DE112009002267T5

DE112009002267T5 - Pflanzen mit erhöhtem Ertrag (LT)

Info

Publication number: DE112009002267T5
Application number: DE112009002267T
Authority: DE
Inventors: Dr. Bläsing Oliver; Dr. Thimm Oliver; Dr. Ritte Gerhard; Dr. Schön Hardy
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2008-09-23
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2012-01-19
Also published as: CN102224246A; BRPI0919153A2; US20110195843A1; CA2736473A1; EP2337853A1; AR073668A1; AU2009295982A1; WO2010034672A1

Abstract

Ein Verfahren zum Erzeugen einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyppflanze, umfassend mindestens den folgenden Schritt: Erhöhen oder Erzeugen in einer Pflanze oder einem Teil davon einer oder mehrerer Aktivität(en), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein; Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-Trans-isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein-Aktivität.

Description

Die vorliegende, hierin offenbarte Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyppflanze bereit, umfassend das Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivität(en) in einer Pflanze oder einem Teil davon. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuren, die ein oder mehrere Merkmale einer transgenen Pflanze, und von Zellen, Früchten, Samen und Pollen, die von solchen Pflanzen oder Teilen abgeleitet sind, verstärken oder verbessern, wie auch Verfahren zur Herstellung und Verfahren zur Verwendung einer bzw. eines solchen (solcher) Pflanzenzelle(n) oder Pflanze(n), Frucht (Früchte), Samen(s) oder Pollen(s). Insbesondere manifestieren sich solche verbesserten Merkmale in einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise durch Verbesserung eines oder mehrerer ertragsbezogener Merkmale.
Unter Feldbedingungen hängt die Leistung einer Pflanze, zum Beispiel hinsichtlich Wachstum, Entwicklung, Biomassenansammlung und Samenerzeugung, von der Toleranz und Akklimatisierungsfähigkeit einer Pflanze an zahlreiche Umweltbedingungen, Veränderungen und Stress ab. Seit dem Beginn der Landwirtschaft und Gartenbauwirtschaft besteht ein Bedarf an einer Verbesserung von Pflanzenmerkmalen im Nutzpflanzenanbau. Vermehrungsstrategien tragen dazu bei, dass Nutzpflanzeneigenschaften biotischem und abiotischem Stress widerstehen, um die Nährstoffnutzungseffizienz zu verbessern und andere intrinsische, für Nutzpflanzen spezifische Ertragsparameter zu verändern, d. h. Erhöhen des Ertrags durch Anwendung technischer Fortschritte. Pflanzen sind festgewachsene Organismen und müssen folglich verschiedene Umweltstresssituationen bewältigen. Biotischer Stress, wie Pflanzenschädlinge und Pathogene einerseits und abiotischer Umweltstress andererseits, sind die wesentlichen einschränkenden Faktoren für Pflanzenwachstum und Produktivität (Bayer, Plant Productivity and Environment, Science 218, 443–448 (1982); Bohnert et al., Adaptation to Environmental Stresses, Plant Cell 7 (7), 1099–1111 (1995)), wodurch die Pflanzenkultivierung und geographische Verteilung eingeschränkt sind. Pflanzen, die verschiedenen Stresssituationen ausgesetzt sind, haben für gewöhnlich geringe Erträge an Pflanzenmaterial, wie Samen, Frucht oder anderen Erzeugnissen. Nutzpflanzenverluste und Nutzpflanzenertragsverluste, die durch abiotischen und biotischen Stress verursacht werden, stellen einen signifikanten wirtschaftlichen und politischen Faktor dar und tragen, insbesondere in vielen unterentwickelten Ländern, zur Nahrungsmittelknappheit bei.
Herkömmliche Mittel für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und im Gartenbau verwenden heute selektive Vermehrungstechniken zur Identifizierung von Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften. fortschritte in der Molekularbiologie haben die Modifizierung des Keimplasmas von Pflanzen in spezifischer Weise ermöglicht. Zum Beispiel führte die Modifizierung eines einzigen Gens in mehreren Fällen zu einer signifikanten Erhöhung z. B. in der Stresstoleranz (Wang et al., 2003) wie auch in anderen ertragsbezogenen Merkmalen. Es besteht ein Bedarf, Gene zu identifizieren, die gegen verschiedene Kombinationen von Stress Resistenz verleihen oder die unter suboptimalen Wachstumsbedingungen einen erhöhten Ertrag liefern. Es besteht noch immer ein Bedarf an der Identifizierung von Genen, die die gesamte Fähigkeit einer Ertragsverbesserung von Pflanzen verleihen.
Ferner haben Bevölkerungszuwächse und Klimaänderungen die Möglichkeit einer globalen Nahrungsmittel-, Futter- und Brennstoffknappheit in den letzten Jahren in den Brennpunkt des Interesses gerückt. Landwirtschaft verbraucht 70% des Wassers, das von Menschen verwendet wird, zu einer Zeit, in der Regenfälle in vielen Teilen der Welt abnehmen. Da sich zusätzlich die Landnutzung von landwirtschaftlichen Betrieben hin zu Städten und Vororten verschiebt, stehen weniger Hektar Ackerland zum Züchten landwirtschaftlicher Nutzpflanzen zur Verfügung. Die landwirtschaftliche Biotechnologie hat versucht, die steigenden Bedürfnisse der Menschheit durch genetische Modifizierungen von Pflanzen zu erfüllen, die den Ertrag von Nutzpflanzen erhöhen könnten, indem sie zum Beispiel eine bessere Toleranz gegen abiotische Stressreaktionen verleihen oder die Biomasse erhöhen.
Landwirtschaftliche Biotechnologen haben Assays in Modellpflanzensystemen, Glashausstudien von Nutzpflanzen und Feldversuchen in ihrem Bemühen verwendet, transgene Pflanzen zu entwickeln, die einen erhöhten Ertrag aufweisen, entweder durch Erhöhung der abiotischen Stresstoleranz oder durch erhöhte Biomasse.
Landwirtschaftliche Biotechnologen verwenden auch Messungen anderer Parameter, die die mögliche Wirkung eines Transgens auf den Ertrag von Nutzpflanzen anzeigen. Für Futterpflanzen wie Luzerne, Wintermais und Heu korreliert die Pflanzenbiomasse mit dem Gesamtertrag. Für Kornpflanzen jedoch wurden andere Parameter zur Schätzung des Ertrags verwendet, wie Pflanzengröße, gemessen durch das Gesamttrockengewicht der Pflanze, oberirdisches Trockengewicht, oberirdisches Frischgewicht, Blattfläche, Stängelvolumen, Pflanzenhöhe, Rosettendurchmesser, Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, Sprossanzahl und Blattanzahl. Die Pflanzengröße in einer frühen Entwicklungsstufe korreliert für gewöhnlich mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann für gewöhnlich mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze und gewinnt daher wahrscheinlich in derselben Zeitperiode mehr an Gewicht. Es gibt eine starke genetische Komponente für Pflanzengröße und Wachstumsrate und somit korreliert wahrscheinlich für eine Reihe verschiedener Genotypen die Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Größe unter einer anderen. Auf diese Weise wird eine Standardumwelt zur Schätzung der verschiedenen und dynamischen Umgebungen verwendet, denen Nutzpflanzen an verschiedenen Stellen und zu verschiedenen Zeiten im Feld ausgesetzt sind.
Einige Gene, die an Stressreaktionen, Wasserverbrauch und/oder Biomasse in Pflanzen beteiligt sind, wurden charakterisiert, aber bisher war der Erfolg bei der Entwicklung transgener Nutzpflanzen mit verbessertem Ertrag begrenzt, und es wurden keine derartigen Pflanzen kommerzialisiert. Es besteht daher ein Bedarf an der Identifizierung zusätzlicher Gene, die die Kapazität haben, den Ertrag von Nutzpflanzen zu erhöhen.
Daher stellt in einer ersten Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyppflanze bereit, umfassend mindestens den folgenden Schritt: Erhöhen oder Erzeugen in einer Pflanze einer oder mehrerer Aktivität(en) (in der Folge als eine oder mehrere ”Aktivität(en)” oder eine oder mehrere der Aktivitäten oder für eine ausgewählte Aktivität als ”die Aktivität” bezeichnet), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein-Aktivität.
Daher stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform eine transgene Pflanze bereit, die ein isoliertes Polynukleotid, das in Tabelle I angeführt ist, im subzellulären Kompartiment und dem darin angegebenen Gewebe überexprimiert. Die transgene Pflanze der Erfindung zeigt einen verbesserten Ertrag oder erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtypvarietät der Pflanze. Die Begriffe ”verbesserter Ertrag” oder ”erhöhter Ertrag” können untereinander austauschbar verwendet werden.
Der Begriff ”Ertrag”, wie hierin verwendet, bezieht sich im Allgemeinen auf ein messbares Erzeugnis von einer Pflanze, insbesondere einer Kulturpflanze. Ertrag und Ertragserhöhung (im Vergleich zu einer nicht transformierten Ausgangs- oder Wildtyppflanze) können auf verschiedene Weisen gemessen werden und es ist klar, dass ein Fachmann imstande ist, angesichts der besonderen Ausführungsformen, der besonderen betroffenen Nutzpflanzen und des spezifischen Zwecks oder der jeweiligen Anwendung die korrekte Bedeutung anzuwenden.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff ”verbesserter Ertrag” oder der Begriff ”erhöhter Ertrag” jede Verbesserung im Ertrag eines gemessenen Pflanzenprodukts, wie Korn, Frucht oder Faser. Gemäß der Erfindung können Veränderungen in verschiedenen phänotypischen Merkmalen den Ertrag verbessern. Zum Beispiel, und ohne Einschränkung, sind Parameter, wie Blütenorganentwicklung, Wurzelinitiierung, Wurzelbiomasse, Samenanzahl, Samengewicht, Ernteindex, Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, Blattbildung, Phototropismus, apikale Dominanz und Fruchtentwicklung, geeignete Maße eines verbesserten Ertrags. Jede Erhöhung im Ertrag ist ein verbesserter Ertrag gemäß der Erfindung. Zum Beispiel kann die Verbesserung im Ertrag eine 0,1%, 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder größere Erhöhung in einem gemessenen Parameter umfassen. Zum Beispiel ist eine Erhöhung im Bushel/Acre Ertrag von Sojabohnen oder Mais, die von Nutzpflanzen abgeleitet sind, die Pflanzen umfassen, die für die Nukleotide und Polypeptide von Tabelle I transgen sind, im Vergleich mit dem Bushel/Acre Ertrag von unbehandelten Sojabohnen und Mais, die unter denselben Bedingungen kultiviert wurden, ein verbesserter Ertrag gemäß der Erfindung. Der erhöhte oder verbesserte Ertrag kann mit oder ohne Stressbedingungen erreicht werden.
Für den Zweck der Beschreibung der vorliegenden Erfindung bezieht sich verstärkter oder erhöhter ”Ertrag” auf einen oder mehrere Ertragsparameter, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biomassenertrag, Trocken-Biomassenertrag, oberirdischem Trocken-Biomassenertrag, unterirdischem Trocken-Biomassenertrag, Frischgewicht-Biomassenertrag, oberirdischem Frischgewicht-Biomassenertrag, unterirdischem Frischgewicht-Biomassenertrag; verstärktem Ertrag an erntbaren Teilen, entweder Trocken- oder Frischgewicht oder beides, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beides; verstärktem Ertrag an Nutzpflanzenfrucht, entweder Trocken- oder Frischgewicht oder beides, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beides; und vorzugsweise verstärktem Ertrag an Samen, entweder Trocken- oder Frischgewicht oder beides, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beides. Der Begriff ”Ertrag”, wie hierin verwendet, bezieht sich im Allgemeinen auf ein messbares Erzeugnis von einer Pflanze, insbesondere Kulturpflanze. Zum Beispiel stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen oder Pflanzen bereit, die ein erhöhtes ertragbezogenes Merkmal aufweisen können, z. B. eine erhöhte Toleranz gegen Umweltstress und/oder eine(n) erhöhte(n) intrinsische(n) Ertrag und/oder Biomassenproduktion im Vergleich zu einer entsprechenden (z. B. nicht transformierten) Wildtyp- oder Ausgangspflanze durch Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer der oben genannten Aktivitäten.
In einer Ausführungsform bezieht sich eine Erhöhung im Ertrag auf einen erhöhten oder verbesserten Nutzpflanzenertrag oder erntbaren Ertrag, Biomassenertrag und/oder einen erhöhten Samenertrag.
Der Nutzpflanzenertrag ist hierin als die Anzahl von Scheffeln (Bushel) eines relevanten landwirtschaftlichen Produkts (wie Korn, Futter oder Samen) definiert, die pro Morgen (Acre) geerntet werden. Der Nutzpflanzenertrag wird durch abiotischen Stress, wie Dürre-, Wärme-, Salzgehalt- und Kältestress, und durch die Große (Biomasse) der Pflanze beeinträchtigt. Herkömmliche Pflanzenvermehrungsstrategien sind relativ langsam und waren im Allgemeinen nicht erfolgreich, erhöhte Toleranz gegen abiotischen Stress zu verleihen. Verbesserungen im Kornertrag durch herkömmliche Vermehrung haben bei Mais annähernd ein Plateau erreicht.
Daher bezieht sich in einer Ausführungsform ”Ertrag”, wie hierin beschrieben, auf den erntbaren Ertrag einer Pflanze. Der Ertrag einer Pflanze kann von der spezifischen Pflanze/Kulturpflanze von Interesse, wie auch von ihrer beabsichtigten Anwendung (wie Nahrungsmittelproduktion, Futterproduktion, Fertignahrungsmittelproduktion, Biokraftstoff-, Biogas- oder Alkoholproduktion, oder dergleichen) von Interesse in jedem besonderen Fall abhängen. Somit wird in einer Ausführungsform der Ertrag als Ernteindex (angegeben als Gewichtsverhältnis der jeweiligen erntbaren Teile dividiert durch die Gesamtbiomasse), Gewicht der erntbaren Teile pro Fläche (Morgen, Quadratmeter oder dergleichen) und dergleichen berechnet. Der Ernteindex, d. h., das Verhältnis von Ertrag an Biomasse zu der gesamten kumulativen Biomasse bei der Ernte, bei Mais war im Wesentlichen während der selektiven Vermehrung für den Kornertrag über die letzten hundert Jahre unverändert. Daher sind in jüngster Zeit bei Mais erreichte Ertragsverbesserungen das Ergebnis einer erhöhten Gesamtbiomassenproduktion pro Einheit Landfläche. Diese erhöhte Gesamtbiomasse wurde durch Erhöhen der Pflanzungsdichte erreicht, die zu adaptiven phänotypischen Veränderungen geführt hat, wie einer Verringerung im Blattwinkel, die das Beschatten niedriger Blätter verringern könnte, und der Quastengröße, die den Ernteindex erhöhen könnte. Der Ernteindex ist unter vielen Umweltbedingungen relativ stabil und somit ist eine robuste Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag möglich. Die Pflanzengröße und der Kornertrag sind intrinsisch verknüpft, da der Großteil der Kornbiomasse von einer aktuellen oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität durch die Blätter und den Stängel der Pflanze abhängig ist. Wie bei der abiotischen Stresstoleranz sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Glashaus Standardpraktiken zur Messung potenzieller Ertragsvorteile, die durch das Vorhandensein eines Transgens verliehen werden.
In einer Ausführungsform bezieht sich ”Ertrag” auf den Biomassenertrag, z. B. auf den Trockengewicht-Biomassenertrag und/oder Frischgewicht-Biomassenertrag. Biomassenertrag bezieht sich auf die oberirdischen oder unterirdischen Teile einer Pflanze, abhängig von den spezifischen Umständen (Testbedingungen, spezifische Nutzpflanzen von Interesse, Anwendung von Interesse, und dergleichen). In einer Ausführungsform bezieht sich Biomassenertrag auf die oberirdischen und unterirdischen Teile. Der Biomassenertrag kann auf der Basis des Frischgewichts, Trockengewichts oder einer eingestellten Feuchtigkeit berechnet werden. Der Biomassenertrag kann auf einer Basis pro Pflanze oder im Verhältnis zu einer spezifischen Fläche berechnet werden (z. B. Biomassenertrag pro Morgen/Quadratmeter/oder dergleichen).
In einer anderen Ausführungsform bezieht sich ”Ertrag” auf den Samenertrag, der durch einen oder mehrere der folgenden Parameter gemessen werden kann: Anzahl an Samen oder Anzahl gefüllter Samen (pro Pflanze oder pro Fläche (Morgen/Quadratmeter/oder dergleichen)); Samenfüllungsrate (Verhältnis zwischen Anzahl gefüllter Samen und Gesamtanzahl an Samen); Anzahl an Blüten pro Pflanze; Samenbiomasse oder Gesamtsamengewicht (pro Pflanze oder pro Fläche (Morgen/Quadratmeter/oder dergleichen)); Tausendkerngewicht (TKW; extrapoliert aus der Anzahl gefüllter, gezählter Samen und deren Gesamtgewicht; eine Erhöhung im TKW kann durch eine erhöhte Samengröße, ein erhöhtes Samengewicht, eine erhöhte Embryogröße und/oder ein erhöhtes Endosperm verursacht werden). Andere Parameter, die eine Messung des Samenertrags ermöglichen, sind auch nach dem Stand der Technik bekannt. Der Samenertrag kann auf einer Trockengewichts- oder auf einer Frischgewichtsbasis bestimmt werden, oder für gewöhnlich auf Basis einer eingestellten Feuchtigkeit, z. B. bei 15,5 Prozent Feuchtigkeit.
In einer Ausführungsform bedeutet der Begriff ”erhöhter Ertrag”, dass der aktive photosynthetische Organismus, insbesondere eine Pflanze, eine erhöhte Wachstumsrate unter abiotischen Umweltstressbedingungen im Vergleich zu dem entsprechenden aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
Eine erhöhte Wachstumsrate kann unter anderem durch eine erhöhte Biomassenproduktion der ganzen Pflanze, oder eine erhöhte Biomassenproduktion der oberirdischen Teile einer Pflanze, oder durch eine erhöhte Biomassenproduktion der unterirdischen Teile einer Pflanze, oder durch eine erhöhte Biomassenproduktion von Teilen einer Pflanze, wie Stängel, Blätter, Blüten, Früchten und/oder Samen, reflektiert werden oder diese verleihen.
In einer Ausführungsform davon beinhaltet ein erhöhter Ertrag höhere Fruchterträge, höhere Samenerträge, höhere Frischsubstanzproduktion und/oder höhere Trockensubstanzproduktion.
In einer anderen Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”erhöhter Ertrag”, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, ein verlängertes Wachstum unter abiotischen Umweltstressbedingungen im Vergleich zu dem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist. Ein verlängertes Wachstum umfasst das Überleben und/oder anhaltende Wachstum des aktiven photosynthetischen Organismus, vorzugsweise der Pflanze, in dem Moment, in dem der nicht transformierte, aktive photosynthetische Wildtyp-Organismus sichtbare Anzeichen von Mangel und/oder Absterben zeigt.
Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform die Pflanze, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, eine Maispflanze. Ein erhöhter Ertrag für Maispflanzen bedeutet in einer Ausführungsform einen erhöhten Samenertrag, insbesondere für Maisvarietäten, die für Futter- oder Nahrungsmittel verwendet werden. Ein erhöhter Samenertrag von Mais bezieht sich in einer Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder ein erhöhtes Kerngewicht, erhöhte Kerne pro Hülse, oder erhöhte Hülsen pro Pflanze. Ferner ist in einer Ausführungsform der Kolbenertrag erhöht, was insbesondere für Maispflanzenvarietäten nützlich ist, die zum Füttern verwendet werden. Ferner ist zum Beispiel die Länge oder Größe des Kolbens erhöht. In einer Ausführungsform bezieht sich ein erhöhter Ertrag für eine Maispflanze auf ein verbessertes Kolben/Kern-Verhältnis.
Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform die Pflanze, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, eine Sojapflanze. Ein erhöhter Ertrag für Sojapflanzen bedeutet in einer Ausführungsform einen erhöhten Samenertrag, insbesondere für Sojavarietäten, die für Futter- oder Nahrungsmittel verwendet werden. Ein erhöhter Samenertrag von Soja bezieht sich in einer Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder ein erhöhtes Kerngewicht, erhöhte Kerne pro Hülse, oder erhöhte Hülsen pro Pflanze.
Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform die Pflanze, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, eine Ölraps-(OSR)Pflanze. Ein erhöhter Ertrag für OSR Pflanzen bedeutet in einer Ausführungsform einen erhöhten Samenertrag, insbesondere für OSR-Varietäten, die für Futter- oder Nahrungsmittel verwendet werden. Ein erhöhter Samenertrag von OSR bezieht sich in einer Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder ein erhöhtes Kerngewicht, erhöhte Kerne pro Hülse, oder erhöhte Hülsen pro Pflanze.
Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform, die Pflanze, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, eine Baumwollpflanze. Ein erhöhter Ertrag für Baumwollpflanzen bedeutet in einer Ausführungsform einen erhöhten Lintertrag. Ein erhöhter Baumwollertrag von Baumwolle bezieht sich in einer Ausführungsform auf eine erhöhte Lintlänge.
Ein erhöhter Samenertrag von Mais bezieht sich in einer Ausführungsform auf eine erhöhte Kerngröße oder ein erhöhtes Kerngewicht, erhöhte Kerne pro Hülse, oder erhöhte Hülsen pro Pflanze.
Der erhöhte Ertrag gemäß der vorliegenden Erfindung kann für gewöhnlich durch Verstärken oder Verbessern eines oder mehrerer ertragsbezogener Merkmale der Pflanze im Vergleich zu einer Ursprungs- oder Wildtyppflanze erreicht werden. Solche ertragsbezogenen Merkmale einer Pflanze, deren Verbesserung zu einem erhöhten Ertrag führen, umfassen, ohne Einschränkung, die Erhöhung der intrinsischen Ertragskapazität einer Pflanze, verbesserte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder erhöhte Stresstoleranz, insbesondere erhöhte abiotische Stresstoleranz.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Ertrag durch Verbesserung eines oder mehrerer der ertragsbezogenen Merkmale, wie hierin definiert, erhöht.
Daher ist in einer Ausführungsform das ertragsbezogene Merkmal, das eine Erhöhung des Ertrags der Pflanze verleiht, eine Erhöhung der intrinsischen Ertragskapazität einer Pflanze und kann sich zum Beispiel durch Verbessern des spezifischen (intrinsischen) Samenertrags (z. B. im Sinne einer erhöhten Samen/Korngröße, erhöhten Ährenanzahl, erhöhten Samenanzahl pro Ähre, Verbesserung der Samenfüllung, Verbesserung der Samenzusammensetzung, Embryo- und/oder Endospermverbesserungen oder dergleichen); Modifizierung und Verbesserung inhärenter Wachstums- und Entwicklungsmechanismen einer Pflanze (wie Pflanzenhöhe, Pflanzenwachstumsrate, Hülsenanzahl, Hülsenposition auf der Pflanze, Anzahl von Internodien, Auftreten einer Enthülsung, Effizienz der Nodulierung und Stickstofffixierung, Effizienz der Kohlenstoffassimilierung, Verbesserung der Setzlingswuchskraft/Frühwuchskraft, verstärkte Effizienz der Keimung (unter gestressten oder nicht gestressten Bedingungen), Verbesserung in der Pflanzenarchitektur, Zellzyklusmodifizierungen, Photosynthese-Modifizierungen, verschiedene Signalleitungspfadmodifizierungen, Modifizierung der transkriptionalen Regulierung, Modifizierung der translationalen Regulierung, Modifizierung der Enzymaktivitäten und dergleichen); und/oder dergleichen manifestieren.
Daher ist in einer Ausführungsform das ertragsbezogene Merkmal, das eine Erhöhung des Ertrags der Pflanze verleiht, eine Verbesserung oder Erhöhung der Stresstoleranz einer Pflanze und kann sich zum Beispiel durch eine Verbesserung oder Erhöhung der Toleranz einer Pflanze gegen Stress, insbesondere abiotischen Stress manifestieren. In der vorliegenden Anwendung bezieht sich abiotischer Stress im Allgemeinen auf abiotische Umweltbedingungen, welchen eine Pflanze für gewöhnlich ausgesetzt ist, einschließlich Bedingungen, die für gewöhnlich als ”abiotische Stressbedingungen” bezeichnet werden, einschließlich, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Dürre (Toleranz gegen Dürre kann infolge einer verbesserten Wassernutzungseffizienz erreicht werden), Wärme, niedere Temperaturen und kalte Bedingungen (wie Gefrier- und Kältebedingungen), Salzgehalt, osmotischer Stress, Schatten, hohe Pflanzendichte, mechanischer Stress, oxidativer Stress und dergleichen.
Daher wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein erhöhter Pflanzenertrag durch Erhöhen der ”Nährstoffnutzungseffizienz einer Pflanze” vermittelt, z. B. durch Verbessern der Nutzungseffizienz von Nährstoffen, einschließlich, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Phosphor, Kalium und Stickstoff. Zum Beispiel besteht ein Bedarf an Pflanzen, die imstande sind, Stickstoff effizienter zu nutzen, so dass weniger Stickstoff für das Wachstum erforderlich ist, wodurch ein verbesserter Ertragswert unter Stickstoffmangelbedingungen erhalten wird. Fernen können höhere Erträge mit aktuellen oder Standardwerten einer Stickstoffnutzung erreicht werden. Daher wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der Pflanzenertrag durch Erhöhen der Stickstoffnutzungseffizienz einer Pflanze oder eines Teils davon erhöht. Wegen der hohen Kosten von Stickstoffdüngemittel im Verhältnis zu den Einnahmen für landwirtschaftliche Produkte und wegen seiner zusätzlich schädlichen Wirkung auf die Umwelt, ist es wünschenswert, Strategien zur Verringerung der Stickstoffzufuhr und/oder Optimierung der Stickstoffaufnahme und/oder Nutzung einer bestimmten Stickstoffverfügbarkeit zu entwickeln, während gleichzeitig ein optimaler Ertrag, eine Produktivität und Qualität von Pflanzen, vorzugsweise kultivierten Pflanzen, z. B. Nutzpflanzen, aufrecht erhalten wird. Es ist auch wünschenswert, den Ertrag von Nutzpflanzen mit geringerer Düngemittelzufuhr und/oder höherem Ertrag auf Böden gleicher oder sogar minderer Qualität aufrechtzuerhalten.
Eine verstärkte NUE der Pflanze kann nach der folgenden Methode bestimmt und quantifiziert werden: Transformierte Pflanzen werden in Töpfen in einer Wachstumskammer gezüchtet (Svalöf Weibull, Svalöv, Schweden). Wenn die Pflanzen Arabidopsis thaliana sind, werden Samen davon in Töpfe gesät, die ein 1:1 (v:v) Gemisch aus nährstoffverarmter Erde (”Einheitserde Typ 0”, 30% Ton, Tantau, Wansdorf Deutschland) und Sand enthalten. Die Keimung wird durch eine viertägige Periode bei 4°C im Dunkeln eingeleitet. Anschließend werden die Pflanzen unter Standardwachstumsbedingungen gezüchtet. Wenn die Pflanzen Arabidopsis thaliana sind, sind die Standardwachstumsbedingungen: Photoperiode mit 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchte und eine Photonenflussdichte von 200 μE. Wenn die Pflanzen Arabidopsis thaliana sind, werden sie jeden zweiten Tag mit einer N-verarmten Nährstofflösung gegossen. Nach 9 bis 10 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Nach einer Gesamtdauer von 29 bis 31 Tagen werden die Pflanzen geerntet und nach dem Frischgewicht der oberirdischen Teile der Pflanzen, vorzugsweise der Rosetten bewertet.
In einer weiteren Ausführungsform wird der erhöhte Ertrag nach der in den Beispielen beschriebenen Methode bestimmt. Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags, umfassend die folgenden Schritte: (a) Messen des Stickstoffgehalts in der Erde, und (b) Bestimmen, ob der Stickstoffgehalt in der Erde für das Wachstum einer Ursprungs- oder Wildtyppflanze, z. B. einer Nutzpflanze, optimal oder suboptimal ist, und (c1) Züchten der Pflanze der Erfindung in der Erde, wenn der Stickstoffgehalt für das Wachstum einer Ursprungs- oder Wildtyppflanze suboptimal ist, oder (c2) Züchten der Pflanze der Erfindung in der Erde und Vergleichen des Ertrags mit dem Ertrag eines Standards, einer Ursprungs- oder einer Wildtyppflanze, Selektieren und Züchten der Pflanze, die den höchsten Ertrag zeigt, wenn der Stickstoffgehalt für die Ursprungs- oder Wildtyppflanze optimal ist.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Pflanzenertrag durch Erhöhen der Stresstoleranz(en) der Pflanze erhöht. Im Allgemeinen kann der Begriff ”erhöhte Toleranz gegen Stress” als Überleben von Pflanzen und/oder Produktion mit höherem Ertrag unter Stressbedingungen im Vergleich zu einer nicht transformierten Wildtyp- oder Ausgangspflanze definiert werden. Zum Beispiel ist die Pflanze der Erfindung oder jene, die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt wird, besser an die Stressbedingungen angepasst. ”Verbesserte Anpassung” an Umweltstress, wie z. B. Zugluft, Wärme, Nährstoffverarmung, Gefrier- und/oder Kältetemperaturen, bezieht sich hierin auf eine verbesserte Pflanzenleistung, die zu einem erhöhten Ertrag führt, insbesondere in Bezug auf eines oder mehrere der ertragsbezogenen Merkmale, wie oben ausführlicher definiert.
Während ihres Lebenszyklus ist eine Pflanze im Allgemeinen unterschiedlichen Umweltbedingungen ausgesetzt. Jede solche Bedingung, die unter gewissen Umständen eine Auswirkung auf den Pflanzenertrag haben kann, wird hierin als ”Stressbedingung” bezeichnet. Umweltstress kann im Allgemeinen in biotischen und abiotischen (Umwelt-)Stress unterteilt werden. Ungünstige Nährstoffbedingungen werden manchmal auch als ”Umweltstress” bezeichnet. Die vorliegende Erfindung zieht auch Lösungen für diese Art von Umweltstress in Betracht, z. B. in Bezug auf erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird der Pflanzenertrag durch Erhöhen der abiotischen Stresstoleranz(en) einer Pflanze oder eines Teils davon erhöht.
Für den Zweck der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Stress”, ”verstärkte Resistenz gegen abiotischen Umweltstress”, ”verstärkte Toleranz gegen Umweltstress”, ”verbesserte Anpassung an Umweltstress” und andere Variationen und Ausdrücke mit gleicher Bedeutung untereinander austauschbar verwendet und beziehen sich, ohne Einschränkung, auf eine Verbesserung in der Toleranz gegen eine oder mehrere abiotische Umweltstresssituation(en), wie hierin beschrieben, und im Vergleich zu einer entsprechenden Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze oder einem Teil davon.
Der Begriff abiotische Stresstoleranz(en) bezieht sich zum Beispiel auf Niedertemperaturtoleranz, Dürretoleranz oder verbesserte Wassernutzungseffizienz (WUE), Wärmetoleranz, Salzstresstoleranz und andere. Studien der Reaktion einer Pflanze auf Austrocknung, osmotischen Schock und Temperaturextreme werden ebenso zur Bestimmung der Toleranz oder Resistenz einer Pflanze gegen abiotischen Stress verwendet.
Stresstoleranz in Pflanzen wie Niedertemperatur-, Dürre-, Wärme- und Salzstresstoleranz kann ein gemeinsames Thema haben, das für das Pflanzenwachstum wichtig ist, nämlich die Verfügbarkeit von Wasser. Pflanzen sind für gewöhnlich während ihres Lebenszyklus Bedingungen eines verringerten Wassergehalts in der Umwelt ausgesetzt. Schützende Strategien sind ähnlich jenen einer Kältetoleranz.
Daher bezieht sich in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das ertragsbezogene Merkmal auf eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der Pflanze der Erfindung und/oder eine erhöhte Toleranz gegen Dürrebedingungen der Pflanze der Erfindung. Die Wassernutzungseffizienz (WUE) ist ein Parameter, der oft mit Dürretoleranz korreliert. Eine Erhöhung in der Biomasse bei geringer Wasserverfügbarkeit kann auf eine relativ verbesserte Wachstumseffizienz oder einen verringerten Wasserverbrauch zurückzuführen sein. Bei der Auswahl von Merkmalen zur Verbesserung von Nutzpflanzen würde eine Senkung des Wasserverbrauchs, ohne Änderung im Wachstum einen besonderen Vorteil in einem bewässerten landwirtschaftlichen System haben, bei dem die Wasserzufuhrkosten hoch sind. Eine Erhöhung im Wachstum ohne entsprechenden Anstieg im Wasserverbrauch fände in allen landwirtschaftlichen Systemen Anwendung. In vielen landwirtschaftlichen Systemen, bei welchen die Wasserversorgung keine Einschränkung darstellt, erhöht eine Erhöhung im Wachstum, selbst bei einer Erhöhung im Wasserverbrauch, auch den Ertrag.
Bei einem Mangel an Grundwasser oder wenn Wasser während Dürreperioden nicht verfügbar ist, sind Nutzpflanzenerträge begrenzt. Ein Wassermangel bei Pflanzen entwickelt sich, wenn die Transpiration von Blättern die Wasserversorgung von den Wurzeln überschreitet. Die verfügbare Wasserversorgung hängt mit der Wassermenge zusammen, die in der Erde gehalten wird, und der Fähigkeit der Pflanze, dieses Wasser mit ihrem Wurzelsystem zu erreichen. Die Transpiration von Wasser aus Blättern ist mit der Fixierung von Kohlendioxid durch Photosynthese durch die Spaltöffnungen verknüpft. Die zwei Prozesse hängen positiv zusammen, so dass ein hoher Kohlendioxidzustrom durch Photosynthese eng mit einem Wasserverlust durch Transpiration verbunden ist. Während Wasser von dem Blatt transpiriert, wird das Blattwasserpotenzial verringert und die Spaltöffnungen neigen dazu, sich in einem hydraulischen Prozess zu schließen, wodurch das Ausmaß der Photosynthese begrenzt wird. Da der Nutzpflanzenertrag von der Federung von Kohlendioxid in der Photosynthese abhängt, sind Wasseraufnahme und Transpiration Faktoren, die zum Nutzpflanzenertrag beitragen. Pflanzen, die imstande sind, weniger Wasser zum Fixieren derselben Menge an Kohlendioxid zu verwenden, oder die imstande sind, normal bei einem niederen Wasserpotenzial zu fungieren, haben das Potenzial, mehr Photosynthese auszuführen und dadurch mehr Biomasse und wirtschaftlichen Ertrag in vielen landwirtschaftlichen Systemen zu erzeugen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bedeutet Dürrestress jeden Umweltstress, der zu einem Wassermangel bei Pflanzen oder einer Verringerung der Wasserversorgung zu Pflanzen führt, einschließlich eines sekundären Stresses durch Niedertemperatur und/oder Salz und/oder eines primären Stresses während Dürre oder Wärme, z. B. Austrocknung usw.
Erhöhte Toleranz gegen Dürrebedingungen kann zum Beispiel nach der folgenden Methode bestimmt und quantifiziert werden. Transformierte Pflanzen werden z. B. einzeln in Töpfen in einer Wachstumskammer gezüchtet (York Industriekälte GmbH, Mannheim, Deutschland). Die Keimung wird eingeleitet. Wenn die Pflanzen Arabidopsis thaliana sind, werden gesäte Samen bei 4°C 3 Tage im Dunkeln gehalten, um die Keimung einzuleiten. Anschließende Bedingungen werden auf 3 Tage bei 20°C/6°C Tag/Nachttemperatur mit einem 16/8 h Tag-Nachtzyklus bei 150 μE/m2s geändert. Anschließend werden die Pflanzen unter Standardwachstumsbedingungen gezüchtet. Wenn die Pflanzen Arabidopsis thaliana sind, sind die Standardwachstumsbedingungen: Photoperiode mit 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchte und eine Photonenflussdichte von 200 μE. Pflanzen werden gezüchtet und kultiviert, bis sie Blätter entwickeln. Wenn die Pflanzen Arabidopsis thaliana sind, werden sie bewässert, bis sie etwa 3 Wochen alt sind. Zu diesem Zeitpunkt wird eine Dürre durch Entzug von Wasser hervorgerufen. Sobald die nicht transformierten Wildtyppflanzen sichtbare Anzeichen einer Verletzung zeigen, beginnt die Auswertung und Pflanzen werden auf Anzeichen von Dürresymptomen und durch einen Biomasseproduktionsvergleich mit Wildtyp- und benachbarten Pflanzen an 5–6 aufeinander folgenden Tagen bewertet. In einer weiteren Ausführungsform wird die Toleranz gegen Dürre, z. B. die Toleranz gegen zyklierende Dürre nach dem Verfahren, das in den Beispielen beschrieben ist, bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Toleranz gegen Dürre eine Toleranz gegen zyklierende Dürre.
Daher betrifft in einer Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags, umfassend die folgenden Schritte: (a) Bestimmen, ob die Wasserversorgung in der Anpflanzungsfläche für das Wachstum einer Ursprungs- oder Wildtyppflanze, z. B. einer Nutzpflanze, optimal oder suboptimal ist, und/oder Bestimmen der sichtbaren Anzeichen einer Verletzung von Pflanzen, die in der Anpflanzungsfläche wachsen; und (b1) Züchten der Pflanze der Erfindung in dem Boden, wenn die Wasserversorgung für das Wachstum einer Ursprungs- oder Wildtyppflanze suboptimal ist oder sichtbare Anzeichen für Dürre bei einer Standard-, Ursprungs- oder Wildtyppflanze festgestellt werden, die in der Fläche wächst; oder (b2) Züchten der Pflanze der Erfindung in dem Boden und Vergleichen des Ertrags mit dem Ertrag einer Standard-, einer Ursprungs- oder einer Wildtyppflanze und Selektieren und Züchten der Pflanze, die den höchsten Ertrag zeigt, wenn die Wasserversorgung für die Ursprungs- oder Wildtyppflanze optimal ist.
Sichtbare Anzeichen einer Verletzung sind eines oder eine Kombination von zwei, drei oder mehr der folgenden Merkmale: (a) Welken; (b) Braunfärbung der Blätter; (c) Verlust an Tumor, der zu einem Abfallen von Blättern oder der Nadelschäfte und Blüten führt, (d) Abfallen und/oder Ausfallen von Blättern oder Nadeln, (e) die Blätter sind grün, aber das Blatt ist im Vergleich zu Kontrollen leicht zur Erde geneigt, (f) Blattspreiten beginnen sich nach innen zu falten (kräuseln), (g) vorzeitige Alterung von Blättern oder Nadeln, (h) Verlust an Chlorophyll in Blättern oder Nadeln und/oder Vergilbung.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das ertragsbezogene Merkmal der Pflanze der Erfindung eine erhöhte Toleranz gegen Wärmebedingungen der Pflanze.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das ertragsbezogene Merkmal der Pflanze der Erfindung eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz der Pflanze, z. B. umfassend eine Gefriertoleranz und/oder Kältetoleranz. Niedertemperaturen betreffen eine Vielzahl biologischer Prozesse. Sie verzögern oder hemmen nahezu alle metabolischen und zellulären Prozesse. Die Reaktion von Pflanzen auf Niedertemperatur ist eine wichtige Determinante ihres ökologischen Bereichs. Das Problem, Niedertemperaturen zu bewältigen, wird durch die Notwendigkeit verschärft, die Züchtungssaison über den kurzen Sommer hinaus zu verlängern, der in hohen Breiten oder Höhen vorherrscht. Die meisten Pflanzen haben Anpassungsstrategien entwickelt, um sich selbst vor Niedertemperaturen zu schützen. Im Allgemeinen kann die Anpassung an Niedertemperatur in Kältetoleranz und Gefriertoleranz unterteilt werden.
Kältetoleranz wird in der Natur bei Spezies mäßiger oder nördlicher Zonen gefunden und ermöglicht ein Überleben und ein verstärktes Wachstum bei niederen, aber nicht Gefriertemperaturen. Spezies aus tropischen oder subtropischen Zonen sind kälteempfindlich und zeigen häufig ein Welken, eine Chlorose oder Nekrose, verlangsamtes Wachstum und sogar Absterben bei Temperaturen um 10°C während einer oder mehrerer Entwicklungsstufen. Daher bezieht sich verbesserte oder verstärkte ”Kältetoleranz” oder Variationen davon hierin auf eine verbesserte Anpassung an niedere, aber nicht Gefriertemperaturen um 10°C, vorzugsweise Temperaturen zwischen 1 bis 18°C, insbesondere 4 bis 14°C und ganz besonders 8 bis 12°C; in der Folge als ”Kältetemperatur” bezeichnet.
Gefriertoleranz ermöglicht das Überleben bei Temperaturen nahe Null und insbesondere unter Null. Es wird angenommen, dass sie durch einen Prozess gefördert wird, der als Kälteakklimatisierung bezeichnet wird, der bei niederen, aber nicht Gefriertemperaturen eintritt und eine Gefriertoleranz bei Temperaturen unter Null fördert. Zusätzlich haben die meisten Spezies aus mäßigen Regionen Lebenszyklen, die an saisonale Temperaturänderungen angepasst sind. Für diese Pflanzen können Niedertemperaturen auch ein wichtige Rolle in der Pflanzenentwicklung durch den Prozess einer Stratifizierung und Vernalisierung spielen. Es wird offensichtlich, dass eine klare Unterscheidung zwischen oder Definition von Kältetoleranz und Gefriertoleranz schwierig ist und dass die Prozesse überlappen oder miteinander verbunden sein können.
Eine verbesserte oder verstärkte ”Gefriertoleranz” oder Variationen davon bezieht sich hierin auf eine verbesserte Anpassung an Temperaturen nahe oder unter Null, nämlich vorzugsweise Temperaturen unter 4°C, insbesondere unter 3 oder 2°C, und besonders bevorzugt bei oder unter 0 (Null)°C oder unter –4°C, oder sogar extreme Niedertemperaturen bis zu –10°C oder niedriger; in der Folge als ”Gefriertemperatur” bezeichnet.
Daher kann die Pflanze der Erfindung in einer Ausführungsform ein frühes Setzlingswachstum nach der Belastung einer kälteempfindlichen Wildtyp- oder Ursprungspflanze mit Niedertemperaturen zeigen, wodurch in einer weiteren Ausführungsform die Samenkeimungsraten verbessert werden. Der Prozess der Samenkeimung hängt stark von der Umwelttemperatur ab und die Eigenschaften der Samen bestimmen den Grad der Aktivität und die Leistung während der Keimung und des Erscheinens von Setzlingen, wenn sie einer Niedertemperatur ausgesetzt sind. Das Verfahren der Erfindung stellt des Weiteren in einer Ausführungsform eine Pflanze bereit, die unter Kältebedingung eine verringerte Verzögerung der Blattentwicklung zeigt. In einer Ausführungsform betrifft das Verfahren der Erfindung eine Produktion einer toleranten Hauptnutzpflanze, z. B. Mais, Bohne, Reis, Sojabohne, Baumwolle, Tomate, Banane, Gurke oder Kartoffel, da die meisten Hauptnutzpflanzen kälteempfindlich sind.
Eine verstärkte Toleranz gegen Niedertemperatur kann zum Beispiel nach der folgenden Methode bestimmt werden: Transformierte Pflanzen werden in Töpfen in einer Wachstumskammer (z. B. York, Mannheim, Deutschland) gezüchtet. Wenn die Pflanzen Arabidopsis thaliana sind, werden Samen davon in Töpfe gesät, die ein 3,5:1 (v:v) Gemisch aus nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand enthalten. Die Pflanzen werden unter Standardwachstumsbedingungen gezüchtet. Wenn die Pflanzen Arabidopsis thaliana sind, sind die Standardwachstumsbedingungen: Photoperiode mit 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchte und eine Photonenflussdichte von 200 μmol/m2s. Die Pflanzen werden gezüchtet und kultiviert. Wenn die Pflanzen Arabidopsis thaliana sind, werden sie jeden zweiten Tag gegossen. Nach 9 bis 10 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Kälte (z. B. Kälte bei 11–12°C) wird 14 Tage nach der Saat bis zum Ende des Experiments angewendet. Nach einer Gesamtwachstumsperiode von 29 bis 31 Tagen werden die Pflanzen geerntet und nach dem Frischgewicht der oberirdischen Teile der Pflanzen bewertet, im Falle von Arabidopsis vorzugsweise der Rosetten.
Daher betrifft in einer Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags, umfassend die folgenden Schritte: (a) Bestimmen, ob die Temperatur in der Anpflanzungsfläche für das Wachstum einer Ursprungs- oder Wildtyppflanze, z. B. einer Nutzpflanze optimal oder suboptimal ist; und (b1) Züchten der Pflanze der Erfindung in der Erde; wenn die Temperatur für das Wachstum einer Ursprungs- oder Wildtyppflanze suboptimal nieder ist, die in der Fläche wächst; oder (b2) Züchten der Pflanze der Erfindung in der Erde und Vergleichen des Ertrags mit dem Ertrag einer Standard-, einer Ursprungs- oder einer Wildtyppflanze und Selektieren und Züchten der Pflanze, die den höchsten Ertrag zeigt, wenn die Temperatur für die Ursprungs- oder Wildtyppflanze optimal ist.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das ertragsbezogene Merkmal auch eine erhöhte Salzgehalttoleranz (Salztoleranz), Toleranz gegen osmotischen Stress, erhöhte Schattentoleranz, erhöhte Toleranz gegen eine hohe Pflanzendichte, erhöhte Toleranz gegen mechanischen Stress und/oder erhöhte Toleranz gegen oxidativen Stress sein.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen einen verstärkten Trocken-Biomassenertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus, wie einer Pflanze, aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten oberirdischen Trocken-Biomassenertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten unterirdischen Trocken-Biomassenertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer anderen Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Frischgewicht-Biomassenertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten oberirdischen Frischgewicht-Biomassenertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten unterirdischen Frischgewicht-Biomassenertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer anderen Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag erntbarer Teile einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag trockener erntbarer Teile einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag trockener, oberirdischer, erntbarer Teile einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag trockener, unterirdischer, erntbarer Teile einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag erntbarer Frischgewichtsteile einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag oberirdischer, erntbarer Frischgewichtsteile einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag unterirdischer, erntbarer Frischgewichtsteile einer Pflanze im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag der Nutzfrucht im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag der frischen Nutzfrucht im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag der trockenen Nutzfrucht im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, ein erhöhtes Korntrockengewicht im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag an Samen im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag an Frischgewichtsamen im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist.
In einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, bei Belastung mit abiotischen Umweltstressbedingungen, einen verstärkten Ertrag an Trockensamen im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus aufweist. Zum Beispiel können die abiotischen Umweltstressbedingungen, denen der Organismus ausgesetzt ist, jedoch jede der hierin genannten abiotischen Umweltstresssituationen sein.
Eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz des erzeugten Mais betrifft in einer Ausführungsform einen verbesserten Proteingehalt der Maissamen, insbesondere in Maissamen, die als Futter verwendet werden. Eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz betrifft in einer anderen Ausführungsform eine erhöhte Kerngröße oder -anzahl. Eine erhöhte Wassernutzungseffizienz des produzierten Mais betrifft in einer Ausführungsform eine erhöhte Kerngröße oder -anzahl. Ferner betrifft eine erhöhte Toleranz gegen Niedertemperatur in einer Ausführungsform eine Frühwuchskraft und ermöglicht das frühe Anpflanzen und Aussäen einer Maispflanze, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert wird.
Eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz der produzierten Sojapflanze betrifft in einer Ausführungsform einen verbesserten Proteingehalt der Sojasamen, insbesondere bei Sojasamen, die als Futter verwendet werden. Eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz betrifft in einer anderen Ausführungsform eine erhöhte Kerngröße oder -anzahl. Eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der produzierten Sojapflanze betrifft in einer Ausführungsform eine erhöhte Kerngröße oder -anzahl. Ferner betrifft eine erhöhte Toleranz gegen Niedertemperatur in einer Ausführungsform eine Frühwuchskraft und ermöglicht das frühe Anpflanzen und Aussäen einer Sojapflanze, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert wird.
Eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz der produzierten OSR Pflanze betrifft in einer Ausführungsform einen verbesserten Proteingehalt der OSR Samen, insbesondere bei OSR Samen, die als Futter verwendet werden. Eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz betrifft in einer anderen Ausführungsform eine erhöhte Kerngröße oder -anzahl. Eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der produzierten OSR Pflanze betrifft in einer Ausführungsform eine erhöhte Kerngröße oder -anzahl. Ferner betrifft eine erhöhte Toleranz gegen Niedertemperatur in einer Ausführungsform eine Frühwuchskraft und ermöglicht das frühe Anpflanzen und Aussäen einer Sojapflanze, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert wird. In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Produktion von widerstandsfähigem Ölraps (OSR mit Winterhärte), umfassend die Verwendung einer widerstandsfähigen Ölrapspflanze in dem oben genannten Verfahren der Erfindung.
Eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz der produzierten Baumwollpflanze betrifft in einer Ausführungsform einen verbesserten Proteingehalt der Baumwollsamen, insbesondere bei Baumwollsamen, die als Futter verwendet werden. Eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz betrifft in einer anderen Ausführungsform eine erhöhte Kerngröße oder -anzahl. Eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der produzierten Baumwollpflanze betrifft in einer Ausführungsform eine erhöhte Kerngröße oder -anzahl. Ferner betrifft eine erhöhte Toleranz gegen Niedertemperatur in einer Ausführungsform eine Frühwuchskraft und ermöglicht das frühe Anpflanzen und Aussäen einer Sojapflanze, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert wird.
Daher ist in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der Ertrag durch Verbessern eines oder mehrerer der ertragsbezogenen Merkmale, wie hierin definiert, erhöht. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereit, die ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden Ursprungs- oder Wildtyppflanze durch Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten (in der Folge ”Aktivitäten”) aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein.
Somit stellt in einer Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze bereit, die einen erhöhten Ertrag, z. B. Stressresistenz, insbesondere abiotische Stressresistenz, im Vergleich zu einer entsprechenden Ursprungs- oder Wildtyppflanze durch Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer der ”Aktivitäten” aufweist. In einer anderen Ausführungsform, ist die abiotische Stressresistenz, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erreicht und von der transgenen Pflanze der Erfindung gezeigt wird, erhöhte Niedertemperaturtoleranz, insbesondere erhöhte Toleranz gegen Kälte.
In einer anderen Ausführungsform, ist die abiotische Stressresistenz, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erreicht und von der transgenen Pflanze der Erfindung gezeigt wird, erhöhte Dürretoleranz, insbesondere erhöhte Toleranz gegen zyklierende Dürre.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Früchten, Samen, und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgeleitet werden, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt jede Pflanze kann auch eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz, insbesondere Kältetoleranz, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle oder Pflanze aufweisen, indem eine oder mehrere der ”Aktivitäten” im subzellulären Kompartiment und Gewebe, wie hierin angegeben, in der Pflanze erhöht oder erzeugt werden.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Früchten, Samen, und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgeleitet werden, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze kann auch eine verbesserte Wassernutzungseffizienz oder erhöhte Dürretoleranz im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle oder Pflanze aufweisen, indem eine oder mehrere der ”Aktivitäten” im subzellulären Kompartiment und Gewebe, wie hierin angegeben, in der Pflanze erhöht oder erzeugt werden.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Früchten, Samen, und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgeleitet werden, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze kann eine Stickstoffnutzungseffizienz (NUE) wie auch eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz und/oder einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder eine Dürretoleranz, insbesondere Kältetoleranz, und Luftzugtoleranz im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle oder Pflanze aufweisen, indem eine oder mehrere der ”Aktivitäten” im subzellulären Kompartiment und Gewebe, wie hierin angegeben, in der Pflanze erhöht oder erzeugt werden.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Früchten, Samen, und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgeleitet werden, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze kann eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz (NUE) wie auch eine Niedertemperaturtoleranz oder erhöhte Dürretoleranz oder einen erhöhten intrinsischen Ertrag, insbesondere Kältetoleranz, und Luftzugtoleranz und eine erhöhte Biomasse im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle oder Pflanze aufweisen, indem eine oder mehrere der ”Aktivitäten” im subzellulären Kompartiment und Gewebe, wie hierin angegeben, in der Pflanze erhöht oder erzeugt werden.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Früchten, Samen, und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgeleitet werden, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze kann eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz (NUE) und Niedertemperaturtoleranz und erhöhte Dürretoleranz und einen erhöhten intrinsischen Ertrag, insbesondere eine Kältetoleranz und Luftzugtoleranz und eine erhöhte Biomasse im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle oder Pflanze aufweisen, indem eine oder mehrere der ”Aktivitäten” im subzellulären Kompartiment und Gewebe, wie hierin angegeben, in der Pflanze erhöht oder erzeugt werden.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform eine transgene Pflanze bereit, die ein oder mehrere erhöhte ertragsbezogene Merkmale im Vergleich zu der entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Ursprungs- oder Wildtyppflanzenzelle oder Pflanze, mit einer oder mehreren erhöhten oder neu erzeugten Aktivitäten, die aus der oben genannten Gruppe ausgewählt sind, in dem subzellulären Kompartiment und Gewebe in der Pflanze, wie hierin angegeben, aufweist.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Früchten, Samen, und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgleitet sind, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt; wobei jede eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz und Stickstoffnutzungseffizienz (NUE) im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle oder Pflanze aufweist, indem eine oder mehrere der ”Aktivitäten” erhöht oder erzeugt werden.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Früchten, Samen, und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgleitet sind, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereitgestellt; wobei jede eine erhöhte und verbesserte NUE und erhöhte zyklierende Dürretoleranz im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle oder Pflanze aufweist, indem eine oder mehrere der ”Aktivitäten” erhöht oder erzeugt werden.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Früchten, Samen, und/oder Pollen, die von einer solchen Pflanze abgleitet sind, oder für die Herstellung einer solchen Pflanze bereit; die einen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Ursprungs- oder Wildtyp-, z. B. nicht transformierten, Zelle oder Pflanze aufweist, indem eine oder mehrere der ”Aktivitäten” erhöht oder erzeugt werden.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze bereit, die eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden Ursprungs- oder Wildtyppflanze aufweist, indem eine oder mehrere der ”Aktivitäten” erhöht oder erzeugt werden. In einer anderen Ausführungsform ist die Nährstoffnutzungseffizienz, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erreicht wird, und die die transgene Pflanze der Erfindung aufweist, eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz.
In einer Ausführungsform ist die Aktivität in einem oder mehreren spezifischen Kompartimenten einer Zelle erhöht und verleiht einen erhöhten Ertrag, z. B. zeigt die Pflanze ein erhöhtes oder verbessertes ertragsbezogenes Merkmal. Zum Beispiel ist die Aktivität im Plastid einer Zelle erhöht, wie in Tabelle I oder II in Spalte 6 angegeben, und erhöht den Ertrag in einer entsprechenden Pflanze. Zum Beispiel verleiht die spezifische plastidäre Lokalisierung der Aktivität ein verbessertes oder erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, wie in Tabelle VIII dargestellt. Ferner kann die Aktivität in Mitochondrien einer Zelle erhöht sein und den Ertrag in einer entsprechenden Pflanze erhöhen, indem z. B. ein verbessertes oder erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal verliehen wird, wie in Tabelle VIII dargestellt ist
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyppflanze, umfassend mindestens einen der Schritte, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Polypeptids umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder mindestens ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II beziehungsweise Tabelle IV angeführt; (ii) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Expressionsprodukts eines oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle, umfassend ein oder mehrere Polynukleotid(e), wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I angeführt, und (iii) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines funktionellen Äquivalents von (i) oder (ii).
Daher wird die Erhöhung oder Erzeugung einer oder mehrerer der Aktivitäten zum Beispiel durch ein oder mehrere Expressionsprodukte des Nukleinsäuremoleküls, z. B. Proteine, verliehen. Daher wird in der vorliegenden, oben beschriebenen Erfindung die Erhöhung oder Erzeugung einer oder mehrerer der Aktivitäten zum Beispiel durch ein oder mehrere Protein(e) verliehen, jeweils umfassend ein Polypeptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 angeführt ist.
Das Verfahren der Erfindung umfasst in einer Ausführungsform die folgenden Schritte: (i) Erhöhen oder Erzeugen der Expression von; und/oder (ii) Erhöhen oder Erzeugen der Expression eines Expressionsprodukts; und/oder (iii) Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten eines Expressionsprodukts, kodiert von; mindestens einem Nukleinsäuremolekül (in der Folge ”ertragsbezogenes Protein(YRP)”-kodierendes Gen oder ”YRP”-Gen), umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid kodiert, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt ist;
(b) einem Nukleinsäuremolekül; das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt ist;
(c) einem Nukleinsäuremolekül, das infolge einer Degeneriertheit des genetischen Kodes von einer Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt ist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht;
(d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30, zum Beispiel 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98, oder 99% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt ist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht;
(e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30, zum Beispiel 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98, oder 99% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids kodiert, für das das Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert, und das die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt wird, das ein Polynukleotid umfasst, wie in Spalte 5 von Tabelle I angeführt, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht;
(f) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht;
(g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt werden, für das eines der Nukleinsäuremoleküle (a) bis (e) kodiert, und mit der Aktivität, die durch das Nukleinsäuremolekül dargestellt wird, das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle I angeführt umfasst;
(h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder eines oder mehrere Polypeptidmotive umfasst, wie in Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV angeführt umfasst;
(i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit der Aktivität kodiert, die durch ein Protein dargestellt ist, wie in Spalte 5 von Tabelle II angeführt, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht;
(j) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III erzeugt wird und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV angeführt umfasst; und
(k) einem Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde erhältlich ist, umfassend eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) oder mit einem Fragment davon mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, oder 500 nt, 1000 nt, 1500 nt, 2000 nt oder 3000 nt eines Nukleinsäuremoleküls komplementär zu einer Nukleinsäuremolekülsequenz, die in (a) bis (e) charakterisiert ist und für ein Polypeptid mit der Aktivität kodiert, die durch ein Protein dargestellt ist, das ein Polypeptid wie in Spalte 5 von Tabelle II angeführt umfasst.

Daher können die Gene der vorliegenden Erfindung, oder die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die für ein Protein mit einer Aktivität kodieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein, die für ein Protein kodieren, das ein Polypeptid umfasst, für das eine Nukleinsäuresequenz wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 dargestellt kodiert, und/oder die für ein Protein kodieren, das ein Polypeptid wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 angeführt umfasst, oder die mit dem Primersatz amplifiziert werden können, der in Tabelle III, Spalte 7 dargestellt ist, auch als ”YRP Gene” bezeichnet werden.
Proteine oder Polypeptide, für die die ”YRP-Gene” kodieren, werden als ”ertragsbezogene Proteine” oder ”YRP” bezeichnet. Für den Zweck der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die Proteine mit einer Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein, Protein(e), die ein Polypeptid umfassen, das von einer oder mehreren Nukleinsäuresequenzen kodiert wird, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 dargestellt, oder Protein(e), die ein Polypeptid umfassen, das in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, oder Proteine, die die Konsensussequenz umfassen, die in Tabelle IV, Spalte 7 dargestellt ist, oder eines oder mehrere der Motive umfassen, die in Tabelle IV, Spalte 7 dargestellt sind, auch als ”ertragsbezogene Proteine” oder ”YRPs” bezeichnet.
Somit stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung eine Pflanze bereit, die einen erhöhten oder verbesserten Ertrag im Vergleich zu der entsprechenden Ursprungs- oder Wildtyppflanze aufweist, durch Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivität(en), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein, die durch ein oder mehrere YRP oder das Genprodukt eines oder mehrerer YRP-Gene verliehen wird, zum Beispiel durch das Genprodukt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polynukleotid umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 angeführt ist, z. B. durch ein oder mehrere Proteine, die jeweils ein Polypeptid umfassen, für das eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen kodieren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 angeführt ist, oder durch ein oder mehrere Protein(e), die jeweils ein Polypeptid umfassen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 angeführt ist, oder ein Protein mit einer Sequenz entsprechend der Konsensussequenz, die in Tabelle IV, Spalte 7 angeführt ist.
Wie erwähnt, kann die Erhöhung des Ertrags durch ein oder mehrere ertragsbezogene Merkmale vermittelt werden. Somit betrifft das Verfahren der Erfindung auch die Produktion einer Pflanze, die eine oder die mehreren ertragsbezogene(m) Merkmal(e) aufweist.
Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze bereit, die eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, z. B. Stickstoffnutzungseffizienz (NUE), erhöhte Stressresistenz insbesondere abiotische Stressresistenz, erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, erhöhte Wassernutzungseffizienz und/oder eine erhöhte Stressresistenz, insbesondere abiotische Stressresistenz, ganz besonders Niedertemperaturtoleranz oder Luftzugtoleranz oder einen erhöhten intrinsischen Ertrag aufweist.
In einer Ausführungsform werden eine oder mehrere der Aktivitäten durch Erhöhen der Menge und/oder spezifischen Aktivität eines oder mehrerer Proteine mit dieser Aktivität erhöht, z. B. durch Erhöhen der Menge und/oder spezifischen Aktivität in der Zelle oder einem Kompartiment einer Zelle eines oder mehrerer YRP, zum Beispiel von Polypeptiden, wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 angeführt, oder entsprechend der Konsensussequenz, wie in Tabelle VI, Spalte 7 angeführt.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Ursprungs- oder Wildtyppflanze, z. B. einer transgenen Pflanze, umfassend: (a) Erhöhen oder Erzeugen, in einem Pflanzenzellkern, einer Pflanzezelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, einer oder mehrerer Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein, z. B. durch die hierin genannten Verfahren; und (b) Kultivieren oder Zuchten der Pflanzenzelle, der Pflanze oder des Teils davon unter Bedingungen, die die Entwicklung der Pflanzenzelle, der Pflanze oder des Teils davon ermöglichen; und (c) Gewinnen einer Pflanze von dem Pflanzenzellkern, einer Pflanzenzelle, einem Pflanzenteil, die einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Ursprungs- oder Wildtyppflanze zeigt; (d) und wahlweise, Selektieren der Pflanze oder eines Teils davon, die/der einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes oder verbessertes ertragsbezogenes Merkmal, z. B. eine verbesserte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder abiotische Stressresistenz, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle aufweist, die z. B. sichtbare Anzeichen eines Mangels und/oder Absterbens zeigt.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren für die Identifizierung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, umfassend das Screenen einer Population eines/einer oder mehrerer Pflanzenzellkerne, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen oder Teile davon für die Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein, Vergleichen des Wertes der Aktivität mit dem Aktivitätswert in einer Referenz, Identifizieren eines/einer oder mehrerer Pflanzenzellkerne, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen oder Teile davon mit der erhöhten Aktivität im Vergleich zu der Referenz, wahlweise Erzeugen einer Pflanze aus dem/der identifizierten Pflanzenzellkern, -zelle oder -gewebe.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren für die Identifizierung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, umfassend das Screenen einer Population eines/einer oder mehrerer Pflanzenzellkerne, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen oder Teile davon für den Expressionswert einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität verleiht, Vergleichen des Expressionswertes mit einer Referenz; Identifizieren eines/einer oder mehrerer Pflanzenzellkerne, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen oder Teile davon mit dem erhöhten Expressionswert im Vergleich zu der Referenz, wahlweise Erzeugen einer Pflanze aus dem/der identifizierten Pflanzenzellkern, -zelle oder -gewebe.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags einer Population von Pflanzen, umfassend das Prüfen der Wachstumstemperatur(en) in der Anpflanzungsfläche, Vergleichen der Temperaturen mit der optimalen Wachstumstemperatur einer Pflanzenspezies oder einer Varietät, die für den Anbau in Betracht gezogen wird, z. B. die hierin erwähnte Ursprungs- oder Wildtyppflanze, Anpflanzen und Züchten der Pflanze der Erfindung, wenn die Wachstumstemperatur für das Anpflanzen und Züchten der Pflanzenspezies oder der Varietät, die für den Anbau in Betracht gezogen wird, z. B. für die Ursprungs- oder Wildtyppflanze, nicht optimal ist. Das Verfahren kann teilweise oder insgesamt ein oder mehrere Male wiederholt werden.
Das Verfahren kann teilweise oder insgesamt ein oder mehrere Male wiederholt werden.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Anpassung an Umweltstress bereit, insbesondere der Anpassung an Niedertemperatur, d. h. Verstärken der Toleranz gegenüber Niedertemperatur, umfassend, ohne aber darauf beschränkt zu sein, eine Verstärkung der Kältetoleranz und/oder Gefriertoleranz, in einem aktiven photosynthetischen Organismus, insbesondere in einer Pflanze, die sich alleine oder gemeinsam in einer solchen erhöhten abiotischen Stressanpassung zeigen, und/oder ein Verfahren für einen erhöhten Ertrag unter abiotischen Stressbedingungen, insbesondere Niedertemperaturstress.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung eine Pflanzenzelle und/oder eine Pflanze mit verstärktem oder verbessertem Ertrag bereit. Wie erwähnt, kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein erhöhter oder verbesserter Ertrag durch Erhöhen oder Verbessern eines oder mehrerer ertragsbezogener Merkmale erreicht werden, z. B. der Nährstoffnutzungseffizienz, Wassernutzungseffizienz, Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere Niedertemperatur oder Dürre, im Vergleich zu der entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyp- oder Ausgangspflanzenzelle und/oder Pflanze.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden diese Merkmale durch einen Prozess für eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress in einem aktiven photosynthetischen, Organismus, vorzugsweise einer Pflanze, im Vergleich zu einem entsprechenden (nicht transformierten) aktiven photosynthetischen Wildtyp- oder Ausgangs-Organismus erreicht.
”Verbesserte Anpassung” an Umweltstress wie z. B. Gefrier- und/oder Kältetemperaturen, bezieht sich auf eine verbesserte Pflanzenleistung unter Umweltstressbedingungen. Daher bezieht sich für den Zweck der Beschreibung der vorliegenden Erfindung der Begriff ”Niedertemperatur” in Bezug auf Niedertemperaturstress bei einem aktiven photosynthetischen Organismus, vorzugsweise einer Pflanze, und ganz besonders einer Nutzpflanze, auf jede Niedertemperaturbedingung wie oben beschrieben, vorzugsweise Kälte- und/oder Gefriertemperaturen, wie oben definiert, abhängig vom Zusammenhang.
In einer weiteren Ausführungsform bedeutet ”verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress” in einem aktiven photosynthetischen Organismus, dass der aktive photosynthetische Organismus, vorzugsweise die Pflanze, wenn er/sie abiotischen Umweltstressbedingungen ausgesetzt ist, wie hierin erwähnt, z. B. Niedertemperaturbedingungen einschließlich Kälte- und Gefriertemperaturen oder z. B. Dürre, einen verstärkten Ertrag, z. B. einen erhöhten Ertrag, wie hierin erwähnt, z. B. einen Samenertrag oder Biomassenertrag, aufweist, im Vergleich zu einem entsprechenden (nicht transformierten) aktiven photosynthetischen Wildtyp oder Ausgangs-Organismus, z. B. einer Wildtyp- oder Ursprungs-Pflanze.
Daher stellt in einer Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle mit erhöhtem Ertrag, z. B. mit Toleranz gegen abiotischen Umweltstress und/oder mit einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle bereit, durch Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-traps-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein Aktivität.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Proteine mit einer Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein-Aktivität, wie auch Polypeptide, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 angeführt sind, oder die die Sequenz umfassen, die in Tabelle IV, Spalte 7 angeführt ist, als ”ertragsbezogene Proteine” bezeichnet.
In einer anderen Ausführungsform zeigt der aktive photosynthetische Organismus, der gemäß der Erfindung hergestellt wird, insbesondere die Pflanze der Erfindung, einen erhöhten Ertrag unter abiotischen Umweltstressbedingungen und zeigt eine verstärkte Toleranz gegen einen weiteren abiotischen Umweltstress oder zeigt ein weiteres verbessertes ertragsbezogenes Merkmal.
In einer anderen Ausführungsform erfüllt diese Erfindung den Bedarf, neue, einzigartige Gene zu Identifizieren, die imstande sind, einen erhöhten Ertrag zu verleihen, z. B. mit einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel mit verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel mit einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, bei einem aktiven photosynthetischen Organismus, vorzugsweise Pflanzen, nach Expression oder Überexpression endogener und/oder exogener Gene. Daher stellt die vorliegende Erfindung YRP und YRP Gene bereit.
In einer anderen Ausführungsform erfüllt diese Erfindung den Bedarf, neue, einzigartige Gene zu identifizieren, die imstande sind, einen erhöhten Ertrag zu verleihen, z. B. mit einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel mit verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel mit einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, bei einem aktiven photosynthetischen Organismus, vorzugsweise Pflanzen, nach Expression oder Überexpression endogener Gene. Daher stellt die vorliegende Erfindung YRP und YRP Gene bereit, die von Pflanzen abgeleitet sind. Insbesondere ein Gen von Pflanzen, wie in Spalte 5 wie auch in Spalte 7 von Tabelle I oder II angeführt.
In einer anderen Ausführungsform erfüllt diese Erfindung den Bedarf, neue, einzigartige Gene zu identifizieren, die imstande sind, einen erhöhten Ertrag zu verleihen, z. B. mit einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel mit verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel mit einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, bei einem aktiven photosynthetischen Organismus, vorzugsweise Pflanzen, nach Expression oder Überexpression exogener Gene. Daher stellt die vorliegende Erfindung YRP und YRP Gene bereit, die von Pflanzen und anderen Organismen in Spalte 5 wie auch in Spalte 7 der Tabelle I oder II abgeleitet sind.
In einer anderen Ausführungsform erfüllt diese Erfindung den Bedarf, neue, einzigartige Gene zu identifizieren, die imstande sind, eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress in Kombination mit einer Erhöhung des Ertrags bei einem aktiven photosynthetischen Organismus, vorzugsweise Pflanzen, nach Expression oder Überexpression endogener und/oder exogener Gene zu verleihen.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zum Beispiel transgenen, aktiven photosynthetischen Organismus, oder eines Teils davon, oder einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Teils davon für die Erzeugung einer solchen Pflanze, wobei der Organismus einen erhöhten Ertrag zeigt, z. B. die Pflanze ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal zeigt, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, wie zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen Dürre und/oder Niedertemperatur, und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einem entsprechenden, zum Beispiel nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus oder einem Teil davon, oder einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon zeigt, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer der Aktivitäten, z. B. der Aktivität des YRP oder des Genprodukt des YRP Gens, z. B. einer Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyposphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein, in einem aktiven photosynthetischen Organismus oder einem Teil davon, z. B. einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, und (b) wahlweise Regenieren einer Pflanze aus der Pflanzenzelle, dem Pflanzenzellkern oder einem Teil davon, Züchten des aktiven photosynthetischen Organismus oder eines Teils davon, z. B. einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Teil davon unter Bedingungen, die die Entwicklung eines aktiven photosynthetischen Organismus oder eines Teils davon ermöglichen, vorzugsweise einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Teils davon, mit erhöhtem Ertrag, z. B. mit einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel mit verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel mit erhöhter Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus oder einem Teil davon, vorzugsweise einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag oder eines Pflanzenzellkerns, einer Pflanzenzelle, oder eines Teils davon für die Erzeugung einer solchen Pflanze, wobei der Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanze erhöht ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhöhen oder Erzeugen, in dem Pflanzenzellkern, der Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, einer oder mehrerer der Aktivitäten, z. B. der Aktivität des YRP oder des Genprodukts des YRP Gens; (b) wahlweise Regenerieren einer Pflanze von dem Pflanzenzellkern, der Pflanzenzelle oder einem Teil davon, Züchten der Pflanze unter Bedingungen, vorzugsweise mit oder ohne Nährstoffmangel und/oder abiotischem(n) Stress, die die Entwicklung einer Pflanze ermöglichen, die einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanze aufweist; und (c) Selektieren der Pflanze, die den erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine verbesserte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder abiotische Stressresistenz, aufweist im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon, die/der sichtbare Anzeichen für einen Mangel und/oder ein Absterben unter den Bedingungen zeigt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung z. B. eines transgenen, aktiven photosynthetischen Organismus oder eines Teils davon, vorzugsweise einer Pflanze, oder einer Pflanzenzelle, eines Pflanzenzellkerns, oder eines Teils davon für die Regenerierung der Pflanze, wobei die Pflanze einen erhöhten Ertrag aufweist, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal aufweist, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress aufweist, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder einen erhöhten Intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal aufweist im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus oder einem Teil davon, vorzugsweise einer Pflanze, wobei das Verfahren mindestens die folgenden Schritte umfasst (a) Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer der Aktivitäten, z. B. der Aktivität des YRP oder des Genprodukts des YRP Gens, z. B. einer Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein-Aktivität in einem aktiven photosynthetischen Organismus oder einem Teil davon, vorzugsweise einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, (b) Züchten des aktiven photosynthetischen Organismus gemeinsam mit einem, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus unter abiotischen Umweltstressbedingungen oder Mangel; (c) Selektieren des aktiven photosynthetischen Organismus mit erhöhtem Ertrag, z. B. mit erhöhtem ertragsbezogenem Merkmal, zum Beispiel mit verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel mit einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, oder eines Teils davon, z. B. einer Pflanzenzelle, wobei der Ertrag im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, aktiven photosynthetischen Wildtyp-Organismus erhöht ist, z. B. einer Pflanze, nachdem der z. B. nicht transformierte, aktive photosynthetische Wildtyp-Organismus oder ein Teil davon sichtbare Anzeichen von Mangel und/oder Absterben zeigt
In einer Ausführungsform in dieser Beschreibung bezieht sich abiotischer Umweltstress auf Niedertemperaturstress. Ferner ist in einer Ausführungsform das ertragsbezogene Merkmal eine erhöhte Niedertemperaturtoleranz.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in dem Verfahren zur Herstellung eines, z. B. transgenen, aktiven photosynthetischen Organismus oder eines Teils davon, die Aktivität des YRP durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, erhöht oder erzeugt, oder durch die Nukleinsäuresequenzen wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 kodiert, in dem Teil einer Zelle, wie in Tabelle II oder Tabelle I in Spalte 6 angeführt, erhöht In einer Ausführungsform wird die Aktivität, z. B. die Aktivität des Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, oder kodiert durch die Nukleinsäuresequenzen, wie in Tabelle I, Spalte 5 dargestellt, in dem Teil einer Zelle, wie in Tabelle II oder Tabelle I in Spalte 6 angeführt, erhöht. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze, Transformieren einer Pflanzenzelle oder eines Pflanzenzellkerns oder eines Pflanzengewebes zur Erzeugung einer solchen Pflanze, mit einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid kodiert, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt ist; (b) einem Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt ist (c) einem Nukleinsäuremolekül, das, infolge der Degeneriertheit des genetischen Kodes, von einer Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt ist, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30, zum Beispiel 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98, oder 99% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt ist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30, zum Beispiel 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98, oder 99% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids kodiert, für das das Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert und mit der Aktivität, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I angeführt, und das einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (f) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt werden, für das eines der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) kodiert, und mit der Aktivität, die durch das Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt; (h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, umfassend die Konsensussequenz oder eines oder mehrere Polypeptidmotive, wie in Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und vorzugsweise mit der Aktivität, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV dargestellt; (i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, mit der Aktivität, die durch ein Protein dargestellt ist, wie in Spalte 5 von Tabelle II angeführt, und das einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (j) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das durch Amplifzieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III erhalten wird und vorzugsweise die Aktivität hat, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, umfassend ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV angeführt; und (k) einem Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde erhalten wird, umfassend eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 20, 30, 50, 100, 200, 300, 500 oder 1000 oder mehr nt eines Nukleinsäuremoleküls komplementär zu einer Nukleinsäuremolekülsequenz, die in (a) bis (e) charakterisiert ist und für ein Polypeptid mit der Aktivität kodiert, die durch ein Protein dargestellt ist, umfassend ein Polypeptid wie in Spalte 5 von Tabelle II angeführt, und Regenerieren einer transgenenen Pflanze aus diesem transformierten Pflanzenzellkern, der Pflanzenzelle oder dem Pflanzengewebe mit erhöhtem Ertrag.
Eine Modifizierung, d. h. eine Erhöhung, kann durch endogene oder exogene Faktoren verursacht werden. Zum Beispiel kann eine Erhöhung der Aktivität in einem Organismus oder einem Teil davon durch Hinzufügen eines Genprodukts oder eines Vorläufers oder eines Aktivators order eines Agonisten zu den Medien oder Nährsubstanzen verursacht werden oder kann durch, vorübergehendes oder stabiles, Einleiten der Subjekte in einen Organismus verursacht werden. Ferner kann eine solche Erhöhung durch das Einleiten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder des kodierten Proteins in das korrekte Zellkompartiment, zum Beispiel in den Kern oder in das Zytoplasma oder in die Plastide, entweder durch Transformation und/oder Targeting verursacht werden. Für den Zweck der Beschreibung der vorliegenden Erfindung sollen die Begriffe ”zytoplasmatisch” und ”nicht zielgerichtet” angeben, dass die Nukleinsäure der Erfindung ohne Hinzufügen einer nicht natürlichen Transitpeptid-Kodierungssequenz exprimiert wird. Eine nicht natürliche Transitpeptid-Kodierungssequenz ist eine Sequenz, die kein natürlicher Teil einer Nukleinsäure der Erfindung ist, z. B. der Nukleinsäuren, die in Tabelle I Spalte 5 oder 7 angeführt sind, sondern vielmehr durch molekulare Manipulationsschritte hinzugefügt wird, wie zum Beispiel in dem Beispiel unter ”Plastid-zielgerichteter Expression” beschrieben. Daher sollen die Begriffe ”zytoplasmatisch” und ”nicht zielgerichtet” eine zielgerichtete Lokalisierung an einem beliebigen Zellkompartiment für die Produkte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen nach ihren natürlich auftretenden Sequenzeigenschaften innerhalb des Hintergrunds des transgenen Organismus nicht ausschließen. Die subzelluläre Stelle des reifen Polypeptids, das von den eingeschlossenen Sequenzen abgeleitet ist, kann von einem Fachmann für den Organismus (die Pflanze) unter Verwendung von Software-Tools wie TargetP (Emanuelsson et al., (2000), Predicting sub-cellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence., J. Mol. Biol. 300, 1005–1016.), ChloroP (Emanuelsson et al. (1999), ChloroP, a neural networkbased method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites., Protein Science, 8: 978–984.) oder anderer vorhersagender Software-Tools (Emanuelsson et al. (2007), Locating Proteins in the cell using TargetP, Signale, and related tools., Nature Protocols 2, 953–971) vorhergesagt werden.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer, z. B. transgenen, Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. mit einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel mit verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel mit einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze, das Folgendes umfasst (a) Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer der Aktivitäten, z. B. der Aktivität des YRP oder des Genprodukts des YRP Gens, z. B. einer Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein in einer Organelle, z. B. in einem Plastid oder einem Mitochondrion, von einer Pflanzenzelle, zum Beispiel wie in Spalte 6 von Tabelle I angeführt, und (b) Zuchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag ermöglichen, z. B. mit einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel mit verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel mit einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Die Lokalisierung des Polypeptids, wie hierin beschrieben, kann das ertragsbezogene Merkmal ändern. Zum Beispiel kann die Lokalisierung unter der Kontrolle eines Transitpeptids stehen, wie in Spalte 6 angeführt, oder nicht-zielgerichtet sein. Eine ”nicht zielgerichtete” Lokalisierung bedeutet, dass das Polypeptid den Ertrag erhöht, z. B. das angegebene ertragsbezogene Merkmal verleiht, das ohne künstliches Transitpeptid exprimiert wird, das an die Kodierungssequenz gebunden ist. Der Fachmann weiß, dass die Lokalisierung eines Polypeptids durch ein oder mehrere Elemente oder Regionen innerhalb des Polypeptids verliehen wird. Signale, die die Lokalisierung kontrollieren, können austauschbar sein, z. B. wie unten für die Transitpeptide dargestellt. In einer Ausführungsform wird eine Aktivität, die laut vorliegender Offenbarung durch ein YPR verliehen wird; z. B. ein Polypeptid, das in Tabelle II dargestellt ist, in dem Plastid erhöht oder erzeugt, wenn in Spalte 6 jeder Tabelle I der Begriff ”plastidär” für das Polypeptid angegeben ist. In einer Ausführungsform wird eine Aktivität, die laut vorliegender Offenbarung durch ein YPR verliehen wird; z. B. ein Polypeptid, das in Tabelle II dargestellt ist, in den Mitochondrien erhöht oder erzeugt, wenn in Spalte 6 jeder Tabelle I der Begriff ”Mitochondrien” für das Polypeptid angegeben ist.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer, z. B. transgenen, Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. mit einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel mit verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel mit erhöhter Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder erhöhter Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze, umfassend (a) Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer der Aktivitäten im Zytoplasma einer Pflanzenzelle, und (b) Züchten der Pflanze unter Bedingungen, die die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag ermöglichen, z. B. mit einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel mit verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel mit erhöhter Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder erhöhter Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
In einer Ausführungsform ist eine Aktivität wie laut vorliegender Offenbarung durch ein Polypeptid verliehen, das in Tabelle II dargestellt ist, im Zytoplasma erhöht oder erzeugt, wenn in Spalte 6 jeder Tabelle I der Begriff ”zytoplasmatisch” für das Polypeptid angeführt ist.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer, z. B. transgenen, Pflanze mit erhöhtem Ertrag, oder eines Teils davon, z. B. einer Pflanze mit einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze, umfassend (a1) Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer der Aktivitäten, z. B. der Aktivität des YRP oder des Genprodukts des YRP Gens, z. B. einer Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerese, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein in einer Organelle einer Pflanzenzelle, oder (a2) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines YRP, z. B. eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, oder wie durch die Nukleinsäuresequenzen kodiert, die in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 dargestellt sind, und das an eine Nukleinsäuresequenz gebunden ist, die für ein Transitpeptid in der Pflanzenzelle kodiert; oder (a3) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines YRP, z. B. eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt oder wie durch die Nukleinsäuresequenzen kodiert, die in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 dargestellt sind, und das an eine Nukleinsäuresequenz gebunden ist, die für eine Organellen-Lokalisierungssequenz kodiert, insbesondere eine Chloroplast-Lokalisierungssequenz, in einer Pflanzenzelle, (a4) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines YRP, z. B. eines Proteins wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, oder wie durch die Nukleinsäuresequenzen kodiert, die in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 dargestellt sind, und das an eine Nukleinsäuresequenz gebunden ist, die für eine Mitochondrion-Lokalisierungssequenz in einer Pflanzenzelle kodiert, und (b) Regenerieren einer Pflanze aus der Pflanzenzelle; (c) Züchten der Pflanze unter Bedingungen, die die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag ermöglichen, z. B. mit einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer weiteren Ausführungsform in dem Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag die Aktivität erhöht oder erzeugt durch (a1) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, kodiert durch die Nukleinsäuresequenzen wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 dargestellt, in einer Organelle einer Pflanze durch die Transformation der Organelle, oder (a2) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, kodiert durch die Nukleinsäuresequenzen wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 dargestellt, in dem Plastid einer Pflanze, oder in einem oder mehreren Teilen davon, durch die Transformation der Plastide; (a3) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines YRP, z. B. eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, oder kodiert durch die Nukleinsäuresequenzen, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 dargestellt, in dem Chloroplasten einer Pflanze, oder in einem oder mehreren Teilen davon, durch Transformation des Chloroplasten, (a4) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines YRP, z. B. eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt oder wie durch die Nukleinsäuresequenzen kodiert, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 dargestellt, im Mitochondrion einer Pflanze, oder in einem oder mehreren Teilen davon, durch Transformation des Mitochondrions.
Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. basierend auf einem erhöhten oder verbesserten ertragsbezogenen Merkmal, im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyppflanze, umfassend mindestens einen der Schritte, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus: (i) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder mindestens ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II beziehungsweise Tabelle IV angeführt; (ii) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Expressionsprodukts eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I angeführt, und (iii) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines funktionellen Äquivalents von (i) oder (ii).
Im Prinzip kann die Nukleinsäuresequenz, die für ein Transitpeptid kodiert, von jedem Organismus, wie Mikroorganismen, wie Algen oder Pflanzen, die Plastide enthaften, vorzugsweise Chloroplasten isoliert werden. Ein ”Transitpeptid” ist eine Aminosäuresequenz, deren kodierende Nukleinsäuresequenz gemeinsam mit dem entsprechenden Strukturgen translatiert wird. Dies bedeutet, dass das Transitpeptid ein integraler Teil des translatierten Proteins ist und eine Amino-terminale Verlängerung des Proteins bildet. Beide werden als so genanntes ”Prä-Protein” translatiert. Im Allgemeinen wird das Transitpeptid von dem Prä-Protein während oder unmittelbar nach dem Import des Proteins in die korrekte Zellorganelle, wie ein Plastid, abgespalten, um das reife Protein zu erhalten. Das Transitpeptid garantiert eine korrekte Lokalisierung des reifen Proteins, indem es den Transport von Proteinen durch intrazelluläre Membrane erleichtert.
Nukleinsäuresequenzen, die für ein Transitpeptid kodieren, können von einer Nukleinsäuresequenz abgeleitet werden, die für ein Protein kodiert, das schließlich im Plastid vorhanden ist und von einem Organismus stammt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Acetabularia, Arabidopsis, Brassica, Capsicum, Chlamydomonas, Cururbita, Dunaliella, Euglena, Flaveria, Glycine, Helianthus, Hordeum, Lemna, Lolium, Lycopersion, Malus, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Oenotherea, Oryza, Petunia, Phaseolus, Physcomitrella, Pinus, Pisum, Raphanus, Silene, Sinapis, Solanum, Spinacea, Stevia, Synechococcus, Triticum und Zea.
Zum Beispiel werden solche Transitpeptide, die vorteilhaft in dem erfindungsgemäßen Prozess verwendet werden, von der Nukleinsäuresequenz abgeleitet, die für ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ribulosebisphosphat-Carboxylase/Oxygenase, 5-Enolpyruvyl-shikimate-3-phosphat-Synthase, Acetolactat-Synthase, Chloroplast ribosomales Protein CS17, Cs Protein, Ferredoxin, Plastocyanin, Ribulose Eisphosphat-Carboxylase-Activase, Tryptophan-Synthase, Acylträgerprotein, Plastid Chaperonin-60, Cytochrom c552, 22-kDA Wärmeschockprotein, 33-kDa Sauerstoff entwickelndes Enhancer-Protein 1, ATP Synthase γ Untereinheit, ATP Synthase δ Untereinheit, Chlorophyll-a/b-BindungsproteinII-1, Sauerstoff entwickelndes Enhancer-Protein 2, Sauerstoff entwickelndes Enhancer-Protein 3, Photosystem I: P21, Photosystem I: P28, Photosystem I: P30, Photosystem I: P35, Photosystem I: P37, Glycerol-3-phosphat-Acyltransferasen, Chlorophyll a/b Bindungsprotein, CAB2 Protein, Hydroxymethyl-bilan-Synthase, Pyruvat-orthophosphat-Dikinase, CAB3 Protein, Plastid Ferritin, Ferritin, Early Light-Inducible Protein, Glutamat-1-semialdehyd-Aminotransferase, Protochlorophyllid-Reductase, Stärke-Granula-gebundene Amylase-Synthase, Lichtsammel-Chlorophyll a/b-Bindungsprotein von Photosystem II, Haupt-Pollenallergen Lol p 5a, Plastid ClpB ATP-abhängige Protease, Superoxid Dismutase, Ferredoxin NADP Oxidoreductase, 28-kDa Ribonucleoprotein, 31-kDa Ribonucleoprotein, 33-kDa Ribonucleoprotein, Acetolactat-Synthase, ATP Synthase CF0 Untereinheit 1, ATP Synthase CF0 Untereinheit 2, ATP Synthase CF0 Untereinheit 3, ATP Synthase CF0 Untereinheit 4, Cytochrom f, ADP-Glucose Pyrophosphorylase, Glutamin-Synthase, Glutamin-Synthase 2, Carbon-Anhydrase, GapA Protein, Wärmeschockprotein hsp21, Phosphat-Translokator, Plastid ClpA ATP-abhängige Protease, Plastid ribosomales Protein CL24, Plastid ribosomales Protein CL9, Plastid ribosomales Protein PsCL18, Plastid ribosomales Protein PsCL25, DAHP Synthase, Stärke-Phosphorylase, Wurzel-Acylträgerprotein II, Betain-Aldehyd-Dehydrogenase, GapB Protein, Glutamin-Synthetase 2, Phosphoribulokinase, Nitrit-Reductase, ribosomales Protein L12, ribosomales Protein L13, ribosomales Protein L21, ribosomales Protein L35, ribosomales Protein L40, Triose-phosphat-3-phosphoglyerat-phosphat-Translokator, Ferredoxin-abhängige Glutamat-Synthase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, NADP-abhängiges Apfelenzym und NADP-Malat-Dehydrogenase.
In einer Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz, die für ein Transitpeptid kodiert, von einer Nukleinsäuresequenz abgeleitet, die für ein Protein kodiert, das schließlich in dem Plastid vorhanden ist und von einem Organismus stammt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Spezies Acetabularia mediterranea, Arabidopsis thaliana, Brassica campestris, Brassica napus, Capsicum annuum, Chlamydomonas reinhardtii, Cururbita moschata, Dunaliella salina, Dunaliella tertiolecta, Euglena gracilis, Flaveria trinervia, Glycine max, Helianthus annuus, Hordeum vulgare, Lemna gibba, Lolium perenne, Lycopersion esculentum, Malus domestica, Medicago falcata, Medicago sativa, Mesembryanthemum crystallinum, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Oenotherea hookeri, Oryza sativa, Petunia hybrida, Phaseolus vulgaris, Physcomitrella patens, Pinus tunbergii, Pisum sativum, Raphanus sativus, Silene pratensis, Sinapis alba, Solanum tuberosum, Spinacea oleracea, Stevia rebaudiana, Synechococcus, Synechocystis, Triticum aestivum und Zea mays.
Nukleinsäuresequenzen, die für Transitpeptide kodieren, sind von Heijne et al. (Plant Molecular Biology Reporter, 9 (2), 104, (1991)) offenbart, das hierin zum Zwecke der Bezugnahme zitiert wird. Tabelle V zeigt einige Beispiele der Transitpeptidsequenzen, die von Heijne et al offenbart sind.
Gemäß der Offenbarung der Erfindung, insbesondere in den Beispielen, kann der Fachmann andere Nukleinsäuresequenzen, die von Heijne et al. offenbart sind, an die hierin offenbarten YRP Gene oder Gene, die für ein YRP kodieren, anbinden, z. B. an Nukleinsäuresequenzen die in Tabelle I, Spalten 5 und 7 angeführt sind, z. B. für die Nukleinsäuremoleküle, für die in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidär” angegeben ist.
Nukleinsäuresequenzen die für Transitpeptide kodieren, werden von der Gattung Spinacia abgeleitet, wie Chloroplast 30S ribosomales Protein PSrp-1, Wurzelacylträgerprotein II, Acylträgerprotein, ATP Synthase: γ Untereinheit, ATP Synthase: δ Untereinheit, Cytochrom f, Ferredoxin I, Ferredoxin NADP Oxidoreductase (= FNR), Nitritreductase, Phosphoribulokinase, Plastocyanin oder Carbonanhydrase. Der Fachmann wird erkennen, dass verschiedene andere Nukleinsäuresequenzen, die für Transitpeptide kodieren, leicht aus Plastid-lokalisierten Proteinen isoliert werden können, die von nuklearen. Genen als Vorläufer exprimiert und dann auf Plastide gerichtet werden. Solche für Transitpeptide kodierende Sequenzen können für die Konstruktion anderer Expressionskonstrukte verwendet werden. Die Transitpeptide, die vorzugsweise in dem erfindungsgemäßen Prozess verwendet werden und die Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und Proteine sind, sind für gewöhnlich 20 bis 120 Aminosäuren, vorzugsweise 25 bis 110, 30 bis 100 oder 35 bis 90 Aminosäuren, insbesondere 40 bis 85 Aminosäuren und ganz besonders 45 bis 80 Aminosäuren lang und fungieren posttranslational, um das Protein zu dem Plastid zu lenken, vorzugsweise zum Chloroplasten. Die Nukleinsäuresequenzen, die für solche Transitpeptide kodieren, sind stromaufwärts einer Nukleinsäuresequenz lokalisiert, die für das reife Protein kodiert. Für die korrekte molekulare Verbindung der für das Transitpeptid kodierenden Nukleinsäure und der Nukleinsäure, die für das anzusteuernde Protein kodiert, ist es manchmal notwendig, zusätzliche Basenpaare an der Verbindungsposition einzuführen, die Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen bildet, die für die molekulare Verbindung der verschiedenen Nukleinsäuremoleküle nützlich sind. Diese Prozedur könnte zu sehr wenigen zusätzlichen Aminosäuren am N-Terminal des reifen importierten Proteins führen, das für gewöhnlich und vorzugsweise die Proteinfunktion nicht beeinträchtigt. In jedem Fall müssen die zusätzlichen Basenpaare an der Verbindungsposition, die Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen bildet, sorgfältig gewählt werden, um die Bildung von Stopp-Kodons oder Kodons zu verhindern, die für Aminosäuren kodieren, die einen starken Einfluss auf die Proteinfaltung haben, wie z. B. Prolin. Es ist bevorzugt, dass solche zusätzlichen Kodons für kleine, strukturelle, flexible Aminosäuren wie Glycin oder Alanin kodieren.
Wie oben erwähnt, kann die Nukleinsäuresequenz, die für das YRP, z. B. für ein Protein, wie in Tabelle II, Spalte 3 oder 5 angeführt, und seine Homologe, wie in Tabelle I, Spalte 7 angeführt, kodiert, an eine Nukleinsäuresequenz gebunden werden, die für ein Transitpeptid kodiert, z. B. wenn für das Nukleinsäuremolekül in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidär” angegeben ist. Diese Nukleinsäuresequenz, die für ein Transitpeptid kodiert, garantiert den Transport des Proteins zu der jeweiligen Organelle, insbesondere dem Plastid. Die Nukleinsäuresequenz des zu exprimierenden Gens und die Nukleinsäuresequenz, die für das Transitpeptid kodiert, sind funktionsfähig verbunden. Daher wird das Transitpeptid in-frame an die Nukleinsäuresequenz fusioniert, die für ein YRP kodiert, z. B. ein Protein, wie in Tabelle II, Spalte 3 oder 5 dargestellt, und seine Homologe, wie in Tabelle I, Spalte 7 offenbart, z. B. wenn für das Nukleinsäuremolekül in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidär” angeführt ist.
Der Begriff ”Organelle” gemäß der Erfindung soll zum Beispiel ”Mitochondrien” oder ”Plastid” bedeuten. Der Begriff ”Plastid” gemäß der Erfindung soll verschiedene Formen von Plastiden beinhalten, einschließlich Proplastide, Chloroplasten, Chromoplasten, Gerontoplasten, Leukoplasten, Amyloplasten, Elaioplasten und Etioplasten, vorzugsweise Chloroplasten. Sie haben alle als einen gemeinsamen Vorfahren die oben genannten Proplasten.
Andere Transitpeptide sind von Schmidt et al. (J. Biol. Chem. 268 (36), 27447 (1993)), Della-Cioppa et al. (Plant. Physiol. 84, 965 (1987)), de Castro Silva Filho et al. (Plant Mol. Biol. 30, 769 (1996)), Zhao et al. (J. Biol. Chem. 270 (11), 6081 (1995)), Römer et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (3), 1414 (1993)), Keegstra et al. (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 471 (1989)), Lubben et al. (Photosynthesis Res. 17 angeführt, 173 (1988)) und Lawrence et al. (J. Biol. Chem. 272 (33), 20357 (1997)) offenbart. Ein allgemeiner Überblick über das Targeting ist von Kermode Allison R. in Critical Reviews in Plant Science 15 (4), 285 (1996) unter dem Titel "Mechanisms of Intracellular Protein Transport and Targeting in Plant Cells" offenbart.
Favorisierte Transitpeptidsequenzen, die in dem erfindungsgemäßen Prozess verwendet werden und Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bilden, sind im Allgemeinen mit hydroxylierten Aminosäureresten (Serin und Threonin) angereichert, wobei diese zwei Reste im Allgemeinen 20 bis 35% des Gesamten ausmachen. Sie haben häufig eine Amino-terminale Region, die frei von Gly, Pro und geladenen Resten ist. Ferner haben sie eine Anzahl kleiner hydrophober Aminosäuren wie Valin und Alanin und im Allgemeinen fehlen saure Aminosäure. Zusätzlich haben sie im Allgemeinen eine mittlere Region, die reich an Ser, Thr, Lys und Arg ist. Insgesamt haben sie häufig eine positive Nettoladung.
Als Alternative können Nukleinsäuresequenzen, die für die Transitpeptide kodieren, chemisch entweder teilweise oder vollständig auf die Struktur von Transitpeptidsequenzen synthetisiert werden, die nach dem Stand der Technik offenbart sind. Die natürlichen oder chemisch synthetisierten Sequenzen können direkt an die Sequenzen, die für das reife Protein kodieren, oder über eine Linker-Nukleinsäuresequenz gebunden werden, die für gewöhnlich weniger als 500 Basenpaare, vorzugsweise weniger als 450, 400, 350, 300, 250 oder 200 Basenpaare, insbesondere weniger als 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 oder 30 Basenpaare und ganz besonders weniger als 25, 20, 15, 12, 9, 6 oder 3 Basenpaare lang sein können und in-frame zu der Kodierungssequenz sind. Ferner können günstige Nukleinsäuresequenzen, die für Transitpeptide kodieren, Sequenzen umfassen, die von mehr als einer biologischen und/oder chemischen Quelle abgeleitet sind, und können eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die von der Amino-terminalen Region des reifen Proteins abgeleitet ist, die in ihrem nativen Zustand an das Transitpeptid gebunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Amino-terminale Region des reifen Proteins für gewöhnlich weniger als 150 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 140, 130, 120, 110, 100 oder 90 Aminosäuren, insbesondere weniger als 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25 oder 20 Aminosäuren und ganz besonders weniger als 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 oder 10 Aminosäuren lang. Aber selbst kürzere oder längere Spannen sind auch möglich. Zusätzlich können auch Targetsequenzen, die den Transport von Proteinen zu anderen Zellkompartimenten, wie Vakuole, endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Komplex, Glyoxysome, Peroxisome oder Mitochondrien, begünstigen, auch Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz sein.
Die Proteine, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen translatiert werden, sind eine Art von Fusionsproteinen, was bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenzen, die für das Transitpeptid kodieren, zum Beispiel jene, die in Tabelle V dargestellt sind, zum Beispiel die letzte der Tabelle, an ein YRP-Gen gebunden sind, z. B. die Nukleinsäuresequenzen, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt sind, z. B. wenn für das Nukleinsäuremolekül in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidär” angegeben ist. Der Fachmann kann die Sequenzen funktionsfähig verbinden. Vorteilhafterweise wird der Transitpeptidteil von dem YRP, z. B. von dem Proteinteil der in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, während des Transport abgespalten, vorzugsweise in die Plastide. Alle Spaltungsprodukte des bevorzugten Transitpeptids, dargestellt in der letzten Zeile von Tabelle V, haben vorzugsweise die N-terminalen Aminosäuresequenzen QIA CSS oder QIA EFQLTT vor dem anfänglichen Methionin von YRP, z. B. das Protein, das in Tabelle II, Spalte 5 und 7 erwähnt ist. Andere kurze Aminosäuresequenzen von einem Bereich von 1 bis 20 Aminosäuren, vorzugsweise 2 bis 15 Aminosäure, bevorzugter 3 bis 10 Aminosäuren, insbesondere 4 bis 8 Aminosäuren, sind auch vor dem anfänglichen Methionin des YRP möglich, z. B. des Proteins, das in Tabelle II, Spalte 5 und 7 erwähnt ist. Im Falle der Aminosäuresequenz QIA CSS stammen die drei Aminosäuren vor dem anfänglichen Methionin von der LIC (= Ligation Independent Cloning) Kassette. Die kurze Aminosäuresequenz ist im Falle der Expression von Escherichia coli Genen bevorzugt. Im Falle der Aminosäuresequenz QIA EFQLTT stammen die sechs Aminosäuren vor dem anfänglichen Methionin von der LIC Kassette. Die kurze Aminosäuresequenz ist im Falle der Expression von Saccharomyces cerevisiae Genen bevorzugt Der Fachmann weiß, dass andere kurze Sequenzen ebenso in der Expression der YRP Gene nützlich sind, z. B. der Gene, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 erwähnt sind. Ferner ist dem Fachmann die Tatsache bewusst, dass es keine Notwendigkeit für solch kurze Sequenzen in der Expression der Gene gibt. Tabelle V: Beispiele von Transitpeptiden, die Heijne et al. offenbart sind
Als Alternative zu dem Targeting des YRP, z. B. Proteine mit den Sequenzen, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt sind, vorzugsweise von Sequenzen, die im Allgemeinen im Kern mit Hilfe der Targeting-Sequenzen, die zum Beispiel in Tabelle V angeführt sind, alleine oder in Kombination mit anderen Targeting-Sequenzen vorzugsweise in die Plastide kodiert werden, können die Nukleinsäuren der Erfindung direkt in das plastidale Genom eingeführt werden, für das z. B. in Spalte 6 von Tabelle II der Begriff ”plastidär” angegeben ist. Daher werden in einer bevorzugten Ausführungsform das YRP Gen, z. B. die Nukleinsäuresequenzen, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt sind, direkt in Plastide eingeführt und exprimiert, insbesondere, wenn in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidär” angegeben ist.
Der Begriff ”eingeführt” im Zusammenhang mit dieser Beschreibung soll bedeuten, dass das Einsetzen einer Nukleinsäuresequenz in den Organismus mit Hilfe einer ”Transfektion”, Transduktion” oder vorzugsweise durch ”Transformation” erfolgt.
Ein Plastid, wie ein Chloroplast, wurde durch eine exogene (vorzugsweise fremde) Nukleinsäuresequenz ”transformiert”, als die Nukleinsäuresequenz in das Plastid eingeführt wurde, was bedeutet, dass diese Sequenz die Membran oder die Membrane des Plastids durchquert hat. Die Fremd-DNA kann in Plastid DNA integriert (kovalent gebunden) werden, die das Genom des Plastids bildet, oder kann nicht integriert bleiben (z. B. durch Einschließen eines Chloroplast-Replikationsursprungs). ”Stabil” integrierte DNA-Sequenzen sind jene, die durch Plastid Replikation vererbt werden, wodurch neue Plastide mit den Merkmalen der integrierten DNA-Sequenz zu der Nachkommenschaft transferiert werden.
Für die Expression ist ein Fachmann mit verschiedenen Methoden zur Einführung der Nukleinsäuresequenzen in verschiedene Organellen, wie die bevorzugten Plastide, vertraut. Solche Methoden sind zum Beispiel von Maiga P. (Annu. Rev. Plant Biol. 55, 289 (2004)), Evans T. ( WO 2004/040973 ), McBride K. E. et al. ( US 5,455,818 ), Daniell H. et al. ( US 5,932,479 und US 5,693,507 ) und Straub J. M. et al. ( US 6,781,033 ) offenbart. Eine bevorzugte Methode ist die Transformation von Mikrosporen-abgeleitetem Hypokotyl- oder kotyledonärem Gewebe (die grün sind und somit zahlreiche Plastide enthaften), Blattgewebe und anschließendes Regenerieren von Sprossen von dem transformierten Pflanzenmaterial auf selektivem Medium. Als Methoden für die Transformation sind das Bombardieren des Pflanzenmaterials oder die Verwendung von unabhängig replizierenden Shuttle-Vektoren dem Fachmann allgemein bekannt. Aber auch eine PEG-vermittelte Transformation der Plastide oder Agrobacterium Transformation mit binären Vektoren ist möglich. Nützliche Marker für die Transformation von Plastiden sind positive Selektionsmarker, zum Beispiel die Chloramphenicol-, Streptomycin-, Kanamycin-, Neomycin-, Amikamycin-, Spectinomycin-, Triazin- und/oder Lincomycin-Toleranzgene. Als zusätzliche Marker, die in der Literatur häufig als sekundäre Marker genannt sind, sind Gene, die für die Toleranz gegen Herbizide, wie Phosphinothricin (= Glufosinat, BASTA^TM, Liberty^TM, kodiert durch das BAR Gen), Glyphosate(= N-(Phosphonomethyl)glycin, Roundup^TM, kodiert durch das 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat Synthase Gen = epsps), Sulfonylharnstoffe (wie Staple^TM, kodiert durch das Acetolactat-Synthase (ALS) Gen), Imidazolinone [= IMI, wie Imazethapyr, Imazamox, Clearfield^TM, kodiert durch das Acetohydroxyacid-Synthase (AHAS) Gen, auch bekannt als Acetolactat-Synthase (ALS) Gen] oder Bromoxynil (= Buctril^TM, kodiert durch das oxy Gen) oder Gene, die für Antibiotika kodieren, wie Hygromycin oder G418, für eine weitere Selektion nützlich. Solche sekundären Marker sind nützlich, wenn die meisten Genomkopien transformiert werden. Zusätzlich sind auch negative Selektionsmarker, wie die bakterielle Cytosin-Deaminase (kodiert durch das codA Gen) für die Transformation von Plastiden nützlich.
Somit wird in einer Ausführungsform eine Aktivität, die laut vorliegender Offenbarung durch ein Polypeptid verliehen wird, das in Tabelle II dargestellt ist, durch Verbinden des Polypeptids, das in Tabelle II offenbart ist, oder eines Polypeptids, das dieselbe Aktivität verleiht, mit einem Targetingsignal, wie hierin beschrieben, erhöht oder erzeugt, wenn in Spalte 6 von Tabelle II der Begriff ”plastidär für das Polypeptid angeführt ist. Zum Beispiel kann das beschriebene Polypeptid an das Targetingsignal gebunden werden, das in Tabelle VII dargestellt ist.
Daher kodiert in dem Verfahren der Erfindung zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze, umfassend das Transformieren einer Pflanzenzelle oder eines Pflanzenzellkerns oder eines Pflanzengewebes mit dem genannten Nukleinsäuremolekül, das Nukleinsäuremolekül, das aus der genannten Gruppe ausgewählt ist, für ein Polypeptid, das die Aktivität verleiht, indem es an ein Targetingsignal gebunden ist, wie hierin erwähnt, z. B. wie in Tabelle VII erwähnt, z. B. wenn in Spalte 6 von Tabelle II der Begriff ”plastidär” für das kodierte Polypeptid angegeben ist.
Zur Erhöhung der Möglichkeit einer Identifizierung von Transformanden ist es auch wünschenswert, Reportergene zu verwenden die andere als die oben genannten Toleranzgene sind, oder zusätzlich zu den Genen. Reportergene sind zum Beispiel β-Galactosidase-, β-Glucuronidase-(GUS), alkalische Phosphatase- und/oder grün-fluoreszierende Protein-Gene (GFP).
Durch Transformieren der Plastide wird der spezifische Transgenfluss unter den Genen blockiert, da eine Reihe von Spezies, wie Mais, Baumwolle und Reis, eine streng mütterliche Vererbung von Plastiden aufweisen. Durch Anordnen des YRP Gens, z. B. der Gene, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 spezifiziert sind, z. B. wenn für das Nukleinsäuremolekül in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidär” angegeben ist, oder aktiver Fragmente davon in den Plastiden von Pflanzen, sind diese Gene nicht in den Pollen der Pflanzen vorhanden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von so genannten ”Chloroplast-Lokalisierungssequenzen”, in welchen eine erste RNA Sequenz oder ein Molekül imstande ist, eine zweite RNA Sequenz, wie eine RNA Sequenz, die von dem YRP Gen transkribiert wird, z. B. die Sequenzen, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt sind, oder ein Sequenz, die für ein YRP kodiert, z. B. das Protein, wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt, von einer Außenumwelt im Inneren einer Zelle oder außerhalb eines Plastids in einen Chloroplast zu transportieren bzw. zu ”begleiten”. In einer Ausführungsform ist das Chloroplast-Lokalisierungssignal im Wesentlichen gleich oder komplementär zu einer vollständigen oder intakten viroiden Sequenz, z. B. wenn für das Polypeptid in Spalte 6 von Tabelle II der Begriff ”plastidär” angegeben ist. Das Chloroplast-Lokalisierungssignal kann von einer DNA-Sequenz kodiert werden, die in die Chloroplast Lokalisierungs-RNA transkribiert ist. Der Begriff ”viroid” bezieht sich auf ein natürlich vorkommendes, einsträngiges RNA-Molekül (Flores, C. R. Acad Sci III. 324 (10), 943 (2001)). Viroide enthalten für gewöhnlich etwa 200–500 Nukleotide und liegen im Allgemeinen als kreisförmige Moleküle vor. Beispiele für Viroide, die Chloroplast-Lokalisierungssignale beinhalten, enthalten, ohne aber darauf beschränkt zu sein, ASBVd, PLMVd, CChMVd und ELVd. Die viroide Sequenz oder ein funktioneller Teil davon, kann an ein YRP Gen, z. B. die Sequenzen, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt sind, oder eine Sequenz, die für ein YRP kodiert, z. B. das Protein, wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt, in einer solchen Weise fusioniert werden, dass die viroide Sequenz eine Sequenz, die von einem YRP Gen transkribiert wird, z. B. die Sequenz, wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt, oder eine Sequenz, die für ein YRP kodiert, z. B. das Protein, wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt, in die Chloroplasten transportiert, z. B. wenn für das Nukleinsäuremolekül oder Polynukleotid in Spalte 6 von Tabelle I oder II der Begriff ”plastidär” angegeben ist. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet ein modifiziertes ASBVd (Navarro et al. Virology. 268 (1), 218 (2000)).
In einer weiteren spezifischen Ausführungsform wird das Protein, das in den Plastiden exprimiert werden soll, wie YRP, z. B. die Proteine, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt sind, z. B. wenn für das Polypeptid in Spalte 6 von Tabelle II der Begriff ”plastidär” angegeben ist, von verschiedenen Nukleinsäuren kodiert. Ein solches Verfahren ist in WO 2004/040973 offenbart, das hierin zum Zwecke der Bezugnahme zitiert werden soll. WO 2004/040973 lehrt ein Verfahren, das die Translokation einer RNA entsprechend einem Gen oder Genfragment in den Chloroplast mit Hilfe einer Chloroplast-Lokalisierungssequenz betrifft. Die Gene, die in der Pflanze oder den Pflanzenzellen exprimiert werden sollen, werden in Nukleinsäurefragmente geteilt, die in verschiedene Kompartimente in der Pflanze eingeführt werden, z. B. den Kern, die Plastide und/oder Mitochondrien. Zusätzlich sind Pflanzenzellen beschrieben, in welchen der Chloroplast ein Ribozym enthält, das an ein Ende an eine RNA fusioniert ist, die für ein Fragment eines Proteins kodiert, das in dem erfindungsgemäßen Prozess verwendet wird, so dass das Ribozym die translozierte Fusions-RNA an die RNA transspleißen kann, die für das zu bildende Genfragment kodiert, und ja nachdem, die Nukleinsäurefragmente wieder mit einer intakten mRNA vereinen kann, die für ein funktionelles Protein kodiert, wie zum Beispiel in Tabelle II, Spalte 5 und 7 offenbart.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden das YRP Gen, z. B. das Nukleinsäuremoleküle, wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt, z. B. wenn in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidär” angegeben ist, die in dem erfindungsgemäß Prozess verwendet werden, in Plastide transformiert, die metabolisch aktiv sind. Diese Plastide sollten vorzugsweise bei einer hohen Kopiezahl in der Pflanze oder dem Pflanzengewebe von Interesse gehalten werden, insbesondere den Chloroplasten, die in grünem Pflanzengewebe, wie Blättern oder Kotyledonen oder in Samen vorgefunden werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden das YRP Gen, z. B. die Nukleinsäuremoleküle, wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt, z. B. wenn in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”mitochondrisch” angegeben ist, die in dem erfindungsgemäßen Prozess verwendet werden, in Mitochondrien transformiert, die metabolisch aktiv sind.
Für eine gute Expression in den Plastiden werden das YRP Gen, z. B. die Nukleinsäuresequenzen, wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt, z. B. wenn in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidär” angegeben ist, in eine Expressionskassette eingeführt, vorzugsweise unter Verwendung eines Promotors und Terminators, die in Plastiden aktiv sind, vorzugsweise eines Chloroplastpromotors. Beispiele für solche Promotoren beinhalten den psbA Promotor von dem Gen von Spinat oder Erbse, den rbcL Promotor, und den atpB Promotor von Mais.
Gemäß der Erfindung betrifft der Begriff ”Pflanzenzelle” oder der Begriff ”Organismus” in der vorliegenden Bedeutung immer eine Pflanzenzelle oder eine Organelle davon, vorzugsweise ein Plastid, insbesondere einen Chloroplast.
Wie hierin verwendet, soll ”Pflanze” nicht nur eine ganze Pflanze, sondern auch einen Teil davon beinhalten, d. h., eine oder mehrere Zellen, und Gewebe, einschließlich zum Beispiel, Blätter, Stängel, Sprossen Wurzeln, Blüten, Früchte und Samen.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die transgene Expression des Saccharomyces cerevisiae, E. coli, Synechocystis oder A. thaliana YRP, z. B. wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, in einer Pflanze wie A. thaliana zum Beispiel, der transgenen Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, erhöhte Dürretoleranz, Niedertemperaturtoleranz und/oder ein anderes erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1703 dargestellt ist oder durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen) kodiert wird, das die Nukleinsäure umfasst, die in SEQ ID NR: 1702 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Glycin max, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1702 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1703 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Peptidy-prolyl-cis-trans-isomerase” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, erhöht oder erzeugt, wobei die Erhöhung insbesondere zytoplasmatisch erfolgt. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte. Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 1703 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1702 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Glycine max Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1702 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1703 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1702 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1703 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, wenn die Aktivität ”Peptidy-prolyl-cis-trans-isomerase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,844-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1773 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 1772 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Synechocystis sp., erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 dargestellt ist, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1772 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1773 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Geranylgeranyl-Reductase” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, und insbesondere ist die Erhöhung plastidär. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 1773 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1772 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1772 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1773 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1772 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1773 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist oder wenn die Aktivität ”Geranylgeranyl-Reductase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,480-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1773 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1772 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1772 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1773 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1772 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1773 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Geranylgeranyl-Reductase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,096-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1939 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 1938 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Synechocystis sp., erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 dargestellt ist, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1938 dargestellt ist bzw. des Polypeptids, das in SEQ ID NR: 1939, dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”slr1293-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist. wobei die Erhöhung insbesondere plastidär erfolgt. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 1939 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1938 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1938 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1939 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die. Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1938 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1939 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”slr1293-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,374-Fach, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1939 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1938 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1938 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1939 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1938 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1939 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”slr1293-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,084-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1939 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül das in SEQ ID NR: 1938 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptid, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1938 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1939 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1938 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1939 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”slr1293-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,088-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahrender Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2043 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 2042 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2042 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2043 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Mating Hormone A Faktor Vorläufer” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid wie in SEQ ID NR: 2043 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2042 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2042 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2043 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2042 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2043 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Mating Hormone A Faktor Vorläufer” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,503-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2043 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2042 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2042 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2043 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2042 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2043 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Mating Hormone A-Faktor Vorläufer” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,155-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2057 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 2056 dargestellt ist oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 dargestellt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2056 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2057 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Adenylate-Kinase” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung plastidär. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 2057 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2056 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2056 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2057 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2056 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2057 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Adenylate-Kinase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn die Polypeptid plastidär lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,370-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2057 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2056 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2056 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2057 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2056 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2057 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Adenylate-Kinase in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,142-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2559 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 2558 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2558 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2559 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Cyclische Nukleotid-Phosphodiesterase” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung plastidär. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid. wie in SEQ ID NR: 2559 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2558 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2558 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2559 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2558 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2559 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Cyclische Nukleotid-Phosphodiesterase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fache auf das 1,331-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2559 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2558 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2558 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2559 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2558 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2559 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Cyclische Nukleotid-Phosphodiesterase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert, ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,22-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2578 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 2577 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2577 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2578 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Exopolyphosphatase” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 2578 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2577 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2577 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid das in SEQ ID NR: 2578 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2577 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2578 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Exopolyphosphatase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,460-Fachen, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2610 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 2609 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2609 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2610 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”YJL181W-Protein” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 2610 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2609 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2609 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid das in SEQ ID NR: 2610 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2609 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2610 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”YJL181W-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,462-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2629 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 2628 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2628 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2629 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. in einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 2629 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2628 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2628 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2629 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2628 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2629 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem. Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,764-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2629 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2628 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2628 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2629 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2628 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2629 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,095-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2629 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2628 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2628 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2629 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2628 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2629 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,316-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2712 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 2711 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2711 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2712 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Proteinkinase” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 2712 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2711 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2711 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2712 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2711 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2712 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Proteinkinase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,575-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2712 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2711 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2711 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2712 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2711 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2712 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Proteinkinase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn die Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,1-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2712 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2711 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2711 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2712 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2711 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2712 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Proteinkinase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,161-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Myo-inositol Transporter” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung plastidär. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 2739 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptid, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Myo-inositol Transporter” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1.284-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Myo-inositol Transporter” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,437-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, oder das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Myo-inositol Transporter” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,313-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht. modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Dürretoleranz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte zyklierende Dürretoleranz verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2739 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Myo-inositol Transporter” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,772-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. unter abiotischen Stressbedingungen, z. B. unter Dürrebedingungen, insbesondere zyklierenden Dürrebedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform, ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid das in SEQ ID NR: 2819 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 2818 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2818 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2819 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Ribose-5-phosphate-Isomerase” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 2819 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2818 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2818 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2819 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2818 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2819 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Ribose-5-phosphat-Isomerase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,516-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2819 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2818 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2818 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2819 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 2818 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2819 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Ribose-5-phosphat-Isomerase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,234-Fachen, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3362 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 3361 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3361 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3362 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”YPL109C-Protein” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung plastidär. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 3362 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3361 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3361 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3362 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3361 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3362 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”YPL109C-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,310-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid das in SEQ ID NR: 3438 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 3437 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Escherichia coli, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3437 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3438 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Cystein-Synthase” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung plastidär. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 3438 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3437 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Escherichia coli Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3437 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3438 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3437 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3438 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Cystein-Synthase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,421-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3438 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3437 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Escherichia coli Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3437 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3438 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3437 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3438 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Cystein-Synthase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,211-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3438 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3437 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Escherichia coli Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3437 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3438 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 3437 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3438 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Cystein-Synthase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,204-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform, ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4404 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 4403 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Glycine max, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4403 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4404 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 4404 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4403 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Glycine max Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4403 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4404 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4403 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4404 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,844-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform, ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4474 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 4473 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Synechocystis sp., erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4473 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4474 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Geranylgeranyl-Reductase” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung plastidär. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 4474 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4473 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4473 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4474 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4473 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4474 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Geranylgeranyl-Reductase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,480-Fach, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4474 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4473 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4473 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4474 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4473 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4474 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Geranylgeranyl-Reductase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,096-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4640, dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 4639 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Synechocystis sp., erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4639 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4640 dargestellt ist, erhöht. oder erzeugt, oder die Aktivität ”slr1293-Protein” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung plastidär. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 4640 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4639 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4639 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4640 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4639 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4640 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”slr1293-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,374-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4640 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4639 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4639 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4640 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4639 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4640 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”slr1293-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,084-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4640 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4639 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4639 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4640 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4639 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4640 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”slr1293-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,088-Fachen, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids umfassend das ertragsbezogene Polypeptid das in SEQ ID NR: 4744 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 4743 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4743 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4744 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”YDR049W-Protein” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 4744 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4743 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4743 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4744 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4743 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4744 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”YDR049W-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,669-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4744 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4743 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4743 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4744 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4743 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4744 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”YDR049W-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn die Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,259-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4744 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4743 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4743 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4744 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 4743 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4744 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”YDR049W-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,166-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhte Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 64 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 63 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Escherichia coli, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 63 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 64 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Oxidoreductase Untereinheit” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 64 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 63 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Escherichia coli Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 63 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 64 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 63 da gestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 64 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Oxidoreductase Untereinheit” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,360-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 64 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 63 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Escherichia coli Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 63 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 64 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 63 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 64 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Oxidoreductase Untereinheit” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,112-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 64 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 63 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Escherichia coli Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 63 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 64 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 63 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 64 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Oxidoreductase Untereinheit” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,06-Fachen auf das 1,117-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 81 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 80 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Escherichia coli, erhöht oder erzeugt. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 80 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 81 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Cystein-Synthase” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung plastidär. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 81 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 80 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Escherichia coli Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 80 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 81 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremoleküls das in SEQ ID NR: 80 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid das in SEQ ID NR: 81 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Cystein-Synthase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,421-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 81 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 80 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Escherichia coli Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 80 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 81 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 80 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 81 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Cystein-Synthase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,211-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 81 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 80 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Escherichia coli Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 80 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 81 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 80 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 81 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Cystein-Synthase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,204-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid das in SEQ ID NR: 1077 dargestellt ist angeführt, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 1076 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Escherichia coli, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1076 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1077 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”B2758-Protein” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 1077 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1076 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Escherichia coli Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1076 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1077 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1076 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1077 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”B2758-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,324-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1077 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1076 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Escherichia coli Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1076 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1077 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1076 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1077 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”B2758-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,071-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1106 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 1105 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Synechocystis sp., erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1105 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1106 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”Protein der Modification Methylase HemK Familie” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 1106 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1105 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1105 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1106 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1105 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1106 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Protein der Modification Methylase HemK Familie” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,384-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1106 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1105 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1105 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1106 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1105 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1106 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Protein der Modification Methylase HemK Familie” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,259-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1106 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1105 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Synechocystis sp. Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1105 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1106 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1105 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1106 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”Protein der Modification Methylase HemK Familie” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,068-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1207 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 1206 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1206 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1207 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”YDR049W-Protein” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 1207 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1206 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1206 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1207 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1206 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1207 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”YDR049W-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,669-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Bedingungen von Niedertemperatur verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1207 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1206 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1206 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1207 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1206 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1207 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”YDR049W-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,259-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Bedingungen von Stickstoffmangel verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1207 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1206 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1206 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1207 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1206 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1207 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”YDR049W-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid zytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,166-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Daher wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze in dem Verfahren der Erfindung verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1246 dargestellt ist, oder kodiert ist durch das ertragsbezogene Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die Nukleinsäure, die in SEQ ID NR: 1245 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, erhöht oder erzeugt ist. Zum Beispiel ist die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1245 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1246 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität ”3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase” ist in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere erfolgt die Erhöhung plastidär. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanze verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, wie in SEQ ID NR: 1246 angeführt oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1245 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1245 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1246 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1245 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1246 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. Insbesondere wird eine Erhöhung das Ertrags vom 1,1-Fachen auf das 1,213-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze. In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verliehen, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1246 dargestellt ist, oder kodiert ist durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1245 dargestellt ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. wenn die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1245 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1246 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, z. B. wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 angeführt, in der jeweils selben Linie wie das Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NR: 1245 dargestellt ist, bzw. das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1246 dargestellt ist, erhöht oder erzeugt ist, oder wenn die Aktivität ”3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt ist, insbesondere, wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen, verliehen. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags vom 1,05-Fachen auf das 1,209-Fache, zum Beispiel plus mindestens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. ohne Nährstoffmangel wie auch Stressbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden, nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze.
Die oben angegebenen Verhältnisse beziehen sich auf einen erhöhten Ertrag, der tatsächlich als Erhöhung der Biomasse gemessen wurde, insbesondere als Frischgewicht-Biomasse von oberirdischen Teilen.
Für den Zweck der Erfindung, soll als Regel der Plural den Singular umfassen und umgekehrt.
Falls nicht anderes angegeben ist, sind die Begriffe ”Polynukleotide”, ”Nukleinsäure” und ”Nukleinsäuremolekül” im vorliegenden Zusammenhang untereinander austauschbar. Falls nicht anderes angegeben ist, sind die Begriffe ”Peptid”, ”Polypeptid” und ”Protein” im vorliegenden Zusammenhang untereinander austauschbar. Der Begriff ”Sequenz” kann sich auf Polynukleotide, Nukleinsäuren, Nukleinsäuremoleküle, Peptide, Polypeptide und Proteine beziehen, abhängig vom Zusammenhang, in dem der Begriff ”Sequenz” verwendet wird. Die Begriffe ”Gen(e)”, ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäuresequenz”, ”Nukleotidsequenz” oder ”Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine polymere Form von Nukleotiden beliebiger Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide. Die Begriffe beziehen sich nur auf die primäre Struktur des Moleküls.
Somit enthalten die Begriffe ”Gen(e)”, ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäuresequenz”, ”Nukleotidsequenz”, oder ”Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, doppel- und einsträngige DNA und/oder RNA. Sie beinhaften auch bekannte Arten von Modifizierungen, zum Beispiel, Methylierung, ”Kappen”, Substitutionen eines oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog. Vorzugsweise umfasst die DNA oder RNA Sequenz ein Kodierungssequenz, die für das hierin definiert Polypeptid kodiert.
Eine ”Kodierungssequenz” ist eine Nukleotidsequenz, die in eine RNA transkribiert ist, z. B. eine regulatorische RNA, wie eine miRNA, eine ta-siRNA, ein Co-Suppressionsmolekül, eine RNAi, ein Ribozym, usw. oder in eine mRNA, die in ein Polypeptid translatiert ist, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der Kodierungssequenz werden durch ein Translationsstartkodon am 5'-Terminus und ein Translationsstoppkodon am 3'-Terminus bestimmt. Eine Kodierungssequenz kann, ohne aber darauf beschränkt zu sein, mRNA, cDNA, rekombinante Nukleotidsequenzen oder genomische DNA enthalten, während auch Introns unter gewissen Umständen vorhanden sein können.
Wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet, kann ein Nukleinsäuremolekül auch die untranslatierte Sequenz umfassen, die sich am 3' und am 5' Ende der Kodierungsgenregion befindet, zum Beispiel mindestens 500, vorzugsweise 200, insbesondere 100, Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5' Endes der Kodierungsregion und mindestens 100, vorzugsweise 50, insbesondere 20, Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3' Endes der Kodierungsgenregion. Wenn zum Beispiel die Antisense, RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Co-Suppressionsmolekül, Ribozym usw. Technologie verwendet wird, können Kodierungsregionen wie auch die 5'- und/oder 3'-Regionen vorteilhaft verwendet werden.
Es ist jedoch häufig vorteilhaft, nur die Kodierungsregion für Klonierungs- und Expressionszwecke zu wählen.
”Polypeptid” bezieht sich auf ein Polymer von Aminosäure (Aminosäuresequenz) und bezieht sich, nicht auf eine spezifische Länge des Moleküls. Somit sind Peptide und Oligopeptide in der Definition von Polypeptid enthalten. Dieser Begriff bezieht sich auch auf post-translationale Modifizierungen des Polypeptids oder beinhaltet diese, zum Beispiel, Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen. In der Definition sind zum Beispiel Polypeptide enthaften, die eine oder mehrere Analog(e) einer Aminosäure enthalten (einschließlich zum Beispiel, unnatürliche Aminosäuren, usw.), Polypeptide mit geeigneten Verknüpfungen, wie auch andere Modifizierungen, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, die sowohl von Natur aus wie auch nicht von Natur aus vorkommen.
Der Begriff ”Tabelle I”, der in dieser Beschreibung verwendet wird, soll den Inhalt von Tabelle I A und Tabelle I B spezifizieren. Der Begriff ”Tabelle II” der in dieser Beschreibung verwendet wird, soll den Inhalt von Tabelle II A und Tabelle II B spezifizieren. Der Begriff ”Tabelle I A”, der in dieser Beschreibung verwendet wird, soll den Inhalt von Tabelle I A spezifizieren. Der Begriff ”Tabelle I B”, der in dieser Beschreibung verwendet wird, soll den Inhalt von Tabelle I B spezifizieren. Der Begriff ”Tabelle II A”, der in dieser Beschreibung verwendet wird, soll den Inhalt von Tabelle II A spezifizieren. Der Begriff ”Tabelle II B”, der in dieser Beschreibung verwendet wird, soll den Inhalt von Tabelle II B spezifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle I” Tabelle I B. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle II” Tabelle II B.
Die Begriffe ”umfassen” oder ”umfassend” und grammatikalische Variationen davon, wenn sie in dieser Beschreibung verwendet werden, sollen das Vorhandensein genannter Merkmale, ganzer Zahlen, Schritte oder Komponenten oder Gruppen davon spezifizieren, aber das Vorhandensein oder Hinzufügen eines/einer oder mehrerer anderer Merkmale, ganzer Zahlen, Schritte, Komponenten oder Gruppen davon nicht ausschließen.
Gemäß der Erfindung hat ein Protein oder Polypeptid die ”Aktivität eines YRP, z. B. eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt”, wenn seine de novo Aktivität, oder seine erhöhte Expression direkt oder indirekt zu einem erhöhten Ertrag führt oder diesen verleiht, z. B. zu einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel zu verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel erhöhter Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder erhöhter Nährstoffnutzungseffizienz, zu einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze, und das Protein hat die oben genannten Aktivitäten eines Proteins wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt. In der Beschreibung ist die Aktivität oder vorzugsweise die biologische Aktivität eines solchen Proteins oder Polypeptids oder eines Nukleinsäuremoleküls oder einer Sequenz, die für ein solches Protein oder Polypeptid kodiert, identisch oder gleich, wenn sie noch die biologische oder enzymatische Aktivität eines Proteins aufweist, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, oder hat mindestens 10% der ursprünglichen enzymatischen Aktivität, vorzugsweise 20%, 30%, 40%, 50%, insbesondere 60%, 70%, 80%, ganz besonders 90%, 95%, 98%, 99% im Vergleich zu einem Protein, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, von S. cerevisiae oder E. coli oder Synechocystis sp. oder A. thaliana. In einer anderen Ausführungsform hat die biologische oder enzymatische Aktivität eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, mindestens 101% der ursprünglichen enzymatischen Aktivität, vorzugsweise 110%, 120%, %, 150%, insbesondere 150%, 200%, 300% im Vergleich zu einem Protein, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, von S. cerevisiae oder E. coli oder Synechocystis sp. oder A. thaliana.
Die Begriffe ”erhöht”, ”gesteigert”, ”verlängert”, ”verstärkt”, ”verbessert” oder ”amplifiziert” beziehen sich auf eine entsprechende Änderung einer Eigenschaft in einer Pflanze, einem Organismus, einem Teil eines Organismus, wie einem Gewebe, Samen, einer Wurzel, einem Blatt, einer Blüte usw. oder in einer Zelle und sind untereinander austauschbar. Vorzugsweise ist die Gesamtaktivität in dem Volumen erhöht oder verstärkt, wenn die Erhöhung oder Verstärkung die Erhöhung oder Verstärkung einer Aktivität eines Genprodukts betrifft, unabhängig davon, ob die Menge des Genprodukts oder die spezifische Aktivität des Genprodukts oder beide erhöht oder verstärkt sind oder ob die Menge, Stabilität oder Translationswirksamkeit der Nukleinsäuresequenz oder des Gens, die/das für das Genprodukt kodiert, erhöht oder verstärkt ist.
Der Begriffe ”Erhöhung” bezieht sich auf eine entsprechende Änderung einer Eigenschaft eines Organismus, oder in einem Teil einer Pflanze, eines Organismus, wie einem Gewebe, Samen, einer Wurzel, einem Blatt, einer Blüte usw. oder in einer Zelle. Vorzugsweise ist die Gesamtaktivität indem Volumen erhöht oder verstärkt, wenn die Erhöhung die Erhöhung einer Aktivität eines Genprodukts betrifft, unabhängig davon, ob die Menge des Genprodukts oder die spezifische Aktivität des Genprodukts oder beide erhöht oder erzeugt sind, oder ob die Menge, Stabilität oder Translationswirksamkeit der Nukleinsäuresequenz oder des Gens, die/das für das Genprodukt kodiert, erhöht ist.
Unter ”Änderung einer Eigenschaft” wird verstanden, dass die Aktivität, der Expressionswert oder die Menge eines Genprodukts oder der Metabolitengehalt in einem spezifischen Volumen relativ zu einem entsprechenden Volumen einer Kontrolle, Referenz oder einem Wildtyp geändert ist, einschließlich der de novo Schaffung der Aktivität oder Expression.
Die Begriffe ”Erhöhung” beinhalten die Änderung der Eigenschaft in nur Teilen des Gegenstandes der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel kann die Modifizierung im Kompartiment einer Zelle vorliegen, wie einer Organelle, oder in einem Teil einer Pflanze, wie Gewebe, Samen, Wurzel, Blatt, Blüte, usw., die aber nicht nachweisbar ist, wenn das gesamte Subjekt, d. h. die vollständige Zelle oder Pflanze, getestet wird.
Daher bedeutet der Begriff ”Erhöhung”, dass die spezifische Aktivität eines Enzyms, wie auch die Menge einer Verbindung oder eines Metaboliten, z. B. eines Polypeptids, eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder einer kodierenden mRNA oder DNA, in einem Volumen erhöht sein kann.
Die Begriffe ”Wildtyp”, ”Kontrolle” oder ”Referenz” sind austauschbar und können eine Zelle oder ein Teil von Organismen sein, wie eine Organelle, wie ein Chloroplast oder ein Gewebe, oder ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, der bzw. die nicht gemäß dem hierin beschriebenen Prozess gemäß der Erfindung modifiziert oder behandelt wurde. Daher entspricht die Zelle oder ein Teil von Organismen, wie eine Organelle, wie ein Chloroplast oder ein Gewebe, oder ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, der/die als Wildtyp, Kontrolle oder Referenz verwendet wird, der Zelle, dem Organismus, der Pflanze oder dem Teil davon soweit wie möglich und ist in jeder anderen Eigenschaft, außer bei dem Ergebnis des Prozesses der Erfindung, mit dem Gegenstand der Erfindung so identisch wie möglich. Somit werden der Wildtyp, die Kontrolle oder die Referenz identisch oder soweit wie möglich identisch behandelt, was heißt, dass nur Zustände oder Eigenschaften anders sein können, die die Qualität der getesteten Eigenschaft nicht beeinflussen.
Vorzugsweise wird jeder Vergleich unter analogen Bedingungen ausgeführt. Der Begriff ”analoge Bedingungen” bedeutet, dass alle Bedingungen wie zum Beispiel Kultur- oder Züchtungsbedingungen, Erde, Nährstoff, Wassergehalt der Ende, Temperatur, Feuchte oder umgebende Luft oder Ende, Testbedingungen (wie Pufferzusammensetzung, Temperatur, Substrate, Pathogenstamm, Konzentrationen und dergleichen) zwischen den zu vergleichenden Experimenten identisch gehalten werden.
Die ”Referenz”, die ”Kontrolle” oder der ”Wildtyp” ist vorzugsweise ein Subjekt, z. B. eine Organelle, eine Zelle, eine Gewebe, ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, das nicht gemäß dem hierin beschriebenen Prozess der Erfindung modifiziert und behandelt wurde, und ist in jeder anderen Eigenschaft mit dem Gegenstand der Erfindung so identisch wie möglich. Die Referenz, die Kontrolle oder der Wildtyp ist in ihrem/seinem Genom, Transkriptom, Proteom oder Metabolom dem Subjekt der vorliegenden Erfindung so ähnlich wie möglich. Vorzugsweise betrifft der Begriff ”Referenz-” ”Kontrolle-” oder ”Wildtyp-”-Organelle, -Zelle, -Gewebe oder -Organismus, insbesondere Pflanze, eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus, insbesondere eine Pflanze, die/das mit der Organelle, der Zelle, dem Gewebe oder dem Organismus, insbesondere der Pflanze, der vorliegenden Erfindung oder einem Teil davon annähernd genetisch identisch ist, vorzugsweise 95%, bevorzugter sind 98%, noch bevorzugter sind 99,00%, insbesondere 99,10%, 99,30%, 99,50%, 99,70%, 99,90%, 99,99%, 99,999% oder mehr. Besonders bevorzugt ist die ”Referenz”, die ”Kontrolle”, oder der ”Wildtyp” ein Subjekt, z. B. eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe, ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, die/das mit dem Organismus, insbesondere der Pflanze, der Zelle, einem Gewebe oder einer Organelle gemäß dem Prozess der Erfindung genetisch identisch ist, außer dass die verantwortlichen oder Aktivität verleihenden Nukleinsäuremoleküle oder das von ihnen kodierte Genprodukt gemäß dem erfindungsgemäßen Prozess verbessert, manipuliert, ausgetauscht oder eingeführt sind.
Wenn eine Kontrolle, eine Referenz oder ein Wildtyp, die/der sich von dem Subjekt der vorliegenden Erfindung nur dadurch unterscheidet, dass sie/er nicht dem Prozess der Erfindung unterzogen wird, nicht bereitgestellt werden kann, kann eine Kontrolle, eine Referenz oder ein Wildtyp ein Organismus sein, in dem die Ursache für die Modulation einer Aktivität, die die verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress und/oder den erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon oder die Expression des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, wie hierin beschrieben, verleiht, zurück- oder ausgeschaltet wurde, z. B. durch Ausknocken der Expression des verantwortlichen Genprodukts, z. B. durch Antisense-Inhibition, durch Inaktivierung eines Aktivators oder Agonisten, durch Aktivierung eines Inhibitors oder Antagonisten, durch Inhibition durch Hinzufügen inhibitorischer Antikörper, durch Hinzufügen aktiver Verbindungen, wie z. B. Hormone, durch Einführen negativer dominanter Mutanten, usw. Eine Genproduktion kann zum Beispiel durch Einführen inaktivierender Punktmutationen ausgeknockt werden, was zu einer Inhibition der enzymatischen Aktivität oder einer Destabilisierung oder einer Inhibition der Fähigkeit führt, an Cofaktoren usw. zu binden.
Daher ist das bevorzugte Referenzsubjekt das Ausgangssubjekt des vorliegenden Prozesses der Erfindung. Vorzugsweise werden die Referenz und der Gegenstand der Erfindung nach einer Standardisierung und Normierung verglichen, z. B. mit der Menge an Gesamt-RNA, -DNA, oder -Protein oder Aktivität oder Expression von Referenzgenen, wie Housekeeping-Genen, wie Ubiquitin, Actin oder ribosomale Proteine.
Die Erhöhung oder Modulation gemäß dieser Erfindung kann konstitutiv sein, z. B. aufgrund einer stabilen permanenten transgenen Expression oder einer stabilen Mutation in dem entsprechenden endogenen Gen, das für das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodiert, oder einer Modulation der Expression oder des Verhaltens eines Gens, das die Expression des Polypeptids der Erfindung verleiht, oder transient, z. B. aufgrund einer transienten Transformation oder vorübergehenden Hinzufügung eines Modulators, wie eines Agonisten oder Antagonisten, oder induzierbar, z. B. nach der Transformation mit einem induzierbaren Konstrukt, das das Nukleinsäuremolekül der Erfindung unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors trägt, und Hinzufügen des Inducers, z. B. Tetracyclin oder, wie hierin in der Folge beschrieben.
Die Erhöhung der Aktivität der Polypeptidmengen in einer Zelle, einem Gewebe, einer Organelle, einem Organ oder einem Organismus, vorzugsweise einer Pflanze, oder einem Teil davon ist vorzugsweise auf mindestens 5%, vorzugsweise auf mindestens 20% oder mindestens auf 50%, insbesondere auf mindestens 70%, 80%, 90% oder mehr, ist ganz besonders auf mindestens 100%, 150% oder 200%, besonders bevorzugt auf mindestens 250% oder mehr im Vergleich zur Kontrolle, zur Referenz oder zum Wildtyp. In einer Ausführungsform bedeutet der Begriff Erhöhung die Erhöhung in Menge im Verhältnis zum Gewicht des Organismus oder eines Teils davon (w/w).
In einer Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Aktivität des Polypeptids in einer Organelle wie einem Plastid. In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Erhöhung in der Aktivität der Polypeptidmengen im Zytoplasma.
Die spezifische Aktivität eines Polypeptids, für das ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung oder das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, kann wie in den Beispielen beschrieben getestet werden. Insbesondere ist die Expression eines fraglichen Proteins in einer Zelle, z. B. einer Pflanzenzelle, im Vergleich zu einer Kontrolle eine leichter Test und kann wie nach dem Stand der Technik beschrieben durchgeführt werden.
Der Begriff ”Erhöhung” beinhaltet, dass eine Verbindung oder eine Aktivität, insbesondere eine Aktivität, in ein Zelle, das Zytoplasm oder ein subzellulläres Kompartiment oder eine Organelle de novo eingeführt wird oder dass die Verbindung oder die Aktivität, insbesondere eine Aktivität, zuvor nicht nachgewiesen wurden, mit anderen Worten ”erzeugt” ist.
Daher umfasst in der Folge der Begriff ”Erhöhen” auch den Begriff ”Erzeugen” oder ”Stimulieren”. Die erhöhte Aktivität manifestiert sich in einem erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel in einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten ertragsbezogenen Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon.
Die Sequenz von GM02LC13512 von Glycine max, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle 1 dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1998) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Ihre Aktivität ist als Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit: erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase” von Glycine max verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das GM02LC13512 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das GM02LC13512, z. B. zytoplasmatisch; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das GM02LC13512 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das GM02LC13512, z. B. zytoplasmatisch. In einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität in dem Prozess der Erfindung erhöht werden soll und das das Genprodukt mit einer Aktivität ist, die als ”Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase” beschrieben ist, zytoplasmatisch erhöht oder erzeugt.

Die Sequenz von SLL1091 von Synechocystis sp., z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Geranylgeranyl-Reductase beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Geranylgeranyl-Reductase” von Synechocystis sp. verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLL1091 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLL1091, z. B. plastidär; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLL1091 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLL1091, z. B. plastidär.

Die Sequenz von SLR1293 von Synechocystis sp., z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als slr1293-Protein beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”slr1293-Protein” von Synechocystis sp. verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLR1293 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLR1293, z. B. plastidär; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLR1293 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLR1293, z. B. plastidär.

Die Sequenz von YDR461W von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Mating Hormone A-Faktor Vorläufer beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Mating Hormone A-Faktor Vorläufer” von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YDR461W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YDR461W z. B. zytoplasmatisch; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YDR461W, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YDR461W, z. B. plastidär.

Die Sequenz von YER170W von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Adenylat-Kinase beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Adenylat-Kinase von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YER170W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YER170W, z. B. plastidär; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YER170W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YER170W, z. B. plastidär.

Die Sequenz von YGR247W von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et. al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Cyclische Nukleotid-Phosphodiesterase beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Cyclische Nukleotid-Phosphodiesterase” von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YGR247W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YGR247W, z. B. plastidär, oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YGR247W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YGR247W, z. B. plastidär.

Die Sequenz von YHR201C von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Exopolyphosphatase beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Exopolyphosphatase” von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YHR201C oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YHR201C, z. B. zytoplasmatisch; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YHR201C oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YHR201C, z. B. zytoplasmatisch.

Die Sequenz von YJL181W von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als YJL181W-Protein beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”YJL181W-Protein” von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YJL181W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YJL181W, z. B. zytoplasmatisch; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YJL181W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YJL181W, z. B. zytoplasmatisch.

Die Sequenz von YJR095W von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter” von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YJR095W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YJR095W, z. B. zytoplasmatisch; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YJR095W oder ein funktionelles

Die Sequenz von YNR047W von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Proteinkinase beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Proteinkinase” von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YNR047W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YNR047W, z. B. zytoplasmatisch; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YNR047W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YNR047W, z. B. zytoplasmatisch.

Die Sequenz von YOL103W von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Myo-inositol Transporter beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Myo-inositol Transporter” von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YOL103W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YOL103W, z. B., plastidär, oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YOL103W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YOL103W, z. B. plastidär.

Die Sequenz von YOR095C von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Ribose-5-phosphat-Isomerase beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Ribose-5-phosphat-Isomerase” von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YOR095C oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YOR095C, z. B. zytoplasmatisch; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YOR095C oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YOR095C, z. B. zytoplasmatisch.

Die Sequenz von YPL109C von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als YPL109C-Protein beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”YPL109C-Protein” von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YPL109C oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YPL109C, z. B. plastidär, oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YPL109C oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YPL109C, z. B. plastidär.

Die Sequenz von B2414_2 von Escherichia coli, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Cystein-Synthase beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Cystein-Synthase” von Escherichia coli verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B2414_2 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B2414_2, z. B. plastidär, oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B2414_2 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B2414_2, z. B. plastidär.

Die Sequenz von GM02LC13512_2 von Glycine max, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase” von Glycine max verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das GM02LC13512_2 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das GM02LC13512_2, z. B. zytoplasmatisch; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das GM02LC13512_2 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das GM02LC13512_2, z. B. zytoplasmatisch.

Die Sequenz von SLL1091_2 von Synechocystis sp., z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Geranylgeranyl-Reductase beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Geranylgeranyl-Reductase” von Synechocystis sp. verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLL1091_2 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLL1091_2, z. B. plastidär, oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLL1091_2 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLL1091_2, z. B. plastidär.

Die Sequenz von SLR1293_2 von Synechocystis sp., z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als slr1293-Protein beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”slr1293-Protein” von Synechocystis sp. verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLR1293_2 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLR1293_2, z. B. plastidär; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLR1293_2 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLR1293_2, z. B. plastidär.

Die Sequenz von YDR049W_2 von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274(5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277(5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als YDR049W-Protein beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität YDR049W-Protein von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YDR049W_2 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YDR049W_2, z. B. zytoplasmatisch; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YDR049W_2 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YDR049W_2, z. B. zytoplasmatisch.

Die Sequenz von B1670 von Escherichia coli, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Oxidoreductase Untereinheit beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Oxidoreductase Untereinheit” von Escherichia coli verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B1670 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B1670, z. B. zytoplasmatisch; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B1670 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B1670, z. B. zytoplasmatisch.

Die Sequenz von B2414 von Escherichia coli, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Cystein-Synthase beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Cystein-Synthase” von Escherichia coli verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B2414 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B2414, z. B. plastidär, oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das 62414 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B2414, z. B. plastidär.

Die Sequenz von B2758 von Escherichia coli, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als B2758-Protein beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”B2758-Protein” von Escherichia coli verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B2758 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B2758, z. B. zytoplasmatisch oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B2758 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das B2758, z. B. zytoplasmatisch.

Die Sequenz von SLL1237 von Synechocystis sp., z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veroffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als Protein der Modification Methylase HemK Familie beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”Protein der Modification Methylase HemK Familie” von Synechocystis sp. verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLL1237 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLL1237 angeführt, z. B. zytoplasmatisch; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II, oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLL1237 oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das SLL1237, z. B. zytoplasmatisch.

Die Sequenz von YDR049W von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als YDR049W-Protein beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”YDR049W-Protein” von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YDR049W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YDR049W, z. B. zytoplasmatisch; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Sparte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YDR049W oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YDR049W, z. B. zytoplasmatisch.

Die Sequenz von YIL074C von Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, ist veröffentlicht: Sequenzen von S. cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen von E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Die Aktivität ist als 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase beschrieben. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Prozess der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität ”3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase” von Saccharomyces cerevisiae verleiht, oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YIL074C oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YIL074C, z. B. plastidär; oder
(b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YIL074C oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon, wie Spalte 7 von Tabelle II dargestellt, vorzugsweise ein Homolog oder ein funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B dargestellt, und in der jeweils selben Linie dargestellt, wie das YIL074C, z. B. plastidär.

Insbesondere wurde beobachtet, dass bei A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül wie in SEQ ID NR: 1702 umfasst, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass ein Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1702 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz im Vergleich zu der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1702 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül wie in SEQ ID NR: 1772 umfasst, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Geranylgeranyl-Reductase”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Geranylgeranyl-Reductase” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1772 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1772 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. plastidär in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Geranylgeranyl-Reductase”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül wie in SEQ ID NR: 1938 umfasst, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”slr1293-Proteins”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines ”slr1293-Proteins” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1938 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1938 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. plastidär in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”slr1293-Proteins”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 2042 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”Mating Hormone A Faktor Vorläufers”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines ”Mating Hormone A-Faktor Vorläufers” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2042 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2042 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines Mating Hormone A-Faktor Vorläufers”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 2056 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Adenylat-Kinase”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Adenylat-Kinase” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2056 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2056 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. plastidär in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Adenylat-Kinase”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 2558 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Cyclischen Nukleotid-Phosphodiesterase”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Cyclischen Nukleotid-Phosphodiesterase” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2558 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2558 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. plastidär in A thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Cyclische Nukleotid-Phosphodiesterase”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 2577 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Exopolyphosphatase”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Exopolyphosphatase” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2577 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2577 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Exopolyphosphatase”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 2609 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”YJL181W-Proteins”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines ”YJL181W-Proteins” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2609 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2609 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”YJL181W-Proteins”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 2628 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporters”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines ”Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporters” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2628 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert Wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2628 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporters”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 2711 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Proteinkinase”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Proteinkinase” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2711 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2711 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Proteinkinase”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 2738 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”Myoinositol Transporters”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines ”Myo-inositol Transporters” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2738 in A. thaliana conferred umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2738 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. plastidär in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”Myoinositol Transporters”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 2818 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Ribose-5-phosphat-Isomerase”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Ribose-5-phosphat-Isomerase” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz. SEQ ID NR: 2818 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 2818 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Ribose-5-phosphat-Isomerase”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 3361 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”YPL109C-Proteins”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines YPL109C-Proteins” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 3361 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 3361 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. plastidär in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”YPL109C-Proteins”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 3437 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Cystein-Synthase”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Cystein-Synthase” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 3437 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 3437 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. plastidär in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Cystein-Synthase”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 4403 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 4403 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 4403 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 4473 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Geranylgeranyl-Reductase”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Geranylgeranyl-Reductase” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 4473 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 4473 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. plastidär in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Geranylgeranyl-Reductase”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 4639 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”slr1293-Proteins”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines ”slr1293-Proteins” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 4639 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 4639 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. plastidär in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”slr1293-Proteins”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 4743 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”YDR049W-Proteins”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines ”YDR049W-Proteins” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 4743 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 4743 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”YDR049W-Proteins”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 63 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Oxidoreductase Untereinheit”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Oxidoreductase Untereinheit” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 63 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 63 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Oxidoreductase Untereinheit”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 80 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Cystein-Synthase”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”Cystein-Synthase” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 80 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 80 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. plastidär in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”Cystein-Synthase”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 1076 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”B2758-Proteins”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines ”B2758-Proteins” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1076 in A thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1076 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”B2758-Proteins”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 1105 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”Proteins der Modification Methylase HemK Familie”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines ”Proteins der Modification Methylase HemK Familie” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1105 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1105 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”Proteins der Modification Methylase HemK Familie”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 1206 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”YDR049W-Proteins”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines YDR049W-Proteins” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1206 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1206 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. zytoplasmatisch in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines ”YDR049W-Proteins”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in SEQ ID NR: 1245 dargestellt ist, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase”, einen erhöhten Ertrag verlieh, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer ”3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase” und das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1245 in A. thaliana umfasst, eine Toleranz gegen abiotischen Umweltstress verlieh, z. B. eine Erhöhung der Niedertemperaturtoleranz verglichen mit der Wildtypkontrolle. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das durch ein Gen kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 1245 umfasst, die wie in Tabelle I, Spalte 6 angeführt lokalisiert ist, z. B. plastidär in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität einer ”3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase”, eine Niedertemperaturtoleranz verlieh.
Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines YRP Gens, das in Tabelle Villa dargestellt ist, z. B. eines Nukleinsäuremoleküls abgeleitet von dem Nukleinsäuremolekül, das in Tabelle Villa dargestellt ist, in A. thaliana, eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz verlieh, z. B. eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz, verglichen mit der Wildtypkontrolle. Somit wird in einer Ausführungsform ein Nukleinsäuremolekül, das in Tabelle Villa angeführt ist, oder sein Homolog, wie in Tabelle I angeführt, oder das Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz verwendet, z. B. zur Erhöhung der Stickstoffnutzungseffizienz, einer Pflanze verglichen mit der Wildtypkontrolle.
Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines YRP Gens das in Tabelle VIIIb dargestellt ist, z. B. eines Nukleinsäuremoleküls, das von dem Nukleinsäuremolekül abgeleitet ist, das in Tabelle VIIIb dargestellt ist, in A. thaliana eine erhöhte Stresstoleranz verlieh, z. B. erhöhte Niedertemperaturtoleranz, verglichen mit der Wildtypkontrolle. Somit wird in einer Ausführungsform ein Nukleinsäuremolekül, das in Tabelle VIIIb angeführt ist, oder sein Homolog, wie in Tabelle I angeführt, oder das Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung der Stresstoleranz verwendet, z. B. zur Erhöhung der Niedertemperatur einer Pflanze verglichen mit der Wildtypkontrolle. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines YRP Gens, das in Tabelle VIIIc dargestellt ist, z. B. eines Nukleinsäuremoleküls, das von dem Nukleinsäuremolekül abgeleitet ist, das in Tabelle VIIIc dargestellt ist, in A. thaliana eine erhöhte Stresstoleranz verlieh, z. B. erhöhte zyklierende Dürretoleranz, verglichen mit der Wildtypkontrolle. Somit wird in einer Ausführungsform ein Nukleinsäuremolekül, das in Tabelle VIIIc angeführt ist, oder sein Homolog, wie in Tabelle I angeführt, oder das Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung der Stresstoleranz verwendet, z. B. zur Erhöhung der zyklierenden Dürretoleranz, einer Pflanze verglichen mit der Wildtypkontrolle. Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines YRP Gens, das in Tabelle VIIId dargestellt ist, z. B. eines Nukleinsäuremoleküls, das von dem Nukleinsäuremolekül abgeleitet ist, das in Tabelle VIIId dargestellt ist, in A. thaliana, eine Erhöhung des intrinsischen Ertrags verlieh, z. B. eine erhöhte Biomasse unter Standardbedingungen, z. B. eine erhöhte Biomasse unter mangellosen oder stressfreien Bedingungen, verglichen mit der Wildtypkontrolle. Somit wird in einer Ausführungsform ein Nukleinsäuremolekül, das in Tabelle VIIId angeführt ist, oder sein Homolog, wie in Tabelle I angeführt, oder das Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung des intrinsischen Ertrags einer Pflanze verglichen mit der Wildtypkontrolle verwendet, z. B. zur Erhöhung des Ertrags einer Pflanze unter Standardbedingungen, z. B. zur Erhöhung der Biomasse unter mangellosen oder stressfreien Bedingungen, verglichen mit der Wildtypkontrolle.
Der Begriff ”Expression” bezieht sich auf die Transkription und/oder Translation eines codogenen Gensegments oder Gens. In der Regel ist das erhaltene Produkt eine mRNA oder ein Protein. Expressionsprodukte können jedoch auch funktionelle RNAs enthalten, wie zum Beispiel, Antisense, Nukleinsäuren, tRNAs, snRNAs, rRNAs, RNAi, siRNA, Ribozyme usw. Die Expression kann systemisch, lokal oder zeitlich sein, zum Beispiel auf gewisse Zellarten, Gewebeorgane oder Organellen oder Zeitperioden begrenzt sein.
In einer Ausführungsform umfasst der Prozess der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere der folgenden Schritte: (a) Stabilisieren eines Proteins, das die erhöhte Expression eines YRP verleiht, z. B. eines Proteins, das durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das Polypeptid der Erfindung kodiert wird, mit der hierin genannten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein, und YPL109C-Protein, und einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon; (b) Stabilisieren einer mRNA, die die erhöhte Expression eines YRP verleiht, z. B. eines Proteins, das durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder seine Homologe kodiert wird, oder einer mRNA, die für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, mit der hierin genannten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den unter (a) erwähnten Aktivitäten, und einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon; (c) Erhöhen der spezifischen Aktivität eines Proteins, das die erhöhte Expression eines YRP verleiht, z. B. eines Proteins, das durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert wird, oder Senken der inhibitorischen Regulierung des Polypeptids der Erfindung; (d) Erzeugen oder Erhöhen der Expression eines endogenen oder künstlichen Transkriptionsfaktors, der die Expression eines Proteins vermittelt, das die erhöhte Expression eines YRP verleiht, z. B. eines Proteins, das durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert wird, mit der hierin genannten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den unter (a) erwähnten Aktivitäten, und einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon; (e) Stimulieren der Aktivität eines Proteins, das die erhöhte Expression eines YRP verleiht, z. B. eines Proteins, das durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert wird, mit der hierin genannten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den unter (a) erwähnten Aktivitäten, und einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon durch Hinzufügen eines oder mehrerer exogener induzierender Faktoren zu dem Organismus oder Teilen davon; (f) Exprimieren eines transgenen Gens, das für ein Protein kodiert, das die erhöhte Expression eines YRP verleiht, z. B. eines Proteins, das durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert wird, mit der hierin genannten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den unter (a) erwähnten Aktivitäten, und einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon; und/oder (g) Erhöhen der Kopienzahl eines Gens, das die erhöhte Expression eines Nukleinsäuremoleküls verleiht, das für ein YRP kodiert, z. B. ein Polypeptid, das durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das Polypeptid der Erfindung kodiert wird, mit der hierin genannten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den unter (a) erwähnten Aktivitäten, und einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon; (h) Erhöhen der Expression des endogenen Gens, das für ein YRP kodiert, z. B. ein Polypeptid der Erfindung oder dessen Homologe, durch Hinzufügen positiver Expressions- oder Entfernen negativer Expressionselemente, z. B. kann eine homologe Rekombination verwendet werden, um entweder positive regulatorische Elemente einzuführen, wie für Pflanzen den 35S Enhancer in den Promotor, oder um Repressorelemente aus regulatorischen Regionen zu entfernen. Ferner können Genkonversionsmethoden verwendet werden, um die Repressorelemente aufzubrechen oder die Aktivität positiver Elements zu verstärken – positive Elemente können regellos in Pflanzen durch T-DNA oder Transposon-Mutagenese eingeführt werden, und Linien können identifiziert werden, in welchen die positiven Elemente nahe einem Gen der Erfindung integriert sind, dessen Expression dadurch verstärkt wird; und/oder (i) Modulieren der Wachstumsbedingungen der Pflanze in derartiger Weise, dass die Expression oder Aktivität des Gens, das für das YRP kodiert, z. B. ein Proteins der Erfindung, oder des Proteins selbst verstärkt ist; (j) Selektieren von Organismen mit besonders hoher Aktivität der Proteine der Erfindung aus natürlichen oder mutagenisierten Ressourcen und deren Vermehrung zu den Zielorganismen, z. B. den Elitenutzpflanzen.
Vorzugsweise wird die mRNA durch das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung und/oder das Protein kodiert, die bzw. das die erhöhte Expression eines Proteins verleiht, das durch das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung alleine oder gebunden an eine Transit-Nukleinsäuresequenz oder ein Transitpeptid kodiert wird, das für die Nukleinsäuresequenz oder das Polypeptid mit der hierin genannten Aktivität kodiert, die z. B. einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon nach dem Erhöhen der Expression oder Aktivität des kodierten Polypeptids, oder mit der Aktivität eines Polypeptids, das eine Aktivität wie das Protein aufweist, wie in Tabelle II Spalte 3 dargestellt, oder seiner Homologe.
Im Allgemeinen korreliert die Menge von mRNA oder Polypeptid in einer Zelle oder einem Kompartiment eines Organismus mit der Menge an kodiertem Protein und somit mit der Gesamtaktivität des kodierten Proteins in dem Volumen. Diese Korrelation ist nicht immer linear, da die Aktivität in dem Volumen von der Stabilität der Moleküle oder dem Vorhandensein aktivierenden oder inhibitierender Co-Faktoren abhängig ist. Ferner sind Produkt- und Eduktinhibitionen von Enzymen allgemein bekannt und in Lehrbüchern beschrieben, z. B. Stryer, Biochemistry.
Im Allgemeinen korreliert die Menge von mRNA, Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül in einer Zelle oder einem Kompartiment eines Organismus mit der Menge an kodiertem Protein und somit mit der Gesamtaktivität des kodierten Proteins in dem Volumen. Diese Korrelation ist nicht immer linear, da die Aktivität in dem Volumen von der Stabilität der Moleküle, der Degradierung der Moleküle oder dem Vorhandensein aktivierenden oder inhibitierender Co-Faktoren abhängig ist. Ferner sind Produkt- und Eduktinhibitionen von Enzymen allgemein bekannt, z. B. Zinser et al. ”Enzyminhibitoren”/Enzyme inhibitors”.
Die Aktivität der oben genannten Proteine und/oder Polypeptide, die durch das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kodiert werden, kann auf verschiedene Weisen erhöht werden. Zum Beispiel wird die Aktivität in einem Organismus oder in einem Teil davon, wie einer Zelle, durch Erhöhen der Genproduktzahl, z. B. durch Erhöhen der Expressionsrate erhöht, wie Einleiten eines starken Promotors, oder durch Erhöhen der Stabilität der exprimierten mRNA und somit Erhöhen der Translationsrate, und/oder Erhöhen der Stabilität des Genprodukts, wodurch die schwachen Proteine verringert werden. Ferner kann die Aktivität oder der Umsatz von Enzymen derart beeinflusst werden, dass eine Verringerung oder Erhöhung der Reaktionsrate oder eine Modifizierung (Verringerung oder Erhöhung) der Affinität zu den Substratergebnissen erreicht wird. Eine Mutation im katalytischen Zentrum eines Polypeptids der Erfindung, z. B. als Enzym, kann die Umsatzrate des Enzyms modulieren, z. B. kann ein Knock-out einer essenziellen Aminosäure zu einer verringerten oder vollständig ausgeknockten Aktivität des Enzyms führen, oder die Depletion oder Mutation von Regulatorbindungsstellen kann eine negative Regulierung, wie eine Feedback-Inhibition (oder eine Substratinhibition, wenn auch der Substratpegel erhöht ist) verringern. Die spezifische Aktivität eines Enzyms der vorliegenden Erfindung kann erhöht sein, so dass die Umsatzrate erhöht ist oder die Bindung eines Co-Faktors verbessert ist. Eine Verbesserung der Stabilität der kodierenden mRNA oder des Proteins kann auch die Aktivität eines Genprodukts erhöhen. Die Stimulierung der Aktivität fällt auch unter den Umfang des Begriffs ”erhöhte Aktivität”.
Ferner kann die Regulierung der oben genannten Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, so dass die Genexpression erhöht ist. Dies kann vorteilhaft mit Hilfe heterologer regulatorischer Sequenzen erreicht werden oder durch Modifizieren, zum Beispiel Mutieren, der vorhandenen, natürlichen regulatorischen Sequenzen. Die vorteilhaften Methoden können auch miteinander kombiniert werden.
Im Allgemeinen kann eine Aktivität eines Genprodukts in einem Organismus oder Teil davon, insbesondere in einer Pflanzenzelle oder Organelle einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Pflanzengewebes oder eines Teil davon oder in einem Mikroorganismus durch Erhöhen der Menge der spezifischen kodierenden mRNA oder des entsprechenden Proteins in dem Organismus oder einem Teil davon erhöht werden. ”Menge von Protein oder mRNA” soll die Molekülanzahl von Polypeptiden oder mRNA-Molekülen in einem Organismus bezeichnen, insbesondere einer Pflanze, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellekompartiment. ”Erhöhung” in der Menge eines Proteins bedeutet die quantitative Erhöhung der Molekülanzahl des Proteins in einem Organismus, insbesondere einer Pflanze, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment, wie in einer Organelle, wie in einem Plastid oder Mitochondrien oder einem Teil davon – zum Beispiel durch eine der hierin in der Folge beschriebenen Methoden – im Vergleich zu einem Wildtyp, einer Kontrolle oder Referenz.
Die Erhöhung in der Molekülanzahl beträgt vorzugsweise mindestens 1%, vorzugsweise mehr als 10%, insbesondere 30% oder mehr, ganz besonders 50%, 70% oder mehr, noch bevorzugter 100%, ganz bevorzugt 500% oder mehr. Eine de novo Expression wird jedoch auch als Gegenstand der vorliegenden Erfindung angesehen.
Eine Modifizierung, d. h. eine Erhöhung, kann durch endogene oder exogene Faktoren verursacht sein. Zum Beispiel kann eine Erhöhung der Aktivität in einem Organismus oder einem Teil davon durch Hinzufügen eines Genprodukts oder eines Vorläufers oder eines Aktivators oder eines Agonisten zu den Medien oder Nährsubstanzen verursacht werden, oder kann durch transientes oder stabiles Einführen der Subjekte in einen Organismus verursacht werden. Ferner kann eine solche Erhöhung durch Einführen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder des kodierten Proteins in das korrekte Zellkompartiment verursacht werden, zum Beispiel in den Kern bzw. in das Zytoplasma oder in Plastide, entweder durch Transformation und/oder Targeting.
Für den Zweck der Beschreibung der vorliegenden Erfindung soll der Begriff ”zytoplasmatisch” angeben, dass die Nukleinsäure der Erfindung ohne Hinzufügen einer nicht natürlichen Transitpeptid Kodierungssequenz exprimiert wird. Eine nicht natürliche, transiente Peptidkodierungssequenz ist eine Sequenz, die nicht ein natürlicher Teil einer Nukleinsäure der Erfindung ist, sondern vielmehr durch molekulare Manipulationsschritte hinzugefügt wird, wie zum Beispiel indem Beispiel unter ”Plastid-zielgerichtete Expression” beschrieben. Daher soll der Begriff ”zytoplasmatisch” eine zielgerichtete Lokalisierung an einem beliebigen Zellkompartiment für die Produkte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen aufgrund ihrer natürlich vorkommenden Sequenzeigenschaften nicht ausschließen.
In einer Ausführungsform wird der erhöhte Ertrag, z. B. das erhöhte ertragsbezogene Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, ein erhöhter intrinsischer Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle in der Pflanze oder einem Teil davon, z. B. in einer Zelle, einem Gewebe, einem Organ, einer Organelle, dem Zytoplasma usw., durch Erhöhen des endogenen Spiegels des Polypeptids der Erfindung erreicht. Daher betrifft in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die vorliegende Erfindung einen Prozess, in dem die Genkopiezahl eines Gens, das für das Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül der Erfindung kopiert, erhöht ist. Ferner kann der endogene Spiegel des Polypeptids der Erfindung zum Beispiel durch Modifizieren der transkriptionalen oder translationalen Regulierung des Polypeptids erhöht werden.
In einer Ausführungsform kann der erhöhte Ertrag, z. B. das erhöhte ertragsbezogene Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, ein erhöhter intrinsischer Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal der Pflanze oder eines Teils davon durch zielgerichtete oder regellose Mutagenese der endogenen Gene der Erfindung verändert werden. Zum Beispiel kann eine homologe Rekombination verwendet werden, um entweder positive regulatorische Elemente, wie für Pflanzen den 35S Enhancer, in den Promotor einzuführen, oder um Repressorelemente aus regulatorischen Regionen zu entfernen. Zusätzlich kann eine Genkonversion, wie Methoden, die von Kochevenko und Willmitzer (Plant Physiol. 132 (1), 174 (2003)) und in den darin angeführten Zitate beschrieben sind, zum Aufbrechen von Repressorelementen oder zur Verstärkung der Aktivität positiver regulatorischer Elemente verwendet werden.
Ferner können positive Elemente regellos in (Pflanzen) Genome durch T-DNA oder Transposonmutagenese eingeführt werden und die Linien können gescreent werden, in welchen die positiven Elemente nahe einem Gen der Erfindung integriert wurden, dessen Expression dadurch verstärkt wird. Die Aktivierung von Pflanzengenen durch regellose Integrationen von Enhancer-Elementen wurde von Hayashi et al. (Science 258,1350 (1992)) oder Weigel et al. (Plant Physiol. 122, 1003 (2000)) und anderen darin zitierten beschrieben.
Reverse genetische Strategien zur Identifizierung von Insertionen (die schließlich die Aktivierungselemente tragen) nahe der Gene von Interesse wurden für verschiedene Fälle beschrieben, z. B. Krysan et al. (Plant Cell 11, 2283 (1999)); Session et al. (Plant Cell 14, 2985 (2002)); Young et al. (Plant Physiol. 125, 513 (2001)); Koprek et al. (Plant J. 24, 253 (2000)); Jeon et al. (Plant J. 22, 561 (2000)); Tissier et al. (Plant Cell 11, 1841 (1999)); Speulmann et al. (Plant Cell 11, 1853 (1999)). Kurz gesagt, Material von allen Pflanzen einer großen T-DNA oder Transposon mutagenisierten Pflanzenpopulation wird geerntet und genomische DNA hergestellt. Dann wird die genomische DNA nach spezifischen Architekturen gepoolt, wie zum Beispiel in Krysan et al. (Plant Cell 11, 2283 (1999)) beschrieben. Pools von genomischen DNAs werden dann durch spezifische multiplexe PCR Reaktionen gescreent, wodurch die Kombination des eingefügten Mutagens (z. B. T-DNA oder Transposon) und des Gens von Interesse nachgewiesen wird. Daher werden PCR Reaktionen auf den DNA Pools mit spezifischen Kombinationen von T-DNA oder Transposon-Grenz-Primern und genspezifischen Primern durchgeführt. Allgemeine Regeln für ein Primerdesign finden sich ebenso in Krysan et al. (Plant Cell 11, 2283 (1999)). Ein erneutes Screening von DNA Pools geringerer Spiegel führt zu der Identifizierung einzelner Pflanzen, in welchen das Gen von Interesse durch das eingesetzte Mutagen aktiviert ist.
Die Verstärkung positiver regulatorischer Elemente oder das Aufbrechen oder Abschwächen negativer regulatorischer Elemente kann auch durch herkömmliche Mutagenesetechniken erreicht werden. Die Produktion von chemisch oder durch Strahlung mutierten Populationen ist eine herkömmliche Technik und dem Fachmann bekannt. Verfahren für Pflanzen sind von Koorneef et al. (Mutat Res. Mar. 93 (1) (1982)) und den darin enthaltenen Zitaten und von Lightner und Caspar in "Methods in Molecular Biology" Band 82, beschrieben. Diese Techniken führen für gewöhnlich Punktmutationen herbei, die in jedem bekannten Gen mit Hilfe von Methoden wie TILLING (Colbert et al., Plant Physiol, 126, (2001)) identifiziert werden können.
Daher kann der Expressionswert erhöht sein, wenn die endogenen Gene, die für ein Polypeptid kodieren, das eine erhöhte Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verleiht, insbesondere Gene, die das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfassen, durch homologe Rekombination, Tilling Methoden oder Genkonversion modifiziert werden. Es ist auch möglich, wie hierin erwähnt, Targeting-Sequenzen den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen hinzuzufügen.
Regulatorische Sequenzen, falls erwünscht, können zusätzlich zu einer Targetsequenz oder einem Teil davon funktionsfähig an die Kodierungsregion eines endogenen Proteins gebunden werden und dessen Transkription und Translation oder die Stabilität oder den Verfall der kodierenden mRNA oder des exprimierten Proteins kontrollieren. Zur Modifizierung und Kontrolle der Expression können Promotor, UTRs, Spleißstellen, Verarbeitungssignale, Polyadenylierungsstellen, Termintoren, Enhancer, Repressoren, post-transkriptionale oder post-translationale Modifizierungsstellen geändert, hinzugefügt oder verändert werden. Zum Beispiel wurde die Aktivierung von Pflanzengenen durch regellose Integrationen von Enhancer-Elementen von Hayashi et al. (Science 258, 1350 (1992)) oder Weigel et al. (Plant Physiol. 122, 1003 (2000)) und anderen darin zitierten beschrieben. Zum Beispiel kann der Expressionswert des endogenen Proteins durch Ersetzen des endogenen Promotors durch einen starken transgenen Promotor oder durch Ersetzen des endogenen 3'UTR durch einen 3'UTR, der mehr Stabilität bietet, ohne die Kodierungsregion zu verändern, moduliert werden. Ferner kann die transkriptionale Regulierung durch Einführen eines künstlichen Transkriptionsfaktors, wie in den Beispielen beschrieben, moduliert werden. Alternative Promotoren, Termintoren und UTR sind in der Folge beschrieben.
Die Aktivierung eines endogenen Polypeptids mit der oben genannten Aktivität, z. B. mit der Aktivität eines Proteins wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, oder des Polypeptids der Erfindung, z. B. die Verleihung eines erhöhten Ertrags, z. B. erhöhten ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einer Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon nach Erhöhung der Expression oder Aktivität im Zytoplasm und/oder in einer Organelle wie einem Plastid, kann auch durch Einführen eines synthetischen Transkriptionsfaktors erhöht werden, der eng an die Kodierungsregion des Gens bindet, das für das Protein wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt kodiert, und seine Transkription aktiviert. Ein chimäres Zink-Finger-Protein kann konstruiert werden, das eine spezifische DNA Bindungsdomäne und eine Aktivierungsdomäne umfasst, wie z. B. die VP16 Domäne des Herpes Simplex Virus. Die spezifische Bindungsdomäne kann an die regulatorische Region des Gens binden, das für das Protein, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, kodiert. Die Expression des chimären Transkriptionsfaktors in einem Organismus, insbesondere in einer Pflanze, führt zu einer spezifischen Expression des Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt. Die Methoden dazu sind einem Fachmann bekannt und/oder z. B. in WO 01/52620 , Oritz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 13290 (2002) oder Guan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 13296 (2002) offenbart.
In einer weiteren Ausführungsform des Prozesses gemäß der Erfindung werden Organismen verwendet, in welchen eines der oben genannten Gene, oder eine der oben genannten Nukleinsäuren in einer Weise mutiert ist, dass die Aktivität des kodierten Genprodukts durch zelluläre Faktoren im Vergleich zu den nicht mutierten Proteinen weniger oder gar nicht beeinflusst ist. Zum Beispiel sind allgemein bekannte Regulierungsmechanismen einer Enzymaktivität Substratinhibitions- oder Feedback-Regulierungsmechanismen. Arten und Techniken für die Einführung von Substitution, Deletionen und Additionen einer oder mehrerer Basen, Nukleotide oder Aminosäuren von einer entsprechenden Sequenz sind hierin in der Folge in den entsprechenden Absätzen und den dort angeführten Referenzen beschrieben, z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, NY, 1989. Der Fachmann ist imstande, Regulierungsdomäne und Bindungsstellen von Regulatoren durch einen Vergleich der Sequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung oder des Expressionsprodukts davon mit dem Stand der Technik mit Hilfe von Computer Softwaremitteln zu identifizieren, die Algorithmen für die Identifizierung von Bindungsstellen und Regulierungsdomänen umfassen, oder durch Einführen systematischer Mutationen in ein Nukleinsäuremolekül oder in ein Protein und Testen auf jene Mutationen, die zu einer erhöhten spezifischen Aktivität oder einer erhöhten Aktivität pro Volumen, insbesondere pro Zelle, führen.
Es kann daher vorteilhaft sein, in einem Organismus ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder ein Polypeptid der Erfindung, abgeleitet von einem evolutionär entfernt verwandten Organismus zu exprimieren, wie z. B. durch Verwendung eines prokaryotischen Gens in einem eukaryotischen Wirt, da in diesen Fällen der Regulierungsmechanisus der Wirtszelle die (zelluläre oder spezifische) Aktivität des Gens oder seines Expressionsprodukts nicht schwächt.
Die Mutation wird derart eingeführt, dass ein erhöhter Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal nicht nachteilig beeinflusst ist.
Unter geringerem Einfluss auf die Regulierung eines Gens oder seines Genprodukts wird eine verringerte Regulierung der enzymatischen Aktivität verstanden, die zu einer erhöhten spezifischen oder zellulären Aktivität des Gens oder seines Produkts führt. Unter Erhöhung der enzymatischen Aktivität wird eine enzymatische Aktivität verstanden, die um mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20, 30 oder 40%, insbesondere mindestens 50, 60 oder 70% im Vergleich zum Ausgangsorganismus erhöht ist. Dies führt zu einem erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhtem ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen ertragsbezogenen Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon.
Die Erfindung sorgt dafür, dass die oben genannten Methoden so ausgeführt werden können, dass der Ertrag, z. B. ein ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Nährstoffnutzungseffizienz, ein intrinsischer Ertrag und/oder ein anderes ertragsbezogenes Merkmale erhöht ist, wobei insbesondere die Toleranz gegen Niedertemperatur erhöht ist. In einer weiteren Ausführungsform sorgt die Erfindung dafür, dass die oben genannten Methoden so ausgeführt werden können, dass die Toleranz gegen abiotischen Stress, insbesondere die Toleranz gegen Niedertemperatur und/oder Wassernutzungseffizienz, und gleichzeitig die Nährstoffnutzungseffizienz, insbesondere die Stickstoffnutzungseffizienz erhöht sind. In einer anderen Ausführungsform sorgt die Erfindung dafür, dass die oben genannten Methoden so ausgeführt werden können, dass der Ertrag ohne Nährstoffmängel wie auch ohne Stressbedingungen erhöht ist. In einer weiteren Ausführungsform sorgt die Erfindung dafür, dass die oben genannten Methoden so ausgeführt werden können, dass die Nährstoffnutzungseffizienz, insbesondere die Stickstoffnutzungseffizienz, und der Ertrag ohne Nährstoffmängel wie auch ohne Stressbedingungen erhöht sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sorgt die Erfindung dafür, dass die oben genannten Methoden so ausgeführt werden können, dass die Toleranz gegen abiotischen Stress, insbesondere die Toleranz gegen Niedertemperatur und/oder Wassernutzungseffizienz, und gleichzeitig die Nährstoffnutzungseffizienz, insbesondere die Stickstoffnutzungseffizienz, und der intrinsische Ertrag erhöht sind. In einer Ausführungsform, ist der Ertrag ohne Nährstoffmängel wie auch ohne Stressbedingungen erhöht.
Die Erfindung ist nicht auf spezifische Nukleinsäuren, spezifische Polypeptide, spezifische Zelltypen, spezifische Wirtszellen, spezifische Bedingungen oder spezifische Methoden usw. als solche beschränkt, sondern kann variieren und zahlreiche Modifizierungen und Variationen darin sind für den Fachmann offensichtlich. Es ist auch klar, dass die hierin verwendete Terminologie nur dem Zweck der Beschreibung spezifischer Ausführungsformen dient und nicht einschränkend sein soll.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuren, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid kodiert, das in Spalte 7 von Tabelle II B, Anwendung. Nr. 1, dargestellt ist; (b) einem Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 7 von Tabelle I B, Anwendung Nr. 1, dargestellt ist; (c) einem Nukleinsäuremolekül, das infolge der Degeneriertheit des genetischen Kodes von einer Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anwendung Nr. 1 angeführt ist, und einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, eine Pflanze oder einem Teil davon; (d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1, dargestellt ist, und erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle eine Pflanze oder einem Teil davon; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids kodiert, das durch das Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c) oder (d) kodiert ist und dessen Aktivität durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt wird, das ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1, dargestellt, umfasst und erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, eine Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (f) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c), (d) oder (e) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, eine Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt werden, das durch eines der Nukleinsäuremoleküle von (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) kodiert ist und die Aktivität aufweist, die durch das Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1, dargestellt ist; (h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder eines oder mehrere Polypeptidmotive, wie in Spalte 7 von Tabelle IV, Anwendung Nr. 1, dargestellt, umfasst und vorzugsweise mit der Aktivität, die durch ein Protein dargestellt ist, das ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV, Anwendung Nr. 1, dargestellt ist; umfasst (i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit der Aktivität kodiert, wie durch ein Protein, wie in Spalte 5 von Tabelle II, Anwendung Nr. 1 dargestellt ist, und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, eine Pflanze oder einem Teil davon verleiht (j) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das durch Amplifizieren einer cDNA Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III, Anwendung Nr. 1, erhalten wird, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Protein dargestellt ist, das ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV, Anwendung Nr. 1, dargestellt ist, umfasst; und (k) einem Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäurebibliothek, insbesondere einer cDNA Bibliothek und/oder einer genomischen Bibliothek, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde erhältlich ist, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 500 nt, 750 nt oder 1000 nt eines Nukleinsäuremoleküls komplementär zu einer Nukleinsäuremolekülsequenz, die in (a) bis (e) charakterisiert ist und für ein Polypeptid mit der Aktivität kodiert, wie durch ein Protein dargestellt, das ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II, Anwendung Nr. 1 dargestellt ist, umfasst. In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül gemäß (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j) und (k) mindestens in einem oder mehreren Nukleotid(en) anders als die Sequenz, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I A, Anwendung Nr. 1, dargestellt ist, und kodiert vorzugsweise für ein Protein, das sich mindestens in einer oder mehreren Aminosäuren von den Proteinsequenzen unterscheidet, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II A, Anwendung Nr. 1 dargestellt sind.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung Homologe der oben genannten Sequenzen, die vorteilhaft von Hefe, Pilzen, Viren, Algen, Bakterien, wie Acetobacter (subgen. Acetobacter) aceti; Acidithiobacillus ferrooxidans; Acinetobacter sp.; Actinobacillus sp; Aeromonas salmonicida; Agrobacterium tumefaciens; Aquifex aeolicus; Arcanobacterium pyogenes; Aster yellows phytoplasma; Bacillus sp.; Bifidobacterium sp.; Borrelia burgdorferi; Brevibacterium linens; Brucella melitensis; Buchnera sp.; Butyrivibrio fibrisolvens; Campylobacter jejuni; Caulobacter crescentus; Chlamydia sp.; Chlamydophila sp.; Chlorobium limicola; Citrobacter rodentium; Clostridium sp.; Comamonas testosteroni; Corynebacterium sp.; Coxiella burnetii; Deinococcus radiodurans; Dichelobacter nodosus; Edwardsiella ictaluri; Enterobacter sp.; Erysipelothrix rhusiopathiae; E. coli; Flavobacterium sp.; Francisella tularensis; Frankie sp. Cpl1; Fusobacterium nucleatum; Geobacillus stearothermophilus; Gluconobacter oxydans; Haemophilus sp.; Helicobacter pylori; Klebsiella pneumoniae; Lactobacillus sp.; Lactococcus lactis; Listeria sp.; Mannheimia haemolytica; Mesorhizobium loti; Methytophaga thalassica; Microcystis aeruginosa; Microscilla sp. PRE1; Moraxella sp. TA144; Mycobacterium sp.; Mycoplasma sp.; Neisseria sp.; Nitrosomonas sp.; Nostoc sp. PCC 7120; Novosphingobium aromaticivorans; Oenococcus oeni; Pantoea citrea; Pasteurella multocida; Pediococcus pentosaceus; Phormidium foveolarum; Phytoplasma sp.; Plectonema boryanum; Prevotella ruminicola; Propionibacterium sp.; Proteus vulgaris; Pseudomonas sp.; Ralstonia sp.; Rhizobium sp.; Rhodococcus equi; Rhodothermus marinus; Rickettsia sp.; Riemerella anatipestifer; Ruminococcus flavefaciens; Salmonella sp.; Seleromonas ruminantium; Serratia entomophila; Shigella sp.; Sinorhizobium meliloti; Staphylococcus sp.; Streptococcus sp.; Streptomyces sp.; Synechococcus sp.; Synechocystis sp. PCC 6803; Thermotoga maritima; Treponema sp.; Ureaplasma urealyticum; Vibrio cholerae; Vibrio parahaemolyticus; Xylella fastidiosa; Yersinia sp.; Zymomonas mobilis, vorzugsweise Salmonelle sp. oder E. coli oder Pflanzen, vorzugsweise von Hefen wie von den Gattungen Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Torulopsis oder Schizosaccharomyces oder Pflanzen wie A. thaliana, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Borretsch, Sonnenblume, Leinsamen, Primel, Ölraps, Canola und Rübsamen, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Solanaceenpflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Auberginen und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Luzerne, Buschpflanzen wie Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Spezies, wie Ölpalme, Kokosnuss, ganzjährigen Gräsern, wie Weidelgras und Schwingel, und Futternutzpflanzen, wie Luzerne und Klee und von Fichte, Kiefer oder Tanne zum Beispiel isoliert werden können. Insbesondere können Homologe der oben genannten Sequenzen von S. cerevisiae, E. coli oder Synechocystis sp. oder Pflanzen, vorzugsweise Brassica napus, Glycine max, Zea mays, Baumwolle oder Oryza sativa, isoliert werden.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise durch rekombinante DNA Techniken produziert. Zum Beispiel wird ein Nukleinsäuremolekül, das für das Protein kodiert, in einen Expressionsvektor geklont, zum Beispiel in einen binären Vektor, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle eingeführt, zum Beispiel A. thaliana Wildtyp NASC N906 oder eine andere Pflanzenzelle wie in der Folge in den Beispielen beschrieben ist, und das Protein wird in der Wirtszelle exprimiert. Beispiele für binäre Vektoren sind pBIN19, pBI101, pBinAR, pGPTV, pCAMBIA, pBIB-HYG, pBecks, pGreen oder pPZP (Hajukiewicz, P. et al., Plant Mol. Biol. 25, 989 (1994), und Hellen et al, Trends in Plant Science 5, 446 (2000)).
In einer Ausführungsform wird das Protein der vorliegenden Erfindung vorzugsweise in einem Kompartiment der Zelle erzeugt, z. B. in den Plastiden. Möglichkeiten zum Einführen von Nukleinsäuren in Plastide und Erzeugen von Proteinen in diesem Kompartiment sind dem Fachmann bekannt und sind auch in dieser Anmeldung beschrieben. In einer Ausführungsform ist das Polypeptid der Erfindung ein Protein, das nach der Expression wie in Spalte 6 von Tabelle II angegeben lokalisiert ist, z. B. nicht-zielgerichtet, mitochondrial oder plastidär, zum Beispiel an ein Transitpeptid fusioniert ist, wie oben für die plastidäre Lokalisierung beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform wird das Protein der vorliegenden Erfindung ohne weiteres Targeting-Signal (z. B. wie hierin erwähnt) erzeugt, z. B. im Zytoplasma der Zelle. Möglichkeiten zum Erzeugen von Proteinen im Zytoplasma sind dem Fachmann bekannt. Möglichkeiten zum Erzeugen von Proteinen ohne künstliches Targeting sind dem Fachmann bekannt.
Vorzugsweise werden die Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung oder das Gen, das gemeinsam mit mindestens einem Reportergen konstruiert wird, in eine Expressionskassette geklont, die in den Organismus über einen Vektor oder direkt in das Genom eingeführt wird. Dieses Reportergen sollte einen leichten Nachweis über Wachstums-, Fluoreszenz-, chemische, Biolumineszenz oder Toleranztests oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispiele für Reportergene, die erwähnenswert sind, sind Antibiotik- oder Herbizidtoleranz-Gene, Hydrolese-Gene, Fluoreszenz-Proteingene, Biolumineszenz-Gene, Zucker- oder metabolische Nukleotid-Gene oder Biosynthese-Gene wie das Ura3 Gen, das IIv2 Gen, das Luciferase Gen, das β-Galactosidase Gen, das gfp Gen, das 2-Desoxyglucose-6-phosphat-Phosphatase-Gen, das β-Glucuronidase-Gen, β-Lactamase-Gen, das Neomycin-Phosphotransferase-Gen, das Hygromycin-Phosphotransferase-Gen, ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS) Gen (auch bekannt als Acetolactat-Synthase(ALS)Gen), ein Gen für ein D-Aminosäure metabolisierendes Enzym oder das BASTA (= Gluphosinattoleranz) Gen. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messung und Quantifizierung der Transkriptionsaktivität und somit der Expression der Gene. Auf diese Weise können Genompositionen identifiziert werden, die unterschiedliche Produktivität aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Nukleinsäurekonstrukt, zum Beispiel eine Expressionskassette, stromaufwärts, d. h. am 5' Ende der Kodierungssequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3' Ende, ein Polyadenylierungssignal und wahlweise andere regulatorische Elemente, die funktionsfähig an die intervenierende Kodierungssequenz mit einer der Nukleinsäuren von SEQ ID NR., die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt sind, gebunden sind. Unter einer funktionsfähigen Bindung wird die aufeinander folgende Anordnung von Promotor, Kodierungssequenz, Terminator und wahlweise anderer regulatorischer Elemente in derartiger Weise verstanden, dass jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion in der Expression der Kodierungssequenz gebührlich erfüllen kann. In einer Ausführungsform sind die Sequenzen, die für eine funktionsfähige Bindung bevorzugt sind, Targeting-Sequenzen, die eine subzelluläre Lokalisierung in Plastiden garantieren. Targeting-Sequenzen, die eine subzelluläre Lokalisierung im Mitochondrium, im endoplasmatischen Reticulum (= ER), im Kern, in Ölkorpuskeln oder anderen Kompartimenten garantieren, können ebenso verwendet wird, wie auch Translationspromotoren, wie die 5' führende Sequenz im Tabakmosaikvirus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 8693 (1987)).
Ein Nukleinsäurekonstrukt, zum Beispiel eine Expressionskassette, kann zum Beispiel einen konstitutiven Promotor oder einen gewebespezifischen Promotor (vorzugsweise den USP oder Napin Promotor), das zu exprimierende Gen und das ER Retentionssignal enthalten. Für das ER Retentionssignal wird vorzugsweise die KDEL Aminosäuresequenz (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) oder die KKX Aminosäuresequenz (Lysin-Lysin-X-Stopp, wobei X jede andere bekannte Aminosäure bezeichnet) verwendet.
Für die Expression in einem Wirtsorganismus, zum Beispiel einer Pflanze, wird die Expressionskassette vorzugsweise in einen Vektor eingesetzt, wie zum Beispiel ein Plasmid, einen Phage oder andere DNA, der eine optimale Expression der Gene in dem Wirtsorganismus ermöglicht. Beispiele für geeignete Plasmide sind: in E. coli pLG338, pACYC184, pBR Serie wie z. B. pBR322, pUC Serie wie pUC18 oder pUC19, M113mp Serie, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 oder pBdCI; in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361; in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214; in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667; in Pilzen pALS1, pI2 oder pBB116; andere vorteilhafte fungale Vektoren sind von Romanos M. A. et al., Yeast 8, 423 (1992) und von van den Hondel, C. A. M. J. J. et al. [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi"] wie auch in "More Gene Manipulations in Fungi" in Bennet J. W. & Lasure L. L., Hrsg., S. 396–428, Academic Press, San Diego, und in "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics von Fungi, Peberdy, J. F. et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge] beschrieben. Beispiele für vorteilhafte Hefepromotoren sind 2 μM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Beispiele für Algen- oder Pflanzenpromotoren sind pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L., Plant Cell Rep. 7, 583 (1988))). Die oben genannten Vektoren oder Derivate der oben angeführten Vektoren sind eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide. Ferner sind Plasmide dem Fachmann gut bekannt und finden sich zum Beispiel, in "Cloning Vectors" (Hrsg. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018). Geeignete Pflanzenvektoren sind unter anderen in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press, Kapitel 6/7, S. 71–119) angegeben. Vorteilhafte Vektoren sind bekannt als Shuttle-Vektoren oder binäre Vektoren, die in E. coli und Agrobacterium replizieren.
Unter Vektoren werden mit Ausnahme von Plasmiden alle anderen Vektoren verstanden, die dem Fachmann bekannt sind, wie zum Beispiel Phage, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenvirus, Transposons, IS Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert werden oder chromosomal repliziert werden, wobei die chromosomale Replikation bevorzugt ist.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Vektor der Expressionskassette gemäß der Erfindung auch vorteilhaft in die Organismen in der Form einer linearen DNA eingeführt werden und in das Genom des Wirtsorganismus durch heterologe oder homologe Rekombinantion integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur der Expressionskassette als Vektor oder den Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung bestehen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann die Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung auch als solche in einen Organismus eingeführt werden.
Wenn zusätzlich zu der Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, gemeinsam mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jeweils als einzelne Gen mit einem Reportergen in einem Vektor, können sie in jedem Fall in den Organismus eingeführt werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder aufeinander folgend eingeführt werden können.
Der Vektor enthält vorzugsweise mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung und/oder der Expressionskassette (= des Genkonstrukts) gemäß der Erfindung.
Die Erfindung stellt ferner einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine Nukleinsäure umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7 angeführt, wobei die Expression des Vektors in einer Wirtszelle zu einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmal im Vergleich zu einer Wildtypvarietät der Wirtszelle führt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ”Vektor” auf ein Nukleinsäuremolekül, das imstande ist, eine andere Nukleinsäure zu transportieren, die angebunden wurde. Eine Art von Vektor ist ein ”Plasmid”, das sich auf eine kreisförmige, doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA Segmente ligiert werden können. Eine andere Art von Vektor ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Gewisse Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle imstande, in die sie eingeführt werden (z. B. bakterielle Vektoren mit bakteriellem Replikationsursprung und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht episomale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle oder einer Organelle nach Einführung in die Wirtszelle integriert und dadurch gemeinsam mit dem Wirts- oder Organellengenom repliziert. Ferner sind gewisse Vektoren imstande, die Expression von Genen zu lenken, an die sie funktionsfähig gebunden sind. Solche Vektoren werden hierin als ”Expressionsvektoren” bezeichnet. Im Allgemeinen weisen Expressionsvektoren von Nutzen in rekombinanten DNA Techniken häufig die Form von Plasmiden auf. In der vorliegenden Beschreibung können ”Plasmid” und ”Vektor” untereinander austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form von Vektor ist. Die Erfindung soll jedoch andere Formen von Expressionsvektoren beinhalten, wie virale Vektoren (z. B. replikationsdefekte Retroviren, Adenviren und Adeno-assoziierte Viren), die äquivalente Funktionen erfüllen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung umfassen eine Nukleinsäure der Erfindung in einer Form, die zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen enthalten, die auf der Basis der Wirtszellen ausgewählt werden, die für die Expression verwendet werden, die funktionsfähig an die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz gebunden sind. Wie hierin in Bezug auf einen rekombinanten Expressionsvektor verwendet, soll ”funktionsfähig gebunden” bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse an die regulatorische(n) Sequenz(en) in einer Weise gebunden ist, die die Expression der Nukleotidsequenz ermöglicht (z. B. in einem in vitro Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird). Der Begriff ”regulatorische Sequenz” soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z. B. Polyadenylierungssignale) enthalten. Solche regulatorischen Sequenzen sind zum Beispiel, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), und Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Hrsg. Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, CRC Press; Boca Raton, Florida, einschließlich der darin enthaltenen Referenzen beschrieben. Regulatorische Sequenzen enthalten jene, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Arten von Wirtszellen lenken, und jene, die die Expression der Nukleotidsequenz nur in gewissen Wirtszellen oder unter gewissen Bedingungen lenken. Für den Fachmann ist offensichtlich, dass das Design des Expressionsvektors auch von Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Expressionswert des Polypeptids, usw. abhängt. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden, um dadurch Polypeptide oder Peptide zu erzeugen, einschließlich Fusionspolypeptide oder Peptide, die durch Nukleinsäuren, wie hierin beschrieben, kodiert werden (z. B. Fusionspolypeptide, ”ertragsbezogene Proteine” oder ”YRPs” usw.).
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für die Expression des Polypeptids der Erfindung in Pflanzenzellen gestaltet sein. Zum Beispiel können YRP Gene in Pflanzenzellen exprimiert werden (siehe Schmidt R., und Willmitzer L., Plant Cell Rep. 7 (1988); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); White F. F., Jenes B. et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band. 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung und Wu R., 128–43, Academic Press: 1993; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991) und der darin enthaltenen Referenzen). Geeignete Wirtszellen sind ferner in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990) besprochen. Als Alternative kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, zum Beispiel mit Hilfe von T7 Promotor regulatorischen Sequenzen und T7 Polymerase.
Die Expression von Polypeptiden in Prokaryoten wird am häufigsten mit Vektoren durchgeführt, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression von entweder Fusions- oder Nicht-Fusionspolypeptiden lenken. Fusionsvektoren fügen eine Anzahl von Aminosäuren einem darin kodierten Polypeptid hinzu, für gewöhnlich am Amino-Terminus des rekombinanten Polypeptids, aber auch am C-Terminus oder fusioniert innerhalb geeigneter Regionen in den Polypeptiden. Solche Fusionsvektoren erfüllen für gewöhnlich drei Zwecke: 1) Erhöhung der Expression eines rekombinanten Polypeptids; 2) Erhöhung der Löslichkeit eines rekombinanten Polypeptids; und 3) Hilfe bei der Reinigung eines rekombinanten Polypeptids, indem sie als Ligand in der Affinitätsreinigung dienen. Häufig wird in Fusionsexpressionsvektoren eine proteolytische Spaltungsstelle an der Verbindung der Fusionsgruppe mit dem rekombinanten Polypeptid eingeführt, um eine Trennung des rekombinanten, Polypeptids von der Fusionsgruppe nach der Reinigung des Fusionspolypeptids zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre kognaten Erkennungssequenzen enthalten Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Zum Beispiel kann die Pflanzenexpressionskassette im pRT Transformationsvektor installiert werden ((a) Toepfer et al., Methods Enzymol. 217, 66 (1993), (b) Toepfer et al., Nucl. Acids. Res. 15, 5890 (1987)). Als Alternative kann ein rekombinanter Vektor (= Expressionsvektor) auch in vitro, z. B. unter Verwendung des T7 Promotors und der T7 RNA Polymerase, transkribiert und translatiert werden.
Expressionsvektoren, die in Prokaryoten verwendet werden, nutzen häufig induzierbare Systeme mit und ohne Fusionsproteine(n) oder Fusionsoligopeptide(n), wobei die Fusionen sowohl auf N-terminale wie auch C-terminale Weise oder in anderen nützlichen Domänen eines Proteins erfolgen können. Solche Fusionsvektoren haben üblicherweise die folgenden Zwecke: 1) Erhöhung der RNA Expressionsrate; 2) Erhöhung der erreichbaren Proteinsyntheserate; 3) Erhöhung der Löslichkeit des Proteins; 4) oder Vereinfachung der Reinigung mit Hilfe einer Bindungssequenz, die für eine Affinitätschromatographie nützlich ist. Proteolytische Spaltungspunkte werden häufig über Fusionsproteine eingeführt, die eine Spaltung eines Teils des Fusionsproteins und eine Reinigung ermöglichen. Solche Erkennungssequenzen für Proteasen sind bekannt, z. B. Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Typische vorteilhafte Fusions- und Expressionsvektoren sind pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith D. B. und Johnson K. S., Gene 67, 31 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), das Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose-Bindugnsprotein oder Protein A enthält.
In einer Ausführungsform wird die Kodierungssequenz des Polypeptids der Erfindung in einen pGEX Expressionsvektor geklont, um einen Vektor zu erzeugen, der für ein Fusionspolypeptid kodiert, umfassend, vom N-Terminus bis zum C-Terminus, GST-Thrombin Spaltungsstelle-X Polypeptid. Das Fusionspolypeptid kann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Glutathion-Agaroseharz gereinigt werden. Rekombinantes PK YRP, das nicht an GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusionspolypeptids mit Thrombin gewonnen werden. Andere Beispiele für E. coli Expressionsvektoren sind pTrc (Amann et al., Gene 69, 301 (1988)) und pET Vektoren (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60–89; Stratagene, Amsterdam, Niederlande).
Eine Target-Genexpression des pTrc Vektors beruht auf einer Wirts-RNA Polymerase-Transkription eines hybriden trp-lac Fusionspromotors. Eine Target-Genexpression des pET 11d Vektors beruht auf einer Transkription eines T7 gn10-lac Fusionspromotors, vermittelt durch eine co-exprimierte virale RNA Polymerase (T7 gn1). Diese virale Polymerase wird von Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) eines residenten I Prophage geliefert, der ein T7 gn1 Gen unter der transkriptionalem Kontrolle des lacUV 5 Promotors enthält.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die YRPs in Pflanzen und Pflanzenzellen wie unizellulären Pflanzenzellen (z. B. Algen) (siehe Falciatore et al., Marine Biotechnology 1 (3), 239 (1999) und darin enthaltene Referenzen) und Pflanzenzellen von höheren Pflanzen (z. B. die Spermatophyten, wie Nutzpflanzen), zum Beispiel zur Regenerierung von Pflanzen aus den Pflanzenzellen, geliefert. Ein Nukleinsäuremolekül, das für YRP kodiert, wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7 dargestellt, könnte in eine Pflanzenzelle durch jedes Mittel ”eingeführt” werden, einschließlich Transfektion, Transformation oder Transduktion, Elektroporation, Teilchenbombardment, Agroinfektion und dergleichen. Eine Transformationsmethode, die dem Fachmann bekannt ist, ist das Eintauchen einer blühenden Pflanze in eine Agrobacteria-Lösung, wobei Agrobacteria die Nukleinsäure der Erfindung enthält, gefolgt von Vermehrung der transformierten Gameten.
Andere geeignete Methoden zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, die Pflanzenzellen enthalten, findet sich in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbar, NY, 1989, und anderen Laborhandbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Band. 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Gartland und Davey, Humane Press, Totowa, New Jersey. Da eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress und/oder ein erhöhter Ertrag ein allgemeines Merkmal ist, das in eine Vielzahl von Pflanzen vererbt werden soll, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Ölraps und Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Solanaceenpflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Auberginen und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Luzerne, Buschpflanzen wie Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Spezies, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss), ganzjährige Gräser und Futternutzpflanzen, sind diese Nutzpflanzen auch bevorzugte Target-Pflanzen für eine genetische Manipulation als eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Futternutzpflanzen enthalten, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Getreidegras, Schilfgras, Trespe, Wildroggengrass, Wiesenrispengras, Knäuelgras, Luerne, Salfoin, Lotusblüte, Schwedenklee, Rotklee und Süßklee.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Transfektion eines Nukleinsäuremoleküls, das für YRP, wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7 dargestellt, kodiert, in eine Pflanze durch Agrobacterium-vermittelten Gentransfer erreicht Eine Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung von GV3101 (pMP90) (Koncz und Schell, Mol. Gen. Genet. 204, 383 (1986)) oder LBA4404 (Clontech) Agrobacterium tumefaciens Stamm durchgeführt werden. Die Transformation kann durch Standardtransformations- und Regenerierungstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al., Nucl. Acids Res. 13, 4777 (1994), Gelvin, Stanton B. und Schilperoort Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2. Auflage – Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick Bernard R., Thompson John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Zum Beispiel kann Raps kann über Kotyledon- oder Hypocotyltransformation transformiert werden (Moloney et al., Plant Cell Report 8, 238 (1989); De Block et al., Plant Physiol. 91, 694 (1989)). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt vom binären Vektor und dem Agrobacteriumstamm ab, die für die Transformation verwendet werden. Die Rapsselektion wird normalerweise unter Verwendung von Kanamycin als selektierbaren Pflanzemarker durchgeführt. Agrobacterium-vermittelter Gentransfer bei Flachs kann zum Beispiel unter Verwendung einer Technik durchgeführt werden, die von Mlynarova et al., Plant Cell Report 13, 282 (1994), beschrieben ist. Zusätzlich kann die Transformation von Sojabohne unter Verwendung zum Beispiel einer Technik durchgeführt werden, die im Europäischen Patent Nr. 424 047 , U.S. Patent Nr. 5,322,783 , Europäischen Patent Nr. 397 687 , U.S. Patent Nr. 5,376,543 oder U.S. Patent Nr. 5,169,770 beschrieben ist. Die Transformation von Mais kann durch Teilchenbombardement, Polyethylenglycol-vermittelte DNA Aufnahme oder über die Siliziumcarbidfasertechnik erreicht werden. (Siehe zum Beispiel Freeling und Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Ein spezifisches Beispiel für eine Maistransformation findet sich in U.S. Patent Nr. 5,990,387 , und ein spezifisches Beispiel für Weizentransformation findet sich in der PCT Anmeldung Nr. WO 93/07256 .
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das eingeführte Nukleinsäuremolekül, das für YRP, wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7 dargestellt, kodiert, stabil in der Pflanzenzelle gehalten werden, wenn es in ein nicht chromosomales autonomes Replikon integriert wird oder in die Pflanzenchromosome oder das Organellengenom integriert wird. Als Alternative könnte das eingeführte YRP auf einem extra-chromosomalen, nicht replizierenden Vektor vorhanden sein und transient exprimiert oder transient aktiv sein.
In einer Ausführungsform kann ein homologer rekombinanter Mikroorganismus erzeugt werden, wobei das YRP in ein Chromosom integriert ist, ein Vektor hergestellt wird, der mindestens einen Teil eines Nukleinsäuremoleküls enthält, das für YRP, wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7 dargestellt, kodiert, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingeführt wurde, um dadurch das YRP Gen zu verändern, zum Beispiel funktionell aufzubrechen. Zum Beispiel ist das YRP Gen ein Hefegen, wie ein Gen von S. cerevisiae, oder ein bakterielles Gen, wie ein E. coli Gen, oder von Synechocystis, kann aber ein Homolog von einer verwandten Pflanze oder sogar von einer Säugetier- oder Insektenquelle sein. Der Vektor kann so gestaltet werden, dass bei homologer Rekombination das endogene Nukleinsäuremolekül, das für YRP, wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7 dargestellt, kodiert, mutiert oder auf andere Weise verändert ist, aber immer noch für ein funktionelles Polypeptid kodiert (z. B. kann die stromaufwärts liegende regulatorische Region verändert sein, um dadurch die Expression des endogenen YRP zu verändern). In einer bevorzugten Ausführungsform ist die biologische Aktivität des Proteins der Erfindung nach homologer Rekombination erhöht. Zur Schaffung einer Punktmutation durch homologe Rekombination können DNA-RNA Hybride in einer Technik verwendet werden, die als Chimeraplasty bekannt ist (Cole-Strauss et al., Nucleic Acids Research 27(5), 1323 (1999) und Kmiec, Gene Therapy American Scientist. 87 (3), 240 (1999)). Homologe Rekombinationsverfahren in Physcomitrella patens sind auch nach dem Stand der Technik allgemein bekannt und werden hierin zur Verwendung in Betracht gezogen.
Während in dem homologen Rekombinationsvektor der veränderte Teil des Nukleinsäuremoleküls, das für YRP, wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7 dargestellt, kodiert, an seinen 5' und 3' Enden von einem zusätzlichen Nukleinsäuremolekül des YRP Gens flankiert ist, um eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen YRP Gen, das vom Vektor getragen wird, und einem endogenen YRP Gen in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze zu ermöglichen. Das zusätzliche flankierende YRP Nukleinsäuremolekül ist von ausreichender Länge für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen. Für gewöhnlich sind mehrere hundert Basenpaare bis zu Kilobasen flankierender DNA (sowohl am 5' wie auch am 3' Ende) im Vektor enthalten. Siehe, z. B. Thomas K. R., und Capecchi M. R., Cell 51, 503 (1987) für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren oder Strepp et al., PNAS, 95 (8), 4368 (1998) für eine auf cDNA basierende Rekombination in Physcomitrella patens. Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle eingeführt (z. B. durch Polyethylenglycol-vermittelte DNA) und Zellen, in welchen das eingeführte YRP Gen homolog mit dem endogenen YRP Gen kombiniert wurden, werden unter Verwendung von Techniken, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, selektiert.
Egal ob in einem extra-chromosomalen, nicht replizierenden Vektor oder einem Vektor, der in ein Chromosom integriert ist – das Nukleinsäuremolekül, das für YRP, wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7 dargestellt, kodiert, befindet sich vorzugsweise in einer Pflanzenexpressionskassette. Eine Pflanzenexpressionskassette enthält vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die zu einem Antreiben einer Genexpression in Pflanzenzellen imstande sind, die so funktionsfähig gebunden sind, dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, zum Beispiel Terminierung einer Transkription durch Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind jene, die von Agrobacterium tumefaciens t-DNA stammen, wie das Gen 3, das als Octopin-Synthase des Ti-Plasmids pTiACH5 bekannt ist (Gielen et al., EMBO J. 3, 835 (1984)) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen Terminatoren, die in Pflanzen funktionell aktiv sind, sind geeignet. Da die Pflanzengenexpression sehr häufig nicht auf transkriptionale Ebenen begrenzt ist, enthält eine Pflanzenexpressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig gebundene Sequenzen, wie translationale Enhancer, wie die Overdrive-Sequenz, die die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz des Tabakmosaikvirus enthält, die das Polypeptid-pro-RNA-Verhältnis verstärkt (Gallie et al., Nucl. Acids Research 15, 8693 (1987)). Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren enthalten jene, die ausführlich dargestellt sind in: Becker D. et al., Plant Mol. Biol. 20, 1195 (1992); und Bevan M. W., Nucl. Acid. Res. 12, 8711 (1984); und "Vectors for Gene Transfer in Higher Plants" in: Transgenic Plants, Band 1, Manipulation von and Utilization, Hrsg. Kung und Wu R., Academic Press, 1993, S. 15–38.
”Transformation” ist hierin als ein Prozess zum Einführen heterologer DNA in eine Pflanzenzelle, ein Pflanzengewebe oder eine Pflanze definiert. Sie kann unter natürlichen oder künstlichen Bedingungen unter Verwendung verschiedener Methoden erfolgen, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Die Transformation kann auf jeder bekannten Methode für das Einfügen fremder Nukleinsäuresequenzen in eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle beruhen. Die Methode wird auf der Basis der transformierten Wirtszelle ausgewählt und könnte, ohne aber darauf beschränkt zu sein, virale Infektion, Elektroporation, Lipofektion und Teilchenbombardement enthalten. Solche ”transformierten” Zellen enthalten stabil transformierte Zellen, in welchen die eingefügte DNA zur Replikation imstande ist, entweder als ein autonom replizierendes Plasmid oder als Teil des Wirtschromosoms. Sie enthaften auch Zellen, die transient die eingefügte DNA oder RNA über begrenzte Zeitperioden exprimieren. Transformierte Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen sollen nicht nur das Endprodukt eines Transformationsprozesses umfassen, sondern auch die transgene Nachkommenschaft davon.
Die Begriffe ”transformiert,” ”transgen” und ”rekombinant” beziehen sich auf einen Wirtsorganismus wie ein Bakterium oder eine Pflanze, in den ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingeführt wurde. Das Nukleinsäuremolekül kann stabil in das Genom des Wirts integriert sein oder das Nukleinsäuremolekül kann auch als ein extra-chromosomales Molekül vorhanden sein. Ein solches extra-chromosomales Molekül kann auto-replizierend sein. Transformierte Zellen, Gewebe oder Pflanzen sollen nicht nur das Endprodukt eines Transformationsprozesses umfassen, sondern auch die transgene Nachkommenschaft davon. Ein ”nicht transformierter”, ”nicht transgener” oder ”nicht rekombinanter” Wirt bezieht sich auf einen Wildtyp-Organismus, z. B. ein Bakterium oder eine Pflanze, der das heterologe Nukleinsäuremolekül nicht enthält.
Eine ”transgene Pflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Pflanze, die eine fremde Nukleotidsequenz enthält, die entweder in ihr Kerngenom oder Organellengenom eingefügt ist. Sie umfasst ferner die nachkommenden Generationen, d. h. die T1-, T2- und folgenden Generationen oder BC1-, BC2- und folgenden Generationen wie auch Kreuzungen davon mit nicht transgenen oder anderen transgenen Pflanzen.
Der Wirtsorganismus (= transgene Organismus) enthält vorzugsweise mindestens eine Kopie der Nukleinsäure gemäß der Erfindung und/oder des Nukleinsäurekonstrukts gemäß der Erfindung.
Im Prinzip können alle Pflanzen als Wirtsorganismus verwendet werden. Bevorzugte transgene Pflanzen sind zum Beispiel ausgewählt aus den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae und vorzugsweise von einer Pflanze, die aus der Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae ausgewählt ist. Bevorzugt sind Nutzpflanzen wie Pflanzen, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe der Gattung Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Olive, Sesam, Haselnuss, Mandel, Avocado, Lorbeer, Kürbis/Speisekürbis, Leinsamen, Soja, Pistazie, Borretsch, Mais, Weizen, Roggen, Hafers, Sorghum und Hirse, Triticale, Reis, Gerste, Maniok, Kartoffel, Zuckerrübe, Aubergine, Luzerne und ganzjährige Gräser und Futterpflanzen, Ölpalme, Gemüse (Kohlarten, Wurzelgemüse, Knollengemüse, Hülsengemüse, Fruchtgemüse, Zwiebelgemüse, Blattgemüse und Stängelgemüse), Buchweizen, Jerusalem Artischocke, Saubohne, Wicken, Linse, Buschbohnen, Lupine, Klee und Lucerne, um nur einige von ihnen zu erwähnen.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind transgene Pflanzen ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Getreide, Sojabohne, Raps (einschließlich Ölraps, insbesondere Canola und Winterölraps), Baumwolle, Zuckerrohr und Kartoffel, insbesondere Mais, Soja, Raps (einschließlich Ölraps, insbesondere Canola und Winterölraps), Baumwolle, Weizen und Reis.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die transgene Pflanze eine Gymnospermpflanze, insbesondere eine Kiefer oder Tanne.
In einer Ausführungsform ist die Wirtspflanze ausgewählt aus den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae und vorzugsweise von einer Pflanze, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaoeae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae. Bevorzugt sind Nutzpflanzen und insbesondere Pflanzen, die hier zuvor als Wirtspflanzen erwähnt wurden, wie die oben erwähnten Familien und Gattungen, zum Beispiel sind bevorzugte Spezies Anacardium occidentale, Calendula officinalis, Carthamus tinctorius, Cichorium intybus, Cynara scolymus, Helianthus annus, Tagetes lucida, Tagetes erecta, Tagetes tenuifolia; Daucus carota; Corylus avellana, Corylus columa, Borago officinalis; Brassica napus, Brassica rapa ssp., Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis, Brassica oleracea, Arabidopsis thaliana, Anana comosus, Ananas ananas, Bromelia comosa, Carica papaya, Cannabis sative, Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba, Convolvulus panduratus, Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva, Beta vulgaris var. esculenta, Cucurbita maxima, Cucurbita mixte, Cucurbita pepo, Cucurbita moschata, Olea europaea, Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta, Ricinus communis, Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile, Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia, Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida, Soja max, Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides, Oleum cocoas, Laurus nobilis, Persea americana, Arachis hypogaea, Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense, Linum trigynum, Punica granatum, Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Gossypium thurberi, Musa nana, Muss acuminata, Muss paradisiaca, Muss spp., Elaeis guineensis, Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium, Sesamum indicum, Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata, Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murmur, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida, Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum millet, Panicum militaceum, Zea mays, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare, Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea liberica, Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens, Capsicum annuum, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Solanum melongena, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium, Solanum lycopersicum Theobroma cacao oder Camellia sinensis.
Anacardiaceae wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium z. B. die Spezies Pistacia vera [Pistazie], Mangifer indica [Mango] oder Anacardium occidentale [Cashew]; Asteraceae wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana z. B. die Spezies Calendula officinalis [Marigold], Carthamus tinctorius [Saflor], Centaurea cyanus [Kornblume], Cichorium intybus [Kapaster], Cynara scolymus [Artischocke], Helianthus annus [Sonnenblume], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scanola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [Kopfsalat], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia [Marigold]; Apiaceae wie the genera Daucus z. B. die Spezies Daucus carota [Karotte]; Betulaceae wie die Gatttungen Corylus z. B. die Spezies Corylus avellana oder Corylus columa [Haselnuss]; Boraginaceae wie die Gattungen Borago z. B. die Spezies Borago officinalis [Borretsch]; Brassicaceae wie die Gattungen Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis z. B. die Spezies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölraps, Rübsamen], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterrübe] oder Arabidopsis thaliana; Bromeliaceae wie die Gattungen Anana, Bromelia z. B. die Spezies Anana comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa [Ananas]; Caricaceae wie die Gattungen Carica z. B. die Spezies Carica papaya [Papaya]; Cannabaceae wie die Gattungen Cannabis z. B. die Spezies Cannabis sative [Hanf], Convolvulaceae wie die Gattungen Ipomea, Convolvulus z. B. die Spezies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus [Süßkartoffel, Prunkwinde, Wildkartoffel], Chenopodiaceae wie die Gattungen Beta, d. h. die Spezies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckcerrübe]; Cucurbitaceae wie die Gattungen Cucubita z. B. die Spezies Cucurbita maxima, Cucurbita mixte, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata [Kürbis/Speisekürbis]; Elaeagnaceae wie die Gattungen Elaeagnus z. B. die Spezies Olea europaea [Olive]; Ericaceae wie die Gattungen Kalmia z. B. die Spezies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Amerikanischer Lorbeer, Breitblättriger Lorbeer, Kalikobusch, Berglorbeer, Schaflorbeer, Alpenlorbeer, Moorlorbeer, Westlicher Moorlorbeer, Sumpflorbeer]; Euphorbiaceae wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus z. B. die Spezies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Maniok, Pfeilwurz, Tapioka, Maniokstrauch] oder Ricinus communis [Rizinus, Rizinusölbusch, Rizinusölpflanze, Christuspalme, Wunderbaum]; Fabaceae wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja z. B. die Spezies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimose julibrissin, Mimose speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimose lebbeck, Mimose speciosa [Bastard Logwood, Seidenbaum, Ostindische Walnuss], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [Luzerne] Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne]; Geraniaceae wie die Gattungen Pelargonium, Cocos, Oleum z. B. die Spezies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides oder Oleum cocois [Kokosnuss]; Gramineae wie die Gattungen Saccharum z. B. die Spezies Saccharum officinarum; Juglandaceae wie die Gattungen Juglans, Wallia z. B. die Spezies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyl, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallia nigra [Walnuss, Schwarze Walnuss, gemeine Walnuss, Persische Walnuss, Weiße Walnuss, Butternuss, Schwarze Walnuss]; Lauraceae wie die Gattungen Persea, Laurus z. B. die Spezies laurel Laurus nobilis [Lorbeer, Lorbeerbaum], Persea americana Persea americana, Persea gratissima oder Persea persea [Avocado]; Leguminosae wie die Gattungen Arachis z. B. die Spezies Arachis hypogaea [Erdnuss]; Linaceae wie die Gattungen Linum, Adenolinum z. B. die Spezies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum [Flachs, Leinsamen]; Lythrarieae wie die Gattungen Punica z. B. die Spezies Punica granatum [Granatapfel]; Malvaceae wie die Gattungen Gossypium z. B. die Spezies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi [Baumwolle]; Musaceae wie die Gattungen Musa z. B. die Spezies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [Banane]; Onagraceae wie die Gattungen Camissonia, Oenothera z. B. die Spezies Oenothera biennis oder Camissonia brevipes [Primel, Nachtkerze]; Palmae wie die Gattungen Elacis z. B. die Spezies Elaeis guineensis [Ölpalme]; Papaveraceae wie die Gattungen Papaver z. B. die Spezies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [Mohn, Türkenmohn, Klatschmohn, Wilder Mohn, Mohnblume, Feldmohn, Saatmohn]; Pedaliaceae wie die Gattungen Sesamum z. B. die Spezies Sesamum indicum [Sesam]; Piperaceae wie die Gattungen Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia z. B. die Spezies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata. [Cayennepfeffer, Wilder Pfeffer]; Poaceae wie die Gattungen Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea, Triticum z. B. die Spezies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [Gerste, Rollgerste, Mähnengerste, Mäusegerste, Wiesengerste], Secale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [Hafer], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cemuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum millet, Panicum militaceum [Sorghum, Hirse], Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [Mais] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybemum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare [Weizen, Brotweizen, gemeiner Weizen], Proteaceae wie die Gattungen Macadamia z. B. die Spezies Macadamia intergrifolia [Macadamia]; Rubiaceae wie die Gattungen Coffea z. B. die Spezies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee]; Scrophulariaceae wie die Gattungen Verbascum z. B. die Spezies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus [Königskerze, Heidefackel-Königskerze, Chaix-Königskerze, Großblütige Königskerze, Seidenhaar-Königskerze, Langblättrige Königskerze, Mehlige Königskerze, Schwarze Königskerze, Kandelaber-Königskerze, Windblumen-Königskerze, Violette Königskerze, Flockige Königskerze, Große Königskerze]; Solanaceae wie die Gattungen Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon z. B. die Spezies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [Pfeffer], Capsicum annuum [Paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak], Solanum tuberosum [Kartoffel], Solanum melongena [Aubergine] (Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum [Tomate]; Sterculiaceae wie die Gattungen Theobroma z. B. die Spezies Theobroma cacao [Kakao]; Theaceae wie die Gattungen Camellia z. B. die Spezies Camellia sinensis) [Tee].
Die Einführung der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung, der Expressionskassette oder des Vektors in Organismen, zum Beispiel Pflanzen, kann im Prinzip nach allen Methoden erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. Die Einführung der Nukleinsäuresequenzen führt zu den rekombinanten oder transgenen Organismen.
Falls nicht anders angegeben, sind die Begriffe ”Polynukleotide”, ”Nukleinsäure” und ”Nukleinsäuremolekül”, wie hierin verwendet, untereinander austauschbar. Falls nicht anders angegeben, sind die Begriffe ”Peptide”, ”Polypeptid” und ”Protein” im vorliegenden Zusammenhang untereinander austauschbar. Der Begriff ”Sequenz” kann sich auf Polynukleotide, Nukleinsäuren, Nukleinsäuremoleküle, Peptide, Polypeptide und Proteine beziehen, abhängig vom Zusammenhang in dem der Begriff ”Sequenz” verwendet wird. Die Begriffe ”Gen(e)”, ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäuresequenz”, ”Nukleotidsequenz” oder ”Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine polymere Form von Nukleotiden beliebiger Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide. Die Begriffe beziehen sich nur auf die primäre Struktur des Moleküls.
Somit beinhalten die Begriffe ”Gen(e)”, ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäuresequenz”, ”Nukleotidsequenz” oder ”Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, doppel- und einsträngige DNA und RNA. Sie enthalten auch bekannte Arten von Modifizierungen, zum Beispiel Methylierung, ”Kappen”, Substitutionen einer oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog. Vorzugsweise umfasst die DNA- oder RNA-Sequenz der Erfindung eine Kodierungssequenz, die für das hierin definierte Polypeptid kodiert.
Eine ”Kodierungssequenz” ist eine Nukleotidsequenz, die in mRNA transkribiert und/oder in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der Kodierungssequenz werden durch ein Translationsstartkodon am 5'-Terminus und ein Translationsstoppkodon am 3'-Terminus bestimmt. Die Tripletts taa, tga und tag stellen die (üblichen) Stoppkodons dar, die untereinander austauschbar sind. Eine Kodierungssequenz kann, ohne aber darauf beschränkt zu sein, mRNA, cDNA, rekombinante Nukleotidsequenzen oder genomische DNA enthalten, während Introns ebenso unter gewissen Umständen vorhanden sein können.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Dabei werden die Verfahren, die für die Transformation und Regenerierung von Pflanzen aus Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen beschrieben sind, für eine transiente oder stabile Transformation verwendet. Geeignete Methoden sind Protoplasttransformation durch Poly(ethylenglycol)-induzierte DNA Aufnahme, die ”biolistische” Methode unter Verwendung der Genkanone – bezeichnet als die Teilchenbombardementmethode, Elektroporation, die Inkubation von trockenen Embryos in DNA Lösung, Mikroinjektion und Gentransfer vermittelt durch Agrobacterium. Die Methoden sind zum Beispiel in Jenes B. et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung S. D und Wu R., Academic Press (1993) 128–143 und in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991) beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, die bzw. das exprimiert werden soll(en), werden bzw. wird vorzugsweise in einen Vektor geklont, der zur Transformation von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)). Agrobacteria, die durch einen solchen Vektor transformiert sind, können dann in bekannter Weise für die Transformation von Pflanzen, insbesondere von Nutzpflanzen verwendet werden, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, zum Beispiel indem zerquetschte Blätter oder geschnittene Blätter in einer agrobakteriellen Lösung gebadet und dann in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. 16, 9877 (1988) beschrieben und ist unter anderen von White F. F., Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Manipulation von and Utilization, Hrsg. Kung S. D. und Wu R., Academic Press, 1993, pp. 15–38, bekannt.
Agrobacteria, die durch einen Expressionsvektor gemäß der Erfindung transformiert werden, können ebenso in bekannter Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie Testpflanzen, wie Arabidopsis, oder Nutzpflanzen, wie Getreidepflanzen, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Sojabohne, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomaten, Karotten, Paprika, Ölraps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Luzerne, Kopfsalat und verschiedene Baum-, Nuss- und Weinspezies, insbesondere Öl enthaltende Nutzpflanzen wie Sojabohne, Erdnuss, Rizinusölpflanze, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Ölraps, Kokosnuss, Ölpalme, Saflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, oder insbesondere Mais, Weizen, Sojabohne, Reis, Baumwolle und Canola, z. B. indem zerquetschte Blätter oder zerschnittene Blätter in einer agrobakterielle Lösung gebadet und dann in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen könnten durch alle Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, regeneriert werden. Geeignete Methoden finden sich in den oben angeführten Veröffentlichungen von Kung S. D. und Wu R., Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
Daher betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung transgene Organismen, die durch mindestens eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette oder einen Vektor gemäß der Erfindung transformiert sind, wie auch Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile – wie, zum Beispiel, Blätter, Wurzeln, usw. im Fall von Pflanzenorganismen- oder reproduktives Material, das von solchen Organismen abgeleitet ist Die Begriffe ”Wirtsorganismus”, ”Wirtszelle”, ”rekombinanter (Wirts-)Organismus” und ”transgene (Wirts-)Zelle” werden hierin untereinander austauschbar verwendet Natürlich betreffen diese Begriffe nicht nur den besonderen Wirtsorganismus oder die besonderes Target-Zelle, sondern auch die Abkömmlinge oder möglichen Abkömmlinge dieser Organismen oder Zellen. Da aufgrund der Mutation oder Umweltwirkungen gewisse Modifizierungen in folgenden Generationen auftreten können, müssen diese Abkömmlinge nicht unbedingt mit der elterlichen Zelle identisch sein, sind aber dennoch noch immer in dem Begriff wie hier verwendet enthalten.
Für die Zwecke der Erfindung bezeichnet ”transgen” oder ”rekombinant” in Bezug auf zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette (= ein Genkonstrukt, Nukleinsäurekonstrukt) oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung enthält, oder einen Organismus, der durch die Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassette oder den Vektor gemäß der Erfindung transformiert ist, all jene Konstruktionen, die durch genetische Manipulationsmethoden erhalten werden, in welchen (a) die Nukleinsäuresequenz, die in Tabelle I, Anwendung Nr. 1, Spalte 5 oder 7 dargestellt ist, oder ihre Derivate oder Teile davon; oder (b) eine genetische Kontrollesequenz, die funktionell an die Nukleinsäuresequenz gebunden ist, die unter (a) beschrieben ist, zum Beispiel eine 3'- und/oder 5'-genetische Kontrollesequenz, wie einen Promotor oder Terminator, oder (c): (a) und (b); nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umwelt vorgefunden werden oder durch genetische Manipulationsmethoden modifiziert wurden, wobei die Modifizierung zum Beispiel eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Natürliche genetische Umwelt bezeichnet den natürlichen genomischen oder chromosomalen Lokus im Organismus des ursprünglichen oder im Inneren des Wirtsorganismus oder das Vorhandensein in einer genomischen Bibliothek. Im Falle einer genomischen Bibliothek wird die natürliche genetische Umwelt der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umwelt begrenzt die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, vorzugsweise mindestens 500 bp, insbesondere mindestens 1000 bp, besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung mit dem entsprechenden Gen – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn letztgenannte durch unnatürliche, synthetische (”künstliche”) Methoden modifiziert ist, wie zum Beispiel eine Mutagenation. Zweckdienliche Methoden sind zum Beispiel in US 5,565,350 oder WO 00/15815 beschrieben.
Geeignete Organismen oder Wirtsorganismen für die Nukleinsäure, Expressionskassette oder den Vektor gemäß der Erfindung sind vorteilhaft im Prinzip alle Organismen, die für die Expression von rekombinanten Genen geeignet sind, wie oben beschrieben. Weitere Beispielen, die erwähnt werden können, sind Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Nutzpflanzen wie Sojabohne, Erdnuss, Rizinusölpflanze, Sonnenblume, Flachs, Mais, Baumwolle, Flachs, Ölraps, Kokosnuss, Ölpalme, Saflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind Wirtspflanzen für die Nukleinsäure, Expressionskassette oder den Vektor gemäß der Erfindung aus der Gruppe ausgewählt, die Mais, Soja, Ölraps (einschließlich Canola und Winterölraps), Baumwolle, Weizen und Reis umfasst.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung betrifft die Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts, z. B. einer Expressionskassette, das eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die für eines oder mehrere Polypeptide kodiert, die in Tabelle II dargestellt sind, oder ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle umfasst, wie in Tabelle I angeführt, oder Kodierungs- oder DNA-Sequenzen, die damit hybridisieren, für die Transformation von Pflanzenzellen, Geweben oder Teilen von Pflanzen.
Dabei können die Nukleinsäuremoleküle oder Sequenzen, die in Tabelle I oder II dargestellt sind, abhängig von der Wahl des Promotors, spezifisch in den Blättern, in den Samen, den Nodula, in Wurzeln, im Stängel oder anderen Teilen der Pflanze exprimiert werden. Diese transgenen Pflanzen, die Sequenzen, z. B. wie in Tabelle I angeführt, überproduzieren, das reproduktive Material davon, gemeinsam mit Pflanzenzellen, Geweben oder Teilen davon, sind eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung.
Die Expressionskassette oder die Nukleinsäuresequenzen oder das Konstrukt gemäß der Erfindung, enthaltend Nukleinsäuremoleküle oder Sequenzen gemäß Tabelle I können ferner auch für die Transformation der Organismen verwendet werden, die zum Beispiel oben identifiziert wurden, wie Bakterien, Hefe, filamentöse Pilze und Pflanzen.
Innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung betrifft erhöhter Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel das künstlich erworbene Merkmal eines erhöhten Ertrags, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrags und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu den nicht genetisch modifizierten, anfänglichen Pflanzen z. B. das Merkmal, das durch genetische Modifizierung des Target-Organismus und aufgrund der funktionellen Überexpression eines oder mehrerer Polypeptide (Sequenzen) von Tabelle II, z. B. kodiert durch die entsprechenden Nukleinsäuremoleküle, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 angeführt, und/oder Homologe in den Organismen gemäß der Erfindung erworben wird, vorzugsweise in den transgenen Pflanze gemäß der Erfindung oder nach dem Verfahren der Erfindung erzeugt wird, zumindest für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.
Eine konstitutive Expression der Polypeptidsequenzen von Tabelle II, kodiert durch das entsprechenden Nukleinsäuremolekül, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 angeführt, und/oder der Homologe, ist ferner vorteilhaft. Andererseits jedoch kann eine induzierbare Expression auch nach Wunsch auftreten. Die Expression der Polypeptidsequenzen der Erfindung kann direkt an dem Zytoplasma oder den Organellen, vorzugsweise den Plastiden der Wirtszellen, vorzugsweise den Pflanzenzellen erfolgen.
Die Effizienz der Expression der Sequenzen von Tabelle II, kodiert durch das entsprechende Nukleinsäuremolekül, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 angeführt, und/oder der Homologe kann zum Beispiel in vitro durch Sprossmeristemvermehrung bestimmt werden. Zusätzlich können die Expression der Sequenzen von Tabelle II, kodiert durch das entsprechende Nukleinsäuremolekül, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 angeführt, und/oder der Homologe, die in der Natur modifiziert sind, und das Ausmaß und seine Auswirkung auf den Ertrag, z. B. auf ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, aber auch auf die Leistung der metabolischen Pfade, an Testpflanzen in Glashausversuchen getestet werden.
Eine zusätzliche Aufgabe der Erfindung umfasst transgene Organismen wie transgene Pflanzen, die durch eine Expressionskassette transformiert sind, die Sequenzen, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 angeführt, gemäß der Erfindung oder DNA-Sequenzen, die damit hybridisieren, wie auch transgene Zellen, Gewebe, Teile und Reproduktionsmaterial von solchen Pflanzen enthält. Besondere Präferenz wird in diesem Fall transgenen Nutzpflanzen verliehen, wie zum Beispiel Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Sojabohne, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Ölraps und Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Distel, Kartoffel, Tabak, Tomaten, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Luzerne, Kopfsalat und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspezies.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind transgene Pflanzen, die durch eine Expressionskassette transformiert sind, die Nukleinsäuremoleküle oder Sequenzen, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 angeführt, insbesondere von Tabelle IIB, enthält oder umfasst, gemäß der Erfindung oder DNA-Sequenzen, die damit hybridisieren, aus der Gruppe ausgewählt, die Mais, Soja, Ölraps (einschließlich Canola und Winterölraps), Baumwolle, Weizen und Reis umfasst.
Für die Zwecke der Erfindung sind Pflanzen mono- und dikotyledone Pflanzen, Moose oder Algen, insbesondere Pflanzen, zum Beispiel in einer Ausführungsform monokotyledone Pflanzen, oder zum Beispiel in einer anderen Ausführungsform dikotyledone Pflanzen. Eine weitere Verfeinerung gemäß der Erfindung sind transgene Pflanzen, wie oben beschrieben, die eine Nukleinsäuresequenz oder ein Konstrukt gemäß der Erfindung oder eine Expressionskassette gemäß der Erfindung enthalten.
Transgen bedeutet jedoch auch, dass die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an ihrer natürlichen Position im Genom eines Organismus angeordnet sind, aber dass die Sequenz, z. B. die Kodierungssequenz oder eine regulatorische Sequenz, zum Beispiel die Promotorsequenz, im Vergleich zu der natürlichen Sequenz modifiziert wurde. Vorzugsweise sollen transgen/rekombinant die Transkription einer oder mehrerer Nukleinsäuren oder Moleküle der Erfindung bedeuten und treten, wie in Tabelle I dargestellt, an einer nicht natürlichen Position im Genom auf. In einer Ausführungsform ist die Expression der Nukleinsäuren oder Moleküle homolog. In einer anderen Ausführungsform ist die Expression der Nukleinsäuren oder Moleküle heterolog. Diese Expression kann transient oder von einer Sequenz sein, die stabil in das Genom integriert ist.
Der Begriff ”transgene Pflanzen”, der gemäß der Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf die Nachkommen einer transgenen Pflanze, zum Beispiel die T1, T2, T3 und folgende Pflanzengenerationen oder die BC1, BC2, BC3 und folgende Pflanzengenerationen. Somit können transgene Pflanzen gemäß der Erfindung gezüchtet und vereinzelt oder mit anderen Individuen gekreuzt werden, um weitere transgene Pflanzen gemäß der Erfindung zu erhalten. Transgene Pflanzen könnten auch durch vegetative Vermehrung transgener Pflanzenzellen erhalten werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch transgenes Pflanzenmaterial, das von einer transgenen Pflanzenpopulation gemäß der Erfindung abgeleitet sein kann. Ein solches Material enthält Pflanzenzellen und gewisse Gewebe, Organe und Teile von Pflanzen in allen ihren Manifestationen, wie Samen, Blätter, Staubbeutel, Fasern, Knollen Wurzeln, Wurzelhaare, Stängel, Embryo, Kalli, Kotelydonen, Blattstiele, geerntetes Material, Pflanzengewebe, reproduktives Gewebe und Zellkulturen, die von der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet sind und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen. Jede transformierte Pflanze, die gemäß der Erfindung erhalten wird, kann in einem herkömmlichen Vermehrungsschema oder in einer in vitro Pflanzevermehrung verwendet werden, um mehrere transformierte Pflanzen mit denselben Eigenschaften zu erzeugen und/oder kann zum Einführen derselben Eigenschaft in andere Varietäten derselben oder verwandte Spezies verwendet werden. Solche Pflanzen sind auch Teil der Erfindung. Samen, die von den transformierten Pflanzen erhalten werden, enthalten genetisch auch dieselbe Eigenschaft und sind Teil der Erfindung. Wie zuvor erwähnt, ist die vorliegende Erfindung im Prinzip bei jeder Pflanze und bei Nutzpflanzen anwendbar, die mit einer der Transformationsmethoden transformiert werden können, die dem Fachmann bekannt sind.
Vorteilhafte induzierbare Pflanzenpromotoren sind zum Beispiel der PRP1 Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22361 (1993)), ein Promotor, der durch Benzolsulfonamid induzierbar ist ( EP 388 186 ), ein Promotor der durch Tetracyclin induzierbar ist (Gatz et al., Plant. J. 2, 397 (1992)), ein Promotor, der durch Salicylsäure induzierbar ist ( WO 95/19443 ), ein Promotor, der durch Abscisinsäure induzierbar ist ( EP 335 528 ) und ein Promotor, der durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbar ist ( WO 93/21334 ). Andere Beispiele für Pflanzenpromotoren, die vorteilhaft verwendet werden können, sind der Promotor von zytoplasmatischer FBPase von Kartoffel, der ST-LSI Promotor von Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445 (1989)), der Promotor von Phosphoribosyl-pyrophosphat-Amidotransferase von Glycine max (siehe auch Genbank-Zugriffsnummer U87999) oder ein Nodien-spezifischer Promotor, wie in EP 249 676 beschrieben.
Besonders vorteilhaft sind jene Promotoren, die eine Expression beim Einsetzen von abiotischen Stressbedingungen garantieren. Besonders vorteilhaft sind jene Promotoren, die eine Expression beim Einsetzen von Niedertemperaturbedingungen garantieren, z. B. beim Einsetzen von Kälte- und/oder Gefriertemperaturen, wie hierin oben definiert, z. B. für die Expression von Nukleinsäuremolekülen, wie in Tabelle VIIIb angeführt. Vorteilhaft sind jene Promotoren, die eine Expression bei Bedingungen einer begrenzten Nährstoffverfügbarkeit garantieren, z. B. dem Einsetzen begrenzter Stickstoffquellen, wenn der Stickstoff der Erde oder des Nährstoffs erschöpft ist, z. B. für die Expression der Nukleinsäuremoleküle oder deren Genprodukte, wie in Tabelle Villa angeführt. Besonders vorteilhaft sind jene Promotoren, die eine Expression beim Einsetzen eines Wassermangels, wie hier oben definiert, garantieren z. B. für die Expression der Nukleinsäuremoleküle oder ihrer Genprodukte, wie in Tabelle VIIIc angeführt. Besonders vorteilhaft sind jene Promotoren, die eine Expression beim Einsetzen von Standardwachstumsbedingungen garantieren, z. B. unter stressfreien Bedingung und ohne mangelnde Nährstoffbereitstellung, z. B. für die Expression der Nukleinsäuremoleküle oder deren Genprodukte, wie in Tabelle VIIId angeführt.
Solche Promotoren sind dem Fachmann bekannt oder können von Genen isoliert werden, die unter den oben genannten Bedingungen induziert werden. In einer Ausführungsform können samenspezifische Promotoren für monokotylodone oder dikotylodone Pflanzen verwendet werden.
Im Prinzip können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulierungsequenzen, wie die oben genannten, für die Expressionskassette gemäß der Erfindung und das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden. Ferner können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden. In der Herstellung einer Expressionskassette können verschiedene DNA Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotidsequenz zu erhalten, die zweckdienlich in die richtige Richtung liest und mit einem korrekten Leserahmen ausgestattet ist. Zur Verbindung der DNA Fragmente (= Nukleinsäuren gemäß der Erfindung) miteinander, können andere Adapteren oder Linker an den Fragmenten angebracht werden. Die Promotor- und die Terminatorregionen können zweckdienlich in der Transkriptionsrichtung bereitgestellt werden, mit einem Linker oder Polylinker, der einen oder mehrere Restriktionspunkte für die Insertion dieser Sequenz enthält. Im Allgemeinen hat der Linker 1 bis 10, insbesondere 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionspunkte. Im Allgemeinen ist die Große des Linkers im Inneren der regulatorischen Region weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, aber mindestens 5 bp. Der Promotor könnte sowohl nativ oder homolog wie auch fremd oder heterolog zu dem Wirtsorganismus, zum Beispiel der Wirtspflanze sein. In der 5'-3' Transkriptionsrichtung enthält die Expressionskassette den Promotor, eine DNA-Sequenz, die in Tabelle I dargestellt ist, und eine Region für die Transkriptionstermination. Verschiedene Terminationsregionen können in jeder gewünschten Weise gegenseitig ausgetauscht werden.
Wie hierin verwendet, sollen die Begriffe ”Nukleinsäure” und ”Nukleinsäuremolekül” DNA Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA) und Analoge der DNA oder RNA enthalten, die mit Hilfe von Nukleotidanalogen erzeugt wurden. Dieser Begriff umfasst auch eine untranslatierte Sequenz, die sich sowohl am 3' wie auch 5' Ende der Kodierungsregion des Gens befindet – mindestens etwa 1000 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5' Endes der Kodierungsregion und mindestens etwa 200 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3' Endes der Kodierungsregion des Gens. Das Nukleinsäuremolekül kann einsträngig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise doppelsträngige DNA.
Ein ”isoliertes” Nukleinsäuremolekül ist jenes, das im Wesentlichen von anderen Nukleinsäuremolekülen getrennt ist, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorhanden sind. Dies bedeutet, dass andere Nukleinsäuremoleküle in einer Menge von weniger als 5%, basierend auf dem Gewicht der Menge der gewünschten Nukleinsäure, vorzugsweise weniger als 2% nach dem Gewicht, insbesondere weniger als 1% nach dem Gewicht, ganz besonders weniger als 0,5% nach dem Gewicht vorhanden sind. Vorzugsweise ist eine ”isolierte” Nukleinsäure frei von einigen der Sequenzen, die von Natur aus die Nukleinsäure (d. h., Sequenzen, die am 5' und 3' Ende der Nukleinsäure vorhanden sind) in der genomischen DNA des Organismus flankieren, von dem die Nukleinsäure abgeleitet ist. Zum Beispiel kann in verschiedenen Ausführungsformen das Ertrags erhöhende, zum Beispiel, Niedertemperaturresistenz- und/oder Toleranz-bezogene Protein (YRP), das für das Nukleinsäuremolekül kodiert, weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen enthalten, die von Natur aus das Nukleinsäuremolekül in genomischer DNA der Zelle flankieren, von der die Nukleinsäure abgeleitet ist. Ferner kann ein ”isoliertes” Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA Molekül, frei von einigem des anderen zellularen Materials sein, mit dem sie von Natur aus assoziiert ist, oder frei von Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken erzeugt wird, oder chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, z. B. ein Nukleinsäuremolekül, des für ein YRP oder einen Teil davon kodiert, das bzw. der einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, z. B. eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress und/oder erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder verstärkte zyklierende Dürretoleranz in Pflanzen, kann unter Verwendung von standardmäßigen, molekularbiologischen Techniken und der hierin bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Zum Beispiel kann eine A. thaliana YRP kodierende cDNA aus einer A. thaliana c-DNA Bibliothek isoliert werden, oder eine Synechocystis sp., Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa YRP kodierende cDNA kann von einer Synechocystis sp., Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa c-DNA Bibliothek isoliert werden, wobei jeweils die gesamten oder ein Teil einer der Sequenzen verwendet wird, die in Tabelle I dargestellt sind. Ferner kann ein Nukleinsäuremolekül, dass die gesamten oder einen Teil einer der Sequenzen von Tabelle I umfasst, durch die Polymerase Kettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern isoliert werden, die auf der Basis dieser Sequenz gestaltet werden. Zum Beispiel kann mRNA von Pflanzenzellen isoliert werden (z. B. durch die Guanidinium-Thiocyanat-Extraktionsprozedur von Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)) und cDNA kann unter Verwendung einer reversen Transkriptase hergestellt werden (z. B. Moloney MLV reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Synthetische Oligonukleotid-Primer für die Polymerase Kettenreaktionsamplifizierung können auf der Basis einer der Nukleotidsequenzen gestaltet werden, die in Tabelle I dargestellt sind. Ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung kann unter Verwendung von cDNA oder alternativ genomischer DNA als Template und geeigneter Oligonukleotid-Primers nach Standard PCR Amplifizierungstechniken hergestellt werden. Das derart amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen geeigneten Vektor geklont und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Ferner können Oligonukleotide, die einer YRP kodierenden Nukleotidsequenz entsprechen, durch synthetische Standardtechniken hergestellt werden, z. B. unter Verwendung eines automatisierten DNA Synthesizers.
In einer Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine(s) der Nukleotidsequenzen oder Moleküle, wie in Tabelle I angeführt, die für das YRP kodieren (d. h., die ”Kodierungsregion”), wie auch eine 5' untranslatierte Sequenz und 3' untranslatierte Sequenz.
Ferner kann das Nukleinsäuremolekül der Erfindung nur einen Teil der Kodierungsregion einer der Sequenzen oder Moleküle einer Nukleinsäure von Tabelle I umfassen, zum Beispiel ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, das für einen biologisch aktiven Teil eines YRP kodiert.
Teile von Proteinen, die durch die YRP kodierenden Nukleinsäuremoleküle der Erfindung kodiert sind, sind vorzugsweise biologisch aktive Teile, wie hierin beschrieben. Wie hierin verwendet, soll der Begriff ”biologisch aktiver Teil” eines YRP einen Teil, z. B. eine Domäne/ein Motiv beinhalten, das einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. eine erhöhtes oder verstärktes ertragsbezogenes Merkmal, z. B. eine erhöhte Niedertemperaturresistenz und/oder -toleranz in eine Pflanze. Zur Bestimmung, ob ein YRP oder ein biologisch aktiver Teil davon zu einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten oder verstärkten ertragsbezogenen Merkmal führt, z. B. einer erhöhten Niedertemperaturresistenz und/oder -toleranz, könnte eine Analysis einer Pflanze, die das YRP enthält, durchgeführt werden. Solche Analysemethoden sind dem Fachmann gut bekannt, wie in den Beispielen genauer beschrieben. Insbesondere können Nukleinsäurefragmente, die für biologisch aktive Teile eines YRP kodieren, durch Isolieren eines Teils einer der Sequenzen der Nukleinsäure von Tabelle I, der den kodierten Teil des YRP oder Peptids exprimiert (z. B. durch rekombinante Expression in vitro) und Bewerten der Aktivität des kodierten Teils des YRP oder Peptids hergestellt werden.
Biologisch aktive Teile eines YRP sind in der vorliegenden Erfindung enthalten und beinhalten Peptide, die Aminosäuresequenzen umfassen, die von der Aminosäuresequenz eines YRP kodierenden Gens, oder der Aminosäuresequenz eines Proteins homolog zu einem YRP abgeleitet sind, die weniger Aminosäuren als ein YRP voller Länge oder das Protein voller Länge enthalten, das zu einem YRP homolog ist, und mindestens eine gewisse enzymatische oder biologische Aktivität eines YRP aufweist. Für gewöhnlich umfassen biologisch aktive Teile (z. B. Peptide, die zum Beispiel, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39,40, 50, 100 oder mehrere Aminosäuren lang sind) eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität eines YRP. Ferner können andere biologisch aktive Teile, in welchen andere Regionen des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Techniken hergestellt und auf eine oder mehrere der hierin beschriebenen Aktivitäten ausgewertet werden. Vorzugsweise enthalten die biologisch aktiven Teile eines YRP eine oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive oder Teile davon mit biologischer Aktivität.
Der Begriff ”biologisch aktiver Teil” oder ”biologische Aktivität” bedeutet ein Polypeptid, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, oder einen Teil des Polypeptids, der noch immer mindestens 10% oder 20%, vorzugsweise 30%, 40%, 50% oder 60%, insbesondere 70%, 75%, 80%, 90% oder 95% der enzymatischen oder biologischen Aktivität des natürlichen oder Ausgangsenzyms oder Proteins aufweist.
In dem Prozess gemäß der Erfindung können Nukleinsäuresequenzen oder Moleküle verwendet werden, die, falls zutreffend, synthetische, nicht natürliche oder modifizierte Nukleotidbasen enthalten, die in DNA oder RNA eingefügt werden können. Die synthetischen, nicht natürlichen oder modifizierten Basen können zum Beispiel die Stabilität des Nukleinsäuremoleküls außerhalb oder innerhalb einer Zelle erhöhen. Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können dieselben Modifizierungen wie oben angeführt enthalten.
Wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet, könnte der Begriff ”Nukleinsäuremolekül” auch die untranslatierte Sequenz oder das Molekül umfassen, die bzw. das am 3' und am 5' Ende der Kodierungsgenregion liegt, zum Beispiel mindestens 500, vorzugsweise 200, insbesondere vorzugsweise 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5' Endes der Kodierungsregion und mindestens 100, vorzugsweise 50, insbesondere 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3' Endes der Kodierungsgenregion. Es ist häufig vorteilhaft, nur die Kodierungsregion für Klonierungs- und Expressionszwecke zu wählen.
Vorzugsweise ist das Nukleinsäuremolekül, das in dem Prozess gemäß der Erfindung verwendet wird, oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül. In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül der Erfindung das Nukleinsäuremolekül, das in dem Prozess der Erfindung verwendet wird.
Ein ”isoliertes” Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül wird von anderen Polynukleotiden oder Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle des Nukleinsäuremoleküls vorhanden sind. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül könnte ein chromosomales Fragment von mehreren kb sein, oder vorzugsweise ein Molekül, das nur die Kodierungsregion des Gens umfasst. Daher könnte ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung chromosomale Regionen umfassen, die neben 5' und 3' oder noch näher bei chromosomalen Regionen liegen, aber umfasst vorzugsweise keine solchen Sequenzen, die von Natur aus die Nukleinsäuremolekülsequenz im genomischen oder chromosomalen Zusammenhang im Organismus flankieren, von dem das Nukleinsäuremolekül stammt (zum Beispiel Sequenzen, die neben den Regionen liegen, die für die 5'- und 3'-UTRs des Nukleinsäuremoleküls kodieren). In verschiedenen Ausführungsformen könnte das isolierte Nukleinsäuremolekül, das in dem Prozess gemäß der Erfindung verwendet wird, zum Beispiel weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen umfassen, die von Natur aus das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle flankieren, von der das Nukleinsäuremolekül stammt.
Die Nukleinsäuremoleküle, die in dem Prozess verwendet werden, zum Beispiel das Polynukleotid der Erfindung oder ein Teil davon, können unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hierin bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Ebenso können auch zum Beispiel eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzregionen auf DNA oder Aminosäureebene mit Hilfe von Vergleichsalgorithmen identifiziert werden. Erstgenannte kann als Hybridisierungsonden in Standardhybridisierungstechniken (zum Beispiel jenen, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, beschrieben sind) zur Isolierung weiterer Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, die in diesem Prozess nützlich sind.
Ein Nukleinsäuremolekül, das eine vollständige Sequenz der Nukleinsäuremoleküle umfasst, die in dem Prozess verwendet werden, zum Beispiel des Polynukleotids der Erfindung oder eines Teils davon, kann zusätzlich durch Polymerase-Kettenreaktion isoliert werden, wobei Oligonukleotid-Primer, die auf dieser Sequenz oder auf Teilen davon basieren verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Nukleinsäuremolekül, das die vollständige Sequenz oder einen Teil davon umfasst, durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern isoliert werden, die auf der Basis eben dieser Sequenz erzeugt wurden. Zum Beispiel kann mRNA von Zellen isoliert werden (zum Beispiel mit Hilfe der Guanidinium-Thiocyanat-Extraktionsmethode von Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)) und cDNA kann mit Hilfe der reversen Transkriptase erzeugt werden (zum Beispiel Moloney, MLV reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL).
Synthetische Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation, z. B. wie in Tabelle III, Spalte 7 angeführt, durch Polymerase-Kettenreaktion können auf der Basis einer hierin gezeigten Sequenz erzeugt werden, zum Beispiel der Sequenz, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 angeführt ist, oder der Sequenzen, die von Tabelle II, Spalte 5 und 7 abgeleitet sind.
Ferner ist es möglich, ein konserviertes Protein durch Ausführung von Proteinsequenzausrichtungen mit dem Polypeptid zu identifizieren, für das die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung kodieren, insbesondere mit den Sequenzen, für die das Nukleinsäuremolekül kodiert, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt ist, von welchen konservierte Regionen und wiederum degenerierte Primer abgeleitet werden können. Konservierte Regionen sind jene, die eine sehr geringe Variation in der Aminosäure in einer bestimmten Position von mehreren Homologen unterschiedlichen Ursprungs zeigen. Die Konsensussequenz und Polypeptidmotive, die in Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt sind, sind von den Ausrichtungen abgeleitet. Ferner ist es möglich, konservierte Regionen von verschiedenen Organismen zu identifizieren, indem Proteinsequenzausrichtungen mit dem Polypeptid ausgeführt werden, für das die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung kodiert, insbesondere mit den Sequenzen, für die das Polypeptidmolekül kodiert, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II angeführt ist, von welchen konservierten Regionen und wiederum degenerierte Primer abgeleitet werden können.
In einer vorteilhaften Ausführungsform ist in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung die Aktivität eines Polypeptids erhöht, das eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Tabelle IV, Spalte 7 dargestellt, umfasst oder aus diesem besteht, und in einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, das eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Tabelle IV, Spalte 7 angeführt, umfasst oder aus diesem besteht, wobei weniger als 20, vorzugsweise weniger als 15 oder 10, vorzugsweise weniger als 9, 8, 7 oder 6, insbesondere weniger als 5 oder 4, sogar bevorzugter weniger als 3, noch bevorzugter weniger als 2, sogar noch bevorzugter 0 der angegebenen Aminosäurepositionen durch eine beliebige Aminosäure sein werden können. In einer Ausführungsform sind nicht mehr als 15%, vorzugsweise 10%, noch bevorzugter 5%, 4%, 3%, oder 2%, besonders bevorzugt 1% oder 0% der Aminosäurepositionen, die durch einen Buchstaben angegeben sind, durch eine andere Aminosäure ersetzt. In einer Ausführungsform sind weniger als 20, vorzugsweise weniger als 15 oder 10, vorzugsweise weniger als 9, 8, 7 oder 6, bevorzugter weniger als 5 oder 4, noch bevorzugter weniger als 3, sogar noch bevorzugter weniger als 2, sogar noch bevorzugter 0 Aminosäuren in eine Konsensussequenz oder ein Proteinmotiv eingesetzt.
Die Konsensussequenz wurde von einer mehrfachen Ausrichtung der in Tabelle II angeführten Sequenzen abgeleitet. Die Buchstaben stellen den Aminosäurekode aus einem Buchstaben dar und zeigen, dass die Aminosäuren in mindestens 80% der ausgerichteten Proteine konserviert sind, während der Buchstabe X für Aminosäuren steht, die in mindestens 80% der ausgerichteten Sequenzen nicht konserviert sind. Die Konsensussequenz beginnt mit der ersten konservierten Aminosäure in der Ausrichtung, und endet mit der letzten konservierten Aminosäure in der Ausrichtung der untersuchten Sequenzen. Die Anzahl gegebener X zeigt die Abstände zwischen konservierten Aminosäureresten an, z. B. Y-x(21,23)-F bedeutet, dass konservierte Tyrosin- und Phenylalaninreste in der Ausrichtung voneinander durch mindestens 21 und maximal 23 Aminosäure Reste in der Ausrichtung aller untersuchten Sequenzen getrennt sind.
Konservierte Domänen wurden von allen Sequenzen identifiziert und sind mit Hilfe eines Teilsatzes der Prosite-Standardnotation beschrieben, z. B. bedeutet das Muster Y-x(21,23)-[FW], dass ein konserviertes Tyrosin mindestens 21 und höchstens 23 Aminosäurereste von entweder einem Phenylalanin oder Tryptophan getrennt ist. Die Muster mussten mit mindestens 80% der untersuchten Proteine übereinstimmen. Konservierte Muster wurden mit dem Software Tool MEME Version 3.5.1 oder manuell identifiziert. MEME wurde von Timothy L. Bailey und Charles Elkan, Dept. of Computer Science and Engeneering, University of California, San Diego, USA, entwickelt und ist von Timothy L. Bailey und Charles Elkan (Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference an intelligent Systems for Molecular Biology, S. 28–36, AAAI Press, Menlo Park, Kalifornien, 1994) beschrieben. Der Quellkode für das selbständige Programm ist öffentlich von dem San Diego Supercomputer Zentrum (http:/meme.sdsc.edu) erhältlich. Zur Identifizierung gemeinsamer Motive in allen Sequenzen mit dem Software Tool MEME wurden die folgenden Einstellungen verwendet: -maxsize 500000, -nmotifs 15, -evt 0,001, -maxw 60, -distance 1e-3, -minsites Anzahl der für die Analyse verwendeten Sequenzen. Die für MEME eingegebenen Sequenzen waren nicht ausgerichtete Sequenzen im Fasta-Format. Andere Parameter wurden in den vorgegebenen Einstellungen in dieser Software Version verwendet. Prosite-Muster für konservierte Domänen wurden mit dem Software Tool Pratt Version 2.1 oder manuell erzeugt. Pratt wurde von Inge Jonassen, Dept. of Informatics, University of Bergen, Norwegen, entwickelt und ist von Jonassen et al. beschrieben (I. Jonassen, J. F. Collins und D. G. Higgins, Finding flexible patterns in unaligned protein sequences, Protein Science 4 (1995), S. 1587–1595; I. Jonassen, Efficient discovery of conserved patterns using a pattern graph, eingereicht bei CABIOS Febr. 1997]. Der Quellkode (ANSI C) für das selbständige Programm ist öffentlich erhältlich, z. B. bei etablierten Bioinformatik Zentren, wie EBI (European Bioinformatics Institute). Zum Erzeugen von Mustern mit dem Software Tool Pratt wurden die folgenden Einstellungen verwendet: PL (max. Musterlänge): 100, PN (max. Anzahl von Mustersymbolen): 100, PX (max. Anzahl aufeinander folgender x): 30, FN (max. Anzahl flexibler Abstandshalter): 5, FL (max. Flexibilität): 30, FP (max. Flex. Produkt): 10, ON (max. Anzahl von Mustern): 50. Die für Pratt eingegebenen Sequenzen waren getrennte Regionen der Proteinsequenzen, die eine hohe Ähnlichkeit aufwiesen, wie durch das Software Tool MEME identifiziert. Die minimale Anzahl von Sequenzen, die mit den erzeugten Mustern übereinstimmen mussten (CM, min. Anzahl von Sequenzen für Übereinstimmung) wurde auf mindestens 80% der bereitgestellten Sequenzen eingestellt. Parameter, die hier nicht erwähnt sind, wurden in ihren vorgegebenen Einstellungen verwendet. Die Prosite-Mustern der konservierten Domänen können zur Suche nach Proteinsequenzen verwendet werden, die mit diesem Muster übereinstimmen. Verschiedene etablierte Bioinformatik Zentren bieten öffentliche Internet-Portale zur Verwendung dieser Muster in Datenbanksuchen (z. B. PIR (Protein Information Resource, am Georgetown University Medical Center) oder ExPASy (Expert Protein Analysis System)). Als Alternative ist eine selbständige Software erhältlich, wie das Programm Fuzzpro, das Teil des EMBOSS Softwarepakets ist. Zum Beispiel ermöglicht das Program Fuzzpro nicht nur die Suche nach einer exakten Muster-Protein Übereinstimmung, sondern ermöglicht auch die Einstellung verschiedener Zweideutigkeiten in der durchgeführten. Suche.
Die Ausrichtung wurde mit der Software ClustalW (Version 1.83) durchgeführt, die von Thompson et al. (Nucleic Acids Research 22, 4673 (1994)) beschrieben ist. Der Quellkode für das selbständige Programm ist öffentlich von dem European Molecular Biology Laboratory; Heidelberg, Deutschland, erhältlich. Die Analyse wurde unter Verwendung der vorgegebenen Parameter von ClustalW v1.83 durchgeführt (Gap Open Penalty: 10,0; Gap Extension Penalty: 0,2; Proteinmatrix: Gonnet; Protein/DNA endgap: -1; Protein/DNA gapdist: 4).
Degenerierte Primer können dann durch PCR für die Amplifikation von Fragmenten von neuartigen Proteinen mit der oben genannten Aktivität verwendet werden, z. B. die einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. das erhöhte ertragsbezogene Merkmal, insbesondere die verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, z. B. Niedertemperaturtoleranz, zyklierende Dürretoleranz, Wassernutzungseffizienz, Nährstoff-(z. B. Stickstoff-)- Nutzungseffizienz und/oder erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon nach dem Erhöhen der Expression oder Aktivität oder mit der Aktivität eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, oder weiterer funktioneller Homologe des Polypeptids der Erfindung von anderen Organismen.
Diese Fragmente können dann als Hybridisierungssonde zur Isolierung der vollständigen Gensequenz verwendet werden. Als eine Alternative können die fehlenden 5' und 3' Sequenzen mit Hilfe von RACE-PCR isoliert werden. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann unter Verwendung der cDNA oder als Alternative genomischen DNA als Template und geeigneter Qligonukleotid-Primer nach PCR Standardamplifizierungstechniken amplifiziert werden. Das amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann somit in einen geeigneten Vektor geklont und mit Hilfe einer DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einem der Nukleinsäuremoleküle entsprechen, das in dem Prozess verwendet wird, können durch Standardsynthesemethoden erzeugt werden, zum Beispiel unter Verwendung eines automatischen DNA Synthesizers.
Nukleinsäuremoleküle, die für den Prozess gemäß der Erfindung vorteilhaft sind, können auf der Basis ihrer Homologie mit den hierin offenbarten Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung der Sequenzen oder eines Teil davon, wie oder für die Erzeugung einer Hybridisierungssonde und nach Standardhybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. In diesem Zusammenhang ist es möglich, zum Beispiel ein oder mehrere isolierte Nukleinsäuremoleküle aus mindestens 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 oder mehr Nukleotiden, vorzugsweise aus mindestens 15, 20 oder 25 Nukleotiden Länge zu verwenden, die unter stringenten Bedingungen an die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle hybridisieren, insbesondere mit jenen, die eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls umfassen, das in dem Prozess der Erfindung verwendet wird oder für ein Protein kodiert, das in der Erfindung verwendet wird, oder des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung. Nukleinsäuremoleküle mit 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden können auch verwendet werden.
Der Begriff ”Homologie” bedeutet, dass die jeweiligen Nukleinsäuremoleküle oder kodierten Proteine funktionell und/oder strukturell äquivalent sind. Die Nukleinsäuremoleküle, die zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen homolog sind und die Derivate der Nukleinsäuremoleküle sind zum Beispiel Variationen der Nukleinsäuremoleküle, die Modifizierungen mit derselben biologischen Funktion darstellen, insbesondere kodierende Proteine mit derselben oder im Wesentlichen derselben biologischen Funktion. Sie können in der Natur vorkommende Variationen sein, wie Sequenzen von anderen Pflanzenvarietäten oder Spezies oder Mutationen. Diese Mutationen können von Natur aus vorkommen oder können durch Mutagenesetechniken erhalten werden. Die allelen Variationen können von Natur aus vorkommende allele Varianten sein wie auch synthetisch erzeugte oder genetisch manipulierte Varianten. Strukturelle Äquivalente können zum Beispiel durch Testung der Bindung des Polypeptids an Antikörper oder Vorhersagen auf Computerbasis identifiziert werden. Strukturelle Äquivalente haben die gleiche immunologische Eigenschaft, umfassen z. B. ähnliche Epitope.
Unter ”Hybridisieren” wird verstanden, dass solche Nukleinsäuremoleküle unter herkömmlichen Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen wie von, z. B. Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6, beschrieben.
Gemäß der Erfindung können DNA- wie auch RNA-Moleküle der Nukleinsäure der Erfindung als Sonden verwendet werden. Ferner können als Template für die Identifizierung funktioneller Homologe Northern Blot Assays wie auch Southern Blot Assays durchgeführt werden. Der Northern Blot Assay stellt vorteilhaft weitere Informationen über das exprimierte Genprodukt bereit z. B. Expressionsmuster, Auftreten von Verarbeitungsschritten, wie Spleißen und Capping, usw. Der Southern Blot Assay stellt zusätzliche Informationen über die chromosomale Lokalisierung und Organisation des Gens bereit, das für das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodiert.
Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel von stringenten Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C, zum Beispiel bei 50°C, 55°C oder 60°C. Der Fachmann weiß, dass diese Hybridisierungsbedingungen abhängig von der Art der Nukleinsäure und, zum Beispiel wenn organische Lösemittel vorhanden sind, in Bezug auf die Temperatur und Konzentration des Puffers unterschiedlich sind. Die Temperatur unter ”Standardhybridisierungsbedingungen” variiert zum Beispiel abhängig von der Art der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 50°C in einem wässerigen Puffer mit einer Konzentration von 0,1 ×, 0,5 ×, 1 ×, 2 ×, 3 ×, 4 × oder 5 × SSC (pH 7,2). Wenn (ein) organische(s) Lösemittel in dem oben genannten Puffer vorhanden sind (ist), zum Beispiel 50% Formamid, ist die Temperatur unter Standardbedingungen ungefähr 40°C, 42°C oder 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA Hybride sind vorzugsweise zum Beispiel 0,1 × SSC und 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C oder 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA Hybride sind vorzugsweise zum Beispiel 0,1 × SSC und 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C oder 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die oben genannten Hybridisierungstemperaturen werden zum Beispiel für eine Nukleinsäure von ungefähr 100 bp (= Basenpaare) Länge und einen G + C-Gehalt von 50% ohne Formamid bestimmt. Der Fachmann kann die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen mit Hilfe von Lehrbüchern bestimmen, zum Beispiel den oben genannte, oder anhand der folgenden Lehrbücher: Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Harnes und Higgins (Ed.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press bei Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press bei Oxford University Press, Oxford.
Ein weiteres Beispiel für eine solche stringente Hybridisierungsbedingung ist eine Hybridisierung mit 4 × SSC bei 65°C, gefolgt von einem Waschschritt in 0,1 × SSC bei 65°C für eine Stunde. Als Alternative ist eine beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingung in 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C. Ferner können die Bedingungen während des Waschschrittes aus dem Bereich von Bedingungen gewählt werden, der durch Bedingungen niedriger Stringenz (ungefähr 2 × SSC bei 50°C) und Bedingungen hoher Stringenz (ungefähr 0,2 × SSC bei 50°C, vorzugsweise bei 65°C) (20 × SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0) abgegrenzt ist. Zusätzlich kann die Temperatur während des Waschschrittes von Bedingungen niedriger Stringenz bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, auf Bedingungen höherer Stringenz bei ungefähr 65°C erhöht werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden oder andernfalls kann einer der zwei Parameter konstant gehalten werden, während der andere variiert wird. Denaturanten, zum Beispiel Formamid oder SDS, können auch während der Hybridisierung verwendet werden. In Gegenwart von 50% Formamid, wird die Hybridisierung vorzugsweise bei 42°C durchgeführt. Relevante Faktoren wie 1) Länge der Behandlung, 2) Salzbedingungen, 3) Detergensbedingungen, 4) Kompetitor DNAs, 5) Temperatur und 6) Sondenauswahl können je nach Fall kombiniert werden, so dass nicht alle Möglichkeiten hierin erwähnt werden können.
Somit werden in einer bevorzugten Ausführungsform Northern Blots mit Rothi-Hybri-Quick Puffer (Roth, Karlsruhe) bei 68°C für 2 h vorhybridisiert. Die Hybridisierung mit radioaktiv markierter Sonde erfolgt über Nacht bei 68°C. Anschließende Waschschritte werden bei 68°C mit 1 × SSC durchgeführt. Für Southern Blot Assays wird die Membran mit Rothi-Hybri-Quick Puffer (Roth, Karlsruhe) bei 68°C für 2 h vorhybridisiert. Die Hybridisierung mit radioaktiv markierter Sonde erfolgt über Nacht bei 68°C. Anschließend wird der Hybridisierungspuffer verworfen und das Filter kurz mit 2 × SSC; 0,1% SDS gewaschen. Nach dem Verwerfen des Waschpuffers wird frischer 2 × SSC; 0,1% SDS Puffer zugegeben und bei 68°C für 15 Minuten inkubiert. Dieser Waschschritt wird zweimal durchgeführt, gefolgt von einem zusätzlichen Waschschritt mit 1 × SSC; 0,1% SDS bei 68°C für 10 min.
Einige Beispiele für Bedingungen zur DNA Hybridisierung (Southern Blot Assays) und Waschschritt sind hierin in der Folge dargestellt:

(1) Hybridisierungsbedingungen können zum Beispiel aus den folgenden Bedingungen gewählt werden:
(a) 4 × SSC bei 65°C,
(b) 6 × SSC bei 45°C,
(c) 6 × SSC, 100 mg/ml denaturierte fragmentierte Fischsperma DNA bei 68°C,
(d) 6 × SSC, 0,5% SDS, 100 mg/ml denaturierte Lachssperma DNA bei 68°C,
(e) 6 × SSC, 0,5% SDS, 100 mg/ml denaturierte fragmentierte Lachssperma DNA, 50% Formamid bei 42°C,
(f) 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C,
(g) 50% (v/v) Formamid, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C,
(h) 2 × oder 4 × SSC bei 50°C (Niederstringenzbedingung), oder
(i) 30 bis 40% Formamid, 2 × oder 4 × SSC bei 42°C (Niederstringenzbedingung).
(2) Waschschritte können zum Beispiel aus den folgenden Bedingungen gewählt werden:
(a) 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% SDS bei 50°C.
(b) 0,1 × SSC bei 65°C.
(c) 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 68°C.
(d) 0,1 × SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C.
(e) 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C.
(f) 2 × SSC bei 65°C (Niederstringenzbedingung).

Polypeptide mit der oben genannten Aktivität, d. h. die einen erhöhte Ertrag verleihen, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, wie hierin erwähnt, z. B. erhöhte abiotische Stresstoleranz, z. B. Niedertemperaturtoleranz, z. B. mit erhöhter Nährstoffnutzungseffizienz und/oder Wassernutzungseffizienz und/oder erhöhtem intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, abgeleitet von anderen Organismen, können durch andere DNA-Sequenzen kodiert sein, die an die Sequenzen, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt sind, unter entspannten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, und die für die Expression für Peptide kodieren, die den erhöhten Ertrag verleihen, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, wie hierin erwähnt, z. B. eine erhöhte abiotische Stresstoleranz, z. B. Niedertemperaturtoleranz oder verstärkte Kältetoleranz, z. B. mit erhöhter Nährstoffnutzungseffizienz und/oder Wassernutzungseffizienz und/oder erhöhtem intrinsischen Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon.
Ferner müssen einige Anwendungen bei Niederstringenz-Hybridisierungsbedingungen durchgeführt werden, ohne Folgen für die Spezifität der Hybridisierung. Zum Beispiel könnte eine Southern Blot Analyse der Gesamt-DNA mit einem Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung sondiert und bei Niederstringenz gewaschen werden (55°C in 2 × SSPE, 0,1% SDS). Die Hybridisierungsanalyse könnte ein einfaches Muster aus nur Genen zeigen, die für Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren oder in dem Prozess der Erfindung verwendet werden, z. B. mit der hierin genannten Aktivität einer Verstärkung des erhöhten Ertrags, z. B. eines erhöhten ertragsbezogenen Merkmals, wie hierin erwähnt, z. B. erhöhter abiotischer Stresstoleranz, z. B. erhöhter Niedertemperaturtoleranz oder verstärkter Kältetoleranz, z. B. mit erhöhter Nährstoffnutzungseffizienz und/oder Wassernutzungseffizienz und/oder erhöhtem intrinsischen Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon. Ein weiteres Beispiel von derartigen niederstringenten Hybridisierungsbedingungen ist 4 × SSC bei 50°C oder eine Hybridisierung mit 30 bis 40% Formamid bei 42°C. Solche Moleküle umfassen jene, die Fragmente, Analoge oder Derivate des Polypeptids der Erfindung sind oder in dem Prozess der Erfindung verwendet werden, und unterscheiden sich zum Beispiel anhand von Aminosäure- und/oder Nukleotiddeletion(en), -insertion(en), -substitution(en), -addition(en) und/oder Rekombination(en) oder jeder anderem Modifizierung, die nach dem Stand der Technik bekannt ist, entweder alleine oder in Kombination aus den oben beschriebenen Aminosäuresequenzen oder deren zugrunde liegender (liegenden) Nukleotidsequenz(en). Es ist jedoch bevorzugt, Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen zu verwenden.
Die Hybridisierung sollte vorteilhaft mit Fragmenten von mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 oder 40 bp, vorteilhaft mindestens 50, 60, 70 oder 80 bp, vorzugsweise mindestens 90, 100 oder 110 bp durchgeführt werden. Besonders bevorzugt sind Fragmente von mindestens 15, 20, 25 oder 30 bp. Bevorzugt sind auch Hybridisierungen mit mindestens 100 bp oder 200, ganz bevorzugt mindestens 400 bp Länge. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sollte die Hybridisierung mit der gesamten Nukleinsäuresequenz mit den oben beschriebenen Bedingungen ausgeführt werden.
Die Begriffe ”Fragment”, ”Fragment einer Sequenz” oder ”Teil einer Sequenz” bedeuten eine trunkierte Sequenz der ursprünglichen Sequenz, auf die Bezug genommen wird. Die trunkierte Sequenz (Nukleinsäure- oder Proteinsequenz) kann in der Länge stark variieren; wobei die Minimalgröße eine Sequenz von ausreichender Größe ist, um eine Sequenz mit mindestens einer vergleichbaren Funktion und/oder Aktivität der ursprünglichen Sequenz oder des Moleküls bereitzustellen, auf die/das Bezug genommen wird, oder die/das mit dem Nukleinsäuremolekül der Erfindung hybridisiert oder in dem Prozess der Erfindung unter stringenten Bedingungen verwendet wird, während die Maximalgröße nicht kritisch ist. In einigen Anwendungen ist die Maximalgröße üblicherweise nicht wesentlich größer als zur Bereitstellung der gewünschten Aktivität und/oder Funktion(en) der ursprünglichen Sequenz notwendig ist.
Für gewöhnlich ist die trunkierte Aminosäuresequenz oder das Molekül etwa 5 bis etwa 310 Aminosäuren lang. Noch üblicher jedoch hat die Sequenz eine maximale Länge von etwa 250 Aminosäuren, vorzugsweise maximal etwa 200 oder 100 Aminosäuren. Es ist für gewöhnlich wünschenswert, Sequenzen von mindestens etwa 10, 12 oder 15 Aminosäuren, bis zu einem Maximum von etwa 20 oder 25 Aminosäuren zu wählen.
Der Begriff ”Epitop” betrifft spezifische immunreaktive Stellen innerhalb eines Antigens, auch bekannt als Antigene Determinante. Diese Epitope können eine lineare Anordnung von Monomeren in einer polymeren Zusammensetzung sein – wie Aminosäuren in einem Protein – oder aus mehreren komplexen sekundären oder tertiären Strukturen bestehen oder diese umfassen. Der Fachmann wird erkennen, dass Immunogene (d. h., Substanzen, die imstande sind, eine Immunreaktion hervorzurufen) Antigene sind; einige Antigene, wie Haptene, sind jedoch nicht immunogen, können aber durch Kopplung an ein Trägermolekül immunogen gemacht werden. Der Begriff ”Antigen” beinhaltet Bezugnahmen auf eine Substanz, zu der ein Antikörper erzeugt werden kann und/oder zu der der Antikörper spezifisch immunreaktiv ist.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Epitop des Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder das in dem Prozess der vorliegenden Erfindung verwendet wird und einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, wie hierin erwähnt, z. B. eine erhöhte abiotische Stresstoleranz, z. B. Niedertemperaturtoleranz oder verstärkte Kältetoleranz, z. B. eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder Wassernutzungseffizienz und/oder einen erhöhten intrinsischen Ertrag usw., im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon.
Der Begriff ”eine oder mehrere Aminosäuren” betrifft mindestens eine Aminosäure, aber nicht mehr als die Anzahl von Aminosäuren, die zu einer Homologie von unter 50% Identität führten. Vorzugsweise ist die Identität mehr als 70% oder 80%, bevorzugter sind 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% oder 95%, noch bevorzugter sind 96%, 97%, 98%, oder 99% Identität.
Ferner umfasst das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das ein Komplement einer der Nukleotidsequenzen der oben genannten Nukleinsäuremoleküle oder eines Teils davon ist. Ein Nukleinsäuremolekül oder seine Sequenz, das bzw. die zu einem bzw. einer der Nukleotidmoleküle oder Sequenzen komplementär ist, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt sind, isst jenes bzw. jene, das bzw. die zu einem bzw. einer der Nukleotidsmoleküle oder Sequenzen, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt sind, ausreichend komplementär ist, so dass es bzw. sie an eine der Nukleotidsequenzen, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 angeführt sind, hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex gebildet wird. Vorzugsweise wird die Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt. Ein Komplement jedoch von einer der hierin offenbarten Sequenzen ist vorzugsweise ein Sequenzkomplement dazu gemäß der Basenpaarung von Nukleinsäuremolekülen, die dem Fachmann gut bekannt ist. Zum Beispiel erfahren die Basen A und G eine Basenpaarung mit den Basen T und U bzw. C und umgekehrt. Modifizierungen der Basen können den Basenpaarungspartner beeinflussen.
Da Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst eine Nukleotidsequenz, die mindestens etwa 30%, 35%, 40% oder 45%, vorzugsweise mindestens etwa 50%, 55%, 60% oder 65%, bevorzugter mindestens etwa 70%, 80%, oder 90%, und noch bevorzugter mindestens etwa 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu einer Nukleotidsequenz homolog ist, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, oder zu einem Teil davon und hat vorzugsweise die oben genannte Aktivität, insbesondere eine den Ertrag erhöhende Aktivität, z. B. die Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel eine Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal nach dem Erhöhen der Aktivität oder einer Aktivität eines Gens, wie in Tabelle I dargestellt, oder eines Genprodukts, z. B. wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt, zum Beispiel durch Expression entweder im Zytsol oder Zytoplasm oder in einer Organelle, wie einem Plastid oder in Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden.
In einer Ausführungsform werden die Nukleinsäuremoleküle, die in Tabelle I, Spalte 6 mit ”plastidär” markiert sind, oder Genprodukte, die durch die Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, in Kombination mit einem Targeting-Signal, wie hierin beschrieben, exprimiert.
Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst eine Nukleotidsequenz oder ein Molekül, die bzw. das an eine der Nukleotidsequenzen oder ein Molekül, wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 angeführt, oder einen Teil davon hybridisiert, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie hierin definiert, hybridisiert, und für ein Protein mit der oben genannten Aktivität kodiert, z. B. einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nahrstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon zum Beispiel durch Expression entweder im Zytsol oder in einer Organelle wie einem Plastid oder in Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden, und wahlweise ist die Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aktivitäten, d. h. 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nukleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, geranylgeranyl Reductase, Mating Hormone A-Faktor Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Modifizierung methylase HemK family Protein, Myo-inositol Transporter, oxido Reductase Untereinheit, Peptidy-prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein, und YPL109C-Protein.
Ferner kann das Nukleinsäuremolekül der Erfindung nur einen Teil der Kodierungsregion einer der Sequenzen umfassen, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 angeführt sind, zum Beispiel ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, das für einen biologisch aktiven Teil des Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder eines Polypeptids, das in dem Prozess der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kodiert, d. h. mit der oben genannten Aktivität, z. B. einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, wenn seine Aktivität zum Beispiel durch eine Expression entweder im Zytsol oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden erhöht wird. Die Nukleotidsequenzen, die aus dem Klonen des vorliegenden, für das Protein gemäß der Erfindung kodierenden Gens bestimmt werden, ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die für die Verwendung in der Identifizierung und/oder Klonierung seiner Homologe in anderen Zelltypen und Organismen gestaltet sind. Die Sonde/der Primer umfasst für gewöhnlich im Wesentlichen gereinigtes Oligonukleotid. Das Oligonukleotid umfasst für gewöhnlich eine Region einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, 15 vorzugsweise etwa 20 oder 25, bevorzugter etwa 40, 50 oder 75 konsekutive Nukleotide eines Sense-Strangs einer der Sequenzen, die z. B. in Tabelle I, Spalte 5 und 7 angeführt sind, eine Antisense-Sequenz einer der Sequenzen, die z. B. in Tabelle I, Spalte 5 und 7 angeführt sind, oder von Natur aus vorkommende Mutanten davon hybridisiert. Primer auf der Basis eines Nukleotids der Erfindung können in PCR Reaktionen verwendet werden, um Homologe des Polypeptids der Erfindung oder des Polypeptids, das in dem Prozess der Erfindung verwendet wird, zu klonen, z. B. wie die Primer, die in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, z. B. wie in den Beispielen dargestellt. Eine PCR mit den Primern, die in Tabelle III, Spalte 7 dargestellt sind, führt zu einem Fragment des Genprodukts, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt.
Primersätze sind untereinander austauschbar. Der Fachmann kann die Primer kombinieren, um das gewünschte Produkt zu erhalten, z. B. in einem Klon voller Länge oder einer Teilsequenz. Sonden auf der Basis der Sequenzen des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder das in dem Prozess der vorliegenden Erfindung verwendet wird, können für den Nachweis von Transkripten oder genomischen Sequenzen verwendet werden, die für dieselben oder homologe Proteine kodieren. Die Sonde kann ferner eine Markergruppe umfassen, die angeheftet ist, z. B. kann die Markergruppe ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym Co-Faktor sein. Solche Sonden können als ein Teil eines genomischen Marker-Testkits für die Identifizierung von Zellen verwendet werden, die ein Polypeptid der Erfindung oder das in dem Prozess der vorliegenden Erfindung verwendet wird, exprimieren, wie durch Messen eines Spiegels eines kodierenden Nukleinsäuremoleküls in einer Probe von Zellen, z. B. Nachweisen der mRNA Spiegel oder Bestimmen, ob ein genomisches Gen, das die Sequenz des Polynukleotids der Erfindung oder das in den Prozessen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, mutiert oder deletiert wurde.
Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodiert für ein Polypeptid oder einen Teil davon, das bzw. der eine Aminosäuresequenz enthält die zu der Aminosäuresequenz, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, ausreichend homolog ist, so dass das Protein oder der Teil davon die Fähigkeit behält, zu einer Erhöhung des Ertrags beizutragen, z. B. Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhen der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhen der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhen des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen ertragsbezogenen Merkmals im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, insbesondere ist ein Erhöhen der Aktivität, wie oben erwähnt wie in den Beispielen beschrieben, in Pflanzen enthaften.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck ”ausreichend homolog” auf Proteine oder Teile davon, die Aminosäuresequenzen haben, die eine minimale Anzahl identischer oder äquivalenter Aminosäurereste (z. B. einen Aminosäurerest, der eine ähnliche Seitenkette hat wie ein Aminosäurerest in einer der Sequenzen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung) zu einer Aminosäuresequenz enthalten, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, so dass das Protein oder der Teil davon imstande ist, zu einer Erhöhung des Ertrags beizutragen, z. B. Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhen der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhen der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhen des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen ertragsbezogenen Merkmals im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon. Zum Beispiel mit der Aktivität eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 dargestellt und, wie hierin beschrieben.
In einer Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure, die für einen Teil des Proteins der vorliegenden Erfindung kodiert. Das Protein ist mindestens etwa 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens etwa 55%, 60%, 65% oder 70%, und bevorzugter mindestens etwa 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% oder 94% und ganz besonders mindestens etwa 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu einer gesamten Aminosäuresequenz von Tabelle II, Spalte 5 und 7 homolog und hat die oben genannte Aktivität, verleiht z. B. einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, zum Beispiel durch Expression entweder im Zytsol oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden.
Teile von Proteinen, die durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktiv, haben vorzugsweise die oben genannte, kommentierte Aktivität, verleihen z. B. einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, nach Erhöhung der Aktivität.
Wie hierin erwähnt, soll der Begriff ”biologisch aktiver Teil” einen Teil enthaften, z. B. eine Domäne/ein Motiv, der einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, oder eine derartige immunologische Aktivität aufweist, dass er an einen Antikörper bindet, der spezifisch an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Polypeptid das in dem Prozess der vorliegenden Erfindung verwendet wird bindet, um den Ertrag zu erhöhen, z. B. eine Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel eine Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon.
Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuremoleküle, die sich von einer der Nukleotidsequenzen, die in Tabelle I A, Spalte 5 und 7 dargestellt sind, (und Teilen davon) aufgrund einer Degeneriertheit des genetischen Kodes unterscheiden und somit für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodieren, insbesondere ein Polypeptid mit der oben genannten Aktivität, z. B. wie die Polypeptide, die durch die Sequenz dargestellt sind, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 angeführt sind, oder die funktionellen Homologe. Vorteilhaft umfasst das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder hat in einer anderen Ausführungsform eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, oder die funktionellen Homologe. In einer weiteren Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül der Erfindung für ein Protein voller Länge, das im Wesentlichen zu einer Aminosäuresequenz, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, oder den funktionellen Homologen homolog ist. In einer Ausführungsform jedoch besteht das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung nicht aus der Sequenz, die in Tabelle I, vorzugsweise Tabelle IA, Spalte 5 und 7, dargestellt ist.
Zusätzlich ist für den Fachmann offensichtlich, dass DNA-Sequenzpolymorphismen, die zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen führen, in einer Population vorhanden sein können. Ein solcher genetischer Polymorphismus in dem Gen, das für das Polypeptid der Erfindung kodiert oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst, kann unter Individuen innerhalb einer Population aufgrund einer natürlichen Variation vorhanden sein.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe ”Gen” und ”rekombinantes Gen” auf Nukleinsäuremoleküle, die einen offenen Leserahmen umfassen, der für das Polypeptid der Erfindung kodiert, oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfassen, oder für das Polypeptid kodieren, das in dem Prozess der vorliegenden Erfindung verwendet wird, vorzugsweise von einer Nutzpflanzen oder von einem Mikroorganismus, die bzw. der für das Verfahren der Erfindung nützlich ist. Solche natürlichen Variationen können für gewöhnlich zu einer Varianz von 1 bis 5% in der Nukleotidsequenz des Gens führen. Jede und alle solchen Nukleotidvariationen und die resultierenden Aminosäurepolymorphismen in Genen, die für ein Polypeptid der Erfindung kodieren oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfassen, die das Ergebnis einer natürlichen Variation sind und die funktionelle Aktivität, wie beschrieben, nicht ändern, sollen im Umfang der Erfindung liegen.
Nukleinsäuremoleküle, die natürlichen Varianten von Homologen eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung entsprechen, die auch eine cDNA sein können, können auf der Basis ihrer Homologie zu den hierin offenbarten Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, oder eines Teils davon, als Hybridisierungssonde nach Standardhybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden.
Daher hat in einer anderen Ausführungsform ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung mindestens 15, 20, 25 oder 30 Nukleotide Länge. Vorzugsweise hybridisiert es unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung oder das in dem Prozess der vorliegenden Erfindung verwendet wird umfasst, z. B. die Sequenz umfasst, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt ist. Das Nukleinsäuremolekül ist vorzugsweise mindestens 20, 30, 50, 100, 250 oder mehrere Nukleotide lang.
Der Begriff ”hybridisiert unter stringenten Bedingungen” ist oben definiert. In einer Ausführungsform soll der Begriff ”hybridisiert unter stringenten Bedingungen” Bedingungen zur Hybridisierung und zum Waschen beschreiben, unter welchen Nukleotidsequenzen, die mindestens 30%, 40%, 50% oder 65% zueinander identisch sind, für gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 70%, bevorzugter mindestens etwa 75% oder 80%, und noch bevorzugter mindestens etwa 85%, 90% oder 95% oder mehr zueinander identisch sind, für gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben.
Vorzugsweise entspricht ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung, das unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz hybridisiert, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül der Erfindung. Wie hierin verwendet, bezieht sich ein ”natürlich vorkommendes” Nukleinsäuremolekül auf ein RNA oder DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (z. B. für ein natürliches Protein kodiert). Vorzugsweise kodiert das Nukleinsäuremolekül für ein natürliches Protein mit der oben genannten Aktivität, z. B. die Verleihung eines erhöhten Ertrags, z. B. Erhöhen eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel Verstärken der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhen der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhen der Nahrstoffnutzungseffizienz, Erhöhen des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals nach Erhöhen der Expression oder Aktivität davon oder der Aktivität eines Proteins der Erfindung oder das in dem Prozess der Erfindung verwendet wird, zum Beispiel durch Expression der Nukleinsäuresequenz des Genprodukts im Zytosol und/oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien, vorzugsweise in Plastiden.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der Sequenzen des Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls der Erfindung wie auch des Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls, das in dem Prozess der Erfindung verwendet wird, die in der Population vorhanden sein können, ist für den Fachmann offensichtlich, dass Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls eingeführt werden können, das für das Polypeptid der Erfindung oder das in dem Prozess der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kodiert, was zu Änderungen in der Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids führt, ohne die funktionelle Fähigkeit des Polypeptids zu verändern, vorzugsweise ohne die Aktivität zu senken.
Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen, die zu Aminosäuresubstitutionen bei ”nicht essenziellen” Aminosäureresten führen, in einer Sequenz des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder das in dem Prozess der Erfindung verwendet wird, wie z. B. in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt, vorgenommen werden.
Ein ”nicht essenzieller” Aminosäurerest ist ein Rest, der von der Wildtypsequenz geändert werden kann, ohne die Aktivität des Polypeptids zu verändern, während eine ”essenzieller” Aminosäurerest für eine Aktivität, wie oben erwähnt, erforderlich ist, z. B. zur Erhöhung des Ertrags führt, z. B. einer Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel einer Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtolerenz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenes Merkmals im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon in einem Organismus nach Erhöhung der Aktivität des Polypeptids. Andere Aminosäurereste jedoch (z. B. jene, die in der Domäne mit der Aktivität nicht konserviert oder nur semi-konserviert sind) könnten für die Aktivität nicht essenziell sein und sind somit wahrscheinlich einer Änderung ohne Änderung der Aktivität zugänglich.
Ferner weiß ein Fachmann, dass die Kodonnutzung zwischen Organismen unterschiedlich sein kann. Daher kann er eine Kodonnutzung in dem Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung an die Nutzung des Organismus oder des Zellkompartiments anpassen, zum Beispiel des Plastids oder der Mitochondrien, in welchem/welchen das Polynukleotid oder Polypeptid exprimiert wird.
Daher betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die für ein Polypeptid mit der oben genannten Aktivität in Organismen oder Teilen davon exprimieren, zum Beispiel eine Expression entweder im Zytosol oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden, die Änderungen in Aminosäureresten enthalten, die für die Aktivität nicht essenziell sind. Solche Polypeptide unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von einer Sequenz, die in den Sequenzen enthalten ist, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt sind, behalten aber dennoch die hierin beschriebene Aktivität bei. Das Nukleinsäuremolekül kann eine Nukleotidsequenz umfassen, die für ein Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens etwa 50% mit einer Aminosäuresequenz identisch ist, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, und imstande ist, zu einer Erhöhung des Ertrags beizutragen, z. B. einer Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel einer Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon nach Erhöhen seiner Aktivität, z. B. seiner Expression, zum Beispiel durch Expression entweder im Zytosol oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden. Vorzugsweise ist das Protein, das durch das Nukleinsäuremolekül kodiert wird, mindestens etwa 60% mit der Sequenz identisch, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 angeführt ist, bevorzugter mindestens etwa 70% mit einer der Sequenzen identisch, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, noch bevorzugter mindestens etwa 80%, 90%, 95% mit der Sequenz homolog, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, und ganz besonders mindestens etwa 96%, 97%, 98%, oder 99% mit der Sequenz identisch, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist.
Zur Bestimmung des Prozentsatzes an Homologie (= Identität, hierin untereinander austauschbar verwendet) von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nukleinsäuremolekülen, werden die Sequenzen für einen optimalen Vergleich untereinander geschrieben (zum Beispiel können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingeführt werden, um eine optimale Ausrichtung mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure zu erzeugen).
Die Aminosäurereste oder Nukleinsäuremoleküle an den entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz von demselben Aminosäurerest oder demselben Nukleinsäuremolekül wie die entsprechende Position in der anderen Sequenz eingenommen wird, sind die Moleküle an dieser Position homolog (d. h., Aminosäure- oder Nukleinsäure-”Homologie”, wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet, entspricht einer Aminosäure- oder Nukleinsäure-”Identität”. Der Prozentsatz an Homologie zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen, die sich die Sequenzen teilen (d. h. % Homologie = Anzahl identischer Positionen/Gesamtanzahl an Positionen × 100). Die Begriffe ”Homologie” und ”Identität” werden somit als Synonyme angesehen.
Für die Bestimmung des Prozentsatzes an Homologie (= Identität) von zwei oder mehr Aminosäuren oder von zwei oder mehr Nukleotidsequenzen wurden mehrere Computer Software Programme entwickelt. Die Homologie von zwei oder mehr Sequenzen kann zum Beispiel mit der Software fasta berechnet werden, die gegenwärtig in der Version fasta 3 verwendet wird (W. R. Pearson und D. J. Lipman, PNAS 85, 2444 (1988); W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183, 63 (1990); W. R. Pearson und D. J. Lipman, PNAS 85, 2444 (1988); W. R. Pearson, Enzymology 183, 63 (1990)). Ein weiteres nützliches Programm für die Berechnung von Homologien von verschiedenen Sequenzen ist das blast Standardprogramm, das in der Biomax pedant Software enthalten ist (Biomax, München, Bundesrepublik Deutschland). Diese führt leider manchmal zu suboptimalen Ergebnissen da blast nicht immer vollständige Sequenzen des Subjekts und der Abfrage enthält. Da dieses Programm sehr effizient ist, kann es dennoch für den Vergleich einer riesigen Anzahl von Sequenzen verwendet werden. Die folgenden Einstellungen werden für gewöhnlich für einen solchen Vergleich von Sequenzen verwendet: -p Program Name [String]; -d Database [String]; Vorgabe = nr; -i Query File [File In]; Vorgabe = stdin; -e Expectation value (E) [Real]; Vorgabe = 10.0; -m alignment view options: 0 = pairwise; 1 = query-anchored showing identities; 2 = queryanchored no identities; 3 = flat query-anchored, show identities; 4 = flat query-anchored, no identities; 5 = query-anchored no identities and blunt ends; 6 = flat query-anchored, no identities and blunt ends; 7 = XML Blast Output; 8 = tabular; 9 tabular with comment lines [Integer]; Vorgabe = 0; -o BLAST report Output File [File Out] Optional; Vorgabe = stdout; -F Filter query sequence (DUST bei blastn, SEG bei anderen) [String]; Vorgabe = T; -G Cost to open a gap (Null führt zu Vorgabeverhalten) [Integer]; Vorgabe = 0; -E Cost to extend a gap (Null führt zu Vorgabeverhalten) [Integer]; Vorgabe = 0; -X X dropoff value for gapped alignment (in Bits) (Null führt zu Vorgabeverhalten); blastn 30, megablast 20, tblastx 0, all others 15 [Integer]; Vorgabe = 0; -I Show Gl's in deflines [T/F]; Vorgabe = F; -q Penalty for a nucleotide mismatch (nur blastn) [Integer]; Vorgabe -3; -r Reward for a nucleotide match (nur blastn) [Integer]; Vorgabe 1; -v Number of database sequences to show one-line descriptions for (V) [Integer]; Vorgabe = 500; -b Number of database sequence to show alignments for (B) [Integer]; Vorgabe = 250; -f Threshold for extending hits, Vorgabe if zero; blastp 11, blastn 0, blastx 12, tblastn 13; tblastx 13, megablast 0 [Integer]; Vorgabe = 0; -g Perfom gapped alignment (bei tblastx nicht verfügbar) [T/F]; Vorgabe = T; -Q Query Genetic code to use [Integer]; Vorgabe = 1; -D DB Genetic code (nur für tblast[nx]) [Integer]; Vorgabe = 1; -a Number of processors to use [Integer]; Vorgabe 1; -O SeqAlign file [File Out] Optional; -J Believe the query defline [T/F]; Vorgabe = F; -M Matrix [String]; Vorgabe = BLOSUM62; -W Word size, Vorgabe if zero (blastn 11, megablast 28, alle anderen 3) [Integer]; Vorgabe = 0; -z Effective length of the database (Null für reale Große verwenden) [Real]; Vorgabe = 0; -K Number of best hits from a region to keep (AUS durch Vorgabe, bei Verwendung wird ein Wert von 100 empfohlen) [Integer]; Vorgabe = 0; -P 0 for multiple hit, 1 for single hit [Integer]; Vorgabe = 0; -Y Effective length of the search space (Null für reale Große verwenden) [Real]; Vorgabe = 0; -S Query strands to search against database (für blast[nx] und tblastx); 3 is both, 1 is top, 2 is bottom [Integer]; Vorgabe = 3; -T Produce HTML Output [T/F]; Vorgabe = F; -I Restrict search of database to list of GI's [String] Optional; -U Use lower case filtering of FASTA sequence [T/F] Optional; Vorgabe = F; -y X dropoff value for ungapped extensions in bits (0.0 führt zu Vorgabeverhalten); blastn 20, megablast 10, all others 7 [Real] Vorgabe = 0.0; -Z X dropoff value for final gapped alignment in bits (0.0 führt zu Vorgabeverhalten); blastn/megablast 50, tblastx 0, all others 25 [Integer]; Vorgabe = 0; -R PSI-TBLASTN checkpoint file [File In] Optional; -n MegaBlast search [T/F]; Vorgabe = F; -L Location on query sequence [String] Optional; -A Multiple Hits window size, Vorgabe if zero (blastn/megablast 0, alle anderen 40 [Integer]; Vorgabe = 0; -w Frame shift penalty (OOF Algorithmzus für blastx) [Integer]; Vorgabe = 0; -t Length of the largest intron allowed in tblastn for linking HSPs (0 sperrt Verknüpfung) [Integer]; Vorgabe = 0.
Ergebnisse hoher Qualität werden unter Verwendung des Algorithmus von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman erzielt. Daher sind Programme bevorzugt, die auf diesen Algorithmen beruhen. Vorzugsweise können die Vergleiche von Sequenzen mit dem Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351 (1987), Higgins et al., CABIOS 5, 151 (1989)) oder vorzugsweise mit den Programmen ”Gap” und ”Needle” erfolgen, die beide auf den Algorithmen von Needleman und Wunsch basieren (J. Mol. Biol. 48; 443 (1970)), sowie ”BestFit”, das auf dem Algorithmus von Smith und Waterman beruht (Adv. Appl. Math. 2; 482 (1981)). ”Gap” und ”BestFit” sind Teil des GCG Software-Pakets (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul et al., (Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)), ”Needle” ist Teil von The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS) (Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)). Daher werden die Berechnungen zur Bestimmung des Prozentsatzes einer Sequenzhomologie vorzugsweise mit den Programmen ”Gap” oder ”Needle” über den gesamten Bereich der Sequenzen durchgeführt. Die folgenden Standardeinstellungen für den Vergleich von Nukleinsäuresequenzen wurden für ”Needle” verwendet Matrix: EDNAFULL, Gap_penalty: 10,0, Extend_penalty: 0,5. Die folgenden Standardeinstellungen für den Vergleich von Nukleinsäuresequenzen wurden für ”Gap” verwendet gap weight: 50, length weight: 3, average match: 10,000, average mismatch: 0,000,
Zum Beispiel soll eine Sequenz, die 80% Homologie mit Sequenz SEQ ID NR: 63 bei dem Nukleinsäurepegel aufweist, eine Sequenz bedeuten, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NR: 63 durch das oben genannte Programm ”Needle” mit der oben genannten Parametereinstellung 80% Homologie aufweist.
Homologie zwischen zwei Polypeptiden soll die Identität der Aminosäuresequenz über in jedem Fall die gesamte Sequenzlänge bedeuten, die durch einen Vergleich mit Hilfe des oben genannten Programms ”Needle” mit Hilfe der Matrix: EBLOSUM62, Gap_penalty: 8.0, Extend_penalty: 2.0, berechnet wird.
Zum Beispiel soll eine Sequenz, die 80% Homologie mit Sequenz SEQ ID NR: 64 bei dem Proteinspiegel aufweist, eine Sequenz bedeuten, die bei einem Vergleich mit der SEQ ID NR: 64 durch das oben genannte Programm ”Needle” mit der oben genannten Parametereinstellung 80% Homologie aufweist.
Funktionelle Äquivalente, die von der Nukleinsäuresequenz, wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt, gemäß der Erfindung durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitet sind, haben mindestens 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65% oder 70% vorzugsweise mindestens 80%, insbesondere mindestens 85% oder 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, besonders bevorzugt mindestens 95%, 97%, 98% oder 99% Homologie mit einem der Polypeptide, wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt, gemäß der Erfindung und kodieren für Polypeptide mit im Wesentlichen denselben Eigenschaften wie das Polypeptid, wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 angeführt. Funktionelle Äquivalente, die von einem der Polypeptide, wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt, gemäß der Erfindung durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitet sind, haben mindestens 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65% oder 70% vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 85% oder 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%, 97%, 98% oder 99% Homologie mit einem der Polypeptide, wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt, gemäß der Erfindung und haben im Wesentlichen dieselben Eigenschaften wie das Polypeptid, wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt.
”Im Wesentlichen dieselben Eigenschaften” eines funktionellen Äquivalents soll vor allem bedeuten, dass das funktionelle Äquivalent die oben genannte Aktivität aufweist, zum Beispiel durch Expression entweder im Zytosol oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden, wähnend die Menge an Protein, Aktivität oder Funktion des funktionellen Äquivalents in einem Organismus, z. B. einem Mikroorganismus, einer Pflanze oder einem Pflanzengewebe oder tierischen Gewebe, pflanzlichen oder tierischen Zellen oder eines Teils derselben, erhöht ist
Ein Nukleinsäuremolekül, das für ein Homolog zu einer Proteinsequenz von Tabelle II, Spalte 5 und 7 kodiert, kann durch Einführen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung, insbesondere von Tabelle I, Spalte 5 und 7, erzeugt werden, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden. Mutationen können in die Kodierungssequenzen von Tabelle I, Spalte 5 und 7 durch Standardtechniken, wie ortsgerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese eingeführt werden.
Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren vorhergesagten, nicht essenziellen Aminosäureresten durchgeführt. Eine ”konservative Aminosäuresubstitution” ist jene, in der der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt ist. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten wurden nach dem Stand der Technik identifiziert. Diese Familien enthalten Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht polaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin).
Somit ist ein vorhergesagter, nicht essenzieller Aminosäurerest in einem Polypeptid der Erfindung oder einem Polypeptid, das in dem Prozess der Erfindung verwendet wird, vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest derselben Familie ersetzt. Als Alternative können in einer anderen Ausführungsform Mutationen regellos entlang der gesamten oder einem Teil einer Kodierungssequenz eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder das in dem Prozess der Erfindung verwendet wird, eingeführt werden, wie durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können auf hierin beschriebene Aktivität getestet werden, um Mutanten zu identifizieren, die die oben genannte Aktivität beibehalten oder sogar erhöht haben, z. B. einen erhöhten Ertrag verleihen, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon.
Nach der Mutagenese einer der Sequenzen wie hierin dargestellt, kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden und die Aktivität des Proteins kann unter Verwendung von zum Beispiel hierin beschriebenen Assays bestimmt werden (siehe Beispiele).
Die höchste Homologie des Nukleinsäuremoleküls, das in dem Prozess gemäß der Erfindung verwendet wird, wurde für die folgenden Datenbankeinträge durch Gap Suche gefunden.
Homologe der verwendeten Nukleinsäuresequenzen mit der Sequenz, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, umfassen auch allele Varianten mit mindestens ungefähr 30%, 35%, 40% oder 45% Homologie, vorzugsweise mindestens ungefähr 50%, 60% oder 70%, bevorzugter mindestens ungefähr 90%, 91%, 92%, 93%, 94% oder 95% und noch bevorzugter mindestens ungefähr 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Homologie mit einer der dargestellten Nukleotidsequenzen oder der oben genannten, abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen oder deren Homologe, Derivate oder Analoge oder Teile derselben. Allele Varianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden der dargestellten Sequenzen, vorzugsweise von Tabelle I, Spalte 5 und 7, oder von den abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen erhalten werden können, wobei die Absicht jedoch ist, dass die Enzymaktivität oder die biologische Aktivität der resultierenden, synthetisierten Proteine vorteilhaft beibehalten oder erhöht wird.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das in dem Prozess der Erfindung verwendet wird, die Sequenzen, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt sind. Es ist bevorzugt, dass das Nukleinsäuremolekül so wenig wie möglich andere Nukleotide umfasst, die nicht in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt sind. In einer Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50 oder 40 weitere Nukleotide. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 30, 20 oder 10 weitere Nukleotide. In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül, das in dem Prozess der Erfindung verwendet wird, mit den Sequenzen identisch, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt sind.
Ebenso bevorzugt ist, dass das Nukleinsäuremolekül, das in dem Prozess der Erfindung verwendet wird, für ein Polypeptid kodiert, das die Sequenz umfasst, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist. In einer Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül für weniger als 150, 130, 100, 80, 60, 50, 40 oder 30 weitere Aminosäuren. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das kodierte Polypeptid weniger als 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 oder 5 weitere Aminosäuren. In einer Ausführungsform, die in dem erfindungsgemäßen Prozess verwendet wird, ist das kodierte Polypeptid mit den Sequenzen identisch, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt sind.
In einer Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das in dem Prozess verwendet wird, für ein Polypeptid, das die Sequenz umfasst, die in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist, und umfasst weniger als 100 weitere Nukleotide. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 30 weitere Nukleotide. In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül, das in dem Prozess verwendet wird, mit einer Kodierungssequenz der Sequenzen identisch, die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt sind.
Polypeptide (= Proteine), die noch die essenzielle biologische oder enzymatische Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung aufweisen, das einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon, d. h. deren Aktivität im Wesentlichen nicht verringert ist, sind Polypeptide mit mindestens 10% oder 20%, vorzugsweise 30% oder 40%, bevorzugter 50% oder 60%, ganz bevorzugt 80% oder 90 oder mehr der biologischen Aktivität oder Enzymaktivität des Wildtyps, vorzugsweise ist die Aktivität im Wesentlichen im Vergleich zu der Aktivität eines Polypeptids, das in Tabelle II, Spalte 5 und 7 dargestellt ist und unter identischen Bedingungen exprimiert ist, nicht verringert.
Homologe von Tabelle I, Spalte 5 und 7 oder der abgeleiteten Sequenzen von Tabelle II, Spalte 5 und 7 bedeuten auch trunkierte Sequenzen, cDNA, einsträngige DNA oder RNA der Kodierungs- und Nichtkodierungs-DNA-Sequenz. Homologe der Sequenzen sollen auch Derivate bezeichnen, die Nichtkodierungsregionen umfassen, zum Beispiel, UTRs, Terminatoren, Enhancer oder Promotorvarianten. Die Promotoren stromaufwärts der genannten Nukleotidsequenzen können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert sein, jedoch ohne die Funktionalität oder Aktivität entweder der Promotoren, des offenen Leserahmens (= ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Termintoren oder anderer 3'-regulatorischen Regionen zu beeinträchtigen, die weit weg vom ORF liegen. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifizierung ihrer Sequenz erhöht ist, oder dass sie vollständig durch mehrere aktive Promotoren ersetzt sind, selbst Promotoren von heterologen Organismen. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt und sind hierin in der Folge erwähnt.
Zusätzlich zu den Nukleinsäuremolekülen, die für die oben beschriebenen YRPs kodieren, betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung negative Regulatoren der Aktivität von Nukleinsäuremolekülen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die gemäß Tabelle I, Spalte 5 und/oder 7 angeführt sind, vorzugsweise Spalte 7. Es wird angenommen, dass Antisense-Polynukleotide dazu die abwärts regulierende Aktivität von diesen negativen Regulatoren hemmen, indem sie das Target-Polynukleotid spezifisch binden und mit Transkription, Spleißen, Transport, Translation und/oder Stabilität des Target-Polynukleotids interferieren. Methoden zum Lenken des Antisense-Polynukleotids auf die chromosomale DNA, auf ein primäres RNA Transkript oder auf eine verarbeitete mRNA sind nach dem Stand der Technik beschrieben. Vorzugsweise enthalten die Target-Regionen Spleißstellen, Translationsinitiationskodons, Translationsterminationskodons und andere Sequenzen innerhalb des offenen Leserahmens.
Der Begriff ”Antisense” bezieht sich für die für die Zwecke der Erfindung auf eine Nukleinsäure, die ein Polynukleotid umfasst, das ausreichend komplementär zu der Gesamtheit oder einem Teil eines Gens, primären Transkripts oder einer verarbeiteten mRNA ist, so dass es die Expression des endogenen Gens beeinträchtigt. ”Komplementäre” Polynukleotide sind jene, die zu einer Basenpaarung gemäß den Watson-Crick Standardkomplementaritätsregeln imstande sind. Insbesondere bilden Purine ein Basenpaar mit Pyrimidinen, um eine Kombination von Guanin gepaart mit Cytosin (G:C) zu bilden, und Adenin bildet ein Paar mit entweder Thymin (A:T) im Falle von DNA, oder Adenin gepaart mit Uracil (A:U) im Falle von RNA. Es ist klar, dass zwei Polynukleotide aneinander hybridisieren können, selbst wenn sie nicht vollständig komplementär zueinander sind, vorausgesetzt, dass jedes mindestens eine Region hat, die im Wesentlichen komplementär zu der anderen ist. Der Begriff ”Antisense-Nukleinsäure” enthält einsträngige RNA wie auch doppelsträngige DNA Expressionskassetten, die zur Erzeugung einer Antisense-RNA transkribiert werden können. ”Aktive” Antisense Nukleinsäuren sind Antisense-RNA-Moleküle, die zur selektiven Hybridisierung mit einem negativen Regulator der Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls imstande sind, das für ein Polypeptid mit mindestens 80% Sequenzidentität mit dem Polypeptid kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die gemäß Tabelle II, Spalte 5 und/oder 7 angeführt ist, vorzugsweise Spalte 7.
Die Antisense-Nukleinsäure kann zu einem vollständigen negativen Regulatorstrang oder nur zu einem Teil davon komplementär sein In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül zu einer ”Nichtkodierungsregion” des Kodierungsstrangs einer Nukleotidsequenz, die für ein YRP kodiert, antisense. Der Begriff ”Nichtkodierungsregion” bezieht sich auf 5' und 3' Sequenzen, die die Kodierungsregion flankieren, die nicht in Aminosäuren translatiert werden (d. h., auch bezeichnet als 5' und 3' untranslatierte Regionen). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann nur zu einem Teil der Nichtkodierungsregion von YRP mRNA komplementär sein. Zum Beispiel kann das Antisense-Oligonukleotid zu der Region komplementär sein, die die Translationsstartstelle von YRP mRNA umgibt. Ein Antisense-Oligonukleotid kann zum Beispiel etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein. Für gewöhnlich umfassen die Antisensemoleküle der vorliegenden Erfindung eine RNA mit 60–100% Sequenzidentität mit mindestens 14 konsekutiven Nukleotiden einer Nichtkodierungsregion einer der Nukleinsäure von Tabelle I. Vorzugsweise, ist die Sequenzidentität mindestens 70%, bevorzugter mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% und ganz besonders 99%.
Eine Antisense-Nukleinsäure der Erfindung kann unter Verwendung einer chemischen Synthese und enzymatischer Ligationsreaktionen unter Verwendung von Prozeduren konstruiert werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel, kann eine Antisense-Nukleinsäure (z. B. ein Antisense-Oligonukleotid) unter Verwendung von in der Natur vorkommenden Nukleotiden oder verschieden modifizierten Nukleotiden synthetisiert werden, die zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physischen Stabilität des Duplexes gestaltet sind, der zwischen den Antisense- und Sense Nukleinsäuren gebildet wird, z. B. können Phosphorothioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, enthalten 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Chlorouracil, 5-Iodouracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)-uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäure-methylester, 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amin-3-N-2-carboxypropyl)-uracil, acp3 und 2,6-Diaminopurin. Als Alternative kann die Antisense-Nukleinsäure biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors erzeugt werden, in den ein Nukleinsäure in einer Antisense-Ausrichtung subgeklont wurde (d. h., RNA, die von der eingefügten Nukleinsäure transkribiert wird, hat eine Antisense-Ausrichtung zu einer Target Nukleinsäure von Interesse, wie im folgenden Teilabschnitt näher beschrieben ist).
In einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in welchen, im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al., Nucleic Acids. Res. 15, 6625 (1987)). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid umfassen (Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15, 6131 (1987)) oder ein chimäres RNA-DNA Analogue (Inoue et al., FEBS Lett. 215, 327 (1987)).
Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung werden für gewöhnlich an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA hybridisieren oder an diese binden. Die Hybridisierungen können durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität erfolgen, um einen stabilen Duplex zu bilden, oder zum Beispiel im Fall eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, das an DNA Duplexe bindet, durch spezifische Interaktionen in der großen Furche (Major Groove) der Doppelhelix. Das Antisense-Molekül kann so modifiziert sein, dass es spezifisch an einen Rezeptor oder ein Antigen bindet, das auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert wird, z. B. durch Verbinden des Antisense-Nukleinsäuremoleküls mit einem Peptid oder einem Antikörper, das bzw. der an einen Zelloberflächenrezeptor oder ein Antigen bindet. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch an Zellen unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren abgegeben werden. Zum Erreichen ausreichender intrazellulärer Konzentrationen der Antisense-Moleküle sind Vektorkonstrukte, in welchen das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter die Kontrolle eines starken prokaryotischen, viralen oder eukaryotischen (einschließlich pflanzlichen) Promotors gestellt ist, bevorzugt.
Als eine Alternative zu Antisense-Polynukleotiden können Ribozyme, Sense-Polynukleotide oder doppelsträngige RNA (dsRNA) zur Verringerung der Expression eines YRP Polypeptids verwendet werden. Unter ”Ribozym” wird ein katalytisches RNA-basiertes Enzym mit Ribonuclease-Aktivität verstanden, das zur Spaltung einer einsträngigen Nukleinsäure, wie einer mRNA, zu der es eine komplementäre Region aufweist, imstande ist. Ribozyme (z. B. Hammerhead Ribozyme, die in Haselhoff und Gerlach, Nature 334, 585 (1988), beschrieben sind) können zum katalytischen Spalten von YRP mRNA Transkripten verwendet werden, um dadurch die Translation von YRP mRNA zu hemmen. Ein Ribozym mit Spezifität für eine YRP-kodierende Nukleinsäure kann auf der Basis der Nukleotidsequenz einer YRP cDNA, wie hierin offenbart, oder auf der Basis einer heterologen Sequenz, die nach den Methoden isoliert wird, die in dieser Erfindung gelehrt werden, gestaltet werden. Zum Beispiel kann ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS RNA konstruiert werden, in dem die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle zu der Nukleotidsequenz komplementär ist, die in eine YRP-kodierende mRNA gespalten werden soll. Siehe, z. B. U.S. Patent Nr. 4,987,071 und 5,116,742 an Cech et al. Als Alternative, kann YRP mRNA zum Selektieren einer katalytischen RNA mit einer spezifischen Ribonuclease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen verwendet werden. Siehe, z. B. Bartel D., und Szostak J. W., Science 261, 1411 (1993). In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Ribozym einen Teil mit mindestens 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 Nukleotiden, und bevorzugter 7 oder 8 Nukleotiden, die 100% Komplementarität zu einem Teil der Target-RNA aufweisen. Methoden zur Herstellung von Ribozymen sind dem Fachmann bekannt. Siehe, z. B. U.S. Patent Nr. 6,025,167 , 5,773,260 und 5,496,698 .
Der Begriff ”dsRNA,” wie hierin verwendet, bezieht sich auf RNA Hybride, die zwei Stränge RNA umfassen. Die dsRNAs können in ihrer Struktur linear oder kreisförmig sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die dsRNA für ein Polynukleotid spezifisch, das entweder für das Polypeptid gemäß Tabelle II oder ein Polypeptid mit mindestens 70% Sequenzidentität mit einem Polypeptid gemäß Tabelle II kodiert. Die hybridisierenden RNAs können im Wesentlichen oder vollständig komplementär sein. Unter ”im Wesentlichen komplementär” wird verstanden, dass, wenn die zwei hybridisierenden RNAs unter Verwendung des BLAST Programms optimal ausgerichtet sind, wie oben beschrieben, die hybridisierenden Teile mindestens 95% komplementär sind. Vorzugsweise ist die dsRNA mindestens 100 Basenpaare lang. Für gewöhnlich weisen die hybridisierenden RNAs eine identische Länge auf, ohne überhängende 5' oder 3' Enden und ohne Lücken. Die dsRNAs mit 5' oder 3' Überhängen von bis zu 100 Nukleotiden können jedoch in den Verfahren der Erfindung verwendet werden.
Die dsRNA kann Ribonukleotide oder Ribonukleotidanaloge umfassen, wie 2'-O-Methylribosylreste, oder Kombinationen davon. Siehe, z. B. U.S. Patent Nr. 4,130,641 und 4,024,222 . Eine dsRNA Polyriboinosinsäure: Polyribocytidylsäure ist in U.S. Patent 4,283,393 beschrieben. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von dsRNA sind nach dem Stand der Technik bekannt. Eine Methode umfasst die gleichzeitige Transkription von zwei komplementären DNA-Strängen, entweder in vivo, oder in einem einzigen in vitro Reaktionsgemisch. Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5,795,715 . In einer Ausführungsform kann dsRNA direkt in eine Pflanze oder Pflanzenzelle durch Standardtransformationsprozeduren eingeführt werden. Als Alternative kann dsRNA in einer Pflanzenzelle durch Transkribieren von zwei komplementären RNAs exprimiert werden.
Andere Methoden für die Inhibition einer endogenen Genexpression, wie Tripelhelixbildung (Moser et al., Science 238, 645, (1987), und Cooney et al., Science 241, 456 (1988)) und Co-Suppression (Napoli et al., The Plant Cell 2, 279, 1990,) sind nach dem Stand der Technik bekannt. cDNAs mit Teil- und voller Länge werden für die Co-Suppression von endogenen Pflanzengenen verwendet. Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 4,801,340 , 5,034,323 , 5,231,020 und 5,283,184 ; Van der Kroll et al., The Plant Cell 2, 291, (1990); Smith et al., Mol. Gen. Genetics 224, 477 (1990), und Napoli et al., The Plant Cell 2, 279 (1990).
Für die Sense-Suppression wird angenommen, dass die Einführung eines Sense-Polynukleotids die Transkription des entsprechenden Target-Gens blockiert. Das Sense-Polynukleotid hat mindestens 65% Sequenzidentität mit dem Target-Pflanzengen oder der RNA. Vorzugsweise ist die prozentuelle Identität mindestens 80%, 90%, 95% oder mehr. Das eingeführte Sense-Polynukleotid muss keine volle Länge relativ zu dem Target-Gen oder Transkript aufweisen. Vorzugsweise hat das Sense-Polynukleotid mindestens 65% Sequenzidentität mit mindestens 100 aufeinander folgenden Nukleotiden von einer der Nukleinsäuren, wie in Tabelle I, Anwendung Nr. 1 dargestellt. Die Regionen mit Identität können Introns und/oder Exons und untranslatierte Regionen umfassen. Das eingeführte Sense-Polynukleotid kann transient in der Pflanzenzelle vorhanden sein oder kann stabil in ein Pflanzenchromosom oder extra-chromosomales Replikon integriert sein.
Ferner ist eine Aufgabe der Erfindung ein Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid kodiert, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anwendung Nr. 1 dargestellt ist; (b) einem Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1 dargestellt ist; (c) einem Nukleinsäuremolekül, das infolge einer Degeneriertheit des genetischen Kodes von einer Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt ist und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogene Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das Nukleinsäuremolekül umfasst, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt ist und einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogene Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, eine Pflanze oder einem Teil davon; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids kodiert, das durch das Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c) oder (d) kodiert ist, und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt umfasst, und einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogene Merkmal, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon; (f) einem Nukleinsäuremolekül, das an ein Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c), (d) oder (e) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogene Merkmal, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon; (g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt werden, für das eines der Nukleinsäuremoleküle von (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) kodiert, und mit der Aktivität, die durch das Nukleinsäuremolekül dargestellt wird. das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1 angeführt umfasst (h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder eines oder mehrere Polypeptidmotive umfasst, wie in Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Protein dargestellt ist, das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV, Anwendung Nr. 1 angeführt umfasst; (i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit der Aktivität kodiert, die durch ein Protein dargestellt ist, wie in Spalte 5 von Tabelle II angeführt, und einen erhöhten Ertrag, verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogene Merkmal, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon; (j) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das durch Amplifizieren einer cDNA Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III erzeugt wird und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Protein dargestellt ist, das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV, Anwendung Nr. 1 angeführt umfasst, und k) einem Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek, insbesondere eine cDNa Bibliothek und/oder einer genomischen Bibliothek, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde erhältlich ist, umfassend eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) oder mit einem Fragment davon mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, oder 500 nt, 750 nt oder 1000 nt eines Nukleinsäuremoleküls komplementär zu einer Nukleinsäuremolekülsequenz, die in (a) bis (e) charakterisiert ist und für ein Polypeptid mit der Aktivität kodiert, die durch ein Protein dargestellt ist, das ein Polypeptid wie in Spalte 5 von Tabelle II, Anwendung Nr. 1 angeführt umfasst.
Die Erfindung stellt ferner einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine YRP kodierende Nukleinsäure, wie oben beschrieben, umfasst, wobei die Expression des Vektor bzw. der YRP kodierenden Nukleinsäure in einer Wirtszelle zu einem erhöhten Ertrag führt, z. B. zu einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmal, im Vergleich zu dem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyp der Wirtszelle. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ”Vektor” auf ein Nukleinsäuremolekül, das zum Transportieren einer anderen Nukleinsäure imstande ist, an die es gebunden wurde. Eine Art von Vektor ist ein ”Plasmid”, das sich auf eine zirkuläre doppelsträngige DNA Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Eine andere Art von Vektor ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Ferner können Arten von Vektoren linearisierte Nukleinsäuresequenzen sein, wie Transposons, die Stücke von DNA sind, die sich selbst kopieren und einsetzen können. Es gibt 2 Arten von Transposons, die vorgefunden werden: einfache Transposons, die als Insertionssequenzen bekannt sind, und zusammengesetzte Transposons, die mehrere Gene wie auch die Gene aufweisen können, die für eine Transposition erforderlich sind. Gewisse Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle imstande, in die sie eingeführt sind (z. B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht episomale Säugetiervektoren) sind in das Genom einer Wirtszelle nach dem Einführen in die Wirtszelle integriert und werden dadurch gemeinsam mit dem Wirtsgenom repliziert. Ferner sind gewisse Vektoren imstande, die Expression von Genen zu lenken, an die sie funktionsfähig gebunden sind. Solche Vektoren werden hierin als ”Expressionsvektoren” bezeichnet. Im Allgemeinen weisen Expressionsvektoren, die in den rekombinanten DNA Techniken von Nutzen sind, häufig die Form von Plasmiden auf. In der vorliegenden Beschreibung können ”Plasmid” und ”Vektor” untereinander austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form von Vektor ist. Die Erfindung soll jedoch andere Formen von Expressionsvektoren beinhalten, wie virale Vektoren (z. B. replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren), die äquivalente Funktionen erfüllen.
Eine Pflanzenexpressionskassette enthält vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die zu einem Antreiben einer Genexpression in Pflanzenzellen imstande sind, die so funktionsfähig gebunden sind, dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, zum Beispiel Terminierung einer Transkription durch Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind jene, die von Agrobacterium tumefaciens T-DNA stammen, wie das Gen 3, das als Octopin-Synthase des Ti-Plasmids pTiACH5 bekannt ist (Gielen et al., EMBO J. 3, 835 (1984)) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen Terminatoren, die in Pflanzen funktionell aktiv sind, sind geeignet. Da die Pflanzengenexpression sehr häufig nicht auf transkriptionale Ebenen begrenzt ist, enthält eine Pflanzenexpressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig gebundene Sequenzen, wie translationale Enhancer, wie die Overdrive-Sequenz, die die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz des Tabakmosaikvirus enthält, die das Polypeptid-pro-RNA-Verhältnis verstärkt (Gallie et al., Nucl. Acids Research 15, 8693 (1987)).
Eine Pflanzengenexpression muss funktionsfähig an einen geeigneten Promotor gebunden sein, der eine Genexpression in einer zeit-, zell- oder gewebespezifischen Weise verleiht. Bevorzugt sind Promotoren, die die konstitutive Expression antreiben (Benfey et al., EMBO J. 8, 2195 (1989)), wie jene, die von Pflanzenviren abgeleitet sind, wie 35S CaMV (Franck et al., Cell 21, 285 (1980)), 19S CaMV (siehe auch U.S. Patent Nr. 5,352,605 und PCT Anmeldung Nr. WO 84/02913 ) oder Pflanzenpromotoren wie jene, von kleinen Rubisco Untereinheit, die in U.S. Patent Nr. 4,962,028 beschrieben sind.
Zusätzliche vorteilhafte regulatorische Sequenzen sind zum Beispiel in den Pflanzenpromotoren enthalten, wie CaMV/35S (Franck et al., Cell 21 285 (1980)), PRP1 (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22, 361 (1993)), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos, Ubiquitin, Napin oder Phaseolin Promotor. Ebenso vorteilhaft in diesem Zusammenhang sind induzierbare Promotoren wie die Promotoren, die in EP 388 186 (Benzylsulfonamid-induzierbar), Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992) (Tetracyclin-induzierbar), EP-A-0 335 528 (Abscisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar) beschrieben. Zusätzliche nützliche Pflanzenpromotoren sind der zytoplasmatische FBPase Promotor oder ST-LSI Promotor von Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445 (1989)), der Phosphorybosyl phyrophoshat-amido-Transferase Promotor von Glycine max (Genbank Zugriffsnr. U87999) oder der Nodus-spezifische Promotor beschrieben in EP-A 0249 676 . Zusätzlich sind besonders vorteilhafte Promotoren samenspezifische Promotoren, die für Monokotyledone oder Dikotyledone verwendet werden können und sind in US 5,608,152 (Napin-Promotor von Raps), WO 98/45461 (Phaseolin-Promotor von Arabidopsis), US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor von Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4 Promotor von Brassica) und Baeumlein et al., Plant J., 2 (2), 233 (1992) (LEB4 Promotor von Leguminosa) beschrieben. Die Promotoren sind in Dikotyledonen nützlich. Die folgenden Promotoren sind zum Beispiel im monokotyledonen lpt-2- oder lpt-1-Promotor von Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder Hordein-Promotor von Gerste nützlich. Andere nützliche Promotoren sind in WO 99/16890 beschrieben. Es ist im Prinzip möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren regulatorischen Sequenzen wie die oben genannten für den neuartigen Prozess zu verwenden. Es ist auch möglich und vorteilhaft, zusätzlich synthetische Promotoren zu verwenden.
Das Genkonstrukt kann auch weitere Gene umfassen, die in die Organismen eingesetzt werden können und die zum Beispiel an einer Erhöhung der Stresstoleranz und des Ertrag beteiligt sind. Es ist möglich und vorteilhaft, regulatorische Gene wie Gene für Inducer, Repressoren oder Enzyme, die durch ihre enzymatische Aktivität in die Regulierung eingreifen, oder eines oder mehrere oder aller Gene eines biosynthetischen Pfades in Wirtsorganismen einzusetzen und zu exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Die eingesetzten Gene können ihren eigenen Promotor haben oder sonst unter der Kontrolle desselben Promotors wie die Sequenzen der Nukleinsäure von Tabelle I oder deren Homologe stehen.
Das Genkonstrukt umfasst vorteilhaft für die Expression der anderen vorhandenen Gene zusätzlich 3' und/oder 5' terminale regulatorische Sequenzen zur Verstärkung der Expression, die für eine optimale Expression abhängig von dem gewählten Wirtsorganismus und des Gens oder der Gene gewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen eine spezifische Expression der Gene und eine Proteinexpression wie oben erwähnt möglich machen. Dies kann abhängig vom Wirtsorganismus bedeuten, dass zum Beispiel das Gen erst nach der Induktion exprimiert oder überexprimiert wird oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen oder Faktoren können ferner vorzugsweise eine günstige Wirkung auf die Expression der eingeführten Gene und somit auf deren Erhöhung haben. Es ist auf diese Weise für die regulatorischen Elemente möglich, auf der Transkriptionsebene vorteilhaft verstärkt zu werden, indem starke Transkriptionssignale, wie Promotoren und/oder Enhancer verwendet werden. Zusätzlich jedoch ist es auch möglich, die Translation zum Beispiel durch Verbessern der Stabilität der mRNA zu verstärken.
Andere bevorzugte Sequenzen zur Verwendung in Pflanzengenexpressionskassetten sind Targeting-Sequenzen, die zum Lenken des Genprodukts in seinem geeigneten Zellkompartiment notwendig sind (für einen Überblick siehe Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15 (4), 285 (1996) und darin angeführte Referenzen) wie der Vakuole, dem Kern, allen Arten von Plastiden wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, dem extrazellulären Raum, Mitochondrien, dem endoplasmatischen Retikulum, Ölkörpern, Peroxisomen und anderen Kompartimenten von Pflanzenzellen.
Die Pflanzengenexpression kann auch durch einen induzierbare Promotor erleichtert werden (für einen Überblick siehe Gatz, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89(1997)). Chemisch induzierbare Promotoren sind insbesondere geeignet, wenn eine Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgen soll.

Tabelle VI listet mehrere Beispiele von Promotoren auf, die zur Regulierung der Transkription der Nukleinsäurekodierungssequenzen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Tab. VI: Beispiele für gewebespezifische und induzierbare Promotoren in Pflanzen

Expression	Referenz
Cor78 – Kälte, Dürre, Salz,	Ishitani, et al., Plant Cell 9, 1935 (1997),
ABA, Verwundunginduzierbar	Yamaguchi-Shinozaki und Shinozaki, Plant Cell 6, 251 (1994)
Rci2A – Kälte, Dehydrierunginduzierbar	Capel et al., Plant Physiol 115, 569 (1997)
Rd22 – Dürre, Salz	Yamaguchi-Shinozaki und Shinozaki, Mol. Gen. Genet. 238, 17 (1993)
Cor15A – Kälte,	Baker et al., Plant Mol. Biol. 24, 701 (1994)
Dehydrierung, ABA
GH3-Auxin induzierbar	Liu et al., Plant Cell 6, 645 (1994)
ARSK1-Wurzel, Salz-	Hwang und Goodman, Plant J. 8, 37 (1995)
induzierbar
PtxA-Wurzel, Salz-	GenBank Zugriff X67427
induzierbar
SbHRGP3 – wurzelspezifisch	Ahn et al., Plant Cell 8,1477 (1998).
KST1 – Guard-Zellespezifisch	Plesch et al., Plant Journal. 28(4), 455–(2001)
KATZ – Guard-Zellespezifisch	Plesch et al., Gene 249, 83 (2000), Nakamura et al., Plant Physiol. 109, 371 (1995)
Salicylisäure-induzierbar	PCT Anmeldung Nr. WO 95/19443
Tetracyclin-induzierbar	Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992)
Ethanol-induzierbar	PCT Anmeldung Nr. WO 93/21334
Pathogen-induzierbar PRP1	Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22, 361–(1993)
Wärme-induzierbar hsp80	U.S. Patent Nr. 5,187,267
Kälte-induzierbare Alpha	PCT Anmeldung Nr. WO 96/12814
amylase
Verwundung-induzierbar pinII	Europäisches Patent Nr. 375 091
RD29A – Salz-induzierbar	Yamaguchi-Shinozalei et al. Mol. Gen. Genet. 236, 331 (1993)
Plastid-spezifische virale	PCT Anmeldung Nr. WO 95/16783 , PCT Anmeldung
RNA Polymerase	WO 97/06250

Andere Promotoren, z. B. Super-Promotor (Ni et al., Plant Journal 7, 661 (1995)), Ubiquitin-Promoter (Callis et al., J. Biol. Chem., 265, 12486 (1990); US 5,510,474 ; US 6,020,190 ; Kawalleck et al., Plant Molecular Biology, 21, 673 (1993)) oder 34S Promotor (GenBank Zugriffsnummer M59930 und X16673) waren für die vorliegende Erfindung ähnlich nützlich und sind dem Fachmann bekannt. Entwicklungsstufen-bevorzugte Promotoren werden vorzugsweise durch gewisse Entwicklungstufen exprimiert. Gewebe- und Organ-bevorzugte Promotoren enthalten jene, die vorzugsweise in gewissen Geweben oder Organen exprimiert werden, wie in Blättern, Wurzeln, Samen, oder Xylem. Beispiele für Gewebe-bevorzugte und Organ-bevorzugte Promotoren enthalten, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Früchte bevorzugte, Samenanlage-bevorzugte, männliche Gewebe-bevorzugte, Samen-bevorzugte, Integument-bevorzugte, Knollen-bevorzugte, Stängel-bevorzugte, Fruchtwand-bevorzugte, und Blatt-bevorzugte, Stigma-bevorzugte, Pollen-bevorzugte, Staubbeutel-bevorzugte, Blütenblatt-bevorzugte, Kelchblatt-bevorzugte, Blütenstiel-bevorzugte, Schoten-bevorzugte, Stiel-bevorzugte, Wurzel-bevorzugte Promotoren und dergleichen. Samen-bevorzugte Promotoren werden vorzugsweise während der Samenentwicklung und/oder Keimung exprimiert. Zum Beispiel können Samen-bevorzugte Promotoren Embryo-bevorzugte, Endosperm-bevorzugte, und Samenhüllen-bevorzugte sein. Siehe Thompson et al. BioEssays 10, 108 (1989). Beispiele für Samen-bevorzugte Promotoren enthalten, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Zellulose Synthase (celA), Cim1, Gamma-Zein, Globulin-1, Mais 19 kD Zein (cZ19B1), und dergleichen.
Andere Promotoren, die in den Expressionskassetten der Erfindung nützlich sind, enthalten, ohne aber darauf beschränkt zu sein, den Haupt-Chlorophyll a/b Bindungsprotein-Promotor, Histon-Promotoren, den Ap3-Promotor, den β-Conglycin-Promotor, den Napin-Promotor, den Sojabohne-Lectin-Promotor, den Mais 15 kD-Zein-Promotor, den 22 kD-Zein-Promotor, den 27 kD-Zein-Promotor, den g-Zein-Promotor, die wachsartigen, shrunken 1, shrunken 2 und Bronze-Promotoren, den Zm13-Promotor ( U.S. Patent Nr. 5,086,169 ), die Mais Polygalacturonase-Promotoren (PG) ( U.S. Patent Nr. 5,412,085 und 5,545,546 ), und den SGB6-Promotor ( U.S. Patent Nr. 5,470,359 ), wie auch synthetische oder andere natürliche Promotoren.
Eine zusätzliche Flexibilität in der Kontrolle der heterologen Genexpression in Pflanzen kann durch Verwendung von DNA Bindungsdomänen und Reaktionselementen von heterologen Quellen erhalten werden (d. h., DNA Bindungsdomänen von nicht pflanzlichen Quellen). Ein Beispiel für eine solche heterologe DNA Bindungsdomäne ist die LexA DNA Bindungsdomäne (Brent und Ptashne, Zelle 43, 729 (1985)).
Die Erfindung stellt ferner einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein YRP DNA-Molekül der Erfindung umfasst, das in den Expressionsvektor in einer Antisense-Ausrichtung geklont ist Das heißt, das DNA-Molekül ist funktionsfähig an eine regulatorische Sequenz derart gebunden, dass eine Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls möglich ist, das zu einer YRP mRNA antisense ist. Regulatorische Sequenzen, die funktionsfähig an ein Nukleinsäuremolekül gebunden sind, das in der Antisense-Ausrichtung geklont wird, können gewählt werden, die die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zellarten lenken. Zum Beispiel können virale Promotoren und/oder Enhancer oder regulatorische Sequenzen gewählt werden, die eine konstitutive, gewebespezifische oder zellartspezifische Expression von Antisense-RNA lenken. Der Antisense-Expressionsvektor kann die Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus aufweisen, wobei Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle einer hocheffizienten regulatorischen Region erzeugt werden. Die Aktivität der regulatorischen Region kann durch die Zellart bestimmt werden, in die der Vektor eingeführt wird. Für eine Besprechung der Regulierung der Genexpression unter Verwendung von Antisense-Genen, siehe Weintraub H. et al., Reviews – Trends in Genetics, Band 1(1), 23 (1986) und Mol et al., FEBS Letters 268, 427 (1990).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte YRPs, und biologisch aktive Teile davon. Ein ”isoliertes” oder ”gereinigtes” Polypeptid oder ein biologisch aktiver Teil davon ist frei von einigem des zellulären Materials, wenn es bzw. er durch rekombinante DNA Techniken erzeugt wird, oder chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn es bzw. er chemisch synthetisiert wird. Der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von zellulärem Material” enthält Zubereitungen von YRP, in welchen das Polypeptid von einigen der zellulären Komponenten der Zellen getrennt ist, in welchen es natürlich oder rekombinant erzeugt wird. In einer Ausführungsform enthält der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von zellulärem Material” Zubereitungen von YRP mit weniger als etwa 30% (Trockengewicht) Nicht-YRP-Material (auch hierin als ”kontaminierendes Polypeptid” bezeichnet), bevorzugter weniger als etwa 20% Nicht-YRP-Material, noch bevorzugter weniger als etwa 10% Nicht-YRP-Material, und ganz besonders weniger als etwa 5% Nicht-YRP-Material.
Wenn das YRP oder der biologisch aktive Teil davon rekombinant erzeugt wird, ist es bzw. er auch vorzugsweise im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d. h., Kulturmedium stellt weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger als etwa 10%, und ganz besonders weniger als etwa 5% des Volumens der Polypeptidzubereitung dar. Der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien” enthält Zubereitungen von YRP, in welchen das Polypeptid von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien getrennt ist, die nicht an der Synthese des Polypeptids beteiligt sind. In einer Ausführungsform enthält der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien” Zubereitungen eines YRP mit weniger als etwa 30% (Trockengewicht) chemische Vorläufer oder Nicht-YRP-Chemikalien, bevorzugter weniger als etwa 20% chemische Vorläufer oder Nicht-YRP-Chemikalien, noch bevorzugter weniger als etwa 10% chemische Vorläufer oder Nicht-YRP-Chemikalien, und ganz besonders weniger als etwa 5% chemische Vorläufer oder Nicht-YRP-Chemikalien. In bevorzugten Ausführungsformen fehlen isolierten Polypeptiden oder biologisch aktiven Teile davon kontaminierende Polypeptide desselben Organismus von dem das YRP abgeleitet ist. Für gewöhnlich werden solche Polypeptide durch rekombinante Expression von zum Beispiel S. cerevisiae, E. coli oder Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa YRP, in einem Mikroorganismus wie S. cerevisiae, E. coli, C. glutamicum, Ciliates, Algen, Pilzen oder Pflanzen erzeugt, vorausgesetzt, dass das Polypeptid in einem Organismus rekombinant exprimiert wird, der sich von dem ursprünglichen Organismus unterscheidet.
Die Nukleinsäuremoleküle, Polypeptide, Polypeptidhomologe, Fusionspolypeptide, Primer, Vektoren und Wirtszellen, die hierin beschrieben sind, können in einer oder mehreren der folgenden Methoden verwendet werden: Identifizierung von S. cerevisiae, E. coli oder Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa und verwandten Organismen; Kartierung von Genomen von Organismen, die mit S. cerevisiae, E. coli verwandt sind; Identifizierung und Lokalisierung von S. cerevisiae, E. coli oder Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa Sequenzen von Interesse; evolutionäre Studien; Bestimmung von YRP Regionen, die für die Funktion erforderlich sind; Modulation einer YRP Aktivität; Modulation des Metabolismus einer oder mehrerer Zellefunktionen; Modulation des Transmembrantransports einer oder mehrerer Verbindungen; Modulation des Ertrags, z. B. eines ertragsbezogenen Merkmals, z. B. einer Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, z. B. Niedertemperaturtoleranz, Dürretoleranz, Wassernutzungseffizienz, Nährstoffnutzungseffizienz und/oder eines intrinsischen Ertrags; und Modulation der Expression von YRP Nukleinsäuren.
Die YRP Nukleinsäuremoleküle der Erfindung sind auch für evolutionäre und Polypeptidstrukturstudien nützlich. Die metabolischen und Transportprozesse, an welchen die Moleküle der Erfindung teilnehmen, werden von einer Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen genutzt; durch Vergleichen der Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung mit jenen, die für ähnliche Enzyme von anderen Organismen kodieren, kann die evolutionäre Verwandtschaft der Organismen bewertet werden. Ebenso ermöglicht ein Vergleich eine Bewertung, welche Regionen der Sequenz konserviert sind und welche nicht, was zu bei der Bestimmung jener Regionen des Polypeptids helfen kann, die für die Funktionsfähigkeit des Enzyms essenziell sind. Die Art der Bestimmung ist für Polypeptid-Manipulationsstudien von Wert und kann einen Hinweis liefern, was das Polypeptid im Sinne einer Mutagenese tolerieren kann, ohne an Funktion zu verlieren.
Die Manipulation der YRP Nukleinsäuremoleküle der Erfindung kann zu der Produktion von SRPs mit funktionellen Unterschieden der Wildtyp YRPs führen. Diese Polypeptide können in Effizienz oder Aktivität verbessert werden, können in größeren Zahlen in der Zelle als üblich vorhanden sein oder können in Effizienz oder Aktivität verringert sein.
Es gibt eine Anzahl von Mechanismen, durch die die Veränderung eines YRP der Erfindung direkt den Ertrag, z. B. das ertragsbezogene Merkmal, zum Beispiel die Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel die Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz, und/oder Nährstoffnutzungseffizienz, den intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal beeinflussen kann.
Die Wirkung der genetischen Modifizierung in Pflanzen bezüglich Ertrag, z. B. ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz, und/oder Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischem Ertrag und/oder einem anderen erwähnten ertragsbezogene Merkmal kann durch Züchten der modifizierten Pflanze unter weniger als geeigneten Bedingungen und anschließende Analyse der Wachstumseigenschaften und/oder des Metabolismus der Pflanze bewertet werden. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann gut bekannt und enthalten Trockengewicht, Frischgewicht, Polypeptidsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese, Evapotranspirationsraten, allgemeinen Pflanzen- und/oder Nutzpflanzenertrag, Blüte, Reproduktion, Samenansatz, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Photosyntheseraten, usw. (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, Band 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seite 469–714, VCH: Weinheim; Belter P. A. et al., 1988, Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy J. F., und Cabral J. M. S., 1992, Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz J. A. und Henry J. D., 1988, Biochemical separations, in Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Band B3, Kapitel 11, Seite 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow F. J., 1989, Separation und purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Zum Beispiel können Hefeexpressionsvektoren, die die hierin offenbarten Nukleinsäuren umfassen, oder Fragmente davon, konstruiert und unter Verwendung von Standardprotokollen in S. cerevisiae transformiert werden. Die erhaltenen transgenen Zellen können dann auf Erzeugung oder Veränderung ihres Ertrags bewertet werden, z. B. ihrer ertragsbezogenen Merkmale, zum Beispiel Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz, und/oder Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal. Ebenso können Pflanzenexpressionsvektoren, die die hierin offenbarten Nukleinsäuren umfassen, oder Fragmente davon, konstruiert und in eine geeignete Pflanzenzelle wie Arabidopsis, Soja, Raps, Mais, Baumwolle, Reis, Weizen, Medicago truncatula, usw., unter Verwendung von Standardprotokollen transformiert werden. Die erhaltenen transgenen Zellen und/oder davon abgeleiteten Pflanzen können dann auf Erzeugung oder Veränderung ihres Ertrags bewertet werden, z. B. ihrer ertragsbezogenen Merkmale, zum Beispiel Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz, und/oder Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal.
Die Manipulation eines oder mehrerer Gene gemäß Tabelle I und die Kodierung für das YRP von Tabelle II der Erfindung könnte auch zu YRPs mit veränderten Aktivitäten führen, die indirekt und/oder direkt die Toleranz gegen abiotischen Umweltstress von Algen, Pflanzen, Ciliaten, Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum beeinflussen.
Zusätzlich können die hierin offenbarten Sequenzen oder Fragmente davon zum Erzeugen von Knockout-Mutationen in den Genomen verschiedener Organismen verwendet werden, wie Bakterien, Säugetierzellen, Hefezellen und Pflanzenzellen (Girke, T., The Plant Journal 15, 39 (1998)). Die erhaltenen Knockout-Zellen können dann auf ihre Fähigkeit oder Kapazität zur Erhöhung des Ertrags bewertet werden, z. B. Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten, ertragsbezogenen Merkmals, ihre Reaktion auf verschiedene abiotische Umweltstressbedingungen, und die Wirkung des Phänotyps und/oder Genotyps der Mutation. Für andere Methoden einer Geninaktivierung, siehe U.S. Patent Nr. 6,004,804 und Puttaraju et al., Nature Biotechnology 17, 246 (1999).
Die oben genannten Mutagenesestrategien für YRPs, die zu einer Erhöhung des Ertrags führen, z. B. einer Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel einer Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals, sollen nicht einschränkend sein und Variationen dieser Strategien sind für einen Fachmann sofort offensichtlich. Unter Verwendung solcher Strategien und Eingliederung der hierin offenbarten Mechanismen können die Nukleinsäure und Polypeptidmoleküle der Erfindung zur Erzeugung von Algen, Ciliaten, Pflanzen, Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum verwendet werden, die mutierte YRP Nukleinsäure und Polypeptidmoleküle exprimieren, so dass die Toleranz gegen abiotischen Umweltstress und/oder Ertrag verbessert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper bereit, die spezifisch an ein YRP oder einen Teil davon binden, wie durch eine hierin beschriebene Nukleinsäure kodiert. Antikörper können durch viele allgemein bekannte Methoden erzeugt werden (siehe, z. B. Harlow und Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Kurz gesagt, gereinigtes Antigen kann in ein Tier in einer Menge und in Intervallen injiziert werden, die ausreichen, um eine Immunreaktion hervorzurufen. Antikörper können entweder direkt gereinigt werden oder es können Milzzellen von dem Tier erhalten werden. Die Zellen können dann mit einer unsterblichen Zellelinie fusioniert und auf Antikörpersekrektion gescreent werden. Die Antikörper können zum Screenen von Nukleinsäure-Klonbibliotheken auf Zellen verwendet werden, die Antigen sezernieren. Diese positiven Klone können dann sequenziert werden. Siehe, zum Beispiel, Kelly et al., Bio/Technology 10, 163 (1992); Bebbington et al., Bio/Technology 10, 169 (1992).
Die Phrasen ”bindet selektiv” und ”bindet spezifisch” mit dem Polypeptid beziehen sich auf eine Bindungsreaktion, die für das Vorhandensein des Polypeptids in einer heterogenen Population von Polypeptiden und anderen biologischen Stoffen determinativ ist. Somit binden unter festgelegten Immunoassay-Bedingungen die spezifizierten Antikörper, die an ein bestimmtes Polypeptid gebunden sind, nicht in einer signifikanten Menge an andere Polypeptide, die in der Probe vorhanden sind. Eine selektive Bindung eines Antikörpers unter solchen Bedingungen könnte einen Antikörper erfordern, der wegen seiner Spezifität für ein besonderes Polypeptid gewählt wird. Es kann eine Reihe von Immunoassay-Formaten zum Selektieren von Antikörpern verwendet werden, die selektiv mit einem besonderen Polypeptid binden. Zum Beispiel werden routinemäßig Festphasen-ELISA-Immunoassays zum Selektieren von Antikörpern verwendet, die selektiv mit einem Polypeptid immunreaktiv sind. Siehe Harlow und Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988), wegen einer Beschreibung von Immunoassay-Formaten und Bedingungen, die zum Bestimmen einer selektiven Bindung verwendet werden könnten.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper von verschiedenen Wirten zu erzeugen. Eine Beschreibung von Techniken zur Erzeugung solcher monoklonalen Antikörper findet sich in Stites et al., Hrsg., "Basic and Clinical Immunology", (Lange Medical Publications, Los Altos, Kalif., vierte Auflage) und den darin zitierten Referenzen, und in Harlow und Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988).
Die Genexpression in Pflanzen wird durch die Interaktion von Proteintranskriptionsfaktoren mit spezifischen Nukleotidsequenzen innerhalb der regulatorischen Region eines Gens reguliert. Ein Beispiel für Transkriptionsfaktoren sind Polypeptide, die Zink-Finger-(ZF)Motive enthaften. Jedes ZF Modul ist ungefähr 30 Aminosäuren lang, gefaltet um ein Zinkion. Die DNA Erkennungsdomäne eines ZF Proteins ist eine α-helikale Struktur, die in die große Furche DNA Doppelhelix eingesetzt ist. Das Modul enthält drei Aminosäuren, die an die DNA binden, wobei jede Aminosäure mit einem einzigen Paar in der Target-DNA-Sequenz in Kontakt steht. ZF Motive sind in einer modularen, sich wiederholenden Weise angeordnet, um einen Satz von Finger zu bilden, die eine angrenzende DNA-Sequenz erkennen. Zum Beispiel erkennt ein ZF Motiv mit drei Fingern 9 bp DNA. Hunderte von Proteinen enthalten nachweislich ZF Motive mit 2 bis 37 ZF Modulen in jedem Protein (Isalan M. et al., Biochemistry 37 (35), 12026 (1998); Moore M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (4), 1432 (2001) und Moore M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (4), 1437 (2001); US Patente US 6,007,988 und US 6,013,453 ).
Die regulatorische Region eines Pflanzengens enthält viele kurze DNA-Sequenzen (cis-agierende Elemente), die als Erkennungsdomäne für Transkriptionsfaktoren dienen, einschließlich ZF Proteine. Ähnliche Erkennungsdomänen in verschiedenen Genen ermöglichen die koordinierte Expression von mehreren Gene, die für Enzyme in einem metabolischen Pfad durch herkömmliche Transkriptionsfaktoren kodieren. Eine Variation in den Erkennungsdomänen unter Mitgliedern einer Genfamilie erleichtert Unterschiede in der Genexpression innerhalb derselben Genfamilie, zum Beispiel unter Gewebe und Entwicklungsstufen und in Reaktion auf Umweltbedingungen.
Typische ZF Proteine enthalten nicht nur eine DNA Erkennungsdomäne, sondern auch eine funktionelle Domäne, die dem ZF Protein ermöglicht, die Transkription eines spezifischen Gens zu aktivieren und zu reprimieren. Experimentell wurde eine Aktivierungsdomäne zum aktivieren der Transkription des Target-Gens verwendet ( US Patent 5,789,538 und Patentanmeldung WO 95/19431 ), aber es ist auch möglich, eine Transkriptionsrepressordomäne mit dem ZF zu verbinden und dadurch die Transkription zu hemmen (Patentanmeldungen WO 00/47754 und WO 01/002019 ). Es wurde berichtet, dass eine enzymatische Funktion wie Nukleinsäurespaltung an ZF gebunden werden kann (Patentanmeldung WO 00/20622 ).
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, dass einem Fachmann ermöglicht, die regulatorische Region von einem oder mehreren YRP kodierenden Gene von dem Genom einer Pflanzenzelle zu isolieren und Zink Finger Transkriptionsfaktoren zu gestalten, die an eine funktionelle Domäne gebunden sind, die mit der regulatorischen Region des Gens interagiert. Die Interaktion des Zink Finger Proteins mit dem Pflanzengen kann so gestaltet sein, dass die Expression des Gens verändert wird, und vorzugsweise dadurch eine Erhöhung des Ertrags verliehen wird, z. B. Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze mit einer YRP kodierenden Nukleinsäure bereit, wobei die Expression der Nukleinsäure(n) in der Pflanze zu einer Erhöhung des Ertrags führt, z. B. Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals im Vergleich zu einer Wildtyppflanze umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der eine YRP kodierende Nukleinsäure umfasst, und (b) Erzeugen aus der Pflanzenzelle einer transgenen Pflanze mit verstärkter Toleranz gegen abiotischen Umweltstress und/oder erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze. For eine solche Pflanzentransformation können binäre Vektoren wie pBinAR verwendet werden (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66, 221 (1990)). Ferner sind geeignete binäre Vektoren zum Beispiel pBIN19, pBI101, pGPTV oder pPZP (Hajukiewicz P. et al., Plant Mol. Biol., 25, 989 (1994)).
Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in die T-DNA erfolgen. 5' zu der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich 3' zu der cDNA. Die gewebespezifische Expression kann unter Verwendung eines gewebespezifischen Promotors wie oben angeführt erreicht werden. Ebenso kann jedes andere Promotorelement verwendet werden. Für eine konstitutive Expression innerhalb der gesamten Pflanze kann der CaMV 35S Promotor verwendet werden.
Das exprimierte Protein kann auf ein zelluläres Kompartiment mit Hilfe eines Signalpeptids gerichtet werden, zum Beispiel für Plastide, Mitochondrien oder endoplasmatisches Retikulum (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 4 (15), 285 (1996)). Das Signalpeptid wird 5' in-frame zu der cDNA geklont, um eine subzelluläre Lokalisierung des Fusionsproteins zu archivieren. Ein Fachmann wird erkennen, dass der verwendete Promotor funktionsfähig an die Nukleinsäure derart gebunden sein sollte, dass der Promotor eine Transkription der Nukleinsäure bewirkt, die zu einer Synthese einer mRNA führt, die für ein Polypeptid kodiert.
Andere Methoden zur Transfektion enthalten die direkte Übertragung von DNA in sich entwickelnde Blüten durch Elektroporation oder Agrobacterium-vermittelten Gentransfer. Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung des GV3101 (pMP90) (Koncz und Schell, Mol. Gen. Genet. 204, 383 (1986)) oder LBA4404 (Ooms et al., Plasmid, 7, 15 (1982); Hoekema et al., Nature, 303, 179 (1983)) Agrobacterium tumefaciens Stamms durchgeführt werden. Die Transformation kann durch Standardtransformations- und Regenerationstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13, 4777 (1994); Gelvin und Schilperoort, Plant Molecular Biology Manual, 2. Auflage-Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick B. R. und Thompson J. E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993. – 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Zum Beispiel, kann Raps kann durch Kotyledon- oder Hypokotyltransformation transformiert werden (Moloney et al., Plant Cell Reports 8, 238 (1989); De Block et al., Plant Physiol. 91, 694 (1989)). Die Verwendung von Antibiotika zur Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt vom binären Vektor und dem Agrobacterium-Stamm ab, die für die Transformation verwendet werden. Die Rapssamenselektion wird normalerweise unter Verwendung von Kanamycin als selektierbaren Pflanzenmarker durchgeführt. Agrobacterium-vermittelter Gentransfer zu Flachs kann zum Beispiel unter Verwendung einer Technik durchgeführt werden, die von Mlynarova et al., Plant Cell Report 13, 282 (1994) beschrieben ist Zusätzlich kann eine Transformation von Sojabohne unter Verwendung zum Beispiel einer Technik durchgeführt werden, die im Europäischen Patent Nr. 424 047 , U.S. Patent Nr. 5,322,783 , Europäischen Patent Nr. 397 687 , U.S. Patent Nr. 5,376,543 oder U.S. Patent Nr. 5,169,770 beschrieben ist. Die Transformation von Mais kann durch Teilchenbombardement, Polyethylenglycol-vermittelte DNA-Aufnahme oder durch die Siliziumcarbidfasertechnik erreicht werden (siehe zum Beispiel, Freeling und Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Ein spezifisches Beispiel für eine Maistransformation findet sich in U.S. Patent Nr. 5,990,387 und ein spezifisches Beispiel für eine Weizentransformation findet sich in der PCT Anmeldung Nr. WO 93/07256 .
Das Züchten der modifizierten Pflanzen unter definierten N-Bedingungen in einer besonderen Ausführungsform unter abiotischen Umweltstressbedingungen und das anschließende Screenen und Analysieren der Wachstumseigenschaften und/oder metabolischen Aktivität bewertet die Wirkung der genetischen Modifizierung in Pflanzen auf die Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann gut bekannt. Sie enthalten neben dem Screenen (Römpp Lexikon Biotechnologie, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1992, "screening" S. 701) Trockengewicht, Frischgewicht, Proteinsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese, Evapotranspirationsraten, allgemeinen Pflanzen- und/oder Nutzpflanzenertrag, Blüte, Reproduktion, Samenansatz, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Photosyntheseraten, usw. (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, Band 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seite 469–714, VCH: Weinheim; Belter, P. A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy J. F. und Cabral J. M. S., 1992 Recovery Processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz J. A. und Henry J. D., 1988 Biochemical separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Band 83, Kapitel 11, Seite 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow F. J. (1989) Separation und purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Identifizierung eines Genprodukts, das eine Erhöhung des Ertrags verleiht, z. B. Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtypzelle in einer Zelle eines Organismus, zum Beispiel einer Pflanze, umfassend die folgenden Schritte: (a) Kontaktieren, z. B. Hybridisieren, einiger oder aller Nukleinsäuremoleküle einer Probe, z. B. Zellen, Gewebe, Pflanzen oder Mikroorganismen oder einer Nukleinsäurebibliothek, die ein Kandidatgen enthalten kann, das für ein Genprodukt kodiert, das eine Erhöhung des Ertrags verleiht, z. B. Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung mit einem Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I A oder B dargestellt, oder einem funktionellen Homolog davon; (b) Identifizieren des Nukleinsäuremoleküles, das unter entspannten stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül hybridisiert, insbesondere an die Nukleinsäuremolekülsequenz, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt ist, und, wahlweise, Isolieren des cDNA Klons voller Länge oder des vollständigen genomischen Klons; (c) Identifizieren der Kandidat Nukleinsäuremoleküle oder eines Fragments davon in Wirtszellen, vorzugsweise in einer Pflanzenzelle; (d) Erhöhen der Expression der identifizierten Nukleinsäuremoleküle in den Wirtszellen, für die eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress und/oder ein erhöhter Ertrag gewünscht sind; (e) Testen des Wertes der verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress und/oder des erhöhten Ertrags der Wirtszellen; und (f) Identifizieren des Nukleinsäuremoleküls und seines Genprodukts, das eine Erhöhung des Ertrags verleiht, z. B. Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals in der Wirtszelle verglichen mit dem Wildtyp.
Entspannte Hybridisierungsbedingungen sind: Nach Standardhybridisierungsprozeduren können Waschschritte bei Bedingungen niederer bis mittlerer Stringenz durchgeführt werden, mit Waschbedingungen von 40–55°C und Salzbedingungen zwischen 2 × SSC und 0,2 × SSC mit 0,1% SDS im Vergleich zu stringenten Waschbedingungen wie z. B. 60° bis 68°C mit 0,1% SDS. Weitere Beispiele finden sich in den oben angeführten Referenzen für die stringenten Hybridisierungsbedingungen. Üblicherweise werden Waschschritte mit einer Erhöhung der Stringenz und Länge wiederholt, bis ein nützliches Signal/Rausch-Verhältnis nachgewiesen wird, und hängen von vielen Faktoren ab, wie dem Target, z. B. seiner Reinheit, dem GC-Gehalt, der Größe usw., der Sonde, z. B. ihrer Länge, ob es sich um eine RNA- oder eine DNA-Sonde handelt, den Salzbedingungen, der Wasch- oder Hybridisierungstemperatur, der Wasch- oder Hybridisierungszeit usw.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Identifizierung eines Genprodukts, dessen Expression einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal in einer Zelle, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Identifizieren eines Nukleinsäuremoleküls in einem Organismus, das mindestens 20%, vorzugsweise 25%, bevorzugter 30%, noch bevorzugter sind 35%, 40% oder 50%, noch mehr bevorzugt sind 60%, 70% oder 80%, ganz besonders bevorzugt sind 90% oder 95% oder mehr zu dem Nukleinsäuremolekül homolog ist, das für ein Protein kodiert, das das Polypeptidmolekül umfasst, Wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das ein Polynukleotid umfasst, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1 dargestellt, oder ein Homolog davon, wie hierin beschrieben, zum Beispiel durch Homologiesuche in einer Datenbank; (b) Verstärken der Expression der identifizierten Nukleinsäuremoleküle in den Wirtszellen; (c) Bewerten des Wertes der Verstärkung in der Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals in den Wirtszellen; und (d) Identifizierender Wirtszelle, in der die verstärkte Expression eine Erhöhung des Ertrags verleiht, z. B. eine Erhöhung eines ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals in der Wirtszelle verglichen mit einem Wildtyp.
Ferner kann das hierin offenbarte Nukleinsäuremolekül, insbesondere das Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I A oder B dargestellt ist, ausreichend zu den Sequenzen von verwandten Spezies homolog sein, so dass diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte in einem verwandten Organismus oder für eine zugehörige Kartierung dienen kann. Ferner kann die natürliche Variation in den genomischen Regionen, die hierin offenbarten Nukleinsäuren entsprechen, insbesondere dem Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I A oder B dargestellt ist, oder ein Homolog davon zu einer Variation in der Aktivität der hierin offenbarten Proteine führen, insbesondere der Proteine, die das Polypeptide wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II A oder B dargestellt umfassen, oder umfassend die Konsensussequenz oder die Polypeptidmotiv wie in Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und ihre Homologe, und folglich zu einer natürlichen Variation eines erhöhten Ertrags, z. B. eines erhöhten ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals.
Folglich ist eine natürliche Variation schließlich auch in Form von mehreren aktiven allelen Varianten vorhanden, die bereits zu einer relativen Erhöhung im Ertrag führen, z. B. einer Erhöhung in einem ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder einem anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmal. Verschiedene Varianten des hierin offenbarten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere der Nukleinsäure, die das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I A oder B dargestellt, umfasst, das verschiedenen Werten eines erhöhten Ertrags entspricht, z. B. verschiedenen Werten eines erhöhten ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel einer unterschiedlichen Verstärkung der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einer Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals, können identifiziert und für eine Marker-unterstützte Vermehrung für einen erhöhten Ertrag verwendet werden, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vermehrung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder andere, umfassend (a) das Selektieren einer ersten Pflanzenvarietät mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhtem ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder andere, basierend auf einer erhöhten Expression einer Nukleinsäure der Erfindung wie hierin offenbart, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I A oder B dargestellt, umfasst oder ein Polypeptid, das ein Polypeptid, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II A oder B dargestellt, umfasst, oder umfassend eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, oder ein Homolog davon, wie hierin beschrieben; (b) Assoziieren des Wertes des erhöhten Ertrags, z. B. des erhöhten ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals mit dem Expressionswert oder der genomischen Struktur eines Gens, das für das Polypeptid oder das Nukleinsäuremolekül kodiert; (c) Kreuzen der ersten Pflanzevarietät mit einer zweiten Pflanzenvarietät, die sich signifikant in ihrem Wert des erhöhten Ertrags unterscheidet, z. B. eines erhöhten ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals; und (d) Identifizieren, welche der Nachkommenvarietäten gute erhöhte Werte eines erhöhten Ertrags aufweist, z. B. eines erhöhten ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals durch den Expressionswert des Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls oder der genomischen Struktur der Gene, die für das Polypeptid oder Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodieren.
In einer Ausführungsform ist der Expressionswert des Gens gemäß Schritt (b) erhöht.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Prozess für die Identifizierung einer Verbindung, die einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, einer Pflanze oder einem Teil davon, umfassend die Schritte: (a) Züchten einer Pflanzenzelle; einer Pflanze oder eines Teils davon, um eine Pflanze beizubehalten, die das Polypeptid, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt, exprimiert oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert ist, das ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt umfasst, oder ein Homolog davon, wie hierin beschrieben, oder ein Polynukleotid, das für das Polypeptid kodiert und einen erhöhten Ertrag verleiht, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon; eine nicht transformierte Wildtyppflanze oder einen Teils davon und Bereitstellen eines Lesesystems, das imstande ist, mit dem Polypeptid unter geeigneten Bedingungen zu interagieren, die die Interaktion des Polypeptids mit diesem Lesesystem ermöglichen, in Gegenwart einer chemischen Verbindung oder einer Probe, die mehrere chemische Verbindungen umfasst und imstande ist, ein nachweisbares Signal als Reaktion auf die Bindung einer chemischen Verbindung an das Polypeptid unter Bedingungen bereitzustellen, die die Expression des Lesesystems und des Proteins, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt, oder das durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert ist, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I Anwendung Nr. 1 dargestellt, oder eines Homologs davon, wie hierin beschrieben, ermöglichen; und (b) Identifizieren, ob die chemische Verbindung ein effektiver Agonist ist, indem das Vorhandensein oder Fehlen oder das Verringern oder Erhöhen eines Signals nachgewiesen wird, das durch das Lesesystem erzeugt wird.
Die Verbindung kann chemisch synthetisiert oder mikrobiologisch erzeugt werden, und/oder zum Beispiel in Proben enthalten sein, z. B. Zellextrakten von z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen, z. B. Pathogenen. Ferner könnten die Verbindung(en) nach dem Stand der Technik bekannt sein, aber bisher war nicht bekannt, dass sie zur Unterdrückung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung imstande sind. Das Reaktionsgemisch könnte ein zellfreies Extrakt sein oder könnte eine Zelle oder Gewebekultur umfassen. Geeignete Einstellungen für den Prozess zur Identifizierung einer Verbindung der Erfindung sind dem Fachmann bekannt und sind, zum Beispiel in Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, dritte Auflage (1994), insbesondere Kapitel 17, allgemein beschrieben. Die Verbindungen könnten z. B. dem Reaktionsgemisch, Kulturmedium zugegeben, in die Zelle injiziert oder auf die Pflanze gesprüht werden.
Wenn eine Probe, die eine Verbindung enthält, in dem Prozess identifiziert wird, ist es entweder möglich, die Verbindung von der ursprünglichen Probe zu isolieren, die identifiziert wurde, dass sie die Verbindung enthält, die zur Aktivierung oder Verstärkung oder Erhöhung des Ertrags imstande ist, z. B. des ertragsbezogenen Merkmals, zum Beispiel der Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder eines anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmals im Vergleich zu einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyp, oder die ursprüngliche Probe weiter zu unterteilen, wenn sie zum Beispiel aus mehreren verschiedenen Verbindungen besteht, um somit die Anzahl verschiedener Substanzen pro Probe zu verringern, und das Verfahren mit den Unterteilungen der ursprünglichen Probe zu wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Proben können die oben beschriebenen Schritte mehrere Male durchgeführt werden, vorzugsweise bis die Probe, die gemäß dem Prozess identifiziert wurde, nur eine begrenzte Anzahl an Substanzen oder nur eine Substanz umfasst. Vorzugsweise umfasst die Probe Substanzen ähnlicher chemischer und/oder physikalischer Eigenschaften und insbesondere sind die Substanzen identisch. Vorzugsweise ist die Verbindung, die gemäß der oben beschriebenen Methode identifiziert ist, oder ihr Derivat ferner in einer Form formuliert, die für die Anwendung in der Pflanzenvermehrung oder Pflanzenzell- und Gewebekultur geeignet ist.
Die Verbindungen, die gemäß dem Prozess getestet und identifiziert werden können, könnten Expressionsbibliotheken sein, z. B. cDNA Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Hormone, Peptidomimetika, PNAs oder dergleichen (Milner, Nature Medicine 1, 879 (1995); Hupp, Cell 83, 237 (1995); Gibbs, Cell 79, 193 (1994), und oben zitierte Referenzen). Die Verbindungen können auch funktionelle Derivate oder Analoge von bekannten Inhibitoren oder Aktivatoren sein. Methoden für die Zubereitung von chemischen Derivativen und Analogen sind dem Fachmann gut bekannt und sind zum Beispiel in Beilstein, Handbock of Organic Chemistry, Springer, New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010 U.S.A. und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA, beschrieben. Ferner können die Derivate und Analoge auf ihre Wirkungen nach Methoden getestet werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Ferner können zum Beispiel Peptidomimetika und/oder computerunterstütztes Design geeigneter Derivate und Analoge gemäß den oben beschriebenen Verfahren verwendet werden. Die Zelle oder das Gewebe, die bzw. das in dem Prozess verwendet werden kann, ist vorzugsweise eine Wirtszelle, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe der Erfindung, das hierin zuvor in den Ausführungsformen beschrieben wurde.
Somit betrifft in einer weiteren Ausführungsform die Erfindung eine Verbindung, die gemäß dem Verfahren zur Identifizierung eines Agonisten der Erfindung erhalten oder identifiziert wird, wobei die Verbindung ein Antagonist des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ist.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ferner eine Verbindung, die durch das Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung identifiziert wird.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Antikörper, der die Verbindung oder den Agonisten der vorliegenden Erfindung spezifisch erkennt.
Die Erfindung betrifft auch eine diagnostische Zusammensetzung, die mindestens eines der oben genannten Nukleinsäuremoleküle, ein Antisense-Nukleinsäuremolekül, RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, ein Co-Suppressionsmolekül, Ribozym, Vektoren, Proteine, Antikörper oder Verbindungen der Erfindung und wahlweise geeignete Mittel für den Nachweis umfasst.
Die diagnostische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist geeignet für das Isolieren einer mRNA aus einer Zelle und zum In-Kontakt-Bringen der derart erhaltenen mRNA mit einer Sonde, die eine Nukleinsäuresonde, wie oben beschrieben, umfasst, unter hybridisierenden Bedingungen, das Nachweisen des Vorhandenseins von mRNA, die an die Sonde hybridisiert ist und dadurch Nachweisen der Expression des Proteins in der Zelle. Ferner umfassen Methoden zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung Immuntechniken, die nach dem Stand der Technik gut bekannt sind, zum Beispiel den enzymgebundenen Immunoadsorbens-Assay. Ferner ist es möglich, die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung als molekulare Marker oder Primer in der Pflanzenvermehrung zu verwenden. Geeignete Mittel für einen Nachweis sind einem Fachmann gut bekannt, z. B. Puffer und Lösungen für Hybridisierungstests, z. B. die oben genannten Lösungen und Puffer, und ferner sind Mittel für Southern-, Western-, Northern- usw. Blots, wie z. B. in Sambrook et al. beschrieben, bekannt. In einer Ausführungsform enthalten diagnostische Zusammensetzungen PCR Primer, die für einen spezifischen Nachweis des Vorhandenseins oder des Expressionswertes des Nukleinsäuremoleküls gestaltet sind, das in dem Prozess der Erfindung reduziert werden soll, z. B. das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, oder um zwischen verschiedenen Varianten oder Allelen des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung zu unterscheiden oder dessen Aktivität in dem Prozess der Erfindung verringert werden soll.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, das das Nukleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle, das Polypeptid oder die Antisense, RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, ein Co-Suppressionsmolekül, oder Ribozymmolekül, oder das virale Nukleinsäuremolekül, den Antikörper, die Pflanzenzelle, die Pflanze oder das Pflanzengewebe, den erntbaren Teil, das Vermehrungsmaterial und/oder die Verbindung und/oder den Agonisten, wie gemäß dem Verfahren der Erfindung identifiziert, umfasst.
Die Verbindungen des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behältern wie Ampullen verpackt werden, wahlweise min Puffern und/oder Lösung. Falls zutreffend können eine oder mehrere der Komponenten in ein und demselben Behälter verpackt werden. Zusätzlich oder als Alternative können eine oder mehrere der Komponenten an einen festen Träger adsorbiert sein, wie z. B. ein Nitrozellulosefilter, eine Glasplatte, einen Chip oder eine Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte. Das Kit kann für jede der hierin beschriebenen Methoden und Ausführungsformen verwendet werden, z. B. für die Produktion der Wirtszellen, transgenen Pflanzen, pharmazeutischen Zusammensetzungen, den Nachweis von homologen Sequenzen, die Identifizierung von Antagonisten oder Agonisten, wie Nahrungsmittel oder Futtermittel oder als eine Ergänzung davon oder als eine Ergänzung für die Behandlung von Pflanzen, usw. Ferner kann das Kit Anweisungen für die Verwendung des Kits für eine der Ausführungsformen enthalten. In einer Ausführungsform umfasst das Kit ferner ein Nukleinsäuremolekül, das für ein oder mehrere der oben genannten Proteine kodiert, und/oder einen Antikörper, einen Vektor, eine Wirtszelle, eine Antisense-Nukleinsäure, eine Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe oder eine Pflanze. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Kit PCR Primer für den Nachweis und die Unterscheidung des zu reduzierenden Nukleinsäuremoleküls, das in dem Prozess der Erfindung verringert werden soll, z. B. des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Produktion einer landwirtschaftlichen Zusammensetzung, die das Nukleinsäuremolekül für die Verwendung gemäß dem Prozess der Erfindung, das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, den Vektor der Erfindung, das Antisense, RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Co-Suppressionsmolekül, Ribozym, oder den Antikörper der Erfindung, das virale Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das Polypeptid der Erfindung bereitstellt, oder die Schritte der Methode gemäß der Erfindung umfasst für das Identifizieren der Verbindung oder des Agonisten; und Formulieren des Nukleinsäuremoleküls, des Vektors oder des Polypeptids der Erfindung oder des Agonisten oder der Verbindung, die gemäß den Verfahren oder Prozessen der vorliegenden Erfindung identifiziert ist, oder unter Verwendung der Gegenstände der vorliegenden Erfindung in einer Form, die als pflanzliche landwirtschaftliche Zusammensetzung anwendbar ist.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Produktion der Pflanzenkultur-Zusammensetzung, umfassend die Schritte der Methode der vorliegenden Erfindung; und Formulieren der identifizierten Verbindung in einer Form, die als landwirtschaftliche Zusammensetzung annehmbar ist.
Unter ”als landwirtschaftliche Zusammensetzung annehmbar” wird verstanden, dass eine solche Zusammensetzung den Gesetzen entspricht, die den Gehalt an Fungiziden, Pflanzennährstoffen, Herbiziden, usw. regeln. Vorzugsweise schädigt eine solche Zusammensetzung die geschützten Pflanzen und die Tiere (einschließlich Menschen) nicht, die damit ernährt werden.
In der gesamten Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen Bezug genommen. Die Offenbarungen aller dieser Veröffentlichungen und jene Referenzen, die in diesen Veröffentlichungen zitiert, sind, werden hierin in ihrer Gesamtheit zum Zwecke der Bezugnahme zitiert, um den Stand der Technik, auf den sich diese Erfindung bezieht, vollständig zu beschreiben.
Es sollte auch klar sein, dass das Vorhergesagte bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betrifft und dass zahlreiche Änderungen und Variationen darin vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Die Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind. Im Gegenteil, es ist eindeutig klar, dass verschiedene Ausführungsformen, Modifizierungen und Äquivalente davon nach dem Lesen der vorliegenden Beschreibung für den Fachmann nahe liegend sind, ohne vom Wesen der vorliegenden Erfindung und/oder dem Umfang der Ansprüche Abstand zu nehmen.
In einer Ausführungsform führt der erhöhte Ertrag zu einer Erhöhung der Produktion eines spezifischen Bestandteils, einschließlich, ohne Einschränkung, eines bzw. einer verstärkten und/oder verbesserten Zuckergehalts oder Zuckerzusammensetzung, eines bzw. einer verstärkten oder verbesserten Stärkegehalts und/oder Stärkezusammensetzung, eines bzw. einer verstärkten und/oder verbesserten Ölgehalts und/oder Ölzusammensetzung (wie verstärkten Samenölgehalts), eines bzw. einer verstärkten oder verbesserten Proteingehalts und/oder Proteinzusammensetzung (wie verstärkten Samenproteingehalts), eines bzw. einer verstärkten und/oder verbesserten Vitamingehalts und/oder Vitaminzusammensetzung, oder dergleichen.
Ferner umfasst in einer Ausführungsform das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Ernten der Pflanze oder eines Teils der Pflanze, die erzeugt oder gepflanzt wurde, und das Erzeugen eines Brennstoffs mit oder aus der geernteten Pflanze oder einem Teil davon. Ferner, umfasst in einer Ausführungsform das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Ernten eines Pflanzenteils, der für die Stärkeisolierung nützlich ist, und das isolieren von Stärke aus diesem Pflanzenteil, wobei die Pflanze eine Pflanze ist, die für eine Stärkeproduktion nützlich ist, z. B. Kartoffel. Ferner umfasst in einer Ausführungsform das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Ernten eines Pflanzenteils, der für die Ölisolierung nützlich ist, und das Isolieren von Öl aus diesem Pflanzenteil, wobei die Pflanze eine Pflanze ist, die für eine Ölproduktion nützlich ist, z. B. Ölraps oder Canola, Baumwolle, Soja, oder Sonnenblume,
Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform der Ölgehalt in Maissamen erhöht. Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Produktion von Pflanzen mit erhöhtem Ölgehalt pro Morgen (erntbares Öl).
Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform der Ölgehalt in Sojasamen erhöht. Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Produktion von Sojapflanzen mit erhöhtem Ölgehalt pro Morgen (erntbares Öl).
Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform der Ölgehalt in OSR-Samen erhöht. Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Produktion von OSR-Pflanzen mit erhöhtem Ölgehalt pro Morgen (erntbares Öl).
Zum Beispiel betrifft die vorliegende Erfindung die Produktion von Baumwollpflanzen mit erhöhtem Ölgehalt pro Morgen (erntbares Öl). Zum Zwecke der Bezugnahme sind ferner die folgenden Anmeldungen mit den vorliegenden Anmeldungen zitiert: EP Patent Anmeldung EP 08164899.0 eingereicht am 23.09.2008, EP Patentanmeldung EP 08169680,9 , eingereicht am 21.11.2008 und EP Patentanmeldung EP 08169875.5 , eingereicht am 25.11.2008.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, ohne durch die Offenbarung der Beispiele eingeschränkt zu sein.
Beispiel 1: Manipulation von Arabidopsis-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder einem anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmal durch überexprimierende YLR Protein Gene, z. B. exprimierende Gene der vorliegenden Erfindung.
Klonieren der Sequenzen der vorliegenden Erfindung, wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt, für die Expression in Pflanzen.
Falls nicht anders angegeben, werden Standardmethoden, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, verwendet.
Die erfindungsgemäße Sequenzen, wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt, wurden durch PCR amplifiziert, wie in dem Protokoll der Pfu Ultra, Pfu Turbo oder Herculase DNA Polymerase (Strategen) beschrieben. Die Zusammensetzung für das Protokoll der Pfu Ultra, Pfu Turbo oder Herculase DNA Polymerase war wie folgt 1 × PCR Puffer (Stratagene), 0,2 mM von jedem dNTP, 100 ng genomische DNA von Saccharomyces cerevisiae (Stamm S288C; Research Genetics, Inc., nun Invitrogen), Escherichia coli (Stamm MG1655; E. coli Genetic Stock Center), Synechocystis sp. (Stamm PCC6803), Azotobacter vinelandii (Stamm N. R. Smith, 16), Thermus thermophilus (HB8) oder 50 ng cDNA von verschiedenen Geweben und Entwicklungsstufen von Arabidopsis thaliana (ecoArt Columbia), Physcomitrella patens, Glycine max (Varietät Resnick), oder Zea mays (Varietät B73, Mo17, A188), 50 pmol Vorwärts-Primer, 50 pmol reverses Primer, mit oder ohne 1 M Betain, 2,5 u Pfu Ultra, Pfu Turbo oder Herculase DNA Polymerase.
Die Amplifikationszyklen waren wie folgt:
1 Zyklus von 2–3 Minuten bei 94–95°C, dann 25–36 Zyklen mit 30–60 Sekunden bei 94–95°C, 30–45 Sekunden bei 50–60°C und 210–480 Sekunden bei 72°C, gefolgt von 1 Zyklus von 5–10 Minuten bei 72°C, dann 4–16°C – vorzugsweise für Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Synechocystis sp., Azotobacter vinelandii, Thermus thermophilus.
Im Fall von Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Physcomitrella patens, Zea mays waren die Amplifikationszyklen wie folgt:
1 Zyklus mit 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 61°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 2 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 3 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 59°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 4 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 58°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 25 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 57°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 1 Zyklus mit 10 Minuten bei 72°C, dann schließlich 4–16°C.
RNA wurde mit dem RNeasy Plant Kit nach dem Standardprotokoll (Qiagen) erzeugt und Superscript II Reverse Transkriptase wurde zum Erzeugen einer doppelsträngigen cDNA nach dem Standardprotokoll (Invitrogen) verwendet.
ORF-spezifische Primerpaare für die zu exprimierenden Gene sind in Tabelle III, Spalte 7 dargestellt. Die folgenden Adapter-Sequenzen wurden den Saccharomyces cerevisiae ORF-spezifischen Primern (siehe Tabelle III) zu Klonierungszwecken zugegeben:
Diese Adapter-Sequenzen ermöglichen ein Klonieren des ORF in die verschiedenen Vektoren, die die Resgen-Adapteren enthalten, siehe Tabellenspalte E von Tabelle VII.
Die folgenden Adaptersequenzen wurden zu Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Synechocystis sp., Azotobacter vinelandii, Thermus thermophilus „Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Physcomitrella patens, oder Zea mays ORF spezifischen Primern zu Klonierungszwecken zugegeben:
Diese Adapter-Sequenzen ermöglichen ein Klonieren des ORF in die verschiedenen Vektoren, die die Colic Adapter enthaften, siehe Tabellenspalte E von Tabelle VII.
Daher wurden für die Amplifikation und das Klonen von Saccharomyces cerevisiae SEQ ID NR: 1206, ein Primer, der aus der Adapter-Sequenz i) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 1238 besteht, und ein zweiter Primer, der aus der Adapter-Sequenz ii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 1239 besteht, verwendet.
Für die Amplifikation und das Klonen von Escherichia coli SEQ ID NR: 63, wurde ein Primer, der aus der Adapter-Sequenz iii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 73 und ein zweiter Primer, der aus der Adapter-Sequenz iiii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 74 besteht, verwendet.
Für die Amplifikation und das Klonen von Synechocystis sp. SEQ ID NR: 1105, wurde ein Primer, der aus der Adapter-Sequenz iii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 1199 und ein zweiter Primer, der aus der Adapter-Sequenz iiii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 1200 besteht, verwendet.
Für die Amplifikation und das Klonen von Glycine max SEQ ID NR: 1702, wurde ein Primer, der aus der Adapter-Sequenz iii) und der ORF-spezifischen SEQ ID NR: 1762 und ein zweiter Primer, der aus der Adapter-Sequenz iiii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 1763 besteht, verwendet.

Anhand dieser Beispiele kann jede Sequenz, die in Tabelle I offenbart ist, vorzugsweise Spalte 5, durch Fusionieren der Adapter-Sequenzen an die jeweils spezifischen Primer-Sequenzen, wie in Tabelle III, Spalte 7 offenbart, unter Verwendung der jeweiligen Vektoren, die in Tabelle VII dargestellt sind, geklont werden. Tabelle VII. Überblick über die verschiedenen Vektoren, die zum Klonen der ORFs verwendet werden und Angabe ihrer SEQ IDs (Spalte A), ihrer Vektornamen (Spalte B), der Promotoren, die sie für die Expression der ORFs enthalten (Spalte C), der zusätzlichen künstlichen Targeting-Sequenz (Spalte D), der Adapter-Sequenz (Spalte E), der Expressionsart, die durch den in Spalte B genannten Promotor verliehen wird (Spalte F) und der Nummer der Figur (Spalte G).

A	B	C	D	E	F	G
SEQ ID	Vektorname	Promotor	Target Seq.	Adapter Seq.	Expressionsart	Fig.
9	pMTX0270p	Super		Colic	nicht zielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	6
31	pMTX155	Big35S		Resgen	nicht zielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	7
32	VC-MME354-1QCZ	Super	FNR	Resgen	plastidäre zielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	3
34	VC-MME356-1QCZ	Super	IVD	Resgen	mitochondriale zielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	8
36	VC-MME301-1QCZ	USP		Resgen	nicht zielgerichtete Expression vorzugsweise in Samen	9
37	pMTX461korrp	USP	FNR	Resgen	plastidäre zielgerichtete Expression vorzugsweise in Semen	10
39	VC-MME462-1QCZ	USP	IVD	Resgen	mitochondriale zielgerichtete Expression vorzugsweise in Samen	11
41	VC-MME220-1qcz	Super		Colic	nicht zielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	1
42	VC-MME432-1qcz	Super	FNR	Colic	plastidäre zielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	4
44	VC-MME431-1qcz	Super	IVD	Colic	mitochondriale zielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	12
46	VC-MME221-1qcz	PcUbi		Colic	nicht zielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	2
47	pMTX447korr	PcUbi	FNR	Colic	plastidäre zielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	13
49	VC-MME445-1qcz	PcUbi	IVD	Colic	mitochondriale zielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	14
51	VC-MME289-1qcz	USP		Colic	nicht zielgerichtete Expression vorzugsweise in Samen	15
52	VC-MME464-1qcz	USP	FNR	Colic	plastidäre zielgerichtete Expression vorzugsweise in Samen	16
54	VC-MME465-1qcz	USP	IVD	Colic	mitochondriale zielgerichtete Expression in vorzugsweise Samen	17
56	VC-MME489-1QCZ	Super		Resgen	nicht zielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	5

Beispiel 1b)
Konstruktion von binären Vektoren für eine nicht zielgerichtete Expression von Proteinen.
”Nicht-zielgerichtete” Expression bedeutet in diesem Zusammenhang, dass keine zusätzliche Targeting-Sequenz dem zu exprimierenden ORF hinzugefügt wurde.
Für eine nicht zielgerichtete Expression waren die binären Vektoren, die zum Klonen verwendet wurden, VC-MME220-1qcz SEQ ID NR.: 41 (1), VC-MME221-1qcz SEQ ID NO 46 (2) bzw. VC-MME489-1QCZ SEQ ID NR: 56 (5). Die binären Vektoren, die zum Klonen der Targeting-Sequenz verwendet wurden, waren VC-MME489-1QCZ SEQ ID NR: 56 (5) bzw. pMTX0270p SEQ ID NR: 9 (6). Andere nützliche binäre Vektoren sind dem Fachmann bekannt; ein Überblick über binäre Vektoren und ihre Verwendung findet sich in in Hellen R., Mullineaux P. und Klee H., (Trends in Plant Science, 5 (10), 446 (2000)). Solche Vektoren müssen gleichermaßen mit geeigneten Promotoren und Targeting-Sequenzen ausgestattet sein.
Beispiel 1c): Amplifikation der plastidären Targeting-Sequenz des Gens FNR von Spinacia oleracea und Konstruktion des Vektors für eine Plastid-zielgerichtete Expression in vorzugsweise grünen Geweben oder vorzugsweise in Samen.
Zum Amplifizieren der Targeting-Sequenz des FNR Gens von S. oleracea, wurde genomische DNA von Blättern von 4 Wochen alten S. oleracea Pflanzen extrahiert (DNeasy Plant Mini Kit, Qiagen, Hilden). Die gDNA wurde als Template für eine PCR verwendet.
Um das Klonen der Transit-Sequenz in den Vektor VC-MME489-1QCZ und VC-MME301-1QCZ zu ermöglichen wurde eine EcoRI Restriktionsenzym-Erkennungssequenz sowohl dem Vorwärts- wie auch reversen Primer zugegeben, während zum Klonen in den Vektoren pMTX0270p, VC-MME220-1qcz, VC-MME221-1qcz und VC-MME289-1qcz eine PmeI Restriktionsenzym-Erkennungssequenz dem Vorwärts-Primer und eine NcoI Stelle dem reversen Primer zugegeben wurde.
Die erhaltene Sequenz SEQ ID NR: 29, amplifiziert von genomischer Spinat-DNA, umfasste eine 5'UTR (bp 1-165), und die Kodierungsregion (bp 166-273 und 351-419). Die Kodierungssequenz ist durch eine intronische Sequenz von bp 274 bis bp 350 unterbrochen:
gcataaacttatcttcatagttaccactccaatttgctccttgaatctcctccacccaatacataatccactcctccatcacccacttcactactaaatcaaacttaactctgtttttctctctcctcctttcatttcttattccaatcatcgtactccgccatgaccaccgctgtcaccgccgctgtttctttcccctctaccaaaaccacctctctccgcccgaagctcctccgtcatttcccctgaca aaatcagctacaaaaaggtgattcccaatttcactgtgttttttattaataatttgttattttgatgatgagatgattaatttgggtgctgcaggttcctttgtactacaggaatgtatctgcaactgggaaaatgggacccatcagggcccagatcgcctct
(SEQ ID NR: 29)
Das PCR Fragment, das mit den Primern FNR5EcoResgen und FNR3EcoResgen abgeleitet wurde, wurde mit EcoRI aufgeschlossen und in die Vektoren VC-MME489-1QCZ und VC-MME301-1QCZ ligiert, die auch mit EcoRI aufgeschlossen worden waren. Die korrekte Ausrichtung der FNR Targeting-Sequenz wurde durch Sequenzierung getestet. Die Vektoren, die in diesem Ligationsschritt erzeugt wurden, waren VC-MME354-1QCZ bzw. pMTX461korrp.
Das PCR Fragment, das mit den Primern FNR5PmeColic und FNR3NcoColic abgeleitet wurde, wurde mit PmeI und NcoI aufgeschlossen und in die Vektoren pMTX0270p, VC-MME220-1qcz, VC-MME221-1qcz und VC-MME289-1qcz ligiert, die mit SmaI und NcoI aufgeschlossen worden waren. Die Vektoren, die in diesem Ligationsschritt erzeugt wurden, waren VC-MME432-1qcz, VC-MME464-1qcz bzw. pMTX447korr.
Für eine plastidär-zielgerichtete konstitutive Expression in vorzugsweise grünen Geweben wurde ein künstlicher Promotor A(ocs)3AmasPmas Promotor (Super Promotor))(Ni et al. Plant Journal 7, 661 (1995), WO 95/14098 ) im Zusammenhang mit dem Vektor VC-MME354-1QCZ für ORFs von Saccharomyces cerevisiae und im Zusammenhang mit dem Vektor VC-MME432-1qcz für ORFs von Escherichia coli verwendet, was in jedem Fall zu einer ”in-frame” Fusion der FNR Targeting-Sequenz mit den ORFs führte.
Für eine plastidär-zielgerichtete Expression in vorzugsweise Samen wurde der USP Promotor (Bäumlein et al., Mol Gen Genet. 225(3): 459–67 (1991)) im Zusammenhang mit entweder dem Vektor
pMTX461korrp für ORFs von Saccharomyces cerevisiae oder im Zusammenhang mit dem Vektor VC-MME464-1qcz für ORFs von Escherichia coli verwendet, was in jedem Fall zu einer ”in-frame” Fusion der FNR Targeting-Sequenz mit den ORFs führte.
Für eine plastidär-zielgerichtete konstitutive Expression in vorzugsweise grünen Geweben und Samen wurde der PcUbi Promotor im Zusammenhang mit dem Vektor pMTX447korr für ORFs von Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Synechocystis sp., Azotobacter vinelandii, Thermus thermophilus, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Physcomitrella patens oder Zea mays verwendet, was in jedem Fall zu einer ”in-frame” Fusion der FNR Targeting-Sequenz mit den ORFs führte.
Beispiel 1d): Konstruktion von binären Vektoren für mitochondriale-zielgerichtete Expression von Proteinen: Amplifikation der mitochondrialen Targeting-Sequenz des Gens IVD von Arabidopsis thaliana und Konstruktion des Vektors für die mitochondriale-zielgerichtete Expression in vorzugsweise grünen Geweben oder vorzugsweise in Samen.
Zum Amplifizieren der Targeting-Sequenz des IVD Gens von A. thaliana, wurde genomische DNA von Blättern von A. thaliana Pflanzen extrahiert (DNeasy Plant Mini Kit, Qiagen, Hilden). Die gDNA wurde als Template für eine PCR verwendet.
Um das Klonen der Transit-Sequenz in die Vektoren VC-MME489-1QCZ und VC-MME301-1QCZ zu ermöglichen, wurde eine EcoRI Restriktionsenzym-Erkennungssequenz sowohl dem Vorwärts- wie auch reversen Primer hinzugefügt, während für das Klonen in den Vektoren VC-MME220-1qcz, VC-MME221-1qcz und VC-MME289-1qcz eine PmeI Restriktionsenzym-Erkennungssequenz dem Vorwärts-Primer und eine NcoI Stelle dem reversen Primer hinzugefügt wurde.
Die erhaltene Sequenz (SEQ ID NR: 61), die von genomischer A. thaliana DNA mit IVD5EcoResgen und IVD3EcoResgen amplifiziert wurde, umfasste 81 bp:
Atgcagaggtttttctccgccagatcgattctcggttacgccgtcaagacgcggaggaggtctttctctctcgttcttcg
SEQ ID NR: 61
Die erhaltene Sequenz (SEQ ID NR: 62), die von genomischer A. thaliana DNA mit mit IVD5PmeColic und IVD3NcoColic amplifiziert wurde, umfasste 89 bp:
Atgcagaggtttttctccgccagatcgattctcggttacgccgtcaagacgcggaggaggtctttctcttctcgttcttcgtctctcct
SEQ ID NR: 62
Das PCR Fragment, das mit den Primern IVD5EcoResgen und IVD3EcoResgen abgeleitet wurde, wurde mit EcoRI aufgeschlossen und in die Vektoren VC-MME489-1QCZ und VC-MME301-1QCZ ligiert, die auch mit EcoRI aufgeschlossen worden waren. Die korrekte Ausrichtung der IVD Targeting-Sequenz wurde durch Sequenzierung getestet. Die Vektoren, die in diesem Ligationsschritt erzeugt wurden, waren VC-MME356-1QCZ bzw. VC-MME462-1QCZ.
Das PCR Fragment, das mit den Primern IVD5PmeColic und IVD3NcoColic abgeleitet wurde, wurde mit PmeI und NcoI aufgeschlossen und in die Vektoren VC-MME220-1qcz, VC-MME221-1qcz und VC-MME289-1qcz ligiert, die mit SmaI und NcoI aufgeschlossen worden waren. Die Vektoren, die in diesem Ligationsschritt erzeugt wurden, waren VC-MME431-1qcz, VC-MME465-1qcz bzw. VC-MME445-1qcz.
Für eine mitochondriale-zielgerichtete konstitutive Expression in vorzugsweise grünen Geweben wurde ein künstlicher Promotor A(ocs)3AmasPmas Promotor (Super Promotor) (Ni et al. Plant Journal 7, 661 (1995), WO 95/14098 ) im Zusammenhang mit dem Vektor VC-AAME356-1QCZ für ORFs von Saccharomyces cerevisiae und im Zusammenhang mit dem Vektor VC-MME431-1qcz für ORFs von Escherichia coli verwendet, was in jedem Fall zu einer ”in-frame” Fusion der IVD-Sequenz mit den jeweiligen ORFs führte.
Für eine mitochondriale-zielgerichtete konstitutive Expression in vorzugsweise Samen wurde der USP Promotor (Bäumlein et al., Mol Gen Genet. 225 (3): 459–67 (1991)) im Zusammenhang mit dem Vektor VC-MME462-1QCZ für ORFs von Saccharomyces cerevisiae und im Zusammenhang mit dem Vektor VC-MME465-1qcz für ORFs von Escherichia coli verwendet, was in jedem Fall zu einer ”in-frame” Fusion der IVD-Sequenz mit den jeweiligen ORFs führte.
Für eine mitochondriale-zielgerichtete konstitutive Expression in vorzugsweise grünen Geweben und Samen wurde der PcUbi Promotor im Zusammenhang mit dem Vektor VC-MME445-1qcz für ORFs von Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Synechocystis sp., Azotobacter vinelandii, Thermus thermophilus, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Physcomitrella patens, oder Zea mays verwendet, was in jedem Fall zu einer ”in-frame” Fusion der IVD-Sequenz mit den jeweiligen ORFs führte.
Andere nützliche binäre Vektoren sind dem Fachmann bekannt; ein Überblick von binären Vektoren und ihre Verwendung findet sich in Hellen R., Mullineaux P. und Klee H., (Trends in Plant Science, 5 (10), 446 (2000)). Solche Vektoren müssen gleichermaßen mit geeigneten Promotoren und Targeting-Sequenzen ausgestattet sein.
Beispiel 1e): Klonieren von erfindungsgemäße Sequenzen, wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 dargestellt, in den verschiedenen Expressionsvektoren.
Zum Klonieren der ORFs von SEQ ID NR: 1206, von S. cerevisiae in Vektoren, die die Resgen Adapter-Sequenz enthalten, wurde die jeweilige Vektor-DNA mit dem Restriktionsenzym NcoI behandelt. Zum Klonieren von ORFs von Saccharomyces cerevisiae in Vektoren, die die Colic Adapter-Sequenz enthalten, wurden die jeweilige Vektor-DNA mit den Restriktionsenzymen PacI und NcoI nach dem Standardprotokoll behandelt (MBI Fermentas). Zum Klonieren von ORFs von Escherichia coli, Synechocystis sp., Azotobacter vinelandii, Thermus thermophilus, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Physcomitrella patens, oder Zea mays wurde die Vektor-DNA mit den Restriktionsenzymen PacI und NcoI nach dem Standardprotokoll behandelt (MBI Fermentas). In allen Fällen wurde die Reaktion durch Inaktivierung bei 70°C nach 20 Minuten gestoppt und über einer QIAquick oder NucleoSpin Extract II Säule nach dem Standardprotokoll getrocknet (Qiagen oder Macherey-Nagel).
Dann wurden das PCR-Produkt, das den amplifizierten ORF darstellt, mit den jeweiligen Adapter-Sequenzen und die Vektor-DNA mit T4 DNA Polymerase nach dem Standardprotokoll (MBI Fermentas), um einsträngige Überhänge zu erzeugen, behandelt, mit den Parameter 1 Einheit T4 DNA Polymerase bei 37°C über 2–10 Minuten für den Vektor und 1–2 Einheiten T4 DNA Polymerase bei 15–17°C über 10–60 Minuten für das PCR Produkt, das die SEQ ID NR: 1206 darstellt.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von salzreichem Puffer gestoppt und über einer QIAquick oder NucleoSpin Extract II Säule nach dem Standardprotokoll (Qiagen oder Macherey-Nagel) gereinigt.
Anhand dieses Beispiels ist der Fachmann imstande, alle Sequenzen zu klonen, die in Tabelle I, vorzugsweise Spalte 5, offenbart sind.
Ungefähr 30–60 ng des zubereiteten Vektors und eine definierte Menge eines zubereiteten Amplifikats wurden gemischt und bei 65°C für 15 Minuten, gefolgt von 37°C 0,1°C/1 Sekunden, gefolgt von 37°C 10 Minuten, gefolgt von 0,1°C/1 Sekunden, dann 4–10°C hybridisiert.
Die ligierten Konstrukte wurden in demselben Reaktionsgefäß durch Zugabe kompetenter E. coli Zellen (Stamm DH5alpha) und eine Inkubation für 20 Minuten bei 1°C, gefolgt von einem Wärmeschock für 90 Sekunden bei 42°C und Kühlen auf 1–4°C transformiert. Dann wurde komplettes Medium (SOC) zugegeben und das Gemisch wurde 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Das gesamte Gemisch wurde anschließend auf eine Agarplatte mit 0,05 mg/ml Kanamycin ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Das Ergebnis des Klonierungsschrittes wurde durch Amplifikation mit Hilfe von Primern verifiziert, die stromaufwärts und stromabwärts der Integrationsstelle binden, wodurch die Amplifikation der Insertion möglich war. Die Amplifikationen wurden wie im Protokoll von Tag DNA Polymerase (Gibco-BRL) beschrieben durchgeführt.
Die Amplifikationszyklen waren wie folgt:
1 Zyklus von 1–5 Minuten bei 94°C, gefolgt von 35 Zyklen von in jeweils 15–60 Sekunden bei 94°C, 15–60 Sekunden bei 50–66°C und 5–15 Minuten bei 72°C, gefolgt von 1 Zyklus von 10 Minuten bei 72°C, dann 4–16°C.
Mehrere Kolonien wurden geprüft, aber nur eine Kolonie, für die ein PCR Produkt der erwarteten Größe nachgewiesen wurde, wurde in den folgenden Schritten verwendet.
Ein Teil dieser positiven Kolonie wurde in ein Reaktionsgefäß überführt, das mit kompletten Medium (LB), ergänzt mit Kanamycin gefüllt war, und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die Plasmidzubereitung wurde wie in dem Qiaprep oder NucleoSpin Multi-96 Plus Standardprotokoll (Qiagen oder Macherey-Nagel) spezifiziert ausgeführt.
Beispiel 1f): Erzeugung von transgenen Pflanzen, die SEQ ID NR: 1206 oder jede andere Sequenz exprimieren, die in Tabelle I, vorzugsweise Spalte 5, offenbart ist
1–5 ng der Plasmid DNA isolierte wurde durch Elektroporation oder Transformation in kompetente Zellen von Agrobacterium tumefaciens, von Stamm GV 3101 pMP90 (Koncz und Schell, Mol. Gen. Gent. 204, 383 (1986)) transformiert. Danach wurde komplettes Medium (YEP) zugegeben und das Gemisch wurde in ein frisches Reaktionsgefäß für 3 Stunden bei 28°C überführt. Danach wurde das gesamte Reaktionsgemisch auf YEP Agarplatten ausgestrichen, die mit den jeweiligen Antibiotika, z. B. Rifampicin (0,1 mg/ml), Gentamycin (0,025 mg/ml und Kanamycin (0,05 mg/ml) ergänzt waren, und 48 Stunden bei 28°C inkubiert.
Agrobacteria, die das Plasmidkonstrukt enthalten, wurden für die Transformation von Pflanzen verwendet.
Eine Kolonie wurde der Agarplatte mit Hilfe einer Pipettenspitze entnommen und in 3 ml flüssigem TB Medium aufgenommen, das auch geeignete Antibiotika, wie oben beschrieben, enthielt. Die Vorkultur wurde 48 Stunden bei 28°C und 120 U/min gezüchtet.
400 ml LB Medium, das dieselben Antibiotika wie oben enthielt, wurden für die Hauptkultur verwendet. Die Vorkultur wurde in die Hauptkultur überführt. Sie wurde 18 Stunden bei 28°C und 120 U/min gezüchtet. Nach der Zentrifugation bei 4 000 U/min wurde das Pellet in Infiltrationsmedium (MS Medium, 10% Sucrose) resuspendiert.
Zum Züchten der Pflanzen für die Transformation, wurden Schalen (Piki Saat 80, grün, mit einem Siebboden, 30 × 20 × 4,5 cm, von Wiesauplast, Kunststofftechnik, Deutschland) halb mit einem GS 90 Substrat gefüllt (Standarderde, Werkverband E.V., Deutschland). Die Schalen wurden über Nacht mit 0,05% Proplant Lösung (Chimac-Apriphar, Belgien) gegossen. A. thaliana C24 Samen (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK; NASC Stock N906) wurden über der Schale verstreut, ungefähr 1000 Samen pro Schale. Die Schalen wurden mit einer Haube bedeckt und in die Stratifizierungsanlage gestellt (8 h, 110 μmol/m2s1, 22°C; 16 h, dunkel, 6°C). Nach 5 Tagen wurden die Schalen in die kurztägige kontrollierte Umweltkammer gestellt (8 h, 130 μmol/m2s1, 22°C; 16 h, dunkel, 20°C), wo sie ungefähr 10 Tage blieben, bis sich die ersten richtigen Blätter gebildet hatten.
Die Setzlinge wurden in Töpfe überführt, die dasselbe Substrat enthielten (Teku Töpfe, 7 cm, LC Serie, hergestellt von Pöppelmann GmbH & Ca, Deutschland). Fünf Pflanzen wurden in jeden Topf ausgepflanzt. Die Töpfe wurden dann wieder in die kurztägige kontrollierte Umweltkammer gestellt, so dass die Pflanze weiter wachsen konnte.
Nach 10 Tagen wurden die Pflanzen in das Glashausabteil überführt (Zusatzbeleuchtung, 16 h, 340 μE/m2s, 22°C; 8 h, dunkel, 20°C), wo sie weitere 17 Tage wachsen konnten.
Für die Transformation wurden 6 Wochen alte Arabidopsis Pflanzen, die gerade zu blühen begonnen hatten, 10 Sekunden in die oben beschriebene agrobakterielle Suspension getaucht, die zuvor mit 10 μl Silwett L77 (Crompton S.A., Osi Specialties, Schweiz) behandelt worden war. Die fragliche Method ist von Clough J. C. und Bent A. F. (Plant J. 16, 735 (1998)) beschrieben.
Die Pflanzen wurden anschließend 18 Stunden in eine feuchte Kammer gestellt. Danach wurden die Töpfe wieder in das Glashaus gebracht, damit die Pflanzen weiter wachsen konnten. Die Pflanzen blieben weitere 10 Wochen in dem Glashaus, bis die Samen zur Ernte bereit waren.
Abhängig von dem Toleranzmarker, der für die Selektion der transformierten Pflanzen verwendet wurden, wurden die geernteten Samen in dem Glashaus gepflanzt und einer Sprühselektion unterzogen oder zuerst sterilisiert und dann auf Agarplatten gezüchtet, die mit dem jeweiligen Selektionsmittel ergänzt waren. Da der Vektor das bloße Gen als Toleranzmarker enthielt, wurden die Pflänzchen viermal in einem intervall von 2 bis 3 Tagen mit 0,02% BASTA^® besprüht und transformierrte Pflanzen konnten Samen ansetzen.
Die Samen der transgenen A. thaliana Pflanzen wurden im Gefrierschrank aufbewahrt (bei –20°C).
Beispiel 1g): Pflanzen-Screening (Arabidopsis) auf Wachstum unter begrenzter Stickstoffversorgung
Durch transgenes Konstrukt wurden 4 unabhängige transgene Linien (= Ereignisse) getestet (25–28 Pflanzen pro Konstrukt).

Arabidopsis thaliana Samen werden in Töpfen gesät, die ein 1:1 (v:v) Gemisch von nährstoffverarmter Erde (”Einheitserde Typ 0”, 30% Ton, Tantau, Wansdorf Deutschland) und Sand enthielten. Die Keimung wird durch eine viertägige Periode bei 4°C, im Dunkeln, eingeleitet. Anschließend werden die Pflanzen unter Standardwachstumsbedingungen gezüchtet (Photoperiod mit 16 h hell und 8 h dunkel, 20°C, 60% relative Feuchte, und eine Photonenflussdichte von 150–200 μE). Die Pflanzen werden gezüchtet und kultiviert, unter anderem werden sie jeden zweiten Tag mit einer N-verarmten Nährstofflösung gegossen. Die N-verarmte Nährstofflösung z. B. enthält neben Wasser

Mineralnährstoff	Endkonzentration
KCl	3,00 mM
MgSO4 × 7H2O	0,5 mM
CaCl2 × 6H2O	1,5 mM
K2SO4	1,5 mM
NaH2PO4	1,5 mM
Fe-EDTA	40 μM
H3BO3	25 μM
MnSO4 × H2O	1 μM
ZnSO4 × 7H2O	0,5 μM
Cu2SO4 × 5H2O	0,3 μM
Na2MoO4 × 2H2O	0,05 μM

Nach 9 bis 10 Tagen werden die Pflanzenvereinzelt. Nach einer Gesamtperiode von 28 bis 31 Tagen werden die Pflanzen geerntet und nach dem Frischgewicht der oberirdischen Teile der Pflanzen bewertet. Die Biomassenerhöhung wurde als Verhältnis des Frischgewichts der oberirdischen Teile der jeweiligen transgenen Pflanze und der nicht transgenen Wildtyppflanze gemessen.

Die Biomassenproduktion von transgenen Arabidopsis thaliana, die unter begrenzter Stickstoffversorgung gezüchtet wurden, ist in Tabelle VIII-A dargestellt Die Biomassenproduktion wurde durch Wiegen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Biomassenerhöhung wurde als Verhältnis von durchschnittlichem Gewicht für transgene Pflanzen verglichen mit dem durchschnittlichen Gewicht von Wildtypkontrollpflanzen aus demselben Experiment berechnet. Die mittlere Biomassenerhöhung des transgenen Konstrukts ist angegeben (Signifikanzwert < 0,3 und Biomassenerhöhung > 5% (Verhältnis > 1,05)). Tabelle VIII-A: Biomassenproduktion von transgenen Arabidopsis thaliana, die unter begrenzter Stickstoffversorgung gezüchtet wurden (erhöhte NUE)

SeqID	Target	Lokus	Biomassenerhöhung
1772	Plastidär	SLL1091	1,096
1938	Plastidär	SLR1293	1,084
2042	Zytoplasmatisch	YDR461W	1,155
2056	Plastidär	YER170W	1,142
2558	Plastidär	YGR247W	1,22
2628	Zytoplasmatisch	YJR095W	1,095
2711	Zytoplasmatisch	YNR047W	1,1
2738	Plastidär	YOL103W	1,437
2818	Zytoplasmatisch	YOR095C	1,234
3437	Plastidär	B2414_2	1,211
4473	Plastidär	SLL1091_2	1,096
4639	Plastidär	SLR1293_2	1,084
4743	Zytoplasmatisch	YDR049W_2	1,259
63	Zytoplasmatisch	B1670	1,112
80	Plastidär	62414	1,211
1105	Zytoplasmatisch	SLL1237	1,259
1206	Zytoplasmatisch	YDR049W	1,259

Beispiel 1h): Pflanzen-Screening für das Wachstum unter Niedertemperaturbedingungen
In einem Standardexperiment wurde Erde als 3,5:1 (v/v) Gemisch aus nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand zubereitet. Die Töpfe wurden mit dem Erdegemisch gefüllt und in Ablagen gestellt. Den Ablagen wurden Wasser zugegeben, so dass das Erdegemisch die passende Wassermenge für die Saatprozedur aufnehmen konnte. Die Samen für transgene A. thaliana Pflanzen wurden in Töpfe (6 cm Durchmesser) gesät Die Töpfe wurden gesammelt, biss sie eine Ablage für die Wachstumskammer füllten. Dann wurde die gefüllte Ablage mit einem transparenten Deckel bedeckt und in das Regelsystem der vorgekühlten (4°C–5°C) Wachstumskammer gestellt. Die Stratifizierung wurde über eine Periode von 2–3 Tagen im Dunkeln bei 4°C–5°C etabliert. Die Samenkeimung und das Wachstum wurden durch Wachstumsbedingungen von 20°C, 60% relative Feuchte, 16 h Photoperiode und Beleuchtung mit fluoreszierendem Licht bei ungefähr 200 μmol/m2s eingeleitet. Die Deckel wurden 7 Tage nach der Aussaat entfernt. Die BASTA Selektion erfolgte am Tag 9 nach der Aussaat durch Besprühen der Töpfe mit Pflänzchen von oben. Dafür wurde eine 0,07% (v/v) Lösung von BASTA Konzentrat (183 g/l Glufosinate-Ammonium) in Leitungswasser aufgesprüht. Transgene Ereignisse und Wildtypkontrollpflanzen wurden regellos über die Kammer verteilt. Die Position der Ablagen innerhalb der Kammern wurde an den Arbeitstagen ab Tag 7 nach der Aussaat geändert. Alle zwei Tage nach Entfernung der Deckel von den Ablagen wurden gegossen. Die Pflanzen wurden 12–13 Tage nach der Aussaat durch Entfernen überschüssiger Setzlinge in einem Topf vereinzelt. Kälte (Kälte von 11°C–12°C) wurde 14 Tage nach der Aussaat an der Versuchserde erzeugt. Zum Messen der Biomassenleistung wurde das Pflanzenfrischgewicht zur Erntezeit bestimmt (z. B. 29–37 Tage nach der Aussaat, zum Beispiel 29–30 Tage nach der Aussaat, oder vorzugsweise, 35–36 Tage nach der Aussaat), indem Sprosse abgeschnitten und gewogen wurden. Neben dem Wiegen wurden phänotypische Informationen im Falle von Pflanzen hinzugefügt, die sich von der Wildtypkontrolle unterschieden. Die Pflanzen befanden sich bei der Ernte in der Stufe vor der Blüte und vor dem Wachstum eines Blütenstandes. Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomassenveränderungen wurden durch Anwenden des Student t-Tests berechnet (Parameter zweiseitige, ungleiche Varianz).
Drei aufeinander folgende Experimente wurden durchgeführt. Im ersten Experiment wurde ein Individuum aus jeder transformierten Linie getestet.
Im zweiten Experiment wurden Konstrukte, die als kältetolerant oder -resistent im ersten Experiment bestimmt worden waren, d. h. einen erhöhten Ertrag, in diesem Fall eine erhöhte Biomassenproduktion, im Vergleich zum Wildtyp zeigten, durch ein bestätigendes Screening gemäß denselben Versuchsprozeduren geführt. In diesem Experiment wurden 3 oder mehrere Linien pro Konstrukt (26–45 Pflanzen pro Konstrukt) gezüchtet, behandelt und wie zuvor gemessen.
In den ersten zwei Experimenten wurden Kältetoleranz oder Toleranz und Biomassenproduktion mit Wildtyppflanzen verglichen.
Im dritten Experiment wurden Konstrukte, die im zweiten Experiment als tolerant oder resistent bestimmt wurden, gezüchtet, behandelt und wie oben bewertet. In diesem Experiment wurden 2 oder mehrere Linien pro Konstrukt (24–60 Pflanzen pro Konstrukt) getestet. Die Ergebnisse davon sind in Tabelle VIII zusammengefasst.

Die Biomassenproduktion wurde durch Wiegen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Biomassenerhöhung wurde als Verhältnis von durchschnittlichem Gewicht für transgene Pflanzen verglichen mit dem durchschnittlichen Gewicht von Wildtypkontrollpflanzen berechnet, die am selben Tag geerntet wurden. Die minimale und maximale Biomassenerhöhung, die in der Gruppe transgener Ereignisse beobachtet wurde, ist für einen Lokus angegeben, wobei alle Ereignisse einen Signifikanzwert < 0,1 und eine Biomassenerhöhung > 1,1 zeigen. Tabelle VIII: Biomassenproduktion von transgenen A. thaliana nach Auferlegen eines Kältestresses. (LT mit Min/Max Werten)

SeqID	Target	Lokus	Biomassenerhöhung min	Biomassenerhöhung max
1702	Zytoplasmatisch	GM02LC13512	1,756	1,844
1772	Plastidär	SLL1091	1,313	1,480
1938	Plastidär	SLR1293	1,368	1,374
2042	Zytoplasmatisch	YDR461W	1,325	1,503
2056	Plastidär	YER170W	1,233	1,370
2558	Plastidär	YGR247W	1,331	1,331
2577	Zytoplasmatisch	YHR201C	1,232	1,460
2609	Zytoplasmatisch	YJL181W	1,425	1,462
2628	Zytoplasmatisch	YJR095W	1,764	1,764
2711	Zytoplasmatisch	YNR047W	1,177	1,575
2738	Plastidär	YOL103W	1,260	1,284
2818	Zytoplasmatisch	YOR095C	1,485	1,516
3361	Plastidär	YPL109C	1,192	1,310
3437	Plastidär	B2414_2	1,219	1,421
4403	Zytoplasmatisch	GMO2LC13512_2	1,756	1,844
4473	Plastidär	SLL1091_2	1,313	1,480
4639	Plastidär	SLR1293_2	1,368	1,374
4743	Zytoplasmatisch	YDR049W_2	1,403	1,669
63	Zytoplasmatisch	B1670	1,231	1,360
80	Plastidär	B2414	1,219	1,421
1076	Zytoplasmatisch	B2758	1,252	1,324
1105	Zytoplasmatisch	SLL1237	1,166	1,384
1206	Zytoplasmatisch	YDR049W	1,403	1,669
1245	Plastidär	YIL074C	1,169	1,213

Beispiel 1i): Pflanzen-Screening auf Wachstum unter zyklierenden Dürrebedingungen
In dem zyklierende Dürre-Test wurde ein wiederholter Stress auf Pflanzen ausgeübt, ohne zu einer Austrocknung zu führen. In einem Standardexperiment wird Erde als 1:1 (v/v) Gemisch aus nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Quarzsand zubereitet. Töpfe (6 cm Durchmesser) wurden mit diesem Gemisch gefüllt und auf Ablagen gestellt. Den Ablagen wurde Wasser zugegeben, so dass das Erdegemisch die passende Wassermenge für die Aussaatprozedur aufnehmen konnte (Tag 1), und anschließend wurden Samen von transgenen A. thaliana Pflanzen und ihren Wildtypkontrollen in Töpfen gesät. Dann wurde die gefüllte Ablage mit einem transparenten Deckel bedeckt und in eine vorgekühlte (4°C–5°C) und abgedunkelte Wachstumskammer gestellt. Die Stratifizierung wurde über eine Periode von 3–4 Tage im Dunkeln bei 4°C–5°C etabliert. Die Samenkeimung und das Wachstum wurden bei Wachstumsbedingungen von 20°C, 60% relative Feuchte, 16 h Photoperiode und Beleuchtung mit fluoreszierendem Licht bei ungefähr 200 μmol/m2s eingeleitet. Die Deckel wurden 7–8 Tage nach der Aussaat entfernt. Die BASTA Selektion erfolgte am Tag 10 oder Tag 11 (9 oder 10 Tage nach der Aussaat) durch Besprühen der Töpfe mit den Pflänzchen von oben. In dem Standardexperiment wurde eine 0,07% (v/v) Lösung von BASTA Konzentrat (183 g/l Glufosinat-Ammonium) in Leitungswasser einmal gesprüht oder als Alternative wurde eine 0,02% (v/v) Lösung von BASTA dreimal gesprüht. Die Wildtypkontrollpflanzen wurden nur mit Leitungswasser besprüht (anstatt einer Besprühung mit BASTA aufgelöst in Leitungswasser), sonst aber identisch behandelt. Die Pflanzen wurden 13–14 Tage nach der Aussaat durch Entfernen des Überschusses von Setzlingen und Belassen eines Setzlings in der Erde vereinzelt. Transgene Ereignisse und Wildtypkontrollpflanzen wurden gleichmäßig über der Kammer verteilt.
Die Wasserversorgung während des Experiments war begrenzt und die Pflanzen wurden Zyklen von Dürre und Wiederbewässerung ausgesetzt. Die Bewässerung wurde am Tag 1 (vor der Aussaat), Tag 14 oder Tag 15, Tag 21 oder Tag 22, und schließlich Tag Tag 27 oder Tag 28 vorgenommen. Zum Messen der Biomassenproduktion wurde das Pflanze Frischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung (Tag 28 oder Tag 29) bestimmt, indem Sprosse abgeschnitten und gewogen wurden. Neben den wegen wurden phänotypische Informationen im Falle von Pflanzen hinzugefügt, die sich von der Wildtypkontrolle unterschieden. Die Pflanzen befanden sich bei der Ernte in der Stufe vor der Blüte und vor dem Wachstum eines Blütenstands. Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomassenveränderungen wurden durch Anwenden des Student t-Tests berechnet (Parameter: zweiseitige, ungleiche Varianz).
Für YOL103W wurden vier Linien (Ereingnisse) pro transgenem Konstrukt in zwei aufeinander folgenden experimentellen Ebenen getestet in der ersten Ebene wurde eine Pflanze pro Linie getestet (4 Pflanzen pro Konstrukt) und in der folgenden Ebene wurden 8–10 Pflanzen pro Linie getestet (38 Pflanzen pro Konstrukt). Die Biomassenleistung wurde wie oben beschrieben bewertet. Die Daten sind für Konstrukte angegeben, die eine erhöhte Biomassenleistung in mindestens zwei aufeinanderfolgenden experimentellen Ebenen zeigten.
Die Biomassenproduktion von transgenen A. thaliana, die unter zyklierenden Dürrewachstumbedingungen gezüchtet wurden, ist in Tabelle VIIIc dargestellt: Die Biomassenproduktion wurde durch Wiegen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Biomassenerhöhung wurde als Verhältnis von durchschnittlichem Gewicht für transgene Pflanzen verglichen mit dem durchschnittlichen Gewicht von Wildtypkontrollpflanzen aus demselben Experiment berechnet. Die mittlere Biomassenerhöhung des transgenen Konstrukts ist angegeben (Signifikanzwert < 0,05). Tabelle VIII-C Biomassenproduktion von transgenen A. thaliana, die unter zyklierende Dürre-Wachstumsbedingungen (erhöhte CD Toleranz) gezüchtet wurden

SeqID Target Lokus Biomassenerhöhung

2738 Zytoplasmatisch YOL103W 1,772
Beispiel 1j): Pflanzen-Screening auf Ertragserhöhung unter standardisierten Wachstumsbedingungen
In diesem Experiment wurde ein Pflanzen-Screening auf eine Erhöhung des Ertrags (in diesem Fall: Erhöhung des Biomassenertrags) unter standardisierten Wachstumsbedingungen ohne wesentlichen abiotischen Stress durchgeführt. In einem Standardexperiment wird Erde als 3,5:1 (v/v) Gemisch aus nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Quarzsand zubereitet. Als Alternative wurden Pflanzen auf nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Deutschland) ausgesät. Die Töpfe wurden mit Erdegemisch gefüllt und in Ablagen gestellt. Den Ablagen wurde Wasser zugegeben, so dass das Erdegemisch die passende Wassermenge für die Aussaatprozedur aufnehmen konnte. Die Samen von transgenen A. thaliana Pflanzen und ihren nicht transgenen Wildtypkontrollen wurden in Töpfen (6 cm Durchmesser) gesät. Dann wurde die gefüllte Ablage mit einem transparenten Deckel bedeckt und in eine vorgekühlte (4°C–5°C) und abgedunkelte Wachstumskammer gestellt. Die Stratifizierung wurde über eine Periode von 3–4 Tage im Dunkeln bei 4°C–5°C etabliert. Die Samenkeimung und das Wachstum wurden bei Wachstumsbedingungen von 20°C, 60% relative Feuchte, 16 h Photoperiode und Beleuchtung mit fluoreszierendem Licht bei 150–200 μmol/m2s eingeleitet. Die Deckel wurden 7–8 Tage nach der Aussaat entfernt. Die BASTA Selektion erfolgte am Tag 10 oder Tag 11 (9 oder 10 Tage nach der Aussaat) durch Besprühen der Töpfe mit den Pflänzchen von oben. In dem Standardexperiment wurde eine 0,07% (v/v) Lösung von BASTA Konzentrat (183 g/l Glufosinat-Ammonium) in Leitungswasser einmal gesprüht oder als Alternative wurde eine 0,02% (v/v) Lösung von BASTA dreimal gesprüht. Die Wildtypkontrollpflanzen wurden nur mit Leitungswasser besprüht (anstatt einer Besprühung mit BASTA aufgelöst in Leitungswasser), sonst aber identisch behandelt. Die Pflanzen wurden 13–14 Tage nach der Aussaat durch Entfernen des Überschusses von Setzlingen und Belassen eines Setzlings in der Erde vereinzelt. Transgene Ereignisse und Wildtypkontrollpflanzen wurden gleichmäßig über der Kammer verteilt.
Die Bewässerung wurde alle zwei Tage nach Entfernung der Deckel in einem Standardexperiment vorgenommen oder als Alternative jeden Tag. Zum Messen der Biomassenleistung wurde das Pflanzefrischgewicht zur Erntezeit (24–29 Tage nach der Aussaat) gemessen, indem die Sprosse abgeschnitten und gewogen wurden. Die Pflanzen befanden sich bei der Ernte in der Stufe vor der Blüte und vor dem Wachstum eines Blütenstandes. Transgene Pflanzen wurden mit den nicht transgenen Wildtypkontrollpflanzen verglichen, die am selben Tag geerntet wurden. Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomassenveränderungen wurden durch Anwenden des Student t-Tests berechnet (Parameter: zweiseitige, ungleiche Varianz).
Es wurden zwei verschiedene Arten von experimentellen Prozeduren durchgeführt:

Prozedur 1): Für jedes transgene Konstrukt wurden 3–4 unabhängige transgene Linien (= Ereignisse) getestet (22–30 Pflanzen pro Konstrukt) und die Biomassenleistung wurde wie oben beschrieben ausgewertet.
Prozedur 2): Vier Linien pro transgenem Konstrukt wurden in zwei aufeinander folgenden experimentellen Ebenen getestet. Nur Konstrukte, die eine positive Leistung zeigten, wurden der nächsten experimentellen Ebene unterzogen. In der ersten Ebene wurde eine Pflanze pro Linie getestet (4 Pflanzen pro Konstrukt) und in der folgenden Ebene wurden 10 Pflanzen pro Linie getestet (40 Pflanzen pro Konstrukt). Die Biomassenleistung wurde wie oben beschrieben ausgewertet. Daten aus dieser Art von Experiment (Prozedur 2) sind für Konstrukte dargestellt, die eine erhöhte Biomassenleistung in mindestens zwei aufeinander folgenden Ebenen zeigten.

Die Biomassenproduktion von transgenen A. thaliana, die unter standardisierten Wachstumsbedingungen gezüchtet wurden, ist in Tabelle VIII-D dargestellt: die Biomassenproduktion wurde durch Wiegen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Biomassenerhöhung wurde als Verhältnis von durchschnittlichem Gewicht für transgene Pflanzen verglichen mit dem durchschnittlichen Gewicht von Wildtypkontrollpflanzen aus demselben Experiment berechnet. Die mittlere Biomassenerhöhung des transgenen Konstrukts ist angegeben (Signifikanzwert < 0,3 und Biomassenerhöhung > 5% (Verhältnis > 1,05)). Tabelle VIII-D Biomassenproduktion von transgenen A. thaliana, die unter standardisierten Wachstumsbedingungen gezüchtet wurden (erhöhte BM; intrinsischer Ertrag)

SeqID	Target	Lokus	Biomassenerhöhung
1938	Plastidär	SLR1293	1,088
2628	Plastidär	YJR095W	1,316
2711	Zytoplasmatisch	YNR047W	1,161
2738	Plastidär	YOL103W	1,313
3437	Plastidär	B2414_2	1,204
4639	Plastidär	SLR1293_2	1,088
4743	Zytoplasmatisch	YDR049W_2	1,166
63	Zytoplasmatisch	B1670	1,117
80	Plastidär	B2414	1,204
1076	Zytoplasmatisch	B2758	1,071
1105	Zytoplasmatisch	SLL1237	1,068
1206	Zytoplasmatisch	YDR049W	1,166
1245	Plastidär	YIL074C	1,209

Beispiel 2: Manipulation von Arabidopsis Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhtem ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder einem anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmal durch überexprimierende, den Ertrag erhöhende, z. B. YRP Protein, z. B. das niedertemperaturresistenz- und/oder -toleranzbezogene Protein kodierende Gene von Saccharomyces cereviesae oder Synechocystis oder E. coli unter Verwendung von gewebespezifischen und/oder stressinduzierbare Promotoren.
Transgene Arabidopsis Pflanzen werden wie in Beispiel 1 erzeugt, um die das YRP, z. B. Ertrag erhöhende, z. B. niedertemperaturresistenz- und/oder -toleranzbezogene Protein kodierenden Transgene unter der Kontrolle eines gewebespezifischen und/oder stressinduzierbaren Promotors zu exprimieren.
Pflanzen der T2 Generation werden erzeugt und unter Stressbedingungen gezüchtet, vorzugsweise Niedertemperaturbedingungen. Die Biomassenproduktion wird nach einer Gesamtzeit von 29 bis 30 Tagen bestimmt, beginnend mit der Aussaat. Die transgenen Arabidopsis Pflanze erzeugt mehr Biomasse als die nicht transgenen Kontrollpflanzen.
Beispiel 3: Überexpression der Ertrag erhöhenden, z. B. der YRP-Protein-, z. B. der niedertemperaturresistenz- und/oder -toleranzbezogene Protein-, z. B. stressbezogenen Gene von Saccharomyces cereviesae oder Synechocystis oder E. coli bietet Toleranz gegen mehrere abiotische Stresssituationen
Pflanzen, die eine Toleranz gegen abiotischen Stress aufweisen, weisen häufig eine Toleranz gegen einen anderen Umweltstress auf. Dieses Phänomenon von Kreuztoleranz ist durch eine mechanistische Ebene nicht erklärbar (McKersie und Leshem, 1994). Dennoch kann vernünftigerweise erwartet werden, dass Pflanzen, die eine verstärkte Toleranz gegen Niedertemperatur, z. B. Kältetemperaturen und/oder Gefriertemperaturen aufgrund der Expression eines Transgens aufweisen, auch eine Toleranz gegen Dürre und/oder Salz und/oder andere abiotische Stresssituationen aufweisen könnten. Zur Untermauerung der Hypothese wird die Expression mehrerer Gene durch mehrere abiotische Stressfaktoren auf- und abwärts reguliert, einschließlich Niedertemperatur, Dürre, Salz, Osmoticum, ABA, usw. (z. B. Hong et al., Plant Mol Biol 18, 663 (1992); Jagendorf und Takabe, Plant Physiol 127, 1827 (2001)); Mizoguchi et al., Proc Natl Acad Sci U S A 93, 765 (1996); Zhu, Curr Opin Plant Biol 4, 401 (2001)).
Zur Bestimmung der Salztoleranz werden Samen von A. thaliana sterilisiert (100% Bleiche, 0,1% TritonX zweimal fünf Minuten und fünfmal mit ddH2O gespült). Die Samen wurden auf Nicht-Selektionsmedien (1/2 MS, 0,6% Phytagar, 0,5 g/L MES, 1% Sucrose, 2 μg/ml Benamyl) ausgestrichen. Die Samen wurden ungefähr zehn Tage keimen gelassen. In der 4–5 Blattstufe wurden die transgenen Pflanzen in Töpfe mit 5,5 cm Durchmesser getopft und ungefähr sieben Tage wachsen gelassen (22°C, kontinuierliches Licht), Bewässerung nach Bedarf. Für den Beginn des Tests wurden zwei Liter 100 mM NaCl und 1/8 MS der Ablage unter den Töpfen zugegeben. Der Ablage, die die Kontrollpflanzen enthält, wurden drei Liter 1/8 MS zugegeben. Die Konzentrationen von NaCl Ergänzungen werden schrittweise um 50 mM alle 4 Tage bis zu 200 mM erhöht. Nach der Salzbehandlung mit 200 mM, wird die frische und überlebende Biomassenproduktion der Pflanzen bestimmt.
Zur Bestimmung der Dürretoleranz werden Samen der transgenen und Niedertemperatur-Linien gekeimt und ungefähr 10 Tage bis zur 4–5 Blattstufe wie oben wachsen gelassen. Die Pflanzen werden dann zu Dürrebedingungen überführt und können durch die Blüte- und Samenansatzentwicklungsstufen laufen. Die Photosynthese kann unter Verwendung der Chlorophyllfluoreszenz als Indikator der photosynthetischen Fitness und Integrität der Photosysteme gemessen werden. Überleben und Pflanzenbiomasseproduktion als Indikatoren für den Samenertrag werden bestimmt.
Pflanzen, die eine Toleranz gegen Salzgehalt oder Niedertemperatur aufweisen, haben erhöhte Überlebensraten und eine erhöhte Biomassenproduktion, einschließlich Samenertrag und Trockensubstanzproduktion, als anfällige Pflanzen.
Beispiel 4: Manipulation von Luzerne-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhtem ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder einem anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmal, z. B. verstärkte abiotische Umweltstresstoleranz und/oder erhöhte Biomassenproduktion durch überexprimierende, den Ertrag erhöhende, z. B. YRP-Protein kodierende, z. B. niedertemperaturresistenz- und/oder -toleranzbezogene Gene von Saccharomyces cereviesae oder Synechocystis oder E. coli
Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird unter Verwendung von Methoden nachdem Stand der Technik transformiert (z. B. McKersie et al., Plant Physiol 119, 839 (1999)). Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist vom Genotyp abhängig und daher ist eine regenerierende Pflanze erforderlich. Methoden zum Erhalten regenerierender Pflanzen wurden beschrieben. Zum Beispiel können diese aus der Kulturpflanzensorte Rangelander (Agriculture Canada) oder einer anderen, im Handel erhältlichen Luzerne-Varietät selektiert werden, wie von Brown D. C. W. und Atanassov A. (Plant Cell Tissue Organ Culture 4, 111 (1985)) beschrieben. Als Alternative wird die RA3 Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in Gewebekultur selektiert (Welker et al., Am. J. Bot. 65, 654 (1978)).
Blattstielexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., Plant Physiol 119, 839 (1999)) oder LBA4404 co-kultiviert, die einen binären Vektor enthält. Es wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme für die Pflanzentransformation beschrieben (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols, Methods in Molecular Biology, Band 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele beruhen auf dem Vektor pBIN19, der von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) beschrieben wurde, der eine Pflanzengen-Expressionskassette enthält, die von der linken und rechten Grenzsequenz des Ti Plasmids von Agrobacterium tumefaciens flankiert ist. Eine Pflanzengen-Expressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarker-Gen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder genomischen DNA des Merkmal-Gens reguliert. Verschiedenen Selektionsmarker-Gene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis Gens, das für ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS) Enzym kodiert ( US Patente 5,7673,666 und 6,225,105 ). Ebenso können verschiedene Promotoren zur Regulierung des Merkmal-Gens verwendet werden, das für eine konstitutive, Entwicklungs-, Gewebe- oder Umwelt-Regulierung der Gentranskription sorgt. In diesem Beispiel wird der 34S Promotor (GenBank Zugriffsnummern M59930 und X16673) zur Bereitstellung der konstitutiven Expression des Merkmal-Gens verwendet.
Die Explantate werden 3 Tage im Dunkeln auf SH Induktionsmedium co-kultiviert, das 288 mg/L Pro, 53 mg/L Thioprolin, 4,35 g/L K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in halbstarkem Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf demselben SH Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum ausgestrichen, um das Agrobacterium Wachstum zu hemmen. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryos auf BOi2Y Entwicklungsmedium übertragen, das keine Wachstumregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/L Sucrose enthält. Die somatischen Embryos werden anschließend auf halbstarkem Murashige-Skoog Medium gekeimt. Verwurzelte Setzlinge werden in Töpfe umgepflanzt und in einem Glashaus gezüchtet.
Pflanzen der T1 oder T2 Generation werden erzeugt und Niedertemperaturexperimenten unterzogen, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Für die Bewertung der Erhöhung des Ertrags, werden z. B. Toleranz gegen Niedertemperatur, Biomassenproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockensubstanzproduktion, und/oder Samenertrag mit Pflanzen verglichen, denen das Transgen fehlt, z. B. die den nicht transgenen Wildtyppflanzen entsprechen.
Beispiel 5: Manipulation von Roggengras-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhtem ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder einem anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmal z. B. verstärkter Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhter Biomassenproduktion durch überexprimierende, den Ertrag erhöhenden, z. B. YRP-Protein-kodierende, z. B. niedertemperaturtoleranzbezogene Gene von Saccharomyces cereviesae oder Synechocystis oder E. coli.
Samen von mehreren verschiedenen Roggengrasvarietäten können als Explantatquellen für die Transformation verwendet werden, einschließlich der kommerziellen Varietät Gunne, erhältlich von der Svalöf Weibull Samenfirma oder der Varietät Affinity. Die Samen werden der Reihe nach mit 1% Tween-20 für 1 Minute, 100% Bleiche für 60 Minuten, 3 Spülungen von 5 Minuten, jeweils mit entionisiertem und destilliertem H2O oberflächensterilisiert und dann 3–4 Tage auf feuchtem, sterilen Filterpapier im Dunkeln gekeimt Die Setzlinge werden 1 Minute mit 1% Tween-20, 5 Minuten mit 75% Bleiche weiter sterilisiert und dreimal mit dd H2O, jeweils 5 min gewaschen.
Oberflächensterilisierte Samen werden auf das Callus-Induktionsmedium gebracht, das Murashige und Skoog Basalsalze und Vitamine, 20 g/L Sucrose, 150 mg/L Asparagin, 500 mg/L Caseinhydrolysat, 3 g/L Phytagel, 10 mg/L BAP und 5 mg/L Dicamba enthält Die Platten werden im Dunkeln bei 25°C 4 Wochen zur Samenkeimung und embryogenen Callusinduktion inkubiert.
Nach 4 Wochen auf dem Callus-Induktionsmedium werden die Sprosse und Wurzeln der Setzlinge abgeschnitten, der Callus wird in frische Medien überführt, weitere 4 Wochen in Kultur gehalten und dann in MSO Medium im Licht für 2 Wochen überführt. Mehrere Stücke des Callus (11–17 Wochen alt) werden entweder durch ein Sieb mit Siebweite 10 gestrichen und auf Callus-Induktionsmedium gebracht, oder in 100 ml flüssigem Roggengras Callus-Induktionsmedium (dasselbe Medium wie für die Callus-Induktion mit Agar) in einem 250 ml Kolben kultiviert Der Kolben wird in Folie eingeschlagen und bei 175 U/min im Dunkeln bei 23°C 1 Woche geschüttelt. Die flüssige Kultur mit einem Sieb der Siebweite 40 gesiebt, um die Zellen zu sammeln. Die auf dem Sieb gesammelte Fraktion wird ausgestrichen und auf festem Roggengras Callus-Induktionsmedium 1 Woche im Dunkeln bei 25°C kultiviert, Der Callus wird dann auf ein MS Medium überführt, das 1% Sucrose enthält, und 2 Wochen kultiviert.
Die Transformation kann entweder mit Agrobacterium- oder mit Teilchenbombardement-Methoden erfolgen. Der Expressionsvektor wird erzeugt, der einen konstitutiven Pflanzenpromotor und die cDNA des Gens in einem pUC Vektor enthält. Die Plasmid DNA wird aus E. coli Zellen mit dem Qiagen Kit nach den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Ungefähr 2 g embryogener Callus wird in der Mitte eines sterilen Filterpapiers in einer Petri-Schale verteilt. Ein Aliquot von flüssigem MSO mit 10 g/L Sucrose wird dem Filterpapier zugegeben. Goldpartikel (1,0 μm groß) werden mit Plasmid DNA nach der Methode von Sanfürd et al., 1993 überzogen und an den embryogenen Callus mit den folgenden Parameter abgegeben: 500 μg Partikel und 2 μg DNA pro Abgabe, 1300 psi und eine Target-Distanz von 8,5 cm von der Stoppplatte zu der Callus-Platte und 1 Abgabe pro Callus-Platte.
Nach dem Bombardement werden die Calli wieder auf frisches Callus-Entwicklungsmedium überführt und im Dunkeln 1 Woche bei Raumtemperatur gehalten. Der Callus wird dann zu Wachstumsbedingungen im Licht bei 25°C überführt, um die Embryodifferenzierung mit dem passenden Selektionsmittel einzuleiten, z. B. 250 nM Arsenal, 5 mg/L PPT oder 50 mg/L Kanamycin. Sprosse, die gegen das Selektionsmittel resistent sind, erscheinen und werden, sobald sie aufgetaucht sind, in die Erde überführt.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um das Vorhandensein von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern Hybridisierung bestätigt, in der DNA auf einem 1% Aagarosegel elektrophoretiert und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird. Das PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird zur Herstellung einer Digoxigenin-markierten Sonde durch PCR verwendet und nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet.
Transgene T0 Roggengras-Pflanzen werden vegetativ durch Herausschneiden der Sprossen vermehrt. Die transplantierten Sprosse werden 2 Monate im Glashaus gehalten, bis sie gut etabliert sind. Die Sprosse werden entblättert und 2 Wochen wachsen gelassen.
Pflanzen der T1 oder T2 Generation werden erzeugt und Niedertemperaturexperimenten unterzogen, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Für die Bewertung der Erhöhung des Ertrags, werden z. B. Toleranz gegen Niedertemperatur, Biomassenproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockensubstanzproduktion, und/oder Samenertrag mit Pflanzen verglichen, denen das Transgen fehlt, z. B. die den nicht transgenen Wildtyppflanzen entsprechen.
Beispiel 6: Manipulation von Sojabohnen-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder einem anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmal z. B. verstärkter Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhter Biomassenproduktion durch überexprimierende, den Ertrag erhöhende, z. B. YRP-Protein kodierende, z. B. niedertemperatturtoleranzbezogene Gene von Saccharomyces cereviesae oder Synechocystis oder E. coli.
Sojabohne wird nach der folgenden Modifizierung der Methode transformiert, die in dem Texas A&M Patent US 5,164,310 beschrieben ist. Mehrere, im Handel erhältliche Sojabohnenvarietäten sind einer Transformation durch diese Methode zugänglich. Die Kulturpflanzensorte Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird herkömmlich für die Transformation verwendet. Die Semen werden durch Eintauchen in 70% (v/v) Ethanol für 6 min und in 25% handelsübliche Bleiche (NaOCl), ergänzt mit 0,1% (v/v) Tween für 20 min sterilisiert, gefolgt von 4 mal Spülen mit sterilem doppelt destilliertem Wasser. Sieben Tage alte Setzlinge werden dann durch Entfernen der Keimwurzel, des Hypokotyls und eines Kotyledons von jedem Setzling vermehrt. Dann wird das Epikotyl mit einem Kotyledon auf frische Keimungsmedien in Petri-Schalen überführt und bei 25°C unter einer 16-h Photoperiode (ungefähr 100 μmol/m2s) drei Wochen inkubiert. Hilfsnoden (ungefähr 4 mm Länge) wurden aus 3–4 Wochen alten Pflanzen geschnitten. Hilfsnoden werden ausgeschnitten und in einer Agrobacterium LBA4404 Kultur inkubiert.
Es wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme für die Pflanzentransformation beschrieben (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humane Press, Totowa, New Jersey). Viele beruhen auf dem Vektor pBIN19, der von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984) beschrieben ist, der eine Pflanzengen-Expressionskassette enthält, die von den linken und rechten Grenzsequenzen des Ti Plasmids von Agrobacterium tumefaciens flankiert ist. Eine Pflanzengen-Expressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarker-Gen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder genomischen DNA des Merkmal-Gens reguliert. Verschiedenen Selektionsmarker-Gene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis Gens, das für ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS) Enzym kodiert ( US Patente 5,7673,666 und 6,225,105 ). Ebenso können verschiedene Promotoren zur Regulierung des Merkmal-Gens verwendet werden, das für eine konstitutive, Entwicklungs-, Gewebe- oder Umwelt-Regulierung der Gentranskription sorgt. In diesem Beispiel kann der 34S Promotor (GenBank Zugriffsnummern M59930 und X16673) zur Bereitstellung der konstitutiven Expression des Merkmal-Gens verwendet werden.
Nach der Co-Kultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt, die mit 500 mg/L Timentin ergänzt sind. Die Sprossen werden ausgeschnitten und auf ein Spross-Verlängerungsmedium gebracht. Sprossen, die länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium für zwei bis vier Wochen gebracht, bevor sie in Erde verpflanzt werden.
Die primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um das Vorhandensein von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern Hybridisierung bestätigt, in der DNA auf einem 1% Aagarosegel elektrophoretiert und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird. Das PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird zur Herstellung einer Digoxigenin-markierten Sonde durch PCR verwendet und nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet.
Pflanzen der T1 oder T2 Generation werden erzeugt und Niedertemperaturexperimenten unterzogen, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Für die Bewertung der Erhöhung des Ertrags, werden z. B. Toleranz gegen Niedertemperatur, Biomassenproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockensubstanzproduktion, und/oder Samenertrag mit Pflanzen verglichen, denen das Transgen fehlt, z. B. die den nicht transgenen Wildtyppflanzen entsprechen.
Beispiel 7: Manipulation von Raps/Canola-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder einem anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmal z. B. verstärkter Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhter Biomassenproduktion durch überexprimierende, den Ertrag erhöhende, z. B. YRP-Protein kodierende, z. B. niedertemperatturtoleranzbezogene Gene von Saccharomyces cereviesae oder Synechocystis oder E. coli.
Kotyledone Blattstiele und Hypokotyle von 5–6 Tage alten Jungsetzlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und nach Babic et al. (Plant Cell Rep 17 angeführt, 183 (1998)) kultiviert. Die im Handel erhältliche Kulturpflanzensorte Westar (Agriculture Canada) ist die Standardvarietät, die für die Transformation verwendet wird, aber es können andere Varietäten verwendet werden.
Agrobacterium tumefaciens LBA4404, enthaltend einen binären Vektor, kann für die Rapstransformation verwendet werden. Es wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme für die Pflanzentransformation beschrieben (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humane Press, Totowa, New Jersey). Viele beruhen auf dem Vektor pBIN19, der von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984) beschrieben ist, der eine Pflanzengen-Expressionskassette enthält, die von den linken und rechten Grenzsequenzen des Ti Plasmids von Agrobacterium tumefaciens flankiert ist. Eine Pflanzengen-Expressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarker-Gen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder genomischen DNA des Merkmal-Gens reguliert. Verschiedenen Selektionsmarker-Gene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis Gens, das für ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS) Enzym kodiert ( US Patente 5,7673,666 und 6,225,105 ). Ebenso können verschiedene Promotoren zur Regulierung des Merkmal-Gens verwendet werden, das für eine konstitutive, Entwicklungs-, Gewebe- oder Umwelt-Regulierung der Gentranskription sorgt. In diesem Beispiel kann der 34S Promotor (GenBank Zugriffsnummern M59930 und X16673) zur Bereitstellung der konstitutiven Expression des Merkmal-Gens verwendet werden.
Rapssamen werden in 70% Ethanol 2 min und dann in 30% Clorox mit einem Tropfen Tween-20 für 10 min oberflächensterilisiert, gefolgt von drei Spülungen mit sterilisiertem destilliertem Wasser. Die Samen werden dann in vitro 5 Tage auf halbstarkem MS Medium ohne Hormone, 1% Sucrose, 0,7% Phytagar bei 23°C, 16 h Licht gekeimt. Die Kotyledon-Blattstielexplantate mit dem anhaftenden Kotyledon werden aus den In vitro-Setzlingen ausgeschnitten und mit Agrobacterium inokuliert, indem das geschnittene Ende des Blattstiels in die bakterielle Suspension getaucht wird. Die Explantate werden dann 2 Tage auf MSBAP-3 Medium, das 3 mg/L BAP, 3% Sucrose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 h Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Co-Kultivierung mit Agrobacterium werden die Blattstiel-Explantate auf MSBAP-3 Medium, das 3 mg/L BAP, Cefotaxim, Carbenicilin, oder Timentin (300 mg/L) enthält, für 7 Tage übertragen und dann auf MSBAP-3 Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregenerierung kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm lang sind, werden sie geschnitten und auf Spross-Verlängerungsmedium (MSBAP-0,5, enthaltend 0,5 mg/L BAP) übertragen. Sprossen von etwa 2 cm Länge werden auf das Bewurzelungsmedium (MSO) zur Wurzeleinleitung übertragen.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um das Vorhandensein von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern Hybridisierung bestätigt, in der DNA auf einem 1% Aagarosegel elektrophoretiert und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird. Das PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird zur Herstellung einer Digoxigenin-markierten Sonde durch PCR verwendet und nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet.
Pflanzen der T1 oder T2 Generation werden erzeugt und Niedertemperaturexperimenten unterzogen, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Für die Bewertung der Erhöhung des Ertrags, werden z. B. Toleranz gegen Niedertemperatur, Biomassenproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockensubstanzproduktion, und/oder Samenertrag mit Pflanzen verglichen, denen das Transgen fehlt, z. B. die den nicht transgenen Wildtyppflanzen entsprechen.
Beispiel 8: Manipulation von Mais Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder einem anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmal z. B. verstärkter Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhter Biomassenproduktion durch überexprimierende, den Ertrag erhöhende, z. B. YRP-Protein kodierende, z. B. niedertemperatturresistenz- und -toleranzbezogene Gene von Saccharomyces cereviesae oder Synechocystis oder E. coli
Transformation von Mais (Zea Mays L.) wird mit einer Modifizierung der Methode durchgeführt, die von Ishida et al. (Nature Biotech 14745 (1996)) beschrieben ist. Die Transformation ist bei Mais genotyp-abhängig und nur spezifische Gentypen sind einer Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Eltern sind gute Quellen für Spendermaterial für die Transformation (Fromm et al. Biotech 8, 833 (1990)), aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Ähren werden von Maispflanzen ungefähr 11 Tage nach der Befruchtung (”days after pollination” – DAP) geerntet, wenn die Länge unreifer Embryos etwa 1 bis 1,2 mm ist. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens co-kultiviert, die ”superbinäre” Vektoren tragen, und transgene Pflanzen werden durch Organgenese gewonnen. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in WO Patent WO 94/00977 und WO 95/06722 beschrieben. Vektoren wurden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das für ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthese (AHAS) Enzym kodiert ( US Patent 6,025,541 ). Ebenso können verschiedene Promotoren zur Regulierung des Merkmal-Gens verwendet werden, das für eine konstitutive, Entwicklungs-, Gewebe- oder Umwelt-Regulierung der Gentranskription sorgt. In diesem Beispiel wurde der 34S Promotor (GenBank Zugriffsnummern M59930 und X16673) zur Bereitstellung der konstitutiven Expression des Merkmal-Gens verwendet.
Ausgeschnittene Embryos werden auf dem Callus-Induktionsmedium, dann Maisregenerationsmedium, das Imidazolinon als Selektionsmittel enthält, gezüchtet. Die Petri-Platten werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Maisbewurzelungsmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln inkubiert. Die bewurzelten Sprossen werden in die Erde im Glashaus verpflanzt. T1 Samen werden aus den Pflanzen erzeugt, die eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und PCR positiv für die Transgene sind.
Die T1 transgenen Pflanzen werden dann auf ihre verstärkte Stresstoleranz, wie Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhte Biomassenproduktion nach dem Verfahren bewertet, das in Beispiel 1 beschrieben ist. Die T1 Generation von Einzel-Lokus-Insertionen der T-DNA segregiert für das Transgen in einem 3:1 Verhältnis. Jene Nachkommen, die eine oder zwei Kopien des Transgens enthalten, sind bezüglich des Imidazolinon-Herbizids tolerant und weisen einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine Verstärkung von Stresstoleranz, wie Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhte Biomassenproduktion im Vergleich zu den Nachkommen auf, denen die Transgene fehlen.
Pflanzen der T1 oder T2 Generation werden erzeugt und Niedertemperaturexperimenten, z. B. wie oben in Beispiel 2 beschrieben, unterzogen. Für die Bewertung der Ertragserhöhung, z. B. Toleranz gegen Niedertemperatur, werden Biomassenproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockensubstanzproduktion und/oder Samenertrag mit z. B. entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen.
Homozygote T2 Pflanzen wiesen ähnliche Phänotypen auf. Hybride Pflanzen (F1 Nachkommen) von homozygoten transgenen Pflanzen und nicht transgenen Pflanzen wiesen auch einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel verstärkte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder ein anderes erwähntes ertragsbezogenes Merkmal, z. B. verstärkte Toleranz gegen Niedertemperatur, auf.
Beispiel 9: Manipulation von Weizen-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder einem anderen erwähnten ertragsbezogenen Merkmal, z. B. verstärkter Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhter Biomassenproduktion durch überexprimierende, den Ertrag erhöhende, z. B. YRP-Protein kodierende, z. B. niedertemperatturresistenz- und -toleranzbezogene Gene von Saccharomyces cereviesae oder Synechocystis oder E. coli
Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, das von Ishida et al. (Nature Biotech. 14745 (1996)) beschrieben ist. Die Kulturpflanzensorte Bobwhite (erhältlich von CYMMIT, Mexiko) wird allgemein in der Transformation verwendet. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens co-kultiviert, die ”superbinäre” Vektoren tragen, und transgene Pflanzen werden durch Organgenese gewonnen. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in WO Patent WO 94/00977 und WO 95/06722 beschrieben. Vektoren werden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das für ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthese (AHAS) Enzym kodiert ( US Patent 6,025,541 ). Ebenso können verschiedene Promotoren zur Regulierung des Merkmal-Gens verwendet werden, das für eine konstitutive, Entwicklungs-, Gewebe- oder Umwelt-Regulierung der Gentranskription sorgt. In diesem Beispiel wird der 34S Promotor (GenBank Zugriffsnummern M59930 und X16673) zur Bereitstellung der konstitutiven Expression des Merkmal-Gens verwendet.
Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryos auf Callus-Induktionsmedium, dann Regenerationsmedium, das Imidazolinon als Selektionsmittel enthält, gezüchtet. Die Petri-Platten werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in die Erde im Glashaus verpflanzt. T1 Semen werden aus den Pflanzen erzeugt, die eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und PCR positiv für die Transgene sind.
Die T1 transgenen Pflanzen werden dann auf ihre verstärkte Toleranz gegen Niedertemperatur und/oder erhöhte Biomassenproduktion nach dem Verfahren bewertet, das in Beispiel 2 beschrieben ist. Die T1 Generation von Einzel-Lokus-Insertionen der T-DNA segregiert für das Transgen in einem 3:1 Verhältnis. Jene Nachkommen, die eine oder zwei Kopien des Transgens enthalten, sind bezüglich des Imidazolinon-Herbizids tolerant und weisen einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine Verstärkung von Toleranz gegen Niedertemperatur und/oder erhöhte Biomassenproduktion im Vergleich zu den Nachkommen auf, denen die Transgene fehlen. Homozygote T2 Pflanzen weisen ähnliche Phänotypen auf.
Für die Bewertung der Ertragserhöhung, werden z. B. Toleranz gegen Niedertemperatur, Biomassenproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockensubstanzproduktion und/oder Samenertrag mit z. B. entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen. Zum Beispiel können Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, z. B. höheren Toleranz gegen Stress, z. B. mit einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, und z. B. mit höherer Toleranz gegen Niedertemperatur eine erhöhte Biomasseproduktion und/oder Trockensubstanzproduktion und/oder Samenertrag unter Niedertemperatur aufweisen, wenn sie mit Pflanzen verglichen werden, denen das Transgen fehlt, z. B. mit entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen.
Beispiel 10: Identifizierung von identischen und heterologen Genen
Gensequenzen können zum Identifizieren identischer oder heterologer Gene aus cDNA oder genomischen Bibliotheken verwendet werden. Identische Gene (e. g. cDNA Klone voller Länge) können durch Nukleinsäurehybridisierung gewonnen werden, zum Beispiel unter Verwendung von cDNA Bibliotheken. Abhängig von dem Überfluss des Gens von Interesse werden 100.000 bis zu 1.000.000 rekombinante Bakteriophage ausgestrichen und auf Nylonmembrane übertragen. Nach der Denaturierung mit Alkali wird die DNA auf der Membran immobilisiert, z. B. durch UV Kreuzvernetzung. Die Hybridisierung wird bei Hochstringenzbedingungen ausgeführt. In wässeriger Lösung wird das Hybridisieren und Waschen bei einer Ionenstärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68°C ausgeführt. Hybridisierungsonden werden durch z. B. radioaktives (32P) Nick-Transkription-Labeling (High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland) ausgeführt. Signale werden durch Autoradiographie nachgewiesen.
Teilweise identische oder heterologe Gene, die verwandt aber nicht identisch sind, können analog zu der oben beschriebenen Prozedur unter Verwendung von Niederstringenzhybridisierungs- und Waschbedingungen identifiziert werden. Für eine wässerige Hybridisierung wird die Ionenstärke normalerweise bei 1 M NaCl gehalten, während die Temperatur progressiv von 68 auf 42°C gesenkt.
Die Isolierung von Gensequenzen mit Homologie (oder Sequenzidentität/ähnlichkeit) nur in einer eigenen Domäne von (zum Beispiel 10–20 Aminosäuren) kann unter Verwendung synthetischer radiomarkierter Oligonukleotidsonden ausgeführt werden. Radiomarkierte Oligonukleotide werden durch Phosphorylierung des 5- primen Endes von zwei komplementären Oligonukleotiden mit T4 Polynukleotid-Kinase hergestellt. Die komplementären Oligonukleotide werden getempert und ligiert, um Konkatemere zu bilden. Die doppelsträngigen Konkatemere werden dann zum Beispiel durch Nick-Transkription radiomarkiert Hybridisierung wird normalerweise bei Niederstringenz-Bedingungen unter Verwendung hoher Oligonukleotid-Konzentrationen durchgeführt. Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:
6 × SSC
0,01 M Natriumphosphat
1 mM EDTA (pH 8)
0,5% SDS
100 μg/ml denaturierte Lachssperma DNA
0,1% fettfreie Trockenmilch
Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise auf 5–10°C unter die geschätzte Oligonukleotid Tm oder bis auf Raumtemperatur gesenkt, gefolgt von Waschschritten und Autoradiographie. Das Waschen wird mit Niederstringenz durchgeführt, wie 3 Waschschritten unter Verwendung von 4 × SSC. Weitere Einzelheiten sind von Sambrook J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel F. M. et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons., beschrieben.
Beispiel 11: Identifizierung von identischen Genen durch Screening von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern
c-DNA Klone können zur Herstellung eines rekombinantes Polypeptids zum Beispiel in E. coli (z. B. Qiagen QIAexpress pQE System) verwendet werden. Rekombinante Polypeptide werden dann normalerweise durch Ni-NTA Affinitätschromatographie (Qiagen) affinitätsgereinigt. Rekombinante Polypeptide werden dann zur Erzeugung spezifischer Antikörper verwendet, zum Beispiel unter Verwendung von Standardtechniken für die Kaninchenimmunisierung. Antikörper werden unter Verwendung einer Ni-NTA Säule affinitätsgereinigt, die mit dem rekombinanten Antigen gesättigt ist, wie von Gu et al., BioTechniken 17, 257 (1994) beschrieben. Der Antikörper kann dann zum Screenen der Expressions-cDNA-Bibliotheken verwendet werden, um identische oder heterologe Gene durch immunologisches Screening zu identifizieren (Sambrook, J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
Beispiel 12: in vivo-Mutagenese
Die In vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann durch Hindurchleiten von Plasmid (oder einer anderen Vektor) DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z. B. Bacillus spp. oder Hefen wie S. cerevisiae) durchgeführt werden, die in ihren Fähigkeiten beeinträchtig sind, die Integrität ihrer genetischen Information beizubehalten. Typische Mutatorstämme haben Mutationen in den Genen für das DNA Reparatursystem (z. B. mutHLS, mutD, mutT, usw.; zur Referenz, siehe Rupp W. D., DNA repair mechanisms, in: E. coli and Salmonella, S. 2277–2294, ASM, 1996, Washington). Solche Stämme sind dem Fachmann gut bekannt. Die Verwendung solcher Stämme ist zum Beispiel, in Greener A. und Callahan M., Strategies 7, 32 (1994) dargestellt Der Transfer von mutierten DNA-Molekülen in Pflanzen erfolgt vorzugsweise nach Selektion und Testung in Mikroorganismen. Transgene Pflanzen werden nach verschiedenen Beispielen in der Erläuterung dieses Dokuments erzeugt.
Beispiel 13: Manipulation von Arabidopsis Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhter Biomassenproduktion durch überexprimierende, YRP kodierenden Gene zum Beispiel von A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa unter Verwendung gewebespezifischer oder stressinduzierbare Promotoren.
Transgene Arabidopsis Pflanzen überexprimierende YRP Gene, z. B. niedertemperaturresistenz- und/oder -toleranzbezogenes Protein kodierende Gene, von zum Beispiel Brassica napus, Glycine max, Zea mays und Oryza sativa werden wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt, um die YRP kodierenden Transgene unter der Kontrolle eines gewebespezifischen oder stressinduzierbaren Promotors zu exprimieren. Pflanzen der T2 Generation werden unter stressfreien oder Nicht-Stressbedingungen erzeugt, z. B. Niedertemperaturbedingungen. Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, z. B. einer höheren Toleranz gegen Stress, z. B. Niedertemperatur, oder mit einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, zeigen erhöhte Biomassenproduktion und/oder Trockensubstanzproduktion und/oder erhöhten Samenertrag unter Niedertemperaturbedingungen, im Vergleich zu Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. zu entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen.
Beispiel 14: Manipulation von Luzerne-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhter Biomassenproduktion durch überexprimierende, YRP kodierende Gene, z. B. niedertemperaturresistenz und/oder -toleranzbezogene Gene zum Beispiel von A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa.
Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird unter Verwendung des Verfahrens von McKersie et al., (Plant Physiol. 119, 839 (1999)) transformiert. Regeneration und Transformation von Luzerne ist vom Genotyp abhängig und daher ist eine regenerierende Pflanze erforderlich. Verfahren zum Erhalten regenerierender Pflanzen wurden beschrieben. Zum Beispiel können diese von der Kulturpflanzensorte Rangelander (Agriculture Canada) oder einer anderen im Handel erhältlichen Luzerne-Varietät selektiert werden, wie von Brown und Atanassov (Plant Cell Tissue Organ Culture 4, 111 (1985)) beschrieben ist. Als Alternative wurde die RA3 Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in Gewebekultur selektiert (Walker et al., Am. J. Bot. 65, 54 (1978)).
Blattstielexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., Plant Physiol 119, 839 (1999)) oder LBA4404, enthaltend einen binären Vektor, co-kultiviert. Es wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme für die Pflanzentransformation beschrieben (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humane Press, Totowa, New Jersey). Viele beruhen auf dem Vektor pBIN19, der von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984) beschrieben ist, der eine Pflanzengen-Expressionskassette enthält, die von den linken und rechten Grenzsequenzen des Ti Plasmids von Agrobacterium tumefaciens flankiert ist. Eine Pflanzengen-Expressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarker-Gen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder genomischen DNA des Merkmal-Gens reguliert. Verschiedenen Selektionsmarker-Gene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis Gens, das für ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthese (AHAS) Enzym kodiert ( US Patente 5,7673,666 und 6,225,105 ). Ebenso können verschiedene Promotoren zur Regulierung des Merkmal-Gens verwendet werden, das für eine konstitutive, Entwicklungs-, Gewebe- oder Umwelt-Regulierung der Gentranskription sorgt. In diesem Beispiel kann der 34S Promotor (GenBank Zugriffsnummern M59930 und X16673) zur Bereitstellung der konstitutiven Expression des Merkmal-Gens verwendet werden.
Die Explantate werden 3 Tage im Dunkeln auf SH Induktionsmedium, enthaltend 288 mg/L Pro, 53 mg/L Thioprolin, 4,35 g/L K2SO4, und 100 μm Acetosyringinon co-kultiviert. Die Explantate wurden in halbstarkem Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf demselben SH Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum ausgestrichen, um das Agrobacterium Wachstum zu hemmen. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryos auf BOi2Y Entwicklungmedium übertragen, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/L Sucrose enthält. Somatische Embryos werden anschließend auf halbstarkem Murashige-Skoog Medium gekeimt Bewurzelte Setzlinge werden in Töpfen umgepflanzt und im Glashaus gezüchtet.
Die T0 transgenen Pflanzen werden durch Nodenschnitte vermehrt und in Turface Wachstumsmedium bewurzelt. Pflanzen der T1 oder T2 Generation werden erzeugt und Experimenten unterzogen, die Stress oder Nicht-Stressbedingungen umfassen, z. B. Niedertemperaturbedingungen, wie in vorherigen Beispielen beschrieben.
Für die Bewertung der Ertragserhöhung werden z. B. Toleranz gegen Niedertemperatur, Biomassenproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockensubstanzproduktion und/oder Samenertrag mit z. B. entsprechenden, nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen.
Zum Beispiel, Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, z. B. höhere Toleranz gegen Stress, z. B. mit einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, und z. B. mit höherer Toleranz gegen Niedertemperatur, können eine erhöhte Biomassenproduktion und/oder Trockensubstanzproduktion und/oder einen erhöhten Samenertrag unter Niedertemperatur im Vergleich zu Pflanzen aufweisen, denen das Transgen fehlt, z. B. zu entsprechenden, nicht transgenen Wildtyppflanzen.
Beispiel 15: Manipulation von Roggengras-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Stresstoleranz, vorzugsweise einer Toleranz, gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhten Biomassenproduktion durch überexprimierende YRP Gene, z. B. niedertemperaturresistenz- und/oder -toleranzbezogenen Genen zum Beispiel von A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa.
Samen von mehreren verschiedenen Roggengras-Varietäten können als Explantatquellen zur Transformation verwendet werden, einschließlich der im Handel erhältlichen Varietät Gunne, erhältlich von der Svalöf Weibull Samenfirma, oder der Varietät Affinity. Die Samen werden der Reihe nach mit 1% Tween-20 für 1 Minute, 100% Bleiche für 60 Minuten, 3 Spülungen von 5 Minuten, jeweils mit entionisiertem und destilliertem H2O oberflächensterilisiert, und dann 3–4 Tage auf feuchtem Sterilfilterpapier im Dunkeln bekeimt. Setzlinge werden ferner 1 Minute mit 1% Tween-20, 5 Minuten mit 75% Bleiche sterilisiert und 3 mal jeweils mit doppelt destiliertem H2O, 5 min gespült.
Oberflächensterilisierte Samen werden auf das Callus-Induktionsmedium aufgebracht, enthaltend Murashige und Skoog Basalsalze und Vitamine, 20 g/L Sucrose, 150 mg/L Asparagin, 500 mg/L Caseinhydrolysat, 3 g/L Phytagel, 10 mg/L BAP, und 5 mg/L Dicamba. Die Platten werden im Dunkeln bei 25°C für 4 Wochen zur Samenkeimung und embryogenen Callus-Induktion inkubiert.
Nach 4 Wochen auf dem Callus-Induktionsmedium werden die Sprosse und Wurzeln der Setzlinge abgeschnitten, der Callus wird in frische Medien überführt, weitere 4 Wochen in Kultur gehalten und dann in MSO Medium im Licht für 2 Wochen überführt. Mehrere Stücke des Callus (11–17 Wochen alt) werden entweder durch ein Sieb mit Siebweite 10 gestrichen und auf Callus-Induktionsmedium gebracht, oder in 100 ml flüssigem Roggengras Callus-Induktionsmedium (dasselbe Medium wie für die Callus-Induktion mit Agar) in einem 250 ml Kolben kultiviert. Der Kolben wird in Folie eingeschlagen und bei 175 U/min im Dunkeln bei 23°C 1 Woche geschüttelt. Die flüssige Kultur mit einem Sieb der Siebweite 40 gesiebt, um die Zellen zu sammeln. Die auf dem Sieb gesammelte Fraktion wird ausgestrichen und auf festem Roggengras Callus-Induktionsmedium 1 Woche im Dunkeln bei 25°C kultiviert, Der Callus wird dann auf ein MS Medium überführt, das 1% Sucrose enthält, und 2 Wochen kultiviert.
Die Transformation kann entweder mit Agrobacterium- oder mit Teilchenbombardement-Methoden erfolgen. Der Expressionsvektor wird erzeugt, der einen konstitutiven Pflanzenpromotor und die cDNA des Gens in einem pUC Vektor enthält. Die Plasmid DNA wird aus E. coli Zellen mit dem Qiagen Kit nach den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Ungefähr 2 g embryogener Callus wird in der Mitte eines sterilen Filterpapiers in einer Petri-Schale verteilt. Ein Aliquot von flüssigem MSO mit 10 g/L Sucrose wird dem Filterpapier zugegeben. Goldpartikel (1,0 μm groß) werden mit Plasmid DNA nach der Methode von Sanfürd et al., 1993 überzogen und an den embryogenen Callus mit den folgenden Parameter abgegeben: 500 μg Partikel und 2 μg DNA pro Abgabe, 1300 psi und eine Target-Distanz von 8,5 cm von der Stoppplatte zu der Callus-Platte und 1 Abgabe pro Callus-Platte.
Nach dem Bombardement werden die Calli wieder auf frisches Callus-Entwicklungsmedium überführt und im Dunkeln 1 Woche bei Raumtemperatur gehalten. Der Callus wird dann zu Wachstumsbedingungen im Licht bei 25°C überführt, um die Embryodifferenzierung mit dem passenden Selektionsmittel einzuleiten, z. B. 250 nM Arsenal, 5 mg/L PPT oder 50 mg/L Kanamycin. Sprosse, die gegen das Selektionsmittel resistent sind, erscheinen und werden, sobald sie aufgetaucht sind, in die Erde überführt.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um das Vorhandensein von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern Hybridisierung bestätigt, in der DNA auf einem 1% Aagarosegel elektrophoretiert und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird. Das PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird zur Herstellung einer Digoxigenin-markierten Sonde durch PCR verwendet und nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet.
Transgene T0 Roggengras-Pflanzen werden vegetativ durch Herausschneiden der Sprossen vermehrt. Die transplantierten Sprosse werden 2 Monate im Glashaus gehalten, bis sie gut etabliert sind, Pflanzen der T1 oder T2 Generation werden erzeugt und Stress oder Nicht-Stressbedingungen ausgesetzt, z. B. Niedertemperaturexperimenten, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben.
Für die Bewertung der Ertragserhöhung, wird z. B. die Toleranz gegen Niedertemperatur, die Biomassenproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trockensubstanzproduktion und/oder der Samenertrag mit z. B. entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen. Zum Beispiel können Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, z. B. einer höheren Toleranz gegen Stress, z. B. mit einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, und z. B. mit höherer Toleranz gegen Niedertemperatur eine erhöhte Biomassenproduktion und/oder Trockensubstanzproduktion und/oder einen erhöhten Samenertrag unter Niedertemperatur aufweisen im Vergleich zu Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. zu entsprechenden, nicht transgenen Wildtyppflanzen.
Beispiel 16: Manipulation von Sojabohnen-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhten Biomassenproduktion durch überexprimierende YRP Gene, z. B. niedertemperaturresistenz- und/oder -toleranzbezogene Gene, zum Beispiel von A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Sojabohne wird nach der folgenden Modifizierung der Methode transformiert, die in dem Texas A&M Patent US 5,164,310 beschrieben ist. Mehrere, im Handel erhältliche Sojabohnenvarietäten sind einer Transformation durch diese Methode zugänglich. Die Kulturpflanzensorte Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird herkömmlich für die Transformation verwendet. Die Samen werden durch Eintauchen in 70% (v/v) Ethanol für 6 min und in 25% handelsübliche Bleiche (NaOCl), ergänzt mit 0,1% (v/v) Tween für 20 min sterilisiert, gefolgt von 4 mal Spülen mit sterilem doppelt destilliertem Wasser. Sieben Tage alte Setzlinge werden dann durch Entfernen der Keimwurzel, des Hypokotyls und eines Kotyledons von jedem Setzling vermehrt. Dann Wird das Epikotyl mit einem Kotyledon auf frische Keimungsmedien in Petri-Schalen überführt und bei 25°C unter einer 16-h Photoperiode (ungefähr 100 μmol/ms) drei Wochen inkubiert. Hilfsnoden (ungefähr 4 mm Länge) wurden aus 3–4 Wochen arten Pflanzen geschnitten. Hilfsnoden werden ausgeschnitten und in einer Agrobacterium LBA4404 Kultur inkubiert.
Es wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme für die Pflanzentransformation beschrieben (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele beruhen auf dem Vektor pBIN19, der von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984) beschrieben ist, der eine Pflanzengen-Expressionskassette enthält, die von den linken und rechten Grenzsequenzen des Ti Plasmids von Agrobacterium tumefaciens flankiert ist. Eine Pflanzengen-Expressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarker-Gen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder genomischen DNA des Merkmal-Gens reguliert. Verschiedenen Selektionsmarker-Gene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis Gens, das für ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthese (AHAS) Enzym kodiert ( US Patente 5,7673,666 und 6,225,105 ). Ebenso können verschiedene Promotoren zur Regulierung des Merkmal-Gens verwendet werden, das für eine konstitutive, Entwicklungs-, Gewebe- oder Umwelt-Regulierung der Gentranskription sorgt. In diesem Beispiel kann der 34S Promotor (GenBank Zugriffsnummern M59930 und X16673) zur Bereitstellung der konstitutiven Expression des Merkmal-Gens verwendet werden.
Nach der Co-Kultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien übertragen, die mit 500 mg/L Timentin ergänzt sind. Sprosse werden ausgeschnitten und auf ein Spross-Verlängerungsmedium aufgebracht. Sprosse, die länger als 1 cm sind, werden zwei bis vier Wochen vor dem Verpflanzen in Erde Bewurzelungsmedium.
Die primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um das Vorhandensein von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern Hybridisierung bestätigt, in der DNA auf einem 1% Aagarosegel elektrophoretiert und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird. Das PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird zur Herstellung einer Digoxigenin-markierten Sonde durch PCR verwendet und nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet.
Sojabohnen-Pflanzen überexprimierende YRP Gene, z. B. niedertemperaturresistenz und/oder -toleranzbezogene Gene von A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa, zeigen einen erhöhten Ertrag, haben zum Beispiel höhere Samenerträge.
Pflanzen der T1 oder T2 Generation werden erzeugt und Stress oder Nicht-Stressbedingungen ausgesetzt, z. B. Niedertemperaturbedingungen, wie zum Beispiel oben in Beispiel 1 beschrieben.
Für die Bewertung der Ertragserhöhung werden z. B. die Toleranz gegen Niedertemperatur, die Biomassenproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trockensubstanzproduktion und/oder der Samenertrag mit z. B. entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen. Zum Beispiel können Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, z. B. einer höheren Toleranz gegen Stress, z. B. mit einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, und z. B. mit höherer Toleranz gegen Niedertemperatur eine erhöhte Biomassenproduktion und/oder Trockensubstanzproduktion und/oder einen erhöhten Samenertrag unter Niedertemperatur aufweisen im Vergleich zu Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. zu entsprechenden, nicht transgenen Wildtyppflanzen.
Beispiel 17: Manipulation von Raps/Canola-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhten Biomassenproduktion durch überexprimierende YRP Gene, z. B. niedertemperaturresistenz- und/oder -toleranzbezogenen Genen, zum Beispiel von A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Kotyeledone Blattstiele und Hypokotyle von 5–6 Tage alten Jungsetzlingen werden für als Explantate für die Gewebekultur verwendet und nach Babic et al. (Plant Cell Rep 17, 183 (1998)) kultiviert. Die im Handel erhältliche Kulturpflanzensorte Westar (Agriculture Canada) ist die Standardvarietät, die für die Transformation verwendet wird, aber es können andere Varietäten verwendet werden.
Agrobacterium tumefaciens LBA4404, enthaltend einen binären Vektor, kann für die Rapstransformation verwendet werden. Es wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme für die Pflanzentransformation beschrieben (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele beruhen auf dem Vektor pBIN19, der von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) beschrieben ist, der eine Pflanzengen-Expressionskassette enthält, die von den linken und rechten Grenzsequenzen des Ti Plasmids von Agrobacterium tumefaciens flankiert ist Eine Pflanzengen-Expressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarker-Gen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder genomischen DNA des Merkmal-Gens reguliert. Verschiedenen Selektionsmarker-Gene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis Gens, das für ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS) Enzym kodiert ( US Patente 5,7673,666 und 6,225,105 ). Ebenso können verschiedene Promotoren zur Regulierung des Merkmal-Gens verwendet werden, das für eine konstitutive, Entwicklungs-, Gewebe- oder Umwelt-Regulierung der Gentranskription sorgt. In diesem Beispiel kann der 34S Promotor (GenBank Zugriffsnummern M59930 und X16673) zur Bereitstellung der konstitutiven Expression des Merkmal-Gens verwendet werden.
Rapssamen werden in 70% Ethanol 2 min und dann in 30% Clorox mit einem Tropfen Tween-20 für 10 min oberflächensterilisiert, gefolgt von drei Spülungen mit sterilisiertem destilliertem Wasser. Die Samen werden dann in vitro 5 Tage auf halbstarkem MS Medium ohne Hormone, 1% Sucrose, 0,7% Phytagar bei 23°C, 16 h Licht gekeimt. Die Kotyledon-Blattstielexplantate mit dem anhaftenden Kotyledon werden aus den in vitro Setzlingen ausgeschnitten und mit Agrobacterium inokuliert, indem das geschnittene Ende des Blattstiels in die bakterielle Suspension getaucht wird. Die Explantate werden dann 2 Tage auf MSBAP-3 Medium, das 3 mg/L BAR, 3% Sucrose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 h Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Co-Kultivierung mit Agrobacterium werden die Blattstiel-Explantate auf MSBAP-3 Medium, das 3 mg/L BAP, Cefotaxim, Carbenicillin, oder Timentin (300 mg/L) enthält, für 7 Tage übertragen und dann auf MSBAP-3 Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregenerierung kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm lang sind, werden sie geschnitten und auf Spross-Verlängerungsmedium (MSBAR-0,5, enthaltend 0,5 mg/L BAP) übertragen. Sprossen von etwa 2 cm Länge werden auf das Bewurzelungsmedium (MSO) zur Wurzeleinleitung übertragen.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um das Vorhandensein von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern Hybridisierung bestätigt, in der DNA auf einem 1% Aagarosegel elektrophoretiert und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird. Das PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird zur Herstellung einer Digoxigenin-markierten Sonde durch PCR verwendet und nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet.
Die transgenen Pflanzen werden dann auf ihren erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, z. B. eine höhere Toleranz gegen Stress, z. B. eine verstärkte Toleranz gegen Niedertemperatur und/oder erhöhte Biomassenproduktion nach dem Verfahren bewertet, das in Beispiel 2 beschrieben ist. Es hat sich gezeigt, dass transgenen Raps/Canola überexprimierende YRP Gene, z. B. niedertemperaturresistenz- und/oder -toleranzbezogene Gene, von A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa, einen erhöhten Ertrag zeigen, zum Beispiel einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, z. B. höhere Toleranz gegen Stress, z. B. mit verstärkter Toleranz gegen Niedertemperatur und/oder erhöhter Biomasseproduktion verglichen mit Pflanzen ohne das Transgen, z. B. entsprechenden, nicht transgenen Kontrollpflanzen, zeigen.
Beispiel 18: Manipulation von Maispflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhten Biomassenproduktion durch überexprimierende YRP Gene, z. B. niedertemperaturresistenz- und/oder -toleranzbezogenen Genen, zum Beispiel von A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa.
Transformation von Mais (Zea Mays L.) wird mit einer Modifizierung der Methode durchgeführt, die von Ishida et al. (Nature Biotech 14745 (1996)) beschrieben ist. Die Transformation ist bei Mais genotyp-abhängig und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Eltern sind gute Quellen für Spendermaterial für die Transformation (Fromm et al. Biotech 8, 833 (1990)), aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Ähren werden von Maispflanzen ungefähr 11 Tage nach der Befruchtung (”days alter pollination” – DAP) geerntet, wenn die Länge unreifer Embryos etwa 1 bis 1,2 mm ist. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens co-kultiviert, die ”superbinäre” Vektoren tragen, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in WO Patent WO 94/00977 und WO 95/06722 beschrieben. Vektoren wurden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das für ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS) Enzym kodiert ( US Patent 6,025,541 ). Ebenso können verschiedene Promotoren zur Regulierung des Merkmal-Gens verwendet werden, das für eine konstitutive, Entwicklungs-, Gewebe- oder Umwelt-Regulierung der Gentranskription sorgt. In diesem Beispiel wurde der 34S Promotor (GenBank Zugriffsnummern M59930 und X16673) zur Bereitstellung der konstitutiven Expression des Merkmal-Gens verwendet.
Ausgeschnittene Embryos werden auf dem Callus-Induktionsmedium, dann Maisregenerationsmedium, das Imidazolinon als Selektionsmittel enthält, gezüchtet. Die Petri-Platten werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Maisbewurzelungsmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln inkubiert. Die bewurzelten Sprossen werden in die Erde im Glashaus verpflanzt. T1 Samen werden aus den Pflanzen erzeugt, die eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und PCR positiv für die Transgene sind.
Die T1 transgenen Pflanzen werden dann auf ihren erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, z. B. eine höhere Toleranz gegen Stress, z. B. eine verstärkte Toleranz gegen Niedertemperatur und/oder erhöhte Biomassenproduktion nach dem Verfahren bewertet, das in Beispiel 2 beschrieben ist. Die T1 Generation von Einzel-Lokus-, Insertionen der T-DNA segregiert für das Transgen in einem 1:2:1 Verhältnis. Jene Nachkommen, die eine oder zwei Kopien des Transgens (3/4 der Nachkommen) enthaften, sind bezüglich des Imidazolinon-Herbizids tolerant und weisen einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine höhere Toleranz gegen Stress, z. B. eine verstärkte Toleranz gegen Niedertemperatur und/oder eine erhöhte Biomassenproduktion verglichen mit jenen Nachkommen, denen die Transgene fehlen. Tolerante Pflanzen haben höhere Samenerträge. Homozygote T2 Pflanzen wiesen ähnliche Phänotypen auf. Hybride Pflanzen (F1 Nachkommen) von homozygoten transgenen Pflanzen und nicht transgenen Pflanzen wiesen auch einen erhöhten Ertrag auf, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, z. B. höhere Toleranz gegen Stress, z. B. mit verstärkter Toleranz gegen Niedertemperatur und/oder erhöhter Biomassenproduktion.
Beispiel 19: Manipulation von Weizenpflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, zum Beispiel einer verstärkten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegen Niedertemperatur, und/oder erhöhten Biomassenproduktion durch überexprimierende YRP Gene, z. B. niedertemperaturresistenz- und/oder -toleranzbezogenen Genen, zum Beispiel von A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa.
Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, das von Ishida et al. (Nature Biotech. 14745 (1996)) beschrieben ist. Die Kulturpflanzensorte Bobwhite (erhältlich von CYMMIT, Mexiko) wird allgemein in der Transformation verwendet. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens co-kultiviert, die ”superbinäre” Vektoren tragen, und transgene Pflanzen werden durch Organgenese gewonnen. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in WO Patent WO 94/00977 und WO 95/06722 beschrieben. Vektoren werden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das für ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthese (AHAS) Enzym kodiert ( US Patent 6,025,541 ). Ebenso können verschiedene Promotoren zur Regulierung des Merkmal-Gens verwendet werden, das für eine konstitutive, Entwicklungs-, Gewebe- oder Umwelt-Regulierung der Gentranskription sorgt. In diesem Beispiel wird der 34S Promotor (GenBank Zugriffsnummern M59930 und X16673) zur Bereitstellung der konstitutiven Expression des Merkmal-Gens verwendet.
Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryos auf Callus-Induktionsmedium, dann Regenerationsmedium, das Imidazolinon als Selektionsmittel enthält, gezüchtet. Die Petri-Platten werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in die Erde im Glashaus verpflanzt. T1 Samen werden aus den Pflanzen erzeugt, die eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und PCR positiv für die Transgene sind.
Die T1 transgenen Pflanzen werden dann auf ihren erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, z. B. eine höhere Toleranz gegen Stress, z. B. eine verstärkte Toleranz gegen Niedertemperatur und/oder erhöhte Biomassenproduktion nach dem Verfahren bewertet, das in Beispiel 2 beschrieben ist. Die T1 Generation von Einzel-Lokus-Insertionen der T-DNA segregiert für das Transgen in einem 1:2:1 Verhältnis. Jene Nachkommen, die eine oder zwei Kopien des Transgens (3/4 der Nachkommen) enthalten, sind bezüglich des Imidazolinon-Herbizids tolerant und weisen einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes ertragsbezogenes Merkmal, zum Beispiel eine höhere Toleranz gegen Stress, z. B. eine verstärkte Toleranz gegen Niedertemperatur und/oder eine erhöhte Biomassenproduktion verglichen mit jenen Nachkommen, denen die Transgene fehlen.
Für die Bewertung der Ertragserhöhung werden z. B. die Toleranz gegen Niedertemperatur, die Biomassenproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trockensubstanzproduktion und/oder der Samenertrag mit z. B. entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen. Zum Beispiel können Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten ertragsbezogenen Merkmal, z. B. einer höheren Toleranz gegen Stress, z. B. mit einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, und z. B. mit höherer Toleranz gegen Niedertemperatur eine erhöhte Biomassenproduktion und/oder Trockensubstanzproduktion und/oder einen erhöhten Samenertrag unter Niedertemperatur aufweisen im Vergleich zu Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. zu entsprechenden, nicht transgenen Wildtyppflanzen.
Beispiel 20: Manipulation von Reispflanzen mit erhöhtem Ertrag unter Bedingung eines transienten und sich wiederholenden abiotischen Stresses durch überexprimierende stressbezogene Gene von Saccharomyces cerevisiae oder E. coli oder Synechocystis
Reistransformation
Das Agrobacterium, das den Expressionsvektor der Erfindung enthält, wird zum Transformieren von Oryza sativa Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der Reis Japonica Kulturpflanzensorte Nipponbare werden geschält. Die Sterilisierung wird durch Inkubieren über eine Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl2, gefolgt von 6 mal 15 Minuten Waschen mit sterilem destilliertem Wasser ausgeführt. Die sterilen Samen werden dann auf einem Medium, das 2,4-D (Callus-Induktionsmedium) enthält, gekeimt. Nach der Inkubation im Dunkeln über vier Wochen werden embryogene, von Rostellum abgeleitete Calli ausgeschnitten und auf demselben Medium vermehrt. Nach zwei Wochen werden die Calli durch Subkultur auf demselben Medium weitere 2 Wochen vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callusstücke werden auf frischem Medium 3 Tage vor der Co-Kultivierung subkultiviert (zur Förderung der Zellteilungsaktivität).
Agrobacterium Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor der Erfindung enthält, wird für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wird auf AB Medium mit dem geeigneten Antibiotikum inokuliert und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Die Bakterien werden dann gesammelt und in flüssigem Co-Kultivierungsmedium auf eine Dichte (OD600) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wird dann in eine Petri-Schale überführt und die Calli werden 15 Minuten in die Suspension getaucht. Die Callus-Gewebe werden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Co-Kultivierungsmedium übertragt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Co-kultivierte Calli werden auf 2,4-D-enthaftendem Medium 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels gezüchtet. In dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende Callus-Inseln. Nach der Übertragung dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Licht, wird das embryogene Potenzial freigesetzt und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Sprosse werden aus den Calli ausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen auf einem Auxin-enthaftend Medium inkubiert, von dem sie in Erde überführt werden. Gehärtete Sprosse werden unter hoher Feuchte und kurzen Tagen in einem Glashaus gezüchtet.
Ungefähr 35 unabhängige T0 Reistransformanten werden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten werden von einer Gewebekulturkammer zu einem Glashaus überführt. Nach einer quantitativen PCR Analyse zur Verifizierung der Kopiezahl des T-DNA Inserts, werden nur transgene Einzelkopie-Pflanzen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen, für die Ernte von T1 Samen behalten. Samen werden dann drei bis fünf Monate nach der Verpflanzung geerntet. Die Methode ergab Einzel-Lokus-Transformanten bei einer Rate von mehr als 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
Für den zyklierende Dürre-Test wird ein sich wiederholender Stress bei Pflanzen angewendet, ohne zur Austrocknung zu führen. Die Wasserversorgung während des Experiments ist begrenzt und Pflanzen werden Zyklen von Dürre und Wiederbewässerung ausgesetzt. Zum Messen der Biomassenproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung bestimmt, indem die Sprosse geschnitten und gewogen werden.
Beispiel 21: Manipulation von Reispflanzen mit erhöhtem Ertrag unter Bedingung eines transienten und sich wiederholenden abiotischen Stresses durch überexprimierende stressbezogene Gene von zum Beispiel, A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa.
Reistransformation
Das Agrobacterium, das den Expressionsvektor der Erfindung enthält, wird zum Transformieren von Oryza sativa Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der Reis Japonica Kulturpflanzensorte Nipponbare werden geschält. Die Sterilisierung wird durch Inkubieren über eine Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl2, gefolgt von 6 mal 15 Minuten Waschen mit sterilem destilliertem Wasser ausgeführt. Die sterilen Samen werden dann auf einem Medium, das 2,4-D (Callus-Induktionsmedium) enthält, gekeimt. Nach der Inkubation im Dunkeln über vier Wochen werden embryogene, von Rostellum abgeleitete Calli ausgeschnitten und auf demselben Medium vermehrt. Nach zwei Wochen werden die Calli durch Subkultur auf demselben Medium weitere 2 Wochen vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callusstücke werden auf frischem Medium 3 Tage vor der Co-Kultivierung subkultiviert (zur Förderung der Zellteilungsaktivität).
Agrobacterium Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor der Erfindung enthält, wird für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wird auf AB Medium mit dem geeigneten Antibiotikum inokuliert und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Die Bakterien werden dann gesammelt und in flüssigem Co-Kultivierungsmedium auf eine Dichte (OD600) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wird dann in eine Petri-Schale überführt und die Calli werden 15 Minuten in die Suspension getaucht. Die Callus-Gewebe werden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Co-Kultivierungsmedium übertragt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Co-kultivierte Calli werden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels gezüchtet. In dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende Callus-Inseln. Nach der Übertragung dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Licht, wird das embryogene Potenzial freigesetzt und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Sprosse werden aus den Calli ausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen auf einem Auxin-enthaltend Medium inkubiert, von dem sie in Erde überführt werden. Gehärtete Sprosse werden unter hoher Feuchte und kurzen Tagen in einem Glashaus gezüchtet.
Ungefähr 35 unabhängige T0 Reistransformanten werden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten werden von einer Gewebekulturkammer zu einem Glashaus überführt. Nach einer quantitativen PCR Analyse zur Verifizierung der Kopiezahl des T-DNA Inserts, werden nur transgene Einzelkopie-Pflanzen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen, für die Ernte von T1 Samen behalten. Samen werden dann drei bis fünf Monate nach der Verpflanzung geerntet. Die Methode ergab Einzel-Lokus-Transformanten bei einer Rate von mehr als 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chen et al. 1993, Hiei et al. 1994).
Für den zyklierende Dürre-Test wird ein sich wiederholender Stress bei Pflanzen angewendet, ohne zur Austrocknung zu führen. Die Wasserversorgung während des Experiments ist begrenzt und Pflanzen werden Zyklen von Dürre und Wiederbewässerung ausgesetzt. Zum Messen der Biomassenproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung bestimmt, indem die Sprosse geschnitten und gewogen werden. Bei einem äquivalent Grad von Dürrestress, sind tolerante Pflanzen imstande, ein normales Wachstum wieder aufzunehmen, während anfällige Pflanzen abgestorben sind oder eine signifikante Verletzung erlitten hatten, die zu kürzeren Blättern und weniger Trockensubstanz führt.
Figuren:
1 Vektor VC-MME220-1qcz (SEQ ID NR: 41), verwendet für das Klonieren eines Gens von Interesse für eine nicht zielgerichtete Expression.
2 Vektor VC-MME221-1qcz (SEQ ID NR: 46), verwendet für das Klonieren eines Gens von Interesse für eine nichtzielgerichtete Expression.
3 Vektor VC-MME354-1QCZ (SEQ ID NR: 32), verwendet für das Klonieren eines Gens von Interesse für eine nicht zielgerichtete Expression.
4 Vektor VC-MME432-1qcz (SEQ ID NR: 42), verwendet für das Klonieren eines Gens von Interesse für eine plastidäre zielgerichtete Expression.
5 VC-MME489-1QCZ (SEQ ID NR: 56), verwendet für das Klonieren eines Gens von Interesse und für das Klonieren einer Targeting-Sequenz.
6. Vektor pMTX0270p (SEQ ID NR: 9), verwendet für das Klonieren einer Targeting-Sequenz.
7. Vektor pMTX155 (SEQ ID NR: 31), verwendet für das Klonieren eines Gens von Interesse für eine nicht zielgerichtete Expression
8. Vektor VC-MME356-1QCZ (SEQ ID NR: 34), verwendet für eine mitochondrische zielgerichtete Expression.
9. Vektor VC-MME301-1QCZ (SEQ ID NR: 36), verwendet für eine nicht zielgerichtete Expression in vorzugsweise Samen.
10, Vektor pMTX461korrp (SEQ ID NR: 37), verwendet für eine plastidäre zielgerichtete Expression in vorzugsweise Samen.
11, Vektor VC-MME462-1QCZ (SEQ ID NR: 39), verwendet für eine mitochondrische zielgerichtete Expression in vorzugsweise Samen.
12. Vektor VC-MME431-1qcz (SEQ ID NR: 44), verwendet für eine mitochondrische zielgerichtete Expression.
13. Vektor pMTX447korr (SEQ ID NR: 47), verwendet für eine plastidäre zielgerichtete Expression.
14. Vektor VC-MME445-1qcz (SEQ ID NR: 49), verwendet für eine mitochondrische zielgerichtete Expression.
15. Vektor VC-MME289-1qcz (SEQ ID NR: 51), verwendet für eine nicht zielgerichtete Expression in vorzugsweise Samen.
16. Vektor VC-MME464-1qcz (SEQ ID NR: 52), verwendet für eine plastidäre zielgerichtete Expression in vorzugsweise Samen.
17. Vektor VC-MWE465-1qcz (SEQ ID NR: 54), verwendet für eine mitochondrische zielgerichtete Expression in vorzugsweise Samen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyppflanze, umfassend mindestens den folgenden Schritt: Erhöhen oder Erzeugen in einer Pflanze oder einem Teil davon einer oder mehrerer Aktivität(en), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthase, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-Phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein-Aktivität.
Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyppflanze, umfassend mindestens einen der Schritte, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder mindestens ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II bzw. Tabelle IV dargestellt; (ii) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Expressionsprodukts eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt, und (iii) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines funktionellen Äquivalents von (i) oder (ii).
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend (i) Erhöhen oder Erzeugen der Expression von; und/oder (ii) Erhöhen oder Erzeugen der Expression eines Expressionsprodukts; und/oder (iii) Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten eines Expressionsprodukts kodiert durch: mindestens ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid kodiert, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt ist; (b) einem Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt ist; (c) einem Nukleinsäuremolekül, das infolge einer Degeneriertheit des genetischen Kodes von einer Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt ist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens etwa 95% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt ist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens etwa 95% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids kodiert, für das das Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert, und das die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt wird, das ein Polynukleotid umfasst, wie in Spalte 5 von Tabelle I angeführt, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (f) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt werden, für das eines der Nukleinsäuremoleküle (a) bis (e) kodiert, und mit der Aktivität, die durch das Nukleinsäuremolekül dargestellt wird, das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle I angeführt umfasst; (h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder eines oder mehrere Polypeptidmotive umfasst, wie in Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV angeführt umfasst; (i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit der Aktivität kodiert, die durch ein Protein dargestellt ist, wie in Spalte 5 von Tabelle II angeführt, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (j) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das durch Amplifizieren einer cDNA Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III erzeugt wird und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV angeführt umfasst; und (k) einem Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde erhältlich ist, umfassend eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) oder mit einem Fragment davon mit mindestens etwa 50 nt eines Nukleinsäuremoleküls komplementär zu einer Nukleinsäuremolekülsequenz, die in (a) bis (e) charakterisiert ist und für ein Polypeptid mit der Aktivität kodiert, die durch ein Protein dargestellt ist, das ein Polypeptid wie in Spalte 5 von Tabelle II angeführt umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht transformierten Wildtyppflanze, umfassend das Transformieren einer Pflanzenzelle oder eines Pflanzenzellkerns oder eines Pflanzengewebes mit einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid kodiert, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt ist; (b) einem Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt ist; (c) einem Nukleinsäuremolekül, das infolge der Degeneriertheit des genetischen Kodes von einer Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt ist, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens etwa 95% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt ist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens etwa 95% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids kodiert, für das das Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert und mit der Aktivität, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I angeführt, und das einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (f) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt werden, für das eines der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) kodiert, und mit der Aktivität, die durch das Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I dargestellt; (h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, umfassend die Konsensussequenz oder eines oder mehrere Polypeptidmotive, wie in Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und vorzugsweise mit der Aktivität, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV dargestellt; (i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, mit der Aktivität, die durch ein Protein dargestellt ist, wie in Spalte 5 von Tabelle II angeführt, und das einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (j) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das durch Amplifzieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III erhalten wird und vorzugsweise die Aktivität hat, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, umfassend ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV angeführt; und (k) einem Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde erhältlich ist, umfassend eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls Von (a) oder (b) oder mit einem Fragment davon, mit mindestens etwa 400 nt eines Nukleinsäuremoleküls komplementär zu einer Nukleinsäuremolekülsequenz, die in (a) bis (e) charakterisiert ist und für ein Polypeptid mit der Aktivität kodiert, die durch ein Protein dargestellt ist, umfassend ein Polypeptid wie in Spalte 5 von Tabelle II angeführt, und Regenerieren einer transgenen Pflanze aus diesem transformierten Pflanzenzellkern, der Pflanzenzelle oder dem Pflanzengewebe mit erhöhtem Ertrag.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei eine oder mehrere Aktivitäten, die erhöht oder erzeugt werden, 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthese, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein bzw. YPL109C-Protein-Aktivität ist bzw. sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das zu einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyppflanze unter Standardwachstumsbedingungen, Niedertemperatur-, Dürre oder abiotischen Stressbedingungen führt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid kodiert, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II B dargestellt ist; (b) einem Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I B dargestellt ist; (c) einem Nukleinsäuremolekül, das infolge der Degeneriertheit des genetischen Kodes von einer Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II dargestellt ist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens etwa 95% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I dargestellt ist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens etwa 95% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids kodiert, für das das Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert und das die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt wird, das ein Polynukleotid umfasst, wie in Spalte 5 von Tabelle I angeführt, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (f) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt werden, für das eines der Nukleinsäuremoleküle (a) bis (e) kodiert, und mit der Aktivität, die durch das Nukleinsäuremolekül dargestellt wird, das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle I angeführt umfasst; (h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder eines oder mehrere Polypeptidmotive umfasst, wie in Spalte 7 von Tabelle IV dargestellt, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV angeführt umfasst; (i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit der Aktivität kodiert, die durch ein Protein dargestellt ist, wie in Spalte 5 von Tabelle II angeführt, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht; (j) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III erzeugt wird und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül dargestellt ist, das ein Polynukleotid wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV angeführt umfasst; und (k) einem Nukleinsäuremolekül, das durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde erhältlich ist, umfassend eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) oder mit einem Fragment davon mit mindestens etwa 400 nt eines Nukleinsäuremoleküls komplementär zu einer Nukleinsäuremolekülsequenz, die in (a) bis (e) charakterisiert ist und für ein Polypeptid mit der Aktivität kodiert, die durch ein Protein dargestellt ist, das ein Polypeptid wie in Spalte 5 von Tabelle II angeführt umfasst.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7, wobei das Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (k) in mindestens einem oder mehreren Nukleotiden anders ist als die Sequenz, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I A dargestellt ist, und vorzugsweise für ein Protein kodiert, das sich mindestens in einer oder mehreren Aminosäuren von den Proteinsequenzen unterscheidet, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II A dargestellt sind.
Nukleinsäurekonstrukt, das die Expression des Nukleinsäuremoleküls von Anspruch 7 oder 8 verleiht, umfassend ein oder mehrere regulatorische Elemente.
Vektor, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7 oder 8 oder das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei das Polypeptid in dem Wirtskern oder in der Wirtszelle nach Anspruch 11 exprimiert wird.
Polypeptid, erzeugt durch das Verfahren nach Anspruch 12 oder kodiert durch das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7 oder 8 oder wie in Tabelle II B dargestellt, wobei sich das Polypeptid über die Sequenz, wie in Tabelle II A dargestellt, um eine oder mehrere Aminosäuren unterscheidet.
Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 13 bindet.
Pflanzenzellkern, Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzenvermehrungsmaterial, Pollen, Nachkommen, geerntetes Material oder eine Pflanze, der/die/das das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7 oder 8 oder den Wirtskern oder die Wirtszelle nach Anspruch 11 umfasst.
Pflanzenzellkern, Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzenvermehrungsmaterial, Samen, Pollen, Nachkommen oder ein Pflanzenteil, der/die/das zu einer Pflanze mit einer Ertragserhöhung nach einer Regeneration führt; einer Pflanze mit einer Ertragserhöhung; oder einem Teil davon; wobei der Ertrag im Vergleich zu einem entsprechenden Wildtyp erhöht ist, der durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erzeugt wird oder mit dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7 oder 8 oder dem Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9 transformiert ist.
Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 15, abgeleitet von einer monokotyledonen Pflanze.
Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 15, abgeleitet von einer dikotyledonen Pflanze.
Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 15, wobei die entsprechende Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Ölraps, einschließlich Canola und Winterölraps, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Flachs, Borretsch, Saflor, Leinsamen, Primel, Ölraps, Rübsamen, Tagetes, Solanaceenpflanzen, umfassend Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate; Vicia-Spezies, Erbse, Luzerne, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Spezies, Ölpalme, Kokosnuss, ganzjährige Gräser, Futterpflanzen und Arabidopsis thaliana.
Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 15, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mais, Soja, Ölraps (einschließlich Canola und Winterölraps), Baumwolle, Weizen und Reis.
Transgene Pflanze, umfassend eines oder mehrere von Pflanzenzellkernen oder Pflanzenzellen, Nachkommen, Samen oder Pollen oder erzeugt durch eine transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 14 bis 19.
Transgene Pflanze, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze, umfassend einen oder mehrere solcher transgener Pflanzenzellkerne oder Pflanzenzellen, Nachkommen, Samen oder Pollen, die von einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 6 bis 9, abgeleitet oder durch diese erzeugt sind, wobei die transgene Pflanze, der transgene Pflanzenzellkern, die transgene Pflanzenzelle, die Pflanze, umfassend einen oder mehrere solcher transgener Pflanzenzellkerne oder Pflanzenzellen, Nachkommen, Samen oder Pollen für ein Transgen genetisch homozygot ist, das einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon verleiht.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, verleihend einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon, in einer Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon, umfassend die Schritte: (a) Kultivieren einer Pflanzenzelle; einer transgenen Pflanze oder eines Teils davon, exprimierend das Polypeptid nach Anspruch 12, und eines Lesesystems, das im stande ist, unter geeigneten Bedingungen mit dem Polypeptid zu interagieren, die die Interaktion des Polypeptids mit dem Lesesystem ermöglichen, in Gegenwart einer Verbindung oder einer Probe, die mehrere Verbindungen umfasst und imstande ist, ein nachweisbares Signal als Reaktion auf die Bindung einer Verbindung an das Polypeptid unter Bedingungen zu liefern, die die Expression des Lesesystems und des Polypeptids ermöglichen, das durch das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12 kodiert wird; (b) Identifizieren, ob die Verbindung ein wirksamer Agonist ist, durch Nachweisen des Vorhandenseins oder Fehlens oder Erhöhen eines Signals, das von dem Lesesystem erzeugt wird.
Verfahren zur Herstellung einer landwirtschaftlichen Zusammensetzung, umfassend die Schritte des Verfahrens nach Anspruch 22 und das Formulieren der in Anspruch 22 identifizierten Verbindung in einer Form, die für eine Anwendung in der Landwirtschaft annehmbar ist.
Zusammensetzung, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7 oder 8, das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, den Vektor nach Anspruch 10, das Polypeptid nach Anspruch 12, die Verbindung nach Anspruch 22; und/oder den Antikörper nach Anspruch 13; and wahlweise einen landwirtschaftlich annehmbaren Träger.
Polypeptid nach Anspruch 12 oder das Nukleinsäuremolekül, das ausgewählt ist aus Hefe oder E. coli.
Verwendung der Nukleinsäuren nach Anspruch 7 oder 8 zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanze.
Verwendung der Nukleinsäuren nach Anspruch 7 oder 8 als Marker zur Identifizierung oder Selektion einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanze.
Verwendung der Nukleinsäuren nach Anspruch 17 oder Teilen davon als Marker für den Nachweis einer Ertragserhöhung in Pflanzen oder Pflanzenzellen.
Verfahren zum Identifizieren einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, umfassend das Screenen einer Population aus einer/einem oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon auf eine Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthese, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myo-inositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein-Aktivität, Vergleichen der Höhe der Aktivität mit der Aktivitätshöhe in einer Referenz; Identifizieren einer/eines oder mehrerer Pflanzenzellkerne, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teile davon mit der erhöhten Aktivität im Vergleich zu der Referenz, wahlweise Erzeugen einer Pflanze aus den identifizierten Pflanzenzellkernen, der -zelle oder dem -gewebe.
Verfahren zum Identifizieren einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, umfassend das Screenen einer Population aus einer/einem oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon auf den Expressionswert einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Aktivität verleiht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, B2758-Protein, Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Cystein-Synthese, Exopolyphosphatase, Geranylgeranyl-Reductase, Mating Hormone A-Faktor-Vorläufer, Mitochondrialer Succinat-Fumarat Transporter, Protein der Modification Methylase HemK Familie, Myoinositol Transporter, Oxidoreductase Subeinheit, Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Proteinkinase, Ribose-5-phosphat-Isomerase, slr1293-Protein, YDR049W-Protein, YJL181W-Protein und YPL109C-Protein-Aktivität, Vergleichen des Expressionswertes mit einer Referenz, Identifizieren einer/eines oder mehrerer Pflanzenzellkerne, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teile davon mit dem erhöhten Expressionswert im Vergleich zu der Referenz, wahlweise Erzeugen einer Pflanze aus den identifizierten Pflanzenzellkernen, der -zelle oder dem -gewebe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder die Pflanze nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei die Pflanze ein verbessertes ertragsbezogenes Merkmal aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder die Pflanze nach einem der Ansprüche 14 oder 15, wobei die Pflanze eine verbesserte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder abiotische Stresstoleranz aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder die Pflanze nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei die Pflanze eine verbesserte erhöhte Niedertemperaturtoleranz aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder die Pflanze nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei die Pflanze eine Erhöhung des erntbaren Ertrags aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder die Pflanze nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei die Pflanze einen verbesserten Ertrag zeigt, wobei der erhöhte Ertrag auf einer Basis pro Pflanze oder in einem Verhältnis zu einer spezifischen Ackerfläche berechnet wird.
Verfahren zum Erhöhen des Ertrags einer Population von Pflanzen, umfassend das Prüfen der Wachstumstemperatur(en) in der Anpflanzungsfläche, Vergleichen der Temperaturen mit der optimalen Wachstumstemperatur einer Pflanzenspezies oder einer Varietät, die zum Anpflanzen in Betracht gezogen wird, Anpflanzen und Züchten der Pflanze nach einem der Ansprüche 14 bis 20 oder 31 bis 35, wenn die Wachstumstemperatur für das Pflanzen und Zuchten der Pflanzenspezies oder der Varietät, die zum Anpflanzen in Betracht gezogen wird, nicht optimal ist.
Verfahren nach den vorangehenden Ansprüchen, umfassend das Ernten der Pflanze oder eines Teils der Pflanze, die erzeugt oder angepflanzt wurde, und Erzeugen eines Brennstoffs mit oder aus der geernteten Pflanze oder einem Teil davon.
Verfahren nach den vorangehenden Ansprüchen, wobei die Pflanze für die Stärkeproduktion nützlich ist, umfassend das Ernten des Pflanzenteils, der für eine Stärkeisolierung nützlich ist, und Isolieren der Stärke aus diesem Pflanzenteil.