küstenbereichen. Der ausgiebige Einsatz von stickstoffhaltigen Düngemitteln kann ferner zu einer letztendlichen Verschlechterung der Erdbodenqualität, zu Umweltverschmutzung und zu Gesundheitsrisiken führen.
Wegen der hohen Kosten von Stickstoffdünger im Verhältnis zu den Einkünften für landwirtschaftliche Produkte und außerdem wegen dessen schädlicher Auswirkung auf die Umwelt ist es wünschenswert, Strategien zu entwickeln, um den Stickstoffeintrag zu reduzieren und/oder die Stickstoffaufnahme und/oder -verwertung einer bestimmten Stickstoffverfügbarkeit zu optimieren unter gleichzeitiger Beibehaltung der optimalen Ausbeute, Produktivität und Qualität von photosynthetischen aktiven Organismen, vorzugsweise von Kulturpflanzen, z. B. Nutzpflanzen. Es ist ebenfalls wünschenswert, einen ”bereits existierenden” Ertrag von Nutzpflanzen mit niedrigerem Düngereinsatz und/oder einem höheren Ertrag auf Böden von ähnlicher oder sogar schlechterer Qualität zu erzielen.
Ammonium-Aufnahmesysteme sind in verschiedenen Organismen, einschließlich Hefe und Pflanzen, charakterisiert worden. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae enthält drei MEP-Gene für Ammoniumtransporter, die alle durch Stickstoff reguliert werden und die in Gegenwart einer Stickstoffquelle, die leicht metabolisiert wird, wie NH₄ ⁺, unterdrückt werden (Marini et al., Mol. Cell. Biol. 17, 4282 (1997)). Pflanzengene, die Ammoniumtransportsysteme codieren, sind durch die Komplementation einer Hefemutante, Homologie-Suchen in Datenbanken und heterologe Hybridisierungen kloniert worden (von Wiren, N., et al., Curr. Opin. Plant Biol., 3, 254 (2000)). Experimentelle Nachweise der physiologischen Funktion von NH₄ ⁺-Transportern beruhen hauptsächlich auf Korrelationen zwischen der Ammoniumtransporter-Expression und dem Eintrag von markiertem Ammonium. Die Situation wird durch die Tatsache kompliziert, dass in Arabidopsis, aber auch in anderen Pflanzen, Ammoniumtransporter in Genfamilien vorliegen, deren Mitglieder unterschiedliche Expressionsmuster und physiologische Charakteristika aufweisen. Die DE 43 37 597 beansprucht zwar Sequenzen für pflanzliche Ammoniumtransporter und deren Verwendung für die Manipulation des Stickstoffmetabolismus und des Pflanzenwachstums unter bestimmten Bedingungen, doch es fehlt jeglicher Beweis für positive Auswirkungen auf die Stickstoffassimilation oder das Pflanzenwachstum unter bestimmten Bedingungen mittels ektopischer Expression der pflanzlichen Ammoniumtransporter. Aus diesem Grund sind Literaturnachweise für die gentechnologische Veränderung der Stickstoffassimilation in Pflanzen immer noch auf wenige Fälle beschränkt, wobei Transporter nicht eingeschlossen sind.
Allerdings besteht immer noch ein Bedarf an photosynthetischen aktiven Organismen, besonders Pflanzen, mit erhöhtem Ertrag, insbesondere einer mit einem erhöhten Ertrag zusammenhängenden Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie Pflanzen, die in der Lage sind, Stickstoff effizienter zu nutzen, so dass weniger Stickstoff für den gleichen Ertrag erforderlich ist oder höhere Erträge bei den derzeitigen Ausmaßen der Stickstoffanwendung erzielt werden können. Außerdem besteht immer noch Bedarf an einem photosynthetischen aktiven Organismus, insbesondere Pflanzen, die eine Zunahme der Biomasse zeigen.
Folglich ist es ein Ziel dieser Erfindung, ein kostengünstiges Verfahren für die Herstellung von photosynthetischen aktiven Organismen, besonders Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, zu entwickeln, wie etwa Pflanzen, die in der Lage sind, Stickstoff effizienter zu nutzen, so dass weniger Stickstoff für den gleichen Ertrag erforderlich ist oder höhere Erträge bei den derzeitigen Ausmaßen der Stickstoffverwendung erzielt werden können. Zum Beispiel kommt es bei dem Verfahren der Erfindung in einem photosynthetischen aktiven Organismus zu einer/einem erhöhten Stickstoffaufnahme und/oder -transport und/oder -assimilation und/oder -verwertung, welche sich allein oder gemeinsam in einer erhöhten Stickstoffnutzungseffizienz bzw. Stickstoffverwertungseffizienz (NUE) und/oder einem Verfahren für eine erhöhte Biomasseproduktion und/oder -ausbeute, zum Beispiel unter Bedingungen einer begrenzten Stickstoffversorgung, widerspiegeln.
Es wurde herausgefunden, dass dieses Ziel durch Bereitstellen eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wie hierin beschrieben erreicht wird.
Es ist weiter ein Ziel dieser Erfindung, Pflanzenzellen und/oder Pflanzen bereitzustellen, die einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine erhöhte NUE, zeigen und/oder unter Bedingungen einer begrenzten Stickstoffversorgung eine Erhöhung in Biomasseproduktion und/oder -ertrag im Vergleich mit einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle und/oder -Pflanze aufzeigen.
Es wurde herausgefunden, dass dieses Ziel durch Bereitstellen von Pflanzenzellen und/oder Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung wie hierin beschrieben erreicht wird.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich mit einer entsprechenden Wildttyp-Pflanze bereit, welches zumindest den folgenden Schritt umfasst: Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren von einer oder mehreren Aktivitäten, die gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendem Protein (im Folgenden als ”Aktivität”, z. B. als ”die Aktivität” bezeichnet) in dem hierin angegebenen subzellulären Kompartiment und Gewebe.
Demgemäß stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform das Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren, in einer transgenen Pflanze, eines isolierten Polynukleotids, wie in Tabelle I identifiziert, in dem hierin angegebenen subzellulären Kompartiment und Gewebe bereit. Die transgene Pflanze der Erfindung zeigt einen verbesserten Ertrag oder erhöhten Ertrag im Vergleich mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze. Die Ausdrücke ”verbessert” oder ”erhöht” oder ”gesteigert” können beliebig austauschbar verwendet werden.
Der Ausdruck ”Ertrag”, wie hierin verwendet, bezieht sich allgemein auf einen messbaren Gewinn aus einer Pflanze, insbesondere einer Nutzpflanze. Der Ertrag und der Ertragszuwachs (im Vergleich zu einer nicht-transformierten Ausgangspflanze oder Wildtyp-Pflanze) können auf eine Reihe von Wegen gemessen werden, und es versteht sich, dass eine Fachperson in der Lage ist, die korrekte Bedeutung hinsichtlich der speziellen Ausführungsformen, der jeweils betroffenen Nutzpflanze und des betreffenden spezifischen Zwecks oder Anwendungsziels anzuwenden.
Für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung bezieht sich ein gesteigerter oder erhöhter ”Ertrag” auf einen oder mehrere Ertragsparameter, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus dem Biomasseertrag, dem Trockenbiomasseertrag, dem oberirdischen Trockenbiomasseertrag, dem unterirdischen Trockenbiomasseertrag; dem Frischgewichtbiomasseertrag, dem oberirdischen Frischgewichtbiomasseertrag, dem unterirdischen Frischgewichtbiomasseertrag, dem gesteigerten Ertrag von erntefähigen Teilen, entweder Trocken- oder Frischgewicht oder beiden, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beidem; dem gesteigerten Ertrag von Nutzpflanzenfrüchten, entweder Trocken- oder Frischgewicht oder beidem, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beidem; und vorzugsweise dem gesteigerten Ertrag an Samen, entweder Trocken- oder Frischgewicht oder beidem, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beidem, besteht.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck ”verbesserter Ertrag” oder der Ausdruck ”erhöhter Ertrag” jegliche Verbesserung beim Etrag von jeglichem gemessenen Pflanzenprodukt, wie Korn, Frucht oder Fasern. Gemäß der Erfindung können Veränderungen bei verschiedenen phänotypischen Merkmalen den Ertrag verbessern. Zum Beispiel sind, und zwar ohne Einschränkung, Parameter, wie die Entwicklung der Blütenorgane, die Wurzelinitiation, Wurzelbiomasse, Samenzahl, Samengewicht, Ernteindex, Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, Blattbildung, Phototropismus, Apikaldominanz und Fruchtentwicklung, geeignete Messungen eines verbesserten Ertrags. Jede Erhöhung des Ertrags ist ein verbesserter Ertrag gemäß der Erfindung. Zum Beispiel kann die Verbesserung hinsichtlich des Ertrags eine um 0,1%, 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder größere Erhöhung bei jedem gemessenen Parameter umfassen. Zum Beispiel ist eine Erhöhung des ”bu/acre”-Ertrags von Sojabohnen oder Mais, die von einer Nutzpflanze abgeleitet sind, welche Pflanzen umfasst, welche für die Nukleotide und Polypeptide von Tabelle I transgen sind, im Vergleich mit dem ”bu/acre”-Ertrag von unbehandelten Sojabohnen oder Mais, die unter den gleichen Bedingungen kultiviert wurden, ein verbesserter Ertrag gemäß der Erfindung. Der erhöhte oder verbesserte Ertrag kann in Abwesenheit oder Gegenwart von Stressbedingungen erzielt werden.
Zum Beispiel stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen bereit, welche eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft zeigen können, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder Biomasseproduktion im Vergleich zu einem entsprechenden (z. B. nicht-transformierten) Wildtyp oder einer Ausgangspflanze durch Erhöhen oder Hervorrufen von einer oder mehreren der oben genannten Aktivitäten.
In einer Ausführungsform bezieht sich eine Erhöhung des Ertrags auf einen erhöhten oder verbesserten Nutzpflanzenertrag oder erntefähigen Ertrag.
Der Nutzpflanzenertrag ist hierin als die Anzahl an ”Bushels” (bzw. Einheiten je 35,2 Liter) eines relevanten Agrarprodukts (wie Korn bzw. Getreide, Viehfutter oder Samen), die pro Morgen bzw. ”acre” geerntet werden, definiert. Der Nutzpflanzenertrag wird von abiotischen Stressformen, wie Dürre, Hitze, Salzgehalt und Kältestress, und durch die Größe (Biomasse) der Pflanze beeinflusst. Traditionelle Pflanzenzuchtstrategien sind relativ langsam und waren im Allgemeinen nicht erfolgreich, was die Verleihung einer erhöhten Toleranz gegenüber abiotischem Stress angeht. Verbesserungen des Korn- bzw. Getreideertrags durch herkömmliche Züchtung haben bei Mais nahezu ein Plateau erreicht.
Folglich kann der Ertrag einer Pflanze in jedem speziellen Fall von der spezifischen Pflanze/Nutzpflanze von Interesse sowie deren beabsichtigter Anwendung (wie Nahrungsmittelproduktion, Futtermittelproduktion, Produktion von verarbeiteten Lebensmitteln, Biokraftstoff, Biogas oder Alkoholproduktion oder dergleichen) von Interesse abhängen. So wird in einer Ausführungsform der Ertrag als Ernteindex (ausgedrückt als das Verhältnis des Gewichts der betreffenden erntefähigen Teile, geteilt durch die Gesamtbiomasse), das Gewicht von erntefähigen Teilen pro Fläche (acre bzw. Morgen, Quadratmeter oder dergleichen); und dergleichen berechnet. Der Ernteindex, d. h. das Verhältnis des Biomasseertrags zu der kumulativen Gesamtbiomasse bei der Ernte ist bei Mais während der selektiven Zucht hinsichtlich des Kornertrags über die letzten hundert Jahre im Wesentlichen unverändert geblieben. Folglich sind in jüngster Zeit erzielte Ertragsverbesserungen, die bei Mais vorkamen, das Ergebnis der erhöhten Gesamtbiomasseproduktion pro Landflächeneinheit. Diese erhöhte Gesamtbiomasse wurde durch Erhöhen der Pflanzungsdichte erzielt, was zu adaptiven phänotypischen Veränderungen geführt hat, wie einer Reduzierung des Blattwinkels, welche die Abschattung von tiefer liegenden Blättern verringern kann, und der Quastengröße, welche den Ernteindex erhöhen können. Der Ernteindex ist unter zahlreichen Umweltbedingungen relativ stabil, und daher ist eine robuste Korrelation zwischen der Pflanzengröße und dem Korn- bzw. Getreideertrag möglich. Die Pflanzengröße und der Getreideertrag sind untrennbar miteinander verknüpft, weil der Großteil der Getreidebiomasse von der momentanen oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität durch die Blätter und den Stängel der Pflanze abhängig ist. Wie bei der abiotischen Stresstoleranz sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken zum Messen der potenziellen Ertragsvorteile, die durch das Vorhandensein eines Transgens herbeigeführt werden.
Zum Beispiel bezieht sich der Ertrag auf den Biomasseertrag, z. B. auf den Trockengewichtbiomasseertrag und/oder den Frischgewichtbiomasseertrag. Biomasseertrag bezieht sich auf die oberirdischen oder unterirdischen Teile einer Pflanze, je nach den spezifischen Umständen (Testbedingungen, spezifische Nutzpflanze von Interesse, Anwendung von Interesse und dergleichen). In einer Ausführungsform bezieht sich Biomasseertrag auf die oberirdischen und unterirdischen Teile. Der Biomasseertrag kann als Frischgewicht, Trockengewicht oder auf einer hinsichtlich Feuchtigkeit angepassten Basis berechnet werden. Der Biomasseertrag kann bezogen je Pflanze oder im Verhältnis zu einer spezifischen Fläche (z. B. Biomasseertrag pro Morgen/Quadratmeter/oder dergleichen) berechnet werden.
In einer anderen Ausführungsform bezieht sich ”Ertrag” auf den Samenertrag, der durch einen oder mehrere der folgenden Parameter gemessen werden kann: Anzahl an Samen oder Anzahl von gefüllten Samen (pro Pflanze oder pro Fläche (Morgen/Quadratmeter/oder dergleichen)); Samenfüllrate (Verhältnis zwischen der Anzahl der gefüllten Samen und der Gesamtzahl an Samen); Anzahl von Blüten pro Pflanze; Samenbiomasse oder Gesamtsamengewicht (pro Pflanze oder pro Fläche (Morgen/Quadratmeter/oder dergleichen); Tausendkorngewicht (TKW; extrapoliert aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht; eine Zunahme des TKW kann durch eine erhöhte Samengröße, ein erhöhtes Samengewicht, eine erhöhte Embryogröße und/oder ein erhöhtes Endosperm bewirkt werden). Andere Parameter, die das Messen des Samenertrags ermöglichen, sind ebenfalls im Fachbereich bekannt. Der Samenertrag kann auf einer Trockengewichts- oder auf einer Frischgewichtsbasis oder typischerweise auf einer hinsichtlich Feuchtigkeit angepassten Basis, z. B. bei 15,5 Prozent Feuchtigkeit, bestimmt werden.
In einer Ausführungsform bedeutet der Ausdruck ”erhöhter Ertrag”, dass der photosynthetische aktive Organismus, besonders eine Pflanze, eine erhöhte Wachstumsrate unter Bedingungen von abiotischem Umweltstress im Vergleich zu dem entsprechenden photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus zeigt. Eine erhöhte Wachstumsrate kann sich u. a. durch eine erhöhte Biomasseproduktion der ganzen Pflanze oder eine erhöhte Biomasseproduktion der oberirdischen Teile einer Pflanze oder durch eine erhöhte Biomasseproduktion der unterirdischen Teile einer Pflanze oder durch eine erhöhte Biomasseproduktion von Teilen einer Pflanze, wie Stängeln, Blättern, Blüten, Früchten und/oder Samen, widerspiegeln oder führt diese herbei.
In einer Ausführungsform davon schließt erhöhter Ertrag höhere Fruchterträge, höhere Samenerträge, höhere Frischsubstanzproduktion und/oder höhere Trockensubstanzproduktion ein.
In einer weiteren Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”erhöhter Ertrag”, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, ein verlängertes Waschstum unter Bedingungen von abiotischem Umweltstress im Vergleich zu dem ent sprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus zeigt. Ein verlängertes Wachstum umfasst das Überleben und/oder fortgesetzte Wachstum des photosynthetischen aktiven Organismus, vorzugsweise einer Pflanze, in dem Moment, wo der nicht-transformierte photosynthetische aktive Wildtyp-Organismus sichtbare Mangel- und/oder Todessymptome zeigt.
Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Pflanze eine Maispflanze. Erhöhter Ertrag für Maispflanzen bedeutet in einer Ausführungsform einen erhöhten Samenertrag, insbesondere für Maisvarietäten, die für Futtermittel oder Lebensmittel verwendet werden. Erhöhter Samenertrag von Mais bezieht sich in einer Ausführungsform auf ein(e) erhöhte(s) Korngröße oder -gewicht, eine Zunahme der Kerne pro Hülse oder Zunahme der Hülsen pro Pflanze. Weiterhin ist in einer Ausführungsform der Kolbenertrag erhöht, und dies ist besonders nützlich für Maispflanzenvarietäten, die zum Füttern verwendet werden. Außerdem ist zum Beispiel die Länge oder Größe des Kolbens erhöht. in einer Ausführungsform betrifft der erhöhte Ertrag für eine Maispflanze ein verbessertes Kolben-zu-Kern-Verhältnis.
Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform die in dem Verfahren der Erfindung verwendete Pflanze eine Sojapflanze. Erhöhter Ertrag für Sojapflanzen bedeutet in einer Ausführungsform einen erhöhten Samenertrag, insbesondere für Sojavarietäten, die für Futtermittel oder Lebensmittel verwendet werden. Erhöhter Samenertrag von Soja bezieht sich in einer Ausführungsform auf ein(e) erhöhte Kerngröße oder -gewicht, eine Zunahme der Kerne pro Hülse oder Zunahme der Hülsen pro Pflanze.
Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform die in dem Verfahren der Erfindung verwendete Pflanze eine Ölsamenraps-(OSR-)Pflanze. Erhöhter Ertrag für OSR-Pflanzen bedeutet in einer Ausführungsform einen erhöhten Samenertrag, insbesondere für OSR-Varietäten, die für Futtermittel oder Lebensmittel verwendet werden. Erhöhter Samenertrag von OSR bezieht sich in einer Ausführungsform auf eine(n) erhöhte Kerngröße oder -gewicht, einen Zunahme der Kerne pro Hülse oder Zunahme der Hülsen pro Pflanze.
Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform die die in dem Verfahren der Erfindung verwendete Pflanze eine Baumwollpflanze. Erhöhter Ertrag für Baumwollpflanzen bedeutet in einer Ausführungsform einen erhöhten Flusenertrag. Ein erhöhter Baumwollertrag bezieht sich bei Baumwolle in einer Ausführungsform auf eine erhöhte Flusenlänge.
Erhöhter Samenertrag von Mais bezieht sich in einer Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder -gewicht, eine Zunahme der Kerne pro Hülse oder Zunahme der Hülsen pro Pflanze.
Der erhöhte Ertrag gemäß der vorliegenden Erfindung kann typischerweise durch Steigern oder Verbessern, im Vergleich zu einer Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze, von einer oder mehreren ertragsbezogenen Eigenschaften der Pflanze erzielt werden. Solche ertragsbezogenen Eigenschaften einer Pflanze, deren Verbesserung zu einem erhöhten Ertrag führt, umfassen ohne Einschränkung die Erhöhung der intrinsischen Ertragskapazität einer Pflan ze, eine verbesserte Nährstoffverwertungseffizienz und/oder eine erhöhte Stresstoleranz, insbesondere eine erhöhte abiotische Stresstoleranz.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Ertrag durch Verbessern von einer oder mehreren der ertragsbezogenen Eigenschaften wie hierin definiert erhöht:
Die intrinsische Ertragskapazität einer Pflanze kann sich zum Beispiel durch Verbessern des spezifischen (intrinsischen) Samenertrags (z. B. hinsichtlich einer erhöhten Samen/Korngröße, erhöhten Ährenzahl, einer erhöhten Samenzahl pro Ähre, der Verbesserung der Samenfüllung, der Verbesserung der Samenzusammensetzung, Embryo- und/oder Endosperm-Verbesserungen oder dergleichen); der Modifizierung und Verbesserung von inhärenten Wachstums- und Entwicklungsmechanismen einer Pflanze (wie Pflanzenhöhe, Pflanzenwachstumsrate, Hülsenzahl, Hülsenposition auf der Pflanze, Zahl der Internodien, Auftreten von Hülsen- bzw. Schotenabwurf, Effizienz der Nodulation und Stickstofffixierung, Effizienz der Kohlenstoffassimilation, Verbesserung der Sämlingsvitalität/-Frühwuchskraft, gesteigerte Keimungseffizienz (unter Stress- oder Nicht-Stress-Bedingungen), Verbesserung der Pflanzenarchitektur, Zellzyklusmodifizierungen, Photosynthesemodifizierungen, verschiedene Signalwegmodifikationen, Modifizierung der transkriptionellen Regulierung, Modifizierung der translationalen Regulierung, Modifizierung der Enzymaktivitäten und dergleichen); und/oder dergleichen manifestieren.
Die Verbesserung oder Erhöhung der Stresstoleranz einer Pflanze kann sich zum Beispiel durch die Verbesserung oder Erhöhung der Toleranz einer Pflanze gegen Stress, insbesondere abiotischen Stress, manifestieren. In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich abiotischer Stress allgemein auf abiotische Umweltbedingungen, denen eine Pflanze typischerweise ausgesetzt ist, einschließlich Bedingungen, die typischerweise als ”abiotische Stress”-Bedingungen bezeichnet werden, darin eingeschlossen, aber nicht beschränkt auf, Dürre (Toleranz gegenüber Dürre kann als eine Folge einer verbesserten Wassernutzungseffizienz erzielt werden), Hitze, niedrige Temperaturen und Kältebedingungen (wie Gefrier- und Abkühlungsbedingungen), Salzgehalt, osmotischer Stress, Schatten, hohe Pflanzendichte, mechanischer Stress, oxidativer Stress und dergleichen.
Der erhöhte Pflanzenertrag kann auch durch Erhöhen der ”Nährstoffverwertungseffizienz einer Pflanze”, z. B. durch Verbessern der Verwertungseffizienz von Nährstoffen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Phosphor, Kalium und Stickstoff, vermittelt werden. Zum Beispiel besteht ein Bedarf an Pflanzen, die in der Lage sind, Stickstoff effizienter zu verwerten, so dass weniger Stickstoff für das Wachstum erforderlich ist und was daher zu dem verbesserten Ertragsniveau unter Stickstoffmangelbedingungen führt. Ferner können höhere Erträge mit derzeitigen oder standardmäßigen Ausmaßen der Stickstoffverwendung erzielt werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden diese Eigenschaften durch ein Verfahren für eine gesteigerte Stickstoffnutzung (= Stickstoffver wertungseffizient (NUE)) in einer Pflanze im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze erreicht.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Biomasseertrag pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Trockenbiomasseertrag pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten oberirdischen Trockenbiomasseertrag pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten unterirdischen Trockenbiomasseertrag pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer weiteren Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Frischgewichtbiomasseertrag pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten oberirdischen Frischgewichtbiomasseertrag pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten unterirdischen Frischgewichtbiomasseertrag pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer weiteren Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag von erntefähigen Teilen einer Pflanze pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag von erntefähigen Trockenteilen einer Pflanze pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag von oberirdischen erntefähigen Trockenteilen einer Pflanze pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag von unterirdischen erntefähigen Trockenteilen einer Pflanze pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer weiteren Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag an erntefähigen Frischgewichtteilen einer Pflanze pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag von oberirdischen erntefähigen Frischgewichtteilen einer Pflanze pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen ge lassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag von unterirdischen erntefähigen Frischgewichtteilen einer Pflanze pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer weiteren Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag der Nutzpflanzenfrucht pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag der Frischnutzpflanzenfrucht pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag der Trockennutzpflanzenfrucht pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdünger, auf dem/der die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze ein gesteigertes Korn- bzw. Getreidetrockengewicht pro zugeführter Stickstoffeinheit im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze aufzeigt, in Analogie zu Reynolds, M. P., Ortiz-Monasterio J. J. und McNab A. (Hrsg.), 2001, "Application of Physiology in Wheat Breeding", Mexico (Einsatz der Physiologie in der Weizenzüchtung), Mexiko, D. F.: CIMMYT, die hierin durch den Bezug eingeschlossen ist.
In einer weiteren Ausführungsform bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag von Samen pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdüngemittel, auf dem die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze aufzeigt.
In einer Ausführungsform bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag von Frischgewichtsamen pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdüngemittel, auf dem die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze aufzeigt.
In einer Ausführungsform bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte NUE”, dass die Pflanze einen gesteigerten Ertrag von Trockensamen pro Stickstoffeinheit, die aus dem umgebenden Medium, Erdboden oder der Umgebung verfügbar ist, einschließlich Stickstoffdüngemittel, auf dem die Pflanze wachsen gelassen wird, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze aufzeigt.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden diese Eigenschaften durch ein Verfahren für eine Erhöhung der Biomasseproduktion und/oder des Ertrags unter Bedingungen einer begrenzten Stickstoffversorgung in einer Pflanze im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze erreicht.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”erhöhte Biomasseproduktion”, dass die Pflanze eine erhöhte Wachstumsrate unter Bedingungen einer begrenzten Stickstoffversorgung im Vergleich zu der entsprechenden Wildtyp-Pflanze aufzeigt. Eine erhöhte Wachstumsrate kann sich u. a. in einer erhöhten Biomasseproduktion der ganzen Pflanze oder einer erhöhten Biomasseproduktion der oberirdischen Teile einer Pflanze oder einer erhöhten Biomasseproduktion der unterirdischen Teile einer Pflanze, oder einer erhöhten Biomasseproduktion von Teilen einer Pflanze, wie Stängeln, Blättern, Blüten, Früchten, Samen, widerspiegeln.
In einer Ausführungsform davon schließt erhöhte Biomasseproduktion höhere Fruchterträge, höhere Samenerträge, eine höhere Frischsubstanzproduktion und/oder höhere Trockensubstanzproduktion ein.
In einer weiteren Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”erhöhte Biomasseproduktion”, dass die Pflanze ein verlängertes Wachstum unter Bedingungen einer begrenzten Stickstoffversorgung im Vergleich zu der entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze zeigt. Ein verlängertes Wachstum umfasst das Überleben und/oder fortgesetzte Wachstum der Pflanze in dem Moment, wo die nicht-transformierte Wildtyp-Pflanze sichtbare Mangel- und/oder Absterbesymptome zeigt.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere mit einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer erhöhten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder einer erhöhten Toleranz gegenüber Umwelt stress und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren von einer oder mehreren Aktivitäten, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und die SET-Domäne enthaltendem Protein besteht, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon; und
(b) Erzeugen einer transformierten Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere mit einer gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhten Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze und Wachsenlassen unter Bedingungen, welche die Entwicklung der Pflanze ermöglichen.

In einer Ausführungsform zeigt die transgene Pflanze eine verbesserte ertragsbezogene Eigenschaft.
Zum Beispiel zeigt die transgene Pflanze der Erfindung eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz.
In einer weiteren Ausführungsform zeigt die transgene Pflanze eine Erhöhung der Biomasseproduktion und/oder des Ertrags unter Bedingungen einer begrenzten Stickstoffversorgung.
Zum Beispiel kann die Stickstoffverwertungseffizienz gemäß dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren für die Erhöhung des Ertrags, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Messen des Stickstoffgehalts im Erdboden, und
(b) Bestimmen, ob der Stickstoffgehalt im Erdboden optimal oder suboptimal für das Wachstum einer Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze, z. B. einer Nutzpflanze, ist, und
(c1) Wachsenlassen der Pflanze der Erfindung in dem Erdboden, wenn der Stickstoffgehalt für das Wachstum der Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze suboptimal ist, oder
(c2) Wachsenlassen der Pflanze der Erfindung im Erdboden und Vergleichen des Ertrags mit dem Ertrag einer Standard-, einer Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze, Selektieren und Wachsenlassen der Pflanze, die den höchsten Ertrag zeigt, wenn der Stickstoffgehalt für die Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze optimal ist.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Pflanzenertrag durch Erhöhen der Stresstoleranz(en) der Pflanze erhöht. Allgemein kann der Ausdruck ”erhöhte Toleranz gegenüber Stress” als Überleben von Pflanzen und/oder Produktion mit höherem Ertrag unter Stressbedingungen im Vergleich zu einer nicht-transformierten Wildtyp- oder Ausgangspflanze, definert werden: Zum Beispiel ist die Pflanze der Erfindung oder die gemäß dem Verfahrender Erfindung produziert wurde, besser an die Stressbedingungen angepasst.
Während ihres Lebenszyklus ist eine Pflanze allgemein einer Vielfalt an Umweltbedingungen ausgesetzt: Alle derartigen Bedingungen, die unter bestimmten Umständen eine Auswirkung auf den Pflanzenertrag haben können, werden hierin als ”Stress”-Bedingung bezeichnet. Umweltstress lässt sich allgemein in biotische und abiotische (Umwelt-)Stressformen einteilen. Ungünstige Nährstoffbedingungen werden manchmal auch als ”Umweltstress” bezeichnet. Die vorliegende Erfindung zieht auch Lösungen für diese Art von Umweltstress in Betracht, z. B. in Bezug auf eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz.
Zum Beispiel wird der Pflanzenertrag durch Erhöhen der abiotischen Stresstoleranz(en) einer Pflanze erhöht. Für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die Ausdrücke ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Stress”, gesteigerte Resistenz gegenüber abiotischem Umweltstress”, ”gesteigerte Toleranz gegenüber Umweltstress, ”verbesserte Anpassung an Umweltstress” und andere Varianten und Ausdrücke mit ähnlicher Bedeutung beliebig austauschbar verwendet und beziehen sich ohne Einschränkung auf eine Verbesserung der Toleranz gegenüber einer oder mehreren abiotischen Umweltstressformen wie hierin beschrieben und im Vergleich zu einer entsprechenden Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze oder einem Teil davon.
Der Ausdruck abiotische Stresstoleranz(en) bezieht sich zum Beispiel auf Niedertemperaturtoleranz, Dürretoleranz oder verbesserte Wassernutzungseffizienz (WUE), Hitzetoleranz, Salzstresstoleranz und Sonstige. Untersuchungen der Anwortreaktion einer Pflanze auf Austrocknung, osmotischen Schock und Temperaturextreme kommen auch zum Einsatz, um die Toleranz der Pflanze oder Resistenz gegenüber abiotischen Stressformen zu bestimmen.
Die Stresstoleranz bei Pflanzen, wie Niedertemperatur-, Dürre-, Hitze- und Salzstresstoleranz, können ein gemeinsames Thema haben, das für das Pflanzenwachstum von Bedeutung ist, nämlich die Verfügbarkeit von Wasser. Pflanzen sind üblicherweise während ihres Lebenszyklus an Bedingungen eines reduzierten Wassergehalts in der Umwelt ausgesetzt. Die Schutzstrategien sind ähnlich wie jene der Abkühlungs- bzw. Frosttoleranz.
Dementsprechend betrifft die ertragsbezogene Eigenschaft eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der Pflanze der Erfindung und/oder eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürrebedingungen der Pflanze der Erfindung. Die Wassernutzungseffizienz (WUE) ist ein Parameter, der oft mit der Dürretoleranz korreliert. Eine Zunahme der Biomasse bei niedriger Wasserverfügbarkeit kann auf eine relativ verbesserte Effizienz von Wachstum oder verringerten Wasserverbrauch zurückzuführen sein. Bei der Selektion von Eigenschaften zur Verbesse rung von Nutzpflanzen hätte eine Verringerung der Wasserverbrauch ohne eine Veränderung beim Wachstum einen besonderen Vorteil in einem landwirtschaftlichen Bewässerungssystem, wo die Wasserverbrauchskosten sehr hoch wären. Eine Zunahme des Wachstums ohne einen entsprechenden Anstieg des Wasserverbrauchs hätte Anwendbarkeit auf alle landwirtschaftlichen Systeme. In vielen landwirtschaftlichen Systemen, wo der Wasservorrat nicht begrenzend ist, erhöht eine Zunahme beim Wachstum, selbst wenn dies auf Kosten einer Zunahme des Wasserverbrauchs geschehen würde, ebenfalls den Ertrag.
Wenn das Bodenwasser erschöpft ist oder wenn Wasser während Dürreperioden nicht verfügbar ist, sind die Nutzpflanzenerträge begrenzt. Ein Pflanzenwassermangel entsteht, wenn die Ausdunstung von den Blättern die Wasserzufuhr von den Wurzeln übersteigt. Der verfügbare Wasservorrat steht mit der Menge des im Erdboden gehaltenen Wassers und der Fähigkeit der Pflanze, dieses Wasser mit ihrem Wurzelsystem zu erreichen, in Zusammenhang. Die Ausdunstung von Wasser von den Blättern ist mit der Fixierung von Kohlendioxid durch Photosynthese über die Stomata bzw. Spaltöffnungen verknüpft. Die zwei Prozesse korrelieren positiv, so dass ein hoher Kohlendioxidzufluss durch Photosynthese eng mit dem Wasserverlust durch Ausdunstung verknüpft ist. In dem Maße, wie Wasser aus dem Blatt ausdunstet, wird das Blattwasserpotential verringert und die Stomata tendieren dazu, sich in einem hydraulischen Prozess zu schließen unter Begrenzung des Ausmaßes der Photosynthese. Da der Nutzpflanzenertrag von der Fixierung von Kohlendioxid in der Photosynthese abhängt, sind die Wasseraufnahme und Ausdunstung beitragende Faktoren zu dem Nutzpflanzenertrag. Pflanzen, die in der Lage sind, weniger Wasser zu verbrauchen, um die gleiche Menge an Kohlendioxid zu fixieren, oder die in der Lage sind, normal bei einem niedrigeren Wasserpotential zu fungieren, haben das Potential, mehr Photosynthese durchzuführen und dadurch mehr Biomasse und wirtschaftlichen Ertrag in zahlreichen landwirtschaftlichen Systemen zu produzieren.
Dürrestress bedeutet jeglichen Umweltstress, der zu einem Wassermangel in Pflanzen oder der Verringerung der Wasserzufuhr zu Pflanzen führt, einschließlich eines sekundären Stress durch niedrige Temperatur und/oder Salz und/oder primären Stress während einer Dürre oder Hitze, z. B. Austrocknung etc.
Zum Beispiel kann eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürrebedingungen gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt und quantifiziert werden: Pflanzen der Erfindung werden einzeln in Töpfen in einer Wachstumskammer wachsen gelassen (York Industriekälte GmbH, Mannheim, Deutschland). Die Keimung wird induziert. Für den Fall, dass die Pflanzen Arabidopsis thaliana sind, werden ausgesäte. Samen 3 Tage lang im Dunkeln auf 4°C gehalten, um die Keimung zu induzieren. Anschließend werden die Bedingungen für 3 Tage auf 20°C/6°C Tag/Nacht-Temperatur bei einem 16/8-h-Tag-Nacht-Zyklus bei 150 μE/m²s verändert. Anschließend werden die Pflanzen unter Standardwachstumsbedingungen wachsen gelassen. Für den Fall, dass die Pflanzen Arabidopsis thaliana sind, sind die Standardwachstumsbedingungen wie folgt: Photoperiode von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchtigkeit und eine Photonenflussdichte von 200 μE. Die Pflanzen werden wachsen gelassen und kultiviert, bis sie Blätter entwickeln. Für den Fall, dass die Pflanzen Arabidopsis thaliana sind, werden sie täglich bewässert, bis sie ungefähr 3 Wochen alt waren. Beginnend an diesem Zeitpunkt wurde eine Dürre herbeigeführt, indem Wasser zurückgehalten wurde. Nachdem die Wildtyp-Pflanzen sichtbare Symptome einer Schädigung zeigten, wird mit der Evaluierung begonnen und die Pflanzen werden auf Symptome von Dürresymptomen und der Biomasseproduktion im Vergleich zu Wildtyp- und benachbarten Pflanzen 5–6 Tage hintereinander (mit Punkten) bewertet. In einer Ausführungsform wird die Toleranz gegenüber Dürre, z. B. die Toleranz gegenüber Dürrezyklen nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren bestimmt.
Dürretoleranz kann eine Toleranz gegenüber Dürrezyklen sein.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren für die Erhöhung des Ertrags, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bestimmen, ob die Wasserversorgung in der Bepflanzungsfläche optimal oder suboptimal für das Wachstum einer Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze, z. B. einer Nutzpflanze, ist und/oder Bestimmen der sichtbaren Symptome einer Schädigung von Pflanzen, die in der Bepflanzungsfläche wachsen; und
(b1) Wachsenlassen der Pflanze der Erfindung in dem Erdboden, wenn die Wasserversorgung für das Wachstum einer Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze suboptimal ist oder sichtbare Symptome für Dürre bei einer Standard-, Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze, die in der Fläche wächst, zu finden sind; oder
(b2) Wachsenlassen der Pflanze der Erfindung in dem Erdboden und Vergleichen des Ertrags mit dem Ertrag einer Standard-, Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze und Selektieren und Wachsenlassen der Pflanze, welche den höchsten Ertrag zeigt, wenn die Wasserversorgung für die Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze optimal ist.

Zu den sichtbaren Schädigungssymptomen gehören ein oder eine beliebige Kombination von zwei, drei oder mehreren der folgenden Merkmale:

a) Verwelken
b) Bräunung der Blätter
c) Verlust des Turgors, was zu einem Abfall der Blätter oder Nadeln, Stängeln und Blüten führt,
d) Abfallen und/oder Abwerfen von Blättern oder Nadeln,
e) die Blätter sind grün, aber das Blatt ist im Vergleich zu Kontrollen leicht in Richtung Erdboden abgewinkelt,
f) die Blattspreiten beginnen sich nach innen zu falten (einzurollen),
g) verfrühte Alterung von Blättern oder Nadeln,
h) Verlust von Chlorophyll in den Blättern oder Nadeln und/oder Vergilbung.

Die ertragsbezogene Eigenschaft der Pflanze der Erfindung kann eine erhöhte Toleranz gegenüber Hitzebedingungen der Pflanze sein.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die ertragsbezogne Eigenschaft der Pflanze der Erfindung eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz der Pflanze, die z. B. Gefriertoleranz und/oder Abkühlungstoleranz umfasst.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Trockenbiomasseertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus, wie einer Pflanze, aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten oberirdischen Trockenbiomasseertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten unterirdischen Trockenbiomasseertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer weiteren Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Frischgewichtbiomasseertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten oberirdischen Frischgewichtbiomasseertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten unterirdischen Frischgewichtbiomasseertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer weiteren Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Ertrag von erntefähi gen Teilen einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Ertrag von erntefähigen Trockenteilen einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Ertrag von erntefähigen oberirdischen Trockenteilen einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Ertrag von erntefähigen unterirdischen Trockenteilen einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer weiteren Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Ertrag von erntefähigen Frischgewichtteilen einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Ertrag von erntefähigen oberirdischen Frischgewichtteilen einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Ertrag von erntefähigen unterirdischen Frischgewichtteilen einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer weiteren Ausführungsform bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Ertrag der Nutzpflanzenfrucht im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Ertrag der Frischnutzpflanzenfrucht im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Ertrag der Trockennutzpflanzenfrucht im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, ein gesteigertes Korntrockengewicht im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer weiteren Ausführungsform bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Samenertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, einen gesteigerten Frischgewichtsamenertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt.
In einer Ausführungsform bedeutet der Ausdruck ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” bei einem photosynthetischen aktiven Organismus, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt wird, eine gesteigerte Trokensamenausbeute im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyp-Organismus aufzeigt. Zum Beispiel können die abiotischen Umweltstressbedingungen, welchen der Organismus ausgesetzt ist, aber jede beliebige der hierin genannten abiotischen Umweltstressformen sein.
Eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz des hergestellten Maises (corn) bezieht sich in einer Ausführungsform auf einen verbesserten Proteingehalt des Maissamens, insbesondere bei Maissamen, der als Futtermittel verwendet wird. Eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz bezieht sich in einer anderen Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder -zahl. Eine erhöhte Wassernutzungseffizienz des hergestellten Maises bezieht sich in einer Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder -zahl. Ferner bezieht sich eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz in einer Ausführungsform auf eine Frühwuchskraft und ermöglicht das frühe Anpflanzen und Aussäen einer Maispflanze, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird.
Eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz der hergestellten Sojapflanze bezieht sich in einer Ausführungsform auf einen verbesserten Proteingehalt des Sojasamens, insbesondere bei Sojasamen, der als Futtermittel verwendet wird. Eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz bezieht sich in einer anderen Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder -zahl. Ein erhöhte Wassernutzungseffizienz der hergestellten Sojapflanze bezieht sich in einer Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder -zahl. Ferner bezieht sich eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz in einer Ausführungsform auf eine Frühwuchskraft und ermöglicht das frühe Anpflanzen und Aussäen einer Sojapflanze, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird.
Eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz der hergestellten OSR-Pflanze bezieht sich in einer Ausführungsform auf einen verbesserten Proteingehalt des OSR-Samens, insbesondere bei OSR-Samen, der als Futtermittel verwendet wird. Eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz bezieht sich in einer anderen Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder -zahl. Ein erhöhte Wassernutzungseffizienz der hergestellten OSR-Pflanze bezieht sich in einer Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder -zahl. Ferner bezieht sich eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz in einer Ausführungsform auf eine Frühwuchskraft und ermöglicht das frühe Anpflanzen und Aussäen einer Sojapflanze, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird. In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von robustem bzw. winterhartem Ölsamenraps (OSR mit Winterfestigkeit), welches die Verwendung einer robusten Ölsamenrapspflanze in dem oben genannten Verfahren der Erfindung umfasst.
Eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz der hergestellten Baumwollpflanze bezieht sich in einer Ausführungsform auf einen verbesserten Proteingehalt des Baumwollsamens, insbesondere bei Baumwollsamen, der für Futtermittel verwendet wird. Eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz bezieht sich in einer anderen Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder -zahl. Eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der hergestellten Baumwollpflanze bezieht sich in einer Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder -zahl. Ferner bezieht sich eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz in einer Ausführungsform auf eine Frühwuchskraft und ermöglicht das frühe Anpflanzen und Aussäen einer Baumwollpflanze, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze; von Abkömmlingen, Samen und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgeleitet sind, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze kann auch eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz, insbesondere Abkühlungstoleranz im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle oder -Pflanze, durch Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren von einer oder mehreren der ”Aktivitäten” in dem hierin angegebenen subzellulären Kompartiment und Gewebe in der Pflanze zeigen.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze; von Abkömmlingen, Samen und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze ”abgeleitet sind, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze kann auch eine verbesserte Wassernutzungseffizienz oder eine erhöhte Dürretoleranz im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle oder -Pflanze, durch Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren von einer oder mehreren der Aktivitäten in dem hierin angegebenen subzellulären Kompartiment und Gewebe in der Pflanze zeigen.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze; von Abkömmlingen, Samen und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgeleitet sind, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze kann eine Stickstoffverwertungseffizienz (NUE) sowie eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz und/oder einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder Dürretoleranz, insbesondere Abkühlungstoleranz und Dürretoleranz im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle oder -Pflanze, durch Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren von einer oder mehreren der Aktivitäten in dem hierin angegebenen subzellulären Kompartiment und Gewebe in der Pflanze zeigen.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze; von Abkömmlingen, Samen und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgeleitet sind, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze kann eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz (NUE) sowie Niedertemperaturtoleranz oder eine erhöhte Dürretoleranz, oder einen erhöhten intrinsischen Ertrag, insbesondere Abkühlungstoleranz und Dürretoleranz und eine Erhöhung der Biomasse im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle oder -Pflanze, durch Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren von einer oder mehreren der Aktivitäten sowie in dem hierin angegebenen subzellulären Kompartiment und Gewebe in der Pflanze zeigen.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze; von Abkömmlingen, Samen und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgeleitet sind, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze kann eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz (NUE) sowie Niedertemperaturtoleranz und eine erhöhte Dürretoleranz und einen erhöhten intrinsischen Ertrag, insbesondere Abkühlungstoleranz und Dürretoleranz und eine Erhöhung der Biomasse im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp- Pflanzenzelle oder -Pflanze, durch Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren von einer oder mehreren der Aktivitäten in dem hierin angegebenen subzellulären Kompartiment und Gewebe in der Pflanze zeigen.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform eine transgene Pflanze bereit, welche eine oder mehrere erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu der entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanzenzelle oder -Pflanze, durch Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren von einer oder mehreren der Aktivitäten, die aus der oben genannten Gruppe von Aktivitäten gewählt sind, in dem hierin angegebenen subzellulären Kompartiment und Gewebe in der Pflanze zeigen.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze; von Abkömmlingen, Samen und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgeleitet sind, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt, wobei jede Pflanze eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz und Stickstoffverwertungseffizienz (NUE) im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle oder -Pflanze, durch Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren von einer oder mehreren der besagten ”Aktivitäten” zeigt.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze; von Abkömmlingen, Samen und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgeleitet sind, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt, wobei jede Pflanze eine erhöhte, verbesserte NUE und eine erhöhte Dürrezyklustoleranz im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle oder -Pflanze, durch Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren von einer oder mehreren der besagten ”Aktivitäten” zeigt.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze; von Abkömmlingen, Samen und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgeleitet sind, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt, wobei jede Pflanze eine erhöhte und verbesserte NUE und einen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle oder -Pflanze, durch Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren von einer oder mehreren der besagten ”Aktivitäten” zeigt.
In einer Ausführungsform wird die Aktivität in einem oder mehreren spezifischen Kompartiments einer Zelle reduziert, unterdrückt oder deletiert und führt einen erhöhten Ertrag herbei, z. B. zeigt die Pflanze eine erhöhte oder verbesserte ertragsbezogene Eigenschaft. Zum Beispiel wird die Aktivität in dem Plastid einer Zelle reduziert, unterdrückt oder deletiert wie in Tabelle I oder II, Spalte 6, angegeben und erhöht den Ertrag bei einer entsprechenden Pflanze.
Ferner betrifft in einer anderen Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ernteertrag, insbesondere erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwer tungseffizienz, wie einer erhöhten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhter Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren der Aktivität von (i) einem Polypeptid, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder mindestens ein Polypeptidmotiv, wie in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle II bzw. der Tabelle IV aufgeführt, umfasst; oder (ii) einem Expressionsprodukt eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polynukleotid, wie in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle I aufgeführt, umfasst, (iii) oder einem funktionellen Äquivalent von (i) oder (ii); in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, und
(b) Erzeugen einer transformierten Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer erhöhten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhter Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, und Wachsen lassen unter Bedingungen, welche die Entwicklung der Pflanze ermöglichen.

Vorzugsweise umfasst das Verfahren der Erfindung ferner das Reduzieren, Vermindern oder Deletieren der Expression oder Aktivität von mindestens einem Nukleinsäuremolekül, das die Aktivität von mindestens einem Nukleinsäuremolekül aufweist oder codiert, repräsentiert durch das Nukleinsäuremolekül, wie es in der Spalte 5 der Tabelle I aufgeführt ist, Anmeldung Nr. 1, und umfassend ein Nukleinsäuremolekül, welches aus der Gruppe gewählt wird, die aus folgendem besteht:

a) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches das Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1 codiert;
b) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1;
c) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes aus einer Polypeptidsequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, abgeleitet werden kann, Anmeldung Nr. 1;
d) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität zu der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1;
e) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) codiert wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1;
f) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das mit Hilfe monoklonaler oder polyklonaler Antikörper isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid hergestellt wurden, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) codiert wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1;
g) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, umfasst, Anmeldung Nr. 1, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1;
h) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
i) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das erhalten wird durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle III, Anmeldung Nr. 1, welche an ihrem 5'-Ende nicht mit den Nukleotiden ATA beginnen, und das vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1;
j) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, wobei das Polypeptid abgeleitet wird durch Substitutieren, Deletieren und/oder Hinzufügen einer oder mehrerer Aminosäuren der Aminosäuresequenz des von den Nukleinsäuremolekülen (a) bis (d) codierten Polypeptids; und
k) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, enthaltend mindestens 15 nt, bevorzugt 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 500 nt, 750 nt oder 1000 nt eines Nukleinsäuremoleküls, komplementär zu einer in (a) bis (d) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz, erhältlich ist und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, umfassend ein Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;

Vorzugsweise umfasst das Verfahren der Erfindung ferner das Reduzieren, Unterdrücken, Vermindern oder Deletieren eines Expressionsproduktes von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie es oben in (a) bis (j) aufgeführt ist, z. B. ein Poly peptid, welches eine Polypeptid umfasst, wie es in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle II gezeigt ist, Anwendung 1, oder eines Proteins, welches durch das Nukleinsäuremolekül codiert wird.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren der Erfindung ferner das Verringern der Aktivität oder der Expression eines Polypeptids, welches ein Polypeptid umfasst, das durch das Nukleinsäuremolekül codiert wird, welches oben stehend charakterisiert ist, in einer Pflanze oder einem Teil davon.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren der Erfindung ferner mindestens einen Schritt, der aus der Gruppe gewählt wird, die aus folgendem besteht:

(a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das eine Ribonukleinsäuresequenz codiert, welche in der Lage ist, ein doppelsträngiges Ribonukleinsäuremolekül zu bilden, wobei ein Fragment von mindestens 17 nt des doppelsträngigen Ribonukleinsäuremoleküls eine Homologie von mindestens 50%, vorzugsweise 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, zu einem Nukleinsäuremolekül aufweist, welches aus der Gruppe von folgendem gewählt wird: (i) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, oben stehend charakterisiert ist; (ii) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 oder 7 der Tabelle I aufgeführt ist, Anwendung 1, oder ein Polypeptid codiert, wie es in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II aufgeführt ist, Anmeldung Nr. 1, und (iii) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit der Aktivität vom Polypeptid, das in der Spalte 5 der Tabelle II aufgeführt ist, codiert, Anmeldung Nr. 1, oder das Expressionsprodukt eines Polynukleotids codiert, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, wie es in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle I aufgeführt ist, Anmeldung Nr. 1;
(b) Einbringen eines RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmoleküls, Ribozyms oder Antisense-Nukleinsäuremoleküls, wobei das RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Cosuppressionsmolekül, Ribozym oder Antisense-Nukleinsäuremolekül ein Fragment von mindestens 17 nt mit einer Homologie von mindestens 50%, vorzugsweise 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, zu einem Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus einer Gruppe gewählt wird, die in Absatzteil (a) dieses Absatzes definiert wird;
(c) Einbringen eines Ribozyms, welches eine Nukleinsäuremolekül spezifisch spaltet, das aus der Gruppe gewählt wird, die in Absatzteil (a) dieses Absatzes definiert wird;
(d) Einbringen des RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmoleküls, Ribozyms oder Antisense-Nukleinsäuremoleküls, charakterisiert in (b), und des Ribozyms, welches in (c) charakterisiert ist;
(e) Einbringen eines Sense-Nukleinsäuremoleküls, das die Expression von einem Nukleinsäuremolekül herbeiführt, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, welches aus der Gruppe gewählt wird, die oben hierin definiert ist oder in dem Absatzteil (a)(ii) oder (a)(iii) oben stehend definiert ist, oder ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit mindestens 50% Identität mit der Aminosäuresequenz von dem Polypeptid aufweist, welches durch das Nukleinsäuremolekül, welches im Absatzteil (a) bis (c) erwähnt ist und die Aktivität besitzt, welche durch ein Protein repräsentiert wird, das ein Polypeptid umfasst, welches in Spalte 5 der Tabelle II Anmeldung Nr. 1 aufgeführt ist, zum Induzieren einer Cosuppression von dem endogenen Expressionsprodukt;
(f) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das die Expression einer dominant-negativen Mutante eines Proteins herbeiführt, das die Aktivität eines Proteins, das in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle II aufgeführt ist, aufweist, Anmeldung Nr. 1, oder ein Polypeptid umfasst, welches durch ein Nukleinsäuremolekül, wie es hierin oben stehend charakterisiert ist, codiert wird;
(g) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das einen Faktor codiert, welcher an ein Nukleinsäuremolekül bindet, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe gewählt wird, die in hierin oben stehend definiert ist oder in Absatzteil (a)(ii) oder (a)(iii) von diesem Paragraphen definiert wird, wobei die Expression eines Proteins herbeigeführt wird, das die Aktivität eines Proteins hat, welches durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird, wie es hierin oben stehend charakterisiert ist;
(h) Einbringen eines viralen Nukleinsäuremoleküls, das den Abbau eines RNA-Moleküls herbeiführt, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe gewählt wird, die hierin oben stehend definiert wird oder in Absatzteil (a)(ii) oder (a)(iii) von diesem Paragraphen definiert wird, wobei die Expression eines Proteins herbeigeführt wird, welches durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird, wie es hierin oben stehend charakterisiert ist;
(i) Einbringen eines Nukleinsäurekonstruktes, das in der Lage ist, mit einem endogenen Gen zu rekombinieren und es zu silencen bzw. es stumm zu schalten, zu inaktivieren, zu unterdrücken oder zu reduzieren, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe gewählt wird, die hierin oben stehend definiert wird oder in Absatzteil (a)(ii) oder (a)(iii) von diesem Absatz definiert wird, wobei die Expression eines Proteins herbeigeführt wird, welches durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird, wie es hierin oben stehend charakterisiert ist;
(j) Einbringen einer Nicht-Silent-Mutation in ein endogenes Gen, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe gewählt wird, die hierin oben stehend definiert wird oder in Absatzteil (a)(ii) oder (a)(iii) von diesem Absatz definiert wird; und;
(k) Einbringen eines Expressionskonstruktes, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls herbeiführt, welches in einem von (a) bis (i) charakterisiert ist.

Vorzugsweise wird in dem Verfahren der Erfindung ein Fragment von mindestens 17 bp einer 3'- oder 5'-Nukleinsäuresequenz einer Sequenz, die ein Nukleinsäuremolekül, das aus der Gruppe gewählt ist, die hierin oben stehend definiert ist oder im oben stehenden Absatz (a)(ii) oder (a)(iii) definiert ist, mit einer Identität von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, umfasst für die Reduktion des Nukleinsäuremoleküls, welches obern stehend charakterisiert ist, oder des Polypeptids, welches durch das Nukleinsäuremolekül codiert wird, verwendet.
Vorzugsweise wird in dem Verfahren der Erfindung die Reduktion oder Deletion durch Anwenden einer chemischen Verbindung von einem nicht-menschlichen Organismus verursacht.
Vorzugsweise wird in dem Verfahren der Erfindung die Pflanze aus der Gruppe gewählt, die aus Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, perennierendem bzw. winterhartem Gras, Viehfutterpflanzen, Gemüsepflanzen und Zierpflanzen besteht.
Vorzugsweise betrifft das Verfahren der Erfindung ferner den Schritt des Einbringens von einem RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmolekül, Ribozym, Antikörper und/oder Antisense-Nukleinsäure, welche entworfen wurde, um das Expressionsprodukt eines Gens anzusteuern, welches das Nukleinsäuremolekül umfasst, wie es hierin oben stehend charakterisiert ist, um einen Abbau bzw. eine Abnahme der mRNA des Gens von Interesse zu induzieren und dadurch die Genexpression stumm zu schalten bzw. zu silencen, oder von einer Expressionskassette, welche die Expression des ersteren sicherstellt.
Ferner betrifft in einer anderen Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe gewählt wird, die aus folgendem besteht:

a) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid, codiert, umfassend ein Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIB, Anwendung 1;
b) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1; oder
c) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, das als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes aus einer Polypeptidsequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIB, abgeleitet werden kann, und die Aktivätät aufweist, wie sie in Spalte 5 der Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist;
d) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid mit mindestens 50% Identität, vorzugsweise mindestens 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (c) codiert wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
e) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das isoliert wird mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (c) codiert wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
f) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, umfasst, die biologische Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II;
g) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
h) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das erhalten wird durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle III, Anmeldung Nr. 1, welche an ihrem 5'-Ende nicht mit den Nukleotiden ATA beginnen, und
i) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine der Sequenzen von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c), oder mit einem Fragment davon, enthaltend mindestens 17 nt des Nukleinsäuremoleküls, das in einem beliebigen von (a) bis (h) charakterisiert ist und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Protein, wie es in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist;

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung in einer anderen Ausführungsform ein RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Cosuppressionsmolekül, Ribozym, Antikörper oder Antisense-Nukleinsäuremolekül für die Reduzierung der oben stehend charakterisierten Aktivität oder der Aktivität oder Expression eines Nukleinsäuremoleküls, wie hierin oben stehend charakterisiert, oder ein durch das Nukleinsäuremolekül codiertes Polypeptid.
Vorzugsweise umfasst das RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Cosuppressionsmolekül, Ribozym oder Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Fragment von mindestens 17 nt des Nukleinsäuremoleküls, wie hierin oben stehend definiert.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein doppelsträngiges RNA (dsRNA)-, RNAi-, snRNA-, siRNA-, miRNA-, Antisense- oder ta-siRNA-Molekül oder Ribozym, das in der Lage ist, ein doppelsträngiges Ribonukleinsäuremolekül zu bilden, wobei ein Fragment von mindestens 17 nt des doppelsträngigen Ribonukleinsäuremoleküls eine Homologie von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% zu einem Nukleinsäuremolekül aufweist, welches aus der Gruppe gewählt wird, die aus Folgendem besteht:

(aa) einem isolierten-Nukleinsäuremolekül, wie hierin oben stehend charakterisiert;
(ab) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 oder 7 der Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist, oder das ein Polypeptid codiert, wie es in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist; und
(ac) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit der Aktivität vom Polypeptid, wie es in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle II aufgeführt ist, codiert, oder das Expressionsprodukt eines Polynukleotids codiert, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, wie es in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist.

Vorzugsweise sind in dem dsRNA-Molekül der Erfindung der Sense-Strang und der Antisense-Strang kovalent miteinander verbunden, und der Antisense-Strang ist im Wesentlichen das Komplementär des ”Sense”-RNA-Strangs.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein virales Nukleinsäuremolekül, welches die Abnahme von einem RNA-Molekül, welches die Expression von einem Protein mit der weiter oben charakterisierten Aktivität herbeiführt, oder von der Aktivität oder Expression eines Nukleinsäuremoleküls, wie hierin oben stehend charakterisiert oder einem Polypeptid, welches durch das Nukleinsäuremolekül codiert wird, herbeiführt.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform einen TILLING-Primer für die Identifizierung eines Knockouts eines Gens, welches eine Nukleinsäuresequenz eines Nukleinsäuremoleküls umfasst, wie in einer beliebigen von Spalte 5 oder 7 der Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform eine dominant-negative Mutante von Polypeptid, die ein Polypeptid umfasst, wie in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Nukleinsäuremolekül, das die oben stehend definierte dominant-negative Mutante codiert.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Nukleinsäurekonstrukt, das die Expression von RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta- siRNA-, Cosuppressionmolekül, Ribozym oder Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung, vom viralen Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder dem Nukleinsäuremolekül der Erfindung herbeiführt.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Nukleinsäurekonstrukt, welches das isolierte Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionmolekül, Ribozym oder Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das virale Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst, wobei das Nukleinsäuremolekül in funktionstüchtiger Weise an ein oder mehrere regulatorische Signale verknüpft bzw. gebunden ist.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform einen Vektor, welcher das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionmolekül, Ribozym oder Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das virale Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung umfasst.
Vorzugsweise befindet sich das Nukleinsäuremolekül in dem Vektor der Erfindung in funktionsfähiger Verknüpfung mit regulatorischen Sequenzen für die Expression in einem Pflanzenwirt.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform eine transgene Pflanzenwirtszelle, welche stabil oder transient mit dem Vektor der Erfindung, oder dem Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder dem Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung transformiert worden ist.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform eine Pflanzenzelle, eine Pflanze oder einen Teil davon, wobei die Aktivität eines Proteins, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotif umfasst, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, oder von einem Nukleinsäuremolekül, das ein Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, umfasst, reduziert ist.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren für die Herstellung eines Polypeptids, das durch eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung codiert wird, wobei das Polypeptid in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon der Erfindung exprimiert wird.
Vorzugsweise ist in dem Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Erfindung oder bei der Wirtszelle der Erfindung die Wirtszelle eine Pflanzenzelle, die aus der Gruppe ge wählt ist, die aus Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, perennierendem bzw. Winterhartem Gras, Viehfutterpflanzen, Gemüsepflanzen und Zierpflanzen besteht, oder sie ist ein Mikroorganismus wie oben stehend definiert.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein isoliertes Polypeptid, welches durch ein Nükleinsäuremolekül der Erfindung codiert wird, oder die das Polypeptid, wie in Spalte 7 von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, umfasst.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform einen Antikörper, welcher spezifisch an das Polypeptid der Erfindung bindet.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Pflanzengewebe, eine Pflanze, ein abgeerntetes Pflanzenmaterial oder Fortpflanzungsmaterial einer Pflanze, welche die Pflanzenzelle der Erfindung umfassen.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zum Screening nach einem Antagonisten einer Aktivität, wie in dem Verfahren der Erfindung oben stehend charakterisiert oder repräsentiert durch das Polypeptid, das von dem für das oben stehende Verfahren der Erfindung charakterisierten Nukleinsäuremolekül codiert wird, umfassend:

(a) Inkontaktbringen eines Organismus, seiner Zellen, seiner Gewebe oder seiner Teile, die das Polypeptid exprimieren, mit einer chemischen Verbindung oder einer Probe, welche eine Vielzahl chemischer Verbindungen enthält, unter Bedingungen, welche die Reduktion oder Deletion der Expression des Nukleinsäuremoleküls, das die von dem Protein repräsentierte Aktivität codiert, gestatten oder welche die Reduktion oder Deletion der Aktivität des Proteins gestatten;
(b) Assay hinsichtlich der Höhe der Aktivität des Proteins oder der Polypeptidexpressionshöhe in der Pflanze, ihren Zellen, Geweben oder Teilen davon, wobei die Pflanze, ihre Zellen, Gewebe oder Teile davon kultiviert oder gehalten werden; und
(c) Identifizieren eines Antagonisten durch Vergleichen der gemessenen Höhe der Aktivität des Proteins oder der Polypeptidexpressionshöhe mit einer Standardhöhe der Aktivität des Proteins oder der Polypeptidexpressionshöhe, welche in Abwesenheit der chemischen Verbindung oder einer Probe, welche die Vielzahl chemischer Verbindungen enthält, gemessen wird, wobei eine verringerte Höhe im Vergleich zum Stan dard zeigt, dass es sich bei der chemischen Verbindung oder der Probe, welche die Vielzahl chemischer Verbindungen enthält, um einen Antagonisten handelt.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche in einer Pflanze gesteigerten Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizient, wie eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze herbeiführt, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Kultivieren oder Halten einer Pflanze, einer Pflanzenzelle oder ihrer Gewebe oder eines Teils davon, welche(r) das Polypeptid mit der in dem oben stehenden Verfahren der Erfindung charakterisierten Aktivität oder das Polypeptid, das von dem in dem oben stehenden Verfahren charakterisierten Nukleinsäuremolekül codiert wird, oder ein das Polypeptid codierendes Polynukleotid sowie ein Ablesungssystem exprimiert, das zur Wechselwirkung mit dem Polypeptid unter geeigneten Bedingungen fähig ist, welche die Interaktion des Polypeptids mit diesem Ablesungssystem in Gegenwart einer chemischen Verbindung oder einer Probe, welche eine Vielzahl chemischer Verbindungen enthält, gestatten, und das zur Abgabe eines nachweisbaren Signals in Antwort auf die Bindung einer chemischen Verbindung an das Polypeptid unter Bedingungen fähig ist, welche die Depression bzw. Unterdrückung des Ablesungssystems und des Polypeptids erlauben; und
(b) Feststellen, ob die chemische Verbindung ein effektiver Antagonist ist, durch Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit oder Verringerung oder Erhöhung eines von dem Ablesungssystem erzeugten Signals.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung einer landwirtschaftlichen Zusammensetzung, welches die Schritte des Verfahrens für die Identifizierung einer Verbindung, die einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze, bei einer Pflanze, einer Pflanzenzelle oder einem Teil davon der Erfindung herbeiführt, und das Formulieren der Verbindung in einer für eine Anwendung in der Landwirtschaft annehmbaren Form umfasst.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform eine Zusammensetzung, die das Protein der Erfindung, das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, das Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung, den Vektor der Erfindung, den gemäß dem Verfahren zur Identifizierung eines Antagonisten der Erfindung identifizierten Antagonisten, den Antikörper der Erfindung, die Wirtszelle der Erfindung, das in dem Verfahren der Erfindung charakterisierte Nukleinsäuremolekül, das RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionmolekül, Ribozym oder Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung und gegebenenfalls einen annehmbaren landwirtschaftlichen Träger umfasst.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Lebensmittel oder Futtermittel, welches das Protein der Erfindung, das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, das Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung, den Vektor der Erfindung, den gemäß dem Verfahren zur Identifizierung eines Antagonisten der Erfindung identifizierten Antagonisten, den Antikörper der Erfindung, die Wirtszelle der Erfindung, das in dem Verfahren der Erfindung charakterisierte Nukleinsäuremolekül, das RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionmolekül, Ribozym oder Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung, die Pflanze, das Pflanzengewebe, das abgeerntete Pflanzenmaterial oder Fortpflanzungsmaterial einer Pflanze der Erfindung umfasst.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform die Verwendung des Proteins der Erfindung, des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, des Nukleinsäurekonstrukts der Erfindung, des Vektors der Erfindung, des gemäß dem Verfahren zur Identifizierung eines Antagonisten der Erfindung identifizierten Antagonisten, des Antikörpers der Erfindung, der Wirtszelle der Erfindung, des in dem Verfahren der Erfindung charakterisierten Nukleinsäuremoleküls, des RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionmoleküls, Ribozyms oder Antisense-Nukleinsäuremoleküls der Erfindung für die Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze.
Die Tabelle I zeigt die SEQ ID NR. von relevanten Polynukleotiden. Die Tabelle II zeigt die SEQ ID NR. von relevanten Polypeptiden. Die Tabelle IV zeigt die SEQ ID NR. von relevanten Konsensussequenzen und relevanten Polypeptidmotiven. In allen diesen Tabellen wurde die Abkürzung ”A. th.” für den Organismus ”Arabidopsis thaliana” verwendet.
Im Folgenden betrifft der Ausdruck ”Polypeptid, wie in der Tabelle II oder IV aufgeführt” auch ein Polypeptid, welches die Konsensussequenz oder mindestens ein Polypeptidmotiv, wie in Tabelle IV aufgeführt, umfasst.
Das Molekül, dessen Aktivität gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll zur Herbeiführung von dem erhöhten Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion im Vergleich mit einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze, z. B. von dem Molekül von I., II. und/oder III. weiter unten, ist im Folgenden das Molekül, ”dessen Aktivität in dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll”. Das Molekül kann zum Beispiel ein Polypeptid oder ein Nukleinsäuremolekül sein.
Dementsprechend betrifft die Erfindung mit anderen Worten ein Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere mit einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion im Vergleich mit einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität von: (I) mindestens einem Polypeptid, das ein Polypeptid umfasst, gewählt aus der Gruppe, die aus SEQ ID NR. 28, 61, 95, 133 und 172 oder einem Homologen davon besteht, wie in Spalte 7 der Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, oder das eine Konsensussequenz oder mindestens ein Polypeptidmotiv von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst; oder (II) mindestens einem Expressionsprodukt eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polynukleotid umfasst, gewählt aus der Gruppe, die aus SEQ ID NR. 27, 60, 94, 132 und 171 oder einem Homologen davon besteht, wie in Spalte 7 der Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie in Spalte 5 oder 7 der Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt; (III) oder einem funktionellen Äquivalent von (I) oder (II); in einer Pflanze oder einem Teil davon, und
(b) Erzeugen einer transformierten Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhter Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, und Wachsenlassen unter Bedingungen, welche die Entwicklung der Pflanze ermöglichen.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere mit einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion im Vergleich mit einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität von: (I) mindestens einem Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus der SEQ ID NR. 28, 61, 95, 133 und 172 oder einem Homologen davon besteht, wie in Spalte 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, oder das eine Konsensussequenz oder mindestens ein Polypeptidmotiv von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst; oder (II) mindestens einem Expressionsprodukt eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polynukleotid umfasst, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus der SEQ ID NR. 27, 60, 94, 132 und 171 oder einem Homologen davon besteht, wie in der Spalte 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie in Spalte 5 oder 7 der Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt; (III) oder einem funktionellen Äquivalent von (I) oder (II); in einer Pflanze oder einem Teil davon; und
(b) Erzeugen einer transformierten Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder einem/einer erhöhter Biomasseertrag/produktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, und Wachsenlassen unter Bedingungen, welche die Entwicklung der Pflanze ermöglichen.
(c) unter Bedingungen einer begrenzten Stickstoffzufuhr, (d) Selektieren des erhöhten Pflanzenertrags, insbesondere einer erhöhten etragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, nachdem der nicht-transformierte Wildtyp sichtbare Mangelsymptome und/oder Absterbesymptome zeigt, die z. B. einem nicht-transformierten Wildtyp entsprechen.

Überraschend wurde beobachtet, dass ein Knockout von mindestens einem Gen, das eine Aktivität herbeiführt, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und die SET-Domäne enthaltendem Protein besteht, oder von einem Gen, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die in Spalte 5 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, beschrieben wird, bei Arabidopsis thaliana eine Steigerung der NUE und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion in den transformierten Pflanzen im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, herbeiführte.
Insbesondere wurde beobachtet, dass der Knockout eines Gens, welches die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 27 umfasst, bei Arabidopsis thaliana einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion gegenüber der Wildtyp-Kontrolle herbeiführte.
Es wurde weiter beobachet, dass das Deletieren, Unterdrücken oder Reduzieren der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines ”At1g74730-Proteins”, das durch ein Gen codiert wird, welches die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 27 umfasst, bei Arabidopsis thaliana einen gesteigerten Ertrag, z. B. eine NUE und/oder erhöhte Biomasseproduktion, besonders einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasse im Vergleich mit der Wildtyp-Kontrolle herbeiführte.
Insbesondere wurde beobachtet, dass der Knockout eines Gens, welches die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 60 umfasst, bei Arabidopsis thaliana einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion gegenüber der Wildtyp-Kontrolle herbeiführte.
Es wurde weiter beobachet, dass das Deletieren, Unterdrücken oder Reduzieren der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines ”SET-Domäne enthaltenden Proteins”, das durch ein Gen codiert wird, welches die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 60 umfasst, bei Arabidopsis thaliana einen gesteigerten Ertrag, z. B. eine NUE und/oder erhöhte Biomasseproduktion, besonders einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasse im Vergleich mit der Wildtyp-Kontrolle herbeiführte.
Insbesondere wurde beobachtet, dass der Knockout eines Gens, welches die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 94 umfasst, bei Arabidopsis thaliana einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion gegenüber der Wildtyp-Kontrolle herbeiführte.
Es wurde weiter beobachet, dass das Deletieren, Unterdrücken oder Reduzieren der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines ”At3g63270-Proteins”, das durch ein Gen codiert wird, welches die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 94 umfasst, bei Arabidopsis thaliana einen gesteigerten Ertrag, z. B. eine NUE und/oder erhöhte Biomasseproduktion, besonders einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasse im Vergleich mit der Wildtyp-Kontrolle herbeiführte.
Insbesondere wurde beobachtet, dass der Knockout eines Gens, welches die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 132 umfasst, bei Arabidopsis thaliana einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion gegenüber der Wildtyp-Kontrolle herbeiführte.
Es wurde weiter beobachet, dass das Deletieren, Unterdrücken oder Reduzieren der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Protein-Serin/Threonin-Phosphatase”, die durch ein Gen codiert wird, welches die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 132 umfasst, bei Arabidopsis thaliana einen gesteigerten Ertrag, z. B. eine NUE und/oder erhöhte Biomasseproduktion, besonders einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasse im Vergleich mit der Wildtyp-Kontrolle herbeiführte.
Insbesondere wurde beobachtet, dass der Knockout eines Gens, welches die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 171 umfasst, bei Arabidopsis thaliana einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion gegenüber der Wildtyp-Kontrolle herbeiführte.
Es wurde weiter beobachet, dass das Deletieren, Unterdrücken oder Reduzieren der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Proteinkinase”, die durch ein Gen codiert wird, welches die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 171 umfasst, bei Arabidopsis thaliana einen gesteigerten Ertrag, z. B. eine NUE und/oder erhöhte Biomasseproduktion, besonders einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasse im Vergleich mit der Wildtyp-Kontrolle herbeiführte.
So kann gemäß dem Verfahren der Erfindung für einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder ein erhöhter Biomasseertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhter Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon im Vergleich mit einer Kontrolle oder einem Wildtyp erreicht werden.
Dementsprechend wird in einer Ausführungsform in dem Fall, wo die Aktivität des A. thaliana-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure SEQ ID NR. 27 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 28 umfasst, reduziert ist oder in dem Fall, wo bei einem anderen Organismus die Aktivität des nativen Homolgen des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids deletiert, unterdrückt oder reduziert ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, jeweils in der derselben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NR. 27 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 28, reduziert ist oder wenn die Aktivität ”At1g74730-Protein” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist, vorzugsweise ein erhöhter Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich mit der Wildtyp-Kontrolle bei der Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, besonders eine gesteigerte NUE, oder eine erhöhte Biomasseproduktion, oder eine gesteigerte NUE und eine erhöhte Biomasseproduktion herbeigeführt.
Eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze wird herbeigeführt, wenn die Aktivität des A. thaliana-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure SEQ ID NR. 27 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 28 umfasst, reduziert ist oder in dem Fall, wo bei einem anderen Organismus die Aktivität des nativen Homolgen des Nuk leinsäuremoleküls oder Polypeptids deletiert, unterdrückt oder reduziert ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, jeweils in der derselben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NR. 27 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 28, reduziert ist oder wenn die Aktivität ”At1g74730-Protein” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz herbeigeführt.
Zum Beispiel wird eine Erhöhung des Ertrags um das 1,05- bis 1,20-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Bedingungen eines Stickstoffmangels im Vergleich mit einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze herbeigeführt.
Dementsprechend wird in einer Ausführungsform in dem Fall, wo die Aktivität des A. thaliana-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure SEQ ID NR. 60 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 61 umfasst, reduziert ist oder in dem Fall, wo bei einem anderen Organismus die Aktivität des nativen Homolgen des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids deletiert, unterdrückt oder reduziert ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, jeweils in der derselben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NR. 60 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 61, reduziert ist oder wenn die Aktivität ”SET-Domäne-enthaltendes Protein” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist, vorzugsweise ein erhöhter Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich mit der Wildtyp-Kontrolle bei der Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, besonders eine gesteigerte NUE, oder eine erhöhte Biomasseproduktion, oder eine gesteigerte NUE und eine erhöhte Biomasseproduktion herbeigeführt.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon herbeigeführt, wenn die Aktivität des A. thaliana-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure SEQ ID NR. 60 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 61 umfasst, reduziert ist oder in dem Fall, wo bei einem anderen Organismus die Aktivität des nativen Homolgen des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids deletiert, unterdrückt oder reduziert ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, jeweils in der derselben Zeile wie das Nuklein säuremolekül SEQ ID NR. 60 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 61, reduziert ist oder wenn die Aktivität ”SET-Domäne enthaltendes Protein” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz herbeigeführt.
Zum Beispiel wird eine Erhöhung des Ertrags um das 1,05- bis 1,11-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Bedingungen eines Stickstoffmangels im Vergleich mit einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze herbeigeführt.
Dementsprechend wird in einer Ausführungsform in dem Fall, wo die Aktivität des A. thaliana-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure SEQ ID NR. 94 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 95 umfasst, reduziert ist oder in dem Fall, wo bei einem anderen Organismus die Aktivität des nativen Homolgen des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids deletiert, unterdrückt oder reduziert ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, jeweils in der derselben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NR. 94 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 95, reduziert ist oder wenn die Aktivität ”At3g63270-Protein” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist, vorzugsweise ein erhöhter Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich mit der Wildtyp-Kontrolle in der Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, besonders eine gesteigerte NUE, oder eine erhöhte Biomasseproduktion, oder eine gesteigerte NUE und eine erhöhte Biomasseproduktion herbeigeführt.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon herbeigeführt, wenn die Aktivität des A. thaliana-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure SEQ ID NR. 94 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 95 umfasst, reduziert ist oder in dem Fall, wo bei einem anderen Organismus die Aktivität des nativen Homolgen des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids deletiert, unterdrückt oder reduziert ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, jeweils in derselben Zeile wie das Nukleinsäure molekül SEQ ID NR. 94 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 95, reduziert ist oder wenn die Aktivität ”At3g63270-Protein” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz herbeigeführt.
Zum Beispiel wird eine Erhöhung des Ertrags um das 1,05- bis 1,23-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Bedingungen eines Stickstoffmangels im Vergleich mit einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze herbeigeführt.
Dementsprechend wird in einer Ausführungsform in dem Fall, wo die Aktivität des A. thaliana-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure SEQ ID NR. 132 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 133 umfasst, reduziert ist oder in dem Fall, wo bei einem anderen Organismus die Aktivität des nativen Homolgen des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids deletiert, unterdrückt oder reduziert ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, jeweils in der derselben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NR. 132 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 133, reduziert ist oder wenn die Aktivität ”Protein-Serin/Threonin-Phosphatase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist, vorzugsweise ein erhöhter Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich mit der Wildtyp-Kontrolle in der Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, besonders eine gesteigerte NUE, oder eine erhöhte Biomasseproduktion, oder eine gesteigerte NUE und eine erhöhte Biomasseproduktion herbeigeführt.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon herbeigeführt, wenn die Aktivität des A. thaliana-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure SEQ ID NR. 132 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 133 umfasst, reduziert ist oder in dem Fall, wo bei einem anderen Organismus die Aktivität des nativen Homolgen des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids deletiert, unterdrückt oder reduziert ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, jeweils in der derselben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NR. 132 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 133, reduziert ist oder wenn die Aktivität ”Protein-Serin/Threonin-Phosphatase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz herbeigeführt.
Zum Beispiel wird eine Erhöhung des Ertrags um das 1,05- bis 1,10-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Bedingungen eines Stickstoffmangels im Vergleich mit einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze herbeigeführt.
Dementsprechend wird in einer Ausführungsform in dem Fall, wo die Aktivität des A. thaliana-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure SEQ ID NR. 171 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 172 umfasst, reduziert ist oder in dem Fall, wo bei einem anderen Organismus die Aktivität des nativen Homolgen des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids deletiert, unterdrückt oder reduziert ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, jeweils in der derselben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NR. 171 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 172, reduziert ist oder wenn die Aktivität ”Proteinkinase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist, vorzugsweise ein erhöhter Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich mit der Wildtyp-Kontrolle bei der Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, besonders eine gesteigerte NUE, oder eine erhöhte Biomasseproduktion, oder eine gesteigerte NUE und eine erhöhte Biomasseproduktion herbeigeführt.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon herbeigeführt, wenn die Aktivität des A. thaliana-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure SEQ ID NR. 171 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 172 umfasst, reduziert ist oder in dem Fall, wo bei einem anderen Organismus die Aktivität des nativen Homolgen des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids deletiert, unterdrückt oder reduziert ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, jeweils in der derselben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NR. 171 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 172, reduziert ist oder wenn die Aktivität ”Proteinkinase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz herbeigeführt.
Zum Beispiel wird eine Erhöhung des Ertrags um das 1,05- bis 1,30-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Bedingungen eines Stickstoffmangels im Vergleich mit einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze herbeigeführt.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz, im Vergleich mit einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze her beigeführt, wenn die Aktivität des A. thaliana-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure SEQ ID NR. 171 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 172 umfasst, reduziert ist oder in dem Fall, wo bei einem anderen Organismus die Aktivität des nativen Homolgen des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids deletiert, unterdrückt oder reduziert ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, jeweils in der derselben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NR. 171 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 172, reduziert ist oder wenn die Aktivität ”Proteinkinase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist.
Zum Beispiel wird eine Erhöhung des Ertrags um das 1,1- bis 1,15-Fache, oder zum Beispiel plus mindestens 20%, oder mindestens 100% davon, unter Bedingungen einer niedrigen Temperatur im Vergleich mit einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze herbeigeführt.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich mit einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon herbeigeführt, wenn die Aktivität des A. thaliana-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure SEQ ID NR. 171 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 172 umfasst, reduziert ist oder in dem Fall, wo bei einem anderen Organismus die Aktivität des nativen Homolgen des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids deletiert, unterdrückt oder reduziert ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, jeweils in der derselben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NR. 171 bzw. das Polypeptid SEQ ID NR. 172, reduziert ist oder wenn die Aktivität ”Proteinkinase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist.
Bei einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit eines Nährstoffmangels sowie von Stressbedingungen herbeigeführt.
Zum Beispiel wird eine Erhöhung des Ertrags um das 1,05- bis 1,19-Fache, zum Beispiel plus mindestens 20%, oder mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit eines Nährstoffmangels sowie Stressbedingungen im Vergleich mit einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze herbeigeführt.
Die oben stehend angegebenen Verhältnisse beziehen sich besonders auf einen erhöhten Ertrag, der tatsächlich als Zunahme der Biomasse gemessen wurde, besonders als Frischgewichtbiomasse von oberirdischen Teilen.
In einer Ausführungsform wird die Reduktion oder Deletion einer Aktivität, die durch ein Nukleinsäuremolekül, das in Tabelle Va angegeben ist, oder dessen Homolog wie in Tabelle I angegeben oder das Expressionsprodukt eines Gens, welches das Nukleinsäuremolekül umfasst, in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet zur Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, z. B. zur Erhöhung der Stickstoffverwertungseffizienz einer Pflanze im Vergleich zu der Wildtyp-Kontrolle.
In einer Ausführungsform wird die Reduktion oder Deletion einer Aktivität, die durch ein Nukleinsäuremolekül, das in Tabelle Vb angegeben ist, oder dessen Homolog, wie in Tabelle I angegeben, oder das Expressionsprodukt eines Gens, welches das Nukleinsäuremolekül umfasst, in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet zur Erhöhung der Stresstoleranz, z. B. zur Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz einer Pflanze im Vergleich zu der Wildtyp-Kontrolle.
In einer Ausführungsform wird die Reduktion oder Deletion einer Aktivität, die durch ein Nukleinsäuremolekül, das in Tabelle Vd angegeben ist, oder dessen Homolog, wie in Tabelle I angegeben, oder das Expressionsprodukt eines Gens, welches das Nukleinsäuremolekül umfasst, in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet zur Erhöhung des intrinsischen Ertrags, z. B. zur Erhöhung des Ertrags unter Standardbedingungen, z. B. zur Erhöhung der Biomasse unter Nicht-Mangel- oder Nicht-Stress-Bedingungen einer Pflanze im Vergleich zu der Wildtyp-Kontrolle.
Für die Zwecke der Erfindung soll gelten, dass die Mehrzahl in der Regel die Einzahl einschließt und umgekehrt.
Außer es ist anderslautend angegeben, sind die Begriffe ”Polynukleotide”, ”Nukleinsäure” und ”Nukleinsäuremolekül” im vorliegenden Kontext austauschbar. Außer es ist anderslautend angegeben, sind die Begriffe ”Peptid”, ”Polypeptid” und ”Protein” im vorliegenden Kontext austauschbar.
Der Begriff ”Sequenz” kann Polynukleotide, Nukleinsäuren, Nukleinsäuremoleküle, Peptide, Polypeptide und Proteine betreffen, abhängig vom Zusammenhang, in dem der Begriff ”Sequenz” verwendet wird. Die Begriffe ”Gen(e)”, ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäuresequenz”, ”Nukleotidsequenz” oder ”Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine polymere Form von Nukleotiden von beliebiger Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide. Die Begriffe betreffen lediglich die Primärstruktur des Moleküls.
So schließen die Begriffe ”Gen(e)”, ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäuresequenz”, ”Nukleotidsequenz” oder ”Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, doppel- und einzelsträngige DNA und/oder RNA ein. Sie beinhalten außerdem bekannte Arten von Modifikationen, zum Beispiel Methylierung, ”Caps” und Substitutionen von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog. Vorzugsweise umfasst die DNA- oder RNA-Sequenz eine codierende Sequenz, die das hierin definierte Polypeptid codiert.
Eine ”codierende Sequenz” ist eine Nukleotidsequenz, welche in eine RNA transkribiert wird, z. B. eine regulatorische RNA, wie eine miRNA, eine ta-siRNA, ein Cosuppressionsmolekül, eine RNAi, ein Ribozym, etc., oder in eine mRNA, die in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Regulation bzw. Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gebracht wird. Die Grenzen der codierenden Sequenzen werden von einem Translations-Startcodon am 5'-Terminus und einem Translations-Stopcodon am 3'-Terminus festgelegt. Eine codierende Sequenz kann, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, mRNA, cDNA, rekombinante Nukleotidsequenzen oder genomische DNA einschließen, während Introns unter gewissen Umständen ebenfalls vorhanden sein können.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, kann ein Nukleinsäuremolekül auch die untranslatierte Sequenz umfassen, die sich am 3'-Ende und am 5'-Ende der codierenden Genregion befindet, beispielsweise mindestens 500, vorzugsweise 200, besonders bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts vom 5'-Ende der codierenden Region, und mindestens 100, vorzugsweise 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts vom 3'-Ende der codierenden Genregion. Für den Fall, dass zum Beispiel die Technologie mit Antisense, RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Cosuppressionsmolekül, Ribozym etc. angewandt wird, können sowohl codierende Regionen als auch die 5'- und/oder 3'-Regionen in vorteilhafter Weise verwendet werden.
Allerdings ist es häufig vorteilhaft, für Klonierungs- und Expressionszwecke lediglich die codierende Region zu wählen.
”Polypeptid” bezieht sich auf ein Aminosäurepolymer (Aminosäuresequenz) und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Moleküls. Daher sind Peptide und Oligopeptide innerhalb der Definition von Polypeptid eingeschlossen. Dieser Begriff betrifft oder beinhaltet auch post-translationale Modifikationen des Polypeptids, zum Beispiel Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen. Innerhalb der Definition sind beispielsweise Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (einschließlich zum Beispiel unnatürlichen Aminosäuren, etc.), Polypeptide mit substituierten Bindungen sowie sonstige im Fachgebiet bekannte, sowohl natürlich vorkommende als auch nicht-natürlich vorkommende, Modifikationen inbegriffen.
Es versteht sich, dass der in dieser Patentbeschreibung verwendete Begriff ”Tabelle I” den Inhalt von Tabelle IA und Tabelle IB bezeichnet. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle II” soll herangezogen werden, um den Inhalt von Tabelle IIA und Tabelle IIB zu bezeichnen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle IA” soll herangezogen werden, um den Inhalt von Tabelle IA zu bezeichnen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle IB” soll den Inhalt von Tabelle IB bezeichnen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle IIA” soll den Inhalt von Tabelle IIA bezeichnen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle IIB” soll den Inhalt von Tabelle IIB bezeichnen. In einer bevorzugten Ausführungsform, bedeutet der Begriff ”Tabelle I” die Tabelle IB. In einer bevorzugten Ausführungsform, bedeutet der Begriff ”Tabelle II” die Tabelle IIB.
Die Begriffe ”umfassen” oder ”umfassend” und grammatikalische Variationen davon, falls in dieser Beschreibung verwendet, sollen das Vorliegen der angegebenen Merkmale, ganzen Zahlen, Schritte oder Komponenten oder Gruppen davon bezeichnen, aber das Vorliegen oder die Hinzufügung von einem oder mehreren anderen Merkmalen, ganzen Zahlen, Schritten, Komponenten oder Gruppen davon nicht ausschließen.
Gemäß der Erfindung bezieht sich der Begriff ”Organismus”, wie hierin zu verstehen, stets auf einen nicht-humanen Organismus, insbesondere auf einen pflanzlichen Organismus, den gesamten Organismus, Gewebe, Organe oder Zelle(n) davon.
Die Tripletts taa, tga und tag repräsentieren die (gewöhnlichen) Stop-Codons, welche austauschbar sind.
Die Begriffe ”Reduktion”, ”Unterdrückung”, ”Verringerung” oder ”Deletion” beziehen sich auf eine entsprechende Änderung einer Eigenschaft in einem Organismus, einem Teil eines Organismus, wie etwa einem Gewebe, Samen, Wurzel, Wurzelknolle, Frucht, Blatt, Blüte, etc., oder in einer Zelle. Unter ”Änderung einer Eigenschaft” wird verstanden, dass die Aktivität, der Expressionsspiegel oder die Menge eines Genproduktes, oder ein Metabolit-Gehalt, in einem speziellen Volumen oder in einer speziellen Menge von Protein relativ zu einem entsprechenden Volumen oder einer entsprechenden Menge an Protein einer Kontrolle, Referenz oder eines Wildtyps verändert wird. Vorzugsweise ist die Gesamtaktivität in dem Volumen in solchen Fällen reduziert, verringert oder deletiert, wenn die Reduktion, Verringerung oder Deletion mit der Reduktion, Verringerung oder Deletion einer Aktivität eines Genproduktes zusammenhängt, unabhängig davon, ob die Menge an Genprodukt oder die spezifische Aktivität des Genproduktes, oder beide, reduziert, verringert oder deletiert werden, oder ob die Menge, Stabilität oder Translationseffizienz der Nukleinsäuresequenz oder des das Genprodukt codierenden Gens reduziert, verringert oder deletiert wird.
Die Begriffe ”Reduktion”, ”Unterdrückung”, Verringerung” oder ”Deletion” schließen die Veränderung der Eigenschaft lediglich in Teilen des Subjekts der vorliegenden Erfindung ein, beispielsweise kann die Modifikation in einem Kompartiment einer Zelle, wie einer Organelle, oder in einem Teil einer Pflanze, wozu, ohne Einschränkung darauf, Gewebe, Samen, Wurzel, Blatt, Knolle, Frucht, Blüte, etc., gehören, gefunden werden, aber ist nicht nachweisbar, wenn das gesamte Subjekt, z. B. die vollständige Zelle oder Pflanze, getestet wird. Vorzugsweise findet sich die ”Reduktion”, ”Unterdrückung”, ”Verringerung” oder ”Deletion” zellulär, weshalb sich der Ausdruck ”Reduktion, Verringerung oder Deletion einer Aktivität” oder ”Reduktion, Verringerung oder Deletion eines Metabolit-Gehaltes” auf die zelluläre Reduktion, Verringerung oder Deletion, verglichen mit der Wildtyp-Zelle, bezieht. Darüber hinaus schließen die Begriffe ”Reduktion”, ”Unterdrückung”, ”Verringerung” oder ”Deletion” die Veränderung der Eigenschaft nur während verschiedener Wachstumsphasen des im Verfahren der Erfindung verwendeten Organismus ein, wobei zum Beispiel die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion nur während des Samenwachstums oder während der Blütezeit stattfindet. Ferner beinhalten die Begriffe eine vorübergehende Reduktion, Verringerung oder Deletion, beispielsweise weil die angewandte Methode, z. B. der Antisense, die RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, das Cosuppressions-Molekül oder das Ribozym, nicht stabil in das Genom des Organismus integriert wird, oder weil die Reduktion, Verringerung, Unterdrückung oder Deletion unter der Steuerung eines regulatorischen oder induzierbaren Elementes, z. B. eines chemisch oder anderweitig induzierbaren Promotors, steht und deshalb nur einen vorübergehenden Effekt aufweist.
Folglich bedeutet der Begriff ”Reduktion”, ”Unterdrückung”, ”Verringerung” oder ”Deletion”, dass die spezifische Aktivität eines Genproduktes, eines Enzyms oder eines anderen Proteins oder einer regulatorischen RNA, sowie die Menge einer Verbindung oder eines Metaboliten, z. B. eines Polypeptids, eines Nukleinsäuremoleküls oder einer codierenden mRNA oder DNA, in einem spezifischen Volumen reduziert, verringert oder deletiert werden kann. Die Begriffe ”Reduktion ”Unterdrückung”, ”Verringerung” oder ”Deletion” beinhalten, dass der Grund für die besagte ”Reduktion”, ”Unterdrückung”, ”Verringerung” oder ”Deletion” eine chemische Verbindung sein könnte, welche an den Organismus oder einen Teil davon verabreicht wird.
Überall in der Beschreibung bedeutet eine Deletion der Aktivität oder der Expression eines Expressionsproduktes, z. B. eines Proteins, wie dargestellt in der Tabelle II, einen vollständigen Verlust der Aktivität. Die Begriffe ”Reduktion”, ”Unterdrückung” oder ”Verringerung” sind austauschbar. Der Begriff ”Reduktion” soll die Begriffe ”Unterdrückung”, ”Verringerung” oder ”Deletion” einschließen, wenn es nicht anderslautend angegeben ist.
Der Begriff ”reduzierend”, ”unterdrückend”, ”verringernd” oder ”deletierend”, wie hierin verwendet, umfasst ebenfalls den Begriff ”mindernd”, ”abreichernd”, ”vermindernd” oder ”absenkend”.
Es versteht sich, dass Reduktion ebenfalls die Modifikation der Substratspezifität bedeutet, wie sie beispielsweise durch den kcat/Km-Wert ausgedrückt werden kann. In diesem Zusammenhang wird die Funktion oder Aktivität, z. B. die enzymatische Aktivität oder die ”biologische Aktivität” um mindestens 10%, vorteilhafterweise 20%, vorzugsweise 30%, besonders bevorzugt 40%, 50% oder 60%, sehr speziell bevorzugt 70%, 80%, 85% oder 90% oder mehr, sehr speziell bevorzugt 95%, stärker bevorzugt 99% oder mehr, im Vergleich zur Kontrolle, Referenz oder zum Wildtyp reduziert. Am stärksten bevorzugt beläuft sich die Reduktion, Verringerung oder Deletion der Aktivität im wesentlichen auf 100%. Somit besteht eine besonders vorteilhafte Ausführungsform in der Inaktivierung der Funktion einer Verbindung, z. B. eines Polypeptids oder eines Nukleinsäuremoleküls.
Die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion des Expressionsspiegels oder der Aktivität führt zu einem erhöhten Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhter Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze von 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 150% oder 200% oder mehr, vorzugsweise 250% oder 300% oder mehr, besonders bevorzugt 350% oder 400% oder mehr, am stärksten bevorzugt von 500% oder 600% w/w, oder mehr, ausgedrückt als Vielfaches, um das die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zur Referenz oder zum Wildtyp zeigt.
Der Begriff ”Aktivität” einer Verbindung bezieht sich auf die Funktion einer Verbindung in einem biologischen System, wie einer Zelle, einem Organ oder einem Organismus. Zum Beispiel bezieht sich der Begriff ”Aktivität” einer Verbindung auf die enzymatische Funktion, regulatorische Funktion oder ihre Funktion als Bindungspartner, Transporter, Regulator oder Träger, etc., einer Verbindung.
In einer Ausführungsform bezieht sich der Begriff ”biologische Aktivität” auf eine Aktivität, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendes Protein, gemäß des entsprechenden Zusammenhangs.
Die Begriffe ”Steigern”, ”Erhöhen”, ”Verringern”, ”Unterdrücken” oder ”Reduzieren” oder ähnliche Begriffe schließen die Änderung oder die Modulation der Eigenschaft in lediglich einem oder einigen Teil(en) ebenso wie in allen Teilen des Subjektes der vorliegenden Erfindung ein. Zum Beispiel kann sich die Modifikation in einem Kompartiment einer Zelle, wie einer Organelle, oder vorzugsweise in einem Teil einer Pflanze, wie einem Gewebe, Samen, Wurzel, Blatt, Frucht, Wurzelknolle, Blüte, etc., finden, aber ist nicht nachweisbar, wenn das gesamte Subjekt, d. h. die vollständige Zelle oder Pflanze, getestet wird.
Stärker bevorzugt ist der Befund, dass eine Änderung oder eine Modulation der Eigenschaft in mehr als einem Teil eines Organismus, insbesondere von einer Pflanze, gefunden wird.
Somit wird, in einer Ausführungsform, die Änderung oder die Modulation der Eigenschaft in einem Gewebe, Samen, Wurzel, Frucht, Knolle, Blatt und/oder Blüte einer Pflanze, welche gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, gefunden.
Allerdings beinhalten die Begriffe ”Steigern”, ”Erhöhen”, ”Verringern”, ”Unterdrücken” oder ”Reduzieren”, oder ähnliche Begriffe, wie hierin verwendet, ebenfalls die Änderung oder Modulation der Eigenschaft im ganzen Organismus, wie erwähnt.
Die Begriffe ”gesteigert” oder ”Erhöhung” bedeuten eine(n) um 10%, 20%, 30%, 40% oder 50% oder höher, vorzugsweise wenigstens eine um 60%, 70%, 80%, 90% oder 100% oder höher, weiter bevorzugt 150%, 200%, 300%, 400% oder 500% oder mehr, erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze. In einer Ausführungsform wird die Erhöhung berechnet, wie es in den Beispielen gezeigt ist.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird die gesteigerte NUE gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt und quantifiziert:
Transformierte Pflanzen werden in Blumentöpfen in einer Wachstumskammer (Svalöf Weibull, Svalöv, Schweden) wachsen gelassen. In dem Fall, dass es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, werden Samen davon in Blumentöpfen ausgesät, welche eine 1:1(v:v)-Mischung von nährstoffabgereicherter Erde (”Einheitserde Typ 0”, 30% Ton, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand enthalten. Die Keimung wird durch eine viertägige Periode bei 4°C, im Dunklen, induziert. Anschließend werden die Pflanzen unter Standard-Wachstumsbedingungen wachsen gelassen. In dem Fall, dass es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, sind die Standard-Wachstumsbedingungen folgende: Photoperiode von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, und eine Photonenflux-Dichte von 200 μE. Die Pflanzen werden herangezogen und kultiviert. In dem Fall, dass es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, werden sie jeden zweiten Tag mit einer N-abgereicherten Nährstofflösung bewässert. Die N-abgereicherte Nährstofflösung enthält z. B. unterhalb bzw. neben Wasser μ

Mineral-Nährstoff	Endkonzentration
KCl	3,00 mM
MgSO₄ × 7H2O	0,5 mM
CaCl₂ × 6H2O	1,5 mM
K₂SO₂	1,5 mM
NaH₂PO₄	1,5 mM
Fe-EDTA	40 μM
H₃BO₃	25 μM
MnSO₄ × H₂O	1 μM
ZnSO₄ × 7H₂O	0,5 μM
Cu₂SO₄ × 5H₂O	0,3 μM
Na₂MoO₄ × 2H₂O	0,05 μM

und kein weiteres N-haltiges Salz.

Nach 9 bis 10 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Nach einer Gesamtzeit von 29 bis 31 Tagen werden die Pflanzen geerntet und in Hinsicht auf das Frischgewicht der oberirdischen Teile der Pflanzen, vorzugsweise der Rosetten, bewertet.
Der Begriff ”Referenz”, ”Kontrolle” oder ”Wildtyp” bedeutet einen Organismus ohne die zuvor erwähnte Modifikation der Expression oder Aktivität eines Expressionsproduktes eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, angegeben in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, oder der Aktivität eines Proteins, aufweisend die Aktivität eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, angegeben in Tabelle II oder IV, Spalte 5 oder 7, oder der Aktivität eines Proteins, codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 angegeben ist.
Mit anderen Worten bezeichnet Wildtyp (a) den Organismus, der die unveränderte (üblicherweise die ”normale”) Form eines Gens oder Allels trägt; (b) den Laboratoriums-Vorratsstamm, aus dem die Mutanten abgeleitet werden. Das Adjektiv ”wildtyp” kann sich auf den Phänotyp oder den Genotyp beziehen.
Eine ”Referenz”, ”Kontrolle” oder ”Wildtyp” ist insbesondere eine Zelle, ein Gewebe, ein Organ, eine Pflanze oder ein Teil davon, welche(s) nicht gemäß dem Verfahren der Erfindung erzeugt wurde.
Folglich sind die Begriffe ”Wildtyp”, ”Kontrolle” oder ”Referenz” austauschbar und können eine Zelle oder ein Teil von Organismen, wie eine Organelle oder ein Gewebe, oder ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, sein, welche(r) nicht gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren gemäß der Erfindung modifiziert oder behandelt worden ist. Folglich entspricht die Zelle oder ein Teil von Organismen, wie eine Organelle oder ein Gewebe, oder ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, welche(r) als Wildtyp, Kontrolle oder Referenz verwendet wird, so weit wie möglich der Zelle, dem Organismus oder dem Teil davon, und ist in jedweder anderen Eigenschaft, außer dem Ergebnis des Verfahrens der Erfindung, bestmöglich identisch zum Gegenstandssubjekt der Erfindung. Daher wird der Wildtyp, die Kontrolle oder die Referenz identisch oder bestmöglich identisch behandelt, womit besagt wird, dass nur Bedingungen oder Eigenschaften verschieden sein könnten, welche die Qualität der getesteten Eigenschaft nicht beeinflussen.
Vorzugsweise wird jeder Vergleich unter analogen Bedingungen durchgeführt. Der Begriff ”analoge Bedingungen” bedeutet, dass alle Bedingungen, wie zum Beispiel Kultur- oder Wachstumsbedingungen, Assay-Bedingungen (wie etwa Pufferzusammensetzung, Temperatur, Substrate, Pathogenstamm, Konzentrationen und dergleichen) unter den zu vergleichenden Experimenten identisch gehalten werden.
Bei der ”Referenz”, ”Kontrolle” oder dem ”Wildtyp” handelt es sich vorzugsweise um ein Subjekt, z. B. eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe, einen Organismus, insbesondere eine Pflanze, das nicht gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren der Erfindung modifiziert oder behandelt worden ist und in jedweder anderen Eigenschaften so ähnlich zum Gegenstandssubjekt der Erfindung ist, wie möglich. Die Referenz, Kontrolle oder der Wildtyp ist hinsichtlich seines Genoms, Transkriptoms, Proteoms oder Metaboloms so ähnlich wie möglich zum Subjekt der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff ”Referenz-”, ”Kontroll-” oder ”Wildtyp-” Organelle, -Zelle, -Gewebe oder -Organismus, insbesondere -Pflanze, auf eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus, insbesondere eine Pflanze, welche(s) zu der Organelle, Zelle, dem Gewebe oder Organismus, insbesondere Pflanze, der vorliegenden Erfindung, oder einem Teil davon, beinahe genetisch identisch ist, und zwar vorzugsweise zu 95%, weiter bevorzugt zu 98%, noch weiter bevorzugt zu 99,00%, insbesondere 99,10%, 99,30%, 99,50%, 99,70%, 99,90%, 99,99%, 99,999% oder mehr. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei der ”Referenz”, ”Kontrolle” oder dem ”Wildtyp” vorzugsweise um ein Subjekt, z. B. eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe, einen Organismus, der/die genetisch identisch zu dem Organismus, der Zelle, der Organelle ist, welche(r) gemäß dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, mit der Ausnahme, dass Nukleinsäuremoleküle, oder das von ihnen codierte Genprodukt, gemäß dem Verfahren der Erfindung verändert oder modifiziert sind.
In dem Fall, dass eine Kontrolle, Referenz oder ein Wildtyp, welche(r) sich vom Subjekt der vorliegenden Erfindung nur dadurch unterscheidet, dass sie/er nicht dem Verfahren der Erfindung unterzogen wird, nicht bereitgestellt werden kann, kann es sich bei einer Kontrolle, Referenz oder einem Wildtyp um einen Organismus handeln, in welchem die Ursache für die Modulation der Aktivität, welche den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, wie hierin beschrieben, vermittelt, zurück- oder ausgeschaltet worden ist, z. B. durch Komplementation des verantwortlichen, reduzierten Genproduktes, z. B. durch stabile oder vorübergehende (Über)expression, durch Aktivierung eines Aktivators oder Agonisten, durch Inaktivierung eines Inhibitors oder Antagonisten, durch Zusetzen von aktiven Verbindungen, wie z. B. Hormonen, durch Einbringen von Enhancern, etc.
Folglich ist das bevorzugte Referenzsubjekt das Ausgangssubjekt des vorliegenden Verfahrens der Erfindung.
Vorzugsweise werden die Referenz und das Gegenstandssubjekt der Erfindung nach Standardisierung und Normierung, z. B. hinsichtlich der Menge an Gesamt-RNA, -DNA oder -Protein, oder der Aktivität oder Expression von Referenzgenen, wie Haushaltsgenen, wie etwa bestimmten Aktin- oder Ubiquitin-Genen, verglichen.
Vorzugsweise unterscheidet sich die Referenz, Kontrolle oder der Wildtyp vom Subjekt der vorliegenden Erfindung nur hinsichtlich der zellulären Aktivität des Polypeptids oder der RNA, welche(s) im Verfahren der Erfindung verwendet wird, z. B. als Ergebnis einer Reduktion, Verringerung oder Deletion des Spiegels des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung oder einer Reduktion, Verringerung oder Deletion der spezifischen Aktivität des Polypeptids oder der RNA, welche(s) im Verfahren der Erfindung verwendet wird, z. B. durch den Expressionsspiegel oder die Aktivität von Protein oder RNA, d. h. durch Reduktion oder Inhibition ihrer/seiner biologischen Aktivität und/oder von deren biochemischen oder genetischen Ursachen.
Der Ausdruck ”Expression” bezieht sich auf die Transkription und/oder Translation eines codogenen Gensegmentes oder Gens. In der Regel ist das resultierende Produkt eine mRNA oder ein Protein. Allerdings können Expressionsprodukte auch funktionelle RNAs einschließen, wie zum Beispiel Antisense, tRNAs, snRNAs, rRNAs, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, ta-siRNA, Cosuppressionsmoleküle, Ribozyme, etc. Eine Expression kann systemisch, lokal oder temporal sein, wobei sie zum Beispiel auf bestimmte Zelltypen, Gewebe, Organe oder Zeitperioden begrenzt ist.
Der Begriff ”Expression” bedeutet die Transkription eines Gens in eine RNA (z. B. rRNA, tRNA, miRNA, dsRNA, snRNA, ta-siRNA, siRNA) oder Botschafter-RNA (mRNA). Somit bedeutet der Begriff ”Expression” die Expression eines Gens mit oder ohne anschließende Translation des Letzteren in ein Protein. Experimentell kann die Expression auf der RNA-Ebene durch allgemein bekannte Verfahren detektiert werden, z. B. Northern-Blotting, Array-Hybridisierungen, qRT-PCR, Transkriptions-Run-On-Assays. Ferner kann die Expression auf der Polypeptidebene durch allgemein bekannte Verfahren detektiert werden, z. B. Western-Blotting oder andere Immuno-Assays.
Der Begriff ”funktionelles Äquivalent” eines Polypeptids, wie in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle II angezeigt, ist ein Polypeptid, welches im wesentlichen die Aktivität eines Polypeptids, wie angezeigt in der Spalte 5 von Tabelle II, vermittelt.
Der Begriff ”funktionelles Äquivalent” eines Nukleinsäuremoleküls, wie es in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I aufgeführt ist, bezeichnet ein Polynukleotid, welches im wesentlichen die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle I, vermittelt.
Gemäß der Erfindung besitzt ein Protein oder Polypeptid die Aktivität eines Polypeptids, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, wenn die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion seiner Aktivität den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoff-Verwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
Insbesondere besitzt ein Protein oder Polypeptid die Aktivität eines Polypeptids, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, wenn die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion seiner Aktivität den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffzienz, wie eine gesteigerte Stickstoff-Verwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
Gemäß der Erfindung besitzt ein Nukleinsäuremolekül oder Polynukleotid die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle I, wenn die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion seiner Expression den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoff-Verwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
Das bedeutet zum Beispiel, dass die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion einer Expression, wie etwa der Expression eines Genproduktes, oder einer Aktivität, wie etwa einer enzymatischen Aktivität, auf irgendeine Weise mit dem erhöhten Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhter Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhter Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, zusammenhängt.
Überall in der Beschreibung bedeutet die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität eines derartigen oben erwähnten Proteins oder Polypeptids, oder des Expressionsproduktes eines/einer derartigen oben erwähnten Nukleinsäuremoleküls oder -sequenz eine Reduktion der Translation, Transkription oder Expressionshöhe oder Aktivität des Genproduktes oder des Polypeptids, beispielsweise der enzymatischen oder biologischen Aktivität des Polypeptids, von wenigstens 10%, vorzugsweise 20%, 30%, 40% oder 50%, besonders bevorzugt 60% 70% oder 80%, am stärksten bevorzugt 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, im Vergleich zur ursprünglichen endogenen Expressionshöhe des Expressionsproduktes oder zur ursprünglichen endogenen Aktivität eines Expressionsproduktes oder Polypeptids, umfassend oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, wie angegeben in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, oder umfassend ein Polypeptid, wie angegeben in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, oder das endogene Homolog oder Äquivalent davon.
Ferner kann der Fachmann auf dem Gebiet in einem Komplementations-Assay bestimmen, ob ein Polypeptid die ”Aktivität eines Polypeptids, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II” aufweist.
Ferner kann der Fachmann auf dem Gebiet in einem Komplementations-Assay bestimmen, ob ein Nukleinsäuremolekül die ”Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle I” aufweist.
Die spezifische Aktivität eines Polypeptids oder eines Nukleinsäuremoleküls, wie hierin zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung beschrieben, kann getestet werden, wie es in den Beispielen oder im Stand der Technik beschrieben ist. Insbesondere ist die Bestimmung, ob die Expression eines betreffenden Polynukleotids oder Polypeptids in einer Pflanzenzelle reduziert, verringert oder deletiert ist, und der Nachweis eines erhöhten Ertrags, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhter Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhter Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze ein einfacher Test und kann wie in den Beispielen oder im Stand der Technik beschrieben, durchgeführt werden.
Um zu testen, ob ein Nukleinsäuremolekül, z. B. ein Gen, ein funktionelles Homolog eines Nukleinsäuremoleküls ist, das in den Spalten 5 oder 7, insbesondere in Spalte 5, aufgeführt ist, kann ein Komplementations-Assay in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze durchgeführt werden. Beispielsweise kann eine Pflanze, der die Aktivität des Gens fehlt, z. B. ein Arabidopsis thaliana-Stamm, in welchem ein Nukleinsäuremolekül, welches das Nukleinsäuremolekül umfasst, ausgeknockt, insbesondere deletiert oder unterbrochen worden ist, mit dem jeweiligen Nukleinsäuremolekül in Frage, z. B. einem Gen oder Homolog, unter der Steuerung eines geeigneten Promotors, z. B. in einem geeigneten Vektor, transformiert werden. Der Promotor kann entweder eine konstitutive oder vorübergehende, oder aber eine gewebe- oder entwicklungsspezifische oder eine induzierbare Expression vermitteln. Vorzugsweise kann der Promotor hinsichtlich räumlicher und zeitlicher Aktivität ähnlich oder identisch zum Promotor des Gens sein, welches ausgeknockt, deletiert oder unterbrochen worden ist. Das betreffende Nukleinsäuremolekül, z. B. das zu testende Gen oder Homolog, enthält vorzugsweise die vollständige codierende Region, entweder mit oder ohne Intron(s). Außerdem kann es bevorzugt sein, 5'- und 3'-UTR oder andere Merkmale an die Sequenz anzufügen, um die Stabilität oder die Translation des Transkripts zu erhöhen.
Transformierte Pflanzen werden hinsichtlich des Vorhandenseins des jeweiligen Konstruktes und der Expression des betreffenden Nukleinsäuremoleküls, z. B. des Gens oder Homologs, oder seines Expressionsprodukts analysiert. Pflanzen, welche eine Expression des Gens oder Homologen aufzeigen, werden mit Wildtyp-Pflanzen verglichen. Die transgene Pflanze, enthaltend eine Knockout-Mutation und exprimierend das jeweilige Gen oder Homolog, ist zu den Wildtyp-Kontrollen bezüglich der Änderung der Steigerung der NUE und/oder der Erhöhung der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, im wesentlichen identisch.
Ein qualifizierter Komplementations-Assay ist zum Beispiel in Iba, K., Journal of Biological Chemistry 268 (32), 24099 (1993), Bonaventure, G., et al., Plant Growth. Plant Cell 15, 1020 (2003), oder in Gachotte, D., et al., Plant Journal 8 (3), 407 (1995), beschrieben.
Die Sequenz von At1g74730 aus Arabidopsis thaliana, z. B. wie sie in der Spalte 5 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, gezeigt wird, ist in der Datenbank TAIR, http://www.arabidopsis.org (Huala, E., et al., Nucleic Acids Res. 29 (1), 102 (2001)), veröffentlicht worden, und seine Aktivität wird als At1g74730-Protein beschrieben.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung folglich die Reduktion oder Unterdrückung eines Genproduktes mit der Aktivität eines ”At1g74730-Proteins” aus Arabidopsis thaliana oder seines funktionellen Äquivalentes oder seines Homologen, z. B. die Reduzierung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie gezeigt in der Spalte 5 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile, wie besagtes At1g74730, oder eines funktionellen Äquivalentes oder eines Homologen davon, wie in der Spalte 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile, wie besagtes At1g74730; oder
(b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in der Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile wie besagtes At1g74730, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile wie besagtes At1g74730,

Huala, E., et al., Nucleic Acids Res. 29 (1), 102 (2001)

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie gezeigt in der Spalte 5 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile, wie besagtes At3g07670, oder eines funktionellen Äquivalentes oder eines Homologen davon, wie in der Spalte 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile, wie besagtes At3g07670; oder
(b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in der Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile wie besagtes At3g07670, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile wie besagtes At3g07670,

Huala, E., et al., Nucleic Acids Res. 29 (1), 102 (2001)

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie gezeigt in der Spalte 5 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile, wie besagtes At3g63270, oder eines funktionellen Äquivalentes oder eines Homologen davon, wie in der Spalte 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile, wie besagtes At3g63270; oder
(b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in der Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile wie besagtes At3g63270, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile wie besagtes At3g63270,

Huala, E., et al., Nucleic Acids Res. 29 (1), 102 (2001)

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie gezeigt in der Spalte 5 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile, wie besagtes At4g03080, oder eines funktionellen Äquivalentes oder eines Homologen davon, wie in der Spalte 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile, wie besagtes At4g03080; oder
(b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in der Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile wie besagtes At4g03080, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile wie besagtes At4g03080,

Huala, E., et al., Nucleic Acids Res. 29 (1), 102 (2001)

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie gezeigt in der Spalte 5 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile, wie besagtes At5g65240, oder eines funktionellen Äquivalentes oder eines Homologen davon, wie in der Spalte 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, vor zugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile, wie besagtes At5g65240; oder
(b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in der Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile wie besagtes At5g65240, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, und aufgeführt in derselben jeweiligen Zeile wie besagtes At5g65240,

Homologe (= Homologa) der vorliegenden Genprodukte, insbesondere Homologe eines Genproduktes, das von einem Nukleinsäuremolekül, wie es in der Spalte 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, gezeigt ist, codiert wird oder das dieses umfasst, oder eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, gezeigt, können aus beliebigen Organismen abgeleitet werden, solange das Homolog die hierin erwähnte Aktivität vermittelt, d. h. solange es ein funktionelles Äquivalent der Moleküle ist. Im Besonderen vermittelt das Homolog einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze nach seiner Reduktion, Unterdrückung und/oder Deletion.

Gemäß der vorliegenden Erfindung, bezieht sich der Begriff ”Homolog” ferner auf die Sequenz eines Organismus, welche, unter allen exprimierten Sequenzen des Organismus, vorzugsweise die höchste oder im wesentlichen die höchste Sequenzhomologie zu den hierin erwähnten oder aufgelisteten Sequenzen aufweist.

Der Fachmann auf dem Gebiet weiß, wie man feststellt, identifiziert und bestätigt, dass ein vermutliches Homolog die besagte ”ertragserhöhende Aktivität”, ”Stresstoleranz erhöhende Aktivität”, ”Steigerung der NUE-Aktivität” und/oder ”Biomasseproduktion erhöhende Aktivi tät”, z. B. wie hierin beschrieben, aufweist. Sofern bekannt, betrifft oder entspricht die biologische Funktion oder Aktivität in einem Organismus im wesentlichen der Aktivität oder Funktion, wie sie für die in Absatz [0246] erwähnten Gene, zum Beispiel mindestens eines der in Tabelle II, Spalte 5, Anmeldung Nr. 1, aufgeführten Protein(e), beschrieben ist.

In einer Ausführungsform umfasst das Homolog oder das funktionelle Äquivalent folglich die Sequenz eines Polypeptids, codiert von einem Nukleinsäuremolekül, welches eine Sequenz, angegeben in Tabelle I, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, umfasst, oder eine Polypeptidsequenz, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, angegeben in Tabelle II oder IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, oder es handelt sich dabei um das Expressionsprodukt eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, welches in Tabelle I, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, angegeben ist.

Die hier offenbarte Information über Sequenz, Aktivität, Konsensussequenz, Polypeptidmotive und Tests führt den Fachmann auf dem Gebiet zum jeweiligen homologen oder funktionell äquivalenten Expressionsprodukt in einem Organismus.

In einer Ausführungsform ist, überall in der Patentbeschreibung, die Aktivität eines Proteins oder Polypeptids oder eines Nukleinsäuremoleküls oder einer Sequenz, codierend ein derartiges Protein oder Polypeptid, z. B. eine Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase, oder SET-Domäne-enthaltendem Protein, eine identische oder ähnliche Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn sie im wesentlichen die gleiche Aktivität aufweist oder wenn sie wenigstens 10% der ursprünglichen enzymatischen oder biologischen Aktivität, vorzugsweise wenigstens 20%, 30%, 40%, 50%, besonders bevorzugt 60%, 70%, 80%, am stärksten bevorzugt 90%, 95%, 98%, 99% der Aktivität im Vergleich zu einem Protein aufweist, wie es in der Tabelle II, Spalte 5 oder 7, Anmeldung Nr. 1, gezeigt ist, weiter bevorzugt wie es in der Tabelle II, Spalte 5, Anmeldung Nr. 1, gezeigt ist.

In einer Ausführungsform ist das Homolog von einem beliebigen der in Tabelle II, Spalte 5, Anmeldung Nr. 1, aufgeführten Polypeptide aus einem Eukaryoten abgeleitet und besitzt eine Sequenzidentität von mindestens 50% und weist vorzugsweise im wesentlichen dieselbe oder eine ähnliche Aktivität auf, wie beschrieben in [0246], wobei jedoch seine Reduktion, Unterdrückung oder die Deletion der Expression oder Aktivität einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, jeweilig in den Organismen oder einem Teil davon herbeiführt.

In einer Ausführungsform ist das Homolog von einem beliebigen der in Tabelle II, Spalte 5, Anmeldung Nr. 1, aufgeführten Polypeptide aus einer Pflanze abgeleitet, vorzugsweise aus einer Pflanze, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Nacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, winterharten Gräsern, Viehfutterpflanzen, Gemüsepflanzen sowie Zierpflanzen, und besitzt eine Sequenzidentität von wenigstens 50% und besitzt vorzugsweise im wesentlichen die gleiche oder eine im wesentlichen ähnliche Aktivität, wie beschrieben in [0246], wobei allerdings wenigstens die Reduktion seiner Expression oder Aktivität einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze herbeiführt.

In einer Ausführungsform ist das Homolog von einem beliebigen der in Tabelle II, Spalte 5, Anmeldung Nr. 1, aufgeführten Polypeptide aus einer Nutzpflanze abgeleitet und besitzt eine Sequenzidentität von wenigstens 30% und besitzt vorzugsweise im wesentlichen die gleiche oder eine ähnliche Aktivität, wie beschrieben in [0246], wobei allerdings wenigstens eine Reduktion der Expression oder Aktivität einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze herbeiführt.
Folglich handelt es sich, in einer Ausführungsform, bei dem Molekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, um das Molekül von (a) oder (b) aus Absatz [0246], [0247] oder aus Absatz [0249].
Somit kann ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent eines Polypeptids, wie angegeben in der Tabelle II, Spalte 3 oder Spalte 5, Anmeldung Nr. 1, ein Polypeptid sein, welches von einem Nukleinsäuremolekül codiert ist, umfassend ein Polynukleotid, wie angegeben in Tabelle I, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, in der gleichen Zeile, oder es kann sich um ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, angegeben in der Tabelle II, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, oder ein oder mehrere Polypeptidmotive, angegeben in der Tabelle IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, oder die Konsensussequenz, wie angegeben in der Tabelle IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, in der gleichen Zeile wie das Polypeptid, das in Tabelle II, Spalte 3 oder Spalte 5, Anmeldung Nr. 1, angegeben ist, handeln.

Somit kann ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent eines Nukleinsäuremoleküls, wie angegeben in Tabelle I, Spalte 5, Anmeldung Nr. 1, ein ein Polypeptid codierendes Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie angegeben in Tabelle I, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, in der gleichen Zeile, sein, oder ein Nukleinsäuremolekül sein, codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, angegeben in Tabelle II, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, oder die Konsensussequenz oder Polypeptidmotive, angegeben in der Tabelle IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, in der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül, angegeben in Tabelle I, Spalte 3 oder Spalte 5, Anmeldung Nr. 1.

Weitere Homologe oder funktionelle Äquivalente des Polypeptids, dessen Aktivität in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert werden soll, werden hierin nachstehend beschrieben.
Als Folge der Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion der Translation, Transkription und/oder Expression, z. B. als Folge der reduzierten, unterdrückten, verringerten oder deletierten Transkription eines Gens, insbesondere eines Gens, wie hierin beschrieben (z. B. umfassend ein in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführtes Nukleinsäuremolekül) tritt eine damit zusammenhängendes phänotypisches Merkmal in Erscheinung, wie etwa der erhöhte Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze.
Eine verringerte, unterdrückte oder reduzierte Aktivität des Moleküls, wobei diese Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, manifestiert sich in einem erhöhten Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhter Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhter Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze.
In einer Ausführungsform, betrifft das Verfahren der Erfindung ein Verfahren für erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion in einer Pflanze im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, wobei das Verfahren das Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren der Expression oder Aktivität von mindestens einem Nukleinsäuremolekül umfasst, aufweisend oder codierend ein Polypeptid mit der Aktivität von mindestens einem Protein, das von dem Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, codiert wird, und wobei das Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die Folgendes umfasst:

(a) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend das Polypeptid wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder enthaltend eine Konsensussequenz, wie in der Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt;
(b) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt;
(c) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, welche als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes aus einer Polypeptidsequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder aus einem Polypeptid, enthaltend eine Konsensussequenz wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, abgeleitet werden kann;
(d) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% or 99,9% Identität zu der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, welches das Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, umfasst;
(e) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid mit mindestens 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% oder 99,9% Identität zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) codiert ist und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie es in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist;
(f) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, welches mit Hilfe monoklonaler oder polyklonaler Antikörper isoliert wird, die gegen ein Polypeptid hergestellt wurden, codiert von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e), und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Protein, wie in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt;
(g) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive, wie aufgeführt in der entsprechenden Zeile von Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, welche repräsentiert wird durch ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polynukleotid, wie es in Spalte 5 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist;
(h) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung von Primern, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle III, Anmeldung Nr. 1, erhalten wird, wobei die Primer an ihrem 5'-Ende nicht mit den Nukleotiden ATA beginnen; und wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül vorzugsweise ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Polypeptid, codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in der Spalte 5 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt;
(i) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Protein, wie es in der Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist; und
(j) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, enthaltend mindestens 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 nt oder mehr eines Nukleinsäuremoleküls, komplementär zu einer in (a) bis (d) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz, erhältlich ist und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie es in der Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist;

Es existiert eine Reihe von Mechanismen, durch die das Molekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. ein Polypeptid- oder ein Nukleinsäuremolekül, insbesondere ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie beschrieben in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, wie beschrieben in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, oder ein funktionelles Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, manipuliert werden kann, um den Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Nährstoffverwertungseffizienz, wie etwa Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder die Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder die Biomasse und/oder die Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze direkt oder indirekt zu beeinflussen.

Zum Beispiel kann die Molekülzahl oder die spezifische Aktivität des Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder die von einem Polypeptid prozessiert wird, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder die Molekülzahl, verarbeitet von oder exprimiert von dem Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, reduziert, verringert oder deletiert werden.

Dem Fachmann auf dem Gebiet ist es allerdings bekannt, dass die Reduktion, Verringerung, Unterdrückung oder Deletion der Expression eines Gens, welches natürlicherweise in den Organismen vorhanden ist, auf mehreren Wegen erzielt werden kann, beispielsweise durch Modifizieren der Regulation des Gens oder durch Reduzieren oder Verringern der Stabilität der mRNA oder des Genproduktes, codiert von dem Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert, unterdrückt, verringert oder deletiert werden soll, z. B. eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polynukleotid umfasst, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1.

Der Ausdruck ”Reduktion” einer biologischen Funktion bezieht sich zum Beispiel auf die quantitative Reduktion einer Bindungsfähigkeit oder Bindungsstärke eines Proteins an ein Substrat in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment im Vergleich zum Wildtyp der gleichen Gattung und Spezies, auf den dieses Verfahren nicht angewandt worden ist, unter ansonsten identischen Bedingungen (wie zum Beispiel Kulturbedingungen, Alter der Pflanzen und dergleichen).

Bindungspartner für das Protein können in der Weise ermittelt werden, mit welcher der Fachmann vertraut ist, beispielsweise durch das Hefe-2-Hybrid-System.
Dies gilt in analoger Weise auch für die kombinierte Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion der Expression eines Gens oder eines Genproduktes des Nukleinsäuremoleküls, das in Spalte 5 oder 7, Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, beschrieben ist, zusammen mit der Manipulation weiterer Aktivitäten.
In einer Ausführungsform kann die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung, Deletion oder Modulierung gemäß dieser Erfindung herbeigeführt werden durch die (z. B. transgenische) Expression eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, einer RNAi, einer snRNA, einer dsRNA, einer siRNA, einer miRNA, einer ta-siRNA, eines Cosuppressionsmoleküls, eines Ribozyms oder eines Antikörpers, eines Inhibitors oder eines anderen Moleküls, das die Expression oder Aktivität des Expressionsproduktes des Nukleinsäuremoleküls inhibiert, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert, verringert oder deletiert werden soll. Z. B. kann die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung, Deletion oder Modulation gemäß dieser Erfindung durch die (z. B. transgenische) Expression von einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, codierend ein Antisense-Nukleinsäuremolekül, RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, ein Cosuppressionsmolekül, Ribozym, oder von einem Antikörper gegen das Nukleinsäuremolekül oder das Polypeptid, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, herbeigeführt werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung, Deletion oder Modulation gemäß dieser Erfindung auch eine stabile Mutation in dem entsprechenden endogenen Gen sein, codierend das im Verfahren der Erfindung zu reduzierende, verringernde oder deletierende Nukleinsäuremolekül, z. B. von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1.
In einer anderen Ausführungsform kann die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung, Deletion oder Modulation gemäß dieser Erfindung eine Modulation der Expression oder des Verhaltens eines Gens sein, das die Expression des Polypeptids, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert, verringert, unterdrückt oder deletiert werden soll, z. B. eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, vermittelt.
Die Expression kann konstitutiv, z. B. aufgrund einer stabilen, permanenten, systemischen, lokalen oder temporalen Expression, zum Beispiel auf bestimmte Zelltypen, Gewebe, Organe oder Zeitperioden begrenzt erfolgen.
Zum Beispiel kann die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung, Deletion oder Modulation gemäß dieser Erfindung vorübergehend sein, z. B. aufgrund einer transienten Transformation, eines vorübergehend aktiven Promotors oder der zeitweiligen Zugabe eines Modulators, wie einem Antagonisten, Inhibitor oder Induktor, z. B. nach Transformation mit einem induzierbaren Konstrukt, welches das doppelsträngige RNA-Nukleinsäuremolekül (dsRNA), den Antisense, die RNAi, snRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, ein Cosuppressionsmolekül, Ribozym, Antikörper etc., wie hierin beschrieben, beispielsweise unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors trägt, kombiniert mit der Anwendung eines entsprechenden Inducers, z. B. Tetracyclin oder Ecdyson.
Die Reduktion, Verringerung oder Unterdrückung der Aktivität des Moleküls, dessen Aktivität gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert wird, beläuft sich vorzugsweise auf mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 30% oder mindestens 60%, speziell bevorzugt mindestens 70%, 80%, 85%, 90% oder mehr, noch weiter bevorzugt mindestens 95%, stärker bevorzugt mindestens 99% oder mehr, im Vergleich zur Kontrolle, Referenz oder zum Wildtyp. Am stärksten bevorzugt beläuft sich die Reduktion, Verringerung, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität auf 100%.
In Übereinstimmung mit der Erfindung sind verschiedene Strategien zum Reduzieren der Menge, der Expression, der Aktivität oder der Funktion von Proteinen, welche durch die Nukleinsäuren codiert werden, oder von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen selbst eingeschlossen. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, das eine Reihe unterschiedlicher Verfahren zur Verfügung steht, um die Quantität eines Proteins, die Aktivität oder die Funktion in gewünschter Weise zu beeinflussen.
Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung, in einer Ausführungsform, einen oder mehrere der folgenden Schritte:

(i) Inhibition, Repression, Inaktivierung oder Reduktion von Translation oder Transkription von,
(ii) Destabilisierung der Transkriptstabilität oder Polypeptidstabiliät von,
(iii) Reduktion der Akkumulierung von,
(iv) Inhibition, Repression, Inaktivierung oder Reduktion der Aktivität von Transkript oder Polypeptid von, und/oder
(v) Reduktion der Kopienzahl von funktionellen (z. B. exprimierten) Genen von,

(a) einem Protein, das die Expression eines Proteins, codiert von dem Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, ermöglicht, vermittelt oder steuert, oder dem Polypeptid, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, z. B. einem Polypeptid, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst oder codiert ist von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1;
(b) einem mRNA-Molekül, das die Expression eines Proteins ermöglicht, vermittelt oder steuert, welches im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll oder welches von dem Nukleinsäuremolekül codiert ist, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, wobei es z. B. die Expression eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, oder eines Polypeptids, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert ist, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, ermöglicht, vermittelt oder steuert,
(c) einem RNA-Molekül, das die Expression einer mRNA ermöglicht, vermittelt oder steuert, die ein Polypeptid codiert, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, z. B. einer mRNA, codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, oder einer mRNA, umfassend das Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, z. B. umfassend ein Polynukleotid wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1;
(d) einem RNA-Molekül, das die Expression eines Expressionsproduktes eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend das Polynukleotid, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, ermöglicht, vermittelt oder steuert; z. B. eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polynukleotid umfasst, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1;
(e) einer mRNA, codierend das Polynukleotid oder das Polypeptid, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird; z. B. von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder von einer mRNA, welche die Expression eines Polypeptids ermöglicht, vermittelt oder steuert, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, wie das Polypeptid, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist;
(f) einem Gen, welches einen Aktivator, der die Aktivierung oder Erhöhung der Expression eines Nukleinsäuremoleküls ermöglicht, codierend ein Polypeptid, welches von dem Nukleinsäuremolekül codiert ist, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, oder das Polypeptid, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, codiert, z. B. einem Gen, codierend einen Aktivator, der die Aktivierung oder Erhöhung der Expression eines Polypeptids, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst, oder eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polynukleotid umfasst, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, ermöglicht; oder
(g) einem endogenen Gen, codierend das Polypeptid oder das Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, beispielsweise einem endogenen Gen, codierend ein Polypeptid, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst, oder ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, umfasst.

Demgemäß kann die

i) Inhibition, Repression, Inaktivierung oder Reduktion von Translation oder Transkription,
ii) Destabilisierung der Transkriptstabilität oder Polypeptidstabiliät,
iii) Reduktion der Akkumulierung,
iv) iInhibition, Repression, Inaktivierung oder Reduktion der Aktivität von Transkript oder Polypeptid, und/oder
v) Reduzierung der Kopienzahl von funktionellen (z. B. exprimierten) Genen,

So betrifft die vorliegende Erfindung beispielsweise, in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren, in welchem die Anzahl an funktionellen (z. B. exprimierten) Kopien eines Gens, welches das Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül der Erfindung codiert, verringert wird.
Ferner kann der endogene Spiegel des Polypeptids der Erfindung beispielsweise durch Modifizieren der transkriptionellen oder translationalen Regulierung oder Effizienz des Polypeptids verringert werden.
Einzelheiten werden später in der Beschreibung oder in den Beispielen beschrieben.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung beispielsweise einen oder mehrere der folgenden Schritte

(a) Stabilisieren eines Proteins, welches die verringerte Expression eines Proteins oder des Nukleinsäuremoleküls oder des Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, herbeiführt;
(b) Stabilisieren einer mRNA oder funktionellen RNA, welche die verringerte Expression eines bzw. des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, herbeiführt;
(c) Erhöhen oder Stimulieren der spezifischen Aktivität eines Proteins, welches die verringerte Expression eines bzw. des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, herbeiführt;
(d) Verringern der spezifischen Aktivität eines Proteins, welches die erhöhte Expression eines bzw. des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, herbeiführt;
(e) Exprimieren eines transgenen Gens, codierend ein Protein, das die verringerte Expression eines Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung verringert wird, herbeiführt;
(f) Erzeugen oder Erhöhen der Expression eines endogenen oder künstlichen Transkriptionsfaktors, der die Expression eines Proteins unterdrückt, das die erhöhte Expression des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung verringert wird, herbeiführt;
(g) Erzeugen oder Erhöhen der Expression eines endogenen oder künstlichen Transkriptionsfaktors, der die Expression eines Proteins vermittelt, das die verringerte Expression des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, herbeiführt;
(h) Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren der Expression eines endogenen oder künstlichen Transkriptionsfaktors, der die Expression eines Proteins unterdrückt, das die verringerte Expression des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, herbeiführt;
(i) Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren der Expression eines endogenen oder künstlichen Transkriptionsfaktors, der die Expression eines Proteins vermittelt, das die erhöhte Expression des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, herbeiführt;
(j) Erhöhen der Anzahl an funktionellen Kopien oder der Expression eines Gens, das die verringerte Expression des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, herbeiführt;
(k) Erhöhen der Aktivität eines Repressorproteins oder einer Repressor-RNA;
(l) Erhöhen der Aktivität eines Proteins oder einer RNA, welche(s) zu einem dominant-negativen Phänotyp des Proteins führt, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird;
(m) Expression eines Antikörpers oder Aptameren, der/das an das Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder das Protein, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, bindet und dadurch dessen Aktivität reduziert, verringert oder deletiert;
(n) Exprimieren eines Repressors, der die reduzierte, unterdrückte, verringerte oder deletierte Expression eines Proteins, codiert von dem Nukleinsäuremolekül, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder des Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, herbeiführt oder die inhibitorische Regulierung des Polypeptids der Erfindung erhöht;
(o) Reduzieren oder Deletieren der Expression des Nukleinsäuremoleküls, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, oder des Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, durch Zusetzen von einem oder mehreren exogenen Repressionsfaktoren, wie zum Beispiel einer inhibierenden chemischen Verbindung, zu dem Organismus oder seinem Medium oder seiner Nahrung, z. B. zur Wasserversorgung des Organismus; oder
(p) Modulieren der Wachstumsbedingungen eines Organismus auf eine solche Weise, dass die Expression oder Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, codierend das Protein, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, oder des Proteins selbst reduziert, unterdrückt, verringert oder deletiert wird. Dies kann beispielsweise durch Modulieren der Licht- und/oder Nährstoffbedingungen erzielt werden, welche ihrerseits die Expression des Gens oder Proteins modulieren, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird.

Andere Strategien und Modifikationen und Kombinationen der oben genannten Strategien sind dem Fachmann auf dem Gebiet durchaus bekannt und sind ebenfalls Ausführungsformen dieser Erfindung. Oben Besagtes kann zum Beispiel erreicht werden durch Zugeben von positiven Expressions- oder Entfernen von negativen Expressionselementen, wobei man zum Beispiel homologe Rekombination anwenden kann, um entweder positive oder negative regulatorische Elemente, wie etwa einen 35S-Enhancer, in einen Pflanzenpromotor einzubringen oder Repressorelemente aus regulatorischen Regionen zu entfernen. Weiterhin können Verfahren zur Genkonversion angewandt werden, um Elemente zu unterbrechen bzw. disruptieren oder die Aktivität von Repressorelementen zu erhöhen. Repressorelemente können statistisch durch T-DNA- oder Transposon-Mutagenese in Pflanzen eingeführt werden. Man kann Linien identifizieren, in denen die Repressorelemente nahe einem Gen, das das Nukleinsäuremolekül oder Polypeptid codiert, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, integriert sind, wodurch dessen Expression reduziert, verringert oder deletiert wird. Ferner können Mutationen, wie Punktmutationen, durch verschiedene Mutageneseverfahren statistisch eingebracht werden und durch spezifische Verfahren, wie zum Beispiel TILLING (übersichtsmäßig zusammengefasst in Slade und Knauf, Transgenic Res., 14 (2), 109 (2005)), selektiert werden.
So kann zum Beispiel eine Erhöhung der Aktivität eines Proteins oder einer RNA, welche zu einem dominant-negativen Phänotyp des Proteins führt, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, durch die Expression eines Nukleinsäuremoleküls erreicht werden, das ein Protein codiert, welches seine biologische Aktivität verloren hat, aber welches an ein anderes Protein in einem multimeren Komplex bindet, wodurch die Aktivität des Komplexes verringert, unterdrückt oder deletiert wird, oder welches beispielsweise als ein Transkriptionsfaktor an DNA bindet und dadurch die Aktivität des translatierten Proteins verringert oder deletiert.
Im Allgemeinen steht die Menge an mRNA, Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül in einer Zelle oder einem Kompartiment eines Organismus in Korrelation mit der Menge an codiertem Protein und somit mit der Gesamtaktivität des codierten Proteins in dem Volumen. Diese Korrelation ist nicht immer linear, sondern die Aktivität in dem Volumen ist abhängig von der Stabilität der Moleküle, dem Abbau der Moleküle oder der Gegenwart von aktivierenden oder inhibierenden Cofaktoren. Ferner sind Produkt- und Edukt-Inhibitionen von Enzymen allgemein bekannt.
Die Aktivität der oben erwähnten Proteine und/oder Polypeptid(e), codiert von dem Nukleinsäuremolekül, welche im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert werden soll, kann auf verschiedenen Wegen reduziert, unterdrückt, verringert oder deletiert werden.
So wird zum Beispiel die Aktivität in einem Organismus oder in einem Teil davon, wie etwa einer Zelle, reduziert, unterdrückt oder verringert durch Reduzieren oder Verringern der Genproduktanzahl, z. B. durch Reduzieren, Unterdrücken oder Verringern der Expressionsrate, wie etwa Mutieren des natürlichen Promotors zu einer geringeren Aktivität, oder durch Reduzieren, Unterdrücken oder Verringern der Stabilität der exprimierten mRNA, wodurch die Translationsrate reduziert, unterdrückt oder verringert wird, und/oder durch Reduzieren, Unterdrücken oder Verringern der Stabilität des Genproduktes, wodurch der Zerfall bzw. Abbau des Proteins erhöht wird. Ferner können die Aktivität oder der Umsatz bzw. Turnover von Enzymen oder Kanälen oder Trägern, Transkriptionsfaktoren und ähnlichen aktiven Proteinen auf eine derartige Weise beeinflusst werden, dass eine Reduktion der Reaktionsrate oder eine Modifikation (Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion) der Affinität zum Substrat resultiert bzw. erreicht wird.
Eine Mutation im katalytischen Zentrum eines Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, z. B. eines Enzyms oder einer katalytischen oder regulatorischen RNA, kann die Turnover-Rate des Enzyms modulieren; so kann z. B. ein Knockout einer essentiellen bzw. wesentlichen Aminosäure zu einer verringerten Aktivität oder einem vollständigen Knockout der Aktivität des Enzyms führen, oder die Deletion von Regulator-Bindungsstellen kann eine positive Regulierung reduzieren.
Die spezifische Aktivität eines Enzyms der vorliegenden Erfindung kann so verringert werden, dass die Turnover-Rate verringert wird oder die Bindung eines Cofaktors reduziert wird Das Reduzieren der Stabilität der codierenden mRNA oder des Proteins kann ebenfalls die Aktivität eines Genproduktes verringern. Die Reduktion der Aktivität liegt ebenfalls im Umfang des Begriffs ”reduzierte, unterdrückte, verringerte oder deletierte Aktivität”. Zusätzlich hierzu kann die Reduktion der Aktivität in vorteilhafter Weise in cis, z. B. durch Mutieren des Promotors, einschließlich anderer cis-regulatorischer Elemente oder der transkribierten oder codierenden Teile des Gens, erreicht werden, aber die Inhibition kann ebenfalls in trans erreicht werden, z. B. durch Trans-Faktoren, wie (einem) chimären Transkriptionsfaktor(en), Ribozymen, Antisense-RNAs, dsRNAs oder dominant-negativen Proteinversionen, welche verschiedene Stufen der Expression stören, z. B. die Transkription, die Translation oder die Aktivität des Proteins oder Proteinkomplexes selbst. Auch epigenetische Mechanismen, wie DNA-Modifikationen, DNA-Methylierung oder DNA-Packung, könnten zum Inaktivieren oder Herunterregulieren der Nukleinsäuren der Erfindung oder der codierten Proteine herangezogen werden.
Folglich wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, insbesondere einer Pflanze, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, in einem nicht-menschlichen Organismus durch die Verwendung einer RNA-Interferenz (dsRNAi), die Einbringung von einer Antisense-Nukleinsäure, einer RNAi, snRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, einem Cosuppressionsmolekül oder einer Ribozym-Nukleinsäure, kombiniert mit einem Ribozym, einer einen Cosuppressor codierenden Nukleinsäure, einer Nukleinsäure codierend ein dominant- negatives Protein, einen DNA- oder Protein-Bindungsfaktor, oder von Antikörpern, abzielend auf das Gen oder RNA oder Proteine, von den RNA-Abbau induzierenden viralen Nukleinsäuren oder einem Mikro-RNA-Molekül, oder Kombinationen davon, gegen das in diesem Absatz charakterisierte Nukleinsäuremolekül erreicht.
Die Regulierung der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen kann so modifiziert werden, dass die Genexpression verringert wird. Diese Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion (Reduktion, Unterdrückung, Verringerung, Deletion, Inaktivierung oder Herunterregulieren werden überall in der Patentbeschreibung als Synonyme verwendet) kann wie oben erwähnt durch alle dem Fachmann bekannten Verfahren erreicht werden, vorzugsweise durch doppelsträngige RNA-Interferenz (dsRNAi), Einbringung einer Antisense-Nukleinsäure, eines Ribozyms, einer Antisense-Nukleinsäure kombiniert mit einem Ribozym, einer Nukleinsäure, codierend einen Cosuppressor, einer Nukleinsäure, codierend ein dominant-negatives Protein, einen DNA- oder Protein-Bindungsfaktor oder Antikörper, abzielend auf das Gen oder RNA oder Proteine, RNA-Abbau induzierende virale Nukleinsäuren und Expressionssysteme, Systeme zum Induzieren von einer homologen Rekombination der Gene, Mutationen in den Genen, oder einer Kombination des oben Genannten.
Im Allgemeinen kann eine Aktivität eines Genproduktes in einem Organismus oder einem Teil davon, insbesondere in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Pflanzengewebe oder einem Teil davon, oder in einem Mikroorganismus, durch Verringern der Menge der spezifischen codierenden mRNA oder des entsprechenden Proteins in dem Organismus oder dem Teil davon verringert werden. Es versteht sich, dass ”Menge von Protein oder mRNA” die Molekülanzahl von Polypeptiden oder mRNA-Molekülen in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment bedeutet. ”Verringerung” der Menge eines Proteins bedeutet die quantitative Verringerung der Molekülanzahl des Proteins in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment oder einem Teil davon – beispielsweise durch eines der hierin nachstehend beschriebenen Verfahren – im Vergleich zu einem Wildtyp, einer Kontrolle oder einer Referenz.
In diesem Kontext bedeutet ”Inaktivierung”, dass die Aktivität des codierten Polypeptids nicht länger in dem Organismus oder in der Zelle, wie zum Beispiel innerhalb der Pflanze oder Pflanzenzelle, nachweisbar ist. Für die Zwecke der Erfindung bedeutet Herunterregulierung (= Reduktion), dass seine Aktivität, z. B. die enzymatische oder biologische Aktivität des codierten Polypeptids, im Vergleich zur Aktivität des unbehandelten Organismus teilweise oder im wesentlichen vollständig reduziert wird. Dies kann durch unterschiedliche zellbiologische Mechanismen erreicht werden. In diesem Zusammenhang kann die Aktivität im gesamten Organismus oder, im Fall von vielzelligen Organismen, in einzelnen Teilen des Organismus, im Fall von Pflanzen beispielsweise in Geweben, wie dem Samen, dem Blatt, der Wurzel oder anderen Teilen, herunterreguliert werden.
Eine Modifikation, d. h. eine Verringerung, kann durch endogene oder exogene Faktoren verursacht werden. So kann eine Verringerung der Aktivität in einem Organismus oder einem Teil davon zum Beispiel durch Zusatz einer chemischen Verbindung, wie einem Antagonisten, zu Medien, Nahrung, Erdboden der Pflanzen oder zu den Pflanzen selbst verursacht werden.
In einer Ausführungsform kann der erhöhte Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze durch Verringern des Spiegels an dem endogenen Nukleinsäuremolekül oder dem endogenen Polypeptid, welche hierin beschrieben sind, erzielt werden, d. h. an dem Nukleinsäuremolekül oder dem Polypeptid, dessen Aktivität gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, im Besonderen an einem Polynukleotid oder Polypeptid, das in der entsprechenden Zeile von Tabelle I bzw. II, Spalte 5 oder 7, Anmeldung Nr. 1, beschrieben ist.
Folglich wird, in einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung, die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität, repräsentiert durch das Protein oder Nukleinsäuremolekül, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, durch mindestens einen Schritt erzielt, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polynukleotid umfasst, codierend eine Ribonukleinsäuresequenz, welche in der Lage ist, ein doppelsträngiges Ribonukleinsäuremolekül zu bilden, wobei ein Fragment von wenigstens 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Nukleotiden (nt) oder mehr, bevorzugt von 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 Nukleotiden (nt) oder mehr, stärker bevorzugt von 50, 60, 70, 80, 90 oder 100 Nukleotiden (nt) oder mehr, und wobei das doppelsträngige Ribonukleinsäuremolekül eine Identität von 50% oder mehr, vorzugsweise eine Identität von 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 oder am stärksten bevorzugt von 100% aufweist/aufweisen zu dem Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder einem Nukleinsäuremolekül, das das Polypeptid codiert, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder das aus der Gruppe gewählt ist, die Folgendes umfasst: (i) das Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert wird; (ii) ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, das ein Polypeptid wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, umfasst, vorzugsweise ein Nukleinsäuremolekül wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, bevorzugt ein Nukleinsäuremolekül wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, und (iii) ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid mit der Aktivität eines in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführten Polypeptids, oder codierend das Expressionsprodukt eines Polynukleotids, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1; und
(b) einem beliebigen der im folgenden Absatz beschriebenen Schritte: (i) Einbringen einer RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, eines Cosuppressionsmoleküls oder eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, wobei die RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, das Cosuppressionsmolekül oder das Antisense-Nukleinsäuremolekül ein Fragment von 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Nukleotiden (nt) oder mehr, bevorzugt von 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 Nukleotiden (nt) oder mehr, weiter bevorzugt von 50, 60, 70, 80, 90 oder 100 Nukleotiden (nt) oder mehr, mit einer Identität von wenigstens 30% oder mehr, vorzugsweise 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 oder am stärksten bevorzugt 100% zu dem Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder einem Nukleinsäuremolekül, codierend das Polypeptid, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder zu einem Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus einer Gruppe, die im Absatzteil (a)(i) bis (iii) definiert ist, umfasst; (ii) Einbringen eines Ribozyms, das das Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder ein Nukleinsäuremolekül, codierend das Polypeptid, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder ein Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus einer Gruppe, die im Absatzteil (a)(i) bis (iii) definiert ist, spezifisch spaltet; (iii) Einbringen der/des in (b)(i) charakterisierten RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Cosuppressionsmoleküls, Ribozyms, Antikörpers, Antisense-Nukleinsäuremoleküls und des in (b)(ii) charakterisierten Ribozyms; (iv) Einbringen eines Sense-Nukleinsäuremoleküls, das die Expression des Nukleinsäuremoleküls, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder eines Nukleinsäuremoleküls, codierend das Polypeptid, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder eines Nukleinsäuremoleküls, ausgewählt aus einer Gruppe, die im Absatzteil (a)(i) bis (iii) definiert ist, herbeiführt zum Induzieren einer Cosuppression des endogenen Expressionsproduktes des Nukleinsäuremoleküls, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder eines Nukleinsäuremoleküls, codierend das Polypeptid, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder eines Nuklein säuremoleküls, ausgewählt aus einer Gruppe, die im Absatzteil (a)(i) bis (iii) definiert ist; (v) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, das die Expression einer dominant-negativen Mutante eines Proteins, welches die Aktivität eines Proteins aufweist, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder eines Proteins, codiert von einem Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder eines Proteins, codiert von einem Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus einer Gruppe, die im Absatzteil (a)(i) bis (iii) definiert ist, herbeiführt; (vi) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, das einen Faktor codiert, der an ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder umfassend ein Nukleinsäuremolekül, codierend das Polypeptid, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das aus einer im Absatzteil (a)(i) bis (iii) definierten Gruppe gewählt ist, bindet; (vii) Einbringen eines viralen Nukleinsäuremoleküls, das den Abbau bzw. die Abnahme eines RNA-Moleküls, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder umfassend ein Nukleinsäuremolekül, codierend das Polypeptid, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das aus einer im Absatzteil (a)(i) bis (iii) definierten Gruppe ausgewählt ist, herbeiführt; (viii) Einbringen eines Nukleinsäurekonstrukts, das zum Rekombinieren mit und zum Silencing, Inaktivieren, Unterdrücken oder Reduzieren der Aktivität eines endogenen Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder umfassend ein Nukleinsäuremolekül, codierend das Polypeptid, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das aus einer im Absatzteil (a)(i) bis (iii) definierten Gruppe ausgewählt ist, befähigt ist; (ix) Einbringen einer nicht-stummen Mutation bzw. Nicht-Silent-Mutation in einem endogenen Gen, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder umfassend ein Nukleinsäuremolekül, codierend das Polypeptid, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das aus einer im Absatzteil (a)(i) bis (iii) definierten Gruppe ausgewählt ist; und/oder (x) Einbringen eines Expressionskonstruktes, das die Expression von einem Nukleinsäuremolekül, das in einem Beliebigen der Punkte (b)(i) bis (ix) charakterisiert ist, herbeiführt.

Folglich wird, in einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung, die Reduktion oder Deletion der Aktivität, repräsentiert durch das im Verfahren der Erfindung verwendete Protein oder Nukleinsäuremolekül, durch mindestens einen Schritt erreicht, der aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht:

(a) Einbringen von Nukleinsäuremolekülen, codierend ein Ribonukleinsäuremolekül, wobei die Sequenz in der Lage ist, ein doppelsträngiges Ribonukleinsäuremolekül zu bilden, wobei der Sense-Strang der doppelsträngigen Ribonukleinsäuremoleküle eine Identität von mindestens 30%, vorzugsweise 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 oder 100% aufweist zu dem Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder einem Nukleinsäuremolekül, das das Polypeptid codiert, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder zu einem Nukleinsäuremolekül, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Folgendes umfasst: (i) ein Nukleinsäuremolekül, das die Expression eines Proteins, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, herbeiführt oder die Expression eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, herbeiführt; (ii) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Protein mit der Aktivität eines Proteins, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, codiert oder die Expression eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, herbeiführt; und (iii) ein Nukleinsäuremolekül umfassend ein Fragment von mindestens 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Basenpaaren von einem Nukleinsäuremolekül mit einer Homologie von mindestens 50% vorzugsweise 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 oder 100% zu einem Nukleinsäuremolekül von (a)(i) oder (ii);
(b) Einbringen eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, wobei das Antisense-Nukleinsäuremolekül eine Identität von mindestens 30% oder mehr, vorzugsweise von 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 oder 100% zu einem Nukleinsäuremolekül-Antisense zu dem Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder einem Nukleinsäuremolekül, codierend das Polypeptid, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder einem Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe, die aus oben stehendem (a)(i) bis (iii) besteht, aufweist;
(c) Einbringen eines Ribozyms, das ein Nukleinsäuremolekül, das die Expression eines Proteins mit der Aktivität eines Proteins, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, spezifisch spaltet oder das ein Nukleinsäuremolekül, das die Expression des Nukleinsäuremoleküls, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder des Polypeptids, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, vermittelt, oder ein Nukleinsäuremolekül, codierend das Polypeptid, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder ein Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe, die aus oben stehendem (a)(i) bis (iii) besteht, spezifisch spaltet;
(d) Einbringen des in (b) charakterisierten Antisense-Nukleinsäuremoleküls und des in (c) charakterisierten Ribozyms;
(e) Einbringen eines Sense-Nukleinsäuremoleküls, das die Expression des Nukleinsäuremoleküls, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder des Polypeptids, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder eines Nukleinsäuremoleküls, codierend das Polypeptid, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder eines Nukleinsäuremoleküls, ausgewählt aus der Gruppe, die aus oben stehendem (a)(i) bis (iii) besteht, herbeiführt zum Induzieren einer Cosuppression des endogenen Nukleinsäuremoleküls, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder eines Nukleinsäuremoleküls, codierend das Polypeptid, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder eines Nukleinsäuremoleküls, ausgewählt aus der Gruppe, die aus oben stehendem (a)(i) bis (iii) besteht;
(f) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das die Expression einer dominant-negativen Mutante eines Proteins mit der Aktivität eines Proteins, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, oder einer dominant-negativen Mutante eines Polypeptids, codiert von einem Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe, die aus oben stehendem (a)(i) bis (iii) besteht, vermittelt, wobei das Exprimieren der Sequenz zum Beispiel zu dem dominant-negativen Mutantenprotein führt, wodurch die Aktivität des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendten Proteins reduziert, verringert oder deletiert wird;
(g) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das einen Faktor codiert, der an ein Nukleinsäuremolekül bindet, das die Expression eines Proteins mit der Aktivität eines Polypeptids, das gemäß des Verfahrens der Erfindung reduziert werden soll, z. B. umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe, die aus oben stehendem (a)(i) bis (iii) besteht, vermittelt;
(h) Einbringen eines viralen Nukleinsäuremoleküls, das den Abbau bzw. die Abnahme eines RNA-Moleküls herbeiführt, das die Expression eines Proteins, das die Aktivität eines im erfindungsgemäßen Verfahren verwendten Proteins aufweist, speziell eines Polypeptids, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst oder codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe, die aus oben stehendem (a)(i) bis (iii) besteht, vermittelt;
(i) Einbringen eines Nukleinsäurekonstrukts, das zum Rekombinieren mit und Mutieren von einem endogenen Gen fähig ist, das die Expression eines Proteins vermittelt, das die Aktivität eines im erfindungsgemäßen Verfahren verwendten Proteins aufweist, speziell eines Polypeptids, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst oder codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe, die aus oben stehendem (a)(i) bis (iii) besteht;
(j) Einführen einer nicht-stummen Mutation in einem endogenen Gen, das die Expression eines Proteins, das die Aktivität eines im erfindungsgemäßen Verfahren verwendten Proteins aufweist, speziell eines Polypeptids, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst oder codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe, die aus oben stehendem (a)(i) bis (iii) besteht, vermittelt;
(k) Selektieren einer nicht-stummen Mutation in einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Protein mit der Aktivität eines im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteins, speziell ein Polypeptid, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst oder das codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe, die aus oben stehendem (a)(i) bis (iii) besteht, aus einer statistisch mutagenisierten Population von Organismen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird; und/oder
(l) Einbringen eines Expressionskonstruktes, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, wie charakterisiert in einem von (a) bis (k) vermittelt, oder die Expression eines Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, charakterisiert in einem von (a) bis (k) vermittelt.

In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung den folgenden Schritt:
Einführen einer Mutation einer bestimmten bzw. einzelnen Aminosäure, die in der Konsensussequenz gezeigt ist, welche in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, in derselben Zeile aufgeführt ist, in ein endogenes Nukleinsäuremolekül, z. B. in ein endogenes Gen, das die Expression eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, oder eines Polypeptids, codiert von einem Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus oben erwähnten (a)(i) bis (iii), vermittelt,
wobei die Mutation eine nicht-stumme Mutation in dem Polypeptid, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere in einem Polypeptid, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst, oder einem Polypeptid, das codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus oben erwähntem (a)(i) bis (iii), herbeiführt.

Die in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführte Konsensussequenz zeigt die Aminosäuren, von denen festgestellt wurde, dass sie innerhalb der Sequenzen der in den Spalten 5 und 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführten Polypeptide stark konserviert sind. Somit wird es bevorzugt, eine oder mehrere der einzelnen konservierten Aminosäuren (welche nicht als X oder Xaa definiert sind) durch ein statistisches Mutationsvorgehen oder durch selektives Einbringen einer Mutation in eine derartige Aminosäure oder in einen Abschnitt von mehreren konservierten Aminosäuren, beispielsweise durch Anwenden von chemischen, physikalischen oder biologischen Mutagenen, wie etwa ortsgerichteter Mutagenese oder Einführung einer homologen Rekombination, zu mutieren.
In einer Ausführungsform werden die codierenden Sequenzen eines Nukleinsäuremoleküls, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere aus dem Nukleinsäuremolekül, erwähnt unter den Absatzteilen (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) oder (j) von Absatz [0252], vorzugsweise eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, für die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion der Nukleinsäuresequenzen, deren Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, gemäß den verschiedenen Verfahrensschritten, welche oben in den Absätzen [0281] bis [0283] erwähnt wurden, verwendet, z. B. wie in Liu Q et al., Plant Physiology 129, 1732 (2002)) beschrieben.
Vorzugsweise werden weniger als 1000 bp, 900 bp, 800 bp oder 700 bp, besonders bevorzugt weniger als 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp oder 100 bp der codierenden Region der Nukleinsäuresequenz verwendet.
Der Fachmann weiß, dass es, ausgehend von den hierin als dem Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, offenbarten Nukleinsäuresequenzen möglich ist, die Aktivität insbesondere von Orthologen der hierin beschriebenen Moleküle zu reduzieren oder zu deletieren. Im Besonderen weiß der Fachmann, wie man das vollständige Gen, die codierende Region (CDR), die exprimierten Regionen (z. B. als cDNA) oder Fragmente davon, der besagten Nukleinsäuresequenzen, insbesondere die besagten Regionen von Molekülen, wie sie in der Tabelle I, Spalte 5 oder 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt sind, falls nicht bereits hierin offenbart, z. B. ausgehend von dem Nukleinsäuremolekül, das unter den Absatzteilen (a) bis (j) von Absatz [0253] oben erwähnt ist, vorzugsweise ausgehend von einem Nukleinsäuremolekül, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst, wie es in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist, isoliert.
In einer Ausführungsform werden die 5'- und/oder 3'-Sequenzen eines Nukleinsäuremoleküls, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere aus dem Nukleinsäuremolekül, das unter den Absatzteilen (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) oder bis (j) von Absatz [0252] erwähnt ist, vorzugsweise von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, für die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion der Nukleinsäuresequenzen, deren Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, gemäß den verschiedenen Verfahrensschritten (a) bis (j), die oben stehend in den Absätzen [0281] bis [0283] erwähnt wurden, verwendet, z. B. wie beschrieben in Ifuku K. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 67 (1), 107 (2003).
Vorzugsweise werden weniger als 1000 bp, 900 bp, 800 bp oder 700 bp, besonders bevorzugt weniger als 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp oder 100 bp der 5'- und/oder 3'-Region der Nukleinsäuresequenz verwendet.
Der Fachmann weiß, dass es, ausgehend von den hierin als dem Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, offenbarten Nukleinsäuresequenzen, möglich ist, die UTRs der Moleküle zu isolieren. Insbesondere weiß der Fachmann, wie man die 5'- und/oder 3'-Regionen der Nukleinsäuresequenzen isoliert, insbesondere die 5'- und/oder 3'-Regionen der in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, Anmeldung Nr. 1, aufgeführten Moleküle, sofern nicht hierin bereits offenbart, z. B. ausgehend von dem oben unter den Absatzteilen (a) bis (j) von Absatz [0252] erwähnten Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise ausgehend von einem Nukleinsäuremolekül, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst, wie es in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist.
5'- und 3'-Regionen können durch verschiedene Verfahren isoliert werden, wie etwa RACE (Zang and Frohman, Methods Mol Biol 69, 61 (1997)) oder Genom-Walking-PCR-Techniken (Mishra et al., Biotechniques 33 (4), 830 (2002); Spertini et al., Biotechniques 27 (2), 308 (1999)).
Die vorangehend erwähnten Verfahrensschritte der Reduktion oder Deletion der biologischen Aktivität, repräsentiert durch das Protein der Erfindung, führen zu einem erhöhten Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhter Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhter Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze.
Eine Reduktion in der Aktivität oder der Funktion wird vorzugsweise durch eine reduzierte Expression eines Gens erzielt, welches das Protein des erfindungsgemäßen Verfahrens codiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung kann die Reduktion der Aktivität oder Funktion der Aktivität eines Genproduktes, codierend das Nukleinsäuremolekül oder das Polypeptid, welches gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. ein Polypeptid, codiert von Nukleinsäuremolekülen, umfassend die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, gezeigten Nukleinsäuremoleküle, oder ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenzen, Konsensussequenzen oder Polypeptidmotive, welche in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, gezeigt sind, oder ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die Nukleinsäuremoleküle, gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenzen, Konsensussequenzen oder Polypeptidmotive, gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, zum Beispiel unter Anwendung der folgenden Verfahren erreicht werden:

(a) Einführen einer doppelsträngigen RNA-Nukleinsäuresequenz (dsRNA), wie oben beschrieben, oder einer Expressionskassette, oder mehr als einer Expressionskassette, welche die Expression der Letztgenannten gewährleistet;
(b) Einführen einer Antisense-Nukleinsäuresequenz oder einer Expressionskassette, welche die Expression der Letztgenannten gewährleistet. Inbegriffen sind diejenigen Verfahren, in welchen die Antisense-Nukleinsäuresequenz gegen ein Gen (d. h. genomische DNA-Sequenzen einschließlich der Promotorsequenz) oder ein Gentranskript (d. h. RNA-Sequenzen), einschließlich der nicht-translatierten 5'- und 3'-Regionen, gerichtet ist. Ebenfalls eingeschlossen sind alpha-anomere Nukleinsäuresequenzen;
(c) Einführen einer Antisense-Nukleinsäuresequenz in Kombination mit einem Ribozym oder einer Expressionskassette, welche die Expression der Erstgenannten gewährleistet;
(d) Einführen von Sense-Nukleinsäuresequenzen zur Herbeiführung von Cosuppression oder einer Expressionskassette, welche die Expression der Erstgenannten gewährleistet;
(e) Einführen einer Nukleinsäuresequenz, welche ein dominant-negatives Protein codiert, oder einer Expressionskassette, welche die Expression des Letzteren gewährleistet;
(f) Einführen von DNA-, RNA- oder Protein-Bindungsfaktor oder Antikörpern gegen Gene, RNAs oder Proteine, oder einer Expressionskassette, welche die Expression der Letztgenannten gewährleistet;
(g) Einführen von viralen Nukleinsäuresequenzen und Expressionskonstrukten, welche den Abbau von RNA herbeiführen, oder einer Expressionskassette, welche die Expression der Erstgenannten gewährleistet;
(h) Einführen von Konstrukten zum Induzieren einer homologen Rekombination auf endogenen Genen, beispielsweise zur Erzeugung von Knockout-Mutanten;
(i) Einführen von Mutationen in endogene Gene zur Erzeugung eines Funktionsverlustes (z. B. Erzeugung von Stopcodons, Leseraster-Verschiebungen und dergleichen);
(j) Einführen einer microRNA oder micro-RNA (miRNA), welche entworfen worden ist, um auf das Gen von Interesse abzuzielen, um einen Abbau oder eine Translationsinhibition der mRNA des Gens von Interesse zu induzieren und dadurch die Genexpression zu silencen, oder einer Expressionskassette, welche die Expression der Erstgenannten gewährleistet;
(k) Einführen einer ta-siRNA, welche entworfen worden ist, um auf das Gen von Interesse abzuzielen, um den Abbau oder die Translationsinhibition der mRNA des Gens von Interesse zu induzieren und dadurch die Genexpression zu silencen, oder einer Expressionskassette, welche die Expression der Erstgenannten gewährleistet; und/oder
(l) Identifizieren einer nicht-stummen Mutation, z. B. Erzeugung von Stopcodons, Leseraster-Verschiebungen, Inversionen und dergleichen, in einer statistisch mutagenisierten Population, z. B. gemäß dem sogenannten TILLING-Verfahren.

Jedes dieser Verfahren kann eine Reduktion der Expression, der Aktivität oder der Funktion für die Zwecke der Erfindung herbeiführen. Auch eine kombinierte Anwendung ist durchführbar. Dem Fachmann auf dem Gebiet sind weitere Verfahren bekannt, und diese können alle möglichen Schritte der Genexpression umfassen, wie zum Beispiel eine Behinderung oder Verhinderung der Prozessierung des Proteins, des Transportes des Proteins oder seiner mRNA, die Inhibition der Ribosomenanlagerung, die Inhibition des RNA-Spleißens, die Induktion eines Enzyms, welches RNA oder das Protein der Erfindung abbaut, und/oder die Inhibition der translationalen Elongation oder Termination.
Demgemäß betreffen die folgenden Absätze vorzugsweise die Unterdrückung, Reduktion, Verringerung oder Deletion einer Aktivität, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und die SET-Domäne enthaltendem Protein, oder einer Aktivität, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül oder Polypeptid, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise von Spalte 5, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise von Spalte 5.
Es folgt nun eine kurze Beschreibung der einzelnen bevorzugten Verfahren.

a) Einführen einer doppelsträngigen RNA-Nukleinsäuresequenz (dsRNA), z. B. für die Reduktion oder Deletion der Aktivität des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polynukleotid, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, umfasst oder ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, codiert.

Das Verfahren zum Regulieren von Genen mittels doppelsträngiger RNA (”doppelsträngige RNA-Interferenz”; dsRNAi) ist ausführlich für Tiere, Hefen, Pilze und Pflanzenorganismen, wie Neurospora, Zebrafisch, Drosophila, Mäuse, Planarien, Menschen, Trypanosoma, Petunia oder Arabidopsis beschrieben worden (siehe zum Beispiel, Matzke MA et al., Plant Mol. Biol. 43, 401 (2000); Fire A. et al., Nature 391, 806 (1998); WO 99/32619 ; WO 99/53050 ; WO 00/68374 ; WO 00/44914 ; WO 00/44895 ; WO 00/49035 ; WO 00/63364 ). Darüber hinaus ist RNAi ebenfalls als ein vorteilhaftes Werkzeug für die Unterdrückung von Genen in Bakterien, wie E. coli, dokumentiert worden, zum Beispiel von Tchurikov et al. (J. Biol. Chem., 275 (34), 26523 (2000)). Fire et al. nannten das Phänomen RNAi, und zwar nach der RNA-Interferenz. Die in den obenstehenden Bezugsstellen beschriebenen Techniken und Verfahren werden hierin ausdrücklich als Bezugsstellen einbezogen. Eine effiziente Gensuppression kann auch in dem Fall einer transienten Expression oder im Anschluss an eine transiente Transformation beobachtet werden, zum Beispiel als Folge einer Biolistik-Transformation (Schweizer P. et al., Plant J 24, 895 (2000)). dsRNAi-Verfahren basieren auf dem Phänomen, dass die gleichzeitige Einführung von Komplementärstrang und Gegenstrang eines Gentranskripts eine hocheffektive Unterdrückung der Expression des betreffenden Gens herbeiführt. Der resultierende Phänotyp ist sehr ähnlich zu demjenigen einer analogen Knockout-Mutante (Waterhouse P. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13959 (1998)).
Tuschl et al., Gens Dev., 13 (24), 3191 (1999), vermochten zu zeigen, dass die Effizienz des RNAi-Verfahrens eine Funktion der Länge des Doppelstranges, der Länge der Überhänge am 3'-Ende und der Sequenz in diesen Überhängen ist.
Demzufolge handelt es sich bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung um ein doppelsträngiges RNA-Molekül (dsRNA), welches – nachdem es in einem geeigneten Organismus, z. B. einer Pflanze oder einem Teil davon, eingeführt oder exprimiert wurde – die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion einer/der Aktivität vermittelt, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendes Protein.
Basierend auf der Arbeit von Tuschl et al. und unter der Annahme, dass die zugrunde liegenden Prinzipien zwischen verschiedenen Spezies konserviert sind, können dem Fachmann die folgenden Richtlinien gegeben werden. Folglich erfüllt das erfindungsgemäße oder im Verfahren der Erfindung verwendete dsRNA-Molekül vorzugsweise mindestens eines der nachstehenden Prinzipien:

– zum Erreichen guter Ergebnisse sollten die untranslatierten 5'- und 3'-Regionen der verwendeten Nukleinsäuresequenz, und Regionen nahe zum Start-Codon, im Allgemeinen vermieden werden, da diese Regionen reicher an regulatorischen Protein-Bindungsstellen sind, und Wechselwirkungen zwischen RNAi-Sequenzen und derartigen regulatorischen Proteinen zu unerwünschten Wechselwirkungen führen könnten;
– in Pflanzen ergeben die untranslatierten 5'- und 3'-Regionen der verwendeten Nukleinsäuresequenz und Regionen nahe zum Start-Codon, vorzugsweise 50 bis 100 nt stromaufwärts des Start-Codons, gute Ergebnisse und sollten daher nicht vermieden werden;
– vorzugsweise wird eine Region der verwendeten mRNA ausgewählt, welche 50 bis 100 nt (= Nukleotide oder Basen) stromabwärts des AUG-Start-Codons liegt;
– nur dsRNA(= doppelsträngige RNA)-Sequenzen aus Exons sind für das Verfahren nützlich, da Sequenzen aus Introns keinen Effekt haben;
– der G/C-Gehalt in dieser Region sollte größer als 30% und geringer als 70%, idealerweise ungefähr 50% sein;
– eine mögliche Sekundärstruktur der Ziel-mRNA ist für den Effekt des RNAi-Verfahrens weniger bedeutsam.

Das dsRNAi-Verfahren kann besonders wirksam und vorteilhaft zum Reduzieren der Expression des Nukleinsäuremoleküls sein, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere bei einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, und/oder Homologe davon. Wie unter anderem in WO 99/32619 beschrieben wird, sind dsRNAi-Vorgehensweisen den herkömmlichen Antisense-Vorgehensweisen deutlich überlegen.
Demgemäß betrifft die Erfindung deshalb außerdem doppelsträngige RNA-Moleküle (dsRNA-Moleküle), welche, bei Einführung in einen Organismus, vorteilhafterweise in eine Pflanze (oder eine Zelle, ein Gewebe, ein Organ oder einen Samen, welche von dieser abgeleitet sind), eine veränderte metabolische Aktivität herbeiführen durch die Reduktion der Expression des Nukleinsäuremoleküls, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, und/oder Homologe davon.
In einem doppelsträngigen RNA-Molekül der Erfindung, z. B. einer dsRNA zum Reduzieren der Expression eines Proteins, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie es in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist, und/oder Homologe davon,

i) ist einer der zwei RNA-Stränge im wesentlichen identisch zu wenigstens einem Teil einer Nukleinsäuresequenz, und
ii) ist der jeweils andere RNA-Strang im wesentlichen identisch zu wenigstens einem Teil des komplementären Stranges einer Nukleinsäuresequenz.

Der Ausdruck ”im wesentlichen identisch” bezieht sich auf die Tatsache, dass die dsRNA-Sequenz auch Insertionen, Deletionen und einzelne Punktmutationen im Vergleich zu der Zielsequenz einschließen kann, während sie immer noch eine effektive Reduktion der Expression herbeiführt. Vorzugsweise beträgt die Identität, wie oben definiert, wenigstens 30%, bevorzugt wenigstens 40%, 50%, 60%, 70% oder 80%, speziell bevorzugt mindestens 90%, am stärksten bevorzugt 100%, zwischen dem ”Sense”-Strang einer inhibitorischen dsRNA und einem Teilsegment einer Nukleinsäuresequenz der Erfindung, einschließlich, in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, ihrer endogenen untranslatierten 5'- und 3'-Regionen, oder aber zwischen dem ”Antisense”-Strang und dem komplementären Strang einer Nukleinsäuresequenz. Das Teilsegment weist eine Länge von wenigstens 10 Basen, vorzugsweise wenigstens 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 Basen, speziell bevorzugt wenigstens 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Basen, sehr speziell bevorzugt wenigstens 100, 200, 300 oder 400 Basen, am stärksten bevorzugt wenigstens 500, 600, 700, 800, 900 oder mehr Basen oder wenigstens 1000 oder 2000 Basen oder mehr auf. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beläuft sich das Teilsegment auf 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 oder 27 Basen, vorzugsweise auf 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Basen. Diese kurzen Sequenzen werden in Tieren und Pflanzen bevorzugt. Die längeren Sequenzen, vorzugsweise zwischen 200 und 800 Basen, werden in Nicht-Säugetieren, vorzugsweise in Wirbellosen, in Hefe, Pilzen oder Bakterien, bevorzugt, aber sie sind auch in Pflanzen anwendbar. Lange doppelsträngige RNAs werden in den Organismen zu vielen siRNAs (= kleine/kurze interferierende RNAs) prozessiert, zum Beispiel durch das Protein Dicer, bei welchem es sich um ein ds-spezifisches Rnase III-Enzym handelt. Als eine Alternative kann eine ”im wesentlichen identische” dsRNA auch als eine Nukleinsäuresequenz definiert werden, welche zum Hybridisieren mit einem Teil eines Gentranskripts in der Lage ist (zum Beispiel in 400 mM NaCl, 40 mM PIPES, pH 6,4, 1 mM EDTA bei 50°C oder 70°C während 12 bis 16 h).
Die dsRNA kann aus einem oder mehreren Strängen von polymerisierten Ribonukleotiden bestehen. Eine Modifikation sowohl des Zucker-Phosphat-Gerüstes als auch der Nukleoside kann ebenfalls vorliegen. So können zum Beispiel die Phosphodiesterbindungen der natürlichen RNA auf eine solche Weise modifiziert sein, dass sie wenigstens ein Stickstoff- oder Schwefel-Heteroatom umfassen. Die Basen können einer Modifikation auf eine derartige Weise unterzogen werden, dass zum Beispiel die Aktivität von Adenosin-Desaminase begrenzt wird. Diese und andere Modifikationen werden hierin nachstehend in den Verfahren zum Stabilisieren von Antisense-RNA beschrieben.
Die dsRNA kann enzymatisch hergestellt werden; sie kann außerdem entweder vollständig oder teilweise chemisch synthetisiert werden. Kurze dsRNA bis zu 30 bp, welche eine RNA-Interferenz in wirksamer Weise vermittelt, kann beispielsweise effizient durch einen partiellen Verdau von langen dsRNA-Matrizen unter Verwendung von E. coli-Ribonuklease III (RNase III) hergestellt werden (Yang, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 9942 (2002))
Die doppelsträngige Struktur kann ausgehend von einem einzelnen, selbst-komplementären Strang oder ausgehend von zwei komplementären Strängen gebildet werden. Bei einem einzelnen, selbst-komplementären Strang können ”Sense”- und ”Antisense”-Sequenz durch eine Verknüpfungssequenz (”Linker”) verbunden sein und beispielsweise eine Haarnadelstruktur ausbilden. Vorzugsweise kann die Verknüpfungssequenz die Form eines Introns einnehmen, welches im Anschluss an die dsRNA-Synthese herausgespleißt wird. Die Nukleinsäuresequenz, welche eine dsRNA codiert, kann weitere Elemente enthalten, wie zum Beispiel Transkriptionsterminationssignale oder Polyadenylierungssignale. Wenn die zwei Stränge der dsRNA in einer Zelle oder einem Organismus, vorzugsweise in einer Pflanze, kombiniert werden sollen, kann dies auf verschiedenen Wegen herbeigeführt werden:

(a) Transformation der Zelle oder des Organismus, vorteilhafterweise einer Pflanze, mit einem Vektor, der die zwei Expressionskassetten umfasst;
(b) Cotransformation der Zelle oder des Organismus, vorteilhafterweise einer Pflanze, mit zwei Vektoren, von denen einer die Expressionskassetten mit dem ”Sense”-Strang umfasst, während der andere die Expressionskassetten mit dem ”Antisense”-Strang umfasst;
(c) Supertransformation der Zelle oder des Organismus, vorteilhafterweise einer Pflanze, mit einem Vektor, umfassend die Expressionskassetten mit dem ”Sense”-Strang, nachdem die Zelle oder der Organismus bereits mit einem Vektor transformiert worden ist, welcher die Expressionskassetten mit dem ”Antisense”-Strang umfasst, oder umgekehrt;
(d) Hybridisieren, z. B. Kreuzung von zwei Organismen, vorteilhafterweise Pflanzen, von denen jede mit einem Vektor transformiert worden ist, von denen einer die Expressionskassette mit dem ”Sense”-Strang umfasst, während der andere die Expressionskassette mit dem ”Antisense”-Strang umfasst;
(e) Einbringen eines Konstruktes, umfassend zwei Promotoren, welche zur Transkription der gewünschten Sequenz aus beiden Richtungen führen; und/oder
(f) Infizieren der Zelle oder des Organismus, vorteilhafterweise einer Pflanze, mit einem konstruierten Virus, das zur Herstellung des gewünschten dsRNA-Moleküls befähigt ist.

Die Bildung des RNA-Doppelstranges kann entweder außerhalb der Zelle oder innerhalb der Zelle initiiert werden. Wenn die dsRNA außerhalb der Zielzelle oder des Zielorganismus synthetisiert wird, kann sie in den Organismus oder eine Zelle des Organismus durch Injektion, Mikroinjektion, Elektroporation, Hochgeschwindwigkeitspartikel, mittels Laserstrahl oder vermittelt durch chemische Verbindungen (DEAE-Dextran, Calciumphosphat, Liposomen) eingeführt werden, oder, im Falle von Tieren, ist es ebenfalls möglich, Bakterien, wie etwa E. coli-Stämme, welche manipuliert wurden, um doppelsträngige RNAi zu exprimieren, an die Tiere zu verfüttern.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, eine dsRNA, wobei der Sense-Strang des doppelsträngigen RNA-Nukleinsäuremoleküls eine Identität von wenigstens 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% oder 60%, vorzugsweise 65%, 70%, 75% oder 80%, weiter bevorzugt 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, oder stärker bevorzugt 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% zu einem Nukleinsäuremolekül aufweist, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein dsRNA-Molekül, umfassend ein Fragment von wenigstens 10 Basenpaaren (= Basen, nt, Nukleotide), vorzugsweise wenigstens 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 oder 50, speziell bevorzugt wenigstens 55, 60, 70, 80 oder 90 Basenpaare, speziell bevorzugt wenigstens 100, 200, 300 oder 400 Basenpaare, am stärksten bevorzugt wenigstens 500, 600, 700, 800, 900 oder mehr Basenpaare oder mindestens 1000 oder 2000 Basenpaare eines Nukleinsäuremoleküls mit einer Identität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80% oder 90%, vorzugsweise 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% zu einem Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder zu dem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid-Protein codiert, umfassend ein Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beläuft sich die codierte Sequenz oder ihr Teilsegment des dsRNA-Moleküls auf 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 oder 27 Basen, vorzugsweise auf 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Basen, wobei die Identität der Sequenz im wesentlichen 95%, 96%, 97%, 98% oder bevorzugt 99% oder 100% beträgt.
Die Expression des dsRNA-Moleküls der Erfindung vermittelt den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwer tungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze im Organismus oder einem Teil davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind der Sense- und Antisense-Strang der doppelsträngigen RNA kovalent gebunden oder sind durch andere, z. B. schwache chemische Bindungen, wie etwa Wasserstoffbrücken, aneinander gebunden, und der Antisense-Strang ist im wesentlichen das Komplement des Sense-RNA-Stranges.
Wie in der WO 99/53050 gezeigt, kann die dsRNA auch eine Haarnadelstruktur umfassen, und zwar durch Verknüpfen der ”Sense”- und ”Antisense”-Stränge über einen ”Linker” (zum Beispiel ein Intron), was hierin durch die Bezugnahme einbezogen ist. Die selbst-komplementären dsRNA-Strukturen sind bevorzugt, da sie lediglich die Expression eines Konstruktes erfordern und stets die komplementären Stränge in einem äquimolaren Verhältnis umfassen.
Die Expressionskassetten, welche den ”Antisense”- oder den ”Sense”-Strang der dsRNA oder den selbst-komplementären Strang der dsRNA codieren, werden vorzugsweise in einen Vektor inseriert und stabil in das Genom einer Pflanze inseriert, wobei die hierin nachstehend beschriebenen Verfahren angewandt werden (zum Beispiel mit Hilfe von Selektionsmarkern), um eine permanente Expression der dsRNA zu gewährleisten. Eine transiente Expression mit bakteriellen oder viralen Vektoren ist in ähnlicher Weise brauchbar.
Die dsRNA kann unter Verwendung einer Menge eingebracht werden, welche zumindest eine Kopie pro Zelle ermöglicht. Eine größere Menge (zum Beispiel mindestens 5, 10, 100, 500 oder 1000 Kopien pro Zelle) kann eine effizientere Reduktion herbeiführen.
Wie bereits beschrieben worden ist, ist nicht notwendigerweise eine 100%ige Sequenzidentität zwischen der dsRNA und einem Gentranskript von einem Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. von einem der Moleküle, umfassend ein Molekül, wie gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, oder dessen Homolog, erforderlich, um eine effektive Reduktion der Expression herbeizuführen. Der Vorteil besteht demgemäß darin, dass das Verfahren tolerant hinsichtlich Sequenzabweichungen ist, wie sie als Folge von genetischen Mutationen, Polymorphismen oder evolutionären Divergenzen vorhanden sein können. Daher kann die Verwendung der dsRNA, welche ausgehend von einem Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. von einem der Moleküle, umfassend ein Molekül, wie gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Motiv, wie gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, oder Homologen davon, des einen Organismus erzeugt worden ist, angewandt werden, um die entsprechende Expression in einem anderen Organismus zu unterdrücken.
Das hohe Ausmaß an Sequenzhomologie oder -identität zwischen gemäß dem Verfahren der Erfindung zu reduzierenden Nukleinsäuremolekülen aus verschiedenen Organismen (z. B. Pflanzen), zum Beispiel von einem der Moleküle, umfassend ein Molekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise von Tabelle IB, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise Tabelle IIB, erlaubt die Schlussfolgerung, dass diese Proteine wahrscheinlich innerhalb der Evolution zu einem hohen Grad konserviert sind, beispielsweise auch in anderen Pflanzen, und dass es deswegen gegebenenfalls möglich ist, dass die Expression einer dsRNA, die aus einem der offenbarten Nukleinsäuremoleküle, welche gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden sollen, z. B. von einem der Moleküle, umfassend ein Molekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, oder Homologen davon, abgeleitet ist, ebenfalls einen vorteilhaften Effekt in anderen Pflanzenspezies aufweisen sollte.
Die dsRNA kann entweder in vivo oder in vitro synthetisiert werden. Zu diesem Zweck kann eine DNA-Sequenz, welche eine dsRNA codiert, unter der Steuerung von mindestens einem genetischen Kontrollelement (wie zum Beispiel Promotor, Enhancer, Silencer, Splice-Donor oder Splice-Acceptor oder Polyadenylierungssignal) in eine Expressionskassette eingebracht werden. Geeignete vorteilhafte Konstrukte sind hierin nachstehend beschrieben. Die Polyadenylierung ist nicht erforderlich, und ebenso wenig müssen die Elemente zum Initiieren der Translation vorhanden sein.
Eine dsRNA kann chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden. Zelluläre RNA-Polymerasen oder Bakteriophagen-RNA-Polymerasen (wie zum Beispiel T3-, T7- oder SP6-RNA-Polymerase) können für diesen Zweck verwendet werden. Geeignete Verfahren zur In-vitro-Expression von RNA sind beschrieben worden ( WO 97/32016 ; US 5 593 874 ; US 5 698 425 , US 5 712 135 , US 5 789 214 , US 5 804 693 ). Vor der Einbringung in eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus kann eine dsRNA, welche in vitro entweder chemisch oder enzymatisch synthetisiert worden ist, zu einem höheren oder geringeren Grad aus der Reaktionsmischung isoliert werden, beispielsweise durch Extrakti on, Fällung, Elektrophorese, Chromatographie oder Kombinationen dieser Verfahren. Die dsRNA kann direkt in die Zelle eingeführt oder ansonsten extrazellulär appliziert werden (z. B. in den interstitiellen Raum hinein). In einer Ausführungsform der Erfindung führt das RNAi-Verfahren lediglich zu einem teilweisen Verlust der Genfunktion und ermöglicht dem Fachmann deshalb, einen Gen-Dosis-Effekt im gewünschten Organismus zu untersuchen und eine Feinabstimmung am Verfahren der Erfindung vorzunehmen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform führt es zu einem vollständigen Verlust der Funktion und erhöht deshalb den Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine Nährstoffverwertungseffizienz, wie etwa Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder die Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder die Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze. Ferner ermöglicht es dem Fachmann, mehrere Funktionen eines Gens zu untersuchen.
Die stabile Transformation der Pflanze mit einem Expressionskonstrukt, welches die Expression der dsRNA herbeiführt, wird jedoch bevorzugt. Geeignete Verfahren sind hierin nachstehend beschrieben.

b) Einbringen einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, z. B. für die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1.

Verfahren zum Unterdrücken eines spezifischen Proteins durch Verhindern der Akkumulierung seiner mRNA mittels der ”Antisense”-Technologie können im weiten Umfang angewandt werden und sind umfassend beschrieben worden, wobei auch Pflanzen eingeschlossen sind; Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8805 (1988); US 4,801,34100 ; Mol J. N. et al., FEBS Lett 268 (2), 427 (1990). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül hybridisiert mit, oder bindet mit, der zellulären mRNA und/oder der genomischen DNA, welche das zu unterdrückende Zielprotein codiert. Dieses Verfahren unterdrückt die Transkription und/oder Translation des Zielproteins. Die Hybridisierung kann in einer herkömmlichen Weise über die Bildung eines stabilen Doppelstranges bzw. Duplex, oder, im Fall von genomischer DNA, durch die Bindung des Antisense-Nukleinsäuremoleküls an den Duplex der genomischen DNA durch spezifische Wechselwirkung in der großen Furche der DNA-Helix herbeigeführt werden.
In einer Ausführungsform umfasst ein ”Antisense”-Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, welche wenigstens teilweise komplementär zu einem ein Protein codierenden ”Sense”-Nukleinsäuremolekül, z. B. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer codierenden mRNA-Sequenz ist. Folglich kann ein Antisense-Nukleinsäuremolekül durch Wasserstoffbrücken an ein Sense-Nukleinsäuremolekül binden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zu einem gesamten codierenden Strang eines Nukleinsäuremoleküls, welches die Expression des Polypeptids vermittelt, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder welches das Nukleinsäuremolekül umfasst, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder lediglich zu einem Abschnitt davon komplementär sein. Folglich kann ein Antisense-Nukleinsäuremolekül der Antisinn zu einer ”codierenden Region” des codierenden Stranges einer Nukleotidsequenz eines Nükleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung sein.
Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf die Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die zu Aminosäureresten translatiert werden.
In einer anderen Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül der Antisinn zu einer ”nicht-codierenden Region” der mRNA, welche die codierende Region einer Nukleotidsequenz flankiert. Der Begriff ”nicht-codierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren, und welche nicht zu einem Polypeptid translatiert werden, d. h. sie werden ebenfalls als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen (5'-UTR oder 3'-UTR) bezeichnet. In vorteilhafter Weise befindet sich die nicht-codierende Region im Bereich von 50 bp, 100 bp, 200 bp oder 300 bp, vorzugsweise 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp oder 1000 bp stromauf- und/oder stromabwärts von der codierenden Region.
Wenn die Sequenzen des codierenden Stranges, codierend das Polypeptid oder das Nukleinsäuremolekül, welches im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. aufweisend die oben stehend erwähnte Aktivität, z. B. die Aktivität eines Polypeptids mit der Aktivität des Proteins, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, wie hierin offenbart, vorgegeben sind, können Antisense-Nukleinsäuremoleküle gemäß den Regeln der Basenpaarung nach Watson und Crick entworfen werden.
Folglich ist noch eine andere Ausführungsform der Erfindung ein Antisense-Nukleinsäuremolekül, welches – nachdem es in einem geeigneten Organismus, z. B. einer Pflanze oder einem Teil davon, exprimiert worden ist – die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der bzw. einer Aktivität herbeiführt, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendes Protein besteht.
Folglich betrifft die Erfindung, in einer anderen Ausführungsform, ein Antisense-Nukleinsäuremolekül, wobei das Antisense-Nukleinsäuremolekül eine Identität von wenigstens 30%, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, insbesondere 70%, 80%, 85%, 90%, 95% zu einem Nukleinsäuremolekül-Antisinn zu einem Nukleinsäuremolekül, codierend das Protein, wie gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Protein, umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder welches codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder einem Homolog davon, wie hierin beschrieben, aufweist und jeweilig einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, nach seiner Expression herbeiführt.
Somit umfasst, in einer anderen Ausführungsform, das Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Fragment von mindestens 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 oder 50, besonders bevorzugt mindestens 60, 70, 80 oder 90 Basenpaaren, noch weiter bevorzugt mindestens 100, 200, 300 oder 400 Basenpaaren, am stärksten bevorzugt mindestens 500, 600, 700, 800, 900 oder mehr Basenpaaren oder wenigstens der gesamten Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls, mit einer Identität von wenigstens 50%, 60%, 70%, 80% oder 90%, vorzugsweise 100% zu einem Antisense-Nukleinsäuremolekül zu einem Nukleinsäuremolekül, welches die Expression eines Proteins, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, herbeiführt oder ein Protein, das eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst oder codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder einem Homolog davon, wie hierin beschrieben, codiert, und welches nach seiner Expression eine Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. NUE, und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, herbeiführt.
Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche zum Reduzieren der Aktivität eines Proteins geeignet ist, kann unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz, welche dieses Protein codiert, beispielsweise der Nukleinsäuresequenz, deren Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, (oder Homologen, Analogen, Paralogen, Orthologen davon), abgeleitet werden durch Anwenden der Basenpaarungs-Regeln nach Watson und Crick. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann komplementär zur Gesamtheit der transkribierten mRNA des Proteins sein; sie kann begrenzt sein auf die codierende Region oder sie kann lediglich aus einem Oligonukleotid bestehen, welches komplementär zu einem Teil der codierenden oder nicht-codierenden Sequenz der mRNA ist. So kann das Oligonukleotid beispielsweise komplementär zu der Nukleinsäureregion sein, welche den Translationsstart für das Protein umfasst. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können eine vorteilhafte Länge von beispielsweise 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden aufweisen, aber sie können auch länger sein und mindestens 100, 200, 500, 1000, 2000 oder 5000 Nukleotide umfassen. Eine besonders bevorzugte Länge beträgt zwischen 15 und 30 Nukleotide, wie etwa 15, 20, 25 oder 30 Nukleotide. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können rekombinant exprimiert oder chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden, wobei dem Fachmann bekannte Verfahren zum Einsatz kommen. Beispielsweise kann ein Antisense-Nukleinsäuremolekül (z. B. ein Antisense-Oligonukleotid) chemisch synthetisiert werden unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder verschiedenartig modifizierten Nukleotiden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuren gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden können. Beispiele für Substanzen, welche verwendet werden können, sind Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide, wie etwa 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Methyluracil-5-oxyacetat, Uracil-5-oxyessigsäure, 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil und 2,6-Diaminopurin. Alternativ dazu kann die Antisense-Nukleinsäure biologisch mit Hilfe eines Expressionsvektors erzeugt werden, in den ein Nukleinsäuremolekül in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h. die RNA, welche von dem inserierten Nukleinsäuremolekül transkribiert wird, wird eine Antisense-Orientierung zu einem Zielnukleinsäuremolekül von Interesse aufweisen, was weiter im nachfolgenden Unterabschnitt beschrieben wird).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Expression von einem Protein, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. codiert von einem Nukleinsäuremolekül, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst, wie es in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist, oder von einem Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, oder Homologen, Analo gen, Paralogen, Orthologen davon, durch Nukleotidsequenzen, welche komplementär zu der regulatorischen Region eines Gens (beispielsweise einem Promotor und/oder Enhancer) sind und welche Triplex-Strukturen mit der DNA-Doppelhelix in dieser Region ausbilden können, sodass die Transkription des Gens reduziert wird, inhibiert werden. Derartige Verfahren sind beschrieben worden (Helene C., Anticancer Drug Res. 6 (6), 569 (1991); Helene C. et al., Ann. NY Acad. Sci. 660, 27 (1992); Maher L. J., Bioassays 14 (12), 807 (1992)).
In einer weiteren Ausführungsform kann das Antisense-Nukleinsäuremolekül eine alpha-anomere Nukleinsäure sein. Derartige alpha-anomere Nukleinsäuremoleküle bilden spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen – im Gegensatz zu den herkömmlichen b-Nukleinsäuren – die zwei Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier C et al., Nucleic Acids Res. 15, 6625 (1987)). Darüber hinaus kann das Antisense-Nukleinsäuremolekül auch 2'-O-Methylribonukleotide (Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15, 6131 (1987)) oder chimäre RNA-DNA-Analoga (Inoue et al., FEBS Lett 215, 327 (1987)) umfassen.
Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung werden typischerweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, sodass sie mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA, welche ein Polypeptid codiert, aufweisend die Aktivität von Protein, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder ein Nukleinsäuremolekül codiert, aufweisend die Aktivität des Nukleinsäuremoleküls, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, hybridisieren oder daran binden und dadurch die Expression des Proteins, z. B. durch Inhibieren der Transkription und/oder Translation, hemmen und zu dem oben erwähnten erhöhten Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhter Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhter Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, führen.
Das Antisense-Molekül der vorliegenden Erfindung umfasst ebenfalls ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die zu der regulatorischen Region einer Nukleotidsequenz, welche das natürlich vorkommende Polypeptid der Erfindung, z. B. die Polypeptidsequenzen, welche in der Sequenzauflistung gezeigt sind oder gemäß der hierin beschriebenen Verfahren identifiziert werden, codiert, z. B. ihrem Promotor und/oder ihrem Enhancer, komplementär ist, wodurch z. B. tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern; siehe allgemein, Helene C., (1991) Anticancer Drug Des. 6 (6), 569 (1991); Helene C. et al., (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27 (1992); und Maher L. J., Bioassays 14 (12), 807 (1992).

c) Einbringen einer mit einem Ribozym kombinierten Antisense-Nukleinsäuresequenz, z. B. für die Reduktion oder Deletion der Aktivität des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, wie es in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist.

Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Ribozym, welches – nachdem es in einem geeigneten Organismus, z. B. einer Pflanze oder einem Teil davon, exprimiert worden ist – die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion der Aktivität herbeiführt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendes Protein.
Daher betrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Ribozym, welches ein Nukleinsäuremolekül, das die Expression eines Proteins vermittelt, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in der Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder ein Homolog davon, wie hierin beschrieben, spezifisch spaltet und welches, nach seiner Expression, eine Steigerung des Ertrag, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. NUE, und/oder eine Erhöhung der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze herbeiführt.
Es ist vorteilhaft, die oben beschriebene Antisense-Strategie mit einem Ribozym-Verfahren zu kombinieren. Katalytische RNA-Moleküle oder Ribozyme können an eine beliebige Ziel-RNA angepasst werden und spalten das Phosphodiester-Gerüst an spezifischen Positionen, wodurch die Ziel-RNA funktionell deaktiviert wird (Tanner N. K., FEMS Microbiol. Rev. 23 (3), 257 (1999)). Das Ribozym an sich wird dadurch nicht modifiziert, sondern ist in der Lage, weitere Ziel-RNA-Moleküle in einer analogen Weise zu spalten, wodurch es die Eigenschaften eines Enzyms annimmt. Die Einbindung von Ribozymsequenzen in ”Antisense”-RNAs verleiht diese enzym-ähnliche RNA-Spaltungseigenschaft an genau diese ”Antisense”-RNAs und erhöht damit deren Effizienz zum Inaktivieren der Ziel-RNA. Die Herstellung und die Verwendung von geeigneten Ribozym-”Antisense”-RNA-Molekülen ist beispielsweise von Haseloff et al., (1988) Nature 33410, 585 (1988), beschrieben worden.
Ferner kann das Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung auch ein Ribozym sein. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zur Spaltung einer einzelsträngigen Nukleinsäure, wie zum Beispiel einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, fähig sind. Auf diese Weise können Ribozyme (beispielsweise ”Hammerkopf”-Ribozyme; Haselhoff und Gerlach, Nature 33410, 585 (1988)) verwendet werden, um die mRNA eines Enzyms, welches unterdrückt werden soll, katalytisch zu spalten und die Translation zu verhindern. Die Ribozym-Technologie kann die Effektivität einer Antisense-Strategie erhöhen. Verfahren zum Exprimieren von Ribozymen zum Reduzieren spezifischer Proteine sind in ( EP 0 291 533 , EP 0 321 201 , EP 0 360 257 ) beschrieben. Ribozym-Expression ist auch für Pflanzenzellen beschrieben worden (Steinecke P. et al., EMBO J. 11 (4), 1525 (1992); de Feyter R. et al., Mol. Gen. Genet. 250 (3), 329 (1996)). Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel, wie beschrieben von Steinecke, P., Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Hrsg.: Galbraith et al., Academic Press, Inc. (1995), S. 449–460, durch Berechnen der Sekundärstrukturen von Ribozym-RNA und Ziel-RNA und durch deren Wechselwirkung identifiziert werden (Bayley, C. C., et al., Plant Mol. Biol. 18 (2), 353 (1992); Lloyd, A. M., und Davis, R. W., et al., Mol. Gen. Genet. 242 (6), 653 (1994)). Zum Beispiel können Derivate der L-19 IVS-RNA von Tetrahymena konstruiert werden, welche komplementäre Regionen zu der mRNA des zu unterdrückenden Proteins besitzen (siehe auch US 4 987 071 und US 5 116 742 ). Als eine Alternative können derartige Ribozyme auch aus einer Bibliothek einer Vielzahl von Ribozymen über ein Selektionsverfahren ermittelt werden (Bartel, D., und Szostak, J. W., Science 261, 1411 (1993)).

d) Einbringung einer (Sense)-Nukleinsäuresequenz zum Induzieren der Cosuppression, z. B. für die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1.

Folglich ist noch eine andere Ausführungsform der Erfindung ein Coexpressionskonstrukt, welches – nachdem es in einem geeigneten Organismus, z. B. einer Pflanze oder einem Teil davon, exprimiert worden ist – die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion einer Aktivität herbeiführt, die gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendes Protein.
Noch eine andere Ausführungsform(en) der Erfindung beinhaltet ein Coexpressionskonstrukt, welches die Abnahme bzw. den Abbau oder die Inaktivierung eines Moleküls, das die Expression eines Proteins, wie gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie gezeigt in Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon vermittelt, wie hierin beschrieben, herbeiführt, wobei es z. B. den Abbau oder die Inaktivierung des Nukleinsäuremoleküls oder des Polypeptids der Erfindung mit dem Ergebnis herbeiführt, dass der Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. NUE, und/oder die Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöht werden.
Die Expression einer Nukleinsäuresequenz in Sense-Orientierung kann zur Cosuppression der entsprechenden homologen endogenen Gene führen. Die Expression von Sense-RNA mit Homologie zu einem endogenen Gen kann die Expression des endogenen Gens reduzieren oder tatsächlich eliminieren, und zwar auf ähnliche Weise, wie für die folgenden Antisense-Vorgehensweisen beschrieben wurde: Jorgensen et al., Plant Mol. Biol. 31 (5), 957 (1996), Goring et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1770 (1991), Smith et al., Mol. Gen. Genet. 224, 447 (1990), Napoli et al., Plant Cell 2, 279 (1990) oder Van der Krol et al., Plant Cell 2, 291 (1990). In diesem Zusammenhang kann das eingebrachte Konstrukt entweder vollständig oder lediglich teilweise das zu reduzierende homologe Gen repräsentieren. Die Anwendung dieser Technik auf Pflanzen ist beispielsweise von Napoli et al., The Plant Cell 2, (1990), und in US 5 03410 323 beschrieben worden. Darüber hinaus kann die oben beschriebene Cosuppressionsstrategie in vorteilhafter Weise mit dem RNAi-Verfahren kombiniert werden, wie von Brummell et al., Plant J. 33, 793 (2003), beschrieben. Zumindest in Pflanzen ist es bei Cosuppressions-Vorgehensweisen vorteilhaft, starke oder sehr starke Promotoren zu verwenden. Jüngere Arbeiten, beispielsweise von Schubert et al., (Plant Journal 16, 2561 (2004)) haben gezeigt, dass Cosuppressionseffekte von einem genspezifischen Schwellenspiegel abhängig sind, wobei erst oberhalb davon eine Cosuppression auftritt.

e) Einbringen von Nukleinsäuresequenzen, welche ein dominant-negatives Protein codieren, z. B. für die Reduktion oder Deletion von Aktivität des Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, insbesondere eines Polypeptids, codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid oder eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1.

Folglich, ist noch eine andere Ausführungsform der Erfindung eine dominant-negative Mutante, welche – nachdem sie in einem geeigneten Organismus, z. B. einer Pflanze oder einem Teil davon, exprimiert worden ist – die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion einer Aktivität herbeiführt, die gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendes Protein.
Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung ist eine dominant-negative Mutante, welche die Abnahme oder Inaktivierung eines Polypeptids herbeiführt, das die Expression eines Proteins, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Polypeptids, umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen, davon vermittelt, wie hierin beschrieben, wobei z. B. die Abnahme oder Inaktivierung des Nukleinsäuremoleküls oder des Polypeptids der Erfindung mit dem Ergebnis herbeigeführt werden, dass der Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. NUE, und/oder die Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöht werden.
Die Funktion oder Aktivität eines Proteins kann in effizienter Weise ebenfalls durch Exprimieren einer dominant-negativen Variante des Proteins reduziert werden. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit Verfahren zum Reduzieren der Funktion oder Aktivität eines Proteins mittels Coexpression seiner dominant-negativen Form vertraut (Lagna, G., und Hemmati-Brivanlou, A., Current Topics in Developmental Biology 36, 75 (1998); Perlmutter, R. M., und Alberola-Ila, J., Current Opinion in Immunology 8 (2), 285 (1996); Sheppard, D., American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology 11 (1), 1 (1994); Herskowitz, I., Nature 329 (6136), 219 (1987)).
Eine dominant-negative Variante kann beispielsweise realisiert werden durch Austauschen einer Aminosäure von einem Polypeptid, codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder von einem Polypeptid, das ein Polypeptid oder eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst, oder Homologen davon.
Dieser Austausch kann beispielsweise durch einen computer-gestützten Vergleich (”Alignment”) bestimmt werden. Diese Mutationen zum Erzielen einer dominant-negativen Variante werden vorzugsweise auf der Ebene der Nukleinsäuresequenzen ausgeführt. Eine entsprechende Mutation kann zum Beispiel durch PCR-vermittelte In-vitro-Mutagenese unter Anwendung geeigneter Oligonukleotidprimer, mit deren Hilfe die gewünschte Mutation eingebracht wird, durchgeführt werden. Zu diesem Zweck werden Verfahren angewandt, mit denen der Fachmann auf dem Gebiet vertraut ist. Zum Beispiel kann das ”LA PCR in vitro Mutagenesis Kit” (Takara Shuzo, Kyoto) für diesen Zweck verwendet werden. Es ist ebenfalls möglich und dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, dass man durch Deletieren oder Verändern funktioneller Domänen, z. B. TF- oder anderer Signalisierungs-Komponenten, welche binden aber nicht aktivieren können, die Verringerung von Proteinaktivität erzielen kann.

f) Einbringung von DNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, z. B. für die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion einer Aktivität des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid oder eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1.

Demgemäß handelt es sich bei noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung um einen DNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, welcher – nachdem er in einem geeigneten Organismus, z. B. einer Pflanze oder in einem Teil davon, exprimiert worden ist – die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion einer Aktivität herbeiführt, die ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendes Protein.
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein DNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, welcher die Abnahme bzw. den Abbau oder die Inaktivierung eines Moleküls herbeiführt, das die Expression eines Proteins vermittelt, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Polypeptids, umfassend eine Consensus-Sequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder welches codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, wie hierin beschrieben, wobei z. B. die Abnahme oder Inaktivierung des Nukleinsäuremoleküls oder des Polypeptids der Erfindung herbeigeführt werden, mit dem Ergebnis, dass der Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. NUE und/oder Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, erhöht werden.
Eine Reduktion in der Expression eines Gens, codierend das Nukleinsäuremolekül oder das Polypeptid, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, insbesondere umfassend ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, oder Homologen davon gemäß der Erfindung, kann auch mit spezifischen DNA-Bindungsfaktoren erzielt werden, beispielsweise Faktoren des Typs der Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren. Diese Faktoren lagern sich an die genomische Sequenz des endogenen Zielgens an, vorzugsweise in den regulatorischen Regionen, und führen eine Unterdrückung des endogenen Gens herbei. Die Anwendung eines derartigen Verfahrens macht die Reduktion der Expression eines endogenen Gens möglich, ohne dass es notwendig wäre, die Sequenz des Letzteren rekombinant zu manipulieren. Derartige Verfahren zur Herstellung von relevanten Faktoren sind beschrieben in Dreier B. et al., J. Biol. Chem. 276 (31), 29466 (2001) und J. Mol. Biol. 303 (4), 489 (2000), Beerli R. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 25), 14628 (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (4), 1495 (2000) und J. Biol. Chem. 275 (42), 32617 (2000), Segal D. J. und Barbas C. F. 3rd, Curr. Opin. Chem. Biol. 4 (1), 3410 (2000), Kang J. S. und Kim J. S., J. Biol. Chem. 275 (12), 8742 (2000), Kim J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (8), 3616 (1997), Klug A., J. Mol. Biol. 293 (2), 215 (1999), Tsai S. Y. et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 30 (1–3), 23 (1998), Mapp A. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (8), 3930 (2000), Sharrocks A. D. et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 29 (12), 1371 (1997) und Zhang L. et al., J. Biol. Chem. 275 43), 33850 (2000). Beispiele für die Anwendung dieser Technologie in Pflanzen sind beschrieben worden in WO 01/52620 , Ordiz M. I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (20), 13290 (2002)) oder Guan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (20), 13296 (2002)).
Diese Faktoren können unter Verwendung eines beliebigen Abschnittes eines Gens ausgewählt werden. Dieses Segment befindet sich vorzugsweise in der Promotorregion. Für die Zwecke der Gensuppression kann es allerdings auch in der Region der codierenden Exons oder der Introns lokalisiert sein. Der Fachmann auf dem Gebiet kann die relevanten Segmente aus ”Genbank” mittels Datenbanksuche oder ausgehend von einer cDNA, deren Gen in Genbank nicht vorhanden ist, mittels Screening einer genomischen Bibliothek hinsichtlich entsprechender genomischer Klone erhalten.
Es ist ebenfalls möglich, zuerst Sequenzen in einer Ziel-Nutzpflanze zu identifizieren, welche das Nukleinsäuremolekül umfassen oder welche das Polypeptid codieren, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, insbesondere von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder Homologe davon, und danach den Promotor aufzuspüren und die Expression durch Verwenden der oben erwähnten Faktoren zu reduzieren.
Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den dazu erforderlichen Verfahren vertraut.
Ferner können Faktoren, welche in eine Zelle eingebracht werden, ebenfalls diejenigen sein, welche selbst das Zielprotein inhibieren. Die Protein-Bindungsfaktoren können beispielsweise Aptamere (Famulok, M., und Mayer, G., Curr. Top Microbiol. Immunol. 243, 123 (1999)) oder Antikörper oder Antikörperfragmente oder Einzelketten-Antikörper sein. Das Erhalten dieser Faktoren ist beschrieben worden, und der Fachmann ist damit vertraut. Zum Beispiel ist ein cytoplasmatischer scFV-Antikörper zum Modulieren der Aktivität des Phytochrom-A-Proteins in genetisch modifizierten Tabakpflanzen verwendet worden (Owen M. et al., Biotechnology (NY) 10 (7), 790 (1992); Franken E. et al. Curr. Opin. Biotechnol. 8 (4), 411 (1997); Whitelam, Trend Plant Sci. 1, 286 (1996)).
Genexpression kann des Weiteren durch maßgeschneiderte niedermolekulargewichtige synthetische Verbindungen unterdrückt werden, zum Beispiel solchen vom Polyamid-Typ; Dervan P. B. und Bürli R. W., Current Opinion in Chemical Biology 3, 688 (1999); Gottesfeld J. M. et al., Gene Expr. 9 (1–2), 77 (2000). Diese Oligomere bestehen aus den Einheiten 3-(Dimethylamino)propylamin, N-Methyl-3-hydroxypyrrol, N-Methylimidazol und N-Methylpyrrol; sie können an jeden Abschnitt von doppelsträngiger DNA auf derartige Weise angepasst sein, dass sie sequenzspezifisch an die große Furche binden und die Expression der in dieser Position befindlichen Gensequenzen blocklieren. Geeignete Verfahren sind beschrieben worden in Bremer R. E. et al., Bioorg. Med. Chem. 9 (8), 2093 (2001), Ansari A. Z. et al., ) Chem. Biol. 8 (6), 583 (2001), Gottesfeld J. M. et al. J. Mol. Biol. 309 (3), 615 (2001), Wurtz N. R. et al., Org. Lett 3 (8), 1201 (2001), Wang C. C. et al., Bioorg. Med. Chem. 9 (3), 653 (2001), Urbach A. R. and Dervan P. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (8), 434103 (2001) und Chiang S. Y. et al., J. Biol. Chem. 275 (32), 24246 (2000).

g) Einbringung von viralen Nukleinsäuresequenzen und Expressionskonstrukten, welche den Abbau von RNA herbeiführen, beispielsweise für die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, umfasst oder ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, codiert.

Folglich handelt es sich bei noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung um ein virales Nukleinsäuremolekül, welches – nachdem es in einem geeigneten Organismus, z. B. einer Pflanze oder einem Teil davon, exprimiert worden ist – die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion einer Aktivität herbeiführt, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und einem die SET-Domäne enthaltendem Protein.
So besteht noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung in einem viralen Nukleinsäuremolekül, welches den Abbau oder die Inaktivierung eines RNA-Moleküls herbeiführt, das die Expression eines Proteins, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, auf geführt, vorzugsweise wie in der Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, oder eines Polypeptids, umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in der Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, wie hierin beschrieben, vermittelt, wobei es z. B. die Abnahme oder die Inaktivierung des Nukleinsäuremoleküls oder des Polypeptids der Erfindung mit dem Ergebnis herbeiführt, dass der Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. NUE und/oder die Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöht werden.
Inaktivierung oder Herunterregulieren können ebenfalls durch Induzieren eines spezifischen RNA-Abbaus durch den Organismus, vorteilhafterweise in der Pflanze, mit Hilfe eines viralen Expressionssystems (Amplikon) effizient herbeigeführt werden (Angell, S. M., et al., Plant J. 20 (3), 357 (1999)). Nukleinsäuresequenzen mit Homologie zu den Transkripten, welche unterdrückt werden sollen, werden durch diese Systeme – die ebenfalls als ”VIGS” (viral induced gene silencing) bezeichnet werden – mit Hilfe viraler Vektoren in die Pflanze eingebracht. Dann wird die Transkription abgeschaltet, was vermutlich durch Pflanzen-Verteidigungsmechanismen gegen Viren vermittelt wird. Geeignete Techniken und Verfähren sind beschrieben in Ratcliff F. et al., Plant J. 25 (2), 237 (2001), Fagard M. and Vaucheret H., Plant Mol. Biol. 43 (2–3), 285 (2000), Anandalakshmi R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (22), 13079 (1998) und Ruiz M. T. Plant Cell 10 (6), 937 (1998).

h) Einbringen von Konstrukten zum Induzieren einer homologen Rekombination auf endogenen Genen, zum Beispiel zum Erzeugen von Knockout-Mutanten, z. B. für die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion von Aktivität des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen bzw. welche Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie es in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist, oder codierend ein Polypeptid, welches ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, umfasst.

Folglich handelt es sich bei noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung um ein Konstrukt zum Induzieren einer homologen Rekombination auf endogenen Genen, welches – nachdem es in einen geeigneten Organismus, z. B. eine Pflanze oder ein Teil davon, eingebracht worden ist – die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion einer Aktivität herbeiführt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendes Protein.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Konstrukt zum Induzieren von homologer Rekombination auf endogenen Genen, welche die Abnahme oder die Inaktivierung eines Moleküls herbeiführt, das die Expression eines Proteins, wie es in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Polypeptids, umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, wie hierin beschrieben, vermittelt, wobei z. B. die Abnahme oder Inaktivierung des Nukleinsäuremoleküls oder des Polypeptids der Erfindung mit dem Ergebnis herbeigeführt wird, dass der Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. NUE und/oder die Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöht werden.
Um einen homolog-rekombinanten Organismus mit reduzierter Aktivität zu erzeugen, wird ein Nukleinsäurekonstrukt verwendet, welches beispielsweise wenigstens einen Teil eines endogenen Gens umfasst, der durch eine Deletion, Addition oder Substitution von wenigstens einem Nukleotid in einer solchen Weise modifiziert ist, dass die Funktionalität reduziert oder vollständig eliminiert ist. Die Modifikation kann auch die regulatorischen Elemente (z. B. den Promotor) des Gens betreffen, sodass die codierende Sequenz unmodifiziert bleibt, aber eine Expression (Transkription und/oder Translation) nicht stattfindet oder reduziert ist.
Im Falle einer herkömmlichen homologen Rekombination wird die modifizierte Region an ihrem 5'- und 3'-Ende von weiteren Nukleinsäuresequenzen flankiert, welche ausreichend lang sein müssen, um eine Rekombination zu gestatten. Ihre Länge liegt in der Regel im Bereich von einhundert Basen bis zu mehreren Kilobasen (Thomas K. R. und Capecchi M. R., Cell 51, 503 (1987); Strepp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (8), 4368 (1998)). Im Falle einer homologen Rekombination wird der Wirtsorganismus – zum Beispiel eine Pflanze – mit dem Rekombinationskonstrukt unter Anwendung der hierin nachstehend beschriebenen Verfahren transformiert, und Klone, welche erfolgreich eine Rekombination durchlaufen haben, werden zum Beispiel unter Verwendung einer Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide selektiert. Unter Anwendung der Cotransformationstechnik kann die Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide anschließend in vorteilhafter Weise durch Ausführen von Kreuzungen wieder eliminiert werden. Ein Beispiel für ein effizientes homologes Rekombinationssystem in Pflanzen ist in Nat. Biotechnol. 20 (10), 1030 (2002) von Terada R et al. veröffentlicht worden.
Homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukaryoten, insbesondere in Pflanzen. Statistische Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit zur Entfernung der zufällig integrierten Sequenzen und somit zur Erhö hung der Anzahl von Zellklonen mit einer korrekten homologen Rekombination besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems, wie beschrieben in US 6 110 736 , mit dessen Hilfe unspezifisch integrierte Sequenzen wieder deletiert werden können, was die Selektion der Ereignisse, welche erfolgreich über homologe Kombination integriert haben, vereinfacht. Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann zur Anwendung kommen, wobei als Beispiele hierfür das Cre/lox-System des Bakteriophagen P1, das FLP/FRT-System aus Hefe, die Gin-Rekombinase des Phagen Mu, die Pin-Rekombinase aus E. coli und das R/RS-System des Plasmides pSR1 erwähnt werden können. Das Cre/lox-System des Bakteriophagen P1 und das Hefe-FLP/FRT-System werden bevorzugt. Das FLP/FRT- und das cre/lox-Rekombinase-System sind bereits auf Pflanzensysteme angewandt worden (Odell et al., Mol. Gen. Genet. 223, 369 (1990)).

i) Einbringung von Mutationen in endogene Gene zur Herbeiführung eines Funktionsverlustes (beispielsweise Erzeugung von Stop-Codons, Leseraster Verschiebungen und dergleichen), z. B. für die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie es in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist, oder codierend ein Polypeptid, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, umfasst.

Demgemäß handelt es sich bei noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung um ein mutiertes Homolog des Nukleinsäuremoleküls, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, welches – nachdem es in einem geeigneten Organismus, z. B. einer Pflanze oder einem Teil davon, exprimiert worden ist – die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion einer Aktivität herbeiführt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendes Protein.
Weitere geeignete Verfahren zum Reduzieren der Aktivität sind die Einbringung von Nonsense-, Deletions- oder Integrationsmutationen in endogene Gene, beispielsweise durch Einbringen von RNA/DNA-Oligonukleotiden in die Pflanze (Zhu et al., Nat. Biotechnol. 18 (5), 555 (2000)), sowie die Erzeugung von Knockout-Mutanten, zum Beispiel mit Hilfe von T-DNA-Mutagenese (Koncz et al., Plant Mol. Biol. 20 (5), 963 (1992)), ENU-(N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff)-Mutagenese oder homologer Rekombination (Hohn, B., und Puchta, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8321 (1999)). Punktmutationen können auch mittels DNA-RNA-Hybriden erzeugt werden, was ebenfalls als ”Chimeraplastie” bekannt ist (Cole-Strauss et al., Nucl. Acids Res. 27 (5), 1323 (1999); Kmiec, Gene Therapy American Scientist 87 (3), 240 (1999)). Die Mutationsstellen können spezifisch angezielt oder zufällig ausgewählt werden. Wenn die Mutationen in statistischer Weise, z. B. durch Transposon-Tagging oder chemische Mutagenese, erzeugt wurden, ist der Fachmann in der Lage, ausgewählte bzw. selektierte Mutationsereignisse in den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren spezifisch anzureichern, speziell durch verschiedene PCR-Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Mutationen können auch durch die Einbringung von sogenannten Homing-Endonukleasen eingebracht werden, welche entworfen sein können, um Doppelstrangbrüche in spezifischen Sequenzen innerhalb des Genoms einzubringen. Die Reparatur der Doppelstrangbrüche führt häufig zu den gewünschten nicht-funktionstüchtigen Mutationen (Arnould et al., Journal of Molecular Biology 355 (3), 443 (2006)).

j) Einbringen einer microRNA (oder micro-RNA), welche entworfen worden ist, um auf das Gen von Interesse abzuzielen, damit ein Abbau oder eine Translationsinhibition der mRNA des Gens von Interesse induziert und dadurch die Genexpression stummgeschaltet bzw. gesilenct wird, oder einer Expressionskassette, welche die Expression der Erstgenannten gewährleistet, z. B. für die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 oder 7 der Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, oder codierend ein Polypeptid, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv umfasst, wie in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt.

Folglich handelt es bei noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung um ein miRNA-Molekül, welches – nachdem es in einem geeigneten Organismus, z. B. einer Pflanze oder einem Teil davon, exprimiert worden ist – die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion einer Aktivität herbeiführt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendes Protein.
Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein miRNA-Molekül, welches die Abnahme oder Inaktivierung eines Moleküls herbeiführt, das die Expression eines Proteins, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, vorzugsweise wie in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, oder eines Polypeptids, das eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, umfasst oder codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in der Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, wie hierin beschrieben, vermittelt, wobei z. B. die Abnahme oder die Inaktivierung des Nukleinsäuremoleküls oder des Polypeptids der Erfindung mit dem Ergebnis herbeigeführt werden, dass der Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. NUE und/oder die Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöht werden.
MicroRNAs (miRNAs) haben sich als evolutionär konservierte, RNA-basierende Regulatoren der Genexpression in Pflanzen und Tieren herausgestellt. MiRNAs (~ 21 bis 25 nt) entstehen aus größeren Vorläufern mit einer Stamm-Schleife-Struktur, die von nicht-proteincodierenden Genen transkribiert werden. Eine miRNA zielt auf eine spezifische mRNA, um die Genexpression auf dem posttranskriptionalen Niveau (d. h. sie baut mRNA ab) oder dem translationalen Niveau (d. h. sie inhibiert die Proteinsynthese) zu unterdrücken (Bartel D., Cell 116, 281 (2004)). MiRNAs können effizient entworfen werden, um ausgewählte Gene spezifisch anzuzielen und herunterzuregulieren. Determinanten der Zielselektion von natürlichen Pflanzen-miRNAs sind von Schwab und Mitarbeitern analysiert worden (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517 (2005)). Diese Arbeit ist auf den Entwurf und die Verwendung von künstlichen miRNAs (amiRNAs) erweitert worden, um Zielgene effizient herunterzuregulieren, was zu Konzepten und Regeln für den Entwurf effektiver amiRNAs für das gerichtete Gen-Silencing (Highly Specific Gene Silencing by Artificial microRNAs in Arabidopsis, Schwab et al., Plant Cell 18 (4), (2006)) sowie zu einem Webbasierten Werkzeug bzw. Hilfsprogramm für das effiziente amiRNA-Design (http://wmd.weigelworld.org) geführt hat.

k) Einbringung einer trans-agierenden kleinen interferierenden RNA (ta-siRNA) oder einer Expressionskassette, welche die Expression der Erstgenannten gewährleistet, z. B. für die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 der Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv umfasst, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt.

Demzufolge handelt es sich bei noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung um eine ta-siRNA, welche – nachdem sie in einem geeigneten Organismus, z. B. einer Pflanze oder einem Teil davon, exprimiert worden ist – die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion einer Aktivität herbeiführt, welche aus der Gruppe gewählt ist, die aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendes Protein besteht.
Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine ta-siRNA, welche die Abnahme oder Inaktivierung eines Moleküls herbeiführt, das die Expression eines Proteins, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Polypeptids, umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in der Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, wie hierin beschrieben, vermittelt, wobei z. B. die Abnahme oder Inaktivierung des Nukleinsäuremoleküls oder des Polypeptids der Erfindung mit dem Ergebnis herbeigeführt werden, dass der Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder die Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöht werden.
Eine trans-agierende kleine interferierende RNA (ta-siRNA) kann entworfen sein, um auf das Gen von Interesse abzuzielen, um einen Abbau der mRNA des Gens von Interesse zu induzieren und dadurch die Genexpression zu silencen.
Verfahren unter Anwendung von ta-siRNAs, die nützlich zur Repression oder Inaktivierung eines Genproduktes gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sind, werden in US 60/672 976 und 60/718 645 beschrieben.
Nukleinsäuresequenzen, wie beschrieben in Punkt b) bis k), werden in der Zelle oder dem Organismus durch Transformation/Transfektion der Zelle oder des Organismus exprimiert oder werden durch bekannte Verfahren in die Zelle oder den Organismus eingebracht, zum Beispiel wie in a) beschrieben.

l) Identifizieren einer Nicht-Silent-Mutation bzw. nicht-stummen Mutation, z. B. Erzeugung von Stopcodons, Leserahmen-Verschiebungen, Integrationen, Inversionen und dergleichen, in einer statistisch mutagenisierten Population gemäß verschiedenen Vorgehensweisen, wie reversem Screening oder dem sogenannten TILLING-Verfahren (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes), z. B. für die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst.

Demgemäß handelt es sich bei noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung um einen TILLING- oder Reverse-Screening-Primer oder ein Heteroduplex zwischen einer mutierten DNA und einer Wildtyp-DNA, welcher zum Identifizieren einer Mutation verwendet werden kann, welche – nachdem sie in einem geeigneten Organismus, z. B. einer Pflanze oder ein Teil davon, exprimiert worden ist – die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion einer Aktivität herbeiführt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus At1g74730- Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendem Protein.
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein TILLING- oder Reverse-Screening-Primer zum Identifizieren einer Mutation, welche die Abnahme oder Inaktivierung eines Moleküls herbeiführt, das die Expression eines Proteins, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Polypeptids, das eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst oder von einem Nukleinsäuremolekül codiert ist, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, wie hierin beschrieben, vermittelt, wobei z. B. die Abnahme oder Inaktivierung des Nukleinsäuremoleküls oder des Polypeptids der Erfindung mit dem Ergebnis herbeigeführt wird, dass der Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder die Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöht werden.
Besonders bevorzugt ist ein TILLING-Primer oder ein Reverse-Screening-Primer für die Identifizierung einer Mutation in einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Homolog eines Nukleinsäuremoleküls wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, vorzugsweise wie in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, ist, wie etwa eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, umfasst, aber welches in einem oder mehreren Nukleotiden mutiert ist.
In einer Ausführungsform umfasst der TILLING- oder Reverse-Screening-Primer ein Fragment von mindestens 17 Nukleotiden (nt), vorzugsweise 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30 nt eines Nukleinsäuremoleküls, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1.
In einer Ausführungsform umfasst der TILLING- oder Reverse-Screening-Primer ein Fragment von mindestens 17 Nukleotiden (nt), vorzugsweise 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30 nt, das mindestens zu 70%, 75%, 80%, 90%, weiter bevorzugt mindestens 95%, am stärksten bevorzugt 100% homolog zu einem Nukleinsäuremolekül ist, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1.
Für das TILLING werden Mutationen durch Behandlung mit einem chemischen Mutagen (EMS) induziert. DNAs werden aus Individuen aufpräpariert und für das anfängliche Screening in Pools als Array bzw. Feld angeordnet. Diese Pools werden Matrizen für PCR unter Verwendung von Primern, die eine Region von Interesse amplifizieren. Heteroduplizes wer den zwischen Wildtyp- und Mutantenfragmenten in dem Pool durch Denaturieren und erneutes Annealen von PCR-Produkten gebildet. Diese Heteroduplizes sind das Substrat für eine Spaltung durch die Nuclease CEL I. Nach dem Verdau werden die resultierenden Produkte unter Verwendung von standardmäßiger fluoreszierender Sequenzierungs-Flachgelelektrophorese sichtbar gemacht. Positive Pools werden dann als Einzel-DNAs erneut gescreent, wodurch die Mutantenpflanze und die ungefähre Position der Mutation entlang der Sequenz identifiziert werden. Diese Positionsinformation erhöht die Effizienz der Sequenzanalyse, da heterozygote Mutationen ansonsten schwierig zu identifizieren sein können.
Hochdurchsatz-TILLING ist zum Beispiel beschrieben in Colbert et al., Plant Physiology 126, 480 (2001), und ist kürzlich bei Nutzpflanzen angewandt worden (Übersichtsartikel in Slade und Knauf, Transgenic Res. 14 (2), 109 (2005)).
Andere Reverse-Screening-Verfahren, die auf die Identifizierung von Individuen in Populationen, die durch die statistische Integration von Nukleinsäuren, wie Transposons oder T-DNAs, mutiert wurden, abzielen, sind mehrfach beschrieben worden, z. B. Krysan et al., Plant Cell 11, 2283 (1999); Sessions et al., Plant Cell 14, 2985 (2002); Young et al., Plant Physiol. 125, 513 (2001); Koprek et al., Plant J. 24, 253 (2000); Jeon et al., Plant J. 22, 561 (2000); Tissier et al., Plant Cell 11, 1841 (1999); Speulmann et al., Plant Cell 11, 1853 (1999).
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung werden Organismen verwendet, in welchen eines der oben erwähnten Gene oder eine der oben erwähnten Nukleinsäuren auf eine solche Weise mutiert ist, dass die Aktivität der codierten Genprodukte, im Vergleich zu den unmutierten Proteinen, durch zelluläre Faktoren in einem größeren Ausmaß als im Referenzorganismus beeinflusst wird. Diese Art von Mutation könnte zu einer Änderung in der Stoffwechselaktivität des Organismus führen, welche dann einen gesteigerten Ertrag, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder eine höhere Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze verursacht. Der Grund für diese höhere Produktivität kann auf einer Änderung in einem Regulierungsmechanismus der enzymatischen Aktivität, wie etwa Substratinhibition oder Rückkopplungsregulation, beruhen. In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung werden Organismen unter derartigen Bedingungen wachsen gelassen, dass die Expression der Nukleinsäuren der Erfindung reduziert oder unterdrückt ist, was zu einem gesteigerten Ertrag, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder einer höheren Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, gemäß der Erfindung, führt.
In einer Ausführungsform kann die Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder der Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze oder einem Teil davon, durch gezielte oder statistische Mutagenese der endogenen Gene erhöht werden, welche das Molekül umfassen oder codieren, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. ein Polynukleotid umfassen, wie es in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist oder das ein Polypeptid codiert, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1.
Zum Beispiel kann homologe Rekombination angewandt werden, um entweder negative regulatorische Elemente einzubringen oder Enhancer-Elemente aus regulatorischen Regionen zu entfernen, zu unterbrechen oder zu deletieren. Darüber hinaus können Genkonversions-ähnliche Verfahren, beschrieben von Kochevenko und Willmitzer (Plant Physiol. 132 (1), 174 (2003)) und den Zitaten darin, modifiziert werden, um Enhancer-Elemente zu disruptieren oder die Aktivität von negativen regulatorischen Elementen zu verstärken. Ferner können Mutationen oder reprimierende Elemente statistisch durch T-DNA- oder Transposon-Mutagenese in (pflanzliche) Genome eingebracht werden, und es kann nach Linien gescreent werden, in welchen reprimierende oder unterbrechende Elemente nahe einem Gen der Erfindung integriert worden sind, dessen Expression dadurch reprimiert, reduziert oder deletiert wird. Die Inaktivierung von Pflanzengenen durch statistische Integrationen von Enhancer-Elementen ist beschrieben worden.
Strategien der reversen Genetik zum Identifizieren von Insertionen (welche schließlich die Inaktivierungselemente tragen) nahe oder in Genen von Interesse sind für verschiedene Fälle beschrieben worden, z. B. Krysan et al., Plant Cell 11, 2283 (1999); Sessions et al., Plant Cell 14, 2985 (2002); Young et al., Plant Physiol. 125, 513 (2001); Koprek et al., Plant J. 24, 253 (2000); Jeon et al., Plant J. 22, 561 (2000); Tissier et al., Plant Cell 11, 1841 (1999); Speulmann et al., Plant Cell 11, 1853 (1999).
Die Verstärkung von negativen regulatorischen Elementen oder die Disruption oder Schwächung von verstärkenden oder aktivierenden regulatorischen Elementen kann des Weiteren durch gewöhnliche Mutagenesetechniken erreicht werden: Die Herstellung von chemisch oder durch Strahlung mutierten Populationen ist eine übliche Technik und dem Fachmann bekannt.
Folglich kann der Expressionsspiegel erhöht werden, wenn die endogenen Gene, die ein Polypeptid oder ein Nukleinsäuremolekül codieren, das die hierin beschriebene Aktivität vermittelt, insbesondere Gene, welche das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfassen, mit Hilfe eines Mutageneseverfahrens durch homologe Rekombination, mit wahlfreier Identifizierung durch TILLING oder sonstige Reverse-Screening-Methoden, oder durch Genkonversion modifiziert werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann die anwendbare Modifikation der hierin zur Verwendung im Verfahren der Erfindung beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, d. h. die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion ihrer Aktivität, wobei sie selbst durch den Wirtsorganismus codiert wird, zum Beispiel durch statistische Mutagenese mit Chemikalien, Strahlung oder UV-Licht oder ortsgerichtete Mutagense auf eine derartige Weise erzielt werden, dass der Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder die Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöht werden. Diese Ausführungsform der Erfindung soll, im Sinne der Erfindung, als transgen betrachtet werden.
Unter Anwendung der hierin erwähnten Klonierungsvektoren und Transformationsverfahren, wie etwa denjenigen, welche veröffentlicht und zitiert sind in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205–225 (1991) und nachstehend weiter zitiert sind, kann ein Nukleinsäuremolekül, abgeleitet aus den hierin für die Verwendung im Verfahren der Erfindung beschriebenen Polynukleotiden, wie hierin beschrieben, für die rekombinante Modifikation einer großen Auswahl an Organismen, insbesondere Pflanzen, angewandt werden, so dass diese aufgrund der Deletion oder Reduktion der Aktivität von Genen, welche das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfassen, oder des Expressionsprodukts der Gene gemäß dem Verfahren der Erfindung, besser und effizienter werden.
Die Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder die verbesserte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze kann durch eine direkte Auswirkung der Manipulation oder durch eine indirekte Auswirkung dieser Manipulation herbeigeführt werden.
Um die Einbringung eines Nukleinsäuremoleküls zur Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion der Expression oder Aktivität der Moleküle, welche im Verfahren der Erfindung reduziert werden sollen, in einen Organismus zu verbessern, können die hierin offenbarten Nukleinsäuremoleküle oder Derivate davon in ein Nukleinsäurekonstrukt und/oder einen Vektor auf eine solche Weise eingebunden werden, dass ihre Einbringung in einen Organismus, z. B. eine Zelle, eine reduzierte oder deletierte endogene oder zelluläre Aktivität entweder auf der Ebene der Nukleinsäuresequenz-Expression oder auf der Ebene des von den Sequenzen codierten Polypeptids herbeiführt.
Zur Verbesserung der Einbringung eines Nukleinsäuremoleküls und zur Herbeiführung oder Verbesserung der Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion der Expression oder Aktivität der Moleküle, welche im Verfahren der Erfindung reduziert werden sollen, in einem Organismus, z. B. in einer transgenen Pflanze oder Mikroorganismus, können folglich Nukleinsäuremoleküle, codierend das hierin offenbarte Antisense-Nukleinsäuremolekül, RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Cosuppressionsmolekül, Ribozym, Antikörper oder ein sonstiges Molekül zum Inhibieren der Expression oder Aktivität eines Expressionsproduktes des Nukleinsäuremoleküls, die im Verfahren der Erfindung reduziert, unterdrückt oder deletiert werden soll, in ein Nukleinsäurekonstrukt und/oder einen Vektor eingebunden werden.
Nach dem oben beschriebenen Reduzieren, Unterdrücken, Verringern oder Deletieren (welches, wie oben definiert, ebenfalls das Hervorrufen einer Aktivität in einem Organismus, d. h. einer de-novo-Aktivität, beinhaltet), zum Beispiel nach der Einbringung und Expression der RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, des Cosuppressionsmoleküls, Ribozyms, Antikörpers oder Antisense-Moleküls oder Ribozyms oder sonstigen Moleküls zum Inhibieren der Expression oder Aktivität, wie beschrieben in den Verfahren oder Vorgehensweisen gemäß der Erfindung, wird der Organismus gemäß der Erfindung, vorteilhafterweise eine Pflanze, ein Pflanzengewebe oder eine Pflanzenzelle, kultiviert und anschließend abgeerntet.
Beispiele können transgene oder nicht-transgene Pflanzen, Zellen oder Protoplasten davon sein. Beispiele von bevorzugten geeigneten Organismen werden in den nachfolgenden Abschnitten beschrieben.
Geeignete Wirtsorganismen (transgene Organismen) zur Erzeugung des Nukleinsäuremoleküls, das gemäß der Erfindung verwendet wird, oder zur Verwendung im Verfahren der Erfindung, die z. B. mit dem Nukleinsäurekonstrukt oder dem Vektor (beide wie nachstehend beschrieben) der Erfindung transformiert werden sollen, welches/welcher z. B. die Expression einer RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, eines Ribozyms oder Antisense-Moleküls oder Ribozyms oder eines sonstigen Moleküls zum Inhibieren der Expression oder Aktivität vermittelt, sind im Prinzip alle Pflanzen, welche für die Unterdrückung, Reduktion oder Deletion von Genen, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder codierend ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, geeignet sind.
Für den Fall, dass es sich bei dem (transgenen) Wirtsorganismus um eine Pflanze, ein Pflanzengewebe oder eine Pflanzenzelle handelt, wie etwa Pflanzen, die aus der Gruppe, bestehend aus den Familien Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae oder winterhartem Gras, Futterpflanzen, Gemüsepflanzen, Zierpflanzen und Arabidopsis thaliana, gewählt sind, wird diese Pflanze zum Beispiel entweder auf einem festen Medium oder in Form von Zellen in einem, z. B. flüssigen, Medium, welches dem Fachmann bekannt ist und dem Organismus entspricht, wachsen gelassen. Darüber hinaus können derartige Pflanzen in Erde oder dergleichen wachsen gelassen werden.
Das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül, insbesondere das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, oder der Produktions- oder Quellorganismus ist oder stammt, in einer Ausführungsform, aus einer Pflanze, wie etwa einer Pflanze, gewählt aus den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae, und vorzugsweise aus einer Pflanze, die aus der Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae gewählt ist.
Bevorzugte Pflanzen werden aus der Gruppe gewählt, umfassend Anacardiaceae, wie etwa die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium, z. B. die Spezies Pistacia vera [Pistazienbaum, Pistazie], Mangifer indica [Mango] oder Anacardium occidentale [Cashew]; Asteraceae, wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, z. B. die Spezies Calendula officinalis [Ringelblume], Carthamus tinctorius [Saflor], Centaurea cyanus [Kornblume], Cichorium intybus [Gewöhnliche Wegwarte], Cynara scolymus [Artischoke], Helianthus annus [Sonnenblume], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [Kopfsalat], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia [Studentenblume]; Apiaceae, wie die Gattung Daucus, z. B. die Spezies Daucus carota [Karotte]; Betulaceae, wie die Gattung Corylus, z. B. die Spezies Corylus avellana oder Corylus colurna [Haselnuss]; Boraginaceae, wie die Gattung Borago, z. B. die Spezies Borago officinalis [Borretsch]; Brassicaceae, wie die Gattungen Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabidopsis, z. B. die Spezies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsamen], Sinapis arvensis, Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterrübe] oder Arabidopsis thaliana; Bromeliaceae, wie die Gattungen Anana, Bromelia, z. B. die Spezies Anana comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa [Ananas]; Caricaceae, wie die Gattung Carica, z. B. die Spezies Carica papaya [Papaya]; Cannabaceae, wie die Gattung Cannabis, z. B. die Spezies Cannabis sative [Hanf], Convolvulaceae, wie die Gattungen Ipomea, Convolvulus, z. B. die Spezies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus [Süsskartoffel, Prunkwinde, Wildkartoffel], Chenopodiaceae, wie die Gattung Beta, d. h. die Spezies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckerrübe]; Cucurbitaceae, wie die Gattung Cucubita, z. B. die Spezies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata [Gartenkürbis, Kürbis]; Elaeagnaceae, wie die Gattung Elaeagnus, z. B. die Spezies Olea europaea [Olive]; Ericaceae, wie die Gattung Kalmia, z. B. die Spezies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Amerikanischer Lorbeer, Breitblättrige Lorbeerrose, Calico-Busch, Berglorbeer, Schaf-Berglorbeer bzw. Schmalblättrige Lorbeerrose, Alpen-Lorbeerrose, Sumpf-Lorbeerrose, Kleinblättrige Lorbeerrose, Poleiblättrige Lorbeerrose]; Euphorbiaceae, wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, z. B. die Spezies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Maniok, Pfeilwurz, Tapioka, Cassava] oder Ricinus communis [Rizinus, Rizinusbusch, Kastoröl-Pflanze, Palma Christi, Wunderbaum]; Fabaceae, wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja, z. B. die Spezies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [Blauholzbaum, Seidenbaum, Lebbekbaum], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [Alfalfa] Glycine max, Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne]; Geraniaceae, wie die Gattungen Pelargonium, Cocos, Oleum, z. B. die Spezies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides oder Oleum cocois [Kokosnuss]; Gramineae, wie die Gattung Saccharum, z. B. die Spezies Saccharum officinarum; Juglandaceae, wie die Gattungen Juglans, Wallia, z. B. die Spezies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallia nigra [Walnuss, Schwarzwalnuss, Echte Walnuss, Persische Walnuss, Weiße Walnuss, Butternuss, Schwarznuss]; Lauraceae, wie die Gattungen Per sea, Laurus, z. B. die Spezies laurel Laurus nobilis [Lorbeerbaum, Lorbeer, Echter Lorbeer, Gewürzlorbeer], Persea americana Persea americana, Persea gratissima oder Persea persea [Avocado]; Leguminosae, wie die Gattung Arachis, z. B. die Spezies Arachis hypogaea [Erdnuss]; Linaceae, wie die Gattungen Linum, Adenolinum, z. B. die Spezies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum [Flachs, Leinsamen]; Lythrarieae, wie die Gattung Punica, z. B. die Spezies Punica granatum [Granatapfel]; Malvaceae, wie die Gattung Gossypium, z. B. die Spezies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi [Baumwolle]; Musaceae, wie die Gattung Musa, z. B. die Spezies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [Banane]; Onagraceae, wie die Gattungen Camissonia, Oenothera, z. B. die Spezies Oenothera biennis oder Camissonia brevipes [Primel, Nachtkerze]; Palmae, wie die Gattung Elacis, z. B. die Spezies Elaeis guineensis [Ölpalme]; Papaveraceae, wie die Gattung Papaver, z. B. die Spezies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [Mohn, Türkenmohn, Klatschmohn, Wilder Mohn, Mohnblume bzw. Klatschrose, Feldmohn, Saat-Mohn, Ackermohn]; Pedaliaceae, wie die Gattung Sesamum, z. B. die Spezies Sesamum indicum [Sesam]; Piperaceae, wie die Gattungen Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, z. B. die Spezies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata. [Cayenne-Pfeffer, Wilder Pfeffer]; Poaceae, wie die Gattungen Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea, Triticum, z. B. die Spezies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [Gerste, Graupen, Mähnengerste, Mäusegerste, Wiesengerste], Secale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [Hafer], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum millet, Panicum militaceum [Sorghum, Hirse], Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [corn, Mais], Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare [Weizen, Ackerweizen, Gemeiner Weizen], Proteaceae, wie die Gattung Macadamia, z. B. die Spezies Macadamia intergrifolia [Macademia]; Rubiaceae, wie die Gattung Coffea, z. B. die Spezies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee]; Scrophulariaceae, wie die Gattung Verbascum, z. B. die Spezies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Ver bascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus [Königskerze, Schaben-Königskerze, Chaix-Königskerze, Großblütige Königskerze, Seidenhaar-Königskerze, Langblättrige Königskerze, Mehlige Königskerze, Schwarze Königskerze, Kandelaber-Königskerze, Windblumen-Königskerze, Violette Königskerze, Flockige Königskerze, Himmelbrand]; Solanaceae, wie die Gattungen Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, z. B. die Spezies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [Pfeffer], Capsicum annuum [Paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak], Solanum tuberosum [Kartoffel], Solanum melongena [Aubergine] (Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum [Tomate]; Sterculiaceae, wie die Gattung Theobroma, z. B. die Spezies Theobroma cacao [Kakao]; Theaceae, wie die Gattung Camellia, z. B. die Spezies Camellia sinensis) [Tee].
Alle oben erwähnten Wirtsorganismen sind ebenfalls als Quellorganismen für das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül, z. B. das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, verwendbar.
Bevorzugt werden Nutzpflanzen und insbesondere hierin als Wirtspflanzen erwähnte Pflanzen, wie etwa die oben erwähnten Familien und Gattungen, zum Beispiel vorzugsweise die Spezies Anacardium occidentale, Calendula officinalis, Carthamus tinctorius, Cichorium intybus, Cynara scolymus, Helianthus annus, Tagetes lucida, Tagetes erecta, Tagetes tenuifolia; Daucus carota; Corylus avellana, Corylus colurna, Borago officinalis; Brassica napus, Brassica rapa ssp., Sinapis arvensis, Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis, Brassica oleracea, Arabidopsis thaliana, Anana comosus, Ananas ananas, Bromelia comosa, Carica papaya, Cannabis sative, Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba, Convolvulus panduratus, Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva, Beta vulgaris var. esculenta, Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo, Cucurbita moschata, Olea europaea, Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta, Ricinus communis, Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile, Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia, Glycine max, Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida, Soja max, Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides, Oleum cocoas, Laurus nobilis, Persea americana, Arachis hypogaea, Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense, Linum trigynum, Punica granatum, Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Gossypium thurberi, Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp., Elaeis guineensis, Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium, Sesamum indicum, Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata, Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida, Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum millet, Panicum militaceum, Oryza sativa, Oryza latifolia, Zea mays, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum or Triticum vulgare, Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea liberica, Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens, Capsicum annuum, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Solanum melongena, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium, Solanum lycopersicum, Theobroma cacao oder Camellia sinensis.
Besonders bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen, die aus der Gruppe, bestehend aus Mais, Soja, Canola, Weizen, Gerste, Triticale, Reis, Leinsamen, Sonnenblume, Hanf, Borretsch, Ölpalme, Kokusnuss, Nachtkerze, Erdnuss, Sonnenblume, Kartoffel und Arabidopsis, gewählt werden.
Andere bevorzugte Pflanzen sind eine nicht-transformierte Form von Pflanzen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Roggen, Hafer, Sojabohne, Baumwolle, Rapssamen, Maniok, Pfeffer, Zuckerrohr, Sonnenblume, Flachs, Saflor, Primel, Raps, Rübssamen bzw. Steckrübe, Tagetes, Nachtschattengewächse, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Spezies, winterhartem Gras und Futter-Nutzpflanzen.
Stärker bevorzugte Pflanzen sind eine nicht-transformierte Linum-Pflanzenzelle, vorzugsweise Linum usitatissimum, weiter bevorzugt die Varietät Brigitta, Golda, Gold Merchant, Helle, Juliel, Olpina, Livia, Marlin, Maedgold, Sporpion, Serenade, Linus, Taunus, Lifax or Liviola, a non-transformed Heliantus plant cell, preferably Heliantus annuus, more preferably the variety Aurasol, Capella, Flavia, Flores, Jazzy, Palulo, Pegasol, PIR64A54, Rigasol, Sariuca, Sideral, Sunny, Alenka, Candisol or Floyd, or a non-transformed Brassica plant cell, preferably Brassica napus, more preferably the variety Dorothy, Evita, Heros, Hyola, Kimbar, Lambada, Licolly, Liconira, Licosmos, Lisonne, Mistral, Passat, Serator, Siapula, Sponsor, Star, Caviar, Hybridol, Baical, Olga, Lara, Doublol, Karola, Falcon, Spirit, Olymp, Zeus, Libero, Kyola, Licord, Lion, Lirajet, Lisbeth, Magnum, Maja, Mendel, Mica, Mohican, Olpop, Ontarion, Panthar, Prinoe, Pronio, Susanna, Talani, Titan, Transfer, Wiking, Woltan, Zeniah, Artus, Contact oder Smart.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden transgene Pflanzen aus der Gruppe ausgewählt, welche Mais, Soja, Ölraps (einschließlich Canola und Winterölsamenraps bzw. ”winter oil seed reap”), Baumwolle, Weizen und Reis umfasst.
Alle oben erwähnten Wirtspflanzen sind ebenfalls als Quellorganismen für die Isolierung oder Identifizierung des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder eines funktionellen Äquivalentes davon, verwendbar. Mais, Soja, Canola, Hanf, Borretsch, Ölpalme, Kokusnuss, Nachtkerze, Erdnuss, Saflor, Weizen, Gerste, Triticale, Reis, Leinsamen, Sonnenblume, Kartoffel und Arabidopsis sind bevorzugte Quellpflanzen.
Der Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder Biomasseproduktion, können, entsprechend zu einem, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp, in einer Pflanze, welche im Verfahren der Erfindung verwendet wird, gemäß dem Verfahren der Erfindung wenigstens um einen Faktor von 1,05, 1,1, vorzugsweise wenigstens einen Faktor von 1,5; 2, 3, 4 oder 5, besonders bevorzugt wenigstens um einen Faktor von 10, 15, 20 oder 30, sehr speziell bevorzugt um wenigstens einen Faktor von 50, verglichen mit dem Wildtyp, der Kontrolle oder der Referenz, erhöht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder zum Erhöhen der Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, umfassend das Reduzieren, Unterdrücken, Verringern oder Deletieren der Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, oder umfassend das Reduzieren, Unterdrücken, Verringern oder Deletieren der Aktivität eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, wie hierin beschrieben.
Demgemäß betrifft in einer anderen bevorzugten Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder zum Erhöhen der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, umfassend das Reduzieren, Unterdrücken, Verringern oder Deletieren der Aktivität oder der Expression von mindestens einem Nukleinsäuremolekül, umfassed ein Nukleinsäuremolekül, das aus der Gruppe gewählt wird, die aus folgendem besteht:

(a) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches das Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, codiert, oder eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv umfasst, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1;
(b) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1;
(c) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes aus einer Polypeptidsequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, abgeleitet werden kann, oder eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv umfasst, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1;
(d) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität zu der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1
(e) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c) oder (d) codiert wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
(f) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das mit Hilfe monoklonaler oder polyklonaler Antikörper isoliert wird, die gegen ein Polypeptid hergestellt wurden, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a), (b), (c), (d) oder (e) codiert wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
(g) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, umfasst, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
(h) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
(i) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid codiert, wobei das Polypeptid abgeleitet wird durch Substitutieren, Deletieren und/oder Hinzufügen einer oder mehrerer Aminosäuren der Aminosäuresequenz des von den Nukleinsäuremolekülen (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) oder (i) codierten Polypeptids; und
(j) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäurebibliothek, z. B. einer Bibliothek, die von einer cDNA- oder genomischen Bibliothek abgeleitet ist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, enthaltend mindestens 15 nt, bevorzugt 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt eines Nukleinsäuremoleküls, komplementär zu einer in (a), (b), (c), (d), (e), (g), (h) oder (i) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz, erhältlich ist und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;

In einer Ausführungsform unterscheidet sich das in dem Verfahren verwendete Nukleinsäuremolekül gegenüber der Sequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, Anmeldung Nr. 1, um mindestens ein oder mehrere Nukleotide, oder besteht nicht aus der Sequenz, wie sie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist.
In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung zu weniger als 100%, 99,999%, 99,99%, 99,9% oder 99% identisch zu der Sequenz, wie sie in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist.
In einer anderen Ausführungsform besteht das Nukleinsäuremolekül nicht aus der Sequenz, wie sie in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist.
Nukleinsäuremoleküle, welche für das Verfahren gemäß der Erfindung vorteilhaft sind und welche Nukleinsäuremoleküle mit der Aktivität, repräsentiert durch ein Expressionsprodukt eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise repräsentiert durch ein Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, weiter bevorzugt repräsentiert durch das Protein, wie aufgeführt in der Spalte 5 der Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, codieren und einen gesteigerten Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze herbeiführen, nachdem ihre Aktivität reduziert oder deletiert worden ist, können aus allgemein zugänglichen Datenbanken ermittelt werden.
Ebenso können Nukleinsäuremoleküle, welche für das Verfahren gemäß der Erfindung vorteilhaft sind und welche Polypeptide mit der Aktivität, repräsentiert durch das Protein, umfassend ein Polypeptid, wie angegeben in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie angegeben in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise repräsentiert durch das Protein, wie angegeben in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie angegeben in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, weiter bevorzugt durch das Protein, angegeben in Spalte 5 von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, codieren und den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, herbeiführen, aus allgemein zugänglichen Datenbanken bestimmt werden.
Diejenigen Datenbanken, welche erwähnt werden müssen, sind in diesem Kontext insbesondere allgemeine Gendatenbanken, wie die EMBL-Datenbank (Stoesser, G., et al., Nucleic Acids Res. 29, 17 (2001)), die GenBank-Datenbank (Benson, D. A., et al., Nucleic Acids Res. 28, 15 (2000)) oder die PIR-Datenbank (Barker, W. C., et al., Nucleic Acids Res. 27, 39 (1999)). Es ist ferner möglich, Organismus-spezifische Gendatenbanken zur Bestimmung von vorteilhaften Sequenzen zu verwenden, wie zum Beispiel im Falle von Hefe vorteilhafterweise die SGD-Datenbank (Cherry, J. M., et al., Nucleic Acids Res. 26, 73 (1998)) oder die MIPS-Datenbank (Mewes, H. W., et al., Nucleic Acids Res. 27, 44 (1999)), im Fall von E. coli die GenProtEC-Datenbank (http://web.bham.ac.uk/bcm4ght6/res.html), und im Fall von Arabidopsis die TAIR-Datenbank (Huala, E., et al., Nucleic Acids Res. 29 (1), 102 (2001)) oder die MIPS-Datenbank.
Ferner ist, in einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, das Molekül, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, neu. Somit betrifft die vorliegende Erfindung außerdem das neue Nukleinsäuremolekül, das ”Nukleinsäuremolekül der Erfindung” oder das ”Polynukleotid der Erfindung”.
Die im Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle nehmen die Form von isolierten Nukleinsäuresequenzen an, welche Polypeptide mit der Aktivität eines Proteins, wie es angegeben ist in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise repräsentiert durch ein neues Protein, wie angegeben in Spalte 7 von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, codieren und welche die Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder die Erhöhung der Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, durch das Reduzieren, Unterdrücken, Verringern oder Deletieren ihrer Aktivität ermöglichen.
Demgemäß betrifft in einer Ausführungsform die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das die Expression eines Produktes herbeiführt, dessen Reduktion, Unterdrückung oder Deletion zu einer Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder zu einer Erhöhung der Biomasseproduktion, insbesondere zu einer Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, oder besonders zu einer Erhöhung der Biomasseproduktion, oder insbesondere zu einer Steigerung der NUE und Erhöhung der Biomasse führt, und zwar im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, und welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe gewählt wird, die aus folgendem besteht:

(a) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches das Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, codiert, vorzugsweise von Tabelle IIB, oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1;
(b) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise von Tabelle IB;
(c) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes aus einer Polypeptidsequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise von Tabelle IIB, abgeleitet werden kann, oder von einem Polypeptid, welches die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv umfasst, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1;
(d) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, Identität zu der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise von Tabelle IB;
(e) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c) oder (d) codiert wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
(f) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das mit Hilfe monoklonaler oder polyklonaler Antikörper isoliert wird, die gegen ein Polypeptid hergestellt wurden, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a), (b), (c), (d) oder (e) codiert wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
(g) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst;
(h) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
(i) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, welches erhalten wird durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer, wie sie in der Spalte 7 der Tabelle III aufgeführt sind, Anmeldung Nr. 1, welche nicht an Ihrem 5-Strich-Ende mit den Nukleotiden ATA starten;
(j) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid codiert, wobei das Polypeptid abgeleitet wird durch Substitutieren, Deletieren und/oder Hinzufügen einer oder mehrerer Aminosäuren der Aminosäuresequenz des von den Nukleinsäuremolekülen (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) oder (i) (c) codierten Polypeptids; und
(k) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, enthaltend mindestens 15 nt, bevorzugt 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 500 nt, 750 nt oder 1000 nt eines Nukleinsäuremoleküls, komplementär zu einer in (a) bis (d) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz, erhältlich ist und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;

Folglich besteht, in einer anderen Ausführungsform, das Nukleinsäuremolekül der Erfindung nicht aus der Sequenz, wie sie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung wenigstens zu 30% identisch zu der Nukleinsäuresequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, Anmeldung Nr. 1, und zu weniger als 100%, vorzugsweise weniger als 99,999%, 99,99% oder 99,9%, weiter bevorzugt weniger als 99%, 98%, 97%, 96% oder 95% identisch zu der Sequenz, wie sie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ”das Nukleinsäuremolekül der Erfindung” auf das Nukleinsäuremolekül, wie es in diesem Absatz bzw. Abschnitt beschrieben ist.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung des Weiteren ein neues Polypeptid, demzufolge das ”Polypeptid der Erfindung” oder das ”Protein der Erfindung”.
Vorzugsweise umfasst das Polypeptid nicht ein Polypeptid, wie es in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist. Vorzugsweise unterscheidet sich das Polypeptid der erfindungsgemäßen Proteine wenigstens in einer, fünf, zehn, 20, 30, 50 oder mehr Aminosäuren von den Polypeptidsequenzen, wie sie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt sind.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Polypeptid der vorliegenden Erfindung wenigstens 30% identisch zur Proteinsequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B, Anmeldung Nr. 1, und weniger als 100%, vorzugsweise weniger als 99,999%, 99,99% oder 99,9%, weiter bevorzugt weniger als 99%, 98%, 97%, 96% oder 95% identisch zu der Sequenz, wie sie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist.
Wie hierin verwendet, schließen die Begriffe ”das Molekül, das im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert werden soll”, ”das Nukleinsäuremolekül, das im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert werden soll” oder ”das Polypeptid, das im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert werden soll” die Begriffe ”das Nukleinsäuremolekül der Erfindung” bzw. ”das Polypeptid der Erfindung” ein.
In einer Ausführungsform stammt das Nukleinsäuremolekül in vorteilhafter Weise aus einer Pflanze.
Wie erwähnt, werden in einer Ausführungsform Nutzpflanzen bevorzugt, z. B. die oben genannten Wirtspflanzen.
Allerdings ist es ebenfalls möglich, künstliche Sequenzen, welche sich vorzugsweise in einer oder mehreren Basen von den in Organismen vorgefundenen Nuklein säuresequenzen, oder in einem oder mehreren Aminosäuremolekülen von in Organismen vorgefundenen Polypeptidsequenzen unterscheiden, zur Ausführung der Erfindung zu verwenden, z. B. um eine Aktivität zu unterdrücken, zu inaktivieren oder herunterzuregulieren, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und SET-Domäne-enthaltendem Protein besteht, z. B. um eine Aktivität des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, welches die oben erwähnte Aktivität vermittelt, zu unterdrücken, inaktivieren oder herunterzuregulieren wobei z. B. der erhöhte Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, insbesondere eine gesteigerte NUE, oder insbesondere eine erhöhte Biomasseproduktion, oder speziell eine gesteigerte NUE und/erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, nach Reduzieren, Unterdrücken, Verringern oder Deletieren seiner Expression oder Aktivität herbeigeführt werden.
In dem Verfahren gemäß der Erfindung können Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, welche, falls geeignet, synthetische, nicht-natürliche oder modifizierte Nukleotidbasen enthalten, die in DNA oder RNA eingebaut werden können. Die synthetischen, nicht-natürlichen oder modifizierten Basen können zum Beispiel die Stabilität des Nukleinsäuremoleküls außerhalb oder innerhalb einer Zelle erhöhen. Die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle können selbige Modifikationen, wie vorstehend erwähnt, enthalten.
Wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet, kann das Nukleinsäuremolekül auch die untranslatierte Sequenz beinhalten, welche sich am 3'- und am 5'-Ende der codierenden Genregion befindet, beispielsweise mindestens 500, vorzugsweise 200, besonders bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5'-Endes der codierenden Region, und mindestens 100, vorzugsweise 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Endes der codierenden Genregion. Für den Fall, dass beispielsweise die RNAi- oder Antisense-Technologie angewandt wird, können in vorteilhafter Weise ebenfalls die 5'- und/oder 3'-Regionen verwendet werden.
In einer Ausführungsform ist es vorteilhaft, die codierende Region zur Klonierung und Expression von Repressionskonstrukten, wie Antisense-, RNAi- oder Cosuppressionskonstrukten, auszuwählen, um auf mehrere oder alle der orthologen Gene abzuzielen, welche ansonsten eine gegenseitige Kompensation erbringen könnten.
In einer anderen Ausführungsform ist es vorteilhaft, sehr genspezifische Sequenzen, welche aus der 3'- oder 5'-Strich-Region stammen, für die Konstruktion von Repressionskonstrukten zu verwenden, und zwar mit dem Ziel, die Aktivität oder den Expressionsspiegel lediglich des Zielgens spezifisch zu reduzieren und somit Nebenwirkungen durch Unterdrücken anderer Nicht-Ziel-Gene (sogenannte off-targets bzw. falsche Ziele) zu vermeiden.
Der Fachmann auf dem Gebiet ist vertraut mit dem Analysieren der tatsächlichen genomischen Situation in seinem Zielorganismus. Die notwendige Information kann durch Suche in relevanten Sequenzdatenbanken oder Ausführen von genomischen Southern-Blottings, welche die Genomstruktur des Zielorganismus offenbaren, und schließlich durch Kombinieren dieser Ergebnisse mit Informationen über Expressionsspiegel der hierin offenbarten Zielgene, wie z. B. erhalten durch Array-Experimente, Northern-Blottings oder RT-qPCR-Experimente, gewonnen werden.
Vorzugsweise ist das im Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül.
Ein ”isoliertes” Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül ist von anderen Polynukleotiden oder Nukleinsäuremolekülen getrennt, welche in der natürlichen Quelle des Nukleinsäuremoleküls vorhanden sind. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kann ein chromosomales Fragment von mehreren kb, oder, vorzugsweise, ein Molekül, das nur die codierende Region des Gens umfasst, sein. Demgemäß kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül chromosomale Regionen, welche 5' und 3' benachbart sind, oder weitere angrenzende chromosomale Regionen umfassen, aber umfasst vorzugsweise keine derartigen Sequenzen, welche natürlicherweise die Nukleinsäuremolekülesequenz im genomischen oder chromosomalen Zusammenhang in dem Organismus, aus welchem das Nukleinsäuremolekül stammt, flankieren (beispielsweise Sequenzen, welche angrenzend an die Regionen vorliegen, welche die 5'- und 3'-UTRs des Nukleinsäuremoleküls codieren). In verschiedenen Ausführungsformen kann das im Verfahren gemäß der Erfindung verwendete, isolierte Nukleinsäuremolekül zum Beispiel weniger als ungefähr 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen umfassen, welche in natürlicher Weise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle flankieren, aus der das Nukleinsäuremolekül stammt.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle, oder ein Teil davon, können unter Anwendung von molekularbiologischen Standardtechniken und der hierin bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Außerdem können beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzregionen auf DNA- oder Aminosäure-Ebene mit Hilfe von Vergleichsalgorithmen identifiziert werden. Erstere kann/können als Hybridisierungssonden unter standardmäßigen Hybridisierungstechniken (zum Beispiel denjenigen, beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) zum Isolieren weiterer Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, welche in diesem Verfahren nützlich sind.
Ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz eines Moleküls, dessen Aktivität im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert werden soll, z. B. wie offenbart in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder einen Teil davon, kann außerdem durch Polymerase-Kettenreaktion isoliert werden, wobei auf dieser Sequenz oder auf Teilen davon basierende Oligonukleotid-Primer verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die vollständige Sequenz oder einen Teil davon, durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern isoliert werden, welche auf der Grundlage der offenbarten Sequenzen hergestellt wurden. Beispielsweise kann mRNA aus Zellen isoliert werden, zum Beispiel durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979), und cDNA kann mittels Reverser Transkriptase erzeugt werden (zum Beispiel Moloney MLV Reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV Reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL).
Synthetische Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation mittels Polyermase-Kettenreaktion können auf der Basis von einer hierin gezeigten Sequenz hergestellt werden, beispielsweise aus den Molekülen, umfassend die Moleküle, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder abgeleitet aus dem Molekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I oder II, Anmeldung Nr. 1. Derartige Primer können verwendet werden, um Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel aus cDNA-Bibliotheken oder aus genomischen Bibliotheken zu amplifizieren und Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren, welche im erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind. Zum Beispiel werden die Primer, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle III, Anmeldung Nr. 1, welche an ihrem 5-Strich-Ende nicht mit den Nukleotiden ATA beginnen, verwendet.
Ferner ist es möglich, konservierte Regionen aus verschiedenen Organismen zu identifizieren durch Ausführen von Proteinsequenz-Alignments mit dem Polypeptid, das von dem Nukleinsäuremolekül codiert wird, welches gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere mit den, von dem Nukleinsäuremolekül codierten, Sequenzen, wie sie in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt sind, aus denen konservierte Regionen und, im Gegenzug, degenerierte Primer abgeleitet werden können.
Konservierte Regionen sind diejenigen, welche eine sehr geringe Variation an der Aminosäure in einer jeweiligen Position von mehreren Homologen unterschiedlicher Herkunft aufzeigen. Die Konsensussequenz und Polypeptidmotive, wie aufgeführt in der Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, werden aus den Alignments hergeleitet. Darüber hinaus ist es möglich, konservierte Regionen aus verschiedenen Organismen zu identifizieren durch Ausführen von Proteinsequenz-Alignments mit dem Polypeptid, codiert von dem Nukleinsäuremolekül, welches gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere mit den Sequenzen, codiert von dem Polypeptidmolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aus denen konservierte Regionen und, im Gegenzug, degenerierte Primer hergeleitet werden können.
Konservierte Regionen sind diejenigen, welche eine sehr geringe Variation an der Aminosäure in einer jeweiligen Position von mehreren Homologen unterschiedlichen Ursprungs aufzeigen. Die Konsensussequenzen und Polypeptidmotive, wie aufgeführt in der Spalte 7 der Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, werden aus den Alignments hergeleitet. in einer vorteilhaften Ausführungsform wird, im Verfahren der vorliegenden Erfindung, die Aktivität eines Polypeptids verringert, welches eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Tabelle IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, umfasst oder daraus besteht, und in einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, umfassend oder bestehend aus einer Konsensussequenz oder einem Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Tabelle IV, Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, wobei 20 oder weniger, vorzugsweise 15 oder 10, bevorzugt 9, 8, 7, oder 6, weiter bevorzugt 5 oder 4, noch weiter bevorzugt 3, noch stärker bevorzugt 2, noch weiter bevorzugt 1, am meisten bevorzugt 0, der angegebenen Aminosäurepositionen durch eine beliebige Aminosäure ersetzt werden können. In einer Ausführungsform sind/ist nicht mehr als 15%, vorzugsweise 10%, noch stärker bevorzugt 5%, 4%, 3% oder 2%, am stärksten bevorzugt 1% oder 0% der Aminosäureposition, angegeben durch einen Buchstaben, durch eine andere Aminosäure ersetzt. In einer Ausführungsform sind 20 oder weniger, vorzugsweise 15 oder 10, vorzugsweise 9, 8, 7 oder 6, weiter bevorzugt 5 oder 4, noch weiter bevorzugt 3, noch weiter bevorzugt 2, noch stärker bevorzugt 1, am stärksten bevorzugt 0 Aminosäuren in eine Konsensussequenz oder ein Proteinmotiv eingefügt bzw. inseriert.
Die Konsensussequenz wurde aus einem Mehrfach-Alignment der Sequenzen, wie sie in Tabelle II aufgelistet sind, abgeleitet. Die Buchstaben repräsentieren den Ein-Buchstabe-Aminosäure-Code und zeigen an, dass die Aminosäuren in allen alignierten Proteinen konserviert sind. Der Buchstabe X steht für Aminosäuren, welche nicht in allen Sequenzen konserviert sind. In einem Beispiel werden in den Fällen, in denen nur eine kleine ausgewählte Teilmenge an Aminosäuren an einer bestimmten Position möglich ist, diese Aminosäuren in Klammern angegeben. Die Anzahl von angezeigten X gibt die Distanzen zwischen konservierten Aminosäureresten an, wobei z. B. Y-x(21, 23)-F bedeutet, dass konservierte Tyrosin- und Phenylalaninreste durch minimal 21 und maximal 23 Aminosäurereste in allen betrachteten Sequenzen voneinander getrennt sind.
Konservierte Domänen wurden aus allen Sequenzen identifiziert und sind unter Anwendung einer Untergruppe der standardmäßigen Prosite-Notation beschrieben, wobei z. B. das Muster Y-x(21, 23)-[FW] bedeutet, dass ein konserviertes Tyrosin durch minimal 21 und maximal 23 Aminosäurereste von entweder einem Phenylalanin oder Tryptophan getrennt ist.
Konservierte Muster wurden mit dem Software-Tool MEME, Version 3.5.1, oder manuell identifiziert. MEME wurde von Timothy L. Bailey und Charles Elkan, Dept. of Computer Science and Engineering, Universität von Kalifornien, San Diego, USA, entwickelt und ist von Timothy L. Bailey und Charles Elkan [Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, S. 28–36, AAAI Press, Menlo Park, Kalifornien 1994] beschrieben worden. Der Quelltext für das Standalone-Programm ist vom San Diego Supercomputer Center (http://meme.sdsc.edu) öffentlich verfügbar.
Zum Identifizieren von gemeinsamen Motiven in allen Sequenzen mit dem Software-Tool MEME wurden die folgenden Einstellungen verwendet: -maxsize 500000, -nmotifs 15, -evt 0.001, -maxw 60, -distance 1e-3, -minsites, Anzahl von Sequenzen, die für die Analyse verwendet werden. Die Eingabesequenzen für MEME waren nicht-alignierte Sequenzen im Fasta-Format. Andere Parameter wurden in den Standardeinstellungen in dieser Softwareversion verwendet.
Prosite-Muster für konservierte Domänen wurden mit dem Software-Werkzeug Pratt, Version 2.1, oder manuell erzeugt. Pratt wurde von Inge Jonassen, Dept. of Informatics, University of Bergen, Norwegen, entwickelt und ist von Jonassen et al. (Jonassen, I., Collins, J. F., und Higgins, D. G., Protein Science 4, 1587 (1995); Jonassen, I., Efficient discovery of conserved patterns using a pattern graph, eingereicht bei CABIOS, Febr. 1997) beschrieben worden. Der Quelltext (ANSI C) für das Standalone-Programm ist öffentlich verfügbar, z. B. bei etablierten Bioinformatik-Zentren, wie dem EBI (Europäisches Bioinformatik-Institut).
Zum Erzeugen von Mustern mit dem Software-Tool Pratt wurden die folgenden Einstellungen verwendet: PL (max. Muster-Länge): 100, PN (max. Anz. an Mustersymbolen): 100, PX (max. Anz. aufeinanderfolgender x's): 30, FN (max. Anz. flexibler Spacer): 5, FL (max. Flexibilität): 30, FP (max. Flex. Produkt): 10, ON (max. Anzahl an Mustern): 50. Die Eingabesequenzen für Pratt waren einzelne Regionen der Proteinsequenzen, welche eine hohe Ähnlichkeit aufwiesen, wie identifiziert mit dem Software-Werkzeug MEME. Die Minimumanzahl an Sequenzen, welche mit den erzeugten Mustern übereinstimmen müssen (CM, min. Anz. von Seq., die Übereinstimmung zeigen müssen) wurde auf mindestens 80% der eingegebenen Sequenzen eingestellt. Die hier nicht erwähnten Parameter wurden in ihren Standardeinstellungen verwendet.
Die Prosite-Muster der konservierten Domänen können verwendet werden, um nach Proteinsequenzen zu suchen, welche diesem Muster entsprechen. Verschiedene etablierte Bioinformatik-Zentren stellen öffentliche Internetportale zur Verwendung dieser Muster in Da tenbank-Suchen bereit (z. B. PIR (Protein Information Resource, am Georgetown University Medical Center) oder ExPASy (Experten-Protein-Analyse-System)). Alternativ dazu ist Standalone-Software verfügbar, wie etwa das Programm Fuzzpro, welches ein Teil des EMBOSS Software-Pakets ist. Beispielsweise gestattet das Programm Fuzzpro nicht nur die Suche nach einer exakten Muster-Protein-Übereinstimmung, sondern ermöglicht es auch, verschiedene Uneindeutigkeiten bei der durchgeführten Suche vorzugeben bzw. einzustellen.
Das Alignment wurde durchgeführt mit der Software ClustalW (Version 1.83) und ist beschrieben von Thompson et al. [Thompson, J. D., Higgins, D. G., und Gibson, T. J., Nucleic Acids Research, 22, 4673 (1994)]. Der Quelltext für das Standalone-Programm ist vom European Molecular Biology Laboratory; Heidelberg, Deutschland, öffentlich verfügbar. Die Analyse wurde unter Verwendung der Standardparameter von ClustalW v1.83 durchgeführt (Lücken-Öffnungs-Strafwert: 10,0; Lücken-Erweiterungs-Strafwert: 0,2; Proteinmatrix: Gonnet; pprotein/DNA-Lückenende: –1; protein/DNA-Lückendistanz: 4).
Degenerierte Primer, entworfen wie oben beschrieben, können dann durch PCR zur Amplifizierung von Fragmenten von neuen codierenden Regionen verwendet werden, codierend Proteine mit der oben erwähnten Aktivität, wobei z. B. die Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder die erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, nach dem Reduzieren, Unterdrücken, Verringern oder Deletieren der Expression oder Aktivität der jeweiligen Nukleinsäuresequenz oder des von der Sequenz codierten Proteins, das z. B. die Aktivität eines Proteins aufweist, das von einer Nukleinsäure codiert ist, deren Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert oder deletiert werden soll, oder weiterer funktioneller Äquivalent(e) oder Homologe aus anderen Organismen herbeigeführt wird.
Diese Fragmente können dann als Hybridisierungssonde zum Isolieren der vollständigen Gensequenz verwendet werden. Als Alternative können die fehlenden 5'- und 3'-Sequenzen mit Hilfe von RACE-PCR isoliert werden. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann unter Verwendung von cDNA oder, als Alternative, genomischer DNA als Matrize und von geeigneten Oligonukleotid-Primern unter Befolgung von standardmäßigen PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Das derartig amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen geeigneten Vektor kloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, welche einem der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle entsprechen, können durch standardmäßige Syntheseverfahren, zum Beispiel unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers, erzeugt werden.
Nukleinsäuremoleküle, welche für das Verfahren gemäß der Erfindung vorteilhaft sind, können basierend auf ihrer Homologie zu den hierin offenbarten Nuklein säuremolekülen unter Verwendung der Sequenzen oder eines Teils davon als Hybridisierungssonde und gemäß Standardhybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden.
In diesem Zusammenhang ist es möglich, zum Beispiel isolierte Nukleinsäuremoleküle von mindestens 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 oder mehr Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 15, 20 oder 25 Nukleotiden Länge zu verwenden, welche unter stringenten Bedingungen mit den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen hybridisieren, insbesondere mit denjenigen, welche eine Nukleotidsequenz umfassen, wie sie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist. Nukleinsäuremoleküle mit 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden können ebenfalls verwendet werden.
Der Begriff ”Homologie” bedeutet, dass die jeweiligen Nukleinsäuremoleküle oder codierten Proteine funktionell und/oder strukturell äquivalent sind. Die Nukleinsäuremoleküle, welche homolog zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen sind und welche Derivate der Nukleinsäuremoleküle sind, sind beispielsweise Variationen der Nukleinsäuremoleküle, die Modifikationen mit der gleichen biologischen Funktion repräsentieren, wobei sie insbesondere Proteine mit der gleichen oder im wesentlichen der gleichen biologischen Funktion codieren. Sie können natürlich vorkommende Variationen, wie Sequenzen aus anderen Pflanzenvarietäten oder -spezies, oder Mutationen sein. Diese Mutationen können natürlich vorkommen oder können durch Mutagenesetechniken erhalten werden. Die allelischen Variationen können natürlich vorkommende allelische Varianten sowie synthetisch hergestellte oder gentechnisch erzeugte Varianten sein. Strukturäquivalente können beispielsweise durch Testen der Bindung des Polypeptids an Antikörper oder durch computergestützte Vorhersagen identifiziert werden. Strukturäquivalente weisen ähnliche immunologische Charakteristika auf, wobei sie zum Beispiel ähnliche Epitope umfassen.
Mit ”Hybridisieren” ist gemeint, dass derartige Nukleinsäuremoleküle unter herkömmlichen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, hybridisieren, wie z. B. beschrieben von Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6.
Gemäß der Erfindung können sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle der Nukleinsäure der Erfindung als Sonden verwendet werden. Ferner können, als Matrize zur Identifizierung von funktionellen Homologen, sowohl Northern-Blot-Assays als auch Southern-Blot-Assays durchgeführt werden. Der Northern-Blot-Assay liefert in vorteilhafter Weise weitere Informationen über das exprimierte Genprodukt: z. B. Expressionsmuster, Auftreten von Prozessierungsschritten, wie Splicing und Capping, etc. Der Southern-Blot- Assay liefert zusätzliche Information über die chromosomale Lokalisierung und die Organisation des Gens, welches das Nukleinsäuremolekül der Erfindung codiert.
Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Southern-Blot-Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C, beispielsweise bei 50°C, 55°C oder 60°C. Der Fachmann auf dem Gebiet weiß, dass diese Hybridisierungsbedingungen als Funktion des Typs der Nukleinsäure und, zum Beispiel, wenn organische Lösungsmittel vorhanden sind, bezüglich der Temperatur und Konzentration des Puffers abweichen. Die Temperatur unter ”Standardhybridisierungsbedingungen” differiert beispielsweise als eine Funktion des Typs der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 50°C in einem wässrigen Puffer mit einer Konzentration von 0,1 ×, 0,5 ×, 1 ×, 2 ×, 3 ×, 4 × oder 5 × SSC (pH 7,2). Wenn organische(s) Lösungsmittel im oben erwähnten Puffer vorhanden ist/sind, beispielsweise 50% Formamid, beläuft sich die Temperatur unter Standardbedingungen auf ungefähr 40°C, 42°C oder 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride sind beispielsweise bevorzugt 0,1 × SSC und 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C oder 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride sind beispielsweise bevorzugt 0,1 × SSC und 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C oder 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die oben erwähnten Hybridisierungstemperaturen werden zum Beispiel für eine Nukleinsäure von ungefähr 100 bp (= Basenpaare) Länge und mit einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid ermittelt. Der Fachmann weiß, wie man die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen mit der Hilfe von Lehrbüchern ermittelt, zum Beispiel denjenigen, welche oben erwähnt wurden, oder aus den folgenden Lehrbüchern: Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames und Higgins (Hrsg.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press bei Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsg.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press bei Oxford University Press, Oxford.
Ein weiteres Beispiel einer derartigen stringenten Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung bei 4 × SSC bei 65°C, gefolgt von Waschen in 0,1 × SSC bei 65°C während einer Stunde. Alternativ dazu besteht eine beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingung in 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C. Ferner können die Bedingungen während des Waschschrittes aus dem Bereich von Bedingungen ausgewählt werden, der von Niederstringenzbedingungen (ungefähr 2 × SSC bei 50°C) und Hochstringenzbedingungen (ungefähr 0,2 × SSC bei 50°C, vorzugsweise bei 65°C) begrenzt wird (20 × SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0). Zusätzlich kann die Temperatur während des Waschschrittes von Niederstringenzbedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, auf Höherstringenzbedingungen mit ungefähr 65°C angehoben werden.
Beide Parameter, Salzkonzentration sowie Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, oder ansonsten kann einer der zwei Parameter konstant gehalten werden, während nur der andere variiert wird. Denaturierungsmittel, zum Beispiel Formamid oder SDS, können ebenfalls während der Hybridisierung verwendet werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung vorzugsweise bei 42°C ausgeführt. Relevante Faktoren wie 1) Länge der Behandlung, 2) Salzbedingungen, 3) Detergenzbedingungen, 4) Kompetitor-DNAs, 5) Temperatur und 6) Sondenauswahl können je nach Fall so kombiniert werden, dass nicht alle Möglichkeiten hierin erwähnt werden können.
Einige Beispiele von Bedingungen für die DNA-Hybridisierung (Southern-Blot-Assays) und den Waschschritt sind hierin nachstehend gezeigt:

(1) Hybridisierungsbedingungen können zum Beispiel aus den folgenden Bedingungen ausgewählt werden: a) 4 × SSC bei 65°C, b) 6 × SSC bei 45°C, c) 6 × SSC, 100 mg/ml denaturierte fragmentierte Fischsperma-DNA bei 68°C, d) 6 × SSC, 0,5% SDS, 100 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 68°C, e) 6 × SSC, 0,5% SDS, 100 mg/ml denaturierte fragmentierte Lachssperma-DNA, 50% Formamid bei 42°C, f) 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C, g) 50% (vol/vol) Formamid, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, h) 2 × oder 4 × SSC bei 50°C (Niederstringenzbedingung), oder i) 30 bis 40% Formamid, 2 × oder 4 × SSC bei 42°C (Niederstringenzbedingung).
(2) Waschschritte können zum Beispiel aus den folgenden Bedingungen gewählt sein: a) 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% SDS bei 50°C. b) 0,1 × SSC bei 65°C. c) 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 68°C. d) 0,1 × SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C. e) 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C. f) 2 × SSC bei 65°C (Niederstringenzbedingung). g) 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C (Mittel-Hochstringenzbedingungen), oder h) 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C (Mittel-Hochstringenzbedingungen), oder i) 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C (Hochstringenzbedingungen), oder j) 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C (Hochstringenzbedingungen)

Polypeptide oder Nukleinsäuremoleküle, welche die oben erwähnte Aktivität aufweisen, z. B. den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoff verwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermitteln, welche aus anderen Organismen abgeleitet sind, können von anderen DNA-Molekülen codiert sein, die an ein Molekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, unter gelockerten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, oder selbiges umfassen, und die bei Expression Peptide oder Nukleinsäuren codieren, deren Aktivität reduziert oder deletiert werden muss, um einen gesteigerten Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze herbeizuführen.
Vorzugsweise weisen die Polypeptide und Polynukleotide weitere biologische Aktivitäten des Proteins oder des Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Molekül, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, II bzw. IV, Anmeldung Nr. 1, auf.
Gelockerte Hybridisierungsbedingungen können zum Beispiel in Southern-Blotting-Experimenten angewandt werden.
Manche Anwendungen müssen bei Niederstringenz-Hybridisierungsbedingungen durchgeführt werden, und zwar ohne irgendwelche Folgen für die Spezifität der Hybridisierung. Zum Beispiel könnte eine Southern-Blot-Analyse von Gesamt-DNA mit einem Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung sondiert und bei niedriger Stringenz (55°C in 2 × SSPE, 0,1% SDS) gewaschen werden. Die Hybridisierungsanalyse könnte ein einfaches Muster von lediglich solchen Genen, welche Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, z. B. mit der hierin erwähnten Aktivität, offenbaren. Ein weiteres Beispiel solcher niederstringenten Hybridisierungsbedingungen ist 4 × SSC bei 50°C oder eine Hybridisierung mit 30 bis 40% Formamid bei 42°C. Derartige Moleküle umfassen diejenigen, welche Fragmente, Analoge oder Derivate des Nukleinsäuremoleküls sind, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder welche das Polypeptid codieren, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, und unterscheiden sich beispielsweise hinsichtlich Aminosäure- und/oder Nukleotiddeletion(en), -insertion(en), -substitution(en), -addition(en) und/oder -rekombination(en) oder jedweder sonstigen Modifikation(en), welche im Fachgebiet bekannt sind, entweder allein oder in Kombination, von den oben beschriebenen Aminosäuresequenzen oder den (zugrundeliegenden) Nukleotidsequenz(en).
Allerdings ist es bevorzugt, Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen anzuwenden.
Die Hybridisierung sollte in vorteilhafter Weise mit Fragmenten von mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 oder 40 bp, vorteilhafterweise mindestens 50, 60, 70 oder 80 bp, vorzugsweise mindestens 90, 100 oder 110 bp durchgeführt werden. Am stärksten bevorzugt sind Fragmente mit wenigstens 15, 20, 25 oder 30 bp. Bevorzugt sind auch Hybridisierungen mit mindestens 100 bp oder 200, insbesondere bevorzugt mindestens 400 bp Länge. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sollte die Hybridisierung mit der gesamten Nukleinsäuresequenz bei den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt werden.
Die Begriffe ”Fragment”, ”Fragment einer Sequenz” oder ”Teil einer Sequenz” bedeuten eine trunkierte bzw. verkürzte Sequenz der betreffenden Originalsequenz. Die trunkierte Sequenz (Nukleinsäure- oder Proteinsequenz) kann hinsichtlich der Länge in großem Maß variieren; wobei die Minimumgröße eine Sequenz von ausreichender Größe ist, um eine Sequenz oder ein Sequenzfragment mit wenigstens 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 bp Länge mit wenigstens 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99% Identität, vorzugsweise 100% Identität, zu einem Fragment eines hierin zur Verwendung im Verfahren der Erfindung beschriebenen Nukleinsäuremoleküls, z. B. einem Fragment der Nukleinsäuremoleküle, deren Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, vorzusehen. Die trunkierten Sequenzen können, wie erwähnt, hinsichtlich der Länge in starkem Maße von 15 bp bis zu 2 kb oder mehr variieren, und vorteilhafterweise haben die Sequenzen eine minimale Länge von 15, 20, 25, 30, 35 oder 40 bp, während die Maximalgröße nicht kritisch ist. Es können Fragmente mit 100, 200, 300, 400, 500 oder mehr Basenpaaren verwendet werden. In manchen Anwendungen ist die Maximumgröße üblicherweise nicht wesentlich größer als diejenige, welche erforderlich ist, um die vollständigen Genfunktion(en) der Nukleinsäuresequenzen bereitzustellen. Derartige Sequenzen können in vorteilhafter Weise für die Unterdrückung, Reduktion, Verringerung oder Deletion der Aktivität, die im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, verwendet werden, zum Beispiel durch die Antisense-, RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmolekül-, Ribozym-Technologie, etc.
Für die Reduktion, Verringerung oder Deletion der Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Nukleinsäuremolekül wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, und/oder eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, können auch die Promotorregionen der offenbarten Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Der Fachmann weiß, wie man die Promotorregionen kloniert.
Typischerweise wird das trunkierte Aminosäuremolekül im Bereich von etwa 5 bis etwa 310 Aminosäuren Länge liegen. Noch typischer wird die Sequenz jedoch maximal etwa 250 Aminosäuren Länge, vorzugsweise maximal etwa 200 oder 100 Aminosäuren, aufweisen. Es ist üblicherweise erwünscht, Sequenzen mit mindestens etwa 10, 12 oder 15 Aminosäuren, bis zu einem Maximum von etwa 20 oder 25 Aminosäuren, zu wählen.
Der Begriff ”eine oder mehrere Aminosäure(n)” bezieht sich auf mindestens eine Aminosäure aber nicht mehr als diejenige Anzahl von Aminosäuren, welche zu einer Homologie von unter 50% Identität führen werden. Vorzugsweise ist die Identität mehr als 70% oder 80%, weiter bevorzugt sind 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% oder 95%, noch weiter bevorzugt sind 96%, 97%, 98% oder 99% Identität.
Ferner umfasst das in dem Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül, das ein Komplement von einer der Nukleotidsequenzen der oben erwähnten Nukleinsäuremoleküle oder eines Abschnittes davon ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das zu einer der Nukleotidsequenzen, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, komplementär ist, oder ein Nukleinsäuremolekül, das die Sequenz umfasst, ist ein solches, welches ausreichend komplementär zu den Nukleotidsequenzen ist, damit es an die Nukleotidsequenzen hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex gebildet wird.
Vorzugsweise wird die Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt. Allerdings ist ein Komplement von einer der hierin offenbarten Sequenzen vorzugsweise ein Sequenzkomplement dazu, in Übereinstimmung mit der dem Fachmann gut bekannten Basenpaarung von Nukleinsäuremolekülen. Beispielsweise gehen die Basen A und G eine Basenpaarung mit den Basen T bzw. U oder C ein, und umgekehrt. Modifikationen der Basen können den Basenpaarungs-Partner beeinflussen.
Das Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu mindestens etwa 30%, 35%, 40% oder 45%, vorzugsweise mindestens etwa 50%, 55%, 60% oder 65%, weiter bevorzugt mindestens etwa 70%, 80% oder 90%, und noch weiter bevorzugt mindestens etwa 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr, zu einer Nukleotidsequenz, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder einem Abschnitt davon, homolog ist und/oder die Aktivität des Proteins, angegeben in derselben Zeile in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder des Nukleinsäuremoleküls, welches das Protein codiert, aufweist.
Das Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, umfasst eine Nukleotidsequenz, welche an eine der Nukleotidsequenzen wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, oder einen Abschnitt davon, hybridisiert, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie hierin definiert, hybridisiert, und ein Protein mit der zuvor erwähnten Aktivität codiert, wobei z. B. der erhöhte Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffver-Wertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, nach der Reduktion oder Deletion seiner Aktivität, und z. B. der Aktivität des Proteins, herbeigeführt wird.
Ferner kann das Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, insbesondere das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, lediglich einen Abschnitt der codierenden Region von einer der Sequenzen, aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, beispielsweise ein Fragment, welches als eine Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, codierend einen biologisch aktiven Abschnitt des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder ein Fragment, das einen nicht-aktiven Teil des Nukleinsäuremoleküls oder des Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, codiert, aber einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn seine Expression oder Aktivität reduziert oder deletiert ist, umfassen.
Die Nukleotidsequenzen, ermittelt aus der Klonierung des Gens, welches das Molekül codiert, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, gestatten die Erzeugung von Sonden und Primern, entworfen für die Verwendung bei der Identifizierung und/oder Klonierung seiner Homologe in anderen Zelltypen und Organismen. Die Sonde/der Primer umfasst typischerweise im wesentlichen gereinigtes Oligonukleotid. Das Oligonukleotid umfasst typischerweise eine Nukleotidsequenz-Region, welche unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, 15, vorzugsweise etwa 20 oder 25, weiter bevorzugt etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges von einer der Sequenzen, dargestellt bzw. beschrieben für die Verwendung im Verfahren der Erfindung, z. B. umfassend das Molekül wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, einer Antisense-Sequenz von einer der Sequenzen oder von natürlich vorkommenden Mutanten davon, hybridisiert. Auf einem Nukleotid der Erfindung basierende Primer können in PCR-Reaktionen verwendet werden, um Homologe des Nukleinsäuremoleküls, dessen Aktivität gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, zu klonieren, z. B. als Primerpaare, beschrieben in den Beispielen der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel Primer, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle III, welche an ihrem 5-Strich-Ende nicht mit den Nukleotiden ATA beginnen. Die Nukleinsäuremoleküle, die Homologe der Nukleinsäuremoleküle sind, deren Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung selbst, können verwendet werden, um die Aktivität, die gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, zu reduzieren, zu verringern oder zu deletieren.
Primersätze sind austauschbar. Der Fachmann auf dem Gebiet weiß, wie man die Primer kombiniert, damit sie zu dem gewünschten Produkt führen, z. B. zu einem Volllängenklon oder einer partiellen Sequenz. Auf den Sequenzen des im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls basierende Sonden können verwendet werden, um Transkripte oder genomische Sequenzen, welche selbige codieren, oder homologe Proteine nachzuweisen. Die Sonde kann ferner eine daran gebundene Markierungsgruppe umfassen, wobei die Markierungsgruppe z. B. ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Cofaktor sein kann. Derartige Sonden können als ein Teil eines genomischen Marker-Testkits zum identifizieren von Zellen eingesetzt werden, welche ein Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, enthalten oder exprimieren oder nicht enthalten oder exprimieren, wie etwa durch Messen eines Spiegels eines codierenden Nukleinsäuremoleküls in einer Probe von Zellen, wobei z. B. mRNA-Spiegel gemessen werden oder bestimmt wird, ob ein genomisches Gen, umfassend die Sequenz des Polynukleotids, mutiert oder deletiert worden ist.
In einer Ausführungsform codiert das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise das Polynukleotid der Erfindung, ein Polypeptid oder einen Abschnitt davon, welcher eine Aminosäuresequenz einschließt, die zu der Aminosäuresequenz wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, ausreichend homolog ist, oder die zu einem Polypeptid, umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, ausreichend homolog ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck ”ausreichend homolog” auf Polypeptide oder Abschnitte davon, welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, die eine minimale Anzahl an identischen oder äquivalenten Aminosäureresten (z. B. einen Aminosäurerest, der eine ähnliche Seitenkette wie der Aminosäurerest, mit dem er verglichen wird, aufweist) im Vergleich zu einer Aminosäuresequenz eines Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert wird, einschließt, wobei das Polypetid im Besonderen zu einem Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, oder z. B. zu einem funktionellen Äquivalent davon ausreichend homolog ist.
Abschnitte der zuvor erwähnten Aminosäuresequenz besitzen eine Länge von mindestens 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50 oder mehr Aminosäuren.
In einer Ausführungsform umfasst das im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül, welches mindestens einen Abschnitt des Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der vorliegenden Erfindung verringert wird, z. B. eines Polypeptids, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, codiert.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Polypeptid, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, insbesondere das Polypeptid der Erfindung, mindestens etwa 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens etwa 55%, 60%, 65% oder 70%, und weiter bevorzugt mindestens etwa 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer gesamten Aminosäuresequenz eines Polypeptids, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder zu einem Polypeptid, umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, und aufweisend die oben erwähnte Aktivität, wobei z. B. vorzugsweise der erhöhte Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze herbeigeführt werden, nachdem seine Aktivität reduziert, unterdrückt oder deletiert worden ist.
Abschnitte des Proteins sind bevorzugt auf eine solche Weise biologisch aktiv, dass sie den Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. die Stickstoffverwertungseffizienz, steigern und/oder die Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhen, indem ihre Aktivität reduziert, unterdrückt, verringert oder deletiert wird.
Wie hierin erwähnt, ist mit dem Begriff ”biologisch aktiver Abschnitt” beabsichtigt, einen Abschnitt, z. B. eine Domäne/ein Motiv oder ein Epitop, einzuschließen, welcher, bei Einbringen des Abschnitts oder eines codierenden Polynukleotids in einen Organismus oder einen Teil davon, insbesondere in eine Zelle, dieselbe Aktivität zeigt, wie sein Homolog, wie es in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV aufgeführt ist.
In einer Ausführungsform besitzt der Abschnitt eines Polypeptids die Aktivität von einem Polypeptid sowie seines Homologs, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, wenn er in der Lage ist, eine Knockout-Mutante, wie hierin beschrieben, zu komplementieren.
Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuremoleküle, welche als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes aus einem Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder aus einem Polypeptid, das eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst, abgeleitet werden können und somit ein Polypeptid, das im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert werden soll, codieren, im Besonderen ein Polypeptid, bei dem das Reduzieren, Unterdrücken, Verringern oder Deletieren seiner Aktivität zu einer Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoff verwertungseffizienz, und/oder zur Erhöhung der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze führt.
In vorteilhafter Weise umfasst oder besitzt das Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, eine Nukleotidsequenz, codierend ein Protein, umfassend oder aufweisend ein Aminosäuremolekül, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, und unterscheidet sich von den Sequenzen des Aminosäuremoleküls, wie sie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt sind, bevorzugt in mindestens einer oder mehreren Aminosäure(n).
Die oben genannten Nukleinsäuremoleküle, z. B. die Nukleinsäuremoleküle, welche als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes aus den Polypeptidsequenzen abgeleitet werden können, können für die Herstellung eines Nukleinsäuremoleküls, z. B. eines Antisense-Moleküls, einer tRNA, einer snRNA, einer dsRNA, einer siRNA, einer miRNA, einer ta-siRNA, von Cosuppressionsmolekülen, eines Ribozymmoleküls oder eines viralen Nukleinsäuremoleküls oder eines anderen inhibitorischen oder aktivitätsreduzierenden Moleküls, wie hierin zur Verwendung im Verfahren der Erfindung beschrieben, verwendet werden, z. B. für die Repression, Verringerung oder Deletion der Aktivität des Polypeptids oder des Nukleinsäuremoleküls zur Verwendung im Verfahren der Erfindung gemäß der Beschreibung hierin.
Darüber hinaus wird es der Fachmann auf dem Gebiet richtig verstehen, dass die DNA-Sequenzpolymorphismen, welche zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen führen, innerhalb einer Population vorkommen können. Ein derartiger genetischer Polymorphismus in dem Gen, welches z. B. das Polypeptid der Erfindung codiert oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung enthält, kann unter Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe ”Gen” und ”rekombinantes Gen” auf Nukleinsäuremoleküle, umfassend einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid codiert, umfassend das Polypeptid, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, oder auf ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptidmolekül, dessen Aktivität im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert wird. Zum Beispiel umfasst das Gen einen offenen Leserahmen, codierend ein Polypeptid, umfassend das Polypeptid, die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, wie etwa das Polypeptid der Erfindung, oder codierend ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, wie etwa das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, und ist vorzugsweise aus einer Nutzpflanze abgeleitet.
Bei dem Gen kann es sich auch um eine natürliche Variation des Gens handeln.
Derartige natürliche Variationen können typischerweise zu einer Varianz von 1–5% in der Nukleotidsequenz des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Gens führen.
Nukleinsäuremoleküle, welche natürlichen Varianten-Homologen des Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, wie etwa das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, entsprechen und bei denen es sich auch um eine cDNA handeln kann, können basierend auf ihrer Homologie zu den hierin offenbarten Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung des Nukleinsäuremoleküls, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, z. B. des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, oder eines Fragmentes davon, als Hybridisierungssonde gemäß Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden.
Folglich ist das Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, z. B. das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, in einer anderen Ausführungsform mindestens 15, 20, 25 oder 30 Nukleotide lang. Vorzugsweise hybridisiert es unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung, z. B. umfassend die Sequenz, wie sie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist. Das Nukleinsäuremolekül besitzt vorzugsweise eine Länge von mindestens 20, 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden.
Der Begriff ”hybridisiert unter stringenten Bedingungen” ist oben stehend definiert. In einer Ausführungsform beschreibt der Ausdruck ”hybridisiert unter stringenten Bedingungen” beabsichtigtermaßen Bedingungen für die Hybridisierung und das Waschen, unter denen Nukleotidsequenzen, welche wenigstens zu 30%, 40%, 50% oder 65% identisch zueinander sind, in der Regel aneinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen derartig, dass Sequenzen mit wenigstens etwa 70%, weiter bevorzugt wenigstens etwa 75% oder 80%, und noch weiter bevorzugt wenigstens etwa 85%, 90% oder 95% oder mehr Identität zueinander in der Regel aneinander hybridisiert bleiben.
In einer Ausführungsform hybridisiert das Nukleinsäuremolekül der Erfindung unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz von Spalte 7 von Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, und entspricht einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Wie hierin verwendet, bezieht sich ein ”natürlich vorkommendes” Nukleinsäuremolekül auf ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, welche in der Natur vorkommt (wobei es z. B. ein natürliches Protein codiert). Vorzugsweise codiert das Nukleinsäuremolekül ein natürliches Protein, welches eine Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder der Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, nach Reduzieren, Verringern oder Deletieren seiner Expression oder Aktivität herbeiführt.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der Nukleinsäure- oder Proteinsequenz, welche in der Population existieren können, wird der Fachmann davon ausgehen, dass Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls, das das Polypeptid codiert, eingebracht werden können, was zu Änderungen in der Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids führt und dadurch das Funktionsvermögen des Polypeptids ändert, gleichbedeutend vorzugsweise mit einer Reduzierung, Verringerung oder Deletierung der Aktivität. Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen, welche zu Aminosäurensubstitutionen an ”essentiellen” Aminosäureresten führen, in einer Sequenz des Nukleinsäuremoleküls vorgenommen werden, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, welches z. B. das entsprechende Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, umfasst. Ein ”essentieller” Aminosäurerest ist ein Rest, der bei Abweichung bzw. Abänderung von der Wildtypsequenz von einem der Polypeptide zu einer veränderten Aktivität des Polypeptids führt, wohingegen ein ”nicht-essentieller” Aminosäurerest für die Aktivität des Proteins, zum Beispiel für die Aktivität als Enzym, nicht erforderlich ist. Die Veränderung von ”essentiellen” Resten führt häufig zu einer reduzierten, verringerten oder deletierten Aktivität der Polypeptide. Vorzugsweise werden Aminosäuren des Polypeptids auf eine solche Weise verändert, dass die Aktivität reduziert, verringert oder deletiert wird, was heißt, dass bevorzugt essentielle Aminosäurereste und/oder mehrere nicht-essentielle Reste verändert werden und hierdurch die Aktivität reduziert wird, was, wie oben erwähnt, zu einer Steigerung von dem Ertrag, insbesondere von einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder einer Erhöhung der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze in einer Pflanze, nach Verringern der Expression oder Aktivität des Polypeptids, führt. Andere Aminosäurereste (z. B. diejenigen, welche in der Domäne mit der Aktivität nicht konserviert oder lediglich halb-konserviert sind) müssen jedoch nicht essentiell für die Aktivität sein und vermögen daher wahrscheinlich einer Änderung unterzogen zu werden, ohne die Aktivität zu verändern, weswegen sie weniger bevorzugt sind.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die spezifische Suche oder Selektion bzw. Auswahl von Änderungen in einer Nukleinsäuresequenz, welche eine reduzierte, unterdrückte oder deletierte Aktivität vermitteln, in einer Population, z. B. in einer natürlichen oder künstlich erzeugten Population. Häufig ist die Suche nach einer Steigerung von dem Ertrag, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder einer Erhöhung der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze in einer Population z. B. wegen komplizierter analytischer Verfahrensweisen, komplex und kostspielig. Es kann daher vorteilhaft sein, in der Population nach Änderungen in einer Nukleinsäuresequenz, die eine reduzierte, unterdrückte oder deletierte Aktivität des Expressionsproduktes vermitteln, zu suchen, wodurch Kandidaten identifiziert werden, welche die gewünschte Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder eine Erhöhung der Biomasseproduktion im Vergleich zum Gehalt einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze bewirken. Ein typisches Beispiel eines natürlichen Gens, dessen Herunterregulierung zu der gewünschten Eigenschaft führt, ist der mlo-Genort (Pifanelli et al., Nature 430 (7002), 887 (2004)). Gerste-Pflanzen, welche Funktionsverlust-Allele (mlo) des Mlo-Genorts tragen, sind resistent gegenüber allen bekannten Isolaten des weit verbreiteten Pilzes ”Echter Mehltau”. Das einzige bisher aus einem natürlichen Habitat isolierte mlo-Resistenzallel, mlo-11, wurde ursprünglich aus äthioischen Landrassen gewonnen und dient heutezutage zur Regulierung der Resistenz gegen Mehltau in der Mehrheit der angebauten europäischen Frühgerste-Elitevarietäten. Somit kann man nach natürlichen Allelen suchen, welche die gewünschte Reduktion, Unterdrückung, Deletierung oder Verringerung in der Funktion eines Nukleinsäuremoleküls herbeiführen, und kann derartige Allele durch Kreuzung und markerunterstützte Selektion oder verwandte Verfahren in landwirtschaftlich bedeutsame Nutzpflanzenvarietäten einführen.
Ferner weiß der Fachmann auf dem Gebiet, dass sich die Codon-Verwendung zwischen Organismen unterscheiden kann. Deshalb wird er die Codon-Verwendung im Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung an die Verwendung des Organismus anpassen, in welchem das Polynukleotid oder Polypeptid exprimiert wird, sodass die Expression des Nukleinsäuremoleküls oder des codierten Proteins mit größerer Wahrscheinlichkeit reduziert wird.
Folglich betrifft die Erfindung Nukleinsäuremolekül-Homologe von einem Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die oben erwähnte Aktivität in einer Pflanze oder Teilen davon aufweist, nachdem es reduziert, verringert, unterdrückt oder deletiert wurde, welche Änderungen in dessen Aminosäureresten enthalten, die essentiell für dessen Aktivität sind, und somit dessen Aktivität reduzieren, verringern, unterdrücken oder deletieren.
Derartige Polypeptide unterscheiden sich hinsichtlich der Aminosäuresequenz dennoch von einer Sequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, und vermitteln eine Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder eine Erhöhung der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze. Das Nukleinsäuremolekül kann eine Nukleotidsequenz umfassen, welche ein Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 50% Identität zu einer Aminosäuresequenz, wie aufgeführt in Anmeldung Nr. 1, Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, umfasst und zur Teilnahme an der Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder der Erhöhung der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, nach Verringern seiner Expression oder seiner biologischen Funktion, in der Lage ist.
Vorzugsweise ist das von dem Nukleinsäuremolekül codierte Protein zu wenigstens etwa 60%, 70% oder 80% identisch zu der Sequenz in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder zu einer Sequenz, umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, weiter bevorzugt wenigstens etwa 85% identisch zu einer der Sequenzen in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder zu einer Sequenz, umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, noch weiter bevorzugt wenigstens etwa 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% homolog zu der Sequenz in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder zu einer Sequenz, umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, und am stärksten bevorzugt wenigstens etwa 96%, 97%, 98% oder 99% identisch zu der Sequenz in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder zu einer Sequenz, die eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv umfasst, wie sie in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt sind.
Um die prozentuale Homologie (= Identität) von zwei Aminosäuresequenzen (zum Beispiel aus Spalte 7 von Tabelle II) oder von zwei Nukleinsäuremolekülen (zum Beispiel aus Spalte 5 von Tabelle I) zu ermitteln, werden die Sequenzen, für einen optimalen Vergleich, untereinander aufgeschrieben. Es können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder eines Nukleinsäuremoleküls eingefügt werden, um ein optimales Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure zu schaffen. Der Aminosäurerest oder das Nukleotid an der entsprechenden Aminosäureposition oder Nukleotidposition wird dann zwischen beiden Polymeren verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz von demselben Aminosäurerest oder demselben Nukleotid wie in der entsprechenden Position der anderen Sequenz besetzt ist, sind die Moleküle an dieser Position identisch. Aminosäure- oder Nukleotid-”Identität”, wie im vorliegenden Kontext verwendet, entspricht Aminosäure- oder Nukleinsäure-”Homologie”. Im Allgemeinen ist die prozentuale Homologie zwischen den zwei Sequenzen eine Funktion der Anzahl identischer Positionen, welche die Sequenzen gemeinsam haben (d. h. % Homologie = Anzahl identischer Positionen/Gesamtanzahl an Positionen × 100). Die Begriffe ”Homologie” und ”Identität” sind daher für diese Beschreibung als Synonyme zu betrachten.
Für die Bestimmung der prozentualen Homologie (= Identität) von zwei oder mehr Aminosäure- oder zwei oder mehr Nukleotid-Sequenzen sind mehrere Computer-Softwareprogramme entwickelt worden. Die Homologie von zwei oder mehreren Se quenzen kann beispielsweise mit der Software Fasta berechnet werden, welche gegenwärtig in der Version Fasta 3 angewandt worden ist (Pearson W. R., und Lipman, D. J., PNAS 85, 2444 (1988); Pearson, W. R., Methods in Enzymology 183, 63 (1990)). Ein anderes nützliches Programm für die Berechnung von Homologien verschiedener Sequenzen ist das standardmäßige Blast-Programm, welches in der Biomax-Pedant-Software (Biomax, München, Bundesrepublik Deutschland) enthalten ist. Dieses führt unglücklicherweise manchmal zu suboptimalen Ergebnissen, da Blast nicht immer vollständige Sequenzen der Datenbanksequenz (Subject) und der Suchsequenz (Query) beinhaltet. Da dieses Programm nichtsdestoweniger sehr effizient ist, kann es für den Vergleich einer erheblichen Anzahl von Sequenzen verwendet werden. Die folgenden Einstellungen werden typischerweise für einen derartigen Vergleich von Sequenzen verwendet: -p Programmname [String]; -d Datenbank [String]; Vorgabe = nr; -i Query-Datei [File In]; Vorgabe = stdin; -e Erwartungswert (E) [Real]; Vorgabe = 10,0; -m Alignment-Ansichtoptionen: 0 = paarweise; 1 = Query-anchored Identitäten-Anzeige; 2 = Query-anchored ohne Identitäten; 3 = flach Query-anchored, Identitäten-Anzeige; 4 = flach Query-anchored, ohne Identitäten; 5 = query-anchored ohne Identitäten und glatte Enden; 6 = flach query-anchored, ohne Identitäten und glatte Enden; 7 = XML-Blast-Ausgabe; 8 = tabellenartig; 9 tabellenartig mit Kommentarzeilen [Integer]; Vorgabe = 0; -o BLAST Bericht-Ausgabedatei [File Out] Optional; Vorgabe = stdout; -F Filter Query-Sequenz (DUST mit blastn, SEG mit sonstigen) [String]; Vorgabe = JA; -G Lückenöffnungs-Kosten (null bedingt Vorgabe-Verhalten) [Integer]; Vorgabe = 0; -E Lückenerweiterungs-Kosten (null bedingt Vorgabe-Verhalten) [Integer]; Vorgabe = 0; -X X Abschaltwert für lückenhaltiges Alignment (in bits) (null bedingt Vorgabe-Verhalten); blastn 30, megablast 20, tblastx 0, alle übrigen 15 [Integer]; Vorgabe = 0; -l Zeige GI's in Deflines [JA/NEIN]; Vorgabe = NEIN; -q Strafwert für Nukleotid-Fehlpaarung (nur für blastn) [Integer]; Vorgabe = –3; -r Belohnungswert für eine Nukleotid-Übereinstimmung (nur für blastn) [Integer]; Vorgabe = 1; -v Anzahl Datenbanksequenzen, die einzeilige Beschreibungen für (V) zeigen sollen [Integer]; Vorgabe = 500; -b Anzahl Datenbanksequenzen, die Alignments für (B) zeigen sollen [Integer]; Vorgabe = 250; -f Schwelle für Treffererweiterung, Vorgabe falls null; blastp 11, blastn 0, blastx 12, tblastn 13; tblastx 13, megablast 0 [Integer]; Vorgabe = 0; -g Ausführen von lückenhaltigem Alignment (nicht verfügbar bei tblastx) [JA/NEIN]; Vorgabe = JA; -Q zu verwendender Query-Genetischer Code [Integer]; Vorgabe = 1; -D DB Genetischer Code (nur für tblast[nx]) [Integer]; Vorgabe = 1; -a Zahl zu nutzender Prozessoren [Integer]; Vorgabe = 1; -O SeqAlign file [File Out] Optional; -J Query-Defline glaubhaft [JA/NEIN]; Vorgabe = NEIN; -M Matrix [String]; Vorgabe = BLOSUM62; -W Wortgröße, Vorgabe falls null (blastn 11, megablast 28, alle übrigen 3) [Integer]; Vorgabe = 0; -z Effektive Länge der Datenbank (verwende null für die reale Größe) [Real]; Vorgabe = 0; -K Anzahl zu behaltender bester Treffern aus einer Region (standardmäßig abgeschaltet, falls verwendet wird ein Wert von 100 empfohlen) [Integer]; Vorgabe = 0; -P 0 für mehrere Treffer, 1 für einzelnen Treffer [Integer]; Vorgabe 0; -Y Effektive Länge des Abfrageraums (benutze null für die reale Größe) [Real]; Vorgabe = 0; -S Query-Stränge die gegen Datenbank abzufragen sind (für blast[nx], und tblastx); 3 für beide, 1 für oberen, 2 für unteren [Integer]; Vorgabe = 3; -T HTML-Ausgabe erstellen [JA/NEIN]; Vorgabe = NEIN; -I Datenbanksuche auf Liste von GI's begrenzen [String] Optional; -U Verwende Kleinbuchstaben-Filterung von FASTA-Sequenz [JA/NEIN] Optional; Vorgabe = NEIN; -y X Abschaltwert für lückenfreie Erweiterungen in bits (0,0 bedingt Standardverhalten); blastn 20, megablast 10, alle übrigen 7 [Real]; Vorgabe = 0,0; -Z X Abschaltwert für lückenhaltiges End-Alignment in bits (0,0 bedingt Standardverhalten); blastn/megablast 50, tblastx 0, alle übrigen 25 [Integer]; Vorgabe = 0; -R PSI-TBLASTN Checkpoint-Datei [File In] Optional; -n MegaBlast Suche [JA/NEIN]; Vorgabe = NEIN; -L Lage auf Query-Sequenz [String] Optional; -A Mehrere Treffer Fenstergöße, Vorgabe falls null (blastn/megablast 0, alle übrigen 40 [Integer]; Vorgabe = 0; -w Rasterschub-Strafwert (OOF-Algorithmus für blastx) [Integer]; Vorgabe = 0; -t Länge des größten Introns, zugelassen in tblastn zum Verknüpfen von HSPs (0 schaltet das Verknüpfen aus) [Integer]; Vorgabe = 0.
Ergebnisse von hoher Qualität werden durch Verwenden des Algorithmus von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman erreicht. Deshalb werden Programme, die auf den genannten Algorithmen basieren, bevorzugt. Vorteilhafterweise können die Vergleiche von Sequenzen mit dem Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351 (1987), Higgins et al., CABIOS 5, 151 (1989)) oder vorzugsweise mit den Programmen ”Gap” und ”Needle”, welche beide auf den Algorithmen von Needleman und Wunsch basieren (J. Mol. Biol. 48; 443 (1970)), sowie ”Best-Fit”, welches auf dem Algorithmus von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482 (1981)) basiert, durchgeführt werden. ”Gap” und ”Best-Fit” sind Teil des GCG-Software-Pakets (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul et al., (Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)), ”Needle” ist ein Teil der ”The European Molecular Biology Open Software Suite” (EMBOSS) (Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)). Deshalb werden die Berechnungen zur Bestimmung der Prozentsätze der Sequenzhomologie vorzugsweise mit den Programmen ”Gap” oder ”Needle” über den gesamten Bereich der Sequenzen hinweg durchgeführt. Die folgenden Standardeinstellungen für den Vergleich von Nukleinsäuresequenzen wurden für ”Needle” verwendet: Matrix: EDNAFULL, Lücken-Strafwert: 10,0, Erweiterungs-Strafwert: 0,5. Die folgenden Standardeinstellungen für den Vergleich von Nukleinsäuresequenzen wurden für ”Gap” verwendet: Lücken-Gewichtung: 50, Längen-Gewichtung: 3, durchschnittliche Übereinstimmung: 10,000, durchschnittliche Fehlpaarung: 0,000.
Es versteht sich zum Beispiel, dass eine Sequenz, welche eine 80%ige Homologie zur Sequenz SEQ-ID NR.: 27 auf dem Nukleinsäureniveau aufweist, eine Sequenz bedeutet, welche beim Vergleich zur Sequenz SEQ-ID NR.: 27 durch das oben genannte Programm ”Needle” mit dem oben genannten Parameter-Satz eine Homologie von 80% aufweist.
Es versteht sich, dass Homologie zwischen zwei Polypeptiden die Identität der Aminosäuresequenz über, in jedem Fall, die gesamte Sequenzlänge bedeutet, welche durch Vergleichen mit Hilfe des oben genannten Programms ”Needle” unter Verwendung der Matrix: EBLOSUM62, Lücken_Strafwert: 8,0, Erweiterungs_Strafwert: 2,0, berechnet wird.
Zum Beispiel versteht es sich, dass eine Sequenz, welche eine 80%ige Homologie mit der Sequenz SEQ-ID NR.: 28 auf der Protein-Ebene aufweist, eine Sequenz bedeutet, welche bei einem Vergleich zur Sequenz SEQ-ID NR.: 28 durch das oben genannte Programm ”Needle” mit dem oben aufgeführten Parameter-Satz eine 80%ige Identität aufweist.
Funktionelle Äquivalente, die von einem der Polypeptide, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, gemäß der Erfindung, durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitet werden, weisen mindestens 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65% oder 70%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 85% oder 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, noch weiter bevorzugt mindestens 95%, 97%, 98% oder 99% Homologie mit einem der Polypeptide, wie gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder mit einem der Polypeptide, umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, gemäß der Erfindung, auf und zeichnen sich durch im wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie das Polypeptid, wie es in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist, vorzugsweise der Polypeptide von A. thaliana, aus.
Funktionelle Äquivalente, welche aus der Nukleinsäuresequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, gemäß der Erfindung, durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitet sind, besitzen mindestens 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65% oder 70%, bevorzugt mindestens 80%, speziell bevorzugt mindestens 85% oder 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, besonders speziell bevorzugt mindestens 95%, 97%, 98% oder 99% Homologie mit einer der Nukleinsäuren, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, gemäß der Erfindung, und codieren Polypeptide, welche im wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie das Polypeptid aufweisen, wie es in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist.
”Im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften” eines funktionellen Äquivalentes versteht sich vor allem in der Bedeutung, dass das funktionelle Äquivalent die oben erwähnte Aktivität aufweist, wobei z. B. eine Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder eine Erhöhung der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze während der Verringerung der Menge an Protein, der Aktivität oder der Funktion des funktionellen Äquivalentes in einem Organismus, z. B. einer Pflanze oder in einem Pflanzengewebe, Pflanzenzellen oder einem Teil derselben, herbeigeführt wird.
Ein Nukleinsäuremolekül, das ein Homolog zu einer hierin gezeigten Proteinsequenz codiert, kann durch Einbringen von einer oder mehreren Nukleotid-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen in eine Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend das Nukleinsäuremolekül wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, so erzeugt werden, dass eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen in das codierte Protein eingeführt werden. Mutationen können in die Sequenzen von z. B. den Sequenzen, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, durch Standardtechniken, wie ortsgerichteter Mutagenese und PCR-vermittelter Mutagenese eingeführt werden.
Vorzugsweise werden nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren vorausgesagten nicht-essentiellen oder bevorzugt essentiellen Aminosäureresten vorgenommen, [und] wodurch die Aktivität des jeweiligen Proteins reduziert, verringert oder deletiert wird. Eine ”konservative Aminosäuresubstitution” ist eine solche, bei welcher der Aminosäurerest mit einem Aminosäurerest ersetzt wird, der eine ähnliche Seitenkette enthält. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind im Fachgebiet definiert worden. Diese Familien beinhalten Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Hystidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht-polaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methioninmethionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin).
Somit wird ein vorhergesagter essentieller Aminosäurerest in einem im Verfahren verwendeten Polypeptid oder im Polypeptid der Erfindung vorzugsweise mit einem anderen Aminosäurerest aus einer anderen Familie ersetzt. Alternativ können, in einer anderen Ausführungsform, Mutationen statistisch entlang der Gesamtheit oder eines Teils einer codierenden Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls, codierend ein im Verfahren der Erfindung verwendetes Polypeptid, oder eines Polynukleotids der Erfindung, beispielsweise durch Sättigungsmutagenese statistisch eingeführt werden, und die resultierenden Mutanten können hinsichtlich der hierin beschriebenen Aktivität durchrastert bzw. gescreent werden, um Mutanten zu identifizieren, welche die Aktivität verloren haben oder eine verringerte Aktivität aufweisen und einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermitteln.
Im Anschluss an die Mutagenese von einender Sequenzen von Spalte 5 oder 7 von Tabelle I kann das codierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann zum Beispiel unter Anwendung der hierin beschriebenen Assays ermittelt werden.
Im Wesentlichen homologe Polynukleotide des Nukleinsäuremoleküls, das hierin für das Verfahren gemäß der Erfindung gezeigt und in Spalte von 5 von Tabelle I aufgeführt ist, wurden durch eine BlastP-Datenbanksuche mit den entsprechenden Polypeptidsequenzen gefunden. Die SEQ-ID NR. der gefundenen homologen Sequenzen eines in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführten Nukleinsäuremoleküls sind in der Spalte 7 von Tabelle I in jeweils derselben Zeile gezeigt. Die SEQ-ID NR. der gefundenen homologen Sequenzen eines in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführten Proteinmoleküls sind in der Spalte 7 von Tabelle II in jeweils derselben Zeile aufgeführt.
Die Proteinsequenz(en) eines in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführten Nukleinsäuremoleküls wurden verwendet, um Proteindatenbanken mit Hilfe des Werkzeuges BlastP zu durchsuchen. Homologe Proteinsequenzen wurden manuell gemäß ihrer Ähnlichkeit mit der Such-Proteinsequenz ausgewählt. Die Nukleotidsequenz, welche der gewählten Proteinsequenz entspricht, ist in den meisten Fällen im Kopfzeilen- bzw. Kennsatz-Abschnitt des Proteindatenbank-Eintrages angegeben und wurde verwendet, sofern vorhanden. Wenn der Proteindatenbank-Eintrag keinen direkten Querverweis auf den entsprechenden Nukleotiddatenbank-Eintrag bereitstellte, wurde das Sequenz-Suchprogramm TBlastN verwendet, um Nukleotiddatenbank-Einträge aus demselben Organismus zu identifizieren, welche exakt dasselbe Protein (100% Identität) codieren. Der Erwartungswert wurde in TBlastN auf 0,001 eingestellt, und es wurde die Blosum62-Matrix verwendet; alle anderen Parameter wurden in ihren Standardeinstellungen verwendet.
Ferner wurden die Proteinmuster, die für die in Spalte 5 und 7, Tabelle II, aufgeführten Proteinsequenzen definiert sind, angewandt, um Proteindatenbanken zu durchsuchen. Proteinsequenzen, welche alle Proteinmuster, aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, aufzeigen, wurden mit der Proteinsequenz, die in Spalte 5 und 7, Tabelle II, in der jeweils selben Zeile aufgeführt ist, aligniert und als homologe Proteine ausgewählt, wenn eine signifikante Ähnlichkeit beobachtet wurde.
Homologe der verwendeten Nukleinsäuresequenzen, aufweisend oder abgeleitet aus einer Sequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder der Nukleinsäuresequenzen, abgeleitet aus den Sequenzen, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder aus der Sequenz, umfassend die Konsensussequenzen oder die Polypeptidmotive wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, umfassen außerdem allelische Varianten mit wenigstens ungefähr 30%, 35%, 40% oder 45% Homologie, vorzugsweise wenigstens ungefähr 50%, 60% oder 70%, weiter bevorzugt wenigstens ungefähr 90%, 91%, 92%, 93%, 94% oder 95%, und noch weiter bevorzugt wenigstens ungefähr 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr, Homologie zu einer der gezeigten Nukleotidsequenzen oder der oben erwähnten abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen oder deren Homologen, Derivaten oder Analogen oder Teilen von diesen.
Allelische Varianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, welche durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden von den Sequenzen, welche gezeigt oder im Verfahren der Erfindung verwendet werden, vorzugsweise wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder aus den abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen erhalten werden können.
In einer Ausführungsform wird allerdings die Enzymaktivität oder die Aktivität der resultierenden synthetisierten Proteine in vorteilhafter Weise verloren oder verringert, z. B. durch Mutation der Sequenz, wie hierin beschrieben, oder durch Anwenden eines Verfahrens zum Reduzieren oder Inhibieren oder Verlieren der biologischen Aktivität, wie hierin beschrieben.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine Sequenz, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder ihre komplementäre Sequenz. Es kann bevorzugt sein, dass ein Homolog eines Nukleinsäuremoleküls, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, so wenig andere Nukleotide wie möglich, verglichen zu der Sequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder ihrer komplementären Sequenz, umfasst. In einer Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50 oder 40 weitere oder andere Nukleotide. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 30, 20 oder 10 weitere oder andere Nukleotide. In einer Ausführungsform ist das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül identisch zu den Sequenzen, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder ihrer komplementären Sequenz.
Ebenfalls bevorzugt wird es, dass das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid codiert, das die Sequenz, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst. In einer Ausführungsform codiert das Nukleinsäuremolekül weniger als 150, 130, 100, 80, 60, 50, 40 oder 30 weitere oder andere Aminosäuren. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das codierte Polypeptid weniger als 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 oder 5 weitere oder andere Aminosäuren. In einer im erfindungsgemäßen Verfahren angewandten Ausführungsform ist das codierte Polypeptid identisch zu den Sequenzen, wie sie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II aufgeführt sind.
In einer Ausführungsform umfasst das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, umfassend eine Sequenz, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, weniger als 100 weitere oder andere Nukleotide, die zu der in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, gezeigten Sequenz unterschiedlich sind. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 30 weitere oder andere Nukleotide, die zu der Sequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, unterschiedlich sind. In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül identisch zu einer codierenden Sequenz von den Sequenzen, wie sie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt sind.
Homologe von Sequenzen, aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder von den abgeleiteten Sequenzen von den Sequenzen, wie sie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt sind, oder von Sequenzen, umfassend die Konsensussequenzen oder die Polypeptidmotive wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, sollen auch trunkierte Sequenzen, cDNA, einzelsträngige DNA oder RNA der codierenden und nicht-codierenden DNA-Sequenz bedeuten. Es versteht sich, dass Homologe der Sequenzen, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder der abgeleiteten Sequenzen von den Sequenzen, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder von Sequenzen, welche die Konsensussequenzen oder die Polypeptidmotive wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, umfassen, ebenfalls Derivate bedeuten, welche nicht-codierende Regionen, wie beispielsweise UTRs, Terminatoren, Enhancer oder Promotorvarianten umfassen.
Die regulatorischen Sequenzen stromaufwärts oder stromabwärts der angegebenen Nukleotidsequenzen können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert sein, wobei diese allerdings bevorzugt die Funktionalität oder Aktivität entweder der Promotoren, des offenen Leserahmens (= ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie etwa Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche weit entfernt vom ORF liegen, stören. Es ist außerdem möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz oder ihrer Regulierung verringert wird, oder dass sie vollständig durch weniger aktive Promotoren ersetzt werden, und dadurch die Aktivität der exprimierten Nukleinsäuresequenz reduziert oder deletiert wird, wobei sogar Promotoren aus heterologen Organismen verwendet werden können. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind hierin nachstehend erwähnt. Das Modifizieren der regulatorischen Sequenzen könnte speziell in denjenigen Fällen vorteilhaft sein, in denen eine vollständige Eliminierung der Expression der Nukleinsäure der Erfindung negative Nebeneffekte, wie etwa ein reduziertes Wachstum oder reduzierten Ertrag, hat. Der Fachmann ist in der Lage, die regulatorischen Sequenzen der Nukleinsäure der Erfindung auf eine solche Weise zu modifizieren, dass die Reduktion ausreichend ist, um den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze zu erzielen, ohne dass unerwünschte Nebeneffekte eintreten. In diesem Zusammenhang könnte es ferner vorteilhaft sein, die regulatorischen Sequenzen auf eine solche Weise zu modifizieren, dass die Reduktion der Expression in einer räumlichen oder zeitlichen Weise stattfindet. Zum Beispiel könnte es nützlich sein, die Nukleinsäuren oder das Polypeptid der Erfindung nur im reifen Zustand der Pflanze zu inhibieren, herunterzuregulieren oder zu unterdrücken, um den gewünschten erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, zu erzielen, ohne das Wachstum oder die Reifung des Organismus zu stören. Es gibt weitere Verfahren zum Modulieren der Promotoren der Gene der Erfindung, z. B. durch Modifizieren der Aktivität von trans-wirkenden Faktoren, d. h. natürlichen oder künstlichen Transkriptionsfaktoren, welche an den Promotor binden und seine Aktivität beeinflussen können. Darüber hinaus ist es möglich, Promotoren von Interesse durch Modifizieren von vorgeschalteten Signalleitungskomponenten, wie Rezeptoren oder Kinasen, welche an der Regulierung des Promotors von Interesse beteiligt sind, zu beeinflussen.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die folgenden Schritte:

(a) Auswählen eines Organismus oder eines Teiles davon, welcher das Polypeptid oder Nukleinsäuremolekül exprimiert, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, z. B. ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1, oder ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1;
(b) Mutagenisieren des gewählten Organismus oder des Teiles davon;
(c) Vergleichen der Aktivität oder der Expressionshöhe des Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls im mutagenisierten Organismus oder dem Teil davon mit der Aktivität oder der Expression des Polypeptids in den gewählten Organismen oder dem Teil davon;
(d) Selektieren der mutagenisierten Organismen oder der Teile davon, welche eine verringerte Aktivität oder Expressionshöhe des Polypeptids, verglichen mit dem ausgewählten Organismus (a) oder dem Teil davon, umfassen;
(e) gegebenenfalls Heranziehen und Kultivieren der Organismen oder der Teile davon; und
(f) Testen, ob der Organismus oder der Teil davon einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, wie etwa einem nicht-mutagenisierten Quell- oder Ursprungsstamm, aufweist.

In vorteilhafter Weise wurden die ausgewählten Organismen gemäß der Erfindung mutagenisiert. Gemäß der Erfindung ist Mutagenese eine beliebige Änderung der genetischen Information im Genom eines Organismus, d. h. jedwede strukturelle oder zusammensetzungsmäßige Änderung in der Nukleinsäure, vorzugsweise DNA, eines Organismus, welche nicht durch normale Segregations- oder genetische Rekombinations-Prozesse verursacht wird. Derartige Mutationen können spontan auftreten oder können durch Mutagene, wie nachstehend beschrieben, induziert werden. Eine derartige Änderung kann entweder statistisch oder selektiv induziert werden. In beiden Fällen wird die genetische Information des Organismus modifiziert. Im Allgemeinen führt dies zu der Situation, dass die Aktivität des Genproduktes der relevanten Gene innerhalb der Zellen oder innerhalb des Organismus reduziert oder unterdrückt ist.
Im Falle der spezifischen oder sogenannten ortsgerichteten Mutagenese wird ein bestimmtes Gen mutiert, und dadurch wird seine Aktivität und/oder die Aktivität des codierten Genproduktes unterdrückt, reduziert, verringert oder deletiert. Im Falle einer statistischen Mutagenese werden ein oder mehrere Gene zufällig mutiert, und ihre Aktivitäten und/oder die Aktivitäten ihrer Genprodukte werden unterdrückt, reduziert, verringert oder deletiert, vorzugsweise verringert oder deletiert. Nichtsdestoweniger kann durch verschiedene, dem Fachmann auf dem Gebiet bekannte, Verfahren nach Mutationen im Gen von Interesse selektiert werden.
Für den Zweck einer Mutagenese einer großen Population von Organismen kann eine derartige Population mit einer DNA-Population oder einer DNA-Bank oder -Konstrukten oder -Elementen transformiert werden, welche für die Inhibition möglichst vieler Gene eines Organismus, vorzugsweise aller Gene, nützlich sind. Mit diesem Verfahren ist es möglich, fast alle Gene eines Organismus durch die Integration eines, vorteilhafterweise identifizierten, DNA-Fragmentes statistisch zu mutagenisieren. Danach kann der Fachmann das Knockout-Ereignis leicht identifizieren. Für die Mutagenese von Pflanzen wird EMS-, T-DNA- und/oder Transposon-Mutagenese bevorzugt.
Im Fall einer statistischen Mutagenese wird eine immense Anzahl an Organismen mit einem mutagenen Agens behandelt. Die Menge des Agens und die Intensität der Behandlung wird in einer solchen Weise ausgewählt, dass statistisch fast jedes Gen mutiert wird. Das Verfahren für die statistische Mutagenese sowie das betreffende Agens sind dem Fachmann gut bekannt. Derartige Verfahren werden beispielsweise offenbart von van Harten, A. M. ("Mutation breeding: theory and practical applications", Cambridge University Press, Cambridge, Großbritannien (1998)), Friedberg, E., Walker, G., Siede, W. ("DNA Repair and Mutagenesis", Blackwell Publishing (1995)), oder Sankaranarayanan, K., Gentile, J. M., Ferguson, L. R. ("Protocols in Mutagenesis", Elsevier Health Sciences (2000)). Der Fachmann weiß, dass die spontane Mutationsrate in den Zellen eines Organismus sehr niedrig ist, und dass eine große Anzahl an chemischen, physikalischen oder biologischen Mitteln für die Mutagenese von Organismen verfügbar ist. Diese Mittel werden als Mutagene oder mutagene Agenzien bezeichnet. Wie oben erwähnt, sind drei unterschiedliche Arten von Mutagenen, nämlich chemische, physikalische oder biologische Agenzien, verfügbar.
Es gibt unterschiedliche Klassen von chemischen Mutagenen, welche nach ihrer Wirkungsart eingeteilt werden können. Zum Beispiel gibt es Basenanaloge, wie etwa 5-Bromouracil, 2-Aminopurin. Andere chemische Mutagene wechselwirken mit der DNA, wie etwa Schwefelsäure, salpetrige Säure, Hydroxylamin; oder andere Alkylierungsmittel, wie etwa monofunktionelle Mittel wie Ethylmethansulfonat (= EMS), Dimethylsulfat, Methylmethansulfonat, Bifunktionelle, wie Dichlorethylsulfid, Mitomycin, Nitrosoguanidindialkylnitrosamin, N-Nitrosoguanidin-Derivate, N-Alkyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin, und interkalierende Farbstoffe, wie Acridin und Ethidiumbromid.
Physikalische Mutagene sind beispielsweise ionisierende Bestrahlung (Röntgenstrahlen), UV-Bestrahlung. Verschiedene Formen von Bestrahlung sind verfügbar, und sie sind starke Mutagene. Zwei Hauptklassen der Bestrahlung können unterschieden werden: a) nicht-ionisierende Bestrahlung, wie etwa UV-Licht, oder ionisierende Bestrahlung, wie etwa Röntgenstrahlen. Biologische Mutagene sind beispielsweise transponierbare Elemente, zum Beispiel IS-Elemente, wie etwa IS100, Transposons, wie Tn5, Tn10, Tn903, Tn916 oder Tn1000, oder Phagen, wie Mu^amplac, P1, T5, λplac, etc. Verfahren zum Einbringen dieser Phagen-DNA in den geeigneten Mikroorganismus sind dem Fachmann allgemein bekannt (siehe Microbiology, Dritte Auflage, Hrsg.: Davis, B. D., Dulbecco, R., Eisen, H. N., und Ginsberg, H. S., Harper International Edition, 1980). Die übliche Vorgehensweise einer Transposonmutagenese ist die Insertion eines transponierbaren Elementes innerhalb eines Gens oder in der Nähe davon, zum Beispiel in der Promotor- oder Terminatorregion, was somit zu einem Verlust der Genfunktion führt. Verfahrensweisen zum Lokalisieren des Transposons innerhalb des Genoms- der Organismen sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt. Für Transposonmutagenese in Pflanzen sind dem Fachmann die Mais-Transposonsysteme Activator-Dissociation (Ac/Ds) und Enhancer-Supressor-Mutator (En/Spm) bekannt, aber andere Transposonsysteme könnten ähnlich nützlich sein. Die Transposons können durch verschiedene verfügbare Standardtechniken für Pflanzentransformationen in die Pflanzengenome eingebracht werden. Ein anderer Typ von biologischer Mutagenese in Pflanzen beinhaltet die T-DNA-Mutagenese, d. h. die statistische Integration von T-DNA-Sequenzen in das Pflanzengenom (Feldmann K. A., Plant J. 1, 71 (1991)). Das Ereignis, in welchem das Gen von Interesse mutiert wird, kann später durch PCR- oder sonstige Hochdurchsatz-Technologien gesucht werden (Krysan et al., Plant Cell 11, 2283 (1999)).
Biologische Verfahren sind von Spee et al. beschrieben (Nucleic Acids Research, 21 (3), 777 (1993)). Spee et al. lehren ein PCR-Verfahren unter Verwendung von dITP für die statistische Mutagenese. Dieses von Spee et al. beschriebene Verfahren wurde von Rellos et al. (Protein Expr. Purif. 5, 270 (1994)) weiter verbessert. Die Anwendung einer In-vitro-Rekombinationstechnik für die molekulare Mutagenese ist von Stemmer beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747 (1994)). Moore et al. (Nature Biotechnology 14, 458 (1996)) beschreiben die Kombination der PCR- und Rekombinations-Verfahren zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität einer Esterase gegenüber einem para-Nitrobenzylester. Ein anderer Weg zur Mutagenese von Enzymen wird von Greener et al. in Methods in Molecular Biology (57, 375 (1996)) beschrieben. Greener et al. verwenden den spezifischen Escherichia-coli-Stamm XL1-Red zum Erzeugen von Escherichia-coli-Mutanten, welche eine erhöhte Antibiotikumresistenz aufweisen.
Vorzugsweise wird für die Mutagenese der Organismen eine chemische oder biochemische Vorgehensweise verwendet. Ein bevorzugtes chemisches Verfahren ist die Mutagenese mit N-Methyl-N-nitro-nitrosoguanidin.
Andere Verfahren sind beispielsweise die Einführung von Mutation mit Hilfe von Viren, wie etwa Bakteriophagen, wie P1, P22, T2, T3, T5, T7, Muamplac, Mu, Mu1, MuX, miniMu, λ, λplac, oder Insertionselementen, wie IS3, IS100, IS900, etc. Wiederum wird das ganze Genom der Bakterien statistisch mutagenisiert. Mutanten können leicht identifiziert werden.
Ein anderes Verfahren zum Disruptieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz und somit zum Reduzieren, Verringern oder Deletieren der Aktivität des codierten Polypeptids, kann durch eine homologe Rekombination mit einer geringfügig abgeänderten Nukleinsäuresequenz der Erfindung, wie hierin als für das Verfahren der Erfindung verwendbar beschrieben, z. B. abgeleitet aus der Sequenz, gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, erreicht werden. Zum Beispiel können die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenzen daher durch eine oder mehrere Punktmutationen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen abgeändert werden. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können eine oder mehrere der regulatorischen Regionen (z. B. ein Promotor, Repressor, UTR, Enhancer oder Inducer) des Gens, welches das Protein der Erfindung codiert, verändert werden (z. B. durch Deletion, Verkürzung, Inversion, Insertion oder Punktmutation), so dass die Expression des entsprechenden Gens moduliert, d. h. reduziert, verringert oder deletiert wird.
Folglich betrifft die Erfindung, in einer Ausführungsform, ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Antisense-, RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmolekül oder Ribozymmolekül der Erfindung oder das Cosuppressions-Nukleinsäuremolekül oder das virale Abbau-Nukleinsäuremolekül der Erfindung, oder codierend einen DNA-, RNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, eine dominant-negative Mutante oder einen Antikörper der Erfindung oder das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül für eine Rekombination, insbesondere das Nukleinsäuremolekül für eine homologe Rekombination, umfassend mindestens ein Fragment von 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 30, 35, 40, 50, 70, 100, 200, 300, 500, 1000, 2000 oder mehr Nukleotiden eines Nukleinsäuremoleküls, ausgewählt aus der Gruppe, die aus folgendem besteht:

(a) ein Nukleinsäuremolekül, welches das Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, codiert; oder eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 7 der Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, beinhaltet;
(b) ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise von Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1;
(c) ein Nukleinsäuremolekül, das als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes aus einer Polypeptidsequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, abgeleitet werden kann;
(d) ein Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, zu der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise von Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1;
(e) ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a), (b) oder (c) codiert wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie aufgeführt in der Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
(f) ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das mit Hilfe monoklonaler oder polyklonaler Antikörper isoliert wird, die gegen ein Polypeptid gerichtet sind, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a), (b), (c), (d) oder (e) codiert wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
(g) ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst;
(h) ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Protein wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;
(i) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das erhalten wird durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle III, Anmeldung Nr. 1, welche an ihrem 5-Strich-Ende nicht mit den Nukleotiden ATA beginnen;
(j) ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, wobei das Polypeptid abgeleitet wird durch Substituieren, Deletieren und/oder Hinzufügen einer oder mehrerer Aminosäuren der Aminosäuresequenz des von den Nukleinsäuremolekülen (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) oder (i) codierten Polypeptids; und
(k) ein Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, enthaltend mindestens 15 nt, bevorzugt 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 500 nt, 750 nt oder 1000 nt eines Nukleinsäuremoleküls, komplementär zu einer in (a) bis (d) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz, erhältlich ist und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie aufgeführt in der Spalte 5 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1;

In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich der Begriff ”das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül”, wie hierin verwendet, auf das Nukleinsäuremolekül, dessen Expression die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität herbeiführt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und/oder SET-Domäne-enthaltendes Protein.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform bezieht sich der Begriff ”das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül”, wie hierin verwendet, auf das Nukleinsäuremolekül, dessen Expression die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion der Aktivität herbeiführt, repräsentiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder repräsentiert von einem Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder IV, Anmeldung Nr. 1.
In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform bezieht sich der Begriff ”das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül” auf das Antisense-, RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmolekül oder Ribozymmolekül der Erfindung oder das Cosuppressions-Nukleinsäuremolekül oder das virale Abbau-Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder codiert einen DNA-, RNA- oder Proteinbindenden Faktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, eine dominant-negative Mutante oder einen Antikörper der Erfindung, oder das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül für eine Rekombination, insbesondere das Nukleinsäuremolekül zur Erzeugung eines homologen Rekombinationsereignisses.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen werden vorteilhafterweise in einem Nukleinsäurekonstrukt, vorzugsweise einer Expressionskassette, eingeführt, was die Reduktion, Unterdrückung, etc. der Nukleinsäuremoleküle in einem Organismus, vorteilhafterweise einer Pflanze oder einem Mikroorganismus, gestattet.
Demgemäß betrifft die Erfindung außerdem ein Nukleinsäurekonstrukt, vorzugsweise ein Expressionskonstrukt, umfassend das im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül oder ein Fragment davon, das funktionstüchtig mit einem oder mehreren regulatorischen Elementen oder Signalen verbunden ist. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ebenfalls Nukleinsäurekonstrukte für die Erzeugung von homologen Rekombinationsereignissen, umfassend das im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül oder Teile davon.
Wie hierin beschrieben, kann das Nukleinsäurekonstrukt auch weitere Gene, welche in die Organismen oder Zellen eingebracht werden sollen, umfassen. Es ist möglich und vorteilhaft, in die Wirtsorganismen regulatorische Gene einzubringen und darin zu exprimieren, wie etwa Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität in die Regulierung von einem oder mehreren Genen eines biosynthetischen Weges eingreifen. Diese Gene können von heterologer oder homologer Herkunft sein. Darüber hinaus können in vorteilhafter Weise weitere Biosynthesegene vorhanden sein, oder diese Gene können sich auf einem oder mehreren weiteren Nukleinsäurekonstrukten befinden.
Wie hierin beschrieben, können Regulatorsequenzen oder Faktoren einen positiven Effekt vorzugsweise auf die Expression der eingebrachten Konstrukte aufweisen, wodurch selbige erhöht wird. So kann eine Verstärkung der Regulatorelemente vorteilhafterweise auf der Ebene der Transkription unter Verwendung starker Transkriptionssignale, wie Promotoren und/oder Enhancern, stattfinden. Darüber hinaus ist jedoch auch eine Steigerung der Translation möglich, beispielsweise durch Erhöhung der RNA-Stabilität. Andererseits werden das hierin beschriebene Nukleinsäuremolekül, das gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, und die Genprodukte reduziert, verringert oder dele tiert, um den Ertrag, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, zu steigern und/oder die Biomasseproduktion zu erhöhen, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze.
Im Prinzip kann das Nukleinsäurekonstrukt die hierin beschriebenen Regulatorsequenzen und weitere Sequenzen umfassen, welche für die Reduktion der Expression von Nukleinsäuremolekülen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden sollen, und andererseits für die Expression zusätzlicher Gene in dem Konstrukt relevant sind.
So können die Nukleinsäurekonstrukt(e) der Erfindung als Expressionskassette verwendet werden und können daher direkt für die Einbringung in die Pflanze verwendet werden, oder aber sie können in einen Vektor eingebracht werden. Folglich ist das Nukleinsäurekonstrukt in einer Ausführungsform eine Expressionskassette, umfassend einen Mikroorganismus-Promotor oder einen Mikroorganismus-Terminator oder beides. In einer anderen Ausführungsform beinhaltet die Expressionskassette einen Pflanzenpromotor oder einen Pflanzenterminator oder beides.
Folglich umfasst das Verfahren gemäß der Erfindung, in einer Ausführungsform, die nachstehenden Schritte:

(a) Einbringung eines Nukleinsäurekonstruktes, umfassend ein im Verfahren der Erfindung zu verwendendes Nukleinsäuremolekül, welches z. B. einen Antisense, eine RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, ein Cosuppressionsmolekül oder Ribozymmolekül der Erfindung oder das Cosuppressions-Nukleinsäuremolekül oder das virale Abbau-Nukleinsäuremolekül der Erfindung codiert oder einen DNA-, RNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, eine dominant-negative Mutante oder einen Antikörper gemäß der Erfindung codiert, oder welches für eine Rekombination, insbesondere eine homologe Rekombination geeignet ist; oder
(b) Einbringung eines Nukleinsäuremoleküls, einschließlich regulatorischer Sequenzen oder Faktoren, dessen Expression die Expression (a) erhöht; in eine(r) Zelle oder einen Organismus oder einen Teil davon, vorzugsweise in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle, und
(c) Unterdrücken, Reduzieren oder Deletieren der Aktivität, die im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, durch das Nukleinsäurekonstrukt oder das Nukleinsäuremolekül, erwähnt unter (a) oder (b), in der Zelle oder dem Organismus oder einem Teil davon, vorzugsweise in einer Pflanze oder Pflanzenzelle.

Nach der Einbringung und Expression des Nukleinsäurekonstruktes wird der transgene Organismus oder die transgene Zelle in vorteilhafter Weise kultiviert und anschließend abgeerntet. Bei dem transgenen Organismus oder der transgenen Zelle kann es sich um einen eukaryotischen Organismus, wie eine Pflanze, eine Pflanzenzelle, ein Pflanzengewebe, vorzugsweise eine Nutzpflanze, oder einen Teil davon, handeln.
Zum Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls zur Reduktion oder Unterdrückung eines Polynukleotids oder Gens, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder ein Homologes davon, oder eines Genproduktes des Polynukleotids, welches z. B. einen Antisense, eine RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, ein Cosuppressionsmolekül oder Ribozymmolekül der Erfindung oder das Cosuppressions-Nukleinsäuremolekül oder das virale Abbau-Nukleinsäuremolekül der Erfindung codiert oder einen DNA-, RNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, eine dominant-negative Mutante oder einen Antikörper der Erfindung codiert oder welches für eine Rekombination, insbesondere eine homologe Rekombination, geeignet ist, oder einer mutagenisierten Nukleinsäuresequenz in ein Nukleinsäurekonstrukt, z. B. als Teil einer Expressionskassette, welche zu einer reduzierten Aktivität und/oder Expression des jeweiligen Gens führt, werden das codogene Gensegment oder die untranslatierten Regionen vorteilhafterweise einer Amplifikations- und Ligationsreaktion in einer dem Fachmann bekannten Weise unterzogen. Es wird bevorzugt einer Verfahrensweise zu folgen, die ähnlich zum Protokoll für die Pfu-DNA-Polymerase oder eine Pfu/Taq-DNA-Polymerasemischung ist. Die Primer werden gemäß der zu amplifizierenden Sequenz ausgewählt. Die spezifische Klonierung von Antisense-, RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionskonstrukten oder Ribozymmolekülen der Erfindung oder der Cosuppressionskonstrukte oder der viralen Abbau-Konstrukte oder von Konstrukten, codierend einen DNA-, RNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, oder Konstrukten für eine dominant-negative Mutante oder einen Antikörper der Erfindung oder von Konstrukten, welche für eine Rekombination, insbesondere eine homologe Rekombination, geeignet sind, ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Geeignete Klonierungsvektoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt (Cloning Vectors (Hrsg.: Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)) und sind veröffentlicht worden, z. B. Earley et al., Plant. J. 45 (4), 616 (2006); Lu et al., Nucleic Acids Res. 32 (21), e171 (2004); Tao und Xhou, Plant J. 38 (5), 850 (2004); Miki und Shimamoto Plant Cell Physiol. 45 (4), 490 (2004); Akashi et al., Methods Mol Biol. 252, 533 (2004); Wesley et al., Plant J. 27 (6,: 581 (2001).
Sie schließen insbesondere Vektoren, welche fähig zur Replikation in leicht handhabbaren Klonierungssystemen sind, wie bakteriellen, Hefe- oder Insektenzellbasierten (z. B. Baculovirus-Expression) Systemen, ein, womit im Speziellen Vektoren gemeint sind, welche eine effiziente Klonierung in E. coli gewährleisten und welche die stabile Transformation von Pflanzen möglich machen. Vektoren, welche erwähnt werden müssen, sind insbesondere verschiedene binäre und cointegrierte Vektorsysteme, welche für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignet sind. Derartige Vektorsysteme sind allgemein da durch gekennzeichnet, dass sie wenigstens die vir-Gene, die für die Agrobacterium-vermittelte Transformation erforderlich sind, sowie die T-DNA-Border-Sequenzen enthalten.
Im Allgemeinen umfassen Vektorsysteme bevorzugt ebenfalls weitere cis-regulatorische Regionen, wie Promotoren und Terminatoren, und/oder Selektionsmarker, durch die geeignet transformierte Organismen identifiziert werden können. Während vir-Gene und T-DNA-Sequenzen im Falle von cointegrierten Vektorsystemen auf demselben Vektor befindlich sind, beruhen binäre Systeme auf mindestens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene aber keine T-DNA trägt, wohingegen ein zweiter T-DNA aber kein vir-Gen trägt. Aufgrund dieser Tatsache sind die zuletzt erwähnten Vektoren verhältnismäßig klein, leicht zu manipulieren und zur Replikation in E. coli und in Agrobacterium befähigt. Diese binären Vektoren schließen Vektoren aus den Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen ein. Diejenigen, welche gemäß der Erfindung bevorzugt verwendet werden, sind Bin19, pBI101, pBinAR, pSun, pGPTV und pCAMBIA. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Anwendung wird von Hellens et al., Trends in Plant Science 5, 446 (2000), gegeben.
Für eine Konstruktherstellung können Vektoren zuerst unter Verwendung von Restriktionsendonuklease(n) linearisiert und dann in geeigneter Weise enzymatisch modifiziert werden. Danach wird der Vektor gereinigt, und ein Aliquot wird im Klonierungsschritt verwendet. Im Klonierungsschritt wird das enzym-gespaltene und notwendigenfalls gereinigte Amplifikat unter Verwendung von Ligase mit gleichartig präparierten Vektorfragmenten zusammenkloniert. Alternativ können Konstrukte durch Rekombination oder Ligations-unabhängige Klonierungsprozeduren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden. Im Allgemeinen kann ein spezifisches Nukleinsäurekonstrukt, oder Vektor- oder Plasmidkonstrukt, ein oder auch mehrere Nukleinsäure-Fragmente bzw. -Segmente aufweisen. Die Nukleinsäurefragmente in diesen Konstrukten sind vorzugsweise mit regulatorischen Sequenzen funktionstüchtig verknüpft. Die regulatorischen Sequenzen schließen insbesondere Pflanzensequenzen, wie die oben beschriebenen Promotoren und Terminatoren, ein. Die Konstrukte können vorteilhafterweise stabil in Mikroorganismen, insbesondere Escherichia coli und/oder Agrobacterium tumefaciens, unter selektiven Bedingungen vermehrt werden und den Transfer von heterologer DNA in Pflanzen oder andere Mikroorganismen ermöglichen. Gemäß einer besonderen Ausführungsform basieren die Konstrukte auf binären Vektoren (Übersichtsartikel für einen binären Vektor: Hellens et al., 2000). In der Regel enthalten sie prokaryotische regulatorische Sequenzen, wie Replikationsursprung und Selektionsmarker, für die Vermehrung in Mikroorganismen, wie Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens. Vektoren können ferner agrobakterielle T-DNA-Sequenzen für den Transfer von DNA in Pflanzengenome, oder andere eukaryotische regulatorische Sequenzen für den Transfer in andere eukaryotische Zellen, z. B. Saccharomyces sp., oder andere prokaryotische regulatorische Sequenzen für den Transfer in andere prokaryotische Zellen, z. B. Corynebacterium sp. oder Bacillus sp., enthalten. Für die Transformation von Pflanzen ist wenigstens die rechte Border-Sequenz, welche ungefähr 25 Basenpaare der gesamten agrobakteriellen T-DNA-Sequenz umfasst, erforderlich. Gewöhnlicherweise enthalten die Pflanzentransformations-Vektorkonstrukte gemäß der Erfindung T-DNA-Sequenzen sowohl aus der rechten als auch aus der linken Border-Region, welche zweckdienliche Erkennungsstellen für ortsspezifisch wirkende Enzyme enthalten, die ihrerseits von einigen der vir-Gene codiert werden. Unterschiedliche Typen von Repressionskonstrukten, z. B. Antisense, Cosuppression, RNAi, miRNA, usw., machen unterschiedliche Klonierungsstrategien notwendig, wie hierin beschrieben.
In vorteilhafter Weise bevorzugt in Übereinstimmung mit der Erfindung sind Pflanzen-Wirtsorganismen. Bevorzugte Pflanzen werden unter den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cactaceae, Caricaceae, Caryophyllaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Elaeagnaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Cucurbitaceae, Cyperaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae, Poaceae, winterhartem Gras, Viehfutterpflanzen, Gemüsepflanzen und Zierpflanzen gewählt.
Besonders bevorzugt sind Pflanzen, ausgewählt aus den Gruppen der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae. Besonders vorteilhaft sind insbesondere Nutzpflanzen. Folglich gehört eine vorteilhafte Pflanze bevorzugt zu der Gruppe der Gattung Erdnuss, Ölsamenraps, Canola, Sonnenblume, Safflower, Olive, Sesam, Haselnuss, Mandel, Avocado, Lorbeer, Kürbis/Gartenkürbis, Leinsamen Soja, Pistazie, Borretsch, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Sorghum und Hirse, Triticale, Reis, Gerste, Maniokstrauch, Kartoffel, Zuckerrübe, Futterrübe, Aubergine und winterharten Grassorten und Viehfutterpflanzen, Ölpalme, Gemüsepflanzen (Kohlarten, Wurzelgemüse, Knollengemüse, Bohnengemüse bzw. Hülsenfrüchte, Fruchtgemüse, Zwiebelgemüse, Blattgemüse und Stängelgemüse), Buchweizen, Jerusalm-Artischocke, Saubohne, Wicken, Linsen, Alfalfa, Buschbohne, Lupine, Klee und Luzerne.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Wirtspflanzen aus der Gruppe gewählt, welche Mais, Soja, Ölsamenraps (einschließlich Canola- und Winter-Ölsamenraps), Baumwolle, Weizen und Reis umfasst.
Weiter bevorzugte Pflanzen sind oben stehend erwähnt.
Um die Aktivität eines Genproduktes gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Einbringung des im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls in eine Pflanze zu reduzieren oder zu unterdrücken, wird zum Beispiel ein isoliertes Antisense-, RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmolekül oder Ribozymmolekül oder ein Cosuppressions-Nukleinsäuremolekül oder ein virales Abbau-Nukleinsäuremolekül oder ein Rekombinations-Nukleinsäuremolekül oder eine mutagenisierte Nukleinsäuresequenz in vorteilhafter Weise zuerst in einen Zwischenwirt, zum Beispiel ein Bakterium oder eine eukaryotische einzellige Zelle übertragen. Die Transformation in E. coli, welche auf eine per se bekannte Weise, zum Beispiel mittels Hitzeschock oder Elektroporation, ausgeführt werden kann, hat sich in diesem Kontext als zweckdienlich erwiesen.
Die Nukleinsäurekonstrukte, welche gegebenenfalls überprüft werden, werden anschließend für die Transformation der Pflanzen verwendet. Zu diesem Zweck kann es zuerst notwendig sein, die Konstrukte aus dem Zwischenwirt zu erhalten. Zum Beispiel können die Konstrukte als Plasmide aus bakteriellen Wirten durch ein Verfahren erhalten werden, das ähnlich zu herkömmlicher Plasmidisolierung ist.
Gen-Silencing in Pflanzen kann in vorteilhafter Weise durch transiente Transformationstechnologien erzielt werden, was bedeutet, dass die Nukleinsäuren vorzugsweise nicht in das Pflanzengenom integriert werden. Geeignete Systeme für transiente Pflanzentransformationen sind zum Beispiel auf Agrobacterium beruhende und auf Pflanzenvirus beruhende Systeme. Einzelheiten über Virus-basierte transiente Systeme und ihre Anwendung für das Gen-Silencing in Pflanzen sind in Lu et al. in Methods 30 (4), 296 (2003), beschrieben. Die Verwendung von Agrobacterium für die transiente Expression von Nukleinsäuren in Pflanzen ist beispielsweise beschrieben worden von Fuentes et al., in Biotechnol. Appl. Biochem. (online: doi:10.1042/BA20030192 (2003, 21. Nov.)).
Eine große Zahl von Verfahren für die Transformation von Pflanzen ist bekannt. Da, gemäß der Erfindung, eine stabile Integration von heterologer DNA in das Genom von Pflanzen vorteilhaft ist, hat sich insbesondere die T-DNA-vermittelte Transformation als zweckdienlich erwiesen. Für diesen Zweck ist es zunächst notwendig, geeignete Vehikel, insbesondere Agrobakterien, mit einem Gensegment oder dem entsprechenden Plasmidkonstrukt zu transformieren, umfassend das Nukleinsäuremolekül, welches transformiert werden soll, z. B. ein Nukleinsäuremolekül, geeignet für das Verfahren der Erfindung, z. B. wie hierin beschrieben, z. B. ein isoliertes Antisense-, RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmolekül oder Ribozymmolekül oder ein Cosuppressions-Nukleinsäuremolekül oder ein virales Abbau-Nukleinsäuremolekül oder ein Rekombinations-Nukleinsäuremolekül oder ein anderes Polynukleotid, das zum Reduzieren oder Unterdrücken der Expression eines Genproduktes befähigt ist, wie gezeigt in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II, oder in der Spalte 5 oder 7, Tabelle I, oder ein Homolog davon.
Dies kann in einer per se bekannten Weise durchgeführt werden. Zum Beispiel kann das Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung, oder das Expressionskonstrukt oder das Plasmidkonstrukt, welches gemäß den oben stehenden detailierten Ausführungen erzeugt worden ist, mittels Elektroporation oder Hitzeschock in kompetente Agrobakterien transformiert werden. Im Prinzip muss man zwischen der Bildung von cointegrierten Vektoren einerseits und der Transformation mit binären Vektoren andererseits unterscheiden. Im Fall der ersten Alternative besitzen die Konstrukte, welche das codogene Gensegment oder das Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung umfassen, keine T-DNA-Sequenzen, sondern die Bildung der cointegrierten Vektoren oder Konstrukte findet in den Agrobakterien durch homologe Rekombination des Konstruktes mit T-DNA statt. Die T-DNA ist in den Agrobakterien in der Form von Ti- oder Ri-Plasmiden vorhanden, in welchen exogene DNA zweckdienlicherweise die Onkogene ersetzt hat. Wenn binäre Vektoren verwendet werden, können sie entweder durch bakterielle Konjugation oder durch direkten Transfer in Agrobakterien überführt werden. Diese Agrobakterien umfassen zweckmäßigerweise bereits den Vektor, der die vir-Gene trägt (derzeit bezeichnet als Helfer-Ti(Ri)-Plasmid).
Darüber hinaus könnte in einigen Fällen die stabile Transformation von Plastiden von Vorteil sein, weil Plastiden in den meisten Nutzpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses über Pollen reduziert oder eliminiert. Das Verfahren der Transformation des Chloroplastengenoms wird allgemein durch ein Verfahren erreicht, welches schematisch in Klaus et al., Nature Biotechnology 22 (2), 225 (2004), dargestellt wurde. Eine plastidäre Transformation könnte besonders vorteilhaft für die Unterdrückung von plastidär-codierten Nukleinsäuren der Erfindung sein.
Kurz dargestellt, werden die zu transformierenden Sequenzen mit einem selektierbaren Markergen zusammen zwischen flankierende Sequenzen kloniert, die homolog zum Chloroplastengenom sind. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Die plastidäre Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und ein Überblick kann entnommen werden aus Bock et al. (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 312 (3), 425 (2001), oder Maliga, P., Trends Biotechnol. 21, 20 (2003). Ein weiterer biotechnologischer Fortschritt ist kürzlich in Form von Marker-freien Plastidentransformanten berichtet worden, welche durch ein transientes cointegriertes Markergen erzeugt werden können, Klaus et al., Nature Biotechnology 22 (2), 225 (2004).
Ein oder mehrere Marker können in zweckdienlicher Weise ebenfalls zusammen mit dem Nukleinsäurekonstrukt oder dem Vektor, und falls Pflanzen oder Pflanzenzellen transformiert werden sollen, zusammen mit der T-DNA verwendet werden, wobei mit deren Hilfe die Isolierung oder Selektion von transformierten Organismen, wie Agrobakterien, oder transformierten Pflanzenzellen möglich ist. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung über eine Reihe von unterschiedlichen Prinzipien, beispielsweise über visuelle Identifizierung mit Hilfe von Fluoreszenz, Lumineszenz oder im Wellenlängenbereich des Lichtes, welches für das menschliche Auge erkennbar ist, durch eine Resistenz gegen Herbizide oder Antibiotika, durch die sogenannten nutritiven Marker bzw. Nährstoffmarker (Auxotrophismus-Marker) oder antinutritiven Marker, durch Enzym-Assays oder durch Phytohormone. Beispiele solcher Marker, welche erwähnt werden können, sind GFP (= Grün-Fluoreszierendes Protein); das Luciferin/Luciferase-System, die β-Galactosidase mit ihren gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal, die Herbizidresistenzen, zum Beispiel gegen Imidazolin, Glyphosat, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff, die Antibiotikaresistenzen beispielsweise gegen Bleomycin, Hygromycin, Streptomycin, Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin, um nur einige wenige zu nennen, nutritive Marker, wie etwa die Verwertung von Mannose oder Xylose, oder antinutritive Marker, wie etwa die Resistenz gegen 2-Desoxyglukose oder D-Aminosäuren (Erikson et al., Nature Biotech 22 (4), 455 (2004)). Bei dieser Liste handelt es sich um eine kleine Anzahl möglicher Marker. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Markern bestens vertraut. Verschiedene Marker werden bevorzugt, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren.
In der Regel ist es erwünscht, dass die Pflanzen-Nukleinsäurekonstrukte an einer oder beiden Seiten des Gensegmentes von T-DNA flankiert werden. Dies ist besonders nützlich, wenn Bakterien der Spezies Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes für die Transformation verwendet werden. Ein Verfahren, welches gemäß der Erfindung bevorzugt ist, ist die Transformation mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens. Allerdings können auch biolistische Verfahren in vorteilhafter Weise zur Einbringung der Sequenzen im Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzt werden und auch die Einbringung mittels PEG ist möglich. Die transformierten Agrobakterien können in einer per se bekannten Weise kultiviert werden, und sind daher für die zweckdienliche Transformation der Pflanzen verfügbar. Die Pflanzen oder Pflanzenteile, welche transformiert werden sollen, werden in der üblichen Weise herangezogen oder bereitgestellt. Die transgenen Agrobakterien lässt man anschließend auf die Pflanzen oder Pflanzenteile einwirken, bis eine ausreichende Transformationsrate erreicht ist. Das Zulassen, dass Agrobakterien auf die Pflanzen oder Pflanzenteile einwirken, kann unterschiedliche Formen einnehmen. Zum Beispiel kann eine Kultur von morphogenen Pflanzenzellen oder -gewebe verwendet werden. Nach dem T-DNA-Transfer werden die Bakterien in der Regel durch Antibiotika eliminiert, und die Regeneration von Pflanzengewebe wird induziert. Dies erfolgt insbesondere unter Verwendung geeigneter Pflanzenhormone, um anfänglich eine Kallusbildung zu induzieren und dann die Schössling- bzw. Sprossentwicklung zu fördern.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird Transformation genannt. Bei der Ausführung derselbigen werden Verfahren, welche für die Trans formation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschrieben wurden, für transiente oder stabile Transformation eingesetzt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es beispielsweise möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzen-Meristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders nützlich erwiesen, einer Suspension von transformierten Agrobakterien zu gestatten, auf die intakte Pflanze oder wenigstens die Blüten-Organanlagen einzuwirken. Die Pflanze wird anschließend wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough and Bent, Plant J. 16, 735 (1998)). Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel selektiven Bedingungen unterzogen, sodass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Beispielsweise können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und, nach einer anfänglichen Wachstumsperiode, einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterzogen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Kultivieren der Samen, notwendigenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels, sodass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Weitere vorteilhafte Transformationsverfahren, insbesondere für Pflanzen, sind dem Fachmann bekannt und sind hierin nachstehend beschrieben.
Weitere vorteilhafte geeignete Verfahren sind Protoplasten-Transformation durch Poly(ethylenglycol)-induzierte DNA-Aufnahme, das ”Biolistik”-Verfahren unter Einsatz der Genkanone – welches als das Teilchenbeschussverfahren bezeichnet wird, Elektroporation, die Inkubation von trockenen Embryonen in DNA-Lösung, Mikroinjektion und durch Agrobakterium vermittelter Gentransfer. Die Verfahren sind zum Beispiel in Jenes B. et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung, S. D. und Wu, R., Academic Press (1993) 128–143, und in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991)), beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden sollen, wird/werden vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)). Durch einen derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen, insbesondere von Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, verwendet werden, beispielsweise durch Baden von zerstampften Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist beispielsweise beschrieben von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. 16, 9877 (1988), oder ist unter anderem aus White, F. F., Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung, S. D., und Wu, R., Academic Press, 1993, S. 15–38, bekannt.
Die oben erwähnten Nukleinsäuremoleküle können in die Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren gemäß der Erfindung in Kombination gemeinsam, mit weiteren Genen kloniert werden, oder aber andere Gene werden durch Transformieren von mehreren Nukleinsäurekonstrukten oder Vektoren (einschließlich Plasmiden) in eine Wirtszelle, vorteilhafterweise in eine Pflanzenzelle, eingebracht.
In einer Ausführungsform können, im erfindungsgemäßen Verfahren, die Nukleinsäuresequenzen, welche im Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, in vorteilhafter Weise funktionsfähig mit einem oder mehreren regulatorischen Signalen verbunden sein, um die Genexpression zu erhöhen, zum Beispiel im Fall von einem Antisense-, RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosupressionsmolekül oder Ribozymmolekül der Erfindung oder dem Cosupressions-Nukleinsäuremolekül oder dem viralen Abbau-Nukleinsäuremolekül der Erfindung, oder einem solchen, das einen DNA-, RNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, eine dominant-negative Mutante oder einen Antikörper der Erfindung codiert.
Diese regulatorischen Sequenzen ermöglichen beabsichtigterweise die spezifische Expression von Nukleinsäuremolekülen, z. B. der Gene oder Genfragmente oder der Genprodukte oder der Nukleinsäure, welche im Verfahren der Erfindung verwendet werden. Abhängig von dem Wirtsorganismus, beispielsweise Pflanze oder Mikroorganismus, kann dies zum Beispiel bedeuten, dass das Gen oder Genfragment oder die Inhibitionskonstrukte nur nach einer Induktion exprimiert und/oder überexprimiert werden/wird, oder dass sie konstitutiv exprimiert und/oder überexprimiert wird/werden. Diese regulatorischen Sequenzen sind zum Beispiel Sequenzen, an welche die Induktoren oder Repressoren binden, und welche so die Expression der Nukleinsäure regulieren.
Darüber hinaus kann das Genkonstrukt in vorteilhafter Weise außerdem eine oder mehrere sogenannte Enhancer-Sequenzen in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Promotor umfassen, und diese ermöglichen eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz. Außerdem ist es möglich, zusätzliche vorteilhafte Sequenzen am 3'-Ende der DNA-Sequenzen zu inserieren, wie zum Beispiel weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren.
Die Nukleinsäuremoleküle, welche Proteine gemäß der Erfindung codieren, und Nukleinsäuremoleküle, welche andere Polypeptide codieren, können in einem oder mehreren Nukleinsäurekonstrukt(en) oder Vektor(en) vorhanden sein. In einer Ausführungsform ist nur eine Kopie von dem Nukleinsäuremolekül zur Verwendung im Verfahren der Erfindung, oder seinen codierenden Genen, im Nukleinsäurekonstrukt oder Vektor vorhanden. Mehrere Vektoren, oder Nukleinsäurekonstrukt oder Vektor können zusammen im Wirtsorganismus exprimiert werden. Das Nukleinsäuremolekül oder das Nukleinsäurekonstrukt oder der Vektor gemäß der Erfindung kann in einen Vektor inseriert werden und in der Zelle in einer freien Form vorhanden sein. Wenn eine stabile Transformation bevorzugt wird, wird ein Vektor verwendet, welcher über mehrere Generationen hinweg stabil dupliziert wird, oder welcher, oder ein Teil dessen, ansonsten in das Genom inseriert wird. Für den Fall von Pflanzen kann eine Integration in das Plastidengenom oder, im Besonderen, in das Zellkerngenom stattgefunden haben. Für die Insertion von mehr als einem Konstrukt in das Wirtsgenom, könnten die zu exprimierenden Konstrukte gemeinsam in einem Vektor, zum Beispiel in den oben beschriebenen Vektoren, welche eine Vielzahl von Konstrukten tragen, vorhanden sein.
In der Regel sind regulatorische Sequenzen für die Expressionsrate von einem Konstrukt(en), beispielsweise eines Inhibitionskonstruktes, wie RNAi, miRNA, Antisense, Cosupressionskonstrukt(en), stromaufwärts (5'), innerhalb und/oder stromabwärts (3') im Verhältnis zur Sequenz des zu regulierenden Nukleinsäuremoleküls lokalisiert. Sie steuern im Besonderen die Transkription und/oder Translation und/oder die Transkriptstabilität. Der Expressionsspiegel ist abhängig von der Anbindung weiterer zellulärer regulatorischer Systeme, wie etwa den Proteinbiosynthese- und Abbausystemen der Zelle.
Regulatorische Sequenzen schließen Transkription und Translation regulierende Sequenzen oder Signale ein, z. B. Sequenzen, welche sich stromaufwärts (5') befinden, die besonders die Regulierung von Transkriptions- oder Translationsinitiation betreffen, wie etwa Promotoren oder Start-Codons, sowie Sequenzen, welche sich stromabwärts (3') befinden, die besonders die Regulierung von Transkriptions- oder Translationstermination und von Transkriptstabilität betreffen, wie etwa Polyadenylierungssignale oder Stop-Codons. Regulatorische Sequenzen können außerdem in transkribierten codierenden Regionen sowie in transkribierten nicht-codierenden Regionen, z. B. in Introns, vorhanden sein, wie zum Beispiel Spleiß-Stellen.
Promotoren für die Regulierung der Expression des Nukleinsäuremoleküls gemäß der Erfindung in einer Zelle, welche verwendet werden können, sind im Prinzip alle diejenigen, welche zur Reduzierung der Transkription der Nukleinsäuremoleküle fähig sind, wenn sie einen endogenen Promotor ersetzen, oder welche die Transkription von inhibitorischen Konstrukten, wie zum Beispiel von einem Antisense, einer RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, einem Cosuppressionsmolekül oder Ribozymmolekül der Erfindung oder dem Cosuppressions-Nukleinsäuremolekül oder dem viralen Abbau-Nukleinsäuremolekül der Erfindung, oder von Konstrukten, codierend einen DNA-, RNA- oder Proteinbindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, eine dominant-negative Mutante oder einen Antikörper der Erfindung, stimulieren können. Geeignete Promotoren, welche in diesen Organismen funktionsfähig sind, sind allgemein bekannt. Sie können die Form von konstitutiven oder induzierbaren Promotoren einnehmen. Geeignete Promotoren können die Entwicklungs- und/oder gewebespezifische Expression in vielzelligen Eukaryoten ermöglichen; daher können Blatt-, Wurzel-, Blüten-, Samen-, Spaltöffnungs-, Knollen- oder Frucht-spezifische Promotoren in vorteilhafter Weise in Pflanzen verwendet werden.
Im Prinzip ist es möglich, natürliche Promotoren zusammen mit ihren regulatorischen Sequenzen, wie etwa denjenigen, die oben erwähnt wurden, für das neue Verfahren zu verwenden. Es ist ebenfalls in vorteilhafter Weise möglich, synthetische Promotoren, entweder zusätzlich oder allein, zu verwenden, insbesondere wenn sie eine samenspezifische Expression vermitteln, wie zum Beispiel in WO 99/16890 beschrieben.
Die Expression der in dem Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle kann allein oder in Kombination mit anderen Genen oder Nukleinsäuren gewünscht sein. Mehrere Nukleinsäuremoleküle, welche die Repression oder Expression von vorteilhaften weiteren Genen vermitteln, können, abhängig von dem zu erreichenden Ziel, durch die gleichzeitige Transformation von mehreren individuellen geeigneten Nukleinsäurekonstrukten, d. h. Expressionskonstrukten, oder vorzugsweise durch Vereinigen mehrerer Expressionskassetten auf einem Konstrukt, eingebracht werden. Es ist außerdem möglich, mehrere Vektoren mit in jedem Fall mehreren Expressionskassetten schrittweise in den Empfängerorganismus hinein zu transformieren.
Wie oben beschrieben, kann die Transkription der Gene, welche zusätzlich zu den eingebrachten Nukleinsäuremolekülen, die exprimiert werden sollen, oder den eingebrachten Genen vorliegen, in vorteilhafter Weise durch geeignete Terminatoren am 3'-Ende der eingebrachten Biosynthesegene (hinter dem Stop-Codon) terminiert werden. Terminatoren, die für diesen Zweck verwendet werden können, sind beispielsweise der OCS1-Terminator, der nos3-Terminator oder der 35S-Terminator. Wie es bei den Promotoren der Fall ist, können unterschiedliche Terminatorsequenzen für jedes Gen verwendet werden. Terminatoren, welche in einem Mikroorganismus nützlich sind, sind beispielsweise der fimA-Terminator, der txn-Terminator oder der trp-Terminator. Derartige Terminatoren können rho-abhängig oder rho-unabhängig sein.
Verschiedene Pflanzenpromotoren, wie zum Beispiel der USP-, der LegB4-, der DC3-Promotor oder der Ubiquitin-Promotor aus Petersilie oder andere hierin erwähnte Promotoren, und verschiedene Terminatoren können in vorteilhafter Weise in dem Nukleinsäurekonstrukt verwendet werden, das für die Reduktion des in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigten Nukleinsäuremoleküls oder seiner hierin erwähnten Homologen nützlich ist. Weitere nützliche Pflanzenpromotoren sind zum Beispiel der Mais-Ubiquitin-Promotor, der Promotor von ScBV (Zuckerrohr-Bacilliformes Virus), die lpt2- oder lpt1-Genpromotoren aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder diejenigen, welche beschrieben sind in der WO 99/16890 (Promotoren aus dem Gerste-Hordein-Gen, dem Glutelin-Gen von Reis, dem Oryzin-Gen von Reis, dem Prolamin-Gen von Reis, dem Gliadin-Gen von Weizen, dem Glutelin-Gen von Weizen, dem Zein-Gen von Mais, dem Glutelin-Gen von Hafer, dem Kasirin-Gen von Sorghum, dem Secalin-Gen von Roggen).
Damit die stabile Integration von im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuremolekülen in Kombination mit weiteren Biosynthesegenen in die transgene Pflanze über mehrere Generationen hinweg gewährleistet wird, kann jede der codierenden Regionen, welche im Verfahren verwendet wird, unter der Steuerung ihres eigenen, vorzugsweise einmalig vorkommenden, Promotors exprimiert werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird in vorteilhafter Weise auf eine solche Weise konstruiert, dass auf einen Promotor eine geeignete Spaltungsstelle für die Insertion der zu exprimierenden Nukleinsäure folgt, vorteilhafterweise in einem Polylinker, woran sich, falls zutreffend, ein Terminator anschließt, der hinter dem Polylinker liegt. Nach Bedarf wird diese Reihenfolge mehrere Male wiederholt, sodass mehrere Gene in einem Konstrukt kombiniert werden und derart in die transgene Pflanze eingebracht werden können, damit sie exprimiert werden. Die Abfolge wird beispielsweise bis zu dreimal wiederholt. Für die Expression werden die Nukleinsäuresequenzen vermittels der geeigneten Spaltungsstelle, zum Beispiel im Polylinker, hinter dem Promotor inseriert. Es ist vorteilhaft, dass jede Nukleinsäuresequenz ihren eigenen Promotor und, falls zutreffend, ihren eigenen Terminator, wie oben erwähnt, besitzt. Allerdings ist es ebenfalls möglich, mehrere Nukleinsäuresequenzen hinter einen Promotor und, falls zutreffend, vor einem Terminator zu inserieren, und zwar insbesondere, wenn eine polycistronische Transkription in den Wirt- oder Zielzellen möglich ist. In diesem Kontext ist die Insertionsstelle oder die Abfolge der inserierten Nukleinsäuremoleküle im Nukleinsäurekonstrukt nicht entscheidend, was heißt, dass ein Nukleinsäuremolekül an der ersten oder letzten Position in der Kassette inseriert werden kann, ohne dass dies eine wesentliche Auswirkung auf die Expression besitzt. Allerdings ist es ebenfalls möglich, nur einen Promotortyp in dem Konstrukt zu verwenden.
Demgemäß vermittelt das Nukleinsäurekonstrukt gemäß der Erfindung, in einer bevorzugten Ausführungsform die Reduktion oder Unterdrückung eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend das Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder eines codierten Genprodukts, z. B. eines Polypeptids, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, das hierin beschrieben ist, und gegebenenfalls weiterer Gene in einer Pflanze und umfasst ein oder mehrere pflanzliche regulatorische Elemente. Das Nukleinsäurekonstrukt gemäß der Erfindung beinhaltet vorteilhafterweise einen Pflanzenpromotor oder einen Pflanzenterminator oder einen Pflanzenpromotor und einen Pflanzenterminator. Es codiert weiterhin beispielsweise ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung, codierend einen Antisense, eine RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA oder ein Ribozymmolekül der Erfindung oder das Cosuppressions-Nukleinsäuremolekül oder das virale Abbau-Nukleinsäuremolekül der Erfindung, oder codierend einen DNA-, RNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, eine dominant- negative Mutante oder einen Antikörper der Erfindung oder das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül für eine Rekombination.
Ein ”Pflanzen”-Promotor umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegmentes in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sondern kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, insbesondere zum Beispiel aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen.
Der Pflanzenpromotor kann auch aus einer Pflanzenzelle, z. B. aus der Pflanze, welche mit dem Nukleinsäurekonstrukt oder Vektor, wie hierin beschrieben, transformiert wird, stammen. Dies gilt auch für andere ”pflanzliche” regulatorische Signale, zum Beispiel bei ”Pflanzen”-Terminatoren.
Ein für pflanzliche Expression geeignetes Nukleinsäurekonstrukt umfasst vorzugsweise regulatorische Elemente, welche zur Steuerung der Expression von Genen in Pflanzenzellen fähig sind und welche funktionsfähig angekoppelt bzw. verknüpft sind, sodass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann. Demgemäß kann das Nukleinsäurekonstrukt auch Transkriptionsterminatoren umfassen. Beispiele für transkriptionale Termination sind Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, welche aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA stammen, wie etwa dem Gen3 des Ti-Plasmides pTiACH5, welches als Octopin-Synthase bekannt ist (Gielen et al., EMBO J. 3, 835 (1984) ff.), oder funktionelle Äquivalente davon, wobei aber alle anderen Terminatoren, welche in Pflanzen funktionsmäßig aktiv sind, ebenfalls geeignet sind.
Im Fall, dass ein für pflanzliche Expression geeignetes Nukleinsäurekonstrukt für die Expression eines Polypeptids verwendet wird, umfasst es vorzugsweise andere funktionstüchtig gekoppelte regulatorische Elemente, wie Translationsenhancer, zum Beispiel die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz von Tabakmosaikvirus umfasst, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht (Gallie et al., Nucl. Acids Research 15, 8693 (1987)).
Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig gekoppelt sein mit einem geeigneten Promotor, oder selbigen umfassen, welcher zum Beispiel das Antisense-, RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosupressionsmolekül oder Ribozymmolekül der Erfindung oder das Cosupressions-Nukleinsäuremolekül oder das virale Abbau-Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder ein solches, codierend einen DNA-, RNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, eine dominant-negative Mutante oder einen Antikörper der Erfindung, am richtigen Zeitpunkt und in einer zell- oder gewebespezifischen Weise exprimiert. Verwendbare Promotoren sind konstitutive Promotoren (Benfey et al., EMBO J. 8, 2195 (1989)), wie etwa diejenigen, welche aus Pflanzenviren stammen, wie 35S-CAMV (Franck et al., Cell 21, 285 (1980)), 19S-CaMV (siehe auch US 5 352 605 und WO 84/02913 ), 34S-FMV (Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 433 (1990)), der Petersilie-Ubiquitin-Promotor oder Pflanzenpromotoren, wie etwa der Promotor der kleinen Rubisco-Untereinheit, beschrieben in US 4 962 028 , oder die Pflanzenpromotoren PRP1 (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22, 361 (1993)), SSU, PGEL1, OCS (Leisner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (5), 2553 (1988)), lib4, usp, mas (Comai, Plant. Mol. Biol. 15 (3), 373 (1990)), STLS1, ScBV (Schenk, Plant. Mol. Biol. 39 (6), 1221 (1999)), B33, SAD1 oder SAD2 (Flachs-Promotoren, Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1696 (1999)) oder nos (Shaw et al., Nucleic Acids Res. 12 (20), 7831 (1984)). Die stabile, konstitutive Expression des Antisense, der RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, des Cosupressionsmoleküls oder des Ribozymmoleküls der Erfindung oder des Cosupressions-Nukleinsäuremoleküls oder des viralen Abbau-Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder eines solchen, codiernd einen DNA-, RNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, einer dominant-negativen Mutante oder eines Antikörpers der Erfindung kann vorteilhaft sein. Allerdings ist eine induzierbare Expression des Nukleinsäuremolekül zur Reduktion eines Nukleinsäuremoleküls, das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbar ist, vorteilhaft, wenn eine späte Expression vor der Ernte von Vorteil ist, da die metabolische Manipulation zu einer Verlangsamung des Pflanzenwachstums führen kann.
Die Expression des Nukleinsäuremoleküls für die Reduktion eines Nukleinsäuremoleküls, verwendbar für das Verfahren der Erfindung, kann ebenfalls wie oben beschrieben durch einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtert werden (für einen Überblick siehe Gatz, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48, 89 (1997)). Chemisch induzierbare Promotoren sind besonders geeignet, wenn gewünscht wird, das Gen in einer zeitspezifischen Weise zu exprimieren. Beispiele derartiger Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor ( WO 95/19443 ) und ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor ( EP 335 528 ), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. Plant J. 2, 397 (1992)), ein Cyclohexanol- oder Ethanol-induzierbarer Promotor ( WO 93/21334 ) oder andere, wie hierin beschrieben.
Sonstige geeignete Promotoren sind diejenigen, welche auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, beispielsweise der Pathogen-induzierte PRP1-Genpromotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22, 361 (1993)), der Hitze-induzierbare hsp80-Promotor der Tomate ( US 5 187 267 ), der Kälte-induzierbare Alpha-Amylase-Promotor der Kartoffel ( WO 96/12814 ) oder der durch Verwundung induzierbare pinII-Promotor ( EP-A-0 375 091 ) oder andere, wie hierin beschrieben.
Bevorzugte Promotoren sind insbesondere diejenigen, welche eine Genexpression in Geweben und Organen, in Samenzellen, wie Endospermzellen, und Zellen des sich entwickelnden Embryos herbeiführen.
Geeignete Promotoren sind der Promotor des Napin-Gens von Ölsamenraps ( US 5 608 152 ), der USP-Promotor von Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 225 (3), 459 (1991)), der Oleosin-Promotor von Arabidopsis ( WO 98/45461 ), der Phaseolin-Promotor von Phaseolus vulgaris ( US 5 504 200 ), der Brassica-Bce4-Promotor ( WO 91/13980 ), der Bohnen-arc5-Promotor, der Karotten-DcG3-Promotor oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., Plant Journal, 2 (2), 233 (1992)), sowie Promotoren, welche die samenspezifische Expression in monokotyledonen Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis und dergleichen, herbeiführen. Vorteilhafte samenspezifische Promotoren sind der Saccharose-Bindungsprotein-Promotor ( WO 00/26388 ), der Phaseolin-Promotor und der Napin-Promotor. Geeignete Promotoren, welche in Betracht gezogen werden müssen, sind der lpt2- oder lpt1-Gen-Promotor von Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ), sowie die Promotoren, welche in WO 99/16890 beschrieben sind (Promotoren aus dem Gerste-Hordein-Gen, dem Reis-Glutein-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Prolamin-Gen von Reis, dem Gliadin-Gen von Weizen, dem Glutelin-Gen von Weizen, dem Zein-Gen von Mais, dem Glutein-Gen von Hafer, dem Kasirin-Gen von Sorghum und dem Secalin-Gen von Roggen). Weitere geeignete Promotoren sind jene von Amy32b, Amy 6-6 und Aleurain [ US 5 677 474 ], Bce4 (Ölsamenraps) [ US 5 530 149 ], Glycinin (Soja) [ EP 571 741 ], Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (Soja) [ JP 06/62870 ], ADR12-2 (Soja) [ WO 98/08962 ], Isocitrat-Lyase (Ölsamenraps) [ US 5 689 040 ] oder alpha-Amylase (Gerste) [ EP 781 849 ]. Andere Promotoren, welche für die Expression von Genen, z. B. des im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere für die Reduktion eines Nukleinsäuremoleküls, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert wird, in Pflanzen verfügbar sind, sind blattspezifische Promotoren, wie diejenigen, beschrieben in DE-A 19644478 , oder lichtregulierte Promotoren, wie zum Beispiel der petE-Promotor der Erbse.
Weitere geeignete Pflanzenpromotoren sind der Promotor der cytosolischen FBPase oder der Kartoffel-ST-LSI-Promotor (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445 (1989)), der Phosphoribosylpyrophosphat-Amidotransferase-Promotor von Glycine max (GenBank-Zugangs-Nr. U87999) oder der Nodus-spezifische Promotor, der in EP-A-0 249 676 beschrieben ist.
Andere Promotoren, welche in speziellen Fällen geeignet sind, sind diejenigen, welche eine plastidenspezifische Expression herbeiführen. Geeignete Promotoren, wie etwa der virale RNA-Polymerase-Promotor, sind in WO 95/16783 und WO 97/06250 beschrieben, sowie der Arabidopsis-clpP-Promotor, der in WO 99/46394 beschrieben ist.
Andere Promotoren, welche für die starke Expression von heterologen Sequenzen, z. B. des im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere zur Reduktion ein Nukleinsäuremoleküls, dessen Aktivität im Verfahren der Erfin dung reduziert wird, in möglichst vielen Geweben, insbesondere auch in Blättern, verwendet werden, sind, zusätzlich zu mehreren der oben erwähnten viralen und bakteriellen Promotoren, vorzugsweise Pflanzenpromotoren von Actin- oder Ubiquitin-Genen, wie zum Beispiel der Actin1-Promotor von Reis. Weitere Beispiele für konstitutive Pflanzenpromotoren sind die V-ATPase-Promotoren der Zuckerrübe ( WO 01/14572 ). Beispiele für synthetische konstitutive Promotoren sind der Super-Promotor ( WO 95/14098 ) sowie Promotoren, welche aus G-Boxen abgeleitet sind ( WO 94/12015 ). Falls geeignet, können darüber hinaus auch chemisch induzierbare Promotoren verwendet werden, vgl. EP-A 388186 , EP-A 335528 , WO 97/06268 .
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Nukleinsäurekonstrukt, vermittelnd die Expression beispielsweise von dem Antisense, der RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, dem Cosupressionsmolekül oder Ribozymmolekül der Erfindung oder dem Cosupressions-Nukleinsäuremolekül oder dem viralen Abbau-Nukleinsäuremolekül der Erfindung, oder codierend einen DNA-, RNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, eine dominant-negative Mutante oder einen Antikörper der Erfindung, wie im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, das für die Expression in Pflanzen geeignet ist.
Bevorzugte Empfängerpflanzen sind, wie oben stehend beschrieben, insbesondere diejenigen Pflanzen, welche in einer geeigneten Weise transformiert werden können. Zu diesen gehören sowohl monokotyledone als auch dikotyledone Pflanzen. Pflanzen, welche erwähnt werden müssen, sind insbesondere landwirtschaftlich nützliche Pflanzen, wie Getreide und Gräser, beispielsweise Triticum spp., Zea mays, Hordeum vulgare, Hafer, Secale cereale, Oryza sativa, Pennisetum glaucum, Sorghum bicolor, Triticale, Agrostis spp., Cenchrus ciliaris, Dactylis glomerata, Festuca arundinacea, Lolium spp., Medicago spp. und Saccharum spp., Hülsenfrüchte und Öl-Kulturpflanzen, zum Beispiel Brassica juncea, Brassica napus, Glycine max, Arachis hypogaea, Gossypium hirsutum, Cicer arietinum, Helianthus annuus, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Sinapis alba, Trifolium repens und Vicia narbonensis, Gemüsepflanzen und Obstpflanzen, beispielsweise Bananen, Weintrauben, Lycopersicon esculentum, Spargel, Kohl, Wassermelonen, Kiwi, Solanum toberosum, Beta vulgaris, Maniokstrauch und Chicoree, Bäume, zum Beispiel Coffea-Spezies, Citrus spp., Eukalyptus spp., Picea spp., Pinus spp. und Populus spp., medizinische Pflanzen und Bäume sowie Blumen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Erzeugung eines Vektors, welches die Insertion des hierin charakterisierten Nukleinsäuremoleküls, des Nukleinsäuremoleküls gemäß der Erfindung oder der Expressionskassette gemäß der Erfindung in einen Vektor umfasst. Der Vektor kann zum Beispiel in eine Zelle, z. B. einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle, wie es hierin für das Nukleinsäurekonstrukt oder nachstehend unter Transformation oder Transfektion beschrieben oder in den Beispielen gezeigt ist, eingebracht werden. Eine transiente oder eine stabile Transformation der Wirts- oder Zielzelle ist möglich, wobei jedoch eine stabile Transformation bevorzugt wird.
Der Vektor gemäß der Erfindung ist vorzugsweise ein Vektor, welcher zum Reduzieren, Unterdrücken, Verringern oder Deletieren des Polypeptids gemäß der Erfindung in einer Pflanze geeignet ist. Das Verfahren kann daher auch einen oder mehrere Schritte zum Integrieren von regulatorischen Signalen in den Vektor einschließen, und zwar insbesondere Signalen, welche die Reduktion, Verringerung oder Deletion in einer Pflanze vermitteln.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung des Weiteren einen Vektor, der das hierin charakterisierte Nukleinsäuremolekül als Teil eines Nukleinsäurekonstruktes, geeignet für pflanzliche Expression, oder das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung umfasst.
Ein vorteilhafter Vektor, der im Verfahren der Erfindung verwendet wird, z. B. der Vektor der Erfindung, umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das ein Nukleinsäuremolekül codiert, welches im Verfahren der Erfindung verwendet wird, oder ein Nukleinsäurekonstrukt, geeignet zur Expression in Pflanzen, umfassend die Nukleinsäuremoleküle, die im Verfahren der Erfindung verwendbar sind, wie obenstehend beschrieben.
Folglich umfassen die rekombinanten Expressionsvektoren, welche im Verfahren der Erfindung vorteilhaft eingesetzt werden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle oder das Nukleinsäurekonstrukt gemäß der Erfindung in einer Form, welche zum Unterdrücken der Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 der Tabelle I, Anmeldung. Nr. 1, oder eines Polypeptids, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, geeignet ist und/oder zur gleichen Zeit, in einer Wirtszelle, zusätzliche Gene exprimiert, welche von den Nukleinsäuremolekülen gemäß der Erfindung begleitet werden oder hierin beschrieben werden. Demgemäß umfassen die rekombinanten Expressionsvektoren ein oder mehrere regulatorische Signale, die auf der Basis der Wirtszellen ausgewählt sind, welche für die Expression verwendet werden sollen, in funktionsfähiger Verknüpfung mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
Gemäß der Erfindung bezieht sich der Begriff ”Vektor” auf ein Nukleinsäuremolekül, welches zum Transport einer anderen Nukleinsäure, mit der es verknüpft ist, fähig ist. Ein Typ von Vektor ist ein ”Plasmid”, was eine kreisförmige doppelsträngige DNA-Schleife bedeutet, in welche weitere DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Typ von Vektor ist ein viraler Vektor, wobei es möglich ist, zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom zu ligieren. Bestimmte Vektoren sind fähig zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in welche sie eingebracht worden sind (beispielsweise bakterielle Vektoren mit bakteriellem Replikationsursprung). Andere bevorzugte Vektoren werden in vorteilhafter Weise vollständig oder teilweise in das Genom einer Wirtszelle integriert, wenn sie in die Wirtszelle eingebracht werden, und replizieren daher gemeinsam mit dem Wirtsgenom. Fernerhin sind bestimmte Vektoren fähig zum Steuern der Expression von Genen, mit denen sie in funktionsfähiger Verbindung stehen. Im vorliegenden Zusammenhang werden diese Vektoren als ”Expressionsvektoren” bezeichnet. Wie oben erwähnt, sind sie fähig zu autonomer Replikation oder können teilweise oder vollständig in das Wirtsgenom integriert werden. Expressionsvektoren, welche für DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, nehmen in der Regel die Form von Plasmiden ein. In der vorliegenden Beschreibung können ”Plasmid” und ”Vektor” austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors ist. Jedoch ist es ebenfalls beabsichtigt, dass die Erfindung solche anderen Formen von Expressionsvektoren einschließt, wie etwa virale Vektoren, welche ähnliche Funktionen ausüben. Der Begriff Vektor soll ferner außerdem andere Vektoren beinhalten, welche dem Fachmann bekannt sind, wie etwa Phagen, Viren, wie SV40, CMV, TMV, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagmide, Cosmide und lineare oder kreisförmige DNA.
In einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet ”funktionstüchtige Verknüpfung”, dass das Nukleinsäuremolekül von Interesse auf eine solche Weise mit den regulatorischen Signalen verbunden ist, dass die Expression der Gene möglich ist: sie sind auf eine solche Weise miteinander gekoppelt, dass die zwei Sequenzen die vorhergesagte Funktion erfüllen, die der Sequenz zugeordnet ist (beispielsweise in einem In-vitro-Transkriptions/Translationssystem, oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht ist).
Der Begriff ”regulatorische Sequenz” umfasst beabsichtigtermaßen Promotoren, Enhancer oder andere Expressions-Steuerungselemente (beispielsweise Polyadenylierungsignale). Diese regulatorischen Sequenzen sind beispielsweise beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsg.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, wobei die darin zitierten Bezugsstellen inbegriffen sind. Zu regulatorischen Sequenzen gehören solche, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Typen von Wirtszellen steuern, sowie solche, welche die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in spezifischen Wirtszellen und unter spezifischen Bedingungen steuern. Der Fachmann auf dem Gebiet weiß, dass der Entwurf des Expressionsvektors von Faktoren, wie der Wahl der zu tranformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß, zu welchem die Proteinmenge reduziert wird, und dergleichen abhängen kann. Eine bevorzugte Auswahl von regulatorischen Sequenzen ist oben beschrieben, beispielsweise Promotoren, Terminatoren, Enhancer und dergleichen. Der Begriff regulatorische Sequenz versteht sich so, dass er vom Begriff regulatorisches Signal beinhaltet wird. Mehrere vorteilhafte regulatorische Sequenzen, insbesondere Promotoren und Terminatoren, sind oben stehend beschrieben. Im Allgemeinen sind die regulatorischen Sequenzen, die für das zur Expression geeignete Nukleinsäurekonstrukt als vorteilhaft beschrieben wurden, ebenfalls für Vektoren anwendbar.
Die verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren können spezifisch für die Expression von im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremolekülen in prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen entworfen werden. Dies ist vorteilhaft, da Zwischenschritte der Vektorkonstruktion häufig aus Gründen der Einfachkeit in Mikroorganismen durchgeführt werden. Zum Beispiel können die Gene gemäß der Erfindung und andere Gene in Bakterienzellen, Insektenzellen (unter Anwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen und anderen Pilzzellen (Romanos, Yeast 8, 423 (1992); van den Hondel, (1991), in: More Gene Manipulations in Fungi, Hrsg.: J. W. Bennet & L. L. Lasure, S. 396–428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C. A. M. J. J. (1991), in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Hrsg.: Peberdy, J. F., et al., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al., Marine Biotechnology. 1, (3), 239 (1999)) unter Verwendung von Vektoren und unter Befolgung eines Transformationsverfahrens, wie beschrieben in WO 98/01572 , und vorzugsweise in Zellen von mehrzelligen Pflanzen [siehe Schmidt, R., und Willmitzer, L., Plant Cell Rep. 583 (1988); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); White F. F., in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung and Wu, R., Academic, Press (1993), 128–43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991), (und den darin zitierten Bezugsstellen)] exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen sind ferner in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), erläutert. Als eine Alternative kann die Sequenz des rekombinanten Expressionsvektors in vitro transkribiert und translatiert werden, wobei zum Beispiel regulatorische Sequenzen des T7-Promotors und T7-Polymerase verwendet werden.
In den meisten Fällen können Polynukleotide, wie RNA, oder Polypeptide oder Proteine in Prokaryoten unter Verwendung von Vektoren exprimiert werden, die konstitutive oder induzierbare Promotoren umfassen, welche die Expression von Fusionsproteinen oder Nicht-Fusionsproteinen steuern. Typische Fusionsexpressionsvektoren sind unter anderem pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B., und Johnson, K. S., Gene 67, 31 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), worin Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose-E-Bindungsprotein oder Protein A mit dem rekombinanten Zielprotein fusioniert ist. Beispiele für geeignete induzierbare Nicht-Fusions-E. coli-Expressionsvektoren sind unter anderem pTrc (Amann et al., Gene 69, 301 (1988)) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60–89). Die Zielgenexpres sion des pTrc-Vektors basiert auf der Transkription von einem hybriden trp-lac-Fusionspromotor durch die RNA-Polymerase des Wirtes. Die Zielgenexpression vom pET 11d-Vektor aus basiert auf der Transkription eines T7-gn10-lac-Fusionspromotors, welche durch eine coexprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) durch einen residenten ”Symbol”-Prophagen bereitgestellt, welcher ein T7 gn1-Gen unter der transkriptionellen Steuerung des lacUV 5-Promotors enthält.
Andere Vektoren, welche in prokaryotischen Organismen geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt; diese Vektoren sind in E. coli beispielsweise pLG338, pACYC184, die pBR-Reihe, wie etwa pBR322, die pUC-Reihe, wie pUC18 oder pUC19, die M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pINIII113-B1, ”Symbol” gt11 oder pBdCl, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Expressionsvektor um einen Hefe-Expressionsvektor. Beispiele von Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYeDesaturasec1 (Baldari et al., Embo J. 6, 229 (1987)), pMFa (Kurjan und Herskowitz, Cell 30, 933 (1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54, 113 (1987)) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren für die Konstruktion von Vektoren, welche zur Verwendung in anderen Pilzen, wie den filamentösen Pilzen, geeignet sind, beinhalten diejenigen, welche ausführlich beschrieben sind in: van den Hondel, C. A. M. J. J. ((1991), Hrsg.: J. F. Peberdy, S. 1–28, Cambridge University Press, Cambridge; oder in: More Gene Manipulations in Fungi; Hrsg.: J. W. Bennet & L. L. Lasure, S. 396–428: Academic Press: San Diego). Beispiele von anderen geeigneten Hefevektoren sind 2 ”Symbol” M, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23.
Weitere Vektoren, welche beispielhaft erwähnt werden können, sind pALS1, pIL2 oder pBB116 in Pilzen, oder pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51 in Pflanzen.
Als Alternative können die Nukleinsäuresequenzen in Insektenzellen exprimiert werden, wobei Baculovirus-Expressionsvektoren angewandt werden. Baculovirusvektoren, welche zum Exprimieren von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (zum Beispiel Sf9-Zellen) verfügbar sind, schließen die pAc-Serie (Smith et al., Mol. Cell Biol. 3, 2156 (1983)) und die pVL-Serie (Lucklow und Summers, Virology 170, 31 (1989)) ein.
Die oben erwähnten Vektoren sind lediglich ein kleiner Überblick der potenziell geeigneten Vektoren. Dem Fachmann auf dem Gebiet sind weitere Plasmide bekannt, und diese sind beispielsweise beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsg.: Pouwels, P. H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Für weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen, siehe die Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Folglich betrifft eine Ausführungsform der Erfindung einen Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren oder ein Nukleinsäurekonstrukt zur Verwendung im Verfahren der Erfindung, z. B. das Nukleinsäuremolekül oder das Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung, umfassend ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend einen Antisense, eine RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, ein Cosuppressionsmolekül oder Ribozymmolekül der Erfindung oder das Cosuppressions-Nukleinsäuremolekül oder das virale Abbau-Nukleinsäuremolekül der Erfindung, oder codierend einen DNA-, RNA- oder Protein-Bindungsfaktor gegen Gene, RNAs oder Proteine, eine dominant-negative Mutante oder einen Antikörper der Erfindung oder das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül für eine Rekombination, insbesondere das Nukleinsäuremolekül für eine homologe Rekombination. Der Vektor ist nützlich für die Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion des Polypeptids gemäß der Erfindung in einem Organismus, vorzugsweise in einer Pflanze. In vorteilhafter Weise steht das Nukleinsäuremolekül in funktionstüchtiger Verknüpfung mit regulatorischen Sequenzen für die Expression in einem prokaryotischen oder eukaryotischen, oder in einem prokaryotischen und einem eukaryotischen, Wirt. Ferner liegen auch Vektoren, welche für homologe Rekombination geeignet sind, innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Folglich betrifft eine Ausführungsform der Erfindung eine Wirtszelle, welche stabil oder transient mit dem im Verfahren der Erfindung verwendbaren Vektor, insbesondere mit dem Vektor gemäß der Erfindung oder dem Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung oder dem Nukleinsäurekonstrukt gemäß der Erfindung, transformiert worden ist. Bei der Wirtszelle kann es sich um einen Mikroorganismus, eine nicht-menschliche tierische Zelle oder eine Pflanzenzelle handeln.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, codiert von dem Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung, z. B. codiert von einem Nukleinsäuremolekül, wie es in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist, was bedeutet, dass die vorliegende Erfindung, zum Beispiel, auch ein Polypeptid, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, betrifft, wobei vorzugsweise eine Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder eine Erhöhung der Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, nach Verringern oder Unterdrücken der Expression oder Aktivität herbeigeführt wird. In vorteilhafter Weise können das Polypeptid oder ein Fragment davon, insbesondere ein Epitop oder ein Hapten, welche alle von dem Begriff ”Polypeptid der Erfindung” beinhal tet sind, verwendet werden, um einen Antikörper gegen das Polypeptid herzustellen oder zu erzeugen. Vorteilhafterweise inaktiviert oder reduziert der Antikörper die Aktivität eines Polypeptids, welche Aktivität im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Polypeptid in einer Wirtszelle gemäß der Erfindung, vorzugsweise in einem Mikroorganismus, einer nicht-humanen Tierzelle oder einer transgenen Pflanzenzelle, exprimiert wird.
In einer Ausführungsform wird das im Verfahren zur Herstellung des Polypeptids verwendete Nukleinsäuremolekül aus dem Mikroorganismus, vorzugsweise aus der prokaryotischen oder der Protozoen-Zelle, bei diesem eukaryotischen Organismus als Wirtszelle, abgeleitet. In einer anderen Ausführungsform wird das Polypeptid in der Pflanzenzelle oder Pflanze mit einem Nukleinsäuremolekül hergestellt, welches aus einem Prokaryoten oder einem Pilz oder einer Alge oder einem anderen Mikroorganismus, jedoch nicht aus einer Pflanze, abgeleitet ist. In einer weiteren Ausführungsform wird das Polypeptid in der Pflanzenzelle oder Pflanze mit einem Nukleinsäuremolekül hergestellt, welches aus einer Pflanze oder aus Algen abgeleitet ist.
Der Fachmann weiß, dass Protein und DNA, welche in unterschiedlichen Organismen exprimiert werden, sich in vielerlei Hinsicht und in vielen Eigenschaften, z. B. Methylierung, Abbau und posttranslationaler Modifikation, wie zum Beispiel Glycosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Myristylierung, ADP-Ribosylierung, Farnesylierung, Carboxylierung, Sulfatierung, Ubiquitylierung, etc., unterscheiden, obwohl sie die gleiche codierende Sequenz aufweisen. Vorzugsweise unterscheidet sich die zelluläre Expressionssteuerung des entsprechenden Proteins demgemäß hinsichtlich der Kontrollmechanismen, welche die Aktivität und Expression eines endogenen Proteins oder eines anderen eukaryotischen Proteins steuern. Ein Hauptunterschied zwischen in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen exprimierten Proteinen ist das Ausmaß der Glycosylierung. So gibt es zum Beispiel in E. coli keine glycosylierten Proteine. In Hefen exprimierte Proteine besitzen einen hohen Mannosegehalt in den glycosylierten Proteinen, wohingegen das Glycosylierungsmuster in Pflanzen komplex ist.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Zum Beispiel wird ein Nukleinsäuremolekül, welches das Protein codiert, in einen Vektor kloniert (wie oben beschrieben), der Vektor wird in eine Wirtszelle eingebracht (wie oben beschrieben), und das Polypeptid wird in der Wirtszelle exprimiert. Das Polypeptid kann dann durch ein geeignetes Reinigungsschema unter Anwendung standardmäßiger Proteinreinigungstechniken aus den Zellen isoliert werden. Alternativ zur rekombinanten Expression kann ein Polypeptid, das von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder ein Homolog davon, codiert wird, insbesondere ein Fragment oder ein Peptid der vorliegenden Erfindung, chemisch unter Anwendung standardmäßiger Peptidsynthesetechniken synthetisiert werden. Darüber hinaus können native Polypeptide, welche dieselbe Struktur haben und vorzugsweise die Aktivität des Proteins vermitteln, welches im Verfahren der Erfindung verwendbar ist, aus Zellen (z. B. endothelialen Zellen) isoliert werden, wobei zum Beispiel der Antikörper der vorliegenden Erfindung, wie nachstehend beschrieben, verwendet wird. Der Antikörper kann durch Standardtechniken unter Verwendung des im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbaren Polypeptids oder eines Fragmentes davon, d. h. des Polypeptids dieser Erfindung, hergestellt werden.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid mit der Aktivität, repräsentiert durch ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, insbesondere einer Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und/oder SET-Domäne-enthaltendes-Protein besteht. Das Polypeptid vermittelt vorzugsweise die vorangehend erwähnte Aktivität, im Besonderen vermittelt das Polypeptid die Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoff-Verwertungseffizienz und/oder der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze nach Verringern oder Unterdrücken der zellulären Aktivität, z. B. durch Verringern der Expression oder der spezifischen Aktivität des Polypeptids. In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, das die von einem Nukleinsäuremolekül der Erfindung codierte Aminosäuresequenz aufweist oder durch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Erfindung erhältlich ist.
In einer Ausführungsform unterscheidet sich das Polypeptid gegenüber der Sequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B, Anmeldung Nr. 1, durch eine oder mehrere Aminosäuren. In einer anderen Ausführungsform besteht das Polypeptid der Erfindung nicht aus der Sequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B, Anmeldung Nr. 1. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polypeptid der vorliegenden Erfindung zu weniger als 100%, 99,999%, 99,99%, 99,9% oder 99% identisch zu Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B, Anmeldung Nr. 1.
Vorzugsweise unterscheidet sich die Sequenz des Polypeptids der Erfindung von der Sequenz, wie sie in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt ist, um nicht mehr als 80% oder 70% der Aminosäuren, vorzugsweise nicht mehr als 60% oder 50%, weiter bevorzugt nicht mehr als 40% oder 30%, noch weiter bevorzugt nicht mehr als 20% oder 10%. In einer Ausführungsform unterscheidet sich das Polypeptid von der Sequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B, Anmeldung Nr. 1, um mehr als 5, 6, 7, 8 oder 9 Aminosäuren, vorzugsweise um mehr als 10, 15, 20, 25 oder 30 Aminosäuren, noch weiter bevorzugt sind mehr als 40, 50 oder 60 Aminosäuren. In einer Ausführungsform stammt das Polypeptid der Erfindung aus einer Pflanzenzelle.
Vorzugsweise ist das Polypeptid isoliert. Ein ”isoliertes” oder ”gereinigtes” Protein oder Nukleinsäuremolekül oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon ist im Wesentlichen frei von zellulärem Material, wenn es durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wird, oder von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von zellulärem Material” schließt Präparationen des Polypeptids ein, in denen das Protein von zellulären Komponenten der Zellen, in denen es natürlicherweise oder rekombinant hergestellt wird, getrennt ist. In einer Ausführungsform schließt der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von zellulärem Material” Präparationen mit weniger als etwa 30% (bezogen auf das Trockengewicht) an ”kontaminierendem Protein”, weiter bevorzugt weniger als etwa 20% an ”kontaminierendem Protein”, noch weiter bevorzugt weniger als etwa 10% an ”kontaminierendem Protein”, und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% an ”kontaminierendem Protein” ein. Der Begriff ”kontaminierendes Protein” betrifft Polypeptide, welche nicht Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind. Wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon rekombinant hergestellt wird, ist es außerdem vorzugsweise im Wesentlichen frei ”von Kulturmedium, d. h. Kulturmedium repräsentiert weniger als etwa 20%, weiter bevorzugt weniger als etwa 10% und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% des Volumens der Proteinpräparation. Der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien” schließt Präparationen ein, in denen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien getrennt ist, welche in der Synthese des Proteins beteiligt sind. Der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien” beinhaltet Präparationen mit weniger als etwa 30% (bezogen auf Trockengewicht) an chemischen Vorläufern oder anderen Proteinen oder Chemikalien, welche nicht identisch zu dem Protein sind, weiter bevorzugt weniger als etwa 20% chemischen Vorläufern oder anderen Proteinen oder Chemikalien, noch weiter bevorzugt weniger als etwa 10% chemischen Vorläufern oder anderen Proteinen oder Chemikalien, und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% chemischen Vorläufern oder anderen Proteinen oder Chemikalien, welche nicht zu dem Protein der Erfindung identisch sind. In bevorzugten Ausführungsformen sind isolierte Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon frei von kontaminierenden Proteinen aus dem gleichen Organismus, aus welchem das Polypeptid der vorliegenden Erfindung abgeleitet ist. Typischerweise werden derartige Proteine durch rekombinante Techniken hergestellt.
Ein Polypeptid der Erfindung umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, welche zu einer Aminosäuresequenz, wie sie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, An meldung Nr. 1, aufgeführt ist oder welche eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst, ausreichend homolog ist, so dass das Protein oder der Abschnitt davon die Fähigkeit beibehält, die Aktivität der vorliegenden Erfindung zu vermitteln. Vorzugsweise besitzt das Polypeptid eine Aminosäuresequenz, die identisch ist zu derjenigen, wie in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt.
Ferner kann das Polypeptid der Erfindung oder das Polypeptid, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die an eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung hybridisiert, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie oben beschrieben, daran hybridisiert.
Folglich besitzt das Polypeptid eine Aminosäuresequenz, welche von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die wenigstens etwa 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% oder 70%, vorzugsweise wenigstens etwa 75%, 80%, 85% oder 90%, und stärker bevorzugt wenigstens etwa 91%, 92%, 93%, 94% oder 95%, und noch weiter bevorzugt wenigstens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr, homolog zu einem der Nukleinsäuremoleküle ist, wie sie in Spalte 5 oder 7 der Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt sind. Das bevorzugte Polypeptid besitzt mindestens eine der Aktivitäten gemäß der Erfindung und wie hierin beschrieben.
Ein bevorzugtes Polypeptid komplementiert den Knockout, z. B. eine Inaktivierung oder eine Reduktion, Unterdrückung oder Deletion eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, wenn es in geeigneter Weise in der Knockout-Mutante exprimiert wird. In geeigneter Weise exprimiert bedeutet in diesem Zusammenhang, dass das Polypeptid in einer ähnlichen Qualität und Quantität und in einer gleichen Entwicklungsphase, einem gleichen Gewebe und Kompartiment in der Knockout-Mutante produziert wird, wie das inaktivierte, deletierte oder reduzierte Polypeptid. Ein bevorzugtes Polypeptid der vorliegenden Erfindung schließt eine Aminosäuresequenz ein, codiert von einer Nukleotidsequenz, welche an eine Nukleotidsequenz von Spalte 5 oder 7 der Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, hybridisiert, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen hybridisiert, oder welche dazu homolog ist, wie oben definiert.
Folglich kann das Polypeptid, dessen Aktivität im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert werden soll, z. B. das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, von der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in der Spalte 7 der Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, hinsichtlich der Aminosäu resequenz aufgrund natürlicher Variation oder Mutagenese, wie hierin ausführlich beschrieben, abweichen. Demgemäß umfasst das Polypeptid eine Aminosäuresequenz, welche wenigstens etwa 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% oder 70%, vorzugsweise wenigstens etwa 75%, 80%, 85% oder 90%, und weiter bevorzugt wenigstens etwa 91%, 92%, 93%, 94% oder 95% und am stärksten bevorzugt wenigstens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer gesamten Aminosäuresequenz eines Polypeptids ist, wie aufgeführt in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in der Spalte 7 der Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1.
Für den Vergleich von Aminosäuresequenzen können dieselben Algorithmen, wie oben beschrieben für/oder Nukleinsäuresequenzen, verwendet werden. Ergebnisse mit hoher Qualität werden durch Verwendung des Algorithmus von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman erzielt. Deshalb werden Programme, welche auf den genannten Algorithmen beruhen, bevorzugt. In vorteilhafter Weise kann der Vergleich von Sequenzen mit dem Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351 (1987), Higgins et al., CABIOS 5, 151 (1989)) oder vorzugsweise mit den Programmen ”Gap” und ”Needle”, welche beide auf den Algorithmen von Needleman und Wunsch basieren (J. Mol. Biol. 48; 443 (1970)), sowie ”Best-Fit”, welches auf dem Algorithmus von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482 (1981)) basiert, durchgeführt werden. ”Gap” und ”Best-Fit” sind Teil des GCG-Software-Pakets (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997))), ”Needle” ist ein Teil der ”The European Molecular Biology Open Software Suite” (EMBOSS) (Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)). Deshalb werden die Berechnungen zur Bestimmung der Prozentsätze der Sequenzhomologie vorzugsweise mit den Programmen ”Gap” oder ”Needle” über den gesamten Bereich der Sequenzen hinweg durchgeführt. Es wurden die folgenden Standardeinstellungen für den Vergleich von Aminosäuresequenzen für ”Needle” verwendet: Matrix: EBLOSUM62, Lücken_Strafwert: 8,0, Erweiterungs_Strafwert: 2,0. Die folgenden Standardeinstellungen für den Vergleich von Aminosäuresequenzen wurden für ”Gap” verwendet: Lücken-Gewichtung: 8, Längen-Gewichtung: 2, durchschnittliche Übereinstimmung: 2,912, durchschnittliche Fehlpaarung: –2,003.
Biologisch aktive Abschnitte eines Polypeptids schließen Peptide ein, die Aminosäuresequenzen umfassen, welche aus der Aminosäuresequenz des hierin offenbarten Polypeptids abgleitet sind, z. B. umfassen sie die Aminosäuresequenz, wie sie in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle II aufgeführt ist, oder die Konsensussequenz oder die Polypeptidmotive von Spalte 7 von Tabelle IV oder die Aminosäuresequenz eines dazu homologen Proteins, welche weniger Aminosäuren beinhalten als ein Volllängenprotein mit der Aktivität des Proteins, z. B. wie offenbart, oder ein Volllängenprotein, das zu einem Protein mit der Aktivität des Proteins, wie offenbart, homolog ist, oder eines Polypeptids, das im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert werden soll, wie hierin aufgeführt, und deren Unter drückung, Reduktion oder Verringerung zu einer Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder einer Erhöhung der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze führt.
Typischerweise umfassen biologisch (oder immunologisch) aktive Bereiche, d. h. Peptide, z. B. Peptide, welche zum Beispiel 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sind, eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer/einem Aktivität oder Epitop des Polypeptids der vorliegenden Erfindung. Ferner können andere biologisch aktive Abschnitte, in denen andere Regionen des Polypeptids deletiert sind, durch rekombinante Techniken hergestellt und hinsichtlich einer oder mehrerer der hierin beschriebenen Aktivitäten ausgewertet werden.
Jegliche Mutagenesestrategien für das im Verfahren der Erfindung verwendbare Polypeptid, insbesondere von einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung, welche zu einer Erhöhung oder zu einer Verringerung der hierin offenbarten Aktivität führen, sind nicht als einschränkend beabsichtigt; Abwandlungen an diesen Strategien werden dem Fachmann auf dem Gebiet ohne Weiteres offensichtlich sein. Unter Anwendung derartiger Strategien und Einbindung der hierin beschriebenen Mechanismen können das hierin offenbarte Nukleinsäuremolekül und Polypeptid angewandt werden, um Pflanzen oder Teile davon zu erzeugen, welche mutierte Nukleinsäuremolekül(e) und/oder Polpypeptidmoleküle exprimieren, die im Verfahren der Erfindung, noch verwendbar sind. Diese gewünschte Verbindung kann ein beliebiges natürliches Produkt von Pflanzen sein, was die Endprodukte von Biosynthesewegen sowie Zwischenprodukte von natürlich stattfindenden Stoffwechselwegen sowie Moleküle, welche nicht natürlicherweise im Stoffwechsel der Zellen auftreten, aber welche von den Zellen der Erfindung produziert werden, einschließt.
Die Erfindung stellt ebenfalls chimäre oder Fusionsproteine bereit.
Wie hierin verwendet umfasst ein ”chimäres Protein” oder ”Fusionsprotein” ein in funktionstüchtiger Weise an ein Polypeptid, das die oben erwähnte Aktivität nicht vermittelt, gekoppeltes Polypeptid, das insbesondere eine Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder eine Erhöhung der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze herbeiführt, wenn seine Expression oder Aktivität verringert wird.
In einer Ausführungsform ist ein Protein (= ”Polypeptid”) bevorzugt, welches eine Steigerung des Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder eine Erhöhung der Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, so bald seine Aktivität verringert wird. Das Protein bezieht sich bevorzugt auf ein Polypeptid, aufweisend eine Aminosäuresequenz, entsprechend dem Polypeptid, wie hierin offenbart, vorzugsweise aufweisend eine Aminosäuresequenz entsprechend den Polypeptiden, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in der Spalte 7 der Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt, oder ein Homolog davon.
Innerhalb des Fusionsproteins bedeutet der Begriff ”operativ verknüpft” beabsichtigtermaßen, dass ein Polypeptid, wie hierin offenbart, und ein anderes Polypeptid oder ein Teil davon so aneinander fusioniert sind, dass beide Sequenzen die vorgeschlagene Funktion erfüllen, welche der verwendeten Sequenz zugeordnet ist. Das andere Polypeptid kann an den N-Terminus oder C-Terminus z. B. eines Polypeptids fusioniert sein, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll. So ist das Fusionsprotein zum Beispiel, in einer Ausführungsform, ein GST-Fusionsprotein, worin die Sequenzen des Polypeptids an den C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Derartige Fusionsproteine können die Reinigung von rekombinanten Polypeptiden der Erfindung erleichtern.
Vorzugsweise wird ein chimäres Protein oder Fusionsprotein der Erfindung durch standardmäßige rekombinante DNA-Techniken hergestellt. So werden zum Beispiel DNA-Fragmente, welche die verschiedenen Polypeptidsequenzen codieren, gemäß herkömmlichen Techniken im selben Leseraster aneinander ligiert, zum Beispiel unter Verwendung von glattendigen oder versetztendigen Termini für die Ligation, Restriktionsenzym-Verdau zur Bereitstellung von geeigneten Termini, Auffüllen kohäsiver Enden, soweit angemessen, Alkalischer-Phosphatase-Behandlung zum Vermeiden von unerwünschter Verknüpfung und enzymatischer Ligation. Das Fusionsgen kann durch herkömmliche Techniken, einschließlich automatischer DNA-Synthesizer, synthetisiert werden. Alternativ dazu kann eine PCR-Amplifikation von Genfragmenten unter Verwendung von Anker-Primern durchgeführt werden, welche zur Entstehung von komplementären Überhängen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten führen, die anschließend annealt und erneut amplifiziert werden können, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen (siehe zum Beispiel, Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg.: Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992). Ferner sind viele Expressionsvektoren im Handel erhältlich, die bereits eine Fusionseinheit (z. B. ein GST-Polypeptid) codieren. Das Nukleinsäuremolekül kann so in einen derartigen Expressionsvektor kloniert werden, dass die Fusionseinheit im selben Leseraster an das codierte Protein verknüpft wird.
Ferner können Faltungs-Simulationen und Computer-Neuentwurf von Strukturmotiven eines Proteins, welches gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert oder unterdrückt werden soll, z. B. eines Polypeptids, wie hierin offenbart, unter Anwendung geeigneter Computerprogramme durchgeführt werden (Olszewski, Proteins 25, 286 (1996); Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11, 675 (1995)). Computer-Modelierung der Prote infaltung kann für die konformationelle und energetische Analyse von detaillierten Peptid- und Proteinmodellen eingesetzt werden (Monge, J. Mol. Biol. 247, 995 (1995); Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376, 37 (1995)). Die passenden Programme können für die Identifizierung von interaktiven Stellen eines Polypeptids und dessen Substraten oder Bindungsfaktoren oder anderen interagierenden Proteinen durch computerunterstützte Suchen nach komplementären Peptidsequenzen verwendet werden (Fassina, Immunomethods 114 (1994)). Weitere passende Computersysteme für den Entwurf von Protein und Peptiden sind im Stand der Technik beschrieben, beispielsweise in Berry, Biochem. Soc. Trans. 22, 1033 (1994); Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501, 1 (1987); Pabo, Biochemistry 25, 5987 (1986). Die aus der oben beschriebenen Computeranalyse erhaltenen Ergebnisse können z. B. für die Herstellung von Peptidomimetika eines Proteins oder Fragmenten davon verwendet werden. Derartige Pseudopeptid-Analoga der natürlichen Aminosäuresequenz des Proteins können das Stammform-Protein sehr effizient nachahmen (Benkirane, J. Biol. Chem. 271, 33218 (1996)). Zum Beispiel führt der Einbau von leicht zugänglichen, achiralen Q-Aminosäureresten in ein Protein oder ein Fragment davon zur Substitution von Amid-Bindungen durch Polymethyleneinheiten einer aliphatischen Kette, wodurch eine zweckmäßige Strategie zum Konstruieren eines Peptidomimetikums bereitgestellt wird (Banerjee, Biopolymers 39, 769 (1996)).
Superaktive peptidomimetische Analoga von kleinen Peptidhormonen in anderen Systemen sind im Stand der Technik beschrieben (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224, 327 (1996)). Passende Peptidomimetika eines Polypeptids können auch durch die Synthese von kombinatorischen Peptidomimetikum-Bibliotheken durch sukzessive Amidalkylierung und Testen der resultierenden Verbindungen, z. B. hinsichtlich ihrer Eindungs- und immunologischen Eigenschaften, identifiziert werden. Verfahren zur Erzeugung und Verwendung von kombinatorischen Peptidomimetikum-Bibliotheken sind im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Ostresh, Methods in Enzymology 267, 220 (1996), und Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4, 709 (1996).
Darüber hinaus kann eine dreidimensionale und/oder kristallographische Struktur des Proteins für den Entwurf von peptidomimetischen Inhibitoren der Aktivität eines Proteins verwendet werden, welches ein Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, umfasst, oder eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, umfasst (Rose, Biochemistry 35, 12933 (1996); Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4, 1545 (1996)).
Außerdem kann eine dreidimensionale und/oder kristallographische Struktur eines hierin beschriebenen Proteins sowie die Identifizierung von interaktiven Stellen und ihren Substraten oder Bindungsfaktoren für den Entwurf von Mutanten mit modulierten Eindungs- oder Turn-over-Aktivitäten verwendet werden. Zum Beispiel kann das aktive Zentrum des Polypeptids der vorliegenden Erfindung modelliert werden, und Aminosäure reste, welche an der katalytischen Reaktion beteiligt sind, können moduliert werden, um die Bindung des Substrates zu erhöhen oder zu verringern, damit das Polypeptid inaktiviert wird. Die Identifizierung des aktiven Zentrums und der an der katalytischen Reaktion beteiligten Aminosäuren erleichtert das Screening nach Mutanten mit einer erhöhten oder verringerten Aktivität.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft außerdem einen Antikörper, der spezifisch an das hierin offenbarte Polypeptid, d. h. spezifische Fragmente oder Epitope eines derartigen Proteins, bindet.
Der Begriff ”Epitop” bezieht sich auf spezifische immunreaktive Stellen innerhalb eines Antigens, welche ebenfalls als antigene Determinanten bekannt sind. Diese Epitope können eine lineare Anordnung von Monomeren in einer polymeren Zusammensetzung – wie etwa Aminosäuren in einem Protein – sein oder aus einer komplexeren Sekundär- oder Tertiärstruktur bestehen, oder diese umfassen. Der Fachmann wird erkennen, dass Immunogene (d. h. Substanzen, die zum Hervorrufen einer Immunantwort befähigt sind) Antigene sind; allerdings sind manche Antigene, wie etwa Haptene, keine Immunogene, sondern können durch Kopplung an ein Trägermolekül immunogen gemacht werden. Der Begriff ”Antigen” beinhaltet Bezugnahmen auf eine Substanz, gegen die ein Antikörper erzeugt werden kann und/oder gegen die der Antikörper spezifisch immunreaktiv ist.
Der Antikörper vermittelt vorzugsweise die Reduktion, Unterdrückung oder Deletion eines Proteins, umfassend ein Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, wie hierin beschrieben, wobei z. B. der Antikörper das Protein der Erfindung wegen seiner Bindung in dem Organismus oder einem Teil davon inaktiviert.
Die Antikörper der Erfindung können auch verwendet werden, um ein Ziel-Polypeptid zu identifizieren und zu isolieren, dessen Aktivität gemäß der Erfindung reduziert werden soll. Derartige Antikörper können auch in den geeigneten Wirtsorganismen exprimiert werden, wodurch die Aktivität eines hierin offenbarten Genproduktes, z. B. des Polynukleotids oder Polypeptids, das hierin offenbart ist, z. B. von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, z. B. dem Polypeptid, umfassend das Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, durch die Bindung an das Expressionsprodukt, welche zum Beispiel zu einer sterischen Störung von deren Aktivität führt, reduziert wird.
Diese Antikörper können monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper oder synthetische Antikörper sowie Fragmente von Antikörpern, wie etwa Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente etc. sein. Monoklonale Antikörper können zum Beispiel durch die Techniken hergestellt werden, wie ursprünglich beschrieben in Köhler und Milstein, Nature 256, 495 (1975) und Galfr6, Meth. Enzymol. 73, 3 (1981), welche die Fusion von Maus-Myelom-Zellen mit aus immunisierten Säugetieren abgeleiteten Milzzellen umfassen.
Außerdem können Antikörper oder Fragmente davon gegen die vorangehend erwähnten Peptide mit Hilfe von Verfahren erhalten werden, welche z. B. beschrieben sind in Harlow und Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Diese Antikörper können beispielsweise für die Immunpräzipitation und Immunlokalisierung von Proteinen gemäß der Erfindung sowie für die Überwachung bzw. Verfolgung der Synthese solcher Proteine, beispielsweise in rekombinanten Organismen, und zur Identifizierung von Verbindungen, welche mit dem Protein gemäß der Erfindung wechselwirken, verwendet werden. Zum Beispiel kann Oberflächen-Plasmon-Resonanz, wie genutzt im BIAcore-System, verwendet werden, um die Effizienz von Phagen-Antikörper-Selektionen zu erhöhen, wodurch ein hoher Zuwachs an Affinität aus einer einzelnen Bibliothek von Phagen-Antikörpern erzielt wird, welche an ein Epitop des Proteins der Erfindung binden (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7, 97 (1996); Malmborg, J. Immunol. Methods 183, 7 (1995)). In vielen Fällen ist das Bindungs-Phänomen von Antikörpern an Antigene äquivalent zu sonstiger Ligand/Anti-Ligand-Bindung.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Erzeugung einer transgenen Pflanzenzelle oder eines transgenen Pflanzengewebes oder einer transgenen Pflanze, welches das Einführen des Nukleinsäurekonstruktes gemäß der Erfindung, des Vektors gemäß der Erfindung oder des Nukleinsäuremoleküls gemäß der Erfindung in die Pflanze, die Pflanzenzelle oder das Pflanzengewebe umfasst.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren für die transiente Erzeugung einer transgenen Pflanzenzelle oder eines transgenen Pflanzengewebes oder einer transgenen Pflanze, welches das Einführen des Nukleinsäurekonstruktes gemäß der Erfindung, des Vektors gemäß der Erfindung, des hierin charakterisierten Nukleinsäuremoleküls, wie es im Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung enthalten ist, oder des im Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls in die Pflanze, die Pflanzenzelle oder das Pflanzengewebe umfasst, wodurch die eingeführten Nukleinsäuremoleküle, das eingeführte Nukleinsäurekonstrukt und/oder der eingeführte Vektor nicht in das Genom des Wirtes oder der Wirtszelle integriert wird bzw. werden. Deshalb sind die Transformanten während der Vermehrung des Wirtes in Bezug auf die eingeführten Nukleinsäuremoleküle, das eingeführte Nukleinsäurekonstrukt und/oder den eingeführten Vektor nicht stabil.
Im Verfahren gemäß der Erfindung versteht es sich, dass transgene Organismen ebenfalls – wenn sie die Form von Pflanzen annehmen – Pflanzenzellen, Pflanzen gewebe, Pflanzenorgane, wie Wurzel, Schössling bzw. Spross, Stängel bzw. Stamm, Samen, Blüte, Knolle oder Blatt, oder intakte Pflanzen, welche herangezüchtet werden, bedeuten.
”Heranzüchten” ist so zu verstehen, dass es zum Beispiel das Kultivieren der transgenen Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenorgane auf oder in einem Nährstoffmedium oder der intakten Pflanze auf oder in einem Substrat, beispielsweise in Hydrokultur, Blumentopfkompost, auf einem Feldboden oder auf den betreffenden N-defizienten Analogen davon bedeutet.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrenskönnen Nukleinsäuremoleküle in Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (zum Beispiel Spermatophyten, wie etwa Nutzpflanzen) exprimiert werden. Beispiele von Pflanzenexpressionsvektoren beinhalten diejenigen, welche hierin oder in: Becker, D. (Plant Mol. Biol. 20, 1195 (1992) ) und Bevan, M. W. (Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984); Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38) ausführlich beschrieben sind. Ein Überblick über binäre Vektoren und ihre Verwendung findet sich auch in Hellens, R. ((Trends in Plant Science 5 (10), 446 (2000)).
Vektor-DNA kann durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken in Zellen eingebracht werden. Die Begriffe ”Transformation” und ”Transfektion” schließen Konjugation und Transduktion ein, und beinhalten, wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet, beabsichtigtermaßen eine Vielzahl von Verfahren des Stands der Technik zum Einbringen von Fremd-Nukleinsäuremolekülen (zum Beispiel DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat-Copräzipitation oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, PEG-vermittelter Transfektion, Lipofektion, natürlicher Kompetenz, chemisch vermitteltem Transfer, Elektroporation oder Teilchenbeschuss. Geeignete Verfahren für die Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich pflanzlichen Zellen, können in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) sowie in anderen Laboratoriums-Handbüchern, wie etwa Methods in Molecular Biology, 1995, Band 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, gefunden werden.
Die oben beschriebenen Verfahren für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen werden für eine transiente oder stabile Transformation von Pflanzen benutzt. Geeignete Verfahren sind die Transformation von Protoplasten durch Polyethylenglycol-induzierte DNA-Aufnahme, das Biolistik-Verfahren mit der Genkanone – bekannt als Teilchenbeschussverfahren – Elektroporation, die Inkubation von trockenen Embryonen in DNA-enthaltener Lösung, Mikroinjektion und der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer. Die oben genannten Verfahren sind beispielsweise in Jenes, B., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von Kung, S. D., and Wu, R., Academic Press (1993) 128–143, und in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991), beschrieben. Das zu exprimierende Konstrukt wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der für das Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in der bekannten Weise für die Transformation von Pflanzen, insbesondere Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, verwendet werden, beispielsweise durch Baden von geritzten Blättern oder Blattsegmenten in einer agrobakteriellen Lösung und anschließendes Kultivieren derselbigen in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens ist beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. 16, 9877 (1988), beschrieben oder unter anderem aus White F. F., Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von Kung, S. D. und Wu, R., Academic Press, 1993, S. 15–38, bekannt.
Um hinsichtlich des erfolgreichen Transfers eines Nukleinsäuremoleküls, Vektors oder Nukleinsäurekonstruktes in einen Wirtsorganismus zu selektieren, ist es vorteilhaft, Markergene zu verwenden, wie sie bereits oben ausführlich beschrieben wurden. Von der stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen weiß man, dass nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt, und, falls gewünscht, in ihr Genom integriert, abhängig vom verwendeten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird üblicherweise ein Gen, codierend für einen selektierbaren Marker (wie oben beschrieben, beispielsweise Resistenz gegen Antibiotika) gemeinsam mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker in Pflanzen umfassen diejenigen, welche Resistenz gegen ein Herbizid, wie Glyphosat oder Gluphosinat, vermitteln. Andere geeignete Marker sind beispielsweise Marker, welche Gene codieren, die in Biosynthesewegen von zum Beispiel Zuckern oder Aminosäuren beteiligt sind, wie etwa β-Galactosidase, ura3 oder ilv2. Marker, welche Gene, wie Luciferase, gfp oder andere Fluoreszenzgene, codieren, sind in gleicher Weise geeignet. Diese Marker und die vorangehend erwähnten Marker können in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene nicht funktional sind, da sie zum Beispiel durch herkömmliche Verfahren deletiert wurden. Ferner können Nukleinsäuremoleküle, welche einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor wie diejenigen, welche das im Verfahren verwendete Nukleinsäuremolekül codieren, oder aber in einem separaten Vektor, in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche mit dem eingebrachten Nukleinsäuremolekül stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (wobei zum Beispiel Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, überleben, während die anderen Zellen absterben).
Da die Markergene, in der Regel besonders das Resistenzgen gegen Antibiotika und Herbizide, nicht länger in der transgenen Wirtszelle erforderlich sind oder sogar unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das Verfahren gemäß der Erfindung zum Einbringen der Nukleinsäuren vorteilhafterweise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Eine derartige Technik ist als sogenannte Cotransformation bekannt. Das Cotransformationsverfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die Nukleinsäure oder das Nukleinsäurekonstrukt gemäß der Erfindung trägt und ein zweiter Vektor die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil der Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% der Transformanten und mehr) beide Vektoren. Die Markergene können anschließend durch Ausführung von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein konditioneller Marker verwendet, der sowohl positive als auch negative Selektion erlaubt, um zuerst das Transformationsereignis durch die Positivselektion zu identifizieren und später die Identifizierung von Linien, welche den Marker durch Kreuzung oder Segregation verloren haben, durch Negativselektion zu gestatten. Marker, welche Resistenz gegen D-Aminosäuren vermitteln, sind bevorzugte derartige konditionelle Marker (Erikson et al., Nature Biotech 22 (4), 455 (2004)). In einem anderen Verfahren werden Markergene, die in ein Transposon integriert sind, für die Transformation zusammen mit gewünschter Nukleinsäure verwendet (was als die Ac/Ds-Technologie bekannt ist). In einigen Fällen (ungefähr 10%) springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen. muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen eliminiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche den Nachweis derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen, deren Vorteil darin besteht, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/lox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen der loxP-Sequenz(en) lokalisierten Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen der loxP-Sequenz integriert ist, wird es, nachdem die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, durch Expression der Rekombinase entfernt. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 22255 (2000); Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 553 (2000)). Eine ortsspezifische Integration der Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
Mit einem Expressionsvektor gemäß der Erfindung transformierte Agrobakterien können auch in einer an sich bekannten Weise für die Transformation von Pflanzen, wie etwa Versuchspflanzen, wie Arabidopsis, oder Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Cano la, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Paprikaschoten, Ölsamenraps, Tapioca, Maniokstrauch bzw. Cassava, Pfeilwurz, Studentenblume bzw. Tagetes, Alfalfa, Kopfsalat und die verschiedenen Baum-, Nuss-, Baumwoll- und Weinstockarten, insbesondere von ölhaltigen Nutzpflanzen, wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Ölsamenraps, Kokusnuss, Ölpalme, Saflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohnen, verwendet werden, zum Beispiel indem man angeritzte Blätter oder Blattsegmente in einer Agrobakterienlösung badet und sie anschließend in geeigneten Medien kultiviert.
Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es auch möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen, und im Besonderen diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, was zur Entstehung von transgenen Pflanzen führt. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und es werden Samen aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von denen ein bestimmter Anteil transformiert und somit transgen ist (Feldman K. A. und Marks M. D., Mol. Gen. Genet. 208, 274 (1987); Feldmann K., in Koncz, C., Chua, N-H., und Shell, J., Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289 (1992)). Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Blütenstände und Inkubation der Exzisionsstelle in der Mitte der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch transformierte Samen gleichermaßen zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang, Plant J. 5, 551 (1994); Katavic, Mol. Gen. Genet. 245, 363 (1994)). Ein besonders wirksames Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie etwa das ”Floral dip”-Verfahren. Im Fall der Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt (Bechthold, N., C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316 1194 (1993)), wohingegen im Fall des ”Floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer Detergenz-behandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird (Clough, S. J., und Bent, A. F., The Plant J. 16, 735 (1998)). Ein gewisser Anteil an transgenen Samen wird in beiden Fällen abgeerntet, und diese Samen können von nicht-transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren kann man in den oben erwähnten Veröffentlichungen von Kung, S. D., und Wu, R., Potrykus oder Höfgen und Willmitzer finden.
So betrifft die vorliegende Erfindung demgemäß auch eine Pflanzenzelle, welche das Nukleinsäurekonstrukt gemäß der Erfindung, das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung oder den Vektor gemäß der Erfindung enthält. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung daher auch eine Pflanzenzelle, welche gemäß des oben erwähnten Verfahrens zum Herstellen einer Pflanzenzelle erzeugt wurde.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung jedwede Zelle, insbesondere eine Pflanzenzelle, Pflanzengewebe oder Pflanze oder ihre Nachkommen, welche hinsichtlich eines beliebigen Nukleinsäuremoleküls oder -konstruktes, das hierin offenbart ist, transgen ist, wobei z. B. die Unterdrückung oder Reduktion des Nukleinsäuremoleküls oder die Unterdrückung oder Reduktion der Aktivität seines Genprodukts den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze herbeiführt.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung jedwede Zelle, transgen hinsichtlich eines beliebigen Nukleinsäuremoleküls, umfassend das Nukleinsäuremolekül oder einen Teil davon, dessen Aktivität reduziert werden soll, oder codierend das Polypeptid, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, das Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung, das Antisense-Molekül der Erfindung, den Vektor der Erfindung oder ein Nukleinsäuremolekül, codierend das Polypeptid der Erfindung, z. B. codierend ein Polypeptid, das die Aktivität des Proteins der Erfindung besitzt.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung jedwede Zelle, welche transgen ist hinsichtlich des Vektors, der Wirtszelle, des Polypeptids oder des Antisense, der RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, des Cosuppressionskonstruktes, des Rekombinationskonstruktes oder des Ribozymmoleküls, oder des viralen Nukleinsäuremoleküls, des Antikörpers der Erfindung, z. B. hinsichtlich des Vektors, der Wirtszelle, des Polypeptids, oder des Antisense-, RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, des Cosuppressionskonstruktes, Rekombinationskonstruktes oder Ribozymmoleküls, oder des viralen Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Fragment des hierin offenbarten Nukleinsäuremoleküls, wobei der Antikörper an ein Epitop des hierin offenbarten Polypeptids bindet.
Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des Promotors des Proteins mit dem entsprechenden Gen, welches das Protein von Interesse codiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn sie durch nicht-natürliche, synthetische ”künstliche” Verfahren, wie zum Beispiel Mutagensierung, modifiziert wird. Derartige Verfahren sind beschrieben worden ( US 5 565 350 ; WO 00/15815 ; gleichfalls siehe oben).
Ferner kann die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe oder die Pflanze auch so transformiert sein bzw. werden, dass weitere Enzyme und Proteine (über)exprimiert oder reprimiert oder reduziert werden, zum Unterstützen eines erhöhten Ertrags, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze.
Im Hinblick auf jedwede Nukleinsäuresequenz, ein Nukleinsäurekonstrukt, das die Nukleinsäuresequenz enthält, oder einen Organismus (= transgener Organismus), welcher mit der Nukleinsäuresequenz oder dem Nukleinsäurekonstrukt transformiert ist, bedeutet ”Transgen” alle diejenigen Konstrukte, welche durch Verfahren der genetischen Manipulation erzeugt wurden, und in welchen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenz oder ein Derivat davon, oder
(b) ein genetisches regulatorisches Element, zum Beispiel ein Promotor, welcher funktionstüchtig mit der Nukleinsäuresequenz oder einem Derivat davon verbunden ist, oder
(c) (a) und (b)

”Natürliche genetische Umgebung” bedeutet den natürlichen chromosomalen Locus bzw. Genort im Ursprungsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise wenigstens noch zum Teil bewahrt. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz mindestens auf einer Seite und besitzt eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, vorzugsweise mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, sehr stark bevorzugt mindestens 5000 bp.
Allerdings bedeutet transgen ebenfalls, dass die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an ihrer natürlichen Position im Genom eines Organismus lokalisiert sind, aber dass die Sequenz im Vergleich zur natürlichen Sequenz modifiziert worden ist, und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Vorzugsweise versteht es sich, dass transgen/rekombinant die Expression der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an einer nicht-natürlichen Position im Genom bedeutet, was heißt, dass die Expression der Nukleinsäuren homolog oder vorzugsweise heterolog ist. Diese Expression kann transient oder von einer stabil in das Genom integrierten Sequenz aus erfolgen.
Die Verwendung der hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenz im Verfahren der Erfindung oder des Nukleinsäurekonstruktes oder einer anderen Ausführungsform gemäß dieser Erfindung zur Erzeugung von transgenen Pflanzen ist deshalb ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Der gemäß der Erfindung verwendete Begriff ”transgene Pflanzen” bezieht sich auf die Nachkommenschaft einer transgenen Pflanze, zum Beispiel die T1, T2, T3 und anschließenden Pflanzengenerationen oder die BC1, BC2, BC3 und anschließenden Pflanzengenerationen. Somit können die transgenen Pflanzen gemäß der Erfindung aufgezogen bzw. kultiviert und geselbstet oder mit anderen Individuen gekreuzt werden, um weitere transgene Pflanzen gemäß der Erfindung zu erhalten. Transgene Pflanzen können ebenfalls erhalten werden, indem man transgene Pflanzenzellen vegetativ vermehrt. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem transgenes Pflanzenmaterial, welches aus einer transgenen Pflanzenpopulation gemäß der Erfindung abgeleitet werden kann. Derartiges Material umfasst Pflanzenzellen und bestimmte Gewebe, Organe und Teile von Pflanzen in allen ihren Ausprägungen, wie etwa Samen, Blätter, Antheren, Fasern, Knollen, Wurzeln, Wurzelhaare, Stängel bzw. Halme, Embryo, Kalli, Kotyledonen, Petiolen, abgeerntetes Material, Pflanzengewebe, Fortpflanzungsgewebe und Zellkulturen, welche aus der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet sind und/oder zum Hervorbringen der transgenen Pflanze verwendet werden können.
Jedwede gemäß der Erfindung erhaltene transformierte Pflanze kann in einem herkömmlichen Züchtungsschema oder in einer In-vitro-Pflanzenvermehrung verwendet werden, um mehr transformierte Pflanzen mit den gleichen Charakteristika herzustellen, und/oder kann verwendet werden, um das gleiche Charakteristikum in anderen Varietäten derselben oder einer verwandten Spezies einzuführen. Derartige Pflanzen sind ebenfalls Teil der Erfindung. Aus den transformierten Pflanzen erhaltene Samen umfassen genetisch ebenfalls dasselbe Charakteristikum und sind Teil der Erfindung. Wie zuvor erwähnt, ist die vorliegende Erfindung im Prinzip auf eine beliebige Pflanze und Nutzpflanze anwendbar, welche mit einem Beliebigen der Transformationsverfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, transformiert werden kann. In einer spezifischen Ausführungsform wird die Nukleinsäure oder das Polypeptid, dessen Aktivität gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert wird, in einer transformierbaren Nutzpflanzenvarietät mutiert oder anderweitig hinsichtlich seiner Aktivität reduziert. Die Gene oder die mutierte Version der Nukleinsäure oder des Polypeptids, welche die Reduktion herbeiführt, werden später auf eine (wirtschaftlich bedeutsame) Elite-Nutzpflanzenvarietät übertragen, beispielsweise durch (Marker-unterstützte) Kreuzung, wodurch die mutierte oder anderweitig reduzierte Version der Nukleinsäure oder des Polypeptids der Erfindung die ursprüngliche oder native und aktive Version ersetzt oder unterdrückt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Organismus, die Wirtszelle, Pflanzenzelle, Pflanze oder das Pflanzengewebe gemäß der Erfindung transgen.
Folglich betrifft die Erfindung daher transgene Organismen, die mit mindestens einem hierin offenbarten Nukleinsäuremolekül, z. B. dem Antisense, der RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, dem Cosuppressionskonstrukt, dem Rekombinationskonstrukt oder Ribozymmolekül oder dem viralen Nukleinsäuremolekül, Nukleinsäurekonstrukt oder Vektor gemäß der Erfindung, transformiert sind, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile – wie beispielsweise im Fall von Pflanzenorganismen, Pflanzengewebe, zum Beispiel Blätter, Wurzeln und dergleichen – oder aus derartigen Organismen abgeleitetes Fortpflanzungsmaterial oder intakte Pflanzen.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung auch Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile – wie zum Beispiel im Fall von Pflanzenorganismen, Pflanzengewebe, beispielsweise Blätter, Wurzeln und dergleichen – oder aus derartigen Organismen abgeleitetes Fortpflanzungsmaterial oder intakte Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhter Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhter Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile – wie zum Beispiel im Fall von Pflanzenorganismen, Pflanzengewebe, beispielsweise Blätter, Wurzeln und dergleichen – oder aus derartigen Organismen abgeleitetes Fortpflanzungsmaterial oder intakte Pflanzen, welche reduzierte oder deletierte Aktivität aufweisen, die aus der Gruppe gewählt wird, bestehend aus: At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und/oder die SET-Domäne enthaltendem Protein.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung außerdem Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile – wie zum Beispiel im Fall von Pflanzenorganismen, Pflanzengewebe, beispielsweise Blätter, Wurzeln und dergleichen – oder aus derartigen Organismen abgeleitetes Fortpflanzungsmaterial, oder intakte Pflanzen, umfassend eine reduzierte Aktivität oder Expression eines Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, welches gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung im Besonderen Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile – wie beispielsweise im Fall von Pflanzenorganismen, Pflanzengewebe, beispielsweise Blätter, Wurzeln und dergleichen – oder aus derartigen Organismen abgeleitetes Fortpflanzungsmaterial oder intakte Pflanzen, umfassend eine reduzierte Aktivität oder Expression von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine reduzierte Aktivität oder Expression eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, aufgeführt.
Die Begriffe ”rekombinanter (Wirt)” und ”transgener (Wirt)” werden in diesem Zusammenhang austauschbar verwendet. Selbstverständlich beziehen sich diese Begriffe nicht nur auf den Wirtsorganismus oder die Zielzelle in Frage, sondern auch auf die Nachkommenschaft oder potenzielle Nachkommenschaft dieser Organismen oder Zellen. Da bestimmte Modifikationen in anschließenden Generationen aufgrund von Mutationen oder Umwelteffekten auftreten können, ist eine derartige Nachkommenschaft nicht notwendigerweise identisch mit der Stammformzelle, aber liegt immer noch innerhalb des Umfanges des Begriffes, wie er hierin verwendet wird.
Geeignete Organismen für das Verfahren gemäß der Erfindung oder als Wirte sind diejenigen, wie sie oben offenbart sind. Die als Wirte verwendeten Organismen sind Mikroorganismen, wie Bakterien, Pilze, Hefen oder Algen, oder Pflanzen, wie etwa dikotyledone oder monokotyledone Pflanzen.
Im Prinzip können alle Pflanzen als Wirtsorganismen verwendet werden, speziell die oben als Quellorganismus erwähnten Pflanzen. Bevorzugte transgene Pflanzen sind zum Beispiel ausgewählt aus den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae, und vorzugsweise aus einer Pflanze, gewählt aus der Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae. Bevorzugt werden Nutzpflanzen, wie etwa Pflanzen, die in vorteilhafter Weise ausgewählt werden aus der Gruppe der Gattung Erdnuss, Ölsamenraps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Olive, Sesam, Haselnuss, Mandel, Avocado, Lorbeer, Gartenkürbis/Kürbis, Leinsamen, Soja, Pistazie, Borretsch, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Sorghum und Hirse, Triticale, Reis, Gerste, Cassava bzw. Maniokstrauch, Kartoffel, Zuckerrübe, Aubergine, Alfalfa und winterharten Gräsern und Viehfutterpflanzen, Ölpalme, Gemüsepflanzen (Kohlarten, Wurzelgemüse, Knollengemüse, Bohnengemüse bzw. Hülsenfrüchte, Fruchtgemüse, Zwiebelgemüse, Blattgemüse und Stängelgemüse), Buchweizen, Jerusalm-Artischocke, Saubohne, Wicken, Linse, Buschbohne, Lupine, Klee und Luzerne, um nur einige von ihnen zu nennen.
Bevorzugte Pflanzenzellen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe oder Teile von Pflanzen stammen von den, unter ”Quellorganismus” erwähnten, Pflanzenfamilien, vorzugsweise aus den oben erwähnten Pflanzengattungen, weiter bevorzugt aus den oben erwähnten Pflanzenspezies.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind Pflanzenzellen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe oder Teile von Pflanzen aus der Gruppe gewählt, umfassend Mais, Soja, Ölsamenraps (einschließlich Canola- und Winterölsamenraps), Baumwolle, Weizen und Reis.
Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung ist eine Zusammensetzung, umfassend das Protein der Erfindung, das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, das Polypeptid der Erfindung, das Nukleinsäurekonstrukt oder den Vektor der Erfindung, den Antagonisten der Erfindung, den Antikörper der Erfindung und gegebenenfalls einen landwirtschaftlich annehmbaren Träger.
In noch einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung außerdem die erntefähigen Teile und Fortpflanzungsmaterial der transgenen Pflanzen gemäß der Erfindung, welche/welches entweder transgene Pflanzenzellen, die ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung exprimieren, enthalten oder welche/welches Zellen, die eine reduzierte, unterdrückte, verringerte oder deletierte zelluläre Aktivität aufzeigen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und/oder SET-Domäne-enthaltendes Protein, enthalten, z. B. welche/welches eine reduzierte, unterdrückte, verringerte oder deletierte Aktivität des Polypeptids oder des Nukleinsäuremoleküls, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, insbesondere eine reduzierte oder deletierte Aktivität eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IIB, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder eines Genproduktes eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend das Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, vorzugsweise wie aufgeführt in Tabelle IB, Anmeldung Nr. 1, zeigen.
Erntefähige Teile können im Prinzip beliebige nützliche Teile einer Pflanze sein, zum Beispiel Blüten, Pollen, Setzlinge, Knollen, Blätter, Stängel bzw. Halme, Frucht, Samen, Wurzeln etc. Das Fortpflanzungsmaterial beinhaltet zum Beispiel Samen, Früchte, Stecklinge, Setzlinge, Knollen, Wurzelstöcke etc. Bevorzugt sind Samen, Setzlinge, Knollen oder Früchte als das erntefähige Material oder Fortpflanzungsmaterial.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Genproduktes, das einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine er höhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze herbeiführt, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Inkontaktbringen, z. B. Hybridisieren, des einen, einiger oder aller Nukleinsäuremoleküle einer Probe, z. B. Zellen, Gewebe, Pflanzen oder Mikroorganismen oder einer Nukleinsäurebibliothek, welche ein Kandidatengen enthalten kann, codierend ein Genprodukt, das einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, nach Reduktion oder Deletion seiner Expression herbeiführt, mit einem Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, Anmeldung Nr. 1, oder einem funktionellen Homolog davon;
(b) Identifizieren der Nukleinsäuremoleküle, welche unter gelockerten stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül hybridisieren, insbesondere an die Nukleinsäuremolekülsequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, und gegebenenfalls isolieren des Volllängen-cDNA-Klons oder vollständigen genomischen Klons;
(c) Identifizieren des Kandidaten-Nukleinsäuremoleküls oder eines Fragmentes davon in Wirtszellen, vorzugsweise in einer Pflanzenzelle;
(d) Reduzieren oder Deletieren der Expression der identifizierten Nukleinsuremoleküle in den Wirtszellen;
(e) Assay der Höhe des/der gesteigerten Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, in den Wirtszellen; und
(f) Identifizieren des Nukleinsäuremoleküls und seines Genproduktes, dessen Reduktion oder Deletion, in Bezug auf Expression, einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, in der Wirtszelle nach Expression, verglichen zum Wildtyp, herbeiführt.

Gelockerte Hybridisierungsbedingungen sind: Nach standardmäßigen Hybridisierungs-Prozeduren können Waschschritte bei niedrigen bis mittleren Stringenzbedingungen üblicherweise mit Waschbedingungen von 40°–55°C und Salzbedingungen zwischen 2 × SSC und 0,2 × SSC mit 0,1% SDS, im Vergleich zu stringenten Waschbedingungen wie z. B. 60° bis 68°C mit 0,1% SDS durchgeführt werden. Weitere Beispiele können in den oben aufgeführten Bezugsstellen für die stringenten Hybridisierungsbedingungen gefunden werden. Üblicherweise werden Waschschritte mit steigender Stringenz und Länge wiederholt, bis ein brauchbares Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis nachgewiesen wird, und hängen von vielen Faktoren ab, wie dem Ziel, z. B. dessen Reinheit, GC-Gehalt, Größe, etc., der Sonde, z. B. deren Länge, ob es sich um eine RNA- oder eine DNA-Sonde handelt, den Salzbedingungen, der Wasch- oder Hybridisierungstemperatur, der Wasch- oder Hybridisierungszeit, etc.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Genproduktes, dessen Reduktion einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze herbeiführt, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Identifizieren eines Nukleinsäuremoleküls in einem Organismus, welches mindestens 20%, vorzugsweise 25%, weiter bevorzugt 30%, noch weiter bevorzugt sind 35%, 40% oder 50%, noch weiter bevorzugt sind 60%, 70% oder 80%, am stärksten bevorzugt sind 90% oder 95% oder mehr, homolog zu dem Nukleinsäuremolekül ist, codierend ein Protein, umfassend das Polypeptidmolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder ein Homolog davon, wie hierin beschrieben, beispielsweise durch Homologiesuche in einer Datenbank;
(b) Unterdrücken, Reduzieren oder Deletieren der Expression der identifizierten Nukleinsäuremoleküle in den Wirtszellen;
(c) Assay der Höhe des/der gesteigerten Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze; und
(d) Identifizieren der Wirtszelle, in der das Unterdrücken, Reduzieren oder Deletieren des Nukleinsäuremoleküls oder seines Genproduktes einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze herbeiführt.

In einer anderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Genproduktes, dessen Reduktion einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffi zienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze herbeiführt, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Vorsehen eines Organismus oder von Wirtszellen gemäß der Erfindung, in denen ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein das Polypeptid umfassendes Protein, inaktiviert, deletiert oder anderweitig hinsichtlich seiner Aktivität reduziert wurde;
(b) Transformieren des Organismus mit einer cDNA-Expressions- oder einer genomischen Bibliothek oder einer beliebigen anderen Nukleinsäurebibliothek, fähig zum effizienten Exprimieren der beinhalteten Nukleinsäuresequenz,
(c) Assayen der Höhe des gesteigerten Ertrags, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze; und
(d) Identifizieren der Wirtszelle, in der die eingebrachte Nukleinsäuresequenz den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, aufhebt bzw. umkehrt, wodurch die Wildtypsituation wieder hergestellt wird.

In einer Ausführungsform können die verschiedenen Verfahren zum Identifizieren eines Genproduktes, dessen Reduktion zu einem erhöhten Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhten Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, führt, in beliebiger Kombination kombiniert werden, um das Verfahren zu optimieren.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ein Verfahren für die Identifizierung einer Verbindung, welche den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, bei besagter Pflanze stimuliert, umfassend:

a) Inkontaktbringen von Zellen, welche das Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder ein Homolog davon, wie hierin beschrieben, oder dessen mRNA, exprimieren, mit einer Kandidatenverbindung unter Zellkulturbedingungen;
b) Assay hinsichtlich einer Reduktion, Verringerung oder Deletion der Expression des Polypeptids oder der mRNA;
c) Vergleichen des Expressionsspiegels zu einer Standardantwort, welche in Abwesenheit der Kandidatenverbindung abgegeben wird; wobei eine reduzierte, verringerte oder deletierte Expression gegenüber dem Standard zeigt, dass die Verbindung den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, stimuliert.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ein Verfahren zum Screening nach Antagonisten der Aktivität des Polypeptids, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, wie hierin beschrieben, z. B. eines Polypeptids, herbeiführend einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze nach Verringerung seiner zellulären Aktivität, z. B. der Aktivität eines Polypeptids mit der Aktivität, repräsentiert durch das Protein oder Nukleinsäuremolekül, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, oder des Polypeptids der Erfindung, umfassend:

a) Inkontaktbringen von Zellen, Geweben, Pflanzen oder Mikroorganismen, welche das Polypeptid gemäß der Erfindung exprimieren, mit einer Kandidatenverbindung oder einer Probe, welche eine Vielzahl an Verbindungen enthält, unter Bedingungen, welche die Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung erlauben;
b) Assay hinsichtlich der gesteigerten Ertragshöhe, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder Biomasseproduktion oder der Polypeptidexpressionshöhe, in der Zelle, dem Gewebe, der Pflanze oder dem Mikroorganismus oder dem Medium, in welchem die Zelle, das Gewebe, die Pflanze oder Mikroorganismen kultiviert oder gehalten werden; und
c) Identifizieren eines Antagonisten durch Vergleichen der gemessenen Höhe des gesteigernten Ertrags, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder Biomasseproduktion oder Polypeptidexpressionshöhe, mit einem standardmäßigen Ertrag, insbesondere einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder Biomasseproduktion oder Polypeptidexpressionshöhe, gemessen in Abwesenheit der Kandidatenverbindung oder einer Probe, welche die Vielzahl an Verbindungen enthält, wobei eine verbesserte Höhe des Ertrags, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder Biomasseproduktion, gegenüber dem Standard zeigt, dass die Verbindung oder die Probe, welche die Vielzahl an Verbindungen enthält, ein Antagonist ist.

Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, herbeiführend erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, in einer Pflanze, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Kultivieren oder Halten einer pflanzlichen oder tierischen Zelle oder ihrer Gewebe oder eines Mikroorganismus, exprimierend ein Polypeptid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder ein Homolog davon, wie hierin beschrieben, oder ein Polynukleotid, codierend das Polypeptid, und Bereitstellen eines Ablesungssystems, das zur Wechselwirkung mit dem Polypeptid unter geeigneten Bedingungen fähig ist, welche die Interaktion des Polypeptids mit diesem Ablesungssystem in Gegenwart einer chemischen Verbindung oder einer Probe, welche eine Vielzahl chemischer Verbindungen enthält, gestatten, und das zur Abgabe eines nachweisbaren Signals in Antwort auf die Bindung einer chemischen Verbindung an das Polypeptid unter Bedingungen fähig ist, welche die Depression des Ablesungssystems und des Proteins, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder eines Homologen davon, wie hierin beschrieben, erlauben; und
b) Feststellen, ob die chemische Verbindung ein effektiver Antagonist ist, durch Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit oder Verringerung oder Erhöhung eines von dem Ablesungssystem erzeugten Signals.

Die Verbindung kann chemisch synthetisiert oder mikrobiologisch hergestellt und/oder beispielsweise in Proben enthalten sein, z. B. Zellextrakten aus z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen, z. B. Pathogenen. Ferner kann die Verbindung(en) im Fachgebiet bekannt sein, wobei von ihr jedoch bislang nicht bekannt war, dass sie fähig zum Unterdrücken des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ist. Die Reaktionsmischung kann ein zellfreier Extrakt sein oder kann eine Zell- oder Gewebekultur umfassen. Geeignete Ansätze bzw. Einrichtungen für das Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung der Erfindung sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind zum Beispiel allgemein in Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, dritte Auflage (1994), insbesondere Kapitel 17, beschrieben. Die Verbindungen können z. B. der Reaktionsmischung, dem Kulturmedium, zugesetzt werden, in die Zelle injiziert werden oder auf die Pflanze aufgesprüht werden.
Wenn eine Probe, welche eine Verbindung enthält, in dem Verfahren identifiziert wird, dann ist es entweder möglich, dass man die Verbindung aus der Ursprungsprobe isoliert, von der ermittelt wurde, dass sie die Verbindung enthält, die zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere eine ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder die Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze fähig ist, oder man kann die Ursprungsprobe weiter aufteilen, wenn sie zum Beispiel aus einer Vielzahl verschiedener Verbindungen besteht, sodass die Anzahl verschiedener Substanzen je Probe verringert wird, und das Verfahren mit den Unterteilungen der Ursprungsprobe wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Proben können die oben beschriebenen Schritte mehrmals durchgeführt werden, vorzugsweise bis die gemäß dem Verfahren identifizierte Probe nur eine beschränkte Anzahl an Substanzen oder nur noch eine Substanz enthält. Vorzugsweise enthält die Probe Substanzen mit ähnlichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften, und am stärksten bevorzugt sind die Substanzen identisch. Vorzugsweise wird die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren identifizierte Verbindung, oder ihr Derivat, ferner in einer Form aufbereitet, die für die Anwendung in der Pflanzenzucht oder der Pflanzenzell- und Gewebekultur von Pflanzen geeignet ist.
Die Verbindungen, welche gemäß dem Verfahren getestet und identifiziert werden können, können Expressionsbibliotheken, z. B. cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Hormone, Peptidomimetika, PNAs oder dergleichen sein (Milner, Nature Medicine 1 879 (1995); Hupp, Cell 83, 237 (1995); Gibbs, Cell 79, 193 (1994), und oben zitierte Bezugsstellen bzw. Referenzen). Die Verbindungen können außerdem funktionale Derivate oder Analoga von bekannten Inhibitoren oder Aktivatoren sein. Verfahren zur Herstellung von chemischen Derivaten und Analogen sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und werden beispielsweise beschrieben in Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer-Ausgabe, New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010 U. S. A., und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Ferner können die Derivate und Analoge hinsichtlich ihrer Effekte gemäß im Fachgebiet bekannten Verfahren getestet werden. Darüber hinaus können Peptidomimetika und/oder computerunterstütztes Design von passenden Derivaten und Analogen, zum Beispiel gemäß der oben beschriebenen Verfahren, eingesetzt werden. Die Zelle oder das Gewebe, welches im Verfahren verwendet werden kann, ist vorzugsweise eine Wirtszelle, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe der Erfindung, welche(s) in den Ausführungsformen hierin oben beschrieben ist.
Somit betrifft die Erfindung, in einer weiteren Ausführungsform, eine Verbindung, erhalten oder identifiziert gemäß dem Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten der Erfindung, wobei die Verbindung ein Antagonist des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ist.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ferner eine Verbindung, identifiziert durch das Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung der vorliegenden Erfindung.
Die Verbindung ist beispielsweise ein antagonistisches Homolog des Polypeptids der vorliegenden Erfindung. Antagonistische Homologe des Polypeptids, welches im Verfahren der vorliegenden Erfindung reduziert werden soll, können durch Mutagenese erzeugt werden, z. B. eine diskrete Punktmutation oder eine Trunkierung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ”antagonistisches Homolog” auf eine Variantenform des Proteins, welche als ein Antagonist der Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung wirkt. Ein Antagonist eines Proteins, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, oder einem Homolog davon, wie hierin beschrieben, hat wenigstens teilweise die biologischen Aktivitäten des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verloren. Im Besonderen vermittelt der Antagonist eine Verringerung des Expressionsspiegels des Polypeptids, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anmeldung Nr. 1, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder einem Homolog davon, wie hierin beschrieben, und dadurch vermittelt die Expression des Antagonisten in einem Organismus oder einem Teil davon den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze. Ein typischer Antagonist in diesem Sinn wäre eine dominant-negative Version des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, zum Beispiel ein Protein, welches immer noch an einem Proteinkomplex partizipieren kann, aber nicht länger seine ursprüngliche biologische, zum Beispiel enzymatische, Funktion erfüllen kann, wodurch der ganze Komplex nahezu inaktiviert wird.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Antikörper, welcher die Verbindung oder den Antagonisten der vorliegenden Erfindung spezifisch erkennt.
Die Erfindung betrifft außerdem eine diagnostische Zusammensetzung, die mindestens eines aus den zuvor erwähnten Nukleinsäuremolekülen, Antisense-Nukleinsäuremolekül, RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Cosuppressionsmolekül, Ribozym, Vektoren, Proteinen, Antikörpern oder Verbindungen der Erfindung, und gegebenenfalls geeignete Nachweismittel umfasst.
Die diagnostische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist für die Isolierung von mRNA aus einer Zelle und das Inkontaktbringen der so erhaltenen mRNA mit einer Sonde, einschließlich einer Nukleinsäuresonde, wie oben beschrieben, unter Hybridisierungsbedingungen, das Nachweisen der Gegenwart von an die Sonde hybridisierter mRNA, und dadurch das Nachweisen der Expression des Proteins in der Zelle geeignet. Weitere Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen im Fachgebiet allgemein bekannte Immuntechniken, zum Beispiel den Enzyme-Linked-Immunoadsorbent-Assay. Ferner ist es möglich, die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung als molekulare Marker oder Primer in der Pflanzenzucht zu verwenden. Geeignete Mittel bzw. Methoden zum Nachweis sind einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt, z. B. Puffer und Lösungen für Hybridisierungs-Assays, z. B. die oben erwähnten Lösungen und Puffer, und fernerhin sind Mittel für Southern-, Western-, Northern- etc. -Blots, wie z. B. beschrieben in Sambrook et al., bekannt. In einer Ausführungsform enthält die diagnostische Zusammensetzung PCR-Primer, entworfen zum spezifischen Nachweisen der Gegenwart oder der Expressionshöhe des Nukleinsäuremoleküls, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, oder zum Unterscheiden zwischen verschiedenen Varianten oder Allelen des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, oder desjenigen, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, welches das Nukleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle, das Polypeptid, oder den Antisense, die RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, das Cosuppressionsmolekül oder Ribozymmolekül oder das virale Nukleinsäuremolekül, den Antikörper, die Pflanzenzelle, die Pflanze oder das Pflanzengewebe, den erntefähigen Teil, das Fortpflanzungsmaterial und/oder die Verbindung und/oder den gemäß des Verfahrens der Erfindung identifizierten Antagonist umfasst.
Die Verbindungen des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behältern, wie Gefäßen, gegebenenfalls mit/in Puffern und/oder Lösung, verpackt sein. Geeignetenfalls könnten eine oder mehrere der Komponenten in ein und demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich dazu oder alternativ dazu könnten eine oder mehrere der Komponenten an einem festen Träger, wie z. B. einem Nitrozellulosefilter, einer Glasplatte, einem Chip oder einer Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotitterplatte, absorbiert sein. Das Kit kann für ein Beliebiges aus den hierin beschriebenen Verfahren und Ausführungsformen, z. B. für die Herstellung der Wirtszellen, transgenen Pflanzen, pharmazeutischen Zusammensetzungen, den Nachweis von homologen Sequenzen, die Identifizierung von Antagonisten oder Agonisten, als Nahrungsmittel oder Futtermittel oder als Ergänzung davon, oder als Zusatz zum Behandeln von Pflanzen, etc., zur Anwendung kommen.
Ferner kann das Kit Anweisungen für den Gebrauch des Kits für eine Beliebige der Ausführungsformen enthalten, insbesondere zur Anwendung für die Herstellung von Organismen oder eines Teiles davon mit einem erhöhten Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhten Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze.
In einer Ausführungsform umfasst das Kit ferner ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein oder mehrere von dem zuvor erwähnten Protein und/oder einen Antikörper, einen Vektor, eine Wirtszelle, eine Antisense-Nukleinsäure, eine Pflanzenzelle oder Pflanzengewebe oder eine Pflanze. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Kit PCR-Primer zum Nachweisen und Unterscheiden des Nukleinsäuremoleküls, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer landwirtschaftlichen Zusammensetzung, bereitstellend das Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß des Verfahrens der Erfindung, das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, den Vektor der Erfindung, den Antisense, die RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, das Cosuppressionsmolekül, Ribozym oder den Antikörper der Erfindung, das virale Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das Polypeptid der Erfindung, oder umfassend die Schritte des Verfahrens gemäß der Erfindung zur Identifizierung der Verbindung oder des Antagonisten; und zum Formulieren des Nukleinsäuremoleküls, des Vektors oder des Polypeptids der Erfindung oder des Antagonisten, oder der Verbindung, identifiziert gemäß den Methoden oder Verfahren der vorliegenden Erfindung oder mit Hilfe der Gegenstandssubjekte der vorliegenden Erfindung, in einer Form, welche als Zusammensetzung in der Pflanzenlandwirtschaft anwendbar ist.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer unterstützenden Pflanzenkulturzusammensetzung, welches die Schritte des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst; sowie zum Formulieren der identifizierten Verbindung in einer als landwirtschaftliche Zusammensetzung annehmbaren Form.
Unter ”annehmbar als landwirtschaftliche Zusammensetzung” versteht es sich, dass eine derartige Zusammensetzung in Übereinstimmung mit den Gesetzen steht, welche den Gehalt an Fungiziden, Pflanzennährstoffen, Herbiziden, etc., regulieren. Vorzugsweise ist eine derartige Zusammensetzung für geschützte Pflanzen sowie Tiere (einschließlich Menschen), welche diese aufnehmen, gefahrlos.
Die hierin offenbarten Nukleinsäuremoleküle, insbesondere die Nukleinsäure, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, Anmeldung Nr. 1, weisen eine Vielzahl von Anwendungen auf. Zunächst können sie zum Identifizieren eines Organismus oder eines nahen Verwandten davon verwendet werden. Des Weiteren können sie zur Ermittlung seiner Gegenwart, oder der eines Verwandten davon, in einer gemischten Population von Pflanzen eingesetzt werden. Durch Sondieren der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer einmaligen oder gemischten Population von Pflanzen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, welche eine Region des Gens der vorliegenden Erfindung überspannt, welche für diese einzigartig ist, kann man feststellen, ob die vorliegende Erfindung angewandt worden ist oder ob er oder ein naher Verwandter vorhanden ist.
Ferner kann das hierin offenbarte Nukleinsäuremolekül, insbesondere das Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, Anmeldung Nr. 1, ausreichend homolog zu den Sequenzen aus verwandten Arten sein, sodass diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte in verwandten Organismen oder für Assoziationskartierung dienen können. Außerdem kann die natürliche Variation in den genomischen Regionen, entsprechend den hierin offenbarten Nukleinsäuren, insbesondere dem Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, Anmeldung Nr. 1, oder einem Homolog davon, zu einer Variation der Aktivität der hierin offenbarten Proteine, insbesondere der Proteine, umfassend Polypeptide, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie gezeigt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, und ihrer Homologe, und in der Konsequenz zu einer natürlichen Variation führen.
Als Folge existiert eine natürliche Variation schließlich ebenfalls in Form von weniger aktiven allelischen Varianten, die bereits zu einem relativ erhöhten Ertrag, insbesondere eine gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion, führen.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Züchten von Pflanzen, umfassend:

a) Auswählen einer ersten Pflanzenvarietät mit einem erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze wegen des Reduzierens, Unterdrückens, Verringerns oder Deletierens der Expression eines Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls, dessen Aktivität im Verfahren der vorliegenden Erfindung redu ziert wird, z. B. wie hierin offenbart, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, Anmeldung Nr. 1, oder eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, wie gezeigt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B, Anmeldung Nr. 1, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, Anmeldung Nr. 1, oder ein Homolog davon, wie hierin beschrieben;
b) Assoziieren des erhöhten Ertrags, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer gesteigerten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhten Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze mit dem Expressionsspiegel bzw. der Expressionshöhe oder der Genomstruktur eines Gens, welches das Polypeptid oder das Nukleinsäuremolekül codiert;
c) Kreuzen der ersten Pflanzenvarietät mit einer zweiten Pflanzenvarietät, welche sich hinsichtlich ihres Ertrags, insbesondere ihrer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. der Stickstoffverwertungseffizienz und/oder ihrer Biomasseproduktion, signifikant unterscheidet; und
d) Feststellen, welche der Nachkommenvarietäten den erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhalten haben, und zwar mittels Analysieren der Höhe des Ertrags, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. der Stickstoffverwertungseffizienz und/oder der Biomasseproduktion oder der Expression des Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls oder der Genomstruktur der Gene, die das Polypeptid oder Nukleinsäuremolekül der Erfindung codieren.

In einer Ausführungsform ist der Expressionsspiegel des Gens gemäß Schritt (b) reduziert.
Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung sind ebenfalls nützlich für evolutionäre Untersuchungen und Untersuchungen der Proteinstruktur. Durch Vergleichen der Sequenzen, z. B. wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, mit denjenigen, welche ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren, kann die evolutionäre Verwandtschaft der Organismen eingeschätzt werden. In ähnlicher Weise gestattet ein derartiger Vergleich eine Einschätzung, welche Regionen der Sequenz konserviert sind und welche nicht, was bei der Ermittlung derjenigen Regionen des Proteins helfen kann, die für das Funktionieren des Enzyms wesentlich sind. Dieser Typ von Bestimmung ist für Proteinengineering-Untersuchungen nützlich und kann einen Hinweis darauf geben, was das Protein im Zuge einer Mutagenese tolerieren kann, ohne an Funktion zu verlieren.
Folglich kann das hierin offenbarte Nukleinsäuremolekül, z. B. das Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder ein Homolog davon für die Identifizierung anderer Nukleinsäuren verwendet werden, die einen erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze nach Reduktion, Unterdrückung, Verringerung oder Deletion ihrer Expression herbeiführen.
Wie hierin offenbart, kann z. B. das Nukleinsäuremolekül, dessen Aktivität gemäß dem Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anmeldung Nr. 1, oder ein Homolog davon, insbesondere das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder ein Fragment oder ein Gen, das die Expression des codierten Expressionsproduktes, z. B. des Polypeptids der Erfindung, vermittelt, für Marker-unterstützte Züchtung oder Assoziationskartierung des Ertrags, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder Biomasseproduktion im Zusammenhang stehenden Merkmale bzw. Erbanlagen angewandt werden.
Diese und andere Ausführungsformen werden durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung offenbart und abgedeckt bzw. umfasst.
Weiterführende Literatur in Betreff auf ein Beliebiges aus den Verfahren, Anwendungen und Verbindungen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, kann aus öffentlichen Bibliotheken, beispielsweise mit Hilfe elektronischer Gerätschaften, gefunden werden.
Zum Beispiel kann die öffentliche Datenbank ”Medline” verwendet werden, welche im Internet zu Verfügung steht, beispielsweise unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Weitere Datenbanken und Adressen, wie etwa http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research-tools.html, http://www.tigr.org/, sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, und können ebenfalls z. B. unter Verwendung von http://www.lycos.com erhalten werden. Ein Überblick über Patientinformationen in der Biotechnologie und eine Übersicht von relevanten Quellen zur Patientinformation, nützlich zur rückblickenden Suche und für den gegenwärtigen Kenntnisstand, ist in Berks, TIBTECH 12, 352 (1994), angegeben.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden Wildtyp-Pflanze, z. B. einer transgenen Pflanze, umfassend:

a) Deletieren, Reduzieren oder Unterdrücken, in einem Pflanzenzellkern, einer Pflanzenzelle oder einem Teil davon, einer oder mehrerer der Aktivitäten; und
b) Kultivieren oder Züchtung der Pflanzenzelle, der Pflanze oder des Teils davon unter Bedingungen welche die Entwicklung der Pflanzenzelle, der Pflanze oder des Teils davon, erlauben; und
c) Gewinnung einer Pflanze von dem Pflanzenzellkern, einer Pflanzenzelle, einem Pflanzenteil, welche einen erhöhten Ertrag, im Vergleich mit einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze;
d) und wahlweise, Selektieren der Pflanze oder eines Teils davon, die einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte oder verbesserte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine verbesserte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder Resistenz gegen abiotischen Stress, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, z. B. welche sichtbare Mangelsymptome aufweist und/oder Tod.

In einer weiteren Ausführungsform, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Identifizierung einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, umfassed das Screenen einer Population, bestehend aus ein oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen oder Teile davon, für die Expressionshöhe einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid codiert, welches diese Aktivität herbeiführt, wie in Tabelle I angegeben, Vergleichen des Expressionsspiegels mit einer Referenz; Identifizieren von einem oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon mit einem niedrigeren Expressionsniveau im Vergleich zu der Referenz, und wahlweise Herstellen einer Pflanze aus den identifizierten Pflanzenzellkernen, -zellen oder -geweben. In einem weiteren Schritt, kann die identifizierte Pflanze, oder der Teil davon, für ihren Ertrag, z. B. ihre ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, getestet werden. Das Verfahren kann in Teilen oder im Ganzen einmal oder mehrmals wiederholt werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für den Ertragszuwachs einer Pflanzenpopulation, umfassend das Kontrollieren der Pflanzbedingungen, z. B. Bodenstickstoffgehalt, Durchschnittstemperatur, Wasserzufuhr, im Bereich der Bepflanzung, wobei die Bedingungen mit den optimalen Bedingungen der Pflanzenart oder einer Variante, die zur Pflanzung in Betracht gezogen wird, z. B. die hierin erwähnte Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze, verglichen wird, die Pflanzung, und das Heranziehen der Pflanze der Erfindung, falls eine oder mehrere der Bedingungen, insbesondere der Bodenstickstoffgehalt, für die Pflanzung und das Heranziehen nicht optimal für die Pflanzung und das Heranziehen einer Pflanzenart, welche für die Pflanzung in Betracht gezogen wird, die nicht gemäß dem Verfahren der Erfindung erzeugt wird, z. B. für die Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze, sind.
Ferner umfasst, in einer Ausführungsform, das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Ernten der Pflanze oder eines Teils der Pflanze, hergestellt oder angepflanzt, und das Erzeugen einen Kraftstoffes mit oder aus der geernteten Pflanze oder Teile davon. Ferner umfasst, in einer Ausführungsform, das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Ernten eines Pflanzenteils, das für die Stärkeisolierung und die Isolierung von Stärke von diesem Pflanzenteil nützlich ist, wobei die Pflanze eine Pflanze ist, die für die Stärkeproduktion, z. B. Kartoffel, nützlich ist. Ferner umfasst, in einer Ausführungsform, das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Ernten eines Pflanzenteils, das für die Ölisolierung und die Isolierung von Öl von diesem Pflanzenteil nützlich ist, wobei die Pflanze eine Pflanze ist, die für die Ölproduktion, z. B. Ölsamen-Raps oder Canola, Baumwolle, Soja oder Sonnenblumen, brauchbar ist.
Zum Beispiel, in einer Ausführungsform, ist der Ölgehalt im Maissamen erhöht. Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Produktion von Pflanzen mit einem erhöhten Ölgehalt pro Morgen (erntefähiges Öl).
Zum Beispiel, in einer Ausführungsform, ist der Ölgehalt im Sojasamen erhöht. Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Produktion von Sojapflanzen mit einem erhöhten Ölgehalt pro Morgen (erntefähiges Öl).
Zum Beispiel, in einer Ausführungsform, ist der Ölgehalt im OSR-Samen erhöht. Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Produktion von OSR-Pflanzen mit einem erhöhten Ölgehalt pro Morgen (erntefähiges Öl).
Zum Beispiel bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Produktion von Baumwollpflanzen mit einem erhöhten Ölgehalt pro Morgen (erntefähiges Öl).
Verfahren um den Stickstoffgehalt im Testboden zu bestimmen, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Heranziehen bzw. Wachsen lassen einer Pflanze, die gemäß der Erfindung hergestellt wurde in dem Boden,
b) Vergleichen des Ertrags und Bestimmen der Ertragunterschiede der Pflanze, die gemäß der Erfindung hergestellt wurde, mit dem Ertrag einer Kontrollpflanze die in dem Erdboden herangezogen wurde, z. B. einer Wildtyp- oder Ursprungspflanze, insbesondere einer Pflanze die nicht gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurde, um eine Pflanze mit erhöhtem Entrag herzustellen,

In einem weiteren Schritt kann das Verfahren Schritte umfassen, um das Ergebnis des Verfahrens für die Bestimmung des Stickstoffbodengehalts zu kontrollieren:

c) Heranziehen der Pflanze die gemäß der Erfindung in Kontrollboden ohne Stickstoffgehaltmangel hergestellt wurde,
d) Vergleichen des Ertrags und Bestimmen der Ertragunterschiede der Pflanze, die gemäß der Erfindung hergestellt wurde, mit dem Ertrag einer Kontrollpflanze, die in dem Erdboden herangezogen wurde, z. B. einer Wildtyp- oder Ursprungspflanze, insbesondere einer Pflanze die nicht gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurde, um eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag herzustellen,

Verfahren zur Identifizierung einer Pflanze mit erhöhter Stickstoffverwertungseffizienz, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Heranziehen einer Pflanze die gemäß der Erfindung in einem Erdboden hergestellt wurde,
b) Vergleichen des Ertrags und Bestimmender Ertragunterschiede der Pflanze, die gemäß der Erfindung hergestellt wurde, mit dem Ertrag einer Kontrollpflanze oder einer Population von Kontrollpflanzen die in dem Erdboden herangezogen wurden, z. B. mit einer oder einer Population von Wildtyp- oder Ursprungspflanzen, insbesondere mit einer oder mehreren Pflanzenarten, die nicht gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, um eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag herzustellen,
c) Identifizierung einer Kontrollpflanzenart, welche einen höheren Ertrag, insbesondere eine höhere Stickstoffverwertungseffizienz im Vergleich zu der Pflanze, die gemäß der Erfindung hergestellt wurde, zeigt,

In einer Ausführungsform ist der Boden ein stickstoffarmer Boden.
In einer Ausführungsform, wird die Pflanze der Erfindung unter Bedingungen einer verminderten NUE-Düngung im Vergleich zu einer Kontroll- oder Wildtyp-Pflanze, z. B. einer Pflanze, die nicht gemäß der Erfindung hergestellt wurde, herangezogen. Vorzugsweise ist der Ertrag der Pflanze der Erfindung oder der nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Pflanze nicht vermindert im Vergleich zu der normalen NUE-Düngung oder ist weniger reduziert im Vergleich zu einer Kontroll- oder Wildtyp-Pflanze, z. B. einer Pflanze, die nicht gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurde. In einer anderen Ausführungsform, wird die Pflanze der Erfindung unter denselben Bedingungen, z. B. NUE-Düngung, wie eine Kontroll- oder Wildtyp-Pflanze, z. B. eine Pflanze die nicht gemäß der Erfindung hergestellt wurde, herangezogen. Vorzugsweise wird der Ertrag der Pflanze der Erfindung oder der nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Pflanze erhöht im Vergleich zu einer Kontroll- oder Wildtyp-Pflanze, z. B. einer Pflanze, die nicht gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurde.
In einer Ausführungsform ist der Ertrag der Proteinertrag. Entsprechend bedeutet erhöhter Ertrag, in einer Ausführungsform, eine erhöhte Menge an gebundenem Stickstoff, z. B. an Aminosäuregehalt oder Proteingehalt in einer Pflanze oder einem Teil davon, z. B. dem Samen.
Durch die Bezugnahme werden ferner die folgenden Anmeldungen bei welchen die vorliegende Anmeldung Anspruch auf Priorität erhebt: EP 07 150 295.9 , angemeldet am 21.01.2007, einbezogen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele und die Figuren (1–3), welche folgen, veranschaulicht:
Beispiel
Gentechnische Veränderung von Arabidopsis-Pflanzen durch Inaktivieren oder Herunterregulieren von ertragsbezogenen Genen, insbesondere von Genen mit ertragsbezogenen Eigenschaften, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz-/biomassebezogenen Genen.
Vektor-Herstellung
Ein binärer Knockout-Vektor wurde basierend auf dem modifizierten pPZP-Binärvektor-Gerüst (umfassend das Kanamycin-Gen für bakterielle Selektion; Hajdukiewicz, P., et al., Plant Mol. Biol., 25, 989 (1994)) und dem Selektionsmarker bar-Gen (De Block et al., EMBO J. 6, 2513 (1987)), gesteuert von den Promotoren mas2'1' und mas 271f (Velten et al., EMBO J. 3, 2723 (1984); Mengiste, Amedeo und Paszkowski, Plant J., 12, 945 (1997)) konstruiert. Der resultierende Vektor, der für Insertionsmutagenese verwendet wurde, war pMTX1a300, SEQ-ID NR.: 1.
Beispiele von anderen nützlichen binären Vektoren für Insertionsmutagenese sind pBIN19, pBI101, pBinAR, pSun oder pGPTV. Ein Überblick über binäre Vektoren und ihre spezifischen Merkmale ist in Hellens et al., Trends in Plant Science, 5: 446 (2000), sowie in Guerineau F., Mullineaux P., Plant transformation and expression vectors in plant molecular biology, LABFAX Series (Hrsg.: Croy R. R. D.), S. 121–127, Bios Scientific Publishers, Oxford (1993), angegeben.
Transformation von Agrobakterien
Das Plasmid wurde in Agrobakterium tumefaciens (GV3101pMP90; Koncz und Schell, Mol. Gen. Genet. 204: 383 (1986)) unter Verwendung von Hitzeschock- oder Elektroporations-Protokollen transformiert. Transformierte Kolonien wurden während 2 Tagen bei 28°C auf YEB-Medium wachsen gelassen und durch jeweilige Antibiotika (Rif/Gent/Km) selektiert. Diese Agrobakterienkulturen wurden für die Pflanzentransformation verwendet.
Arabidopsis thaliana des Ökotyps C24 wurden gemäß Standardbedingungen wachsen gelassen und transformiert (Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G., C. R. Acad. Sci. Paris 316, 1194 (1993); Bent, A. F., Clough, J. C., PLANT J. 16, 735 (1998)).
Transformierte Pflanzen (F1) wurden durch die Verwendung ihrer jeweiligen Resistenzmarker selektiert. Im Falle von BASTA^®-Resistenz wurden Pflänzchen viermal in einem Intervall von 2 bis 3 Tagen mit 0,02% BASTA^® besprüht, und es wurde zugelassen, dass transformierte Pflanzen Samen ausbilden. 50–100 Setzlinge (F2) wurden erneut einer Markerselektion unterzogen, im Fall von BASTA-Resistenz durch Besprühen mit 0,1% BASTA^® an 4 aufeinanderfolgenden Tagen während der Pflänzchenphase. Pflanzen, welche hinsichtlich eines einzelnen Resistenz-Genortes segregierten (ungefähr 3:1 resistente Setzlinge zu empfindlichen Setzlingen), wurden für die weitere Analyse gewählt. Aus diesen Linien, wurden drei der resistenten Setzlinge (F2) wieder zur Samenbildung zugelassen und wurden hinsichtlich der Homozygotie durch In-vitro-Keimung ihrer Samen (F3) auf Agarmedium getestet, welches das Selektionsmittel enthielt (BASTA^®, 15 mg/l Ammoniumglufosinat, Pestanal, Riedel de Haen, Seelze, Deutschland). Diese F2-Linien, welche beinahe 100% resistente Nachkommen (F3) aufzeigten, wurden als homozygot betrachtet und für die Funktionsanalyse herangezogen.
Pflanzen-Screening (Arabidopsis) für Wachstum unter limitierter Stickstoffzufuhr.
Für das Screening von transgenen Pflanzen wurde eine spezielle Aufzuchteinrichtung benutzt. Für Hochdurchsatz-Zwecke wurden Pflanzen auf Agarplatten mit limitierter Stickstoffzufuhr (adaptiert von Estelle und Somerville, 1987) bzgl. der Biomasseproduktion gescreent. Diese Screening-Leitung besteht aus zwei Ebenen. Transgene Linien werden nachfolgender Ebene falls die Biomasseproduktion signifikant im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen verbessert war, unterzogen. Mit jeder Ebene wurde die Anzahl der Replikate und die statistische Stringenz erhöht.
Für die Saat, werden die Samen, die im Kühlschrank (bei –20°C) gelagert wurden, mit Hilfe eines Zahnstochers aus den Eppendorfbehältern entfernt und auf die oben-genannten Agarplatten mit einer begrenzten Stickstoffzufuhr (0,05 mM KNO₃) überführt. Insgesamt werden ungefähr 15–30 Samen horizontal auf jeder Platte (12 × 12 cm) verteilt.
Nachdem die Samen gesäht wurden, werden die Platten der Stratifikation für 2–4 Tage im Dunkeln bei 4°C ausgesetzt. Nach der Stratifikation wurden die Testpflanzen 22 bis 25 Tage lang mit einem 16-h-Licht-, 8-h-Dunkelheit-Rhythmus bei 20°C, einer atmosphärischen Luftfeuchtigkeit von 60% und einer CO₂-Konzentration von ungefähr 400 ppm wachsen gelassen. Die verwendeten Lichtquellen erzeugen ein dem Sonnenfarbspektrum mit einer Lichtintensität von ungefähr 100 μE/m2s gleichendem Licht. Nach 10 bis 11 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Verbessertes Wachstum unter bzgl. Stickstoff limitierten Bedingungen wurde durch die Biomasseproduktion von Trieben und Wurzeln von transgenen Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollpflanzen nach 20–25 Tagen Wachstum bewertet.

Transgene Linien die eine signifikant erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen zeigen, werden folgendem Experiment des nachfolgenden Niveaus unterworfen:
Samen von Arabidopsis thaliana werden in Blumentöpfe die eine 1:1 (v:v) Mischung aus nährstofferschöftem Erdboden (”Einheitserde Typ 0”, 30% Ton, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand enthalten, eingesät. Die Keimung wird durch eine Haltung für vier Tage bei 4°C im Dunkeln induziert. Danach werden die Pflanzen unter Standardwachstumsbedingungen (Lichtperiode von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Luftfeuchtigkeit, und eine Photonenflussdichte von 200 μE) wachsen gelassen. Die Pflanzen werden wachsen gelassen und kultiviert, unter anderem werden sie jeden zweiten Tag mit einer N-erschöpften Nährstofflösung bewässert. Die N-erschöpfte Nährstofflösung, z. B. enthält neben Wasser

Mineralnährstoff	Endkonzentration
KCl	3,00 mM
MgSO₄ × 7H₂O	0,5 mM
CaCl₂ × 6H₂O	1,5 mM
K₂SO₄	1,5 mM
NaH₂PO₄	1,5 mM
Fe-EDTA	40 μM
H₃BO₃	25 μM
MnSO₄ × H₂O	1 μM
ZnSO₄ × 7H₂O	0,5 μM
Cu₂SO₄ × 5H₂O	0,3 μM
Na₂MoO₄ × 2H₂O	0,05 μM

Nach 9 bis 10 Tagen waren die Pflanzen individualisiert bzw. vereinzelt. Nach einer Gesamtzeit von 29 bis 31 Tage werden die Pflanzen abgeerntet und durch das Frischgewicht der oberirdischen Teile der Pflanzen beurteilt. Die Ergebnisse davon sind in der Tabelle Va zusammengefasst. Der Biomassezuwachs wurde als Verhältnis des Frischgewichtes der oberirdischen Teile der jeweiligen transgenen Pflanze und der nicht-transgenen Wildtyp-Pflanze gemessen. Tabelle Va: Stickstoffverwertungseffizienz

SeqID Genort Biomassezuwachs

27 At1g74730 1,20

60 At3g07670 1,11

94 At3g63270 1,23

132 At4g03080 1,10

171 At5g65240 1,30
Pflanzen-Screening hinsichtlich Wachstum unter Niedertemperatur-Bedingungen
In einem Standardexperiment wurde Erdboden als eine Mischung von 3,5:1 (v/v) an nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand zubereitet. Blumentöpfe wurden mit dem Erdgemisch befüllt und in Schalen gebracht. Wasser wurde den Schalen zugesetzt, damit die Erdmischung eine angemessene Menge an Wasser für die Aussaat-Prozedur aufnimmt. Die Samen für transgene A. thaliana-Pflanzen wurden in die Blumentöpfe eingesät (6 cm Durchmesser). Die Stratifikation wurde während eines Zeitraums von 3 Tagen im Dunklen bei 4°C–5°C etabliert. Die Keimung der Samen und das Wachstum wurden bei einer Wachstumsbedingung von 20°C, etwa 60% relative Feuchtigkeit, 16 h-Lichtperiode und Beleuchtung mit Fluoreszenzlicht bei 150–200 μmol/m²s initiert. Die BASTA-Selektion wurde am Tag 9 nach dem Einsäen durch Besprühen der Töpfe mit Pflänzchen von oben vorgenommen. Demgemäß wurde eine Lösung von 0,07% (v/v) BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinat-Ammonium) in Leitungswasser versprüht. Die Wildtyp-Kontrollpflanzen wurden nur mit Leitungswasser besprüht (anstelle des Besprühens mit in Leitungswasser gelöstem BASTA), wurden ansonsten jedoch gleich behandelt. Transgene Ereignisse und Wildtyp-Kontrollpflanzen waren zufallsmäßig in der Kammer verteilt. Das Bewässern erfolgte alle zwei Tage, nachdem die Hauben von den Schalen entfernt worden waren. Die Pflanzen wurden 12–13 Tage nach dem Einsäen durch Entfernen des Überschusses an Setzlingen, wobei nur ein Setzling in einem Blumentopf übergelassen wurde, vereinzelt. Kälte (Abkühlen auf 11°C–12°C) wurde 14–16 Tage nach dem Einsäen bis zum Ende des Experiments angewandt. Zum Messen der Biomasse-Leistung wurde das Pflanzenfrischgewicht zur Erntezeit bestimmt (36–37 Tage nach dem Einsäen) durch Abschneiden der Sprosse und Wiegen derselben. Die Pflanzen waren bei der Ernte im Stadium vor dem Aufblühen und vor dem Wachstum des Blütenstands. Transgene Pflanzen wurden mit nicht-transgenen Wildtyp-Kontrollpflanzen verglichen. Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasse-Änderungen wurden durch Anwenden des t-Tests bzw. Student's-Test (Parameter: zweiseitige, ungleiche Varianz) berechnet.
Tabelle Vb: Biomasseproduktion von transgenen A. thaliana nach Herbeiführung von Abkühlungsstress.
Die Biomasseproduktion wurde durch Wiegen von Pflanzenrosetten gemessen. Der Biomassezuwachs wurde als Verhältnis des durchschnittlichen Gewichts für transgene (Zell)-Linien im Vergleich zum durchschnittlichen Gewicht von Wildtyp-Kontrollpflanzen für das gleiche Experiment (> jeweils 19 Pflanzen) berechnet. Der mittlere Biomassezuwachs von transgenen Pflanzen ist angeführt (Signifikanzwert = 0,045).

SeqID Genort Biomassezuwachs

171 At5g65240 1,15
Pflanzen-Screening hinsichtlich Ertragssteigerung unter standartisierten Wachstumsbedingungen
In diesem Experiment wurde ein Pflanzen-Screening hinsichtlich Ertragszuwachs (in diesem Fall Biomasse-Ertragsszuwachs) unter standartisierten Wachstumskonditionen in der Abwesenheit von substantiellem abiotischem Stress durchgeführt. In einem Standardexperiment wurde Erdboden als eine Mischung von 3,5:1 (v/v) an nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Quartzsand zubereitet. Alternativ wurden Pflanzen in nährstoffreichem Erdboden (GS90, Tantau, Deutschland) gesäht. Blumentöpfe wurden mit dem Erdgemisch befüllt und in Schalen gebracht. Wasser wurde den Schalen zugesetzt, damit die Erdmischung eine angemessene Menge an Wasser für die Aussaat-Prozedur aufnimmt. Die Samen für transgene A. Thaliana-Pflanzen und deren nicht-transgene Wildtyp-Kontrollpflanzen wurden in Blumentöpfe eingesät (6 cm Durchmesser). Die Stratifikation wurde während eines Zeitraums von 3–4 Tagen im Dunklen bei 4°C–5°C etabliert. Die Keimung der Samen und das Wachstum wurden bei einer Wachstumsbedingung von 20°C, und etwa 60% relative Feuchtigkeit, 16 h-Lichtperiode und Beleuchtung mit Fluoreszenzlicht bei etwa 150–200 μmol/m²s initiert. Die BASTA-Selektion wurde am Tag 10 oder Tag 11 (9 oder 10 Tage nach dem Einsäen) durch Besprühen der Töpfe mit Pflänzchen von oben vorgenommen. In dem Standardexperiment wurde eine Lösung von 0,07% (v/v) BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinat-Ammonium) in Leitungswasser einmal versprüht, oder andernfalls, eine Lösung von BASTA von 0,02% (v/v) wurde dreimal versprüht. Die Wildtyp-Kontrollpflanzen wurden nur mit Leitungswasser besprüht (anstelle des Besprühens mit in Leitungswasser gelöstem BASTA), wurden ansonsten jedoch gleich behandelt. Die Pflanzen wurden 13–14 Tage nach dem Einsäen durch Entfernen des Überschusses an Setzlingen, wobei nur ein Setzling in Erdboden gelassen wurde, vereinzelt. Transgene Ereignisse und Wildtyp-Kontrollpflanzen waren gleichmäßig in der Kammer verteilt.
Das Bewässern erfolgte alle zwei Tage, nachdem die Hauben in einem Standardexperiment entfernt worden waren, oder alternativ jeden Tag. Zum Messen der Biomasse-Leistung wurde das Pflanzenfrischgewicht zur Erntezeit bestimmt (24–25 Tage nach dem Einsäen) durch Abschneiden der Sprosse und Wiegen derselben. Die Pflanzen waren bei der Ernte im Stadium vor dem Aufblühen und vor dem Wachstum des Blütenstands. Transgene Pflanzen wurden mit nicht-transgenen Wildtyp-Kontrollpflanzen verglichen. Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasse-Änderungen wurden durch Anwenden des t-Tests (Parameter: zweiseitige, ungleiche Varianz) berechnet.
Tabelle Vd: Biomasseproduktion von transgenen A. Thaliana, herangezogen unter standartisierten Wachstumskonditionen.
Die Biomasseproduktion wurde durch Wiegen von Pflanzenrosetten gemessen. Der Biomassezuwachs wurde als Verhältnis des durchschnittlichen Gewichts von Pflanzen transgener (Zell-)-Linien im Vergleich zum durchschnittlichen Gewicht von Wildtyp-Kontrollpflanzen für das gleiche Experiment (jeweils > 20 Pflanzen) berechnet. Der mittlere Biomassezuwachs von transgenen Pflanzen ist angeführt (Signifikanzwert = 0,002).

SeqID Ziel Genort Biomassezuwachs

171 nd At5g65240 1,19
Analyse von den ausgewählten Linien mit gesteigertem Ertrag, insbesondere einer gesteigerten Ertrags-bezogenen Eigenschaft, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Biomasseproduktion. Da die Linien für Einzelinsertionsgenorte und einer homozygotischen Situation des Resistenzmarkers vorselektiert wurden, wurde erwartet, dass die Störung (oder Mutation) einzelner Gene durch die Integration der T-DNA zu dem Stress-reistentem Phänotypen führte. Linien, die einen konsistenten Phänotyp zeigten, wurden für die Molekularanalyse ausgewählt.
Genomische DNA wurde aus ungefähr 100 mg Blattgewebe aus diesen Linien unter Anwendung von Standardprozeduren (entweder Zentrifugensäulen von Qiagen, Hilden, Deutschland, oder das Nucleon Phytopure Kit von Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland) gereinigt. Die Amplifikation der Insertionsseite bzw. -stelle der T-DNA wurde unter Anwendung zweier verschiedener Verfahren erreicht. Einerseits durch ein Adaptor-PCR-Verfahren gemäß Spertini D, Béliveau C. und Bellemare G., Biotechniques, 27, 308 (1999), unter Verwendung der T-DNA-spezifischen Primer
LB1 (5'-TGA CGC CAT TTC GCC TTT TCA-3'; SEQ ID NR.: 4) oder
RB1-2 (5'-CAA CTT AAT CGC CTT GCA GCA CA-3'; SEQ ID NR.: 5)
für die erste bzw.
LB2 (5'-CAG AAA TGG ATA AAT AGC CTT GCT TCC-3'; SEQ ID NR.: 6) oder
RB4-2 (5'-AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG-3'; SEQ ID NR.: 7)
bzw. für die zweite PCR.
Alternativ dazu wurde eine TAIL-PCR (Liu Y-G, Mitsukawa N, Oosumi T und Whittier RF, Plant J. 8, 457 (1995)) durchgeführt. In diesem Fall wurden für die erste PCR
LB1 (5'-TGA CGC CAT TTC GCC TTT TCA-3', SEQ ID NR.: 4) oder
RB1-2 (5'-CAA CTT AAT CGC CTT GCA GCA CA-3'; SEQ ID NR.: 5),
für die zweite PCR
LB2 (5'-CAG AAA TGG ATA AAT AGC CTT GCT TCC-3'; SEQ ID NR.: 6) oder
RB4-2 (5'-AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG-3', SEQ ID NR.: 7)
und für die letzte PCR
LB3 (5'-CCA ATA CAT TAC ACT AGC ATC TG-3'; SEQ ID NR.: 8) oder
RB5 (5'-AAT GCT AGA GCA GCT TGA-3'; SEQ ID NR.: 9) als T-DNA-spezifische Primer für die linken bzw. rechten T-DNA-Border verwendet.
Geeignete PCR-Produkte wurden auf Agarosegelen identifiziert und unter Verwendung von Säulen und Standardprozeduren (Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt. PCR-Produkte wurden mit zusätzlichen T-DNA-spezifischen Primern sequenziert, die in Richtung der Border bzw. Grenzen relativ zu den für die Amplifikation verwendeten Primern lokalisiert sind. Für Adaptor-PCR-Produkte, welche die linken Border-Sequenzen enthielten, wurde der Primer
LBseq (5'-CAA TAC ATT ACA CTA GCA TCT G-3'; SEQ ID NR.: 10) und für Sequenzen, welche die rechten Border-Sequenzen enthielten, der Primer
RBseq (5'-AGA GGC CCG CAC CGA TCG-3'; SEQ ID NR.: 11)
für Sequenzierungsreaktionen verwendet. Für TAIL-PCR-Produkte, welche linke Border-Sequenzen enthielten, wurde der Primer
LBseq2 (5'-CTA GCA TCT GAA TTT CAT AAC C-3'; SEQ ID NR.: 12) und für PCR-Produkte, welche rechte Border-Sequenzen enthielten, der Primer
RBseq2 (5'-GCT TGA GCT TGG ATC AGA TTG-3'; SEQ ID NR.: 13) für die Sequenzierungsreaktionen verwendet. Die resultierenden Sequenzen wurden für einen Vergleich mit der verfügbaren Arabidopsis-Genomsequenz von Genbank unter Verwendung des Blast-Algorithmus (Altschul et al., 1990. J. Mol. Biol., 215: 403 (1990)) verwendet.
Weitere Einzelheiten hinsichtlich PCR-Produkten, die zum Identifizieren des genomischen Genorts verwendet wurden, sind in der nachstehenden Tabelle VI angegeben. Angegeben sind der identifizierte, vermerkte offene Leserahmen im Arabidopsis-Genom, die geschätzte Größe des erhaltenen PCR-Produkts (in Basenpaaren), die T-DNA-Border (LB: linke Border, RB: rechte Border), für welche die Amplifikation erzielt wurde, das Verfahren, das zum aufgeführten PCR-Produkt führte (Erläuterung siehe Text oben), die jeweiligen Restriktionsenzyme im Fall von Adaptor-PCR, und die degenerierten Primer im Fall von TAIL-PCR. Routinemäßig wurden die degenerierten Primer
ADP2 (5'-NGT CGA SWG ANA WGA A-3'; SEQ ID NR.: 14),
ADP3 (5'-WGTGNAGWANCANAGA-3'; SEQ ID NR.: 15),
ADP5 (5'-STT GNT AST NCT NTG C-3'; SEQ ID NR.: 16),
ADP6 (5'-AGWGNAGWANCANAGA-3'; SEQ ID NR.: 17),
ADP8 (5'-NTGCGASWGANWAGAA-3'; SEQ ID NR.: 18),
ADP9 (5'-NTG CGA SWG ANT AGA A-3'; SEQ ID NR.: 19) und
ADP11 (5'-SST GGS TAN ATW ATW CT-3'; SEQ ID NR.: 20) verwendet.
Die Identifikation des Insertions-Genorts wurde in jedem Fall durch eine Kontroll-PCR unter Verwendung eines der oben erwähnten T-DNA-spezifischen Primer und eines, aus dem identifizierten genomischen Genort, nahe der Insertionsstelle, abgeleiteten Primers bestätigt. Die Amplifikation eines PCR-Produktes der erwarteten Größe aus der Insertionslinie unter Verwendung dieser zwei Primer bewies die Disruption des identifizierten Genorts durch die T-DNA-Integration.

Tabelle VI: Einzelheiten über PCR-Produkte, die zum Identifizieren des herunterregulierten Gens in Linien verwendet wurden, welche erhöhten Ertrag, insbesondere eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, wie eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze zeigen. Das herunterregulierte Gen ist durch seinen TAIR-Genort (Locus) definiert. Tabelle VI: PCR-Produkte

SEQ ID	Genort	Border	Verfahren	Restriktionsenzym oder deg. Primer
27	At1g74730	RB	Adapter	SpeI
60	At3g07670	RB	TAIL	ADP8
94	At3g63270	LB	Adapter	SpeI
132	At4g03080	RB	Adapter	MunI
171	At5g65240	LB	Adapter	Psp1406I/Bsp119I

Die Spalte 1 bezieht sich auf die SEQ-ID NR.: des Gens, welches ausgeknockt wurde, die Spalte 2 bezieht sich auf den TAIR-Genort des ausgeknockten Gens (Locus), die Spalte 3 bezieht sich auf die T-DNA-Border, für welche das PCR-Produkt amplifiziert wurde, Spalte 4 bezieht sich auf das PCR-Verfahren zur Amplifikation, und Spalte 5 bezieht sich auf das Restriktionsenzym oder den degenerierten Primer, die im PCR-Verfahren verwendet wurden (für eine ausführliche Erläuterung der Spalten 4 und 5 siehe obenstehenden Text; APX bedeutet entweder Primer AP2, Primer AP5, Primer AP6, Primer AP9 oder Primer AP11).
Konstruktion von Antisense-Konstrukten zur Unterdrückung der Aktivität oder Expression eines Gens, z. B. eines Gens welches die SEQ-ID NR.: 27 umfasst.
Ein Fragment von SEQ-ID NR.: 27 wird durch PCR amplifiziert. Um die Klonierung des PCR-Produkts zu ermöglichen, können den für die Amplifikation verwendeten Primern Restriktionsstellen hinzugefügt werden. Alternativ können den Primern Rekombinationsstellen zum Ermöglichen einer Rekombinationsreaktion hinzugefügt werden. Das PCR-Fragment kann auf eine solche Art in einen binären Vektor, vorzugsweise unter der Kontrolle eines starken konstitutiven, gewebe- oder entwicklungsspezifischen Promotors, entweder kloniert oder rekombiniert werden, dass die Orientierung zur Richtung des Gens entgegengesetzt der Richtung sein kann, die das Gen in seiner ursprünglichen genomischen Position besitzt.
Die Amplifikation eines Fragmentes von einer Sequenz, angegeben in einer Zeile von Spalte 5 von Tabelle III, Anmeldung Nr. 1, kann unter Verwendung derjenigen Primer durchgeführt werden, welche in Spalte 7, Anmeldung Nr. 1, in jeweils derselben Zeile in der gleichen Tabelle III aufgeführt sind, umfassend die Erweiterungen 5'-ATACCCGGG-3' (SEQ-ID NR.: 21) oder 5'-ATAGAGCTC-3' (SEQ-ID NR.: 22). Die Erweiterungen 5'-ATACCCGGG-3_ (SEQ-ID NR.: 21) oder 5'-ATAGAGCTC (SEQ-ID NR.: 22) enthalten für Klonierungszwecke die Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme XmaI bzw. SacI.
Die Oligonukleotide werden in Wasser gelöst, um eine Konzentration von 20 μM zu erhalten. Die PCR-Reaktion enthält 5 μl Herculase-Puffer (Stratagene), 0,4 μl dNTPs (je 25 mM) (Amersham), 0,5 μl jedes Primers, 0,5 μl Herculase (Stratagene), 0,5 μl gDNA und 42,6 μl Wasser. Die PCR wird auf einem MJ-Cycler Tetrad (BioZym) mit dem folgendem Programm durchgeführt:
4 min 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von 1 min 94°C, 1 min 50°C, 2 min 72°C, gefolgt von 10 min 77°C und Abkühlen auf 25°C.
Das PCR-Produkt kann unter Anwendung eines Kits von Qiagen gereinigt werden. Die DNA wird anschließend mit XmaI/SacI bei 37°C über Nacht verdaut. Das Fragment kann dann in den Vektor 1bxPcUbicolic, SEQ-ID NR.: 2, der mit XmaI/SacI verdaut werden kann, kloniert werden.
Konstruktion von RNAi-Konstrukten zur Unterdrückung der Aktivität oder Expression eines Gens, z. B. eines Gens, welches die SEQ-ID NR.: 27 umfasst.
Ein Fragment von SEQ-ID NR.: 27 kann durch PCR amplifiziert werden. Um die Klonierung des PCR-Produkts zu ermöglichen, können den für die Amplifikation verwendeten Primern Restriktionsstellen hinzugefügt werden. Alternativ können den Primern Rekombinationsstellen zum Ermöglichen einer Rekombinationsreaktion hinzugefügt werden. Das PCR-Fragment kann auf eine solche Art in einen binären Vektor, vorzugswei se unter der Kontrolle eines starken konstitutiven, gewebe- oder entwicklungsspezifischen Promotors, entweder kloniert oder rekombiniert, so dass das Fragment als ein invertierter Repeat zweimal im Vektor eingeführt werden kann, wobei die Repeats durch einen DNA-Spacer getrennt sind.
Die Amplifikation eines Fragments einer Sequenz, angegeben in einer Zeile von Spalte 5 von Tabelle III, kann unter Verwendung derjenigen Primer durchgeführt werden, welche in Spalte 7 in jeweils derselben Zeile in dergleichen Tabelle III aufgeführt sind, umfassend die Erweiterungen 5'-ATAGGTACC-3' (SEQ-ID NR.: 23) oder 5'-ATAGTCGAC-3' (SEQ-ID NR.: 24). Die Erweiterungen 5'-ATAGGTACC-3' (SEQ-ID NR.: 23) oder 5'-ATAGTCGAC-3' (SEQ-ID NR.: 24) enthalten für Klonierungszwecke die Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme Asp718 bzw. SalI.
Die Oligonukleotide können in Wasser gelöst werden, um eine Konzentration von 20 μM zu erhalten. Die PCR-Reaktion enthält 5 μl Herculase-Puffer (Stratagene), 0,4 μl dNTPs (je 25 mM) (Amersham), 0,5 μl jedes Primers, 0,5 μl Herculase (Stratagene), 0,5 μl gDNA und 42,6 μl Wasser. Die PCR kann auf einem MJ-Cycler Tetrad (BioZym) mit dem folgendem Programm durchgeführt werden:
4 min bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von 1 min 94°C, 1 min 50°C, 2 min 72°C, gefolgt von 10 min 72°C und Abkühlen auf 25°C.
Das PCR-Produkt kann unter Anwendung eines Kits von Qiagen gereinigt werden. Die DNA kann anschließend mit Asp718/SalI bei 37°C über Nacht verdaut werden. Das Fragment kann dann in den Vektor 10xPcUbispacer, SEQ-ID NR.: 3, der mit Asp718/SalI verdaut werden kann, kloniert werden. Das resultierende Konstrukt kann mit XhoI/BsrGI verdaut werden, und dasselbe Asp718/SalI-verdaute PCR-Fragment kann in diesen Vektor ligiert werden. Anschließend kann die Expressionskassette, die zur BASTA-Resistenz führt, als XbaI-Fragment in diesen Vektor ligiert werden, der zuvor mit XbaI geöffnet und dephosphoryliert werden kann.
Konstruktion von Cosuppressionskonstrukten zur Unterdrückung der Aktivität oder Expression eines Gens, z. B. eines Gens, welches die SEQ-ID NR.: 27 umfasst.
Ein Fragment der SEQ-ID NR.: 27 wird durch PCR amplifiziert. Um die Klonierung des PCR-Produkts zu ermöglichen, können den für die Amplifikation verwendeten Primern Restriktionsstellen hinzugefügt werden. Alternativ können den Primern Rekombinationsstellen zum Ermöglichen einer Rekombinationsreaktion hinzugefügt werden. Das PCR-Fragment kann auf eine solche Art in einen binären Vektor, vorzugsweise unter der Kontrolle eines starken konstitutiven, gewebe- oder entwicklungsspezifischen Promotors, entweder kloniert oder rekombiniert werden, so dass die Orientierung zum Promotor iden tisch zu der Richtung sein kann, die das Gen in seiner ursprünglichen genomischen Position besitzt.
Die Amplifikation des Fragments der Sequenzen, angegeben in einer Zeile von Spalte 5 von Tabelle III, kann unter Verwendung derjenigen Primer durchgeführt werden, welche in Spalte 7 in jeweils derselben Zeile in der gleichen Tabelle III aufgeführt sind, umfassend die Erweiterungen 5'-ATACCATGG-3' (SEQ-ID NR.: 25) oder 5'-ATATTAATTAA-3' (SEQ-ID NR.: 26). Die Erweiterungen 5'-ATACCATGG-3' (SEQ-ID NR.: 25) oder 5'-ATATTAATTAA-3' (SEQ-ID NR.: 26) enthalten für Klonierungszwecke die Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme NcoI bzw. PacI.
Die Oligonukleotide können in Wasser gelöst werden, um eine Konzentration von 20 μM zu erhalten. Die PCR-Reaktion enthält 5 μl Herculase-Puffer (Stratagene), 0,4 μl dNTPs (je 25 mM) (Amersham), 0,5 μl jedes p, 0,5 μl Herculase (Stratagene), 0,5 μl gDNA und 42,6 μl Wasser. Die PCR kann auf einem MJ-Cycler Tetrad (BioZym) mit dem folgendem Programm durchgeführt werden:
4 min 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von 1 min 94°C, 1 min 50°C, 2 min 72°C, gefolgt von 10 min 72°C und Abkühlen auf 25°C.
Das PCR-Produkt kann unter Anwendung eines Kits von Qiagen gereinigt werden. Die DNA kann anschließend mit NcoI/PacI bei 37°C über Nacht verdaut werden. Das Fragment kann dann in den Vektor 1bxPcUbicolic, SEQ-ID NR.: 2, der mit NcoI/PacI verdaut ist, kloniert werden.
Reduzieren der Aktivität oder Expression eines Gens, z. B. eines Gens umfassend SEQ-ID NR.: 27, durch künstliche Transkriptionsfaktoren
Ein Gen und seine homologen ORFs in anderen Spezies können ebenfalls durch Einbringen eines synthetischen spezifischen Repressors herunterreguliert werden. Für diesen Zweck kann ein Gen für ein chimäres Zinkfingerprotein konstruiert werden, das an eine spezifische Region in der regulatorischen oder codierenden Region der Gene von Interesse oder ihre Homologe in anderen Spezies bindet. Das künstliche Zinkfingerprotein umfasst eine spezifische DNA-Bindungsdomäne, welche zum Beispiel aus dem Zinkfinger und gegebenfalls einer Repression besteht, wie etwa der EAR-Domäne (Hiratsu et al., Plant J. 34, 733 (2003); "Dominant repression of target genes by chimeric repressors that include the EAR motif, a repression domain, in Arabidopsis").
Die Expression dieses chimären Repressors, zum Beispiel in Pflanzen, resultiert dann in einer spezifischen Unterdrückung des Zielgens oder seiner Homologen in anderen Pflanzenspezies, führt zu einer erhöhten Metabolitproduktion. Die experimentellen Details, insbesondere hinsichtlich Design und Konstruktion von spezifischen Zinkfingerdomänen, können ausgeführt werden, wie beschrieben in WO 01/52620 oder Ordiz MI, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, (20), 13290 (2002)) oder Guan (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99 (20), 13296 (2002)).
Gentechnische Veränderung von Raygraspflanzen durch Unterdrücken der Aktivität oder Expression eines Gens, z. B. eines Genhomologen zu einem Gen, umfassend SEQ-ID NR.: 27, in Raygras
Samen von mehreren verschiedenen Raygrasvarietäten können als Explantat-Quellen für die Transformation verwendet werden, einschließlich der handelsüblichen Varietät Gunne, erhältlich von Svalöf Weibull Seed Company, oder der Varietät Affinity. Die Samen werden der Reihe nach mit 1% Tween-20 während 1 Minute, 100% Bleichmittel während 60 Minuten, 3 Spülungen von je 5 Minuten mit entionisiertem und destilliertem H₂O, oberflächensterilisiert und dann während 3–4 Tagen auf feuchtem, sterilem Filterpapier im Dunklen auskeimen gelassen. Die Setzlinge werden ferner 1 Minute lang mit 1% Tween-20, 5 Minuten mit 75% Bleichmittel, sterilisiert und dreimal mit ddH₂O jeweils 5 Minuten lang gespült.
Oberflächensterilisierte Samen werden auf das Kallusinduktionsmedium gebracht, das basale Salze and Vitamine nach Murashige und Skoog, 20 g/l Saccharose, 150 mg/l Asparagin, 500 mg/l Caseinhydrolysat, 3 g/l Phytagel, 10 mg/l BAP und 5 mg/l Dicamba enthält. Die Platten können 4 Wochen lang im Dunklen bei 25°C für die Samenkeimung und zur Induktion von embryogenem Kallus inkubiert werden.
Nach 4 Wochen auf dem Kallusinduktionsmedium können die Sprosse und Wurzeln der Setzlinge weggeschnitten werden, der Kallus kann in frisches Medium überführt werden, kann weitere 4 Wochen lang in Kultur gehalten werden und kann dann bei Licht während 2 Wochen zu MSO-Medium überführt werden. Mehrere Stücke von Kallus (11–17 Wochen alt) werden entweder durch ein 10-mesh-Sieb passieren gelassen und auf Kallusinduktionsmedium gebracht, oder werden in 100 ml flüssigem Raygras-Kallusinduktionsmedium (gleiches Medium wie für Kallusinduktion mit Agar) in einem 250-ml-Kolben kultiviert. Der Kolben kann in Folie eingewickelt werden und im Dunklen bei 23°C eine Woche lang bei 175 U/min geschüttelt werden. Durch Absieben der Flüssigkultur mit einem 40-mesh-Sieb können die Zellen abgesammelt werden.
Die auf dem Sieb gesammelte Fraktion kann ausplattiert werden und kann auf festem Raygras-Kallusinduktionsmedium 1 Woche lang im Dunklen bei 25°C kultiviert werden. Der Kallus kann dann auf MS-Medium, enthaltend 1% Saccharose, überführt werden und 2 Wochen lang darauf kultiviert werden.
Die Transformation kann entweder mit Agrobacterium- oder mit Teilchenbeschuss-Verfahren erreicht werden. Ein Expressionsvektor kann erzeugt werden, der einen konstitutiven oder anderweitig geeigneten Pflanzenpromotor und den Antisense, die RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, das Cosuppressionskonstrukt, das Rekombinationskonstrukt oder Ribozymmolekül, oder das virale Nukleinsäuremolekül, Nukleinsäurekonstrukt, in einem pUC-Vektor enthält. Die Plasmid-DNA kann aus E. coli-Zellen mit Hilfe des Qiagen-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert werden Ungefähr 2 g embryogener Kallus können in der Mitte eines sterilen Filterpapiers in einer Petri-Schale verteilt werden. Ein Aliquot von flüssigem MSO mit 10 g/l Saccharose kann dem Filterpapier zugesetzt werden. Goldteilchen (1,0 μm Größe) werden mit Plasmid-DNA gemäß dem Verfahren von Sanford et al., 1993, beschichtet und werden dem embryogenen Kallus unter den folgenden Parametern zugeführt: 500 μg Teilchen und 2 μg DNA je Schuß, 1300 psi und eine Zieldistanz von 8,5 cm von der Stoppingplatte zur Kallus-Platte, sowie 1 Schuß je Kallus-Platte.
Nach dem Beschuß werden die Kalli zurück zu frischem Kallus-Entwicklungsmedium überführt und während eines Zeitraums von 1 Woche im Dunklen bei Raumtempratur gehalten. Der Kallus kann dann zu Wachstumsbedingungen in Licht bei 25°C zum Initiieren der Embryodifferenzierung, mit dem passenden Selektionsmittel, z. B. 250 nM Arsenal, 5 mg/l PPT oder 50 mg/l Kanamycin, überführt werden. Schösslinge, die gegen das Selektionsmittel resistent sind, erscheinen und werden, nach der Wurzelbildung, in Erdboden überführt.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in welcher DNA einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen werden kann und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt werden kann, bestätigt. Das „PCR DIG Probe Synthesis”-Kit (Roche Diagnostics) kann verwendet werden, um eine Digoxigenin-markierte Sonde durch PCR herzustellen, wobei es gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt wird. Ferner werden die primären transgenen Pflanzen (T0) hinsichtlich der unterdrückten Expression des zu reprimierenden Gens durch Standardverfahren, wie Northern-Blots oder quantitativer RTPCR, analysiert.
Transgene T0-Raygraspflanzen werden durch Exzision von Schösslingen vegetativ vermehrt. Die transplantierten Schösslinge werden 2 Monate lang im Gewächshaus gehalten, bis sie sich gut entwickelt haben. Die Schösslinge werden entlaubt und 2 Wochen lang wachsen gelassen.
Gentechnische Veränderung von Sojabohnenpflanzen durch Unterdrücken der Aktivität oder Expression eines Gens, z. B. eines Genhomologen zu einem Gen, umfassend SEQ-ID NR.: 27, in Sojabohne
Sojabohnen können gemäß der folgenden Modifikation des Verfahrens, welches im Patent US 5 164 310 von Texas A&M beschrieben ist, transformiert werden. Mehrere kommerzielle Sojabohnen-Varietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zuführbar. Das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) kann üblicherweise für die Transformation verwendet werden. Die Samen können durch Eintauchen in 70% (v/v) Ethanol während 6 Minuten und in 25% kommerziellem Bleichmittel (NaOCl), ergänzt mit 0,1% (v/v) Tween, während 20 Minuten sterilisiert werden, gefolgt von viermaligem Spülen mit sterilem doppeltdestilliertem Wasser. Durch Entfernen der Keimwurzel, des Hypokotyls und eines Kotyledons aus jedem Setzling werden Sieben-Tages-Setzlinge vermehrt. Dann kann das Epikotyl mit einem Kotyledon auf frisches Keimungsmedium in Petrischalen überführt werden und bei 25°C bei einer 16-h-Lichtperiode (ungefähr 100 μE/m²s) drei Wochen lang inkubiert werden. Axilläre Nodi bzw. Blattansätze (etwa 4 mm in der Länge) werden von 3 bis 4 Wochen alten Pflanzen abgeschnitten. Die axillären Nodi können herausgeschnitten und in Agrobacterium LBA4404-Kultur inkubiert werden.
Für die Pflanzen-Transformation sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An, G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Bd. 44, S. 47–62, Hrsg. Gartland K. M. A und M. R. Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele können auf dem Vektor pBIN19 basiert sein, der von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) beschrieben worden ist, welcher eine pflanzliche Genexpressionskassette enthält, die von den linken und rechten Border-Sequenzen aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens flankiert wird. Eine pflanzliche Genexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem pflanzlichen Promotor, der die Transkription des Antisense, der RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, des Cosuppressionskonstrukts oder des Ribozymmoleküls oder des viralen Nukleinsäuremoleküls reguliert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, wie oben beschrieben, einschließlich des Arabidopsis-Gens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patente 5 767 366 und 6 225 105 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren der Repressionskassette verwendet werden, um eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Repression der Gentranskription, wie oben beschrieben, vorzusehen. In diesem Beispiel kann der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet werden, um eine konstitutive Repression der Repressionskassette vorzusehen.
Nach der Cokultivierungs-Behandlung können die Explantate gewaschen und zu Selektionsmedien überführt werden, die mit 500 mg/l Timentin supplementiert sind. Schösslinge können herausgeschnitten und auf ein Schössling-Elongationsmedium gebracht werden. Schösslinge, die länger als 1 cm sind, können zwei bis vier Wochen lang auf Bewurzelungsmedium gesetzt werden, bevor sie in Erde umgepflanzt werden.
Die primären transgenen Pflanzen (T0) können durch PCR analysiert werden, um die Anwesenheit von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse können durch eine Southern-Hybridisierung bestätigt werden, in welcher DNA auf einem 1%-igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt werden kann. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) kann verwendet werden, um eine Digoxigenin-markierte Sonde durch PCR herzustellen, und es kann wie vom Hersteller empfohlen verwendet werden. Darüber hinaus können die primären transgenen Pflanzen (T0) hinsichtlich der unterdrückten Expression des zu reprimierenden bzw. zu unterdrückenden Gens durch Standardverfahren, wie Northern-Blots oder quantitative RTPCR, analysiert werden.
Gentechnische Veränderung von Maispflanzen durch Unterdrücken der Aktivität oder Expression eines Gens, z. B. eines Genhomologen zu einem Gen, das die SEQ-ID NR.: 27 umfasst, in Mais
Die Transformation von Mais (Zea Mays L.) kann mit einer Modifikation des von Ishida et al. (Nature Biotech. 14745 (1996)) beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden.
Die Transformation kann in Mais genotypabhängig sein, und nur spezielle Genotypen können für eine Transformation und Regeneration zugänglich sein. Die durch Inzucht erzeugte Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Stammform können gute Quellen für Spendermaterial für eine Transformation sein (Fromm et al., Biotech. 8, 833 (1990)), aber andere Genotypen können ebenfalls erfolgreich verwendet werden. Ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) können Ähren von den Maispflanzen geerntet werden, wenn die Länge von unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm betragen kann. Unreife Embryos können mit Agrobacterium tumefaciens, welche ”superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert werden, und transgene Pflanzen können durch Organogenese rückgewonnen werden. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco kann in den WO-Patenten WO 94/00977 und WO 95/06722 beschrieben werden. Die Vektoren können wie beschrieben konstruiert werden. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patent 6025541 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren der Repressionskassette verwendet werden, um eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Expression des Antisense, der RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, des Cosuppressionskonstrukts oder des Ribozymmoleküls oder des viralen Nukleinsäuremoleküls vorzusehen. In diesem Beispiel kann der 34S- Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet werden, um eine konstitutive Expression der Repressionskassette vorzusehen.
Herausgeschnittene Embryos können auf Kallusinduktionsmedium, anschließend Maisregenerationsmedium, das Imidazolinon als Selektionsmittel enthält, wachsen gelassen werden. Die Petri-Schalen können im Licht bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, oder bis sich Schösslinge entwickeln, inkubiert werden. Die grünen Schösslinge von jedem Embryo können in Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C 2 bis 3 Wochen lang inkubiert werden, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Schösslinge können im Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt werden. T1-Samen können aus Pflanzen erzeugt werden, welche eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und welche eine unterdrückte Expression des zu reprimierenden Gens zeigen. Eine derartige Analyse kann durch Standardverfahren, wie Northern-Blots oder quantitative RTPCR, durchgeführt werden.
Die T1-Generation von Einzelgenort-Insertionen der T-DNA kann bezüglich des Transgens in einem Verhältnis von 3:1 segregieren. Diejenigen Nachkommen, die eine oder zwei Kopien des Transgens enthalten, können gegenüber dem Imidazolinon-Herbizid tolerant sein. Homozygote T2-Pflanzen können ähnliche Phänotypen wie die T1-Pflanzen aufweisen. Hybrid-Pflanzen (F1-Nachkommen) von homozygoten transgenen Pflanzen und nicht-transgenen Pflanzen können ebenfalls verstärkte ähnliche Phänotypen aufweisen.
Gentechnische Veränderung von Weizenpflanzen durch Unterdrücken der Aktivität oder Expression eines Gens, z. B. eines Genhomologen zu einem Gen, das die SEQ-ID NR.: 27 umfasst, in Weizen.
Die Transformation von Weizen kann mit Hilfe des Verfahrens durchgeführt werden, das von Ishida et al. (Nature Biotech. 14745 (1996)) beschrieben wurde. Bei der Transformation kann gewöhnlich das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CYMMIT, Mexiko) verwendet werden. Unreife Embryos können mit Agrobacterium tumefaciens, welche ”superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert werden, und transgene Pflanzen können durch Organogenese rückgewonnen werden. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco kann in den WO-Patenten WO 94/00977 und WO 95/06722 beschrieben werden. Die Vektoren wurden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patent 6 025 541 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren der Repressionskassette verwendet werden, um eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulation des Antisense, der RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, des Cosuppressionskonstrukts, des Ribozymmoleküls oder des viralen Nukleinsäuremoleküls vorzusehen. In diesem Beispiel kann der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet werden, um eine konstitutive Expression der Repressionskassette vorzusehen.
Nach Inkubation mit Agrobacterium können die Embryonen auf Kallusinduktionsmedium, anschließend Regenerationsmedium das Imidazolinon als einem Selektionsmittel enthält, wachsen gelassen werden. Die Petri-Schalen können im Licht bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, oder bis sich Schösslinge entwickeln, inkubiert werden. Die grünen Schösslinge von jedem Embryo können zu einem Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C 2 bis 3 Wochen lang inkubiert werden, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Schösslinge können im Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt werden. T1-Samen können aus Pflanzen erzeugt werden, welche eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und welche eine unterdrückte Expression des zu reprimierenden Gens zeigen. Eine derartige Analyse kann durch Standardverfahren, wie Northern-Blots oder quantitative RTPCR, durchgeführt werden.
Die T1-Generation von Einzelgenort-Insertionen der T-DNA kann bezüglich des Transgens in einem Verhältnis von 3:1 segregieren. Diejenigen Nachkommen, die eine oder zwei Kopien des Transgens enthalten, können gegenüber dem Imidazolinon-Herbizid tolerant sein. Homozygote T2-Pflanzen wiesen ähnliche Phänotypen auf.
Gentechnische Veränderung von Raps(samen)/Canola-Pflanzen durch Unterdrücken der Aktivität oder Expression eines Gens, z. B. eines Genhomologen zu einem Gen, das die SEQ-ID NR.: 27 umfasst, in Raps/Canola-Pflanzen.
Kotyledonäre Petiolen und Hypokotyle von 5–6 Tage alten Jung-Setzlingen können als Explantate für Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (Plant Cell Rep. 17, 183 (1998)) transformiert werden. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) kann die Standardvarietät sein, die für die Transformation verwendet wird, aber andere Varietäten können verwendet werden.
Agrobacterium tumefaciens LBA4404, das einen binären Vektor enthält, kann für die Canola-Transformation eingesetzt werden. Für die Transformation von Pflanzen sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An, G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Bd. 44, S. 47–62, Hrsg. Gartland K. M. A. und Davey M. R., Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele können auf dem Vektor pBIN19 basiert sein, beschrieben von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)), der eine Pflanzliche Genexpressionskassette enthält, die von den linken und rechten Border-Sequenzen aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens flankiert wird. Eine Pflanzliche Genexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem pflanzlichen Promotor, der die Transkription der Repressionskassette des Merkmal-Gens reguliert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet wer den, einschließlich des Arabidopsis-Gens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patente 5 7673 666 und 6 225 105 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren der Repressionskassette verwendet werden, um eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulation des Antisense, der RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, des Cosuppressionskonstrukts, des Ribozymmoleküls oder des viralen Nukleinsäuremoleküls vorzusehen. In diesem Beispiel kann der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet werden, um eine konstitutive Expression der Repressionskassette vorzusehen.
Canola-Samen können in 70%-igem Ethanol während 2 min, und dann in 30%-igem Clorox mit einem Tropfen Tween-20 während 10 min oberflächensterilisiert werden, gefolgt von drei Spülungen mit sterilisiertem, destilliertem Wasser. Die Samen können dann in vitro 5 Tage auf MS-Medium von halber Stärke ohne Hormone, 1% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 h Licht, auskeimen gelassen werden. Die Kotyledon-Petiolen-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon können aus den In-vitro-Setzlingen herausgeschnitten werden und können mit Agrobacterium durch Eintauchen des geschnittenen Endes des Petiolen-Explantats in die Bakteriensuspension beimpft werden. Die Explantate können dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 h Licht kultiviert werden. Nach zwei Tagen der Cokultivierung mit Agrobacterium, können die Petiolen-Explantate zu MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l), während 7 Tagen überführt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Schösslingsregeneration kultiviert werden. Wenn die Schösslinge eine Länge von 5 bis 10 mm haben können, können sie geschnitten und zu Schösslings-Elongationsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt werden. Schösslinge mit einer Länge von etwa 2 cm können auf das Bewurzelungsmedium (MS0) zur Wurzelinduktion überführt werden.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) können durch PCR analysiert werden, um die Anwesenheit von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse können durch eine Southern-Hybridisierung, in welcher DNA auf einem 1%-igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen werden kann und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt werden kann, bestätigt werden. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) kann verwendet werden, um eine Digoxigenin-markierte Sonde durch PCR herzustellen, und gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt werden. Darüber hinaus können die primären transgenen Pflanzen (T0) hinsichtlich einer unterdrückten Expression des zu reprimierenden Gens durch Standardverfahren, wie Northern-Blots oder quantitative RTPCR, analysiert werden.
Gentechnische Veränderung von Alfalfa-Pflanzen durch Unterdrücken der Aktivität oder Expression eines Gens, z. B. eines Genhomologen zu einem Gen, das die SEQ-ID NR.: 27 umfasst, in Alfalfa.
Ein regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) kann unter Anwendung des Verfahrens von McKersie et al., Plant Physiol. 119, 839 (1999), transformiert werden. Die Regeneration and Transformation von Alfalfa kann genotyp-abhängig sein, und deswegen kann eine regenerierende Pflanze erforderlich sein. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät, wie beschrieben von Brown, D. C. W., und Atanassov, A. (Plant Cell Tissue Organ Culture 4, 111 (1985)), ausgewählt werden. Alternativ, ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in Gewebekultur gewählt worden (Walker et al., Am. J. Bot. 65, 654 (1978)).
Petiolen-Explante können mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., Plant Physiol. 119, 839 (1999)) oder LBA4404, das einen binären Vektor enthält, cokultiviert werden. Für die Pflanzen-Transformation sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An, G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology, Bd. 44, S. 47–62, Hrsg. Gartland, K. M. A. und M. R. Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele können auf dem Vektor pBIN19 basiert sein, beschrieben von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)), der eine Pflanzliche Genexpressionskassette enthält, die von den linken und rechten Border-Sequenzen aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens flankiert wird. Eine pflanzliche Genexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem pflanzlichen Promotor, der die Transkription des Antisense, der RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, des Cosuppressionskonstrukts, des Ribozymmoleküls oder des viralen Nukleinsäuremoleküls reguliert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis-Gens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patente 5 7673 666 und 6 225 105 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren der Repressionskassette verwendet werden, was eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulation der Genrepression vorsieht. In diesem Beispiel kann der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet werden, um eine konstitutive Expression der Repressionskassette vorzusehen.
Die Explantate können während 3 Tagen im Dunklen auf SH-Induktionsmedium, enthaltend 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon, cokultiviert werden. Die Explantate können in Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) von halber Stärke gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeignetem Antibiotikum zum Inhibieren des Wachstums von Agrobacterium, ausplattiert werden. Nach mehreren Wochen können somatische Embryos zu BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält, überführt werden. Somatische Embryos können anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen werden. Bewurzelte Setzlinge können in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Treibhaus wachsen gelassen werden.
Die transgenen T0-Pflanzen können durch Nodus-Stecklinge bzw. -Schnitte vermehrt und in Turface-Wachstumsmedium bewurzelt werden. Die Pflanzen können entlaubt und zu einer Höhe von etwa 10 cm (ungefähr 2 Wochen nach der Entlaubung) wachsen gelassen werden. Ferner können die primären transgenen Pflanzen (T0) hinsichtlich einer unterdrückten Expression des zu reprimierenden Gens durch Standardverfahren, wie Northern-Blots oder quantitative RTPCR, analysiert werden.
Tolerante Pflanzen gemäß [0774] (Raygraspflanzen), [0783] (Sojabohnenpflanzen), [0788] (Maispflanzen), [0793] (Weizenpflanzen), [0797] (Raps/Canola) oder [0802] (Alfalfa-Pflanzen) zeigen einen gesteigerten Ertrag, insbesondere von einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. der Stickstoffverwertungseffizienz und/oder der Biomasseproduktion.
Knockout eines Gens durch eine homologe Rekombination, z. B. eines Gens, das die in der SEQ-ID NR.: 27 gezeigte Sequenz umfasst.
1. Identifizieren von Mutationen in dem Gen in statistisch mutagenisierten Populationen:
a) In einer chemisch oder durch Strahlung mutierten Population
Die Erzeugung von chemisch oder durch Strahlung mutierten Populationen kann eine übliche Technik und dem Fachmann bekannt sein. Die Verfahren können von Koorneef et al., 1982, und den Zitaten darin, und von Lightner und Caspar in "Methods in Molecular Biology" Bd. 82, beschrieben sein. Diese Techniken induzieren in der Regel Punktmutationen, die in einem beliebigen bekannten Gen unter Verwendung von Verfahren wie TILLING (Colbert et al. 2001) identifiziert werden können.
b) In einer durch T-DNA oder Transposon mutierten Population durch eine reverse Genetik.
Strategien der reversen Genetik zum Identifizieren von Insertionsmutanten in Genen von Interesse sind für verschiedene Fälle beschrieben worden, siehe z. B. Krysan et al. (Plant Cell 11, 2283 (1999)); Sessions et al. (Plant Cell 14, 2985 (2002)); Young et al. (Plant Physiol. 125, 513 (2001)); Koprek et al. (Plant J. 24, 253 (2000)); Jeon et al. (Plant J. 22, 561 (2000)); Tissier et al. (Plant Cell 11, 1841 (1999)); Speulmann et al. (Plant Cell 11, 1853 (1999)). Kurz gesagt, kann Material aus allen Pflanzen einer großen durch T-DNA oder Transposon mutagenisierten Pflanzenpopulation geerntet und genomische DNA präpariert werden. Dann kann die genomische DNA unter Befolgung spezifischer Architekturen, wie zum Beispiel bei Krysan et al. (Plant Cell 11, 2283 (1999)) beschrieben, gepoolt bzw. vereinigt werden. Pools von genomischen DNAs können dann durch spezifische Multiplex-PCR-Reaktionen gescreent werden, wobei die Kombination des insertionalen Mutagens (z. B. T-DNA oder Transposon) und des Gens von Interesse nachgewiesen wird. Daher können PCR-Reaktionen an den DNA-Pools mit spezifischen Kombinationen von T-DNA- oder Transposon-Border-Primern und genspezifischen Primern ausgeführt werden. Allgemeine Regeln für das Primerdesign können wiederum aus Krysan et al. (Plant Cell 11, 2283 (1999)) entnommen werden. Das Rescreening von DNA-Pools auf niedrigeren Ebenen führt zur Identifizierung einzelner Pflanzen, in denen das Gen von Interesse durch das insertionale Mutagen disruptiert ist.
Äquivalente
Der normale Fachmann im Fachbereich wird viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der hierin beschrieben Erfindung erkennen oder mit Hilfe von lediglich routinemäßigem Experimentieren ermitteln können. Derartige Äquivalente können beabsichtigtermaßen von den nachfolgenden Patentansprüchen abgedeckt werden.
Figuren
Zusammenfassung
Pflanzen mit erhöhtem Ertrag (KO NUE)
Diese Erfindung betrifft allgemein transformierte Pflanzenzellen und Pflanzen oder Teile davon, die ein inaktiviertes oder herunterreguliertes Gen umfassen, was zu einem erhöhten Ertrag, insbesondere einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, wie einer erhöhten Stickstoffverwertungseffizienz und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion, verglichen mit, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Zellen, führt, sowie Verfahren zur Herstellung solcher Pflanzenzellen oder Pflanzen oder Teile davon.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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- WO 99/32619 [0297, 0301]
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- US 480134100 [0322]
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Claims

Verfahren zur Erhöhung des Ertrags einer Pflanze im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyp-Pflanze, welches das Verringern von einer oder mehreren Aktivitäten, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und die SET-Domäne enthaltendem Protein besteht, in der Pflanze oder einem Teil davon umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon mit gesteigertem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren von einer oder mehreren Aktivitäten, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus At1g74730-Protein, At3g63270-Protein, Proteinkinase, Protein-Serin/Threonin-Phosphatase und die SET-Domäne enthaltendem Protein besteht, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon; und (b) Erzeugen einer transformierten Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon mit gesteigerter NUE und/oder erhöhter Biomassenproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon, und Wachsenlassen unter Bedingungen, welche die Entwicklung von der Pflanzenzelle, Pflanze oder des Teils davon ermöglichen.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon mit gesteigertem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Reduzieren, Unterdrücken oder Deletieren der Aktivität von (i) einem Polypeptid, das ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder mindestens ein Polypeptidmotiv, wie in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle II bzw. der Tabelle IV aufgeführt, umfasst; oder (ii) einem Expressionsprodukt eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polynukleotid, wie in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle I aufgeführt, umfasst, (iii) oder einem funktionellen Äquivalent von (i) oder (ii); in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, und (b) Erzeugen einer transformierten Pflanze mit gesteigerter NUE und/oder erhöhter Biomassenproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon und Wachsenlassen unter Bedingungen, welche die Entwicklung der Pflanze ermöglichen.
Verfahren wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, umfassend das Reduzieren, Vermindern oder Deletieren der Expression oder Aktivität von mindestens einem Nukleinsäuremolekül, das die Aktivität von mindestens einem Nukleinsäuremolekül aufweist oder codiert, repräsentiert durch das Nukleinsäuremolekül, wie es in der Spalte 5 der Tabelle I aufgeführt ist, und umfassend ein Nukleinsäuremolekül, welches aus der Gruppe gewählt wird, die aus folgendem besteht: (a) einem Nukleinsäuremolekül, welches das in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle II gezeigte Polypeptid codiert; (b) einem Nukleinsäuremolekül, das in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle I gezeigt ist; (c) einem Nukleinsäuremolekül, welches als ein Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes von einer Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann, die in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle II aufgeführt ist; (d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, welches das in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle I gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das mindestens 30% Identität zu der Aminosäuresequenz von dem Polypeptid aufweist, das durch das Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) codiert wird, und die Aktivität besitzt, die durch ein Nukleinsäuremolekül repräsentiert wird, welches ein Polynukleotid umfasst, wie es in der Spalte 5 der Tabelle I aufgeführt ist; (f) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches mit der Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid hergestellt wurden, welches durch eines der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) codiert wird und die Aktivität besitzt, die durch das Nukleinsäuremolekül repräsentiert wird, welches ein Polynukleotid umfasst, wie es in der Spalte 5 der Tabelle I aufgeführt ist; (g) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive, wie in der Spalte 7 der Tabelle IV gezeigt, umfasst und vorzugsweise die Aktivität besitzt, die durch ein Nukleinsäuremolekül repräsentiert wird, welches ein Polynukleotid umfasst, wie es in der Spalte 5 der Tabelle II oder IV aufgeführt ist; (h) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität aufweist, die durch ein Protein repräsentiert wird, wie es in der Spalte 5 der Tabelle II aufgeführt ist; (i) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, welches erhalten wird durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in der Spalte 7 der Tabelle III, welche nicht an ihrem 5'-Ende mit den Nukleotiden ATA starten, und vorzugsweise die Aktivität besitzt, die durch ein Nukleinsäuremolekül repräsentiert wird, welches ein Polynukleotid umfasst, wie es in der Spalte 5 der Tabelle II oder IV aufgeführt ist; (j) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid durch Substituieren, Deletieren und/oder Hinzufügen von einer oder mehreren Aminosäuren von der Aminosäuresequenz des Polypeptids abgeleitet ist, das durch die Nukleinsäuremoleküle (a) bis (d) codiert wird; und (k) einem Nukleinsäuremolekül, das erhältlich ist durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, welche eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, aufweisend mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt eines Nukleinsäuremoleküls, das zu einer Nukleinsäuremolekülsequenz komplementär ist, die in (a) bis (d) charakterisiert ist und ein Polypeptid mit der Aktivität codiert, welche durch ein Protein repräsentiert wird, das ein Polypeptid umfasst, wie es in der Spalte 5 der Tabelle II gezeigt ist; oder welches eine Sequenz aufweist, die komplementär dazu ist; oder Reduzieren, Unterdrücken, Vermindern oder Deletieren eines Expressionsproduktes von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie es in (a) bis (k) aufgeführt ist, z. B. eines Polypeptids, welches ein Polypeptid umfasst, wie es in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle II gezeigt ist; oder eines Proteins, welches durch das Nukleinsäuremolekül codiert wird.
Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, umfassend das Verringern der Aktivität oder der Expression eines Polypeptids, welches ein Polypeptid umfasst, das durch das Nukleinsäuremolekül codiert wird, welches in Anspruch 3 charakterisiert ist, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon.
Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren mindestens einen Schritt umfasst, der aus der Gruppe gewählt wird, die aus folgendem besteht: (a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das eine Ribonukleinsäuresequenz codiert, welche in der Lage ist, ein doppelsträngiges Ribonukleinsäuremolekül zu bilden, wobei ein Fragment von mindestens 17 nt des doppelsträngigen Ribonukleinsäuremoleküls eine Homologie von mindestens 50% zu einem Nukleinsäuremolekül aufweist, welches aus der Gruppe von folgendem gewählt wird: (i) einem Nukleinsäuremolekül, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3 charakterisiert ist; (ii) einem Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 oder 7 der Tabelle I aufgeführt ist oder das ein Polypeptid codiert, wie es in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II aufgeführt ist, und (iii) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid mit der Aktivität vom Polypeptid, das in der Spalte 5 der Tabelle II aufgeführt ist, codiert, oder das Expressionsprodukt eines Polynukleotids codiert, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, wie es in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle I aufgeführt ist; (b) Einbringen eines RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmoleküls, Ribozyms oder Antisense-Nukleinsäuremoleküls, wobei das RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmolekül, Ribozym oder Antisense-Nukleinsäuremolekül ein Fragment von mindestens 17 nt mit einer Homologie von mindestens 50% zu einem Nukleinsäuremo lekül umfasst, das aus einer Gruppe gewählt wird, die in Abschnitt (a) dieses Anspruchs definiert wird; (c) Einbringen eines Ribozyms, welches ein Nukleinsäuremolekül spezifisch spaltet, das aus der Gruppe gewählt wird, die in Abschnitt (a) dieses Anspruchs definiert wird; (d) Einbringen des RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmoleküls, Ribozyms oder Antisense-Nukleinsäuremoleküls, charakterisiert in (b), und des Ribozyms, welches in (c) charakterisiert ist; (e) Einbringen eines Sense-Nukleinsäuremoleküls, das die Expression von einem Nukleinsäuremolekül herbeiführt, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, welches aus der Gruppe gewählt wird, die in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 definiert ist, oder in dem Abschnitt (a)(ii) oder (a)(iii) von diesem Anspruch definiert ist, oder ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit mindestens 50% Identität mit der Aminosäuresequenz von dem Polypeptid codiert, welches durch das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 3 (a) bis (c) codiert wird und die Aktivität besitzt, welche durch ein Protein repräsentiert wird, das ein Polypeptid umfasst, welches in Spalte 5 der Tabelle II aufgeführt ist, zum Induzieren einer Cosuppression des endogenen Expressionsprodukts; (f) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das die Expression einer dominant-negativen Mutante eines Proteins herbeiführt, das die Aktivität eines Proteins, wie es in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II aufgeführt ist, aufweist oder ein Polypeptid umfasst, welches durch ein Nukleinsäuremolekül, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 charakterisiert ist, codiert wird; (g) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das einen Faktor codiert, welcher an ein Nukleinsäuremolekül bindet, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe gewählt wird, die in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 definiert wird oder in Abschnitt (a)(ii) oder (a)(iii) von diesem Anspruch definiert wird, wobei die Expression eines Proteins herbeigeführt wird, das die Aktivität eines Proteins besitzt, welches durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird, wie es durch einen beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 charakterisiert ist; (h) Einbringen eines viralen Nukleinsäuremoleküls, das den Abbau bzw. die Abnahme eines RNA-Moleküls herbeiführt, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe gewählt wird, die in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 definiert wird oder in Abschnitt (a)(ii) oder (a)(iii) von diesem Anspruch definiert wird, wobei die Expression eines Proteins herbeigeführt wird, welches durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird, wie es durch einen beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 charakterisiert ist; (i) Einbringen eines Nukleinsäurekonstruktes, das in der Lage ist, mit einem endogenen Gen zu rekombinieren und dessen Aktivität zu silencen bzw. es stumm zu schalten, zu inaktivieren, zu unterdrücken oder zu reduzieren, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe gewählt wird, die in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 definiert wird oder in Abschnitt (a)(ii) oder (a)(iii) von diesem Anspruch definiert wird, wobei die Expression eines Proteins herbeigeführt wird, welches durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird, wie es durch einen beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 charakterisiert ist; (j) Einbringen einer Nicht-Silent-Mutation in ein endogenes Gen, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe gewählt wird, die in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 definiert wird oder in Abschnitt (a)(ii) oder (a)(iii) von diesem Anspruch definiert wird; und (k) Einbringen eines Expressionskonstruktes, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls herbeiführt, welches in einem von (a) bis (i) charakterisiert ist.
Verfahren wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, wobei ein Fragment von mindestens 17 bp einer 3'- oder 5'-Nukleinsäuresequenz einer Sequenz, die ein Nukleinsäuremolekül, das aus der Gruppe gewählt ist, die in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 definiert ist oder in Abschnitt (a)(ii) oder (a)(iii) von diesem Anspruch definiert ist, mit einer Identität von mindestens 50% umfasst, für die Reduktion des Nukleinsäuremoleküls, welches in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 charakterisiert ist, oder des Polypeptids, welches durch das Nukleinsäuremolekül codiert wird, verwendet wird.
Verfahren, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, wobei die Pflanze aus der Gruppe gewählt wird, die aus Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, perennierendem bzw. winterhartem Gras, Viehfutterpflanzen, Gemüsepflanzen und Zierpflanzen besteht.
Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, umfassend den Schritt des Einbringens von einem RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, einem Cosuppressionsmolekül, Ribozym, Antikörper und/oder einer Antisense-Nukleinsäure, welche entworfen wurde, um das Expressionsprodukt eines Gens anzusteuern, welches das Nukleinsäuremolekül umfasst, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 charakterisiert ist, um einen Abbau bzw. eine Abnahme der mRNA des Gens von Interesse zu induzieren und dadurch die Genexpression stumm zu schalten, oder von einer Expressionskassette, welche die Expression des ersteren sicherstellt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: (a) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, umfassend das Polypeptid, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIB gezeigt ist; (b) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IB gezeigt ist; (c) ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes aus einer Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann, welche in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIB aufgeführt ist und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführte Protein; (d) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das mindestens 50% Identität mit der Aminosäuresequenz eines Polypeptids aufweist, welches von dem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (c) codiert wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführte Protein; (e) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid isoliert wird, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (c) codiert wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführte Protein; (f) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das die Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie aufgeführt in Spalte 7 von Tabelle IV, umfasst und die biologische Aktivität aufweist, repräsentiert durch das in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführte Protein; (g) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II; (h) Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das erhalten wird durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III, welche an ihrem 5'-Ende nicht mit den Nukleotiden ATA beginnen; und (i) ein Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine der Sequenzen des Nukleinsäuremoleküls von (a) bis (c), oder mit einem Fragment von mindestens 17 nt des Nukleinsäuremoleküls, das in einem beliebigen von (a) bis (h) charakterisiert ist, erhältlich ist und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Protein, aufgeführt in Spalte 5 von Tabelle II; oder das eine Sequenz umfasst, die dazu komplementär ist; wobei das Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (i) wenigstens in einem oder mehreren Nukleotiden unterschiedlich zu der in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA aufgeführten Sequenz ist und vorzugsweise ein Protein codiert, das sich wenigstens in einer oder mehreren Aminosäuren von den in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA aufgeführten Proteinsequenzen unterscheidet.
RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmolekül, Ribozym, Antikörper oder Antisense-Nukleinsäuremolekül für die Reduktion der Aktivität, charakterisiert in Anspruch 1, oder die Aktivität oder Expression eines Nukleinsäuremoleküls, wie in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 10 charakterisiert, oder eines Polypeptids, welches durch das Nukleinsäuremolekül codiert wird.
RNAi-, snRNA-, dsRNA-, siRNA-, miRNA-, ta-siRNA-, Cosuppressionsmolekül, Ribozym, oder Antisense-Nukleinsäuremolekül von Anspruch, umfassend ein Fragment von mindestens 17 nt des Nukleinsäuremoleküls von Anspruch 10.
Doppelsträngiges RNA-(dsRNA), RNAi-, snRNA-, siRNA-, miRNA-, Antisense- oder ta-siRNA-Molekül oder Ribozym, das fähig zur Bildung eines doppelsträngigen Ribonukleinsäuremoleküls ist, wobei ein Fragment von mindestens 17 nt des doppelsträngigen Ribonukleinsäuremoleküls eine Homologie von mindestens 50% zu einem Nukleinsäuremolekül aufweist, das aus der folgenden Gruppe gewählt wird (i) ein Nukleinsäuremolekül, wie charakterisiert in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3; (ii) ein Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 oder 7 der Tabelle I aufgeführt, oder codierend ein Polypeptid, wie in der Spalte 5 oder 7 von Tabelle II aufgeführt, und (iii) ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid mit der Aktivität eines in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II aufgeführten Polypeptids, oder codierend das Expressionsprodukt eines Polynukleotids, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I.
dsRNA-Molekül von einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 13, wobei der Sense-Strang und der Antisense-Strang kovalent miteinander verbunden sind und der Antisense-Strang im wesentlichen das Komplementär des ”Sense”-RNA-Stranges ist.
Virales Nukleinsäuremolekül, das die Abnahme von einem RNA-Molekül, welches die Expression von einem Protein mit der in Anspruch 1 charakterisierten Aktivität herbeiführt, oder von der Aktivität oder Expression eines Nukleinsäuremoleküls, wie in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 10 charakterisiert, oder einem Polypeptid, welches durch das Nukleinsäuremolekül codiert wird, herbeiführt.
Tilling-Primer für die Identifizierung eines Knockouts eines Gens, umfassend eine Nukleinsäuresequenz eines Nukleinsäuremoleküls, wie aufgeführt in einer beliebigen von Spalte 5 oder 7 der Tabelle I.
Dominant-negative Mutante vom Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, wie es in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigt ist.
Nukleinsäuremolekül, das die dominant-negative Mutante von Anspruch 17 codiert.
Tilling-Primer von Anspruch 16, umfassend ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, oder ein komplementäres Fragment davon.
Nukleinsäurekonstrukt, das die Expression von RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Cosuppressionsmolekül, Ribozym, Antikörper oder Antisense-Nukleinsäuremolekül von einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14, von dem viralen Nukleinsäuremolekül von Anspruch 15 oder von dem Nukleinsäuremolekül von Anspruch 10 herbeiführt.
Nukleinsäurekonstrukt, umfassend ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wie beansprucht in Anspruch 10, oder die RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, das Cosuppressionsmolekül, Ribozym oder Antisense-Nukleinsäuremolekül von einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14, oder das virale Nukleinsäuremolekül von Anspruch 15, wobei das Nukleinsäuremolekül in funktionstüchtiger Weise an ein oder mehrere regulatorische Signale verknüpft ist.
Vektor, umfassend das in Anspruch 10 beanspruchte Nukleinsäuremolekül oder die RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, das Cosuppressionsmolekül, Ribozym, Antisense-Nukleinsäuremolekül von einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14, oder das virale Nukleinsäuremolekül von Anspruch 15, oder das Nukleinsäurekonstrukt, wie beansprucht in Anspruch 21.
Vektor, wie beansprucht in Anspruch 22, wobei das Nukleinsäuremolekül sich in funktionsfähiger Verknüpfung mit regulatorischen Sequenzen für die Expression in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon befindet.
Transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder ein Teil davon, welche/welcher stabil oder transient mit dem Vektor, wie beansprucht in Anspruch 22 oder 23, oder dem Nukleinsäuremolekül, wie beansprucht in Anspruch 10, oder dem Nukleinsäurekonstrukt, wie beansprucht in Anspruch 20 oder 21, transformiert worden ist,
Transgene Pflanzenzelle, eine Pflanze oder ein Teil davon, wobei die Aktivität eines Proteins, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II, vorzugsweise Tabelle IIB oder IV, aufgeführt, oder eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle I, vorzugsweise Tabelle IB, aufgeführt, reduziert ist.
Transgene Pflanzenzelle, eine Pflanze oder ein Teil davon gemäß Anspruch 24 oder 25, abgeleitet aus einer monokotyledonen Pflanze.
Transgene Pflanzenzelle, eine Pflanze oder ein Teil davon gemäß Anspruch 24 oder 25, abgeleitet aus einer dikotyledonen Pflanze.
Transgene Pflanzenzelle, eine Pflanze oder ein Teil davon gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei die Pflanze aus der Gruppe bestehend aus Mais (Zea), Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Soja, Erdnuss, Baumwolle, Ölsamen-Raps (einschließlich Canola und Winter-Ölsamenraps), Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Flachs, Bor retsch, Saflor, Leinsamen, Primel, Rübsamen, Steckrübe bzw. Rübsen, Tagetes, Nachtschattengewächsen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Spezies, Ölpalme, Kokosnuss, winterhartem Gras, Futterpflanzen und Arabidopsis thaliana gewählt ist.
Transgene Pflanzenzelle, eine Pflanze oder ein Teil davon gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei die Pflanze aus der Gruppe gewählt wird, die aus Mais, Soja, Ölsamen-Raps (einschließlich Canola und Winter-Ölsamenraps), Baumwolle, Weizen und Reis besteht.
Isoliertes Polypeptid, das durch ein Nukleinsäuremolekül, wie beansprucht in Anspruch 10, codiert wird oder das Polypeptid, wie es in Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, umfasst.
Antikörper, der an das Polypeptid, wie beansprucht in Anspruch 31, spezifisch bindet.
Pflanzengewebe, Pflanze, abgeerntetes Pflanzenmaterial oder Fortpflanzungsmaterial einer Pflanze, umfassend die Pflanzenzelle, wie beansprucht in Anspruch 24 oder 25.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, codiert von einer Nukleinsäuresequenz, wie beansprucht in Anspruch 10, wobei das Polypeptid in einer Wirtszelle, wie beansprucht in Anspruch 24 oder 25, exprimiert wird.
Transgene Pflanzenzelle, eine Pflanze oder ein Teil davon gemäß Anspruch 24 oder 25, welche einen gesteigerten Ertrag unter Bedingungen aufweist, bei denen Stickstoff für das Wachstum für eine nicht-transformierte Wildtyp-Pflanzenzellen, eine -Pflanze oder einen Teil davon begrenzend wäre.
Verfahren zum Screening nach einem Antagonisten der Aktivität, wie charakterisiert in Anspruch 1 oder repräsentiert durch das Polypeptid, das von dem in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 charakterisierten Nukleinsäuremolekül codiert wird, umfassend: i) Inkontaktbringen eines Organismus, seiner Zellen, seiner Gewebe oder seiner Teile, die das Polypeptid exprimieren, mit einer chemischen Verbindung oder einer Probe, welche eine Vielzahl chemischer Verbindungen enthält, unter Bedin gungen, welche die Reduktion oder Deletion der Expression des Nukleinsäuremoleküls, das die von dem Protein repräsentierte Aktivität codiert, gestatten oder welche die Reduktion oder Deletion der Aktivität des Proteins gestatten; ii) Assay hinsichtlich der Höhe der Aktivität des Proteins oder der Polypeptidexpressionshöhe in der Pflanze, ihren Zellen, Geweben oder Teilen davon; und iii) Identifizieren eines Antagonisten durch Vergleichen der gemessenen Höhe der Aktivität des Proteins oder der Polypeptidexpressionshöhe mit einer Standardhöhe der Aktivität des Proteins oder der Polypeptidexpressionshöhe, welche in Abwesenheit der chemischen Verbindung oder einer Probe, welche die Vielzahl chemischer Verbindungen enthält, gemessen wird, wobei eine verringerte Höhe im Vergleich zum Standard zeigt, dass es sich bei der chemischen Verbindung oder der Probe, welche die Vielzahl chemischer Verbindungen enthält, um einen Antagonisten handelt.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche in einer Pflanze gesteigerten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze herbeiführt, das die folgenden Schritte umfasst: (i) Kultivieren oder Halten einer Pflanze oder eines Teils davon, welche(r) das Polypeptid mit der in Anspruch 1 charakterisierten Aktivität oder das Polypeptid, das von dem in einem beliebigen der Ansprüche 2 oder 3 charakterisierten Nukleinsäuremolekül codiert wird, oder ein das Polypeptid codierendes Polynukleotid sowie ein Ablesungssystem exprimiert, das zur Wechselwirkung mit dem Polypeptid unter geeigneten Bedingungen fähig ist, welche die Interaktion des Polypeptids mit diesem Ablesungssystem in Gegenwart einer chemischen Verbindung oder einer Probe, welche eine Vielzahl chemischer Verbindungen enthält, gestatten, und das zur Abgabe eines nachweisbaren Signals in Antwort auf die Bindung einer chemischen Verbindung an das Polypeptid unter Bedingungen fähig ist, welche die Depression des Ablesungssystems und des Polypeptids erlauben; und (ii) Feststellen, ob die chemische Verbindung ein effektiver Antagonist ist, durch Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit oder Verringerung oder Erhöhung eines von dem Ablesungssystem erzeugten Signals.
Zusammensetzung, die das Protein gemäß Anspruch 30, das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 10, das Nukleinsäurekonstrukt von Anspruch 20 oder 21, den Vektor von Anspruch 22 oder 23, den gemäß Anspruch 35 identifizierten Antagonisten, den Antikörper von Anspruch 31, die Pflanze von einem beliebigen der Ansprüche 24 bis 29, das Nukleinsäuremolekül, charakterisiert in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3, die RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, das Cosuppressionsmolekül, Ribozym oder Antisense-Nukleinsäuremolekül von einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14 und gegebenenfalls einen landwirtschaftlich annehmbaren Träger umfasst.
Nahrungs- oder Futtermittelzusammensetzung, die das Protein gemäß Anspruch 30, das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 10, das Nukleinsäurekonstrukt von Anspruch 20 oder 21, den Vektor von Anspruch 22 oder 23, den gemäß Anspruch 35 identifizierten Antagonisten, den Antikörper von Anspruch 31, die Pflanze von einem beliebigen der Ansprüche 24 bis 29, das Nukleinsäuremolekül, welches in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 3 charakterisiert ist die RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, das Cosuppressionsmolekül, Ribozym oder Antisense-Nukleinsäuremolekül von einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14, die Pflanze, Pflanzengewebe, das abgeerntete Pflanzenmaterial oder Fortpflanzungsmaterial einer Pflanze von Anspruch 32 oder 36 umfasst.
Verwendung von i) dem Nukleinsäuremolekül gemäß einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14, dem viralen Nukleinsäuremolekül von Anspruch 15 oder dem Nukleinsäuremolekül von Anspruch 10, oder ii) dem Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 20 oder 21, oder iii) dem Vektor von Anspruch 22 oder 23; zur Herstellung einer Pflanzenzelle mit gesteigerter NUE und/oder erhöhter Biomassenproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Pflanzenteil.
Verfahren zum Bestimmen des Stickstoffgehalts von Testerdboden, umfassend die folgenden Schritte: a) gegebenenfalls Wachsenlassen einer Pflanze, die das Nukleinsäuremolekül gemäß einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14 umfasst, in einem Erdboden ohne Stickstoffmangel; Vergleichen des Ertrags und Bestimmen des Ertragsunter schieds der Pflanze mit dem Ertrag einer Kontrollpflanze, die in dem Erdboden wachsen gelassen wird, vorzugsweise mit einer Wildtyp-Pflanze, und Selektion der Pflanze, wenn die Pflanze nicht einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu der Kontrollpflanze zeigt; b) Wachsenlassen der Pflanze, die das Nukleinsäuremolekül gemäß einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14 umfasst, in einem zu testenden Erdboden, c) Vergleichen des Ertrags und Bestimmen des Ertragsunterschiedes der erzeugten Pflanze mit dem Ertrag einer Kontrollpflanze, die in dem Erdboden unter den gleichen Bedingungen wachsen gelassen wird, vorzugsweise mit einer Wildtyp-Pflanze, wobei ein gesteigerter Ertrag der Pflanze im Vergleich zu der Kontrollpflanze einen Stickstoffmangel des Erdbodens anzeigt.