CN102224246A - 产量增加的植物(lt) - Google Patents

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Abstract

产生与相应的野生型植物相比产量增加的植物的方法，所述方法包括至少如下步骤：在植物或其部分中增加或生成选自以下的一种或多种活性：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白活性。

Description

产量增加的植物(LT)
发明领域
本文公开的本发明提供了产生与相应的野生型植物相比产量增加的植物的方法，所述方法包括在植物或其部分中增加或生成一种或多种活性。本发明还涉及增强或改善转基因植物以及源自此类植物或部分的细胞、子代、种子和花粉的一种或多种性状的核酸，以及制备此类植物细胞或植物、子代、种子或花粉的方法，和利用此类植物细胞或植物、子代、种子或花粉的方法。特别是，所述改善的性状表现为增加的产量，优选通过改善一种或多种产量相关性状实现。
发明背景
在田间条件下，植物表现，例如就生长、发育、生物质累积和种子生成而言，取决于植物对众多环境条件、变化和胁迫的耐受性和适应能力。  自农业和园艺开始以来就存在提高作物栽培方面的植物性状的需求。育种策略培育作物性能，以抵抗生物和非生物胁迫、提高养分利用效率以及改变其他固有的作物特定产量参数，即，通过应用技术进步来增加产量。植物为固着生物，因此需要对付多种环境胁迫。一方面生物胁迫例如植物害虫和病原体，另一方面非生物环境胁迫，是植物生长和生产力的主要限速因子(Boyer，Plant Productivity and Environment，Science 218，443-448(1982)；Bohnert等，Adaptations to EnvironmentalStresses，Plant Cell7(7)，1099-1111(1995))，从而限制了植物的栽培和地理分布。接触不同胁迫的植物一般具有低产量的植物材料，像种子、果实或其他产出。因非生物和生物胁迫造成的作物损失和作物产量损失构成重要的经济和政治因素，并造成粮食短缺，在许多不发达国家尤为如此。
现今作物和园艺改善的常规方法是利用选育技术来鉴定具有期望特征的植物。分子生物学进展已经允许以特定的方式修饰植物的种质。例如，修饰单个基因在多种情况下导致例如胁迫耐受性(Wang等，2003)以及其他产量相关性状的显著增加。需要鉴定可以赋予对多种胁迫组合的抗性或在次生长条件下赋予提高的产量的基因。还需要鉴定赋予提高植物产量的整体能力的基因。
此外，人口增加和环境变化已经使全球粮食、饲料和燃料短缺的可能性成为近年来的尖锐焦点。在世界上许多地区的降雨在不断下降的同时，农业消耗了70％的人类用水。另外，随着土地使用从农场转变为城市和郊区，可用来生长农业作物的耕地面积越来越少。农业生物技术已经尝试通过能够增加作物产量的植物遗传修饰，例如通过对非生物胁迫反应赋予更佳的耐受性，或通过增加生物量，来满足人类不断增长的需求。
农业生物技术学家已经应用模式植物系统的测定、作物植物的温室研究以及田间试验来努力开发因非生物胁迫耐受性增加或因生物量增加而呈现出产量增加的转基因植物，
农业生物技术学家还应用指示转基因对作物产量的潜在影响的其他参数来量度。对于饲料作物像苜蓿、青贮谷物和干草，植物生物量与总产量相关。然而，对于籽粒作物，已经应用其他参数来估计产量，例如植物大小，测量为植物总干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座(rosette)直径、叶长、根长、根质量、分蘖数和叶数。早期发育阶段的植物大小通常与发育后期的植物大小相关。具有更大叶面积的较大植物通常能够比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多。植物大小和生长速率存在着强遗传因素，因此对于一系列各种各样的基因型而言，植物在一种环境条件下的大小很可能与另一种环境条件下的大小相关。这样，可以使用标准环境来模拟田间作物在不同地点和时间所遭遇到的多样化动态环境。
已经表征了植物中一些参与胁迫反应、水利用和/或生物量的基因，但是迄今在开发产量提高的转基因作物植物方面取得的成功有限，且尚未有这样的植物被商业化。因此仍需要鉴定有能力增加作物植物产量的其他基因。
因此，在第一个实施方案中，本发明提供了产生与相应的野生型植物相比产量增加的植物的方法，所述方法包括至少如下步骤：在植物中于本文所述的亚细胞区室和组织中增加或生成选自下组的一种或多种活性(在下文称为一种或多种“活性”、或一种或多种所述活性、或对于一种选择的活性，称为“所述活性”)：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白活性。
从而在另一实施方案中，本发明提供了在本文所示的亚细胞区室和组织中过表达表I所示分离的多核苷酸的转基因植物。本发明的转基因植物与该植物的野生型品种相比表现出提高的产量或增加的产量。术语“提高的产量”或“增加的产量”可互换使用。
如本文所用的术语“产量”通常定义为植物、尤其是作物可测量的产出。产量和产量增加(与未转化的起始或野生型植物相比)可通过多种方法量度，且可以理解本领域技术人员能够根据具体的实施方案、涉及的具体作物以及涉及的具体目的或用途来应用正确的含义。
如本文所用，术语“提高的产量”或术语“增加的产量”表示任何所测量的植物产物例如粮谷、水果或纤维产量上的提高。根据本发明，不同表型性状的变化可以提高产量。例如，但非限制性地，诸如花器官发育、根发生、根生物量、种子数、种子重量、收获指数、对非生物环境胁迫的耐受性、叶形成、趋光性、顶端优势和果实发育等参数为产量提高的适宜量度。产量上的任何增加都是根据本发明的提高的产量。例如，产量上的提高可以包括任何测量参数的0.1％、0.5％、1％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的增加。例如，与相同条件下栽培的未处理大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量相比，源自表I核苷酸和多肽的转基因植物作物的大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量的增加，是根据本发明的提高的产量。增加或提高的产量可在不存在或存在胁迫条件下实现。
出于说明本发明的目的，增强的或增加的“产量”是指选自下组的一个或多个产量参数：生物量产量、干生物量产量、地上干生物量产量、地下干生物量产量、鲜重生物量产量、地上鲜重生物量产量、地下鲜重生物量产量；增强的可收获部分产量，干重或鲜重或两者，地上或地下或两者；增强的作物果实产量，干重或鲜重或两者，地上或地下或两者；和优选地增强的种子产量，干重或鲜重或两者，地上或地下或两者。如本文所用的术语“产量”一般指可测量的植物，优选作物的产物。例如，本发明提供了通过增加或生成上文所述的一种或多种所述活性而产生转基因植物细胞或植物的方法，与相应(例如未转化)的野生型或起始植物相比，所述转基因植物细胞或植物能够表现出增加的产量相关性状，例如增加的环境胁迫耐受性和/或增加的固有产量和/或生物量产量。
在一个实施方案中，产量增加是指增加或提高的作物产量或可收获产量、生物质产量和/或增加的种子产量。
作物产量在本文定义为每英亩收获的相应农产品(如粮谷(grains)、饲料或种子)的蒲式耳数。作物产量受非生物胁迫例如干旱、热、盐度和寒冷胁迫的影响，并受植物大小(生物量)的影响。传统植物育种策略相对缓慢，且在赋予增加的非生物胁迫耐受性方面一般是不成功的。对于玉蜀黍，通过常规育种实现的粮谷产量提高几乎已经达到了一个平台。
因此，在一个实施方案中，如本文描述的“产量”指植物的可收获产量。植物的产量可取决于在每种具体情况下具体的目的植物/作物以及感兴趣的目的应用(例如粮食生产、饲料生产、加工的粮食产品、生物燃料、生物气体或酒精生产等等)。因而，在一个实施方案中，产量计算为收获指数(表达为相应可收获部分的重量除以总生物量的比值)、单位面积(英亩、平方米等)的可收获部分重量等等。玉蜀黍的收获指数，即收获时的产量生物量与总累积生物量的比值，在过去百年中在粮谷产量的选育过程中已经基本上保持不变。因此，近年来所出现的玉蜀黍产量提高是每单位土地面积上总生物量产量增加的结果。这种总生物量的增加通过增加植物种植密度实现，这已经引起适应性表型的改变，例如叶角度的减小(这可以减小对下方叶子的遮光)和穗大小的减小(这可以增加收获指数)。收获指数在许多环境条件下相对稳定，故而植物大小和粮谷产量之间可以是强相关的。植物大小和粮谷产量固有地联系，因为大多数粮谷生物量取决于植物叶和茎当前或贮存的光合生产力。如同非生物胁迫耐受性一样，在生长箱或温室标准条件下测量早期发育阶段的植物大小，是测量转基因存在所赋予的潜在产量优势的标准实践。
在一个实施方案中，“产量”是指生物量产量，例如干重生物量产量和/或鲜重生物量产量。生物量产量是指植物的地上或地下部分，这取决于具体的情况(测试条件、具体的目的作物、目的应用等等)。在一个实施方案中，生物量产量是指地上和地下部分。生物量产量可以计算为鲜重、干重或基于水分调整来计算。生物量产量可以基于每株植物或相对于具体的面积(例如，每英亩/平方米等的生物量产量)来计算。
在其他实施方案中，“产量”是指可通过一个或多个如下参数衡量的种子产量：种子数量或饱满种子数量(每株植物或单位面积(英亩/平方米等))；种子充实率(饱满种子数量和种子总数量之间的比值)；每株植物的花朵数量；种子生物量或种子总重量(每株植物或单位面积(英亩/平方米等))；千粒重(TKW；通过计数的饱满种子数量及其总重量外推得到；TKW的增加可以因种子大小增加、种子重量增加、胚大小增加和/或胚乳增加所致)。允许衡量种子产量的其他参数在本领域也已知。种子产量可以基于干重或鲜重、或者一般地基于水分调整，例如在15.5％水分，确定。
在一个实施方案中中，术语“增加的产量”表示光合作用生物尤其是植物与相应的野生型光合作用生物相比，在非生物环境胁迫条件下呈现出增加的生长速率。
增加的生长速率可以例如反映为或者赋予整株植物增加的生物量产量，或植物地上部分增加的生物量产量，或植物地下部分增加的生物量产量，或植物部分像茎、叶、花、果实、和/或种子增加的生物量产量。
在其一个实施方案中，增加的产量包括更高的果实产量、更高的种子产量、更高的鲜物质产量、和/或更高的干物质产量。
在其另一实施方案中，术语“增加的产量”表示光合作用生物，优选植物，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比，在非生物环境胁迫条件下呈现出延长的生长。延长的生长包括光合作用生物优选植物在未转化野生型光合作用生物显示出缺陷和/或死亡的可视症状的时候仍存活和/或持续生长。
例如，在一个实施方案中，本发明方法中使用的植物是谷物植物。谷物植物增加的产量在一个实施方案中是指增加的种子产量，特别是用作饲料或粮食的谷物品种。谷物增加的种子产量在一个实施方案中是指增加的籽粒大小或重量、增加的每角粒数、或增加的单株角果(pod)数。此外，在一个实施方案中，穗轴产量增加，这对于饲料用谷物植物品种尤其有用。此外，例如，穗轴的长度或大小增加。在一个实施方案中，谷物植物增加的产量涉及提高的穗轴与籽粒比。
例如，在一个实施方案中，本发明方法中使用的植物是大豆植物。大豆植物增加的产量在一个实施方案中是指增加的种子产量，特别是用作饲料或粮食的大豆品种。大豆增加的种子产量在一个实施方案中是指增加的籽粒大小和重量、增加的每角粒数、或增加的单株角果数。
例如，在一个实施方案中，本发明方法中使用的植物是油菜籽油菜(OSR)植物。OSR植物增加的产量在一个实施方案中是指增加的种子产量，特别是用作饲料或粮食的OSR品种。OSR增加的种子产量在一个实施方案中是指增加的籽粒大小和重量、增加的每角粒数、或增加的单株角果数。
例如，在一个实施方案中，本发明方法中使用的植物是棉花植物。棉花植物增加的产量在一个实施方案中是指增加的棉绒(lint)产量。棉花增加的棉产量在一个实施方案中是指增加的棉绒长度。
谷物增加的种子产量在一个实施方案中是指增加的籽粒大小和重量、增加的每角粒数、或增加的单株角果数。
根据本发明所述的增加的产量一般可通过与起源或野生型植物相比增强或提高植物的一种或多种产量相关性状而实现。其提高可以导致增加的产量的此类植物产量相关性状包括，但不限于：增加的植物固有生产力，提高的养分利用效率，和/或增加的胁迫耐受性，尤其是增加的非生物胁迫耐受性。
根据本发明，通过提高如本文所定义的一种或多种产量相关性状来增加产量。
因此，在一个实施方案中，产量相关性状赋予的植物产量增加为植物固有生产力的增加，例如可以通过提高特定(固有)种子产量(例如，就增加的种子大小/籽粒大小、增加的穗数量、增加的每穗种子数量、种子充实改善、种子组成改善、胚和/或胚乳改善等等而言)；调节和改善植物固有的生长和发育机制(例如植物高度、植物生长速率、角果数量、植物的角果位置、节间数量、角果脱落的发生、结瘤和固氮效率、碳同化效率、幼苗活力/早期活力改善、萌发效率的增强(在胁迫或非胁迫条件下)、植物构造改善、细胞周期调节、光合作用调节、多种信号传递通路调节、转录调控调节、翻译调控调节、酶活调节等等)；和/或类似方面而显现。
因此，在一个实施方案中，赋予植物产量增加的产量相关性状为植物胁迫耐受性的提高或增加，可以例如通过提高或增加植物对胁迫、尤其是非生物胁迫的耐受性而显现。在本发明中，非生物胁迫一般是指植物通常会面对的非生物环境条件，包括一般称为“非生物胁迫”条件的条件，包括但不限于：干旱(干旱耐受性可以因为水利用效率提高而实现)、热、低温和冷条件(例如冰冻和寒冷条件)、盐度、渗透胁迫、遮光、高植物密度、机械胁迫、氧化胁迫等等。
因此，在本发明的一个实施方案中，通过增加“植物的养分利用效率”介导增加的植物产量，例如提高对养分，包括但不限于钾、磷和氮，的利用效率。例如，需要能够更有效地利用氮从而生长需要更少氮并由此导致在氮缺乏条件下提高的产量水平的植物。此外，可以使用当前或标准的氮利用水平来获得更高的产量。因此，在本发明的一个实施方案中，通过增加植物或其部分的氮利用效率增加植物产量。由于相对于农业产品收入而言氮肥成本高昂，另外还由于其对环境的有害影响，期望开发策略以减小氮投入，和/或优化给定氮供应下的氮吸收和/或利用而同时维持植物、优选栽培植物例如作物的最佳产量、生产力和品质。还期望以更低的化肥投入来维持作物产量和/或在相似或甚至更差品质的土壤上维持更高产量。
植物增强的NUE可根据如下方法来确定和定量：转化的植物在生长室的花盆中生长(
Figure BDA0000062525460000081
Weibull，
Figure BDA0000062525460000082
瑞典)。在植物为拟南芥(Arabidopsis thaliana)的情况下，其种子播种在含1∶1(v∶v)养分耗竭土壤(“Einheitserde Typ 0”，30％粘土，Tantau，Wansdorf德国)和沙子混合物的花盆中。通过在4℃暗中为期4天诱导萌发。随后植物在标准生长条件下生长。在植物为拟南芥的情况下，标准生长条件是：光周期为16h光照和8h黑暗，20℃，60％相对湿度，光子通量密度200μE。在植物为拟南芥的情况下，每隔一天用N耗竭的营养液浇水。9-10天后，植物被个体化。总计29-31天后，收获植物，并通过植物地上部分、优选莲座的鲜重来定级。
在另一个实施方案中，根据实施例中描述的方法确定增加的产量。因此，在一个实施方案中，本发明涉及增加产量的方法，其包含以下步骤：(a)测量土壤中的氮含量，和(b)确定土壤中的氮含量对原始或野生型植物例如作物的生长是最佳的还是次佳的，和(c1)如果氮含量对原始或野生型植物的生长是次佳的，则在所述土壤中培养本发明的植物，或(c2)如果氮含量对原始或野生型植物的生长是最佳的，则在土壤中培养本发明的植物并将产量与标准、原始或野生型植物的产量比较，选择和培养显示最高产量的植物。
在本发明的另一实施方案中，植物产量通过增加植物的胁迫耐受性而增加。一般而言，术语“增加的胁迫耐受性”可定义为与未转化的野生型或起始植物相比，在胁迫条件下植物存活和/或产量更高。例如，本发明的植物或根据本发明方法产生的植物更好地适应于胁迫条件。对环境胁迫例如像干旱、热、养分耗竭、冰冻和/或寒冷温度的“适应性提高”在本文是指植物性能提高，导致产量增加，尤其是就上文更详细定义的一种或多种产量相关性状而言。
在其生命周期中，植物一般要面对多种环境条件。可以在某些情况下影响植物产量的任何此类条件在本文均称为“胁迫”条件。一般，环境胁迫可以分为生物和非生物(环境)胁迫。不利的营养条件有时也称为“环境胁迫”。本发明确实也考虑用于这类环境胁迫的技术方案，例如，涉及增加养分利用效率。
在本发明的另一个实施方案中，植物产量通过增加植物或其部分的非生物胁迫耐受性而增加。
出于说明本发明的目的，术语“增强的非生物胁迫耐受性”、“增强的非生物环境胁迫抗性”、“增强的环境胁迫耐受性”、“提高的环境胁迫适应性”及意义上相似的其他变化形式和表达方式可互换使用，是指但不限于与相应的原始或野生型植物或其部分相比，对本文所述的一种或多种非生物环境胁迫的耐受性提高。
术语非生物胁迫耐受性是指例如低温耐受性、干旱耐受性或提高的水利用效率(WUE)、热耐受性、盐胁迫耐受性等。也可以通过研究植物对干燥、渗压休克和极端温度的应答，确定植物对非生物胁迫的耐受性或抗性。
植物的胁迫耐受性像低温、干旱、热和盐胁迫耐受性可具有对植物生长重要的共同主题，即水利用度。植物在其生命周期中一般会接触环境水分减小的条件。该保护策略类似于寒冷耐受性的保护策略。低水利用度时生物量的增加可以由生长效率相对提高或水耗减小而引起。在选择性状用于改良作物时，水利用降低而生长不变，在水投入成本高的灌溉农业系统中将会具有特别的价值。生长增加而没有相应的水利用暴涨将会在所有农业系统中具有实用性。在许多水供应不受限的农业系统中，生长增加，即便是以水利用增加为代价，也会增加产量。
当土壤水耗竭时或者在干旱期无水可用时，作物产量会受限。如果自叶的蒸腾超过自根的水供应，则出现植物缺水。可用的水供应量与土壤持水量和植物通过其根系获取该水的能力相关。叶子的水蒸腾与通过气孔进行的二氧化碳光合作用固定相关。这两个过程正相关，因而通过光合作用的高二氧化碳流入与通过蒸腾的水丧失密切相关。当水从叶子蒸发时，叶子的水势减小，气孔在水压过程中倾向于闭合，限制光合作用量。由于作物产量取决于光合作用中的二氧化碳固定，水吸收和蒸腾是对作物产量起作用的因素。能够利用更少的水固定相同量的二氧化碳、或能够在较低的水势下正常行使功能的植物有潜力进行更多的光合作用，由此在许多农业系统中产生更多的生物量和经济产量。
在本发明的一个实施方案中干旱胁迫是指导致植物缺水或向植物的水供应减小的任何环境胁迫，包括因低温和/或盐引起的次级胁迫，和/或干旱或热期间的初级胁迫，例如脱水等。
增加的干旱条件耐受性可例如，根据如下方法确定和定量：例如，转化的植物按个体在生长室的花盆中生长(York
Figure BDA0000062525460000101
GmbH，Mannheim，德国)。诱导萌发。在植物为拟南芥的情况下，播种的种子在4℃黑暗中保持3天以诱导萌发。随后3天条件改成20℃/6℃的日间/夜间温度，16/8h日夜周期，150μE/m2s。随后植物在标准生长条件下生长。在植物为拟南芥的情况下，标准生长条件是：光周期为16h白昼和8h黑夜，20℃，60％相对湿度，光子通量密度200μE。植物生长并培养直至长出叶子。在植物为拟南芥的情况下，每天浇水直至约3周龄。
自那时起，通过限水来造成干旱。在未转化的野生型植物显示出可视的损伤症状后，开始评价，连续5-6天与野生型邻近植物相比，对植物的干旱症状和生物量产量进行计分。在另一个实施方案中，干旱耐受性例如周期性干旱耐受性根据实施例中所述的方法来确定。
在一个优选的实施方案中，干旱耐受性是周期性干旱耐受性。
从而，在一个实施方案中，本发明涉及增加产量的方法，包括如下步骤：
(a)确定种植地区的水供应对于原始或野生型植物例如作物的生长是最佳还是次佳的，和/或确定种植地区生长的植物的可视损伤症状；和
(b1)如果水供应对于原始或野生型植物生长是次佳的，或者干旱的可视症状可见于该地区生长的标准、原始或野生型植物，则在所述土壤中培养本发明的植物，或
(b2)如果水供应对于原始或野生型植物是最佳的，则在所述土壤中培养本发明的植物，就其产量与标准、原始或野生型植物的产量进行比较，选择和培养显示出最高产量的植物。
损伤的可视症状是指如下特征之一或其两个、三个或更多个的任何组合：(a)枯萎；(b)叶子褐化；(c)膨胀丧失，这引起叶子或针叶、茎以及花低垂；(d)叶子或针叶低垂和/或脱落；(e)叶子绿色但是与对照相比叶子角度稍稍偏向地面；(f)叶片已经开始朝里翻卷(卷曲)；(g)叶子或针叶早熟性衰老；(h)叶子或针叶丧失叶绿素和/或黄化。
在本发明的另一实施方案中，本发明植物的所述产量相关性状是所述植物增加的对热条件的耐受性。
在本发明的另一实施方案中，本发明植物的所述产量相关性状是所述植物增加的低温耐受性，例如包括冰冻耐受性和/或寒冷耐受性。低温影响很多生物学过程。其阻碍或抑制几乎所有的代谢和细胞过程。植物对低温的反应是其生态范围的重要决定因素。对付低温的问题由于需要延长生长季超越高纬度或海拔所见的短夏季而加剧。大多数植物已经进化出适应策略以保护自身抗低温。一般而言，低温适应性可以划分为寒冷耐受性和冰冻耐受性。
寒冷耐受性天然见于温带或北温带的物种，允许在低温但非冰冻温度时的存活和增强的生长。热带或亚热带的物种是寒冷敏感型的，并且在一个或多个发育阶段中在10℃左右的温度时，往往表现出枯萎、褪绿或坏死、生长减慢甚至是死亡。从而，提高或增强的“寒冷耐受性”或其变化形式在本文是指对10℃左右的低温但非冰冻温度的适应性提高，优选1-18℃的温度，更优选4-14℃，最优选8-12℃；下文称作“寒冷温度”。
冰冻耐受性允许在接近零度至特别是零度以下的温度存活。据信其由称为冷适应的过程促成，该过程在低温但非冰冻温度时发生，并提供在零度以下的温度时增加的冰冻耐受性。另外，温带地区的大多数物种都具有适应温度季节性变化的生命周期。对于那些植物，低温还可以通过成层和春化过程在植物发育方面起重要作用。显而易见的是难以对寒冷耐受性和冰冻耐受性进行截然的区分和定义，所述过程可以是重叠的或相互关联的。
提高或增强的“冰冻耐受性”或其变化形式在本文是指对接近零度或低于零度的温度的适应性提高，即优选低于4℃的温度，更优选低于3或2℃，尤其优选0℃(零度)或低于0℃，或低于-4℃，或者甚至下至-10℃或更低的极端低温；下文称作“冰冻温度”。
从而，本发明的植物在一个实施方案中与寒冷敏感型野生型或原始植物相比在接触低温后可以表现出早期幼苗生长，在另一实施方案中提高种子发芽率。种子萌发过程强烈取决于环境温度，种子的性质在萌发和幼苗出土期间接触低温时决定活性和性能的水平。本发明的方法在一个实施方案中还提供了在寒冷条件下表现出叶子发育延迟减少的植物。在一个实施方案中本发明的方法涉及耐受性的主要作物例如玉米、豆、稻、大豆、棉花、番茄、香蕉、黄瓜或马铃薯的生产，因为大多数主要作物是寒冷敏感型的。
增强的低温耐受性可以例如根据如下方法来确定：转化的植物在生长室的花盆中生长(例如，York，Mannheim，德国)。在植物为拟南芥的情况下，将其种子播种在含3.5∶1(v∶v)养分富集土壤(GS90，Tantau，Wansdorf，德国)和沙子混合物的花盆中。植物在标准生长条件下生长。在植物为拟南芥的情况下，标准生长条件是：光周期为16h白昼和8h黑夜，20℃，60％相对湿度，光子通量密度200μmol/m2s。长出并培养植物。在植物为拟南芥的情况下，每隔一天浇水。9-10天后，植物个体化。播种14天后施加冷处理(例如11-12℃的寒冷)，直至试验结束。在总计29-31天的生长周期后，收获植物，并通过植物地上部分，在拟南芥的情况下优选莲座，的鲜重来定级。
从而，在一个实施方案中，本发明涉及增加产量的方法，包括如下步骤：
(a)确定种植地区的温度对于原始或野生型植物例如作物的生长是最佳还是次佳的；和
(b1)如果温度对于原始或野生型植物生长是次佳的，则在所述土壤中培养本发明的植物；或
(b2)如果温度对于原始或野生型植物是最佳的，则在所述土壤中培养本发明的植物，就其产量与标准、原始或野生型植物的产量进行比较，选择和培养显示出最高产量的植物。
在本发明的另一实施方案中，产量相关性状还可以是增加的盐度耐受性(盐耐受性)、渗透胁迫耐受性、增加的遮光耐受性、增加的高植物密度耐受性、增加的机械胁迫耐受性、和/或增加的氧化胁迫耐受性。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物如植物相比，呈现出增强的干生物量产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的地上干生物量产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的地下干生物量产量。
在其另一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的鲜重生物量产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的地上鲜重生物量产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的地下鲜重生物量产量。
在其另一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的植物可收获部分的产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的干植物可收获部分的产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的干植物地上可收获部分的产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的干植物地下可收获部分的产量。
在其另一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的植物鲜重可收获部分的产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的植物地上鲜重可收获部分的产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性”表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的植物地下鲜重可收获部分的产量。
在另一实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的作物果实产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的鲜作物果实产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性”表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的干作物果实产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的粮谷干重。
在另一实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的种子产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的鲜重种子产量。
在其一个实施方案中，术语光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性””表示所述光合作用生物优选植物在遭遇非生物环境胁迫条件时，与相应例如未转化的野生型光合作用生物相比呈现出增强的干种子产量。不过，例如，生物遭遇的非生物环境胁迫条件可以是本文提及的任何非生物环境胁迫。
所产生的谷物的增加氮利用效率在一个实施方案中是指谷物种子尤其是用作为饲料的谷物种子提高的蛋白质含量。增加的氮利用效率在另一实施方案中是指增加的籽粒大小或粒数。所产生的谷物的增加水利用效率在一个实施方案中是指增加的籽粒大小或粒数。此外，增加的低温耐受性在一个实施方案中是指早期活力，并允许早期种植和播种根据本发明方法产生的谷物植物。
所产生的大豆植物的增加氮利用效率在一个实施方案中是指大豆种子尤其是用作为饲料的大豆种子提高的蛋白质含量。增加的氮利用效率在另一实施方案中是指增加的籽粒大小或粒数。所产生的大豆植物的增加水利用效率在一个实施方案中是指增加的籽粒大小或粒数。此外，增加的低温耐受性在一个实施方案中是指早期活力，并允许早期种植和播种根据本发明方法产生的大豆植物。
所产生的OSR植物的增加氮利用效率在一个实施方案中是指OSR种子尤其是用作为饲料的OSR种子提高的蛋白质含量。增加的氮利用效率在另一实施方案中是指增加的籽粒大小或粒数。所产生的OSR植物的增加水利用效率在一个实施方案中是指增加的籽粒大小或粒数。此外，增加的低温耐受性在一个实施方案中是指早期活力，并允许早期种植和播种根据本发明方法产生的大豆植物。在一个实施方案中，本发明涉及产生耐寒油菜籽油菜(具有耐冬性的OSR)的方法，包括在上述本发明的方法中应用耐寒油菜籽油菜植物。
所产生的棉花植物的增加氮利用效率在一个实施方案中是指棉花种子尤其是用作为饲料的棉花种子提高或增加的蛋白质含量。增加的氮利用效率在另一实施方案中是指增加的籽粒大小或粒数。所产生的棉花植物的增加水利用效率在一个实施方案中是指增加的籽粒大小或粒数。此外，增加的低温耐受性在一个实施方案中是指早期活力，并允许早期种植和播种根据本发明方法产生的棉花植物。
从而，在本发明的一个实施方案中，通过提高一种或多种如本文定义的产量相关性状增加了产量。因此，本发明提供了产生转基因植物的方法，所述转基因植物与相应的原始或野生型植物相比表现出增加的产量相关性状，通过增加或生成选自下组的一种或多种活性实现：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白。
因而，在一个实施方案中，本发明提供了产生植物的方法，所述植物与相应的原始或野生型植物相比表现出增加的产量，例如胁迫抗性，特别是非生物胁迫抗性，所述方法通过增加或生成一种或多种所述“活性”实现。在另一实施方案中，根据本发明方法实现的、本发明转基因植物所表现出的非生物胁迫抗性是增加的低温耐受性，尤其是增加的寒冷耐受性。
在另一实施方案中，根据本发明方法实现的、本发明转基因植物所表现出的非生物胁迫抗性是增加的干旱耐受性，尤其是增加的周期性干旱耐受性。
因而，在本发明的另一实施方案中，提供了产生转基因植物、来自此植物或用于产生此类植物的子代、种子和/或花粉的方法；每个植物与相应例如未转化的野生型植物细胞或植物相比还可表现出增加的低温耐受性、尤其是增加的寒冷耐受性，所述方法通过在所述植物的本文所述亚细胞区室和组织中增加或生成一种或多种所述“活性”来实现。
因而，在本发明的另一实施方案中，提供了产生转基因植物、来自此类植物或用于产生此类植物的子代、种子和/或花粉的方法；每个植物与相应例如未转化的野生型植物细胞或植物相比可表现出提高的水利用效率或增加的干旱耐受性，所述方法通过在所述植物的本文所述亚细胞区室和组织中增加或生成一种或多种所述活性来实现。
因而，在本发明的另一实施方案中，提供了产生转基因植物、来自此类植物或用于产生此类植物的子代、种子和/或花粉的方法；每个植物与相应例如未转化的野生型植物细胞或植物相比可表现出氮利用效率(NUE)以及增加的低温耐受性和/或增加的固有产量和/或干旱耐受性，特别是寒冷耐受性和干旱耐受性，所述方法通过在所述植物的本文所述亚细胞区室和组织中增加或生成一种或多种所述活性来实现。
因而，在本发明的另一实施方案中，提供了产生转基因植物、来自此类植物或用于产生此类植物的子代、种子和/或花粉的方法；每个植物与相应例如未转化的野生型植物细胞或植物相比可表现出增加的氮利用效率(NUE)以及低温耐受性或增加的干旱耐受性或增加的固有产量，特别是寒冷耐受性和干旱耐受性和增加的生物质，所述方法通过在所述植物的本文所述亚细胞区室和组织中增加或生成一种或多种所述活性来实现。
因而，在本发明的另一实施方案中，提供了产生转基因植物、来自此类植物或用于产生此类植物的子代、种子和/或花粉的方法；每个植物与相应例如未转化的野生型植物细胞或植物相比可表现出增加的氮利用效率(NUE)和低温耐受性和增加的干旱耐受性和增加的固有产量，特别是寒冷耐受性和干旱耐受性和增加的生物质，所述方法通过在所述植物的本文所述亚细胞区室和组织中增加或生成一种或多种所述活性来实现。
而且，在一个实施方案中，本发明提供了转基因植物，其与相应例如未转化的原始或野生型植物细胞或植物相比表现出一种或多种增加的产量相关性状，在所述植物的本文所述亚细胞区室和组织中具有增加的或新生成的一种或多种选自上文所述活性组的活性。
因而，在本发明的另一实施方案中，提供了产生转基因植物、来自此类植物或用于产生此类植物的子代、种子和/或花粉的方法；每种与相应例如未转化的野生型植物细胞或植物相比表现出增加的低温耐受性和氮利用效率(NUE)，所述方法通过增加或生成一种或多种所述“活性”实现。
因而，在本发明的另一实施方案中，提供了产生转基因植物、来自此类植物或用于产生此类植物的子代、种子和/或花粉的方法；每种与相应例如未转化的野生型植物细胞或植物相比表现出提高的NUE和增加的周期性干旱耐受性，所述方法通过增加或生成一种或多种所述“活性”实现。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生植物、转基因植物、来自此类植物或用于产生此类植物的子代、种子和/或花粉的方法；每种与相应例如未转化的原始或野生型细胞或植物相比表现出增加的固有产量，所述方法通过增加或生成一种或多种所述“活性”实现。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生植物的方法，所述植物与相应原始或野生型植物相比表现出增加的养分利用效率，所述方法通过增加或生成一种或多种所述“活性”实现。在另一个实施方案中，根据本发明的方法得到的和本发明转基因植物表现出的养分利用效率为增加的氮利用效率。
在一个实施方案中，所述活性在细胞的一个或多个特定区室中增加并赋予增加的产量，例如植物表现出增加的或提高的所述产量相关性状。例如，如表I或II第6栏所示在细胞质体中增加所述活性，和在相应植物中增加的产量。例如，如表VIII所示，所述活性的特定质体定位赋予增加或提高的产量相关性状。此外，如表VIII所示，所述活性可在细胞线粒体中增加，并增加相应植物的产量，例如赋予提高或增加的产量相关性状。
此外，本发明涉及产生与相应野生型植物相比产量增加的植物的方法，包括选自下组的至少一个步骤：
(i)增加或生成包含分别如表II或表IV第5或7栏所示的多肽、共有序列或至少一种多肽基序的多肽的活性；
(ii)增加或生成包含一种或多种表I第5或7栏所示多核苷酸的一种或多种核酸分子的表达产物的活性，和
(iii)增加或生成(i)或(ii)的功能等同物的活性。
从而，增加或生成一种或多种所述活性可以例如由所述核酸分子的一种或多种表达产物例如蛋白质而赋予。因此，在上文所述的本发明中，增加或生成一种或多种所述活性可以例如由分别包含选自表II第5和7栏所示多肽的一种或多种蛋白质而赋予。
本发明的方法在一个实施方案中包括如下步骤：
(i)增加或生成至少一种核酸分子(以下称作“产量相关蛋白质(YRP)”编码基因或“YRP”基因)的表达；和/或(ii)增加或生成其表达产物的表达；和/或(iii)增加或生成其编码的表达产物的一种或多种活性，其中所述YRP基因核酸分子包含选自下组的核酸分子：
(a)编码表II第5或7栏所示多肽的核酸分子；
(b)表I第5或7栏所示的核酸分子；
(c)核酸分子，其由于遗传密码简并性可由表II第5或7栏所示的多肽序列获得，且赋予转基因植物或其部分与相应例如未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(d)核酸分子，其与包含表I第5或7栏所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％、例如50、60、70、80、85、90、95、97、98或99％的同一性，且赋予转基因植物或其部分与相应例如未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(e)核酸分子，其编码的多肽与(a)至(c)中核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％、例如50、60、70、80、85、90、95、97、98或99％的同一性，并具有包含表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性，且赋予转基因植物或其部分与相应例如未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(f)核酸分子，其与(a)至(c)中的核酸分子在严格杂交条件下杂交，且赋予转基因植物或其部分与相应例如未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(g)核酸分子，其编码的多肽可借助于针对(a)至(e)中核酸分子之一所编码的多肽制备的单克隆或多克隆抗体分离，并具有包含表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；
(h)核酸分子，其编码的多肽包含表IV第7栏所示的共有序列或一种或多种多肽基序，且优选具有包含表II或IV第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；
(i)核酸分子，其编码的多肽具有表II第5栏所示蛋白质所呈现的活性，且赋予转基因植物或其部分与相应例如未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(j)核酸分子，其所包含通过利用表III第7栏的引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得的多核苷酸，且优选具有包含表II或IV第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；和
k)核酸分子，其可通过在严格杂交条件下、用包含(a)或(b)中核酸分子的互补序列的探针或用其片段来筛选适宜的核酸文库而获得，且编码具有包含表II第5栏所示多肽的蛋白质所呈现的活性的多肽，其中所述片段具有(a)至(e)中所表征的核酸分子序列的互补核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt、1000nt、1500nt、2000nt或3000nt。
因此，本发明的基因或根据本发明使用的基因，当其编码的蛋白质具有选自3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白的活性时；编码的蛋白质包含表I第5或7栏所示核酸序列编码的多肽时；和/或编码的蛋白质包含表II第5和7栏所示的多肽时；或其可用表III第7栏所示的引物组扩增时，也都称作“YRP基因”。
由“YRP基因”编码的蛋白质或多肽称作“产量相关蛋白质”或“YRP”。出于说明本发明的目的，具有选自3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白的活性的蛋白质；包含表I第5或7栏所示一种或多种核酸序列编码的多肽的蛋白质；或包含表II第5和7栏所示的多肽的蛋白质；或包含表IV第7栏所示共有序列或包含表IV第7栏所示一种或多种基序的蛋白质，也都称作“产量相关蛋白质”或“YRP”。
因而，在一个实施方案中，本发明提供了产生植物的方法，其与相应的原始或野生型植物相比表现出增加或提高的产量，所述方法通过增加或生成选自下组的一种或多种活性实现：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白，所述活性由一种或多种YRP或一种或多种YRP基因的基因产物赋予，例如由包含选自表I第5或7栏所示组的多核苷酸的核酸序列的基因产物赋予；例如由分别包含选自表I第5或7栏所示组的一种或多种核酸序列所编码的多肽的一种或多种蛋白质赋予；或者由分别包含选自表II第5和7栏所示组的多肽的一种或多种蛋白质赋予；或者由具有与表IV第7栏所示共有序列相对应的序列的蛋白质赋予。
如所述及的那样，增加的产量可以通过一种或多种产量相关性状来介导。因而，本发明的方法也涉及产生表现出所述一种或多种产量相关性状的植物。
因而，本发明提供了产生表现出增加的养分利用效率例如氮利用效率(NUE)，增加的胁迫抗性特别是非生物胁迫抗性，增加的养分利用效率，增加的水利用效率，和/或增加的胁迫抗性特别是非生物胁迫抗性，尤其是低温耐受性或干旱耐受性或增加的固有产量。
在一个实施方案中，一种或多种所述活性通过增加具有所述活性的一种或多种蛋白质的量和/或比活而增加，例如在细胞或细胞区室中增加一种或多种YRP的量和/或比活，例如增加表II第5和7栏所示的多肽、或与表VI第7栏所示共有序列对应的多肽的量和/或比活。
此外，本发明涉及产生与相应的原始或野生型植物相比产量增加的植物例如转基因植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞核、植物细胞、植物或其部分中增加或生成选自下组的一种或多种活性：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白；和
(b)在允许植物细胞、植物或其部分发育的条件下培养或生长所述植物细胞、植物或其部分；和
(c)由所述植物细胞核、植物细胞、植物部分产生与相应例如未转化的原始或野生型植物相比表现出增加的产量的植物；
(d)和任选地，选择与相应例如未转化的野生型植物细胞[例如表现出可视的缺陷和/或死亡症状的野生型植物细胞]相比表现出增加的产量的植物或其部分，例如表现出增加的或提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率和/或非生物胁迫抗性的植物或其部分。
此外，本发明还涉及鉴定产量增加的植物的方法，包括对一种或多种植物细胞核、植物细胞、植物组织或植物或其部分的群体筛选选自下组的所述活性：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白，就所述活性水平与参照的活性水平进行比较；鉴定与参照相比活性增加的一种或多种植物细胞核、植物细胞、植物组织或植物或其部分，任选地由所鉴定的植物细胞核、细胞或组织产生植物。
在另一实施方案中，本发明还涉及鉴定产量增加的植物的方法，包括对一种或多种植物细胞核、植物细胞、植物组织或植物或其部分的群体筛选编码赋予所述活性的多肽的核酸的表达水平，就所述表达水平与参照进行比较；鉴定与参照相比表达水平增加的一种或多种植物细胞核、植物细胞、植物组织或植物或其部分，任选地由所鉴定的植物细胞核、细胞或组织产生植物。
在另一实施方案中，本发明涉及增加植物群体的产量的方法，包括检查种植地区的生长温度，就所述温度与考虑种植的植物物种或品种(例如本文所述的原始或野生型植物)的最佳生长温度进行比较，如果生长温度对于该考虑种植的植物物种或品种(例如原始或野生型植物)的种植和生长不是最佳的，则种植和生长本发明的植物。所述方法可部分或全部地重复一次或多次。
所述方法可部分或全部地重复一次或多次。
在一个实施方案中，本发明提供了在光合作用生物中，特别是在植物中提高环境胁迫适应性，尤其是对低温的适应性，即增强对低温的耐受性的方法，其包含但不限于增强寒冷耐受性和/或冰冻耐受性，所述植物在所述增加的非生物胁迫适应中单独或全部受影响(reflected)，和/或在非生物胁迫特别是低温胁迫条件下增加产量的方法。
此外，本发明提供了产量增强或提高的植物细胞和/或植物。如所提及的那样，根据本发明，增加或提高的产量可通过与相应例如未转化的野生型植物或初始植物细胞和/或植物相比增加或提高一种或多种产量相关性状，例如养分利用效率、水利用效率、非生物环境胁迫、尤其是低温或干旱耐受性，实现。
在本发明的一个实施方案中，这些性状通过在光合作用生物优选植物中与相应(未转化的)野生型或初始光合作用生物相比增强非生物环境胁迫耐受性的方法来实现。
对环境胁迫像例如冰冻和/或寒冷温度“提高的适应性”是指在环境胁迫条件下提高的植物性能。因此，为了描述本发明的目的，有关光合作用生物优选植物最优选作物植物低温胁迫的术语“低温”指如上所述的任意低温条件，优选如上面定义的、如上下文规定的寒冷和/或冷冻温度。
在另一实施方案中，光合作用生物“增强的非生物环境胁迫耐受性”表示所述光合作用生物优选植物在遭遇如本文所述的非生物环境胁迫条件(例如像低温条件，包括寒冷和冰冻温度，或例如干旱)时，与相应(未转化的)野生型或起始光合作用生物例如野生型或原始植物相比呈现出增强的产量，例如呈现出如本文所述的增加的产量，例如种子产量或生物量产量。
从而，在一个实施方案中，本发明提供了产生与相应例如未转化的野生型植物细胞相比具有增加的产量，例如非生物环境胁迫耐受性和/或其他增加的产量相关性状的转基因植物细胞的方法，通过增加或生成选自下组的一种或多种活性实现：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白活性。
在本发明的一个实施方案中，将具有选自下组的活性的蛋白质：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白活性以及表II第5和7栏所示的或包含表IV第7栏所示序列的多肽称为“产量相关蛋白质”。
在另一实施方案中，根据本发明产生的光合作用生物，特别是本发明的植物，在非生物环境胁迫条件下表现出增加的产量，并对另一非生物环境胁迫表现出增强的耐受性，或表现出其他提高的产量相关性状。
在另一实施方案中，本发明满足了鉴定在表达或过表达内源和/或外源基因时，能够赋予光合作用生物优选植物增加的产量的新的独特基因的需求，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状。因此，本发明提供了YRP和YRP基因。
在其另一实施方案中，本发明满足了鉴定在表达或过表达内源基因时，能够赋予光合作用生物优选植物增加的产量的新的独特基因的需求，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状。从而，本发明提供了来源于植物的YRP和YRP基因。特别地，来自植物的基因描述在表I或II的第5栏及第7栏之中。
在其另一实施方案中，本发明满足了鉴定在表达或过表达外源基因时，能够赋予光合作用生物优选植物增加的产量的新的独特基因的需求，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状。从而，本发明提供了表I或II的第5栏及第7栏中来源于植物和其他生物的YRP和YRP基因。
在另一实施方案中，本发明满足了鉴定在表达或过表达内源和/或外源基因时，能够赋予光合作用生物优选植物增强的非生物环境胁迫耐受性以及增加的产量的新的独特基因的需求。
因此，本发明涉及产生例如转基因光合作用生物或其部分、或用于生成此类植物的植物细胞、植物或其部分的方法，与相应例如未转化的野生型光合作用生物或其部分或植物细胞、植物或其部分相比，所述生物表现出增加的产量，例如所述植物表现出增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，像例如增强的干旱和/或低温耐受性，和/或表现出增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状，所述方法包括：(a)在光合作用生物或其部分(例如植物细胞、植物或其部分)中增加或生成一种或多种所述活性，例如所述YRP或所述YRP基因的基因产物的活性，例如选自下组的活性：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白，和(b)任选地，由所述植物细胞、植物细胞核或其部分再生植物，在允许光合作用生物或其部分、优选植物细胞、植物或其部分发育的条件下，培养与相应例如未转化的野生型光和作用生物或其部分、优选植物细胞、植物或其部分相比，产量增加(例如具有增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状)的光合作用生物或其部分(例如植物细胞、植物或其部分)。
在另一实施方案中，本发明涉及产生产量增加的转基因植物或用于生成此类植物的植物细胞核、植物细胞或其部分的方法，产量与相应未转化的野生型植物相比增加，所述方法包括：(a)在所述植物细胞核、植物细胞、植物或其部分中增加或生成一种或多种所述活性，例如所述YRP或所述YRP基因的基因产物的活性；(b)任选地，由所述植物细胞核、植物细胞或其部分再生植物，在允许植物发育的条件下、优选在养分不足和/或非生物胁迫存在或不存在下，培养与相应未转化的野生型植物相比表现出增加的产量的植物；和(c)选择与在所述条件下表现出缺陷和/或死亡可视症状的相应未转化野生型植物细胞、转基因植物或其部分相比，表现出增加的产量，优选提高的养分利用效率和/或非生物胁迫抗性，的植物。
在另一实施方案，本发明涉及产生例如转基因光合作用生物或其部分、优选植物、或用于再生所述植物的植物细胞、植物细胞核或其部分的方法，所述植物与相应例如未转化的野生型光合作用生物或其部分优选植物相比表现出增加的产量，例如表现出增加的产量相关性状，例如表现出增强的非生物环境胁迫耐受性，例如表现出增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，和/或固有产量和/或其他增加的产量相关性状，所述方法包括至少如下步骤：
(a)在光合作用生物或其部分，优选植物细胞、植物或其部分中增加或生成一种或多种所述活性，例如所述YRP或所述YRP基因的基因产物的活性，例如选自下组的活性：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白活性，
(b)在非生物环境胁迫或不足条件下与例如未转化的野生型光合作用生物一起培养所述光合作用生物；
(c)选择具有增加的产量的光合作用生物或其部分(例如植物细胞)，例如具有增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状，所述产量与相应例如未转化的野生型光合作用生物例如植物相比，在例如未转化的野生型光合作用生物或其部分表现出缺陷和/或死亡可视症状之后增加。
在整篇说明书的一个实施方案中，非生物环境胁迫是指低温胁迫。
此外，在一个实施方案中，产量相关性状为增加的低温耐受性。
在本发明的一个实施方案中，在生产例如转基因光合作用生物或其部分的所述方法中，所述TRP的活性通过下述增加或生成：通过增加或生成如表II第3栏所示的或由表I第5或7栏所示核酸序列编码的蛋白质的活性，所述活性在表II或表I第6栏所示的细胞部分中增加。
在一个实施方案中，所述活性，例如表II第3栏所示的或由表I第5栏所示核酸序列编码的所述蛋白质的活性在表II或表I第6栏所示的细胞部分中增加。此外，本发明涉及产生与相应例如未转化的野生型植物相比产量增加的转基因植物的方法，用包含选自下组的核酸分子的核酸分子转化植物细胞或植物细胞核或植物组织以产生此类植物：
(a)编码表II第5或7栏所示多肽的核酸分子；
(b)表I第5或7栏所示的核酸分子；
(c)核酸分子，其由于遗传密码简并性可由表II第5或7栏所示的多肽序列获得，且赋予转基因植物或其部分与相应例如未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(d)核酸分子，其与包含表I第5或7栏所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％、例如50、60、70、80、85、90、95、97、98或99％的同一性，且赋予转基因植物或其部分与相应例如未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(e)核酸分子，其编码的多肽与(a)至(c)中核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％、例如50、60、70、80、85、90、95、97、98或99％的同一性，并具有包含表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性，且赋予转基因植物或其部分与相应例如未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(f)核酸分子，其与(a)至(c)中的核酸分子在严格杂交条件下杂交，且赋予转基因植物或其部分与相应例如未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(g)核酸分子，其编码的多肽可借助于针对(a)至(e)中核酸分子之一所编码的多肽制备的单克隆或多克隆抗体分离，并具有包含表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；
(h)核酸分子，其编码的多肽包含表IV第7栏所示的共有序列或一种或多种多肽基序，且优选具有包含表II或IV第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；
(i)核酸分子，其编码的多肽具有表II第5栏所示蛋白质所呈现的活性，且赋予转基因植物或其部分与相应例如未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(j)核酸分子，其所包含通过利用表III第7栏的引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得的多核苷酸，且优选具有包含表II或IV第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；和
(k)核酸分子，其可通过在严格杂交条件下、用包含(a)或(b)中核酸分子的互补序列的探针或用其片段来筛选适宜的核酸文库而获得，且编码的多肽具有包含表II第5栏所示多肽的蛋白质所呈现的活性，其中所述片段具有(a)至(e)中所表征的核酸分子序列的互补核酸分子的至少20、30、50、100、200、300、500或1000或更多个nt，并由该转化的植物细胞核、植物细胞或植物组织再生具有增加的产量的转基因植物。
调节，即增加，可因内源或外源因素引起。例如，生物或其部分中活性的增加可通过在培养基或营养液中添加基因产物或前体或激活剂或激动剂而引起，或可通过向生物体中瞬时或稳定引入所述物质而引起。此外，此类增加可通过将本发明的核酸序列或编码的蛋白质引入到正确的细胞区室中而实现，例如通过转化和/或靶向，引入到细胞核或细胞质中或引入到质体中。出于说明本发明的目的，术语“细胞质”和“非靶向的”应指在不添加非天然的转运肽编码序列的情况下表达本发明的核酸。非天然的转运肽编码序列是并非本发明核酸(例如表I第5或7栏所示核酸)的天然部分的序列，而是通过分子操作步骤例如在实施例中“质体靶向表达”部分所述步骤添加的。因此，术语“细胞质”和“非靶向的”不应排除在转基因生物背景中本发明核酸序列的产物通过其天然存在的序列特性而靶向定位到任何细胞区室。由所附序列获得的成熟多肽的亚细胞定位可针对生物(植物)由技术人员利用软件工具预测，像TargetP(Emanuelsson等，(2000)，Predicting sub-cellular localization of proteins based on their N-terminalamino acid sequence.，J.Mol.Biol.300，1005-1016)、ChloroP(Emanuelsson等(1999)，ChloroP，a neural network-based method for predictingchloroplast transit peptides and their cleavage sites.，Protein Science，8：978-984)或其他预测软件工具(Emanuelsson等(2007)，Locating proteins inthe cell using TargetP，SignalP，and related tools.，Nature Protocols 2，953-971)。
因此，本发明涉及产生例如转基因植物的方法，所述植物与相应例如未转化的野生型植物相比具有增加的产量，例如具有增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状，所述方法包括：(a)在植物细胞的细胞器例如质体或线粒体(例如如表I第6栏所示)中增加或生成一种或多种所述活性，例如所述YRP或所述YRP基因的基因产物的活性，例如选自下组的活性：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白，和(b)在允许与相应例如未转化的野生型植物相比具有增加的产量的植物发育的条件下培养植物细胞，例如具有增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状。
如本文描述的多肽定位可改变产量相关性状。例如，定位可在第6栏所示的转运肽控制之下或是无靶向的。“无靶向的”定位指被表达的提高产量例如赋予指示产量相关性状的多肽没有与其编码序列连接的人工转运肽。本领域技术人员知道，多肽的定位是由多肽内的一个或多个元件或区域赋予的。控制定位的信号可以互换，例如如下所示的转运肽。
在一个实施方案中，在质体中增加或生成由YPR例如表II所示多肽赋予的如本文所公开的活性；条件是在各表I的第6栏针对所述多肽列出了术语“质体”。
在一个实施方案中，在线粒体中增加或生成由YPR例如表II所示多肽赋予的如本文所公开的活性；条件是在各表I的第6栏针对所述多肽列出了术语“线粒体”。
在另一实施方案中，本发明涉及产生例如转基因植物的方法，所述植物与相应例如未转化的野生型植物相比具有增加的产量，例如具有增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状，所述方法包括：
(a)在植物细胞的细胞质中增加或生成一种或多种所述活性，和
(b)在允许与相应例如未转化的野生型植物相比具有增加的产量的植物发育的条件下培养植物，例如具有增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成由表II所示多肽赋予的如本文所公开的活性；条件是在各表I的第6栏针对所述多肽列出了术语“细胞质”。
在另一实施方案中，本发明涉及产生例如与相应例如未转化的野生型植物相比具有增加的产量的转基因植物或其部分(例如具有增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状的植物)的方法，所述方法包括：
(a1)在植物细胞的细胞器中增加或生成一种或多种所述活性，例如所述YRP或所述YRP基因的基因产物的活性，例如选自下组的活性：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白，或(a2)在植物细胞中增加或生成YRP的活性，例如表II第3栏所示的蛋白质的活性、或由表I第5或7栏所示核酸序列编码的蛋白质的活性，且其与编码转运肽的核酸序列相连；或(a3)在植物细胞中增加或生成YRP的活性，例如表II第3栏所示的蛋白质的活性、或由表I第5或7栏所示核酸序列编码的蛋白质的活性，且其与编码细胞器定位序列、特别是叶绿体定位序列的核酸序列相连；或(a4)在植物细胞中增加或生成YRP的活性，例如表II第3栏所示的蛋白质的活性、或由表I第5或7栏所示核酸序列编码的蛋白质的活性，且其与编码线粒体定位序列的核酸序列相连，和(b)由所述植物细胞再生植物；(c)在允许与相应例如未转化的野生型植物相比具有增加的产量(例如具有增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状)的植物发育的条件下培养植物。
因此，在另一实施方案中，在产生具有增加的产量的转基因植物的所述方法中，如下增加或生成所述活性：
(a1)通过细胞器转化在植物细胞器中增加或生成表II第3栏所示的、表I第5或7栏所示核酸序列编码的蛋白质的活性，或
(a2)通过质体转化在植物质体或其一个或多个部分中增加或生成表II第3栏所示的、表I第5或7栏所示核酸序列编码的蛋白质的活性；
(a3)通过叶绿体转化在植物叶绿体或其一个或多个部分中增加或生成YRP的活性，例如表II第3栏所示的、或由表I第5或7栏所示核酸序列编码的蛋白质的活性；
(a4)通过线粒体转化在植物线粒体或其一个或多个部分中增加或生成YRP的活性，例如表II第3栏所示的、或由表I第5或7栏所示核酸序列编码的蛋白质的活性。
因此，本发明还涉及产生与相应的野生型植物相比具有增加的产量的植物(例如基于增加或提高的产量相关性状)的方法，所述方法包括选自下组的至少一个步骤：
(i)增加或生成包含分别如表II或表IV第5或7栏所示的多肽、共有序列或至少一种多肽基序的多肽的活性；
(ii)增加或生成包含表I第5或7栏所示多核苷酸的核酸分子的表达产物的活性，和
(iii)增加或生成(i)或(ii)的功能等同物的活性。
原则上，编码转运肽的核酸序列可分离自每一种含有质体优选叶绿体的生物，例如微生物如藻类、或植物。“转运肽”是氨基酸序列，其编码核酸序列与相应的结构基因一起翻译。这意味着转运肽是该翻译蛋白质整体的一部分，并形成该蛋白质的氨基酸末端延伸。两者作为所谓的“前蛋白质”翻译。一般而言，转运肽在该蛋白质运输到正确的细胞器例如质体期间或刚刚运输入之后，即从前蛋白质上切割下来以产生成熟蛋白质。转运肽通过促进蛋白质跨细胞内膜运输而确保成熟蛋白质正确定位。
编码转运肽的核酸序列可源自编码最终定居于质体中的蛋白质且起源于选自下组的生物的核酸序列：伞藻属(Acetabularia)、拟南芥属(Arabadopsis)、芸苔属(Brassica)、辣椒属(Capsicum)、衣藻属(Chlamydomonas)、南瓜属(Cururbita)、杜氏藻属(Dunaliella)、裸藻属(Euglena)、黄菊属(Flaveria)、大豆属(Glycine)、向日葵属(Helianthus)、大麦属(Hordeum)、浮萍属(Lemna)、黑麦草属(Lolium)、番茄属(Lycopersion)、苹果属(Malus)、苜蓿属(Medicago)、日中花属(Mesembryanthemum)、烟草属(Nicotiana)、月见草属(Oenotherea)、稻属(Oryza)、碧冬茄属(Petunia)、菜豆属(Phaseolus)、剑叶藓属(Physcomitrella)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、萝卜属(Raphanus)、蝇子草属(Silene)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、菠菜属(Spinacea)、甜叶菊属(Stevia)、聚球藻属(Synechococcus)、小麦属(Triticum)和玉蜀黍属(Zea)。
例如，可有益地用在本发明方法中的此类转运肽源自编码选自下组的蛋白质的核酸序列：核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、乙酰乳酸合酶、叶绿体核糖体蛋白CS17、Cs蛋白、铁氧还蛋白、质体蓝素、核酮糖二磷酸羧化酶活化酶、色氨酸合酶、酰基载体蛋白、质体伴侣蛋白-60、细胞色素c552、22-kDA热休克蛋白、33-kDa放氧增强蛋白1(oxygen-evolving enhancer protein)、ATP合酶γ亚基、ATP合酶δ亚基、叶绿素a/b结合蛋白II-1、放氧增强蛋白2、放氧增强蛋白3、光系统I：P21、光系统I：P28、光系统I：P30、光系统I：P35、光系统I：P37、甘油-3-磷酸酰基转移酶、叶绿素a/b结合蛋白、CAB2蛋白、羟甲基胆色烷合酶、丙酮酸-正磷酸双激酶、CAB3蛋白、质体铁蛋白、铁蛋白、早期光诱导蛋白、谷氨酸-1-半醛转氨酶、原叶绿素酸酯还原酶、淀粉粒结合淀粉酶合成酶、光系统II的捕光叶绿素a/b结合蛋白、主要花粉变应原Lol p5a、质体ClpB ATP依赖性蛋白酶、超氧化物歧化酶、铁氧还蛋白NADP氧化还原酶、28-kDa核糖核蛋白、31-kDa核糖核蛋白、33-kDa核糖核蛋白、乙酰乳酸合酶、ATP合酶CF0亚基1、ATP合酶CF0亚基2、ATP合酶CF0亚基3、ATP合酶CF0亚基4、细胞色素f、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺合成酶2、碳酸酐酶、GapA蛋白、热休克蛋白hsp21、磷酸易位蛋白、质体ClpA ATP依赖性蛋白酶、质体核糖体蛋白CL24、质体核糖体蛋白CL9、质体核糖体蛋白PsCL18、质体核糖体蛋白PsCL25、DAHP合酶、淀粉磷酸化酶、根酰基载体蛋白II、甜菜碱-醛脱氢酶、GapB蛋白、谷氨酰胺合成酶2、磷酸核酮糖激酶、亚硝酸还原酶、核糖体蛋白L12、核糖体蛋白L13、核糖体蛋白L21、核糖体蛋白L35、核糖体蛋白L40、磷酸丙糖-3-磷酸甘油酸-磷酸易位蛋白、铁氧还蛋白依赖性谷氨酸合酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、NADP依赖性苹果酸酶和NADP苹果酸脱氢酶。
在一个实施方案中，编码转运肽的核酸序列源自编码最终位于质体中的蛋白质且起源于选自下组物种的生物的核酸序列，：地中海伞藻(Acetabularia mediterranea)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassicacampestris)、欧洲油菜(Brassica napus)、辣椒(Capsicum annuum)、雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、南瓜(Cururbita moschata)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、Dunaliella tertiolecta、细小裸藻(Euglena gracilis)、Flaveria trinervia、大豆(Glycine max)、向日葵(Helianthus annuus)、大麦(Hordeum vulgare)、Lemna gibba、多年生黑麦草(Lolium perenne)、番茄(Lycopersion esculentum)、苹果(Malus domestica)、野苜蓿(Medicagofalcata)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、冰叶日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)、白花丹叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)、林烟草(Nicotianasylvestris)、烟草(Nicotiana tabacum)、Oenotherea hookeri、稻(Oryza sativa)、矮牵牛(Petunia hybrida)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、黑松(Pinus tunbergii)、豌豆(Pisum sativum)、萝卜(Raphanus sativus)、白花蝇子草(Silene pratensis)、白芥(Sinapis alba)、马铃薯(Solanum tuberosum)、菠菜(Spinacea oleracea)、甜菊(Steviarebaudiana)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、普通小麦(Triticum aestivum)和玉蜀黍(Zea mays)。
编码转运肽的核酸序列由von Heijne等(Plant Molecular BiologyReporter，9(2)，104，(1991))公开，在此并入作为参考。表V显示了vonHeijne等公开的转运肽序列的一些实例。
根据本发明，特别是实施例的公开内容，技术人员能够将von Heijne等公开的其他核酸序列与本文公开的YRP基因或编码YRP的基因相连，例如与表I第5和7栏所示的核酸序列(例如，针对该核酸分子，表I第6栏显示术语“质体”)相连。
编码转运肽的核酸序列可以源自菠菜属(Spinacia)，例如叶绿体30S核糖体蛋白PSrp-1、根酰基载体蛋白II、酰基载体蛋白、ATP合酶：γ亚基、ATP合酶：δ亚基、细胞色素f、铁氧还蛋白I、铁氧还蛋白NADP氧化还原酶(＝FNR)、亚硝酸还原酶、磷酸核酮糖激酶、质体蓝素或碳酸酐酶。技术人员将会意识到编码转运肽的多种其他核酸序列能够容易地从作为前体由核基因表达然后靶向质体的质体定位蛋白质中分离。此类转运肽编码序列可用于构建其他表达构建体。有利地用在本发明的方法中且为本发明核酸序列和蛋白质的一部分的转运肽，一般长度20-120个氨基酸，优选25-110、30-100或35-90个氨基酸，更优选40-85个氨基酸，最优选45-80个氨基酸，并在翻译后发挥作用以使蛋白质定向到质体优选叶绿体中。编码此类转运肽的核酸序列定位在编码成熟蛋白质的核酸序列的上游。为了转运肽编码核酸与待靶向蛋白质的编码核酸之间的正确分子连接，有时候需要在连接位置引入额外的碱基对，这形成可用于不同核酸分子的分子连接的限制性酶识别序列。此方法可能在成熟输出蛋白质的N-末端产生极少的额外氨基酸，其通常且优选不干扰蛋白质功能。在任何情况下，需要仔细选择连接位置处形成限制性酶识别序列的的额外碱基对，以避免形成终止密码子或编码对蛋白质折叠有强烈影响的氨基酸例如脯氨酸的密码子。优选此类额外的密码子编码结构上灵活的小氨基酸如甘氨酸或丙氨酸。
如上文所述，可以将编码YRP、例如表II第3或5栏所示的蛋白质以及如表I第7栏所公开的其同源物的核酸序列与编码转运肽的核酸序列连接，例如，如果表I第6栏针对该核酸分子显示有术语“质体”的话。编码转运肽的核酸序列确保蛋白质运输到相应的细胞器特别是质体中。待表达基因的核酸序列和编码转运肽的核酸序列有效连接。因此，转运肽与编码YRP、例如表II第3或5栏所示的蛋白质以及如表I第7栏所公开的其同源物的核酸序列(例如，如果针对该核酸分子表I第6栏显示有术语“质体”的话)符合读框融合。
根据本发明的术语“细胞器”应表示例如“线粒体”或“质体”。根据本发明的术语“质体”旨在包括各种形式的质体，包括原质体、叶绿体、色质体、老质体(gerontoplast)、白色体、造粉体、油质体和黄化质体，优选叶绿体。它们均具有共同的祖先即前述原质体。
其他转运肽由Schmidt等(J.Biol.Chem.268(36)、27447(1993))、Della-Cioppa等(Plant.Physiol.84，965(1987))、de Castro Silva Filho等(Plant Mol.Biol.30，769(1996))、Zhao等(J.Biol.Chem.270(11)、6081(1995))、
Figure BDA0000062525460000381
等(Biochem.Biophys.Res.Commun.196(3)、1414(1993))、Keegstra等(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.40，471(1989))、Lubben等(Photosynthesis Res.17，173(1988))和Lawrence等(J.Biol.Chem.272(33)、20357(1997))公开。有关靶向的综述由Kermode Allison R.在Critical Reviews in Plant Science 15(4)，285(1996)在标题“植物细胞中的细胞内蛋白质转运和靶向机制(Mechanisms ofIntracellular Protein Transport and Targeting in Plant Cells)”中公开。
用于本发明方法的、形成本发明核酸序列的一部分的有利的转运肽序列一般富含羟基化氨基酸残基(丝氨酸和苏氨酸)，其中这两个残基一般占总数的20-35％。它们往往具有不含Gly、Pro和荷电残基的氨基末端区域。此外，他们具有许多小的疏水氨基酸，例如缬氨酸和丙氨酸，并且一般缺乏酸性氨基酸。另外，它们一般具有富含Ser、Thr、Lys和Arg的中间区域。总体上它们往往具有净正电荷。
可选地，编码转运肽的核酸序列可以根据现有技术中公开的转运肽序列结构而部分或完全地化学合成。所述天然或化学合成序列可与编码成熟蛋白质的序列直接相连，或借助于接头核酸序列，其可以长度一般小于500个碱基对，优选小于450、400、350、300、250或200个碱基对，更优选小于150、100、90、80、70、60、50、40或30个碱基对，最优选小于25、20、15、12、9、6或3个碱基对，并与编码序列符合读框。此外，编码转运肽的有利核酸序列可以包含源自一个以上生物和/或化学来源的序列，并且可以包括源自成熟蛋白质氨基末端区域的、天然状态下与转运肽相连的核酸序列。在本发明优选的实施方案中，成熟蛋白质的所述氨基末端区域长度一般小于150个氨基酸，优选小于140、130、120、110、100或90个氨基酸，更优选小于80、70、60、50、40、35、30、25或20个氨基酸，最优选小于19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个氨基酸。但是甚至更短或更长的链也是可能的。另外，促进蛋白质转运至其他细胞区室如液泡、内质网、高尔基体、乙醛酸循环体、过氧物酶体或线粒体的导向序列也可以是本发明核酸序列的部分。
由本发明核酸序列翻译的蛋白质可以是融合蛋白质类型，这意味着编码转运肽的核酸序列例如表V所示的那些，例如该表中的最后一个连接于YRP基因，例如表I第5和7栏所示的核酸序列，例如，如果针对该核酸分子表I第6栏显示有术语“质体”的话。本领域技术人员能够使所述序列以有功能的方式连接。有利地，在转运(优选至质体)期间，转运肽部分自YRP例如自表II第5和7栏所示的蛋白质部分切割下来。表V末行所示的优选转运肽的所有切割产物优选在YRP例如表II第5和7栏所述蛋白质的起始甲硫氨酸之前具有N-末端氨基酸序列QIA CSS或QIA EFQLTT。在YRP例如表II第5和7栏所述蛋白质的起始甲硫氨酸之前，范围1-20个氨基酸、优选2-15个氨基酸、更优选3-10个氨基酸、最优选4-8个氨基酸的其他短氨基酸序列也是可行的。在氨基酸序列QIA CSS的情况下，起始甲硫氨酸之前的3个氨基酸源自于LIC(＝连接不依赖性克隆)盒。在表达大肠杆菌基因的情况下优选所述短氨基酸序列。在氨基酸序列QIAEFQLTT的情况下，起始甲硫氨酸之前的6个氨基酸源自于LIC盒。在表达酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因的情况下优选所述短氨基酸序列。技术人员知晓其他短序列也可用于表达YRP基因，例如表I第5和7栏所述的基因。此外，技术人员明白在表达所述基因方面此类短序列并非必需的。
表V：von Heijne等公开的转运肽的实例
Figure BDA0000062525460000401
Figure BDA0000062525460000411
作为借助于例如表V所述的靶向序列单独、或其与其他靶向序列(优选靶向到质体中)的组合来定向YRP(例如具有表II第5和7栏所示序列的蛋白质，优选通常在细胞核中编码的序列)的备选方案，本发明的核酸可直接引入到质体基因组中，例如表II第6栏针对其指示了术语“质体”的那些本发明核酸。因此，在优选的实施方案中，YRP基因例如表I第5和7栏所示的核酸序列直接引入到质体中和表达，特别是当针对该核酸序列，表I第6栏显示了术语“质体”时。
术语“引入”在本说明书上下文中应当指通过“转染”、“转导”或优选通过“转化”将核酸序列插入到生物体中。
如果核酸序列已经引入到质体中，则质体例如叶绿体已经被外源(优选外来)核酸序列“转化”，这意味着此序列已经穿过质体的一层或多层膜。外来DNA可以整合(共价连接)到质体DNA中，构成质体的基因组，或者其可以保持非整合(例如，通过纳入叶绿体复制起点)。“稳定”整合的DNA序列通过质体复制遗传，由此将具有整合DNA序列的特征的新质体转移给子代。
为进行表达，本领域技术人员熟知将核酸序列引入到不同细胞器例如优选质体中的不同方法。此类方法例如由Maiga P.(Annu.Rev.Plant Biol.55，289(2004))、Evans T.(WO 2004/040973)、McBride K.E.等(US5,455,818)、Daniell H.等(US 5,932,479和US 5,693,507)和Straub J.M.等(US 6,781,033)公开。优选的方法是转化小孢子来源的下胚轴或子叶组织(其为绿色因而含有众多质体)、叶组织，之后在选择培养基上由所述转化的植物材料再生芽。至于转化方法，轰击植物材料或利用独立复制的穿梭载体为技术人员公知。而且PEG介导的质体转化或双元载体农杆菌转化也是可行的。有用的质体转化标记为阳性选择标记，例如氯霉素、链霉素、卡那霉素、新霉素、丁胺卡那霉素、壮观霉素、三嗪和/或林可霉素耐受性基因。作为文献中通常称作次级标记的其他标记，编码除草剂耐受性的基因，例如膦丝菌素(＝草铵膦、BASTATM、LibertyTM，由bar基因编码)、草甘膦(＝N-(膦酰甲基)甘氨酸、RoundupTM，由5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因＝epsps编码)、磺酰脲类(像StapleTM，由乙酰乳酸合酶(ALS)基因编码)、咪唑啉酮类[＝IMI，像咪草烟(imazethapyr)、甲氧咪草烟(imazamox)、ClearfieldTM，由乙酰羟酸合酶(AHAS)基因，也称为乙酰乳酸合酶(ALS)基因编码]或溴苯腈(bromoxynil)(＝BuctrilTM，由oxy基因编码)耐受性基因，或编码抗生素例如潮霉素或G418的基因可用于进一步的选择。此类次级标记在大多数基因组拷贝被转化的情况下有用。另外阴性选择标记例如细菌胞嘧啶脱氨酶(由codA基因编码)也可用于质体转化。
因而，在一个实施方案中，在表II第6栏针对所述多肽列有术语“质体”时，通过使表II公开的多肽或赋予相同所述活性的多肽与本文所述的靶向信号相连，而增加或生成由表II所示多肽赋予的本文所公开活性。例如，所述多肽可与表VII所示的靶向信号相连。
从而，在包括用述及的核酸分子转化植物细胞或植物细胞核或植物组织的、用于产生与相应例如未转化的野生型植物相比产量增加的转基因植物的本发明方法中，选自述及组的所述核酸分子编码赋予所述活性的多肽，该多肽与本文所述靶向信号例如表VII所示的靶向信号相连，例如，当表II第6栏针对该编码的多肽列有术语“质体”时。
为增加鉴定转化株的可能性，还期望使用非前述耐受性基因的报告基因或除所述耐受性基因之外还利用报告基因。报告基因有例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、碱性磷酸酶和/或绿色荧光蛋白基因(GFP)。
通过转化质体，可以阻断种内特异性转基因流，这是因为许多物种例如玉米、棉花和稻具有严格的质体母系遗传。通过将YRP基因，例如表I第5和7栏所述基因(例如在表I第6栏针对该核酸分子显示有术语“质体”时)，或其活性片段置于植物质体中，这些基因不会存在于所述植物的花粉中。
本发明的另一实施方案涉及所谓“叶绿体定位序列”的应用，其中第一RNA序列或分子能够转运或“陪伴”第二RNA序列，例如由YRP基因(例如表I第5和7栏所示的序列、或编码YRP例如表II第5和7栏所示的蛋白质的序列)转录的RNA序列，从外部环境进入细胞内部，或从质体外部进入叶绿体。在一个实施方案中，叶绿体定位信号基本上与全长或完整的类病毒序列相似或互补，例如，在表II第6栏针对多肽显示有术语“质体”时。叶绿体定位信号可以由转录为叶绿体定位RNA的DNA序列编码。术语“类病毒”是指天然存在的单链RNA分子(Flores，C.R.Acad Sci III.324(10)，943(2001))。类病毒通常含有约200-500个核苷酸，且一般作为环形分子存在。含有叶绿体定位信号的类病毒的实例包括但不限于ASBVd、PLMVd、CChMVd和ELVd。类病毒序列或其功能部分可与YRP基因，例如表I第5和7栏所示的序列、或编码YRP例如表II第5和7栏所示蛋白质的序列以这样的方式融合，从而类病毒序列可以将自YRP基因(例如表I第5和7栏所示的序列、或编码YRP例如表II第5和7栏所示蛋白质的序列)转录的序列转运至叶绿体中，例如，在对于所述核酸分子或多肽，表I或II第6栏显示有术语“质体”时。优选的实施方案应用修饰的ASBVd(Navarro等，Virology.268(1)，218(2000))。
在另一具体实施方案中，欲在质体中表达的蛋白质，例如YRP，例如表II第5和7栏所示的蛋白质(例如，在表II第6栏针对该多肽显示有术语“质体”时)，由不同的核酸编码。这样的方法公开在WO 2004/040973中，其并入作为参考。WO 2004/040973教导了一种方法，涉及通过叶绿体定位序列将对应于基因或基因片段的RNA转位到叶绿体中。欲在植物或植物细胞中表达的基因被分割成核酸片段，这些片段被引入到植物的不同区室例如细胞核、质体和/或线粒体中。另外，描述了植物细胞，在所述细胞中叶绿体含有在一端融合了编码本发明方法所用蛋白质的片段的RNA的核酶，这样该核酶能够将该转位的融合RNA反式剪接成编码待形成的基因片段的RNA，并根据具体情况而定将核酸片段重新结合为编码例如表II第5和7栏所示功能性蛋白质的完整mRNA。
在本发明的另一实施方案中，本发明方法中所用的YRP基因，例如表I第5和7栏所示的核酸分子，例如，在表I第6栏显示有术语“质体”时，转化到代谢活性的质体中。这些质体应当优选以高拷贝数维持在目的植物或植物组织、最优选见于绿色植物组织如叶子或子叶或种子的叶绿体中。
在本发明的另一实施方案中，本发明方法中所用的YRP基因，例如表I第5和7栏所示的核酸分子，例如，在表I第6栏显示有术语“线粒体”时，转化到代谢活性的线粒体中。
为在质体中良好表达，YRP基因，例如表I第5和7栏所示的核酸序列，例如，在表I第6栏显示有术语“线粒体”时，引入到表达盒中，所述表达盒优选应用在质体中有活性的启动子和终止子，优选叶绿体启动子。此类启动子的实例包括来自菠菜或豌豆基因的psbA启动子，rbcL启动子，和来自玉米的atpB启动子。
根据本发明，术语“植物细胞”或术语“生物”在本文理解为总是指植物细胞或其细胞器，优选质体，更优选叶绿体。
如本文所用，“植物”旨在不仅包括整株植物，而且包括其部分，即一个或多个细胞、及组织，包括例如，叶子、茎、枝条、根、花、果实和种子。
令人惊讶地发现，在植物例如拟南芥中转基因表达酿酒酵母、大肠杆菌、集胞藻属或拟南芥YRP(例如如表II第3栏所示的)，赋予转基因植物细胞、植物或其部分与相应例如未转化的野生型植物相比增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，增加的养分利用效率，增加的干旱耐受性、低温耐受性和/或其他增加的产量相关性状。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：1703所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1702所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自大豆)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1702所示核酸分子或SEQ ID NO：1703所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“肽基脯氨酰顺反异构酶”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1703所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1702所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：1702所示核酸分子或SEQ ID NO：1703所示多肽的大豆核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1702所示核酸分子或SEQ ID NO：1703所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“肽基脯氨酰顺反异构酶”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.844倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：1773所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1772所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自集胞藻属物种)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1772所示核酸分子或SEQ ID NO：1773所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”活性，特别是在质体中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1773所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1772所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：1772所示核酸分子或SEQ ID NO：1773所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1702所示核酸分子或SEQ ID NO：1773所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.480倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1773所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1772所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：1772所示核酸分子或SEQ ID NO：1773所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1772所示核酸分子或SEQ ID NO：1773所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.096倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：1939所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1938所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自集胞藻属物种)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1938所示核酸分子或SEQ ID NO：1939所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“slr1293-蛋白”活性，特别是在质体中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1939所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1938所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：1938所示核酸分子或SEQ ID NO：1939所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1938所示核酸分子或SEQ ID NO：1939所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“slr1293-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.374倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1939所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1938所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：1938所示核酸分子或SEQ ID NO：1939所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1938所示核酸分子或SEQ ID NO：1939所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“slr1293-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.084倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1939所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1938所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：1938所示核酸分子或SEQ ID NO：1939所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1938所示核酸分子或SEQ ID NO：1939所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“slr1293-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.088倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：2043所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2042所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2042所示核酸分子或SEQ ID NO：2043所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“交配激素A-因子前体”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2043所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2042所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：2042所示核酸分子或SEQ ID NO：2043所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2042所示核酸分子或SEQ IDNO：2043所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“交配激素A-因子前体”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.503倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2043所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2042所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：2042所示核酸分子或SEQ ID NO：2043所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2042所示核酸分子或SEQ IDNO：2043所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“交配激素A-因子前体”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.155倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：2057所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2056所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2056所示核酸分子或SEQ ID NO：2057所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“腺苷酸激酶”活性，特别是在质体中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2057所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2056所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：2056所示核酸分子或SEQ ID NO：2057所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2056所示核酸分子或SEQ IDNO：2057所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“腺苷酸激酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.370倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2057所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2056所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：2056所示核酸分子或SEQ ID NO：2057所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2056所示核酸分子或SEQ IDNO：2057所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“腺苷酸激酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.142倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：2559所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2558所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2558所示核酸分子或SEQ ID NO：2559所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“环核苷酸磷酸二酯酶”活性，特别是在质体中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2559所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2558所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：2558所示核酸分子或SEQ ID NO：2559所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2558所示核酸分子或SEQ IDNO：2559所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“环核苷酸磷酸二酯酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.331倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2559所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2558所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：2558所示核酸分子或SEQ ID NO：2559所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2558所示核酸分子或SEQ IDNO：2559所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“环核苷酸磷酸二酯酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.22倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：2578所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2577所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2577所示核酸分子或SEQ ID NO：2578所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“多磷酸外切酶”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2578所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2577所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：2577所示核酸分子或SEQ ID NO：2578所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2577所示核酸分子或SEQ IDNO：2578所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“多磷酸外切酶”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.460倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：2610所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2609所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2609所示核酸分子或SEQ ID NO：2610所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“YJL181W-蛋白”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2610所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2609所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：2609所示核酸分子或SEQ ID NO：2610所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2609所示核酸分子或SEQ IDNO：2610所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“YJL181W-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.462倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：2629所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2628所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2628所示核酸分子或SEQ ID NO：2629所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2629所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2628所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：2628所示核酸分子或SEQ ID NO：2629所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2628所示核酸分子或SEQ IDNO：2629所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.764倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2629所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2628所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：2628所示核酸分子或SEQ ID NO：2629所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2628所示核酸分子或SEQ IDNO：2629所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.095倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2629所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2628所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：2628所示核酸分子或SEQ ID NO：2629所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2628所示核酸分子或SEQ IDNO：2629所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.316倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：2712所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2711所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2711所示核酸分子或SEQ ID NO：2712所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“蛋白激酶”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2712所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2711所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：2711所示核酸分子或SEQ ID NO：2712所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2711所示核酸分子或SEQ IDNO：2712所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“蛋白激酶”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.575倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2712所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2711所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：2711所示核酸分子或SEQ ID NO：2712所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2711所示核酸分子或SEQ IDNO：2712所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“蛋白激酶”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.1倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2712所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2711所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：2711所示核酸分子或SEQ ID NO：2712所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2711所示核酸分子或SEQ IDNO：2712所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“蛋白激酶”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.161倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：2739所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2738所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2738所示核酸分子或SEQ ID NO：2739所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“肌醇转运蛋白”活性，特别是在质体中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2739所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2738所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：2738所示核酸分子或SEQ ID NO：2739所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2738所示核酸分子或SEQ IDNO：2739所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“肌醇转运蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.284倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2739所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2738所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：2738所示核酸分子或SEQ ID NO：2739所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2738所示核酸分子或SEQ IDNO：2739所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“肌醇转运蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.437倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2739所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2738所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：2738所示核酸分子或SEQ ID NO：2739所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2738所示核酸分子或SEQ IDNO：2739所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“肌醇转运蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.313倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一个实施方案中，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的干旱耐受性。在一个实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2739所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2738所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：2738所示核酸分子或SEQ ID NO：2739所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2738所示核酸分子或SEQ ID NO：2739所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“肌醇转运蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时赋予增加的周期性干旱耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如在非生物胁迫条件下，例如在干旱条件下，特别是在周期性干旱条件下时)赋予1.05倍至1.772倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：2819所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2818所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2818所示核酸分子或SEQ ID NO：2819所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“核糖-5-磷酸异构酶”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2819所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2818所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：2818所示核酸分子或SEQ ID NO：2819所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2818所示核酸分子或SEQ IDNO：2819所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“核糖-5-磷酸异构酶”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.516倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：2819所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：2818所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：2818所示核酸分子或SEQ ID NO：2819所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：2818所示核酸分子或SEQ IDNO：2819所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“核糖-5-磷酸异构酶”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.234倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：3362所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：3361所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：3361所示核酸分子或SEQ ID NO：3362所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“YPL109C-蛋白质”活性，特别是在质体中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：3362所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：3361所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：3361所示核酸分子或SEQ ID NO：3362所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：3361所示核酸分子或SEQ IDNO：3362所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“YPL109C-蛋白质”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.310倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：3438所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：3437所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自大肠杆菌)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：3437所示核酸分子或SEQ ID NO：3438所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“半胱氨酸合酶”活性，特别是在质体中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：3438所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：3437所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：3437所示核酸分子或SEQ ID NO：3438所示多肽的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：3437所示核酸分子或SEQ IDNO：3438所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“半胱氨酸合酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.421倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：3438所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：3437所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：3437所示核酸分子或SEQ ID NO：3438所示多肽的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：3437所示核酸分子或SEQ IDNO：3438所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“半胱氨酸合酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.211倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：3438所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：3437所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：3437所示核酸分子或SEQ ID NO：3438所示多肽的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：3437所示核酸分子或SEQ IDNO：3438所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“半胱氨酸合酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.204倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：4404所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4403所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自大豆)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4403所示核酸分子或SEQ ID NO：4404所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“肽基脯氨酰顺反异构酶”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：4404所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4403所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：4403所示核酸分子或SEQ ID NO：4404所示多肽的大豆核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4403所示核酸分子或SEQ ID NO：4404所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“肽基脯氨酰顺反异构酶”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.844倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：4474所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4473所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自集胞藻属物种)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4473所示核酸分子或SEQ ID NO：4474所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”活性，特别是在质体中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：4474所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4473所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：4473所示核酸分子或SEQ ID NO：4474所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4473所示核酸分子或SEQ ID NO：4474所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.480倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：4474所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4473所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：4473所示核酸分子或SEQ ID NO：4474所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4473所示核酸分子或SEQ ID NO：4474所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.096倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：4640所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4639所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自集胞藻属物种)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4639所示核酸分子或SEQ ID NO：4640所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“slr1293-蛋白”活性，特别是在质体中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：4640所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4639所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：4639所示核酸分子或SEQ ID NO：4640所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4639所示核酸分子或SEQ ID NO：4640所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“slr1293-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.374倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：4640所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4639所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：4639所示核酸分子或SEQ ID NO：4640所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4639所示核酸分子或SEQ ID NO：4640所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“slr1293-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.084倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：4640所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4639所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：4639所示核酸分子或SEQ ID NO：4640所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4639所示核酸分子或SEQ ID NO：4640所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“slr1293-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.088倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：4744所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4743所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4743所示核酸分子或SEQ ID NO：4744所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“YDR049W-蛋白”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：4744所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4743所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：4743所示核酸分子或SEQ ID NO：4744所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4743所示核酸分子或SEQ IDNO：4744所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“YDR049W-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.669倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：4744所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4743所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：4743所示核酸分子或SEQ ID NO：4744所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4743所示核酸分子或SEQ IDNO：4744所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“YDR049W-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.259倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：4744所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：4743所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：4743所示核酸分子或SEQ ID NO：4744所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：4743所示核酸分子或SEQ IDNO：4744所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“YDR049W-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.166倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：64所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：63所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自大肠杆菌)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：63所示核酸分子或SEQID NO：64所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“氧化还原酶亚基”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：64所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：63所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：63所示核酸分子或SEQ ID NO：64所示多肽的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：63所示核酸分子或SEQ ID NO：64所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“氧化还原酶亚基”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.360倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：64所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：63所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：63所示核酸分子或SEQ ID NO：64所示多肽的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：63所示核酸分子或SEQ ID NO：64所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“氧化还原酶亚基”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.112倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：64所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：63所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：63所示核酸分子或SEQ ID NO：64所示多肽的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：63所示核酸分子或SEQ ID NO：64所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“氧化还原酶亚基”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.117倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：81所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：80所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自大肠杆菌)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：80所示核酸分子或SEQID NO：81所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“半胱氨酸合酶”活性，特别是在质体中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：81所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：80所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：80所示核酸分子或SEQ ID NO：81所示多肽的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：80所示核酸分子或SEQ ID NO：81所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“半胱氨酸合酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.421倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：81所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：80所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：80所示核酸分子或SEQ ID NO：81所示多肽的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：80所示核酸分子或SEQ ID NO：81所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“半胱氨酸合酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.211倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：81所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：80所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：80所示核酸分子或SEQ ID NO：81所示多肽的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：80所示核酸分子或SEQ ID NO：81所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“半胱氨酸合酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.204倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：1077所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1076所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自大肠杆菌)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1076所示核酸分子或SEQ ID NO：1077所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“B2758-蛋白”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1077所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1076所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：1076所示核酸分子或SEQ ID NO：1077所示多肽的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1076所示核酸分子或SEQ IDNO：1077所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“B2758-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.324倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1077所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1076所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：1076所示核酸分子或SEQ ID NO：1077所示多肽的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1076所示核酸分子或SEQ IDNO：1077所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“B2758-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.071倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：1106所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1105所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自集胞藻属物种)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1105所示核酸分子或SEQ ID NO：1106所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“修饰甲基化酶HemK家族蛋白”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1106所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1105所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：1105所示核酸分子或SEQ ID NO：1106所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1105所示核酸分子或SEQ ID NO：1106所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“修饰甲基化酶HemK家族蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.384倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1106所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1105所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：1105所示核酸分子或SEQ ID NO：1106所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1105所示核酸分子或SEQ ID NO：1106所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“修饰甲基化酶HemK家族蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.259倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1106所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1105所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：1105所示核酸分子或SEQ ID NO：1106所示多肽的集胞藻属物种核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1105所示核酸分子或SEQ ID NO：1106所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“修饰甲基化酶HemK家族蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.068倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：1207所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1206所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1206所示核酸分子或SEQ ID NO：1207所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“YDR049W-蛋白”活性，特别是在细胞质中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1207所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1206所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：1206所示核酸分子或SEQ ID NO：1207所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1206所示核酸分子或SEQ IDNO：1207所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“YDR049W-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.669倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1207所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1206所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：1206所示核酸分子或SEQ ID NO：1207所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1206所示核酸分子或SEQ IDNO：1207所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“YDR049W-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予增加的氮利用效率。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在氮不足条件下赋予1.05倍至1.259倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1207所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1206所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：1206所示核酸分子或SEQ ID NO：1207所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1206所示核酸分子或SEQ IDNO：1207所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“YDR049W-蛋白”的活性时，特别是当所述多肽是细胞质定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.166倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
从而，在一个实施方案中，在本发明的方法中，当增加或生成包含SEQID NO：1246所示产量相关多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1245所示核酸的产量相关核酸分子(或基因)编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物(例如源自酿酒酵母)的活性时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比增加的产量。例如，在植物细胞、植物或其部分中增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1245所示核酸分子或SEQ ID NO：1246所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者增加或生成“3-磷酸甘油酸脱氢酶”活性，特别是在质体中发生增加。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1246所述多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1245所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如在分别包含SEQ ID NO：1245所示核酸分子或SEQ ID NO：1246所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1245所示核酸分子或SEQ IDNO：1246所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“3-磷酸甘油酸脱氢酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比，增加的非生物环境胁迫耐受性、尤其是增加的低温耐受性。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在低温条件下赋予1.1倍至1.213倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
在另一实施方案中，当在植物细胞、植物或其部分中增加或生成根据SEQ ID NO：1246所示多肽的多肽、或由包含SEQ ID NO：1245所示核酸分子的核酸分子编码的多肽、或者所述核酸分子或多肽的同源物的活性(例如，分别包含SEQ ID NO：1245所示核酸分子或SEQ ID NO：1246所示多肽的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性的情况下)时，例如，当增加或生成包含表I、II或IV第7栏中分别与SEQ ID NO：1245所示核酸分子或SEQ IDNO：1246所示多肽对应相同行所示的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性时，或者当增加或生成“3-磷酸甘油酸脱氢酶”的活性时，特别是当所述多肽是质体定位时，赋予与相应未修饰的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的固有产量。在一个实施方案中，在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件下)赋予增加的产量。
特别的，与相应未修饰的例如未转化的野生型植物相比在标准条件下(例如不存在养分不足及胁迫的条件时)赋予1.05倍至1.209倍的产量增加，例如至少其的100％以上。
上文所示的比值尤其是指实际上测量为生物量、特别是地上部分鲜重生物量的增加的产量增加。
出于本发明的目的，原则上复数旨在涵盖单数，反之亦然。
除非另有说明，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本上下文中可互换。除非另有说明，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本上下文中可互换。术语“序列”可以指多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于术语“序列”应用的上下文。如本文所用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)多聚体形式。该术语仅指分子的一级结构。
因而，如本文所用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”包括双链和单链DNA和/或RNA。它们也包括已知类型的修饰，例如，甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸。优选DNA或RNA序列包含编码本文定义的多肽的编码序列。
“编码序列”是核苷酸序列，当置于适当调控序列的控制之下时，其转录为RNA，例如调控RNA，例如miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、RNAi、核酶等；或转录为可以翻译成多肽的mRNA。编码序列的边界由位于5’-末端的翻译起始密码子和位于3’-末端的翻译终止密码子界定。编码序列可包括但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，其中在某些情况下也可以存在内含子。
如本上下文所用，核酸分子还可以包括位于编码基因区3’端和5’端的非翻译序列，例如编码区5’端上游序列的至少500、优选200、特别优选100个核苷酸，和编码区3’端下游序列的至少100、优选50、特别优选20个核苷酸。在例如利用反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶等技术时，可以有利地使用编码区以及该5’-和/或3’-区域。
不过，对于克隆和表达目的，只选择编码区通常是有利的。
“多肽”指氨基酸的聚合物(氨基酸序列)，并不涉及分子的特定长度。因而，肽和寡肽包含在多肽的定义范围内。该术语的确还涉及或包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。包含在该定义范围内的有例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，具有取代的键接以及本领域已知的其他修饰的多肽，无论该修饰是天然存在的还是非天然存在的。
本说明书中所用的术语“表I”应理解为指表I A和表I B的内容。本说明书中所用的术语“表II”应理解为指表II A和表II B的内容。本说明书中所用的术语“表I A”应理解为指表I A的内容。本说明书中所用的术语“表IB”应理解为指表I B的内容。本说明书中所用的术语“表IIA”应理解为指表II A的内容。本说明书中所用的术语“表IIB”应理解为指表II B的内容。在一个优选的实施方案中，术语“表I”表示表I B。在一个优选的实施方案中，术语“表II”表示表II B。
术语“包含”或“含有”及其语法变形当用在本说明书中时应理解为指存在所述特征、要素、步骤或组分或其组，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、要素、步骤或组分或其组。
根据本发明，当与相应例如未转化的野生型植物相比，蛋白质或多肽的从头合成活性或其增加的表达直接或间接地导致并赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状，且所述蛋白质具有表II第3栏所示蛋白质的上述活性时，则该蛋白质或多肽具有“YRP，例如“表II第3栏所示蛋白质”的活性”。在通篇说明书中，与表II第3栏所示酿酒酵母或大肠杆菌或集胞藻属物种或拟南芥的蛋白质相比，此类蛋白质或多肽或者编码此类蛋白质或多肽的核酸分子或序列的活性，优选生物活性，是相同或相似的，如果其仍然具有表II第3栏所示蛋白质的生物活性或酶活的话，或者其具有至少10％的原始酶活，优选20％、30％、40％、50％，尤其优选60％、70％、80％，尤其最优选90％、95％、98％、99％。在另一实施方案中，与表II第3栏所示酿酒酵母或大肠杆菌或集胞藻属物种或拟南芥的蛋白质相比，表II第3栏所示蛋白质的生物活性或酶活具有至少101％的原始酶活，优选110％、120％、％、150％，尤其优选150％、200％、300％。
术语“增加的”、“升高的”、“扩大的”、“增强的”、“提高的”或“增大的”涉及植物、生物、生物部分例如组织、种子、根、叶、花等、或细胞中特性的相应变化，并可互换。当增加或增强涉及基因产物活性的增加或增强，则优选在体积中的总体活性增加或增强，而不论是基因产物的量或基因产物的比活或两者增加或增强，还是编码该基因产物的核酸序列或基因的量、稳定性或翻译效率增加或增强。
术语“增加”涉及生物或植物、生物部分例如组织、种子、根、叶、花等、或细胞中特性的相应变化。在增加涉及基因产物活性增加的情况下，优选在体积中的总体活性增加，而不论是基因产物的量或基因产物的比活或两者增加或生成，还是编码该基因产物的核酸序列或基因的量、稳定性或翻译效率增加。
“特性变化”应理解为特定体积中基因产物的活性、表达水平或量或代谢物含量相对于对照、参照或野生型的相应体积发生变化，包括从头产生活性或表达。
术语“增加”包括仅在本发明主题的部分中的所述特性的变化，例如，该变化可见于细胞区室像细胞器、或植物部分像组织、种子、根、叶、花等，但当测试整体主题，即整个细胞或植物时则不可检测。
从而，术语“增加”表示一定体积中酶的比活以及化合物或代谢物的量(例如本发明多肽、核酸分子或编码mRNA或DNA)可增加。
术语“野生型”、“对照”或“参照”可互换，并且可以是细胞、或生物的部分例如细胞器像叶绿体或组织，或生物，尤其是植物，其未曾按照本文所述的本发明方法进行过修饰或处理。因此，用作野生型、对照或参照的细胞、或生物部分例如细胞器像叶绿体或组织、或生物，尤其是植物，与本发明的细胞或生物、植物或其部分尽可能地一致，并且除了本发明方法的结果以外，其在其他任何特性上尽可能地与本发明的主题完全相同。因此，野生型、对照或参照被完全相同地或尽可能完全相同地处理，就是说只有不影响所测试特性的性质的条件或性能可以不同。
优选任何比较均在类似条件下进行。术语“类似条件”是指在待比较的实验之间所有条件(例如培养或生长条件、土壤、养分、土壤水含量、温度、湿度或周围空气或土壤、测定条件(例如缓冲液组成、温度、底物、病原体株、浓度等))保持相同。
所述“参照”、“对照”或“野生型”优选为未曾按照本文所述的本发明方法进行过修饰或处理并在其他任何特性上尽可能地与本发明的主题相似的对象，例如细胞器、细胞、组织，生物，尤其是植物。参照、对照或野生型在其基因组、转录组、蛋白质组或代谢物组上尽可能地与本发明的主题相似。优选术语“参照”、“对照”或“野生型”细胞器、细胞、组织或生物，尤其是植物，是指与本发明的细胞器、细胞、组织或生物，尤其是植物或其部分在遗传上几乎完全相同的细胞器、细胞、组织或生物，尤其是植物，优选95％相同，更优选98％，甚至更优选99.00％，尤其是99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、99.90％、99.99％、99.999％或以上。最优选“参照”、“对照”或“野生型”是指除了如下例外，与根据本发明方法所用的生物、尤其是植物、细胞、组织或细胞器在遗传上完全相同的对象，例如细胞器、细胞、组织、生物，尤其是植物，所述例外是根据本发明方法变更、操作、交换或引入了负责的或赋予活性的核酸分子或其编码的基因产物。
在不能够提供仅因为不是本发明方法的受试对象而不同于本发明主题的对照、参照或野生型的情况下，对照、参照或野生型可以是这样的生物，其中与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予增强的非生物环境胁迫耐受性和/或增加的产量的活性调节原因或者本文所述的本发明核酸分子的表达已经被解除或者关闭，例如通过敲除责任基因产物的表达，例如通过反义抑制，通过失活激活剂或激动剂，通过激活抑制剂或拮抗剂，通过添加抑制性抗体而抑制，通过添加活性化合物例如激素，通过引入显性失活突变体等。基因生产可例如通过引入失活点突变而敲除，这导致酶活的抑制、或去稳定化、或抑制结合辅因子的能力等。
从而，优选的参照对象是本发明方法的起始对象。优选，在标准化和校准后，例如针对总RNA、DNA或蛋白质、或参照基因例如管家基因，如泛素、肌动蛋白或核糖体蛋白的活性或表达进行标准化和校准之后，比较参照和本发明的主题。
根据本发明的增加或调节可以是组成型的，例如由于稳定永久性的转基因表达，或者编码本发明核酸分子的相应内源基因的稳定突变，或者赋予本发明多肽表达的基因的表达或行为的调节；或者是瞬时性的，例如由于瞬时转化或暂时添加调节剂例如激动剂或拮抗剂；或者是诱导型的，例如在用携带处于诱导型启动子控制之下的本发明核酸分子的诱导型构建体转化并添加诱导剂，例如四环素或如下文所述的那些之后。
与对照、参照或野生型相比，在细胞、组织、细胞器、器官或生物、优选植物或其部分中，多肽活性的增加优选达到至少5％，优选达到至少20％或达到至少50％，特别优选达到至少70％、80％、90％或以上，极特别优选达到至少100％、150％或200％，最优选达到至少250％或以上。在一个实施方案中，术语增加表示相对于生物或其部分的重量而言量的增加(w/w)。
在一个实施方案中，多肽活性的增加发生在细胞器例如质体中。在另一实施方案中，多肽活性的增加发生在细胞质中。
本发明核酸分子编码的多肽或者本发明多肽的比活可如实施例中所述测试。尤其是，与对照相比，细胞例如植物细胞中所讨论蛋白质的表达是容易测试的，并且可如现有技术所述进行。
术语“增加”包括将化合物或活性，特别是活性，从头引入到细胞、细胞质或亚细胞区室或细胞器中，或者该化合物或活性，特别是活性，之前从未曾被检测到过，换言之其被“生成”。
从而在下文中，术语“增加”也包括术语“生成”或“刺激”。增加的活性可以表现为，与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他增加的产量相关性状。
来自大豆GM02LC13512的序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为肽基脯氨酰顺反异构酶。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自大豆的赋予“肽基脯氨酰顺反异构酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述GM02LC13512描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述GM02LC13512描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述GM02LC13512描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述GM02LC13512描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“肽基脯氨酰顺反异构酶”的活性的基因产物。
来自集胞藻属物种的SLL1091序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为牻牛儿基牻牛儿基还原酶。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自集胞藻属物种的赋予“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述SLL1091描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述SLL1091描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在质体中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述SLL1091描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述SLL1091描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在质体中。
在一个实施方案中，在质体中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”的活性的基因产物。
来自集胞藻属物种的SLR1293序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为slr1293-蛋白质。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自集胞藻属物种的赋予“slr1293-蛋白质”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述SLR1293描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述SLR1293描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在质体中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述SLR1293描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述SLR1293描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在质体中。
在一个实施方案中，在质体中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“slr1293-蛋白”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YDR461W序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为交配激素A-因子前体。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“交配激素A-因子前体”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YDR461W描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YDR461W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YDR461W描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YDR461W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“交配激素A-因子前体”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YER170W序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为腺苷酸激酶。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“腺苷酸激酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YER170W描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YER170W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在质体中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YER170W描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YER170W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在质体中。
在一个实施方案中，在质体中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“腺苷酸激酶”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YGR247W序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为环核苷酸磷酸二酯酶。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“环核苷酸磷酸二酯酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YGR247W描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YGR247W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在质体中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YGR247W描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YGR247W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在质体中。
在一个实施方案中，在质体中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“环核苷酸磷酸二酯酶”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YHR201C序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为多磷酸外切酶。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“多磷酸外切酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YHR201C描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YHR201C描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YHR201C描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YHR201C描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“多磷酸外切酶”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YJL181W序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为YJL181W-蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“YJL181W-蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YJL181W描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YJL181W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YJL181W描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YJL181W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“YJL181W-蛋白”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YJR095W序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YJR095W描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YJR095W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YJR095W描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YJR095W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YNR047W序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为蛋白激酶。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“蛋白激酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YNR047W描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YNR047W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YNR047W描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YNR047W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“蛋白激酶”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YOL103W序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为肌醇转运蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“肌醇转运蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YOL103W描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YOL103W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在质体中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YOL103W描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YOL103W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在质体中。
在一个实施方案中，在质体中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“肌醇转运蛋白”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YOR095C序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为核糖-5-磷酸异构酶。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“核糖-5-磷酸异构酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YOR095C描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YOR095C描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YOR095C描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YOR095C描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“核糖-5-磷酸异构酶”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YPL109C序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为YPL109C-蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“YPL109C-蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YPL109C描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YPL109C描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在质体中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YPL109C描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YPL109C描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在质体中。
在一个实施方案中，在质体中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“YPL109C-蛋白”的活性的基因产物。
来自大肠杆菌的B2414_2序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为半胱氨酸合酶。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自大肠杆菌的赋予“半胱氨酸合酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述B2414_2描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述B2414_2描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在质体中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述B2414_2描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述B2414_2描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在质体中。
在一个实施方案中，在质体中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“半胱氨酸合酶”的活性的基因产物。
来自大豆的GM02LC13512_2序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为肽基脯氨酰顺反异构酶。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自大豆的赋予“肽基脯氨酰顺反异构酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述GM02LC13512_2描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述GM02LC13512_2描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述GM02LC13512_2描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述GM02LC13512_2描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“肽基脯氨酰顺反异构酶”的活性的基因产物。
来自集胞藻属物种的SLL1091_2序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为牻牛儿基牻牛儿基还原酶。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自集胞藻属物种的赋予“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述SLL1091_2描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述SLL1091_2描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在质体中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述SLL1091_2描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述SLL1091_2描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在质体中。
在一个实施方案中，在质体中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”的活性的基因产物。
来自集胞藻属物种的SLR1293_2序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为slr1293-蛋白质。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自集胞藻属物种的赋予“slr1293-蛋白质”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述SLR1293_2描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述SLR1293_2描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在质体中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述SLR1293_2描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述SLR1293_2描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在质体中。
在一个实施方案中，在质体中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“slr1293-蛋白”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YDR049W_2序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为YDR049W-蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“YDR049W-蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YDR049W_2描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YDR049W_2描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YDR049W_2描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YDR049W_2描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“YDR049W-蛋白”的活性的基因产物。
来自大肠杆菌的B1670序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为氧化还原酶亚基。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自大肠杆菌的赋予“氧化还原酶亚基”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述B1670描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述B1670描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述B1670描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述B1670描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“氧化还原酶亚基”的活性的基因产物。
来自大肠杆菌的B2414序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为半胱氨酸合酶。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自大肠杆菌的赋予“半胱氨酸合酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述B2414描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述B2414描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在质体中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述B2414描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述B2414描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在质体中。
在一个实施方案中，在质体中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“半胱氨酸合酶”的活性的基因产物。
来自大肠杆菌的B2758序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为B2758-蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自大肠杆菌的赋予“B2758-蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述B2758描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述B2758描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述B2758描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述B2758描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“B2758-蛋白”的活性的基因产物。
来自集胞藻属物种的SLL1237序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为修饰甲基化酶HemK家族蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自集胞藻属物种的赋予“修饰甲基化酶HemK家族蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述SLL1237描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述SLL1237描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述SLL1237描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述SLL1237描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“修饰甲基化酶HemK家族蛋白”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YDR049W序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为YDR049W-蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“YDR049W-蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YDR049W描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YDR049W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在细胞质中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YDR049W描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YDR049W描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在细胞质中。
在一个实施方案中，在细胞质中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“YDR049W-蛋白”的活性的基因产物。
来自酿酒酵母的YIL074C序列，例如如表I第5栏所示，已经公开：来自酿酒酵母的序列已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546(1996)中公开，来自大肠杆菌的序列已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453(1997)中公开。其活性描述为3-磷酸甘油酸脱氢酶。
因此，在一个实施方案中，本发明用于产生产量增加的植物的方法包括增加或生成来自酿酒酵母的赋予“3-磷酸甘油酸脱氢酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加：
(a)包含表I第5栏中与所述YIL074C描述在相同相应行的核酸分子的基因的基因产物，或表I第7栏中与所述YIL074C描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表I B第7栏所示的同源物或功能等同物的基因产物，例如在质体中；或
(b)包含在表II第5栏或表IV第7栏中与所述YIL074C描述在相同相应行的多肽、共有序列或多肽基序的多肽；或表II第7栏中与所述YIL074C描述在相同相应行的其功能等同物或同源物，优选表II B第7栏所示的同源物或功能等同物，例如在质体中。
在一个实施方案中，在质体中增加或生成所述分子，其中所述分子的活性待在本发明方法中增加、且其是具有描述为“3-磷酸甘油酸脱氢酶”的活性的基因产物。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：1702所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性(例如具有“肽基脯氨酰顺反异构酶”活性)，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“肽基脯氨酰顺反异构酶”活性且由包含SEQ ID NO：1702核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQ ID NO：1702核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“肽基脯氨酰顺反异构酶”活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：1772所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”活性且由包含SEQ ID NO：1772核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如质体定位的)、由包含SEQ ID NO：1772核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：1938所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“slr1293-蛋白”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“slr1293-蛋白”活性且由包含SEQ ID NO：1938核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如质体定位的)、由包含SEQ IDNO：1938核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“slr1293-蛋白”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：2042所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“交配激素A-因子前体”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“交配激素A-因子前体”活性且由包含SEQID NO：2042核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQ ID NO：2042核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“交配激素A-因子前体”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：2056所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“腺苷酸激酶”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“腺苷酸激酶”活性且由包含SEQ ID NO：2056核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如质体定位的)、由包含SEQ ID NO：2056核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“腺苷酸激酶”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：2558所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“环核苷酸磷酸二酯酶”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“环核苷酸磷酸二酯酶”活性且由包含SEQ IDNO：2558核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如质体定位的)、由包含SEQ ID NO：2558核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“环核苷酸磷酸二酯酶”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：2577所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“多磷酸外切酶”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“多磷酸外切酶”活性且由包含SEQ ID NO：2577核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQID NO：2577核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“多磷酸外切酶”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：2609所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“YJL181W-蛋白”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“YJL181W-蛋白”活性且由包含SEQ ID NO：2609核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQ ID NO：2609核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“YJL181W-蛋白”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：2628所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白”活性且由包含SEQ ID NO：2628核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQ ID NO：2628核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：2711所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“蛋白激酶”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“蛋白激酶”活性且由包含SEQ ID NO：2711核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQ ID NO：2711核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“蛋白激酶”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：2738所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“肌醇转运蛋白”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“肌醇转运蛋白”活性且由包含SEQ ID NO：2738核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如质体定位的)、由包含SEQ IDNO：2738核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“肌醇转运蛋白”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：2818所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“核糖-5-磷酸异构酶”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“核糖-5-磷酸异构酶”活性且由包含SEQ IDNO：2818核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQ ID NO：2818核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“核糖-5-磷酸异构酶”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：3361所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“YPL109C-蛋白”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“YPL109C-蛋白”活性且由包含SEQ IDNO：3361核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如质体定位的)、由包含SEQ ID NO：3361核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“YPL109C-蛋白”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：3437所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“半胱氨酸合酶”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“半胱氨酸合酶”活性且由包含SEQ ID NO：3437核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如质体定位的)、由包含SEQ IDNO：3437核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“半胱氨酸合酶”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：4403所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“肽基脯氨酰顺反异构酶”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“肽基脯氨酰顺反异构酶”活性且由包含SEQ ID NO：4403核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQ ID NO：4403核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“肽基脯氨酰顺反异构酶”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：4473所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”活性且由包含SEQ ID NO：4473核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如质体定位的)、由包含SEQ ID NO：4473核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“牻牛儿基牻牛儿基还原酶”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：4639所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“slr1293-蛋白”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“slr1293-蛋白”活性且由包含SEQ ID NO：4639核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如质体定位的)、由包含SEQ IDNO：4639核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“slr1293-蛋白”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：4743所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“YDR049W-蛋白”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“YDR049W-蛋白”活性且由包含SEQ IDNO：4743核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQ ID NO：4743核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“YDR049W-蛋白”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：63所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“氧化还原亚基”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“氧化还原亚基”活性且由包含SEQ ID NO：63核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQ IDNO：63核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“氧化还原亚基”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：80所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“半胱氨酸合酶”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“半胱氨酸合酶”活性且由包含SEQ ID NO：80核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如质体定位的)、由包含SEQ ID NO：80核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“半胱氨酸合酶”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：1076所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“B2758-蛋白”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“B2758-蛋白”活性且由包含SEQ ID NO：1076核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQ IDNO：1076核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“B2758-蛋白”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：1105所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“修饰甲基化酶HemK家族蛋白”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“修饰甲基化酶HemK家族蛋白”活性且由包含SEQ ID NO：1105核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQ ID NO：1105核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“修饰甲基化酶HemK家族蛋白”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：1206所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“YDR049W-蛋白”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“YDR049W-蛋白”活性且由包含SEQ IDNO：1206核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如细胞质定位的)、由包含SEQ ID NO：1206核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“YDR049W-蛋白”的活性，赋予了低温耐受性。
尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成由包含SEQ ID NO：1245所示核酸分子的基因编码的基因产物的活性，例如具有“3-磷酸甘油酸脱氢酶”的活性，赋予了增加的产量，例如增加的产量相关性状。还观察到在拟南芥中增加或生成具有所述“3-磷酸甘油酸脱氢酶”活性且由包含SEQ IDNO：1245核酸序列的基因编码的基因产物的活性，与野生型对照相比，赋予了非生物环境胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。尤其是，已经观察到在拟南芥中增加或生成如表I第6栏所示定位的(例如质体定位的)、由包含SEQ ID NO：1245核酸序列的基因编码的基因产物的活性，例如具有“3-磷酸甘油酸脱氢酶”的活性，赋予了低温耐受性。
还观察到在拟南芥中增加或生成表VIIIa所示的YRP基因，例如衍生自表VIIIa所示核酸分子的核酸分子，的活性，与野生型对照相比，赋予了增加的养分利用效率，例如增加的氮利用效率。因而，在一个实施方案中，表VIIIa所示的核酸分子或表I所示的其同源物或表达产物用在本发明的方法中，从而与野生型对照相比，增加植物的养分利用效率，例如增加氮利用效率。
还观察到在拟南芥中增加或生成表VIIIb所示的YRP基因，例如衍生自表VIIIb所示核酸分子的核酸分子，的活性，与野生型对照相比，赋予了增加的胁迫耐受性，例如增加的低温耐受性。因而，在一个实施方案中，表VIIIb所示的核酸分子或表I所示的其同源物或表达产物用在本发明的方法中，从而与野生型对照相比，增加植物的胁迫耐受性，例如增加低温耐受性。
还观察到在拟南芥中增加或生成表VIIIc所示的YRP基因，例如衍生自表VIIIc所示核酸分子的核酸分子，的活性，与野生型对照相比，赋予了增加的胁迫耐受性，例如增加的周期性干旱耐受性。因而，在一个实施方案中，表VIIIc所示的核酸分子或表I所示的其同源物或表达产物用在本发明的方法中，从而与野生型对照相比，增加植物的胁迫耐受性，例如增加周期性干旱耐受性。
还观察到在拟南芥中增加或生成表VIIId所示的YRP基因，例如衍生自表VIIId所示核酸分子的核酸分子，的活性，与野生型对照相比，赋予了增加的固有产量，例如标准条件下增加的生物量，例如在非不足或非胁迫的条件下增加的生物量。因而，在一个实施方案中，表VIIId所示的核酸分子或表I所示的其同源物或表达产物用在本发明的方法中，从而与野生型对照相比，增加植物的固有产量，例如在标准条件下增加产量，例如在非不足的或非胁迫的条件下增加生物量。
术语“表达”是指编码性基因区段或基因的转录和/或翻译。原则上，所得的产物是mRNA或蛋白质。然而，表达产物也可包括功能性RNA，例如，反义核酸、tRNA、snRNA、rRNA、RNAi、siRNA、核酶等。表达可以是系统、局部或暂时性的，例如局限于某些细胞类型、组织器官或细胞器或时间阶段。
在一个实施方案中，本发明的方法包括一个或多个如下步骤：
(a)稳定赋予YRP(例如由本发明核酸分子编码的蛋白质)或本发明多肽增加的表达的蛋白质，其中所述本发明多肽具有选自3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白的本文所述活性，并赋予与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他提及的产量相关性状；
(b)稳定赋予YRP(例如由本发明核酸分子编码的蛋白质或其同源物)或编码本发明多肽的mRNA增加的表达的mRNA，其中所述本发明多肽具有选自(a)中所述活性组的本文所述活性，且与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他提及的产量相关性状；
(c)增加赋予YRP(例如由本发明核酸分子编码的蛋白质)或本发明多肽增加的表达的蛋白质的比活，或降低对本发明多肽的抑制性调控；
(d)生成或增加内源或人工转录因子的表达，所述转录因子介导赋予YRP(例如由本发明核酸分子编码的蛋白质)或本发明多肽增加的表达的蛋白质的表达，其中所述本发明多肽具有选自(a)中所述活性组的本文所述活性，且与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他提及的产量相关性状；
(e)通过向生物或其部分添加一种或多种外源诱导因子，刺激赋予YRP(例如由本发明核酸分子编码的蛋白质)或本发明多肽增加的表达的蛋白质的活性，其中所述本发明多肽具有选自(a)中所述活性组的本文所述活性，并与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他提及的产量相关性状；
(f)表达编码赋予YRP(例如由本发明核酸分子编码的蛋白质)或本发明多肽增加的表达的蛋白质的转基因，其中所述本发明多肽具有选自(a)中所述活性组的本文所述活性，并与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他提及的产量相关性状；和/或
(g)增加赋予YRP(例如由本发明核酸分子编码的蛋白质)或本发明多肽的编码核酸分子增加的表达的基因的拷贝数，其中所述本发明多肽具有选自(a)中所述活性组的本文所述活性，并与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他提及的产量相关性状；
(h)通过添加正表达元件或除去负表达元件而增加编码YRP(例如本发明多肽或其同源物)的内源基因的表达，例如可利用同源重组向启动子中引入正调控元件像用于植物的35S增强子或从调控区除去阻遏元件。更多的基因转换方法可用来破坏阻遏元件或增强正元件的活性——正元件可通过T-DNA或转座子诱变随机引入植物中，并可鉴定其中正元件已经整合在本发明基因附近、由此增强其表达的株系；和/或
(i)调节植物的生长条件，从而增强YRP(例如本发明的蛋白质)编码基因或蛋白质自身的表达或活性；
(j)从天然或诱变来源选择具有特别高活性的本发明蛋白质的生物，并将其育种成靶生物，例如原种(elite)作物。
优选地，本发明的核酸分子编码所述mRNA，和/或所述赋予蛋白质增加的表达的蛋白质(单独地或连接于转运核酸序列或转运肽编码核酸序列)，或具有本文所述活性的所述多肽(例如，在增加所编码多肽的表达或活性后，与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他提及的产量相关性状，或具有表II第3栏所示蛋白质多肽或其同源物的活性)。
一般而言，生物细胞或区室中mRNA或多肽的量与所编码蛋白质的量相关，由此与所述体积中所编码蛋白质的总体活性相关。所述相关并非总是线性的，该体积中的活性取决于所述分子的稳定性，或激活或抑制辅因子的存在。此外，酶的产物和终产物(educt)抑制众所周知，并描述在教科书例如Stryer，Biochemistry中。
一般而言，生物细胞或区室中mRNA、多核苷酸或核酸分子的量与所述体积中所编码蛋白质的量从而与所编码蛋白质的总体活性相关。所述相关并非总是线性的，该体积中的活性取决于所述分子的稳定性，所述分子的降解，或激活或抑制辅因子的存在。此外，酶的产物和终产物抑制众所周知，例如Zinser等“Enzyminhibitoren”/“Enzyme inhibitors”。
由本发明核酸分子编码的前述蛋白质和/或多肽的活性可由多种方式增加。例如，可以借助于增加基因产物的数量，例如通过增加表达率，像引入强启动子，或通过增加表达的mRNA的稳定性从而增加翻译率，和/或增加基因产物的稳定性从而减小蛋白质分解，而增加生物体或其部分像细胞中的活性。此外，可以以减小或增加反应速率或调节(减小或增加)对底物的亲和力的方式，影响酶的活性或转换。本发明多肽例如酶的催化中心的突变可调节酶的转换率，例如敲除必需氨基酸可导致减小或完全敲除酶的活性，或者缺失或突变调控因子结合位点可减小负调控像反馈抑制(或底物抑制，如果底物水平也增加的话)。可增加本发明酶的比活，从而增加转换率，或提高辅因子的结合。提高编码mRNA或蛋白质的稳定性也可增加基因产物的活性。对活性的刺激也落在术语“增加的活性”的范围之内。
而且，可以修饰对前述核酸序列的调控，从而增加基因表达。这可有利地通过异源调控序列或通过修饰例如突变存在的天然调控序列实现。这些有利的方法也可以彼此组合。
一般而言，生物或其部分、尤其是植物细胞或植物细胞的细胞器、植物、或植物组织或其部分、或微生物中基因产物的活性可通过增加所述生物或其部分中该特定编码mRNA或相应蛋白质的量来增加。“蛋白质或mRNA的量”应理解为表示生物、特别是植物、组织、细胞或细胞区室中多肽或mRNA分子的分子数量。蛋白质的量“增加”表示与野生型、对照或参照相比，生物、特别是植物、组织、细胞或细胞区室例如细胞器像质体或线粒体或其部分中所述蛋白质的分子数量的定量增加，例如通过下文所述的方法之一。
分子数量的增加优选达到至少1％，优选达到10％以上，更优选达到30％或以上，特别优选达到50％、70％或以上，极特别优选达到100％，最优选达到500％或以上。不过，从头表达也视为本发明的主题。
调节，即增加，可因内源或外源因素引起。例如，生物或其部分中活性的增加可因在培养基或营养液中添加基因产物或前体或激活物或激动剂而引起，或可因向生物体中瞬时或稳定引入所述物质而引起。此外，此类增加可通过将本发明的核酸序列或编码的蛋白质引入到正确的细胞区室中而实现，例如通过转化和/或靶向，分别引入到细胞核或胞质中或引入到质体中。
出于说明本发明的目的，术语“胞质”应指在不添加非天然的转运肽编码序列的情况下表达本发明的核酸。非天然的转运肽编码序列是并非本发明核酸的天然部分的序列，而是通过例如在实施例中“质体靶向表达”部分所述的分子操作步骤添加的。因此，术语“胞质”不应排除本发明核酸序列的产物因其天然存在的序列特性而靶向定位到任何细胞区室。
在一个实施方案中，与相应例如未转化的野生型植物细胞相比，植物或其部分、例如细胞、组织、器官、细胞器、细胞质等中增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状，通过增加本发明多肽的内源水平来实现。从而在本发明的一个实施方案中，本发明涉及其中增加编码本发明多核苷酸或核酸分子的基因的基因拷贝数的方法。此外，本发明多肽的内源水平可例如通过调节所述多肽的转录或翻译调控而增加。
在一个实施方案中，植物或其部分中增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状，可通过靶向或随机诱变本发明的内源基因而改变。例如可利用同源重组向启动子中引入正调控元件像用于植物的35S增强子或从调控区除去阻遏元件。另外，基因转化法像Kochevenko和Willmitzer(Plant Physiol.132(1)，174(2003))及其中引述的文献所述的方法可用来破坏阻遏元件或增强正调控元件的活性。
此外，正元件可通过T-DNA或转座子诱变随机引入(植物)基因组中，并可筛选其中正元件已经整合在本发明基因附近、由此增强其表达的株系。通过随机整合增强子元件来激活植物基因已经由Hayashi等(Science 258，1350(1992))或Weigel等(Plant Physiol.122，1003(2000))及其中引述的其他文献描述。
鉴定在目的基因附近的插入(其最终携带激活元件)的反向遗传策略已经在多种情况下描述，例如Krysan等(Plant Cell 11，2283(1999))；Sessions等(Plant Cell 14，2985(2002))；Young等(Plant Physiol.125，513(2001))；Koprek等(Plant J.24，253(2000))；Jeon等(Plant J.22，561(2000))；Tissier等(Plant Cell 11，1841(1999))；Speulmann等(Plant Cell 11，1853(1999))。简言之，自大的T-DNA或转座子诱变植物群的所有植物收获材料，并制备基因组DNA。然后遵循如Krysan等(Plant Cell 11，2283(1999))所述的特定构造体系，合并基因组DNA。然后通过检测插入诱变剂(例如，T-DNA或转座子)和目的基因的组合的特异性多重PCR反应，筛选基因组DNA合并物。由此，利用T-DNA或转座子边界引物和基因特异性引物的特异性组合来对DNA合并物进行PCR反应。引物设计的一般原则可再次参见Krysan等(Plant Cell 11，2283(1999))。对更低水平的DNA合并物进行再筛选可以导致鉴定到目的基因被插入诱变剂激活的个体植物。
增强正调控元件或者破坏或弱化负调控元件也可以通过常用诱变技术实现：产生化学或辐照突变群是常用技术且为技术人员已知。用于植物的方法由Koorneef等(Mutat Res.Mar.93(1)(1982))和其中引述的文献、以及Lightner和Caspar在“Methods in Molecular Biology”82卷中描述。这些技术通常诱导点突变，可利用诸如TILLING(Colbert等，Plant Physiol，126，(2001))等技术在任何已知基因中鉴定该点突变。
因此，当借助同源重组、Tilling方法或基因转换法修饰编码赋予本发明多肽增加的表达的多肽的内源基因、特别是包含本发明核酸分子的基因时，可增加表达水平。还可以如本文所述向本发明的核酸序列添加靶向序列。
当期望时，除了靶向序列或其部分之外，还可以将调控序列有效连接于内源蛋白质的编码区，并控制其转录和翻译或者编码mRNA或所表达蛋白质的稳定性或降解。为了调节和控制表达，可以改变、添加或变更启动子、UTR、剪接位点、加工信号、多聚腺苷酸化位点、终止子、增强子、阻遏子、转录后或翻译后修饰位点。例如，Hayashi等(Science 258，1350(1992))或Weigel等(Plant Physiol.122，1003(2000))及其中引述的其他文献已经描述过通过随机整合增强子元件激活植物基因。例如，内源蛋白质的表达水平可通过将内源启动子替换成更强的转基因启动子、或者通过将内源3’UTR替换成提供更高稳定性的3’UTR而不变更编码区来调节。此外，转录调控可如实施例中所述通过引入人工转录因子来调节。可选的启动子、终止子和UTR在下文描述。
具有上述活性(例如具有表II第3栏所示蛋白质或本发明多肽的活性，例如与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，在细胞质和/或细胞器像质体中增加表达或活性之后，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状)的内源多肽的激活，也可通过引入合成转录因子而增加，所述合成转录因子在靠近表II第3栏所示蛋白质的编码基因的编码区的位置结合并激活其转录。可构建嵌合锌指蛋白，其包含特异性DNA结合结构域和激活结构域，像例如单纯疱疹病毒的VP16结构域。特异性结合结构域可与表II第3栏所示蛋白质的编码基因的调控区结合。嵌合转录因子在生物特别是植物中的表达将引起表II第3栏所示蛋白质的特异性表达。其方法为技术人员已知，和/或公开在例如WO01/52620、Oriz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99，13290(2002)或Guan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，13296(2002)中。
在根据本发明方法的另一实施方案中，使用其中上述基因之一或上述核酸之一突变了的生物，其中所述突变导致，与未突变的蛋白质相比，编码的基因产物的活性较少或根本不受细胞因子的影响。例如，公知的酶活调控机制有底物抑制或反馈调控抑制。在相应序列中引入取代、缺失和添加一个或多个碱基、核苷酸或氨基酸的方法和技术在下文相应段落及其中所列的参考文献，例如Sambrook等，Molecular Cloning，Cold SpringHarbour，NY，1989中描述。通过利用包含鉴定结合位点和调控结构域的算法的计算机软件工具对本发明核酸分子或其表达产物的序列与现有技术进行比较，或通过向核酸分子或蛋白质中引入系统突变、并测定导致单位体积尤其是每个细胞中比活增加或活性增加的那些突变，本领域技术人员将能够鉴定调控因子的结合位点和调控结构域。
因此在生物体中表达源自进化上远相关的生物的本发明核酸分子或本发明多肽可能是有利的，例如像在真核宿主中应用原核基因，因为在这些情况下，宿主细胞的调控机制可能不削弱基因或其表达产物的活性(细胞活性或比活)。
可以以如下方式引入突变，所述方式不导致不利地影响增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状。
基因或其基因产物的调控受到较少的影响，应理解为表示减小的对酶活的调控，从而导致基因或其产物的比活或细胞活性增加。酶活增加应理解为表示与起始生物相比酶活增加至少10％，有利地至少20、30或40％，特别有利地至少50、60或70％。这导致与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状。
通过本发明，能够实施上述方法，从而增加产量、例如产量相关性状、例如增强非生物环境胁迫耐受性、例如干旱耐受性和/或低温耐受性和/或养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状，其中尤其是增加低温耐受性。在另一实施方案中，通过本发明，能够实施上述方法，从而增加非生物胁迫耐受性、尤其是低温耐受性和/或水利用效率、且同时增加养分利用效率、尤其是氮利用效率。在另一实施方案中，通过本发明，能够实施上述方法，从而在无氮不足以及无胁迫的条件下增加产量。在另一实施方案中，通过本发明，能够实施上述方法，从而在无氮不足以及无胁迫的条件下增加养分利用效率、尤其是氮利用效率以及产量。在优选的实施方案中，通过本发明，能够实施上述方法，从而增加非生物胁迫耐受性、尤其是低温耐受性和/或水利用效率、且同时增加养分利用效率、尤其是氮利用效率以及固有产量。在一个实施方案中，在无氮不足以及无胁迫的条件下增加产量。
本发明并不限于特定的核酸、特定的多肽、特定的细胞类型、特定的宿主细胞、特定的条件或特定的方法等，而是可以多种多种，且其中的众多形式和变通形式对本领域技术人员将会是显而易见的。还应当理解本文所用的术语仅仅用于举例说明具体实施方案的目的而并非旨在限制。
本发明还涉及分离的核酸，其包含选自下组的核酸分子：
(a)编码1号申请中表II B第7栏所示多肽的核酸分子；
(b)1号申请中表I B第7栏所示的核酸分子；
(c)核酸分子，其由于遗传密码简并性可由1号申请中表II第5或7栏所示的多肽序列获得，且与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状；
(d)核酸分子，其与包含1号申请中表I第5或7栏所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％的同一性，优选至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一性，且与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状；
(e)核酸分子，其编码的多肽与(a)、(b)、(c)或(d)中核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％的同一性，优选至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一性，并具有包含1号申请中表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性，且与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状；
(f)核酸分子，其与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中的核酸分子在严格杂交条件下杂交，且与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状；
(g)核酸分子，其编码的多肽可借助于针对(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中核酸分子之一编码的多肽所制备的单克隆或多克隆抗体分离，且其具有包含1号申请中表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；
(h)核酸分子，其编码的多肽包含1号申请中表IV第7栏所示的共有序列或一个或多个多肽基序，且优选地具有包含1号申请中表II或IV第5栏所示多肽的蛋白质所呈现的活性；
(i)核酸分子，其编码的多肽具有1号申请中表II第5栏所示蛋白质所呈现的活性，且其与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状；
(j)核酸分子，其包含通过利用1号申请中表III第7栏的引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得的多核苷酸，且优选地具有包含1号申请中表II或IV第5栏所示多肽的蛋白质所呈现的活性；和
(k)核酸分子，其可通过在严格杂交条件下、用包含(a)或(b)中核酸分子的互补序列的探针或用其片段来筛选适宜的核酸文库而获得，所述片段具有与(a)至(e)中所表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt、500nt、750nt或1000nt，且其编码具有包含1号申请中表II第5栏所示多肽的蛋白质所呈现的活性的多肽。
在一个实施方案中，根据(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)和(k)的核酸分子与1号申请中表I A第5或7栏所示序列有至少一个或多个核苷酸不同，且优选其编码的蛋白质与1号申请中表II A第5或7栏所示蛋白质序列有至少一个或多个氨基酸不同。
在一个实施方案中，本发明涉及前述序列的同源物，其可有利地分离自酵母、真菌、病毒、藻类、细菌，例如醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti(醋杆菌亚属))；嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)；不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)；放线杆菌属物种(Actinobacillus sp)；杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；产水菌(Aquifex aeolicus)；化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)；紫苑黄化植原体(Aster yellows phytoplasma)；芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)；双歧杆菌属物种(Bifidobacterium sp.)；伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；扩展短杆菌(Brevibacterium linens)；马耳他布鲁氏菌(Brucella melitensis)；巴克纳氏菌属物种(Buchnera sp.)；溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)；新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)；衣原体属物种(Chlamydia sp.)；嗜衣原体属物种(Chlamydophilasp.)；泥生绿菌(Chlorobium limicola)；啮齿柠檬酸杆菌(Citrobacterrodentium)；梭菌属物种(Clostridium sp.)；睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)；棒状杆菌属物种(Corynebacterium sp.)；伯氏考克斯体(Coxiellaburnetii)；耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)；节瘤拟杆菌(Dichelobacter nodosus)；鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)；肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)；红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；大肠杆菌(E.coli)；黄杆菌属物种(Flavobacterium sp.)；土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)；弗兰克氏菌属物种(Frankia sp.)CpI1；具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)；嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)；氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)；嗜血杆菌属物种(Haemophilus sp.)；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)；乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；李斯特菌属物种(Listeria sp.)；溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)；百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)；(Methylophaga thalassica)；铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)；微颤菌属物种(Microscilla sp.)PRE1；莫拉氏菌属物种(Moraxella sp.)TA144；分枝杆菌属物种(Mycobacterium sp.)；支原体属物种(Mycoplasma sp.)；奈瑟菌属物种(Neisseria sp.)；亚硝化单胞菌属物种(Nitrosomonas sp.)；念珠藻属物种(Nostoc sp.)PCC 7120；溶芳烃新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumaromaticivorans)；酒酒球菌(Oenococcus oeni)；柠檬泛菌(Pantoea citrea)；多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)；戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)；坑形席藻(Phormidium foveolarum)；植原体属物种(Phytoplasma sp.)；鲍氏织线藻(Plectonema boryanum)；栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)；丙酸杆菌属物种(Propionibacterium sp.)；普通变形菌(Proteus vulgaris)；假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)；雷尔氏菌属物种(Ralstonia sp.)；根瘤菌属物种(Rhizobium sp.)；马红球菌(Rhodococcusequi)；海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)；立克次体属物种(Rickettsiasp.)；鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer)；黄色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)；沙门氏菌属物种(Salmonella sp.)；反刍兽月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)；嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)；志贺氏菌属物种(Shigella sp.)；苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)；葡萄球菌属物种(Staphylococcus sp.)；链球菌属物种(Streptococcus sp.)；链霉菌属物种(Streptomyces sp.)；聚球藻属物种(Synechococcus sp.)；集胞藻属物种(Synechocystis sp.)PCC 6803；海栖热袍菌(Thermotoga maritima)；密螺旋体属物种(Treponema sp.)；解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)；苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；耶尔森氏菌属物种(Yersinia sp.)；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，优选沙门氏菌属物种或大肠杆菌或植物，优选来自酵母，例如来自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，或植物，例如，拟南芥、玉蜀黍、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、琉璃苣、向日葵、亚麻子、樱草、油菜籽、芸苔和芜菁、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、茄属植物例如马铃薯、烟草、茄子和番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、灌木植物，例如咖啡、可可、茶树、柳属物种、乔木例如油椰、椰子、多年生草本植物、例如黑麦草和羊茅草、以及饲料作物，例如苜蓿和三叶草，以及来自例如云杉、松树或冷杉。更优选前述序列的同源物可分离自酿酒酵母、大肠杆菌或集胞藻属物种或植物，优选欧洲油菜(Brassica napus)、大豆(Glycine max)、玉蜀黍(Zea mays)、棉花或水稻(Oryza sativa)。
本发明的蛋白质优选通过重组DNA技术产生。例如，将编码蛋白质的核酸分子克隆到表达载体、例如文库载体中，将表达载体引入到宿主细胞例如拟南芥野生型NASC N906或参见下文实施例中所述的任何其他植物细胞中，并在所述宿主细胞中表达蛋白质。双元载体的实例有pBIN19、pBI101、pBinAR、pGPTV、pCAMBIA、pBIB-HYG、pBecks、pGreen或pPZP(Hajukiewicz，P.等Plant Mol.Biol.25，989(1994)和Hellens等Trends in Plant Science 5，446(2000))。
在一个实施方案中，本发明的蛋白质优选在细胞区室例如质体中产生。将核酸引入到质体中以及在此区室中产生蛋白质的方法为本领域技术人员已知，并且也已经在本申请中说明。在一个实施方案中，本发明的多肽是表达后如表II第6栏所示定位的蛋白质，例如非靶向的、线粒体或质体定位，例如与上文所述用于质体定位的转运肽融合。
在另一实施方案中，产生本发明的蛋白质而没有其他靶向信号(例如本文所述的那些)，例如在细胞的细胞质中产生。在细胞质中产生蛋白质的方法为本领域技术人员已知。产生无人工靶向的蛋白质的方法为本领域技术人员已知。
有利地，将根据本发明的核酸序列或基因构建体与至少一个报告基因一起克隆到表达盒中，其借助于载体引入到生物体中或直接引入到基因组中。此报告基因应当允许借助生长、荧光、化学、生物发光或耐受性测定法或借助光度计测量而容易地检测。可提及的报告基因的实例有抗生素或除草剂耐受性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、糖或核苷酸代谢基因或生物合成基因，例如Ura3基因、Ilv2基因、萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、gfp基因、2-脱氧葡糖-6-磷酸磷酸酶基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、β-内酰胺酶基因、新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因(也称为乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、D-氨基酸代谢酶基因或BASTA(＝草胺膦耐受性)基因。这些基因允许容易地测量和定量转录活性从而测量和定量基因的表达。以这种方法可以鉴定呈现出不同生产力的基因组位置。
在优选的实施方案中，核酸构建体例如表达盒在上游即在编码序列5’端含有启动子，在下游即在3’端含有多聚腺苷酸化信号和任选的其他调控元件，其有效连接于具有表I第5和7栏所示SEQ ID NO核酸之一的该居间编码序列。有效连接表示启动子、编码序列、终止子和任选的其他调控元件相继排布，从而每一种调控元件能够在编码序列的表达中以预期方式实现其功能。在一个实施方案中，优选进行有效连接的序列是用于确保质体亚细胞定位的靶向序列。然而，也可以采用确保线粒体、内质网(＝ER)、细胞核、油体(oil corpuscle)或其他区室中亚细胞定位的靶向序列以及翻译启动子例如烟草花叶病毒的5’前导序列(Gallie等，Nucl.Acids Res.15 8693(1987))。
核酸构建体例如表达盒可以例如含有组成型启动子或组织特异性启动子(优选USP或napin启动子)、待表达的基因和ER滞留信号。关于ER滞留信号，优选采用KDEL氨基酸序列(赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)或KKX氨基酸序列(赖氨酸-赖氨酸-X-终止，其中X表示每一种其他已知的氨基酸)。
为在宿主生物例如植物中表达，表达盒有利地插入载体例如质粒、噬菌体或允许在宿主生物中最佳表达基因的其他DNA中。适宜质粒的实例有：大肠杆菌中pLG338、pACYC184、pBR系列例如pBR322、pUC系列例如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI；链霉菌中pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；芽孢杆菌中pUB110、pC194或pBD214；棒状杆菌中pSA77或pAJ667；真菌中pALS1、pIL2或pBB116；其他有利的真菌载体由Romanos M.A.等，Yeast 8，423(1992)和van denHondel，C.A.M.J.J.等[(1991)“Heterologous gene expression in filamentousfungi”]以及“More Gene Manipulations”in”Fungi”in Bennet J.W.&Lasure L.L.编辑396-428页，Academic Press，San Diego和“Gene transfersystems and vector development for filamentous fungi”[van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)in：Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.F.等编辑，1-28页，Cambridge University Press：Cambridge]描述。有利的酵母启动子的实例有2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。藻类或植物启动子的实例有pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、pVKH或pDH51(参见Schmidt，R.和Willmitzer，L.，Plant CellRep.7，583(1988)))。上文鉴定的载体或上文鉴定的载体的衍生物是小部分可以选择的可行质粒。更多的质粒为本领域技术人员公知且可见于例如“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等编辑Elsevier，Amsterdam-NewYork-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)。适宜的植物载体特别描述在“Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology”(CRC Press，Ch.6/7，71-119页)。有利的载体称作穿梭载体或双元载体，其在大肠杆菌和农杆菌中复制。
载体表示除质粒外本领域技术人员已知的所有其他载体，例如噬菌体、病毒例如SV40、CMV、杆状病毒、腺病毒、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、线性或环形DNA。这些载体可在宿主生物体中自主复制或染色体复制，优选染色体复制。
在载体的另一实施方案中，根据本发明的表达盒还可以有利地以线性DNA的形式引入到生物体中，并通过异源或同源重组整合到宿主生物的基因组中。这种线性DNA可以由线性化质粒组成，或仅由作为载体的表达盒、或根据本发明的核酸序列组成。
在另一有利的实施方案中，还可将根据本发明的核酸序列独自地引入到生物体中。
当除了根据本发明的核酸序列以外，欲向生物体中引入其他基因，则可以向生物体中引入与报告基因一起位于单个载体上的所有基因，或者引入各自分开地与报告基因在载体上的各单个基因，从而可同时或相继地引入不同的载体。
载体有利地含有至少一个拷贝根据本发明的核酸序列和/或根据本发明的表达盒(＝基因构建体)。
本发明还提供了分离的重组表达载体，其含有编码表II第5或7栏所示多肽的核酸，其中载体在宿主细胞中的表达导致与宿主细胞的野生型品种相比增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状。
如本文所用，术语“载体”是指能够运输与之相连的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其是指环形双链DNA环，其中可连入额外的DNA区段。另一类载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可连入病毒基因组中。某些载体能够在其引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞之后整合到宿主细胞染色体或细胞器中，由此随宿主或细胞器基因组一起复制。而且，某些载体能够指导与之有效连接的基因表达。此类载体在本文称为“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体往往是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。不过，本发明旨在包括其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)，它们可以发挥等同的功能。
本发明的重组表达载体含有本发明的核酸，其形式适合于在宿主细胞中表达所述核酸，这意味着重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞选择的一个或多个调控序列，该调控序列有效连接于待表达的核酸序列。如本文所用，就重组表达载体而言，“有效连接”旨在表示目的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中，或当载体引入到宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式与调控序列相连。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子及其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述在例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)以及Gruber和Crosby，in：Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson编辑，7章，89-108，CRC Press；Boca Raton，Florida中，包括其中的参考文献。调控序列包括指导核苷酸序列在许多类型宿主细胞中组成型表达的那些，以及指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中或在某些条件下表达的那些。本领域技术人员将会理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择、期望的多肽表达水平等因素。本发明的表达载体可引入到宿主细胞中，由此产生多肽或肽，包括由本文所述核酸编码的融合多肽或肽(例如，融合多肽、“产量相关蛋白质”或“YRP”等)。
本发明的重组表达载体可设计为在植物细胞中表达本发明的多肽。例如，YRP基因可在植物细胞中表达(参见Schmidt R.和Willmitzer L.，PlantCell Rep.7(1988)；Plant Molecular Biology and Biotechnology，C Press，Boca Raton，Florida，Chapter 6/7，71-119页(1993)；White F.F.，Jenes B.等，Techniques for Gene Transfer，in：Transgenic Plants，Vol.1，Engineeringand Utilization，Kung和Wu R.编辑，128-43，Academic Press：1993；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42，205(1991)以及其中引述的参考文献)。适宜的宿主细胞在Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press：San Diego，CA(1990)中进一步讨论。可选地，重组表达载体可在体外转录和翻译，例如利用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
多肽在原核细胞中的表达最常用含有指导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体进行。融合载体向其中编码的多肽添加多个氨基酸，通常在重组多肽的氨基末端但也可以在C-末端，或融合在多肽中的适宜区域中。此类融合载体一般有3个目的：1)增加重组多肽的表达；2)增加重组多肽的溶解度；和3)通过在亲和纯化中作为配体而辅助重组多肽的纯化。通常，在融合表达载体中于融合部分与重组多肽的结合处引入蛋白水解切割位点，以能够在纯化融合多肽之后使重组多肽与融合部分分离。此类酶及其关连识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。
作为举例，植物表达盒可安置在pRT转化载体((a)Toepfer等，Methods Enzymol.217，66(1993)，(b)Toepfer等，Nucl.Acids.Res.15，5890(1987))中。可选地，重组载体(＝表达载体)也可在体外转录和翻译，例如利用T7启动子和T7RNA聚合酶。
在原核细胞中采用的表达载体往往利用有或无融合蛋白质或融合寡肽的诱导型系统，其中这些融合可发生在N-末端和C-末端或蛋白质的其他有用的结构域中。此类融合载体通常具有如下目的：1)增加RNA表达率；2)增加可实现的蛋白质合成率；3)增加蛋白质的溶解度；4)或通过可用于亲和纯化的结合序列简化纯化。蛋白水解切割点也常常借助融合蛋白质引入，这允许切割融合蛋白质的一部分并纯化。此类蛋白酶识别序列由例如Xa因子、凝血酶和肠激酶识别。
典型有利的融合和表达载体有含有谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白或蛋白A的pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith D.B.和Johnson K.S.，Gene 67，31(1988))、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。
在一个实施方案中，本发明多肽的编码序列克隆到pGEX表达载体中以创建编码从N-末端到C-末端包含GST-凝血酶切割位点-X多肽的融合多肽的载体。融合多肽可利用谷胱甘肽-琼脂糖树脂通过亲和层析纯化。可通过用凝血酶切割该融合多肽而回收未与GST融合的重组PK YRP。大肠杆菌表达载体的其他实例有pTrc(Amann等，Gene 69，301(1988))和pET载体(Studier等，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89；Stratagene，Amsterdam，荷兰)。
自pTrc载体的靶基因表达依赖于宿主RNA聚合酶自杂合trp-lac融合启动子的转录。自pET 11d载体的靶基因表达依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的自T7 gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)从含有处于lacUV 5启动子转录控制下的T7 gn1基因的定居原噬菌体I提供。
在本发明的另一实施方案中，YRP在植物和植物细胞例如单细胞植物细胞(例如藻类)(参见Falciatore等，Marine Biotechnology 1(3)，239(1999)及其中的参考文献)以及来自高等植物的植物细胞(例如种子植物，例如作物植物)中表达，例如以由植物细胞再生植物。编码表II第5或7栏所示YRP的核酸分子可以通过任何方式“引入”到植物细胞中，包括转染、转化或转导、电穿孔、粒子轰击、农杆菌感染等。本领域技术人员已知的一种转化方法是将开花植物浸到农杆菌溶液中，其中农杆菌含有本发明的核酸，接着培育转化的配子。
转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的其他适宜方法可见于Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版编辑Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989，以及其他实验指南例如Methods inMolecular Biology，1995，44卷，Agrobacterium protocols，编辑Gartlandand Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey。由于增加的非生物环境胁迫耐受性和/或产量是希望在广泛种类的植物(像玉蜀黍、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽和芸苔、木薯、胡椒、向日葵和万寿菊、茄属植物像马铃薯、烟草、茄子和番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶树)、柳属物种、乔木(油椰、椰子)、多年生草本植物和饲料作物)中遗传的一般性状，故作为本发明的另一实施方案，这些作物植物也是优选的遗传工程靶植物。饲料作物包括但不限于冰草、虉草、雀麦、披碱草、早熟禾、鸭茅草、苜蓿、Salfoin、百脉根、瑞士三叶草、红三叶草和草木樨。
在本发明的一个实施方案中，用编码表II第5或7栏所示YRP的核酸分子转化植物通过农杆菌介导的基因转移实现。农杆菌介导的植物转化可利用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，Mol.Gen.Genet.204，383(1986))或LBA4404(Clontech)根癌农杆菌菌株实现。转化可通过标准转化和再生技术进行(Deblaere等，Nucl.Acids Res.13，4777(1994)，Gelvin，Stanton B.和Schilperoort Robert A，Plant Molecular Biology Manual，第二版Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，1995.-in Sect.，RingbucZentrale Signatur：BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick Bernard R.，Thompson John E.，Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Boca Raton：CRC Press，1993 360S.，ISBN 0-8493-5164-2)。例如，油菜籽可借助子叶或下胚轴转化法而转化(Moloney等，Plant CellReport 8，238(1989)；De Block等，Plant Physiol.91，694(1989))。进行农杆菌和植物选择的抗生素的应用取决于用于转化的双元载体和农杆菌菌株。油菜籽选择通常地利用卡那霉素作为可选择的植物标记来进行。农杆菌介导的亚麻基因转移可利用例如由Mlynarova等，Plant Cell Report 13，282(1994)所述的技术进行。另外，大豆转化可利用例如欧洲专利No.424 047、美国专利No.5,322,783、欧洲专利No.397687、美国专利No.5,376,543或美国专利No.5,169,770中所述的技术进行。玉蜀黍转化可通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或借助碳化硅纤维技术来实现(参见例如，Freeling和Walbot“The maize handbook”Springer Verlag：New York(1993)ISBN 3-540-97826-7)。玉蜀黍转化的具体实例见美国专利No.5,990,387，而小麦转化的具体实例可见PCT申请WO 93/07256。
根据本发明，引入的编码表II第5或7栏所示YRP的核酸分子当掺入到非染色体自主复制子中或整合到植物染色体或细胞器基因组中时，可以稳定维持在植物细胞中。可选地，引入的YRP可以存在于染色体外非复制载体中，瞬时表达或具有瞬时活性。
在一个实施方案中，可创建其中使YRP整合到染色体中的同源重组微生物，制备载体使之含有编码表II第5或7栏所示YRP的核酸分子的至少一部分，在该部分中已经引入了缺失、添加或取代，由此改变例如功能性破坏YRP基因。例如，该YRP基因可以是酵母基因像酿酒酵母基因，或细菌基因像大肠杆菌基因，或集胞藻基因，但也可以是来自相关植物或者甚至是来自哺乳动物或昆虫来源的同源物。可设计载体，使得在同源重组后导致编码表II第5或7栏所示YRP的内源核酸分子突变或以其他方式改变但仍然编码功能性多肽(例如，可改变上游调控区，由此改变内源YRP的表达)。在优选的实施方案中，本发明蛋白质的生物活性经同源重组而增加。为借助同源重组创建点突变，可在称为嵌合修复术(chimeraplasty)的技术之中使用DNA-RNA杂合体(Cole-Strauss等，Nucleic Acids Research 27(5)，1323(1999)和Kmiec，Gene TherapyAmerican Scientist.87(3)，240(1999))。小立碗藓中的同源重组方法也是本领域公知的，并考虑在本文使用。
在同源重组载体中，编码表II第5或7栏所示YRP的核酸分子中的改变的部分在其5’和3’端侧接额外的YRP基因核酸分子，以允许载体携带的外源YRP基因与微生物或植物中的内源YRP基因之间发生同源重组。额外侧接的YRP核酸分子的长度应足以与内源基因进行成功的同源重组。一般，载体中包括数百个碱基对直到上千碱基的侧接DNA(5’和3’端皆如此)。参见例如Thomas K.R.和Capecchi M.R.，Cell 51，503(1987)关于同源重组载体的描述或Strepp等，PNAS，95(8)，4368(1998)关于小立碗藓中基于cDNA的重组的描述。将载体引入到微生物或植物细胞中(例如，借助聚乙二醇介导的DNA摄取)，并利用本领域已知的技术选择其中引入的YRP基因已经与内源YRP基因同源重组的细胞。
不论是存在于染色体外非复制型载体中还是存在于整合到染色体中的载体中，编码表II第5或7栏所示YRP的核酸分子优选位于植物表达盒中。植物表达盒优选含有能够驱动在植物细胞中基因表达的调控序列，这些调控序列有效连接从而每个序列能够实现其功能，例如，通过多聚腺苷酸化信号的转录终止。优选的多聚腺苷酸化信号是来源于根癌农杆菌t-DNA的那些，例如Ti质粒pTiACH5的称为章鱼碱合酶的基因3(Gielen等，EMBO J.3，835(1984))或其功能等同物，但所有其他在植物中有功能活性的终止子也都是适宜的。由于植物基因表达十分常见地不受限于转录水平上，所以植物表达盒优选含有其他有效连接的序列，像翻译增强子，例如含烟草花叶病毒5’-非翻译前导序列的过驱动序列，以增加多肽/RNA比(Gallie等，Nucl.Acids Research 15，8693(1987))。植物表达载体的实例包括如下详述的那些：Becker D.等，Plant Mol.Biol.20，1195(1992)和Bevan M.W.，Nucl.Acid.Res.12，8711(1984)以及“Vectors for GeneTransfer in Higher Plants”in：Transgenic Plants，1卷，Engineering andUtilization，Kung and Wu R.编辑，Academic Press，1993，S.15-38。
“转化”在本文定义为将异源DNA引入到植物细胞、植物组织或植物中的方法。其可利用本领域公知的多种方法在天然或人工条件下发生。转化可以依赖于任何已知的将外来核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的方法。所述方法基于进行转化的宿主细胞来选择，并且可以包括但不限于：病毒感染、电穿孔、脂转染和粒子轰击。此类“转化的”细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的DNA能够作为自主复制的质粒或作为宿主染色体的一部分而复制。它们也包括在有限的时间段瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。转化的植物细胞、植物组织或植物应理解为不仅涵盖转化方法的终产物，而且涵盖其转基因子代。
术语“转化的”、“转基因的”和“重组的”是指其中已经引入了异源核酸分子的宿主生物，例如细菌或植物。核酸分子可稳定整合在宿主染色体中，或者核酸分子也可作为染色体外分子存在。此类染色体外分子可自主复制。转化的细胞、组织或植物应理解为不仅涵盖转化方法的终产物，而且涵盖其转基因子代。“未转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主是指野生型生物，例如细菌或植物，其不含异源核酸分子。
如本文所用的“转基因植物”是指含有插入在其细胞核基因组或细胞器基因组中的外来核苷酸序列的植物。其还涵盖子代，即T1、T2和后续子代或BC1、BC2和后续子代及其与非转基因的或其他转基因的植物的杂种。
宿主生物(＝转基因生物)有利地含有至少一个拷贝根据本发明的核酸和/或根据本发明的核酸构建体。
原则上，所有植物均可用作为宿主生物。优选的转基因植物选自例如：槭树科(Aceraceae)、漆树科(Anacardiaceae)、伞形科(Apiaceae)、菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、棕榈科(Arecaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、莎草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、唇形科(Labiaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、忍冬科(Carifolaceae)、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或禾本科(Poaceae)，且优选来自选自伞形科(Apiaceae)、菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、豆科(Fabaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茄科(Solanaceae)、百合科(Liliaceae)或禾本科(Poaceae)的植物。优选作物植物，例如有利地选自下组的植物：花生、油菜籽油菜、芸苔、向日葵、红花、橄榄、芝麻、榛、杏、鳄梨、月桂、南瓜/倭瓜、亚麻籽、大豆、阿月浑子、琉璃苣、玉蜀黍、小麦、黑麦、燕麦、高粱和粟、黑小麦、稻、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、茄子、苜蓿、以及多年生草本植物和饲料植物、油椰、蔬菜(芸苔属植物、根菜类、块茎类蔬菜、豆荚类蔬菜、果菜类、葱类蔬菜、叶菜类和茎菜类)、荞麦、菊芋、蚕豆、巢菜、兵豆、矮菜豆、羽扇豆、三叶草和紫苜蓿，这仅仅是其中的一些。
在本发明的一个实施方案中，转基因植物选自下组：谷物、大豆、油菜籽(包括油菜籽油菜、特别是芸苔和冬油菜籽油菜)、棉花、甘蔗和马铃薯，特别是玉米、大豆、油菜籽(包括油菜籽油菜、特别是芸苔和冬油菜籽油菜)、棉花、小麦和稻。
在本发明的另一实施方案中，转基因植物是裸子植物，特别是云杉、松树或冷杉。
在一个实施方案中，宿主植物选自槭树科(Aceraceae)、漆树科(Anacardiaceae)、伞形科(Apiaceae)、菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、棕榈科(Arecaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、莎草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、唇形科(Labiaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、忍冬科(Carifolaceae)、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或禾本科(Poaceae)，且优选为来自选自伞形科(Apiaceae)、菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、豆科(Fabaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茄科(Solanaceae)、百合科(Liliaceae)或禾本科(Poaceae)的植物。优选作物植物，特别是本文上面述及作为宿主植物的植物，例如上文述及的科和属，例如优选的物种：腰果(Anacardium occidentale)、金盏花(Calendula officinalis)、红花(Carthamus tinctorius)、菊苣(Cichorium intybus)、洋蓟(Cynara scolymus)、向日葵(Helianthus annus)、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)、细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)；胡萝卜(Daucus carota)；欧洲榛(Corylus avellana)、土耳其榛(Corylus colurna)、琉璃苣(Boragoofficinalis)；欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁(Brassica rapa ssp.)、野欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassica juncea)、Brassica juncea var.juncea、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、Brassica nigra、Brassica sinapioides、Melanosinapis communis、抱子甘蓝(Brassica oleracea)、拟南芥、凤梨(Anana comosus)、Ananasananas、凤梨(Bromelia comosa)、番木瓜(Carica papaya)、大麻(Cannabissative)、甘薯(Ipomoea batatus)、Ipomoea pandurata、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、Ipomoea fastigiata、Ipomoea tiliacea、Ipomoea triloba、Convolvulus panduratus、甜菜(Beta vulgaris)、Beta vulgaris var.altissima、Beta vulgaris var.vulgaris、Beta maritima、Beta vulgaris var.perennis、Betavulgaris var.conditiva、Beta vulgaris var.esculenta、笋瓜(Cucurbitamaxima)、灰籽南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)、油橄榄(Olea europaea)、Manihot utilissima、Janiphamanihot、Jatropha manihot.、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihotmanihot、Manihot melanobasis、Manihot esculenta、蓖麻(Ricinuscommunis)、豌豆(Pisum sativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、Pisum humile、紫苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicagovaria)、大豆(Glycine max)、大豆(Dolichos soja)、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、Glycine hispida、Phaseolus max、黄豆(Soja hispida)、大豆(Soja max)、椰子(Cocos nucifera)、茶藨子天竺葵(Pelargonium grossularioides)、Oleumcocoas、月桂(Laurus nobilis)、鳄梨(Persea americana)、落花生(Arachishypogaea)、亚麻(Linum usitatissimum)、Linum humile、奥地利亚麻(Linumaustriacum)、Linum bienne、窄叶亚麻(Linum angustifolium)、泻亚麻(Linumcatharticum)、金黄亚麻(Linum flavum)、大花亚麻(Linum grandiflorum)、Adenolinum grandiflorum、刘易斯亚麻(Linum lewisii)、那旁亚麻(Linumnarbonense)、宿根亚麻(Linum perenne)、宿根亚麻刘易斯变种(Linumperenne var.lewisii)、Linum pratense、Linum trigynum、石榴(Punicagranatum)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)、Gossypiumthurberi、香蕉(Musa nana)、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musaparadisiaca)、芭蕉属物种(Musa spp.)、油棕(Elaeis guineensis)、Papaverorientale、虞美人(Papaver rhoeas)、Papaver dubium、胡麻(Sesamumindicum)、Piper aduncum、Piper amalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、Piper auritum、萎叶(Piper betel)、毕澄茄(Piper cubeba)、Piper longum、胡椒(Piper nigrum)、Piper retrofractum、Artanthe adunca、Artantheelongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata、大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、鼠大麦(Hordeummurinum)、刺稃野大麦(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeumdistichon)、Hordeum aegiceras、六棱大麦(Hordeumhexastichon)、Hordeum hexastichum、Hordeum irregulare、普通大麦(Hordeum sativum)、刺稃野大麦(Hordeum secalinum)、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、石茅高粱(Sorghumhalepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、蜀黍(Sorghumvulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcussorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、Sorghumcaffrorum、垂穗高粱草(Sorghum cernuum)、Sorghum dochna、Sorghumdrummondii、硬高粱草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghumlanceolatum、多脉高粱草(Sorghum nervosum)、甜高粱(Sorghumsacch aratum)、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱(Sorghum vulgare)、石茅高粱(Holcus halepensis)、Sorghum miliaceummillet、稷(Panicum militaceum)、玉蜀黍(Zea mays)、普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、面包小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare)、咖啡属物种(Cofeaspp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)、大果咖啡(Coffea liberica)、辣椒(Capsicum annuum)、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米辣(Capsicum frutescens)、辣椒(Capsicum annuum)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茄(Solanummelongena)、番茄(Lycopersicon esculentum)、Lycopersiconlycopersicum、Lycopersicon pyriforme、红茄(Solanum integrifolium)、番柿(Solanum lycopersicum)、可可(Theobroma cacao)或大叶茶(Camelliasinensis)。
漆树科(Anacardiaceae)，例如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)，例如物种阿月浑子(Pistacia vera)[阿月浑子，开心果]、芒果(Mangifer indica)[芒果]或腰果(Anacardium occidentale)[腰果]；菊科(Asteraceae)，例如金盏花属(Calendula)、红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、Locusta、万寿菊属(Tagetes)、缬草属(Valeriana)，例如物种金盏花(Calendula officinalis)[金盏花]、红花(Carthamus tinctorius)[红花]、矢车菊(Centaurea cyanus)[矢车菊]、菊苣(Cichorium intybus)[蓝雏菊]、洋蓟(Cynarascolymus)[洋蓟]、向日葵(Helianthus annus)[向日葵]、莴苣(Lactuca sativa)、Lactuca crispa、Lactuca esculenta、Lactuca scariola L.ssp.Sativa、Lactuca scariolaL.var.integrata、Lactuca scariola L.var.integrifolia、Lactuca sativa subsp.Romana、Locusta communis、Valeriana locusta[莴苣]，香叶万寿菊(Tageteslucida)、万寿菊(Tagetes erecta)或细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)[万寿菊]；伞形科(Apiaceae)，例如胡萝卜属(Daucus)，例如物种胡萝卜(Daucuscarota)[胡萝卜]；桦木科(Betulaceae)，例如榛属(Corylus)，例如物种欧洲榛(Corylus avellana)或土耳其榛(Corylus colurna)[榛子]；紫草科(Boraginaceae)，例如琉璃苣属(Borago)，例如物种琉璃苣(Boragoofficinalis)[琉璃苣]；十字花科(Brassicaceae)，例如芸苔属(Brassica)、Melanosinapis、白芥属(Sinapis)、拟南芥属(Arabadopsis)，例如物种欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁(Brassica rapa ssp.)[芸苔，油菜籽油菜，甘蓝型油菜]、野欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassica juncea)、Brassica juncea var.juncea、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassicajuncea var.foliosa)、Brassica nigra、Brassica sinapioides、Melanosinapiscommunis[芥菜]、抱子甘蓝(Brassica oleracea)[饲料甜菜]或拟南芥；凤梨科(Bromeliaceae)，例如凤梨属(Anana)、凤梨属(Bromelia)，例如物种凤梨(Anana comosus)、Ananas ananas或凤梨(Bromelia comosa)[凤梨]；番木瓜科(Caricaceae)，例如番木瓜属(Carica)，例如物种番木瓜(Carica papaya)[番木瓜]；大麻科(Cannabaceae)，例如大麻属(Cannabis)，例如物种大麻(Cannabis sative)[大麻]，旋花科(Convolvulaceae)，例如番薯属(Ipomea)，旋花属(Convolvulus)，例如物种甘薯(Ipomoea batatus)、Ipomoea pandurata、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、Ipomoea fastigiata、Ipomoeatiliacea、Ipomoea triloba或Convolvulus panduratus[甘薯，红薯，野生马铃薯]，藜科(Chenopodiaceae)，例如甜菜属(Beta)，即物种甜菜(Betavulgaris)、Beta vulgaris var.altissima、Beta vulgaris var.Vulgaris、Betamaritima、Beta vulgaris var.perennis、Beta vulgaris var.conditiva或Betavulgaris var.esculenta[糖萝卜]；葫芦科(Cucurbitaceae)，例如南瓜属(Cucubita)，例如物种笋瓜(Cucurbita maxima)、灰籽南瓜(Cucurbitamixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)或南瓜(Cucurbita moschata)[南瓜，倭瓜]；胡颓子科(Elaeagnaceae)，例如胡颓子属(Elaeagnus)，例如物种油橄榄(Oleaeuropaea)[油橄揽]；杜鹃花科(Ericaceae)，例如山月桂属(Kalmia)，例如物种宽叶山月桂(Kalmia latifolia)、狭叶山月桂(Kalmia angustifolia)、小叶山月桂(Kalmia microphylla)、Kalmia polifolia、Kalmia occidentalis、Cistuschamaerhodendros或Kalmia lucida[美洲月桂，阔叶月桂，山月桂，spoonwood，狭叶山月桂，阿尔卑斯山月桂，沼泽月桂，西部沼泽月桂，湿地月桂]；大戟科(Euphorbiaceae)，例如木薯属(Manihot)、Janipha、麻疯树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)，例如物种Manihot utilissima、Janiphamanihot、Jatropha manihot.、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihotmanihot、Manihot melanobasis、Manihot esculenta[木薯(manihot)，竹芋，木薯(tapioca)，木薯(cassava)]或蓖麻(Ricinus communis)[蓖麻子，CastorOil Bush，Castor Oil Plant，Palma Christi，蓖麻]；豆科(Fabaceae)，例如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、音加属(Inga)、Pithecolobium、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、苜蓿属(Medicajo)、大豆属(Glycine)、镰扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、大豆属(Soja)，例如物种豌豆(Pisum sativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、Pisum humile[豌豆]、Albizia berteriana、合欢(Albizia julibrissin)、阔荚合欢(Albizialebbeck)、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Albizia berteriana、Albizziaberteriana、Cathormion berteriana、Feuillea berteriana、Ingafragrans、Pithecellobium berterianum、Pithecellobiumfragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizzia berteriana、Acaciajulibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosajulibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda julibrissin、Acacialebbeck、Acacia macrophylla、阔荚合欢(Albizia lebbeck)、Feuilleealebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosa speciosa[杂种洋苏木，丝树，东印度胡桃]，紫苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicago varia)[苜蓿]、大豆(Glycine max Dolichos soja)、宽叶蔓豆(Glycinegracilis)、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja hispida或大豆(Soja max)[大豆]；牻牛儿苗科科(Geraniaceae)，例如，天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum，例如物种椰子(Cocos nucifera)、茶藨子天竺葵(Pelargonium grossularioides)或Oleum cocois[椰子]；科本禾(Gramineae)，如甘蔗属例(Saccharum)，例如物种甘蔗(Saccharum officinarum)，胡桃科(Juglandaceae)，例如核桃属(Juglans)、Wallia例如物种核桃(Juglansregia)、Juglans ailanthifolia、山核桃(Juglans sieboldiana)、灰核桃(Juglanscinerea)、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃(Juglanscalifornica)、印度黑核桃(Juglans hindsii)、Juglans intermedia、Juglansjamaicensis、大核桃(Juglans major)、Juglans microcarpa、黑核桃(Juglans nigra)或Wallia nigra[核桃，黑胡桃，普通核桃，波斯核桃木，白核桃，灰核桃，黑核桃]；樟科(Lauraceae)，例如鳄梨属(Persea)、月桂属(Laurus)，例如物种月桂(Laurus nobilis)[月桂树，月桂，月桂(bay laurel)，甜月桂]，樟梨(Persea americana)，油梨(Persea americana)，Perseagratissima或Persea persea[鳄梨]；豆科(Leguminosae)，例如落花生属(Arachis)，例如物种落花生(Arachis hypogaea)[花生]；亚麻科(Linaceae)，例如亚麻属(Linum)、Adenolinum，例如物种亚麻(Linum usitatissimum)、Linum humile、奥地利亚麻(Linum austriacum)、Linum bienne、窄叶亚麻(Linum angustifolium)、泻亚麻(Linum catharticum)、金黄亚麻(Linumflavum)、大花亚麻(Linum grandiflorum)、Adenolinum grandiflorum、刘易斯亚麻(Linum lewisii)、那旁亚麻(Linum narbonense)、宿根亚麻(Linumperenne)、宿根亚麻刘易斯变种(Linum perenne var.lewisii)、Linum pratense或Linum trigynum[亚麻，亚麻子]；千屈菜科(Lythrarieae)，例如石榴属(Punica)，例如物种石榴(Punica granatum)[石榴]；锦葵科(Malvaceae)，例如棉属(Gossypium)，例如物种陆地棉(Gossypium hirsutum)、树棉(Gossypiumarboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)或Gossypium thurberi[棉花]；芭蕉科(Musaceae)，例如芭蕉属(Musa)，例如物种香蕉(Musa nana)，小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musaparadisiaca)、芭蕉属物种(Musa spp.)[香蕉]；柳叶菜科(Onagraceae)，例如Camissonia、月见草属(Oenothera)，例如物种月见草(Oenothera biennis)或Camissonia brevipes[樱草，晚樱草]；棕榈科(Palmae)，例如油棕属(Elacis)，例如物种油棕(Elaeis guineensis)[油棕]；罂粟科(Papaveraceae)，例如罂粟属(Papaver)，例如物种Papaver orientale、虞美人(Papaver rhoeas)、Papaverdubium[罂粟，东洋罂粟，角罂粟，田野罂粟，雪莉罂粟，田野罂粟，长穗罂粟，长荚罂粟]；胡麻科(Pedaliaceae)，例如胡麻属(Sesamum)，例如物种胡麻(Sesamum indicum)[胡麻]；胡椒科(Piperaceae)，例如胡椒属(Piper)、Artanthe、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia，例如物种Piper aduncum、Piperamalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、Piper auritum、萎叶(Piper betel)、毕澄茄(Piper cubeba)、Piper longum、胡椒(Piper nigrum)、Piperretrofractum、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata[番椒、竹叶椒]；禾本科(Poaceae)，例如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、蜀黍属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、稷属(Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)，例如物种大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、鼠大麦(Hordeum murinum)、刺稃野大麦(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、Hordeumaegiceras、六棱大麦(Hordeum hexastichon)、Hordeum hexastichum、Hordeum irregulare、普通大麦(Hordeum sativum)、刺稃野大麦(Hordeumsecalinum)[大麦，珍珠大麦，狐尾大麦，鼠大麦，草地大麦]，黑麦(Secalecereale)[黑麦]，燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avenabyzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)[燕麦]，两色蜀黍(Sorghum bicolor)、石茅高粱(Sorghum halepense)、甜高粱(Sorghumsaccharatum)、蜀黍(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcusbicolor、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghumarundinaceum、Sorghum caffrorum、垂穗高粱草(Sorghumcernuum)、Sorghum dochna、Sorghum drummondii、硬高粱草(Sorghumdurra)、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱草(Sorghumnervosum)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、Sorghumsubglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱(Sorghum vulgare)、石茅高粱(Holcus halepensis)、Sorghum miliaceum millet、稷(Panicummilitaceum)[高粱，粟]，稻(Oryza sativa)、Oryza latifolia[稻]，玉蜀黍(Zeamays)[玉米，玉蜀黍]，普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、面包小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticumvulgare)[小麦，面包小麦，普通小麦]，山龙眼科(Proteaceae)，例如澳洲坚果属(Macadamia)，例如物种全缘叶澳洲坚果(Macadamia intergrifolia)[澳洲坚果]；茜草科(Rubiaceae)，例如咖啡属(Coffea)，例如物种咖啡属物种(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)或大果咖啡(Coffea liberica)[咖啡]；玄参科(Scrophulariaceae)，例如毛蕊花属(Verbascum)，例如物种：毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、东方毛蕊花(Verbascum chaixii)、密花毛蕊花(Verbascum densiflorum)、Verbascumlagurus、长叶毛蕊花(Verbascum longifolium)、Verbascum lychnitis、黑毛蕊花(Verbascum nigrum)、Verbascum olympicum、Verbascum phlomoides、紫花毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或Verbascum thapsus[毛蕊花，白蛾毛蕊花，荨麻叶毛蕊花，密花毛蕊花，银毛蕊花，长叶毛蕊花，白毛蕊花，黑毛蕊花，希腊毛蕊花，橙毛蕊花，紫毛蕊花，灰白毛蕊花，大毛蕊花]；茄科(Solanaceae)，例如辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)，例如物种辣椒(Capsicum annuum)、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米辣(Capsicum frutescens)[胡椒]、辣椒(Capsicum annuum)[红辣椒]，烟草(Nicotiana tabacum)、花烟草(Nicotianaalata)、Nicotiana attenuata、光烟草(Nicotiana glauca)、Nicotiana langsdorffii、Nicotiana obtusifolia、Nicotiana quadrivalvis、Nicotiana repanda、黄花烟草(Nicotiana rustica)、Nicotiana sylvestris[烟草]，马铃薯(Solanum tuberosum)[马铃薯]，茄(Solanum melongena)[茄子]，番茄(Lycopersicon esculentum)、Lycopersiconlycopersicum、Lycopersicon pyriforme、红茄(Solanum integrifolium)或番柿(Solanum lycopersicum)[番茄]；梧桐科(Sterculiaceae)，例如可可属(Theobroma)，例如物种可可(Theobroma cacao)[可可]；山茶科(Theaceae)，例如山茶属(Camellia)，例如物种大叶茶(Camellia sinensis)[茶树]。
向生物例如植物中引入根据本发明的核酸、表达盒或载体原则上可通过本领域技术人员已知的所有方法进行。核酸序列的引入产生重组或转基因生物。
除非另有说明，如本文所用的术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换。除非另有说明，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本上下文中可互换。术语“序列”可以指多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，取决于术语“序列”使用的上下文。如本文所用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的多聚体形式。该术语仅指分子的一级结构。
因而，如本文所用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”包括双链和单链DNA和RNA。它们也包括已知类型的修饰，例如，甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸。优选本发明的DNA或RNA序列包含编码本文定义的多肽的编码序列。
“编码序列”是核苷酸序列，其当置于适当调控序列的控制之下时可以转录为mRNA和/或翻译成多肽。编码序列的边界由位于5’-末端的翻译起始密码子和位于3’-末端的翻译终止密码子界定。三联体taa、tga和tag为可互换的(常见)终止密码子。编码序列可包括但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，同时在某些情况下也可以存在内含子。
外来基因转移到植物基因组中称为“转化”。为此，描述用于转化和从植物组织或植物细胞再生植物的方法用来进行瞬时或稳定转化。适宜的方法有原生质体转化，通过聚乙二醇诱导的DNA摄取，利用基因枪的“生物弹射击”法--称为粒子轰击法，电穿孔，在DNA溶液中孵育干胚，微注射和农杆菌介导的基因转移。所述方法例如由Jenes B.等，Techniquesfor Gene Transfer，in：Transgenic Plants，Vol.1，Engineering andUtilization，编辑Kung S.D和Wu R.，Academic Press(1993)128-143以及Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42，205(1991)描述。待表达的核酸或构建体优选克隆到适合于转化根癌农杆菌的载体中，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12，8711(1984))。此类载体转化的农杆菌随之可用来以已知的方式转化植物，尤其是作物植物例如烟草植物，例如通过将擦伤的或切碎的叶子浸浴在农杆菌溶液中，然后在适宜的培养基上培养之。通过根癌农杆菌转化植物描述在例如
Figure BDA0000062525460001411
和Willmitzer，在Nucl.Acid Res.16，9877(1988)中，或可以例如从F.F.White，Vectors forGene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants中，第1卷，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页等获知。
转化了根据本发明的表达载体的农杆菌同样可以以本身已知的方式来转化植物，例如试验植物像拟南芥或作物植物例如谷物作物、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、芸苔、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡萝卜、柿子椒、油菜籽油菜、木薯(tapioca)、树薯(cassava)、葛根(arrow root)、万寿菊、苜蓿、莴苣和各种乔木、坚果和藤本物种，尤其是含油作物植物例如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油菜籽油菜、椰子、油椰、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆，或者尤其是玉米、小麦、大豆、稻、棉花和芸苔，例如通过在农杆菌液中浸浴擦伤的或切断的叶子，然后在合适的培养基上培养之。
可以通过本领域技术人员已知的所有方法再生遗传修饰的植物细胞。适当的方法可见上述Kung S.D.和Wu R.，Potrykus或和Willmitzer的出版物。
从而，本发明另一方面涉及转化了至少一种根据本发明的核酸序列、表达盒或载体的转基因生物，以及来自此类生物的细胞、细胞培养物、组织、部分--例如，植物生物的情况下叶子、根等--或繁殖材料。术语“宿主生物”、“宿主细胞”、“重组(宿主)生物””和“转基因(宿主)细胞”在本文可互换使用。当然这些术语不仅指特定的宿主生物或特定的靶细胞，而且指这些生物或细胞的子代或潜在子代。由于突变或环境效应，某些修饰可能在后代中产生，故这些后代不必然与亲本细胞完全相同，但尽管如此仍然涵盖在此处所用的术语范围内。
出于本发明的目的，“转基因”或“重组”就例如核酸序列而言表示含有根据本发明的核酸序列的表达盒(＝基因构建体、核酸构建体)或载体或由根据本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，所有这些构建体均通过遗传工程方法产生，其中：
(a)1号申请中表I第5或7栏所示核酸分子或其衍生物或其部分；或
(b)与(a)中所述核酸序列功能性连接的遗传控制序列，例如3’和/或5’遗传控制序列，例如启动子或终止子，或
(c)(a)和(b)；
并不见于其天然遗传环境，或者已经通过遗传工程方法修饰，其中修饰可以例如是一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒置或插入。天然遗传环境表示原始生物体中、或宿主生物体内、或基因组文库中存在的天然基因组或染色体座位。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选至少部分地保留。所述环境至少在核酸序列的一侧，且序列长度至少50bp，优选至少500bp，尤其优选至少1,000bp，最尤其优选至少5,000bp。天然存在的表达盒--例如本发明核酸序列的天然启动子与相应基因的天然存在着的组合--当通过非天然的、合成的(“人工”)方法例如诱变而被修饰时变成转基因表达盒。适当的方法描述在例如US5,565,350或WO 00/15815中。
用于根据本发明的核酸、表达盒或载体的适宜生物或宿主生物原则上有利地是适合于表达如上所述的重组基因的所有生物。可以提及的更多实例有植物，例如拟南芥属、菊科例如金盏花属或作物植物，例如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、亚麻、玉米、棉花、亚麻、油菜籽油菜、椰子、油椰、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆。
在本发明的一个实施方案中，用于根据本发明的核酸、表达盒或载体的宿主植物选自下组：玉米、大豆、油菜籽油菜(包括芸苔和冬油菜籽油菜)、棉花、小麦和稻。
本发明的另一目的涉及核酸构建体例如表达盒(其含有编码一个或多个表II所示多肽的一个或多个DNA序列，或包含一个或多个表I所示核酸分子，或与之杂交的编码序列或DNA序列)用于转化植物细胞、组织或植物部分的用途。
为此，根据启动子的选择，表I或II所示核酸分子或序列可在叶子、种子、节、根、茎或植物其他部分中特异性地表达。过表达例如表I所示序列的那些转基因植物、其繁殖材料、连同植物细胞、组织或其部分是本发明的另一目的。
而且，还可采用含有根据表I的核酸分子或序列的本发明表达盒或核酸序列或构建体来转化上文举例说明的生物，例如细菌、酵母、丝状真菌和植物。
在本发明的框架内，增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状是指，例如与非遗传修饰的原始植物相比，人工取得的产量增加的性状，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状，例如通过遗传修饰靶生物、以及因为在根据本发明的生物、有利地在根据本发明的或根据本发明方法产生的转基因植物中至少持续至少一个植物世代地功能性过表达表II中一个或多个多肽(序列)(例如由表I第5或7栏所示的相应核酸分子编码)和/或同源物而取得的性状。
此外，由表I第5或7栏所示的相应核酸分子编码的表II多肽序列和/或同源物的组成型表达是有利的。不过，另一方面，也可能期望诱导型表达。本发明的多肽序列可在细胞质或细胞器中表达，优选在宿主细胞、优选植物细胞的质体中表达。
由表I第5或7栏所示的相应核酸分子编码的表II序列和/或同源物的表达效率可例如在体外通过芽分生组织繁殖来确定。另外，可在温室试验中在试验植物上测试表II序列(由表I第5或7栏所示的相应核酸分子编码)和/或同源物在性质和水平上改变的表达、及其对产量的影响，例如对增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率的影响，以及对代谢途径性能的影响。
本发明的另一目的包括转基因生物，例如用含有表I第5或7栏所示本发明序列或与之杂交的DNA序列的表达盒转化的转基因植物，以及此植物的转基因细胞、组织、部分和繁殖材料。在本案中尤其优选转基因作物植物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大豆、稻、棉花、甜菜、油菜籽油菜和芸苔、向日葵、亚麻、大麻、蓟、马铃薯、烟草、番茄、木薯、树薯、葛根、苜蓿、莴苣和各种乔木、坚果和藤本物种。
在本发明的一个实施方案中，用含有或包含表I第5或7栏、尤其是表IIB所示本发明核酸分子或序列或与之杂交的DNA序列的表达盒转化的转基因植物选自：玉米、大豆、油菜籽油菜(包括芸苔和冬油菜籽油菜)、棉花、小麦和稻。
出于本发明的目的，植物是单子叶和双子叶植物、苔藓或藻类，特别是植物，例如在一个实施方案中是单子叶植物，或例如在另一实施方案中是双子叶植物。根据本发明的另一改进是如上所述的转基因植物，其含有根据本发明的核酸序列或构建体或根据本发明的表达盒。
不过，转基因也表示根据本发明的核酸位于生物基因组中的其天然位置上，但是该序列(例如编码序列或调控序列，例如启动子序列)与天然序列相比已经被修饰。优选转基因/重组理解为表示在基因组的非天然位置上发生表I所示一个或多个本发明核酸或分子的转录。在一个实施方案中，所述核酸或分子是同源表达。在另一实施方案中，所述核酸或分子是异源表达。表达可是瞬时表达或是稳定整合到基因组中的序列的表达。
根据本发明使用的术语“转基因植物”也指转基因植物的子代，例如T1、T2、T3及后继植物世代，或BC1、BC2、BC3及后继植物世代。因而，可培养根据本发明的转基因植物，并自交或与其他个体杂交以获得其它根据本发明的转基因植物。转基因植物也可以通过营养繁殖转基因植物细胞而获得。本发明还涉及转基因植物材料，其可由根据本发明的转基因植物群获得。此类材料包括植物细胞和某些组织、器官和植物部分(所有表现形式)，例如种子、叶子、花药、纤维、块茎、根、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获材料、植物组织、繁殖组织和细胞培养物，它们来自于目前的转基因植物和/或可用于产生转基因植物。根据本发明获得的任何转化的植物均可用于常规育种策略或体外植物繁殖以产生具有相同特征的其它转化的植物，和/或可用于向相同或相关物种的其他品种中引入相同的特征。此类植物也是本发明的一部分。由转化的植物获得的种子在遗传上也含有相同的特征，也是本发明的一部分。如前文所述，本发明原则上适用于可用本领域技术人员已知的任何转化方法转化的任何植物和作物。
有利的诱导型植物启动子有例如PRP1启动子(Ward等，Plant.Mol.Biol.22361(1993))、苯磺酰胺诱导型启动子(EP 388 186)、四环素诱导型启动子(Gatz等，Plant J.2，397(1992))、水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、脱落酸诱导型启动子(EP 335 528)以及乙醇或环己酮诱导型启动子(WO93/21334)。可有利地使用的植物启动子的其他实例有来自马铃薯的细胞质FBPase启动子、来自马铃薯的ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8，2445(1989))、来自大豆的磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶启动子(还请参阅基因库登录号U87999)或EP 249 676中所述的nodiene特异性启动子。
尤其有利的是在非生物胁迫条件出现时确保表达的那些启动子。尤其有利的是在低温条件出现时，例如在上文所定义的寒冷和/或冰冻温度出现时确保表达的那些启动子，例如用于表达表VIIIb所示的核酸分子。有利的是在养分利用度受限的条件下，例如出现氮源受限时(如果土壤中的氮或养分耗尽时)确保表达的那些启动子，例如用于表达表VIIIa所示的核酸分子或其基因产物。尤其有利的是在出现上文所定义的水不足时确保表达的那些启动子，例如用于表达表VIIIc所示的核酸分子或其基因产物。尤其有利的是在出现标准生长条件时，例如在无胁迫和无养分供应不足的条件下确保表达的那些启动子，例如用于表达表VIIId所示的核酸分子或其基因产物。
此类启动子为本领域技术人员已知，或者可从在上述条件下被诱导的基因中分离。在一个实施方案中，种子特异性启动子可用于单子叶或双子叶植物。
原则上所有天然启动子及其调控序列都可像上文所列的那些一样用于根据本发明的表达盒和根据本发明的方法。除此之外，也可以有利地应用合成启动子。在表达盒的制备方面，可操作多个DNA片段以获得核苷酸序列，其有益地以正确的方向阅读并配有正确的读框。为使DNA片段(＝根据本发明的核酸)彼此连接，可将衔接子或接头附于片段上。通常可以以转录方向提供启动子和终止子区域，其带有含有一个或多个限制性位点的接头或多接头用以插入所述序列。一般而言，接头具有1-10、大多1-8、优选2-6个限制性位点。一般而言，在调控区内接头的大小小于100bp、常常小于60bp、但至少5bp。启动子对于宿主生物例如宿主植物而言既可以是天然或同源的，也可以是外来或异源的。表达盒在5’-3’转录方向上含有启动子、表I所示的DNA序列和转录终止区。不同的终止区可以以任何期望的方式彼此交换。
同样如本文所用，术语“核酸”和“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及利用核苷酸类似物生成的DNA或RNA类似物。该术语也包括位于基因编码区3’和5’端的非翻译序列--编码区5’端上游至少约1000个核苷酸的序列和基因编码区3’端下游至少约200个核苷酸的序列。核酸分子可以是单链或双链，但优选是双链DNA。
“分离的”核酸分子是指该核酸分子与存在于该核酸分子的天然来源中的其他核酸分子基本上分离开。这意味着以重量计，其他核酸分子的存在量小于期望核酸的量的5％，优选以重量计小于2％，更优选以重量计小于1％，最优选以重量计小于0.5％。优选“分离的”核酸不含在所述核酸来源生物的基因组DNA中天然侧接所述核酸的序列(即，位于所述核酸5’和3’端的序列)中的一些。例如，在多个实施方案中，分离的、产量增加、例如低温抗性和/或耐受性相关蛋白质(YRP)编码核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb在所述核酸来源细胞的基因组DNA中天然侧接此核酸分子的核苷酸序列。而且，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，可不含与其天然相伴的一些其他细胞物质，或当通过重组技术产生时不含培养基，或当化学合成时不含化学前体或其他化学品。
本发明的核酸分子，例如编码YRP或其部分的核酸分子，可利用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息来分离，所述YRP或其部分赋予植物增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性和/或增加的养分利用效率，和/或增强的周期性干旱耐受性。例如，拟南芥YRP编码cDNA可分离自拟南芥c-DNA文库，或者可以利用表I所示序列之一的全部或部分，分别自集胞藻属物种、欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻c-DNA文库分离集胞藻属物种、欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻YRP编码cDNA。而且，包含表I序列之一的全部或部分的核酸分子可利用基于该序列设计的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应来分离。例如，可自植物细胞分离mRNA(例如，通过Chirgwin等，Biochemistry 18，5294(1979)的硫氰酸胍提取方法)，并利用反转录酶制备cDNA(例如，莫洛尼MLV反转录酶，可购自Gibco/BRL，Bethesda，MD；或AMV反转录酶，可购自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL)。用于聚合酶链式反应扩增的合成寡核苷酸引物可基于表I所示核苷酸序列之一来设计。本发明的核酸分子可利用cDNA或可选的基因组DNA作为模板以及使用适当的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩增。如此扩增的核酸分子可克隆到适当的载体中，并通过DNA序列分析来表征。此外，对应于YRP编码核苷酸序列的寡核苷酸可通过标准合成技术，例如利用自动化DNA合成仪来制备。
在一实施方案中，本发明分离的核酸分子包含表I所示编码YRP的核苷酸序列或分子之一(即“编码区”)，以及5’非翻译序列和3’非翻译序列。
而且，本发明的核酸分子可仅包含表I核酸序列或分子之一的编码区的一部分，例如，可用作为探针或引物的片段，或编码YRP生物活性部分的片段。
由本发明的YRP编码核酸分子编码的蛋白质的部分优选是本文所述的生物活性部分。如本文所用，术语YRP的“生物活性部分”旨在包括赋予植物增加的产量、例如增加或增强产量相关性状、例如增加低温抗性和/或耐受性的部分，例如结构域/基序，其参与在植物中增强养分利用效率例如氮利用效率和/或增加固有产量。为确定YRP或其生物活性部分是否导致植物增加的产量，例如增加的或增强的产量相关性状，例如增加的低温抗性和/或耐受性，可对包含YRP的植物进行分析。此类分析方法为本领域技术人员公知，如实施例中详述的那样。更具体地，编码YRP生物活性部分的核酸片段可通过分离表I核酸序列之一的部分，表达该编码的YRP的部分或肽(例如，通过体外重组表达)，并评估该编码的YRP的部分或肽的活性来制备。
YRP的生物活性部分涵盖在本发明范围内，并包括这样的肽，其包含来自YRP编码基因的氨基酸序列或者与YRP同源的蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列，其包括比全长YRP或与YRP同源的全长蛋白质更少的氨基酸，并呈现出YRP的至少一些酶活或生物活性。一般，生物活性部分(例如长度例如5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多个氨基酸的肽)包含具有YRP至少一种活性的结构域或基序。而且，可通过重组技术制备缺失了蛋白质其他区域的其他生物活性部分，并就本文所述的一种或多种活性进行评价。优选YRP的生物活性部分包括其具有生物活性的一个或多个选择的结构域/基序或部分。
术语“生物活性部分”或“生物活性”表示表II第3栏所示的多肽或所述多肽的部分，其仍然具有天然或起始酶或蛋白质至少10％或20％，优选30％、40％、50％或60％，特别优选70％、75％、80％、90％或95％的酶活或生物活性。
在根据本发明的方法中，在适当的情况下，可利用含有可掺入到DNA或RNA中的合成的、非天然的或修饰的核苷酸碱基的核酸序列或分子。所述合成的、非天然的或修饰的碱基可例如增加核酸分子在细胞外或内的稳定性。本发明的核酸分子可含有如前所述的相同修饰。
如本上下文所用，术语“核酸分子”还可以包含位于编码基因区3’端和5’端的非翻译序列或分子，例如编码区5’端上游至少500、优选200、特别优选100个核苷酸的序列，和编码区3’端下游至少100、优选50、特别优选20个核苷酸的序列。通常有利地仅选择编码区用于克隆和表达目的。
优选根据本发明方法中使用的核酸分子或本发明的核酸分子是分离的核酸分子。在一个实施方案中，本发明的核酸分子是在本发明方法中使用的核酸分子。
“分离的”多核苷酸或核酸分子与所述核酸分子天然来源中存在的其他多核苷酸或核酸分子分离开。分离的核酸分子可以是数kb的染色体片段，或优选是仅包含基因编码区的分子。从而，本发明分离的核酸分子可以包含5’和3’的邻近染色体区域或其他邻近的染色体区域，但优选不包含在所述核酸分子来源生物的基因组或染色体环境中天然侧接此核酸分子的此类序列(例如，邻近编码核酸分子5’-和3’-UTR的区域的序列)。在多个实施方案中，根据本发明的方法中使用的分离的核酸分子可以例如包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb在所述核酸分子来源细胞的基因组DNA中天然侧接此核酸分子的核苷酸序列。
本发明方法中使用的核酸分子例如本发明的多核苷酸或其部分，可利用分子生物学标准技术和本文提供的序列信息来分离。此外，例如，可借助于比较算法来鉴定在DNA或氨基酸水平上的同源序列或同源保守序列区域。前者可在标准杂交技术中用作为杂交探针(例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中所述的那些)，以分离可用于本发明方法的其它核酸序列。
另外，包含在本发明方法中使用的核酸分子的全长序列例如本发明多核苷酸或其部分的核酸分子，可以通过聚合酶链式反应，使用基于该序列或其部分的寡核苷酸引物来分离。例如，包含全长序列或其部分的核酸分子可通过聚合酶链式反应，使用基于该序列本身生成的寡核苷酸引物来分离。例如，可自植物细胞分离mRNA(例如，通过Chirgwin等，Biochemistry18，5294(1979)的硫氰酸胍提取方法)，并利用反转录酶制备cDNA(例如，莫洛尼MLV反转录酶，可购自Gibco/BRL，Bethesda，MD或AMV反转录酶，可获自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL)。
通过聚合酶链式反应用于扩增的合成寡核苷酸引物，例如表III第7栏所示的那些，可基于本文所示的序列，例如表I第5和7栏所示的序列或来自表II第5和7栏的序列，生成。
而且，可以通过与本发明核酸分子编码的多肽，尤其是与表I第5或7栏所示核酸分子编码的序列进行蛋白质序列比对来鉴定保守蛋白质，由之可获得保守区域进而是简并引物。保守区域是在不同来源的若干同源物的一个特定位置中显示出极小的氨基酸变化的区域。表IV第7栏所示共有序列和多肽基序来源于所述比对。而且，可以通过与本发明核酸分子编码的多肽，尤其是与表I第5或7栏所示核酸分子编码的序列进行蛋白质序列比对，自多个生物鉴定保守区域，由之可获得保守区域进而是简并引物。
在一个有利的实施方案中，在本发明的方法中，增加包含表IV第7栏所示共有序列或多肽基序或由之组成的多肽的活性，而在另一实施方案中，本发明涉及包含表IV第7栏所示共有序列或多肽基序或由之组成的多肽，其中少于20个，优选少于15或10个，优选少于9、8、7或6个，更优选少于5或4个，甚至更优选少于3个，甚至更优选少于2个，甚至更优选0个所示的氨基酸位置可替换成任何氨基酸。在一个实施方案中，不超过15％，优选10％，甚至更优选5％、4％、3％或2％，最优选1％或0％字母所示的氨基酸位置被替换成其他氨基酸。在一个实施方案中，少于20个，优选少于15或10个，优选少于9、8、7或6个，更优选少于5或4个，甚至更优选少于3个，甚至更优选少于2个，甚至更优选0个氨基酸插入到共有序列或蛋白质基序中。
共有序列由表II所列序列的多重比对获得。字母是单字母氨基酸代码，并表示该氨基酸在至少80％比对的蛋白质中是保守的，而字母X代表在至少80％比对的序列中不保守的氨基酸。共有序列始于比对中首个保守的氨基酸，止于所研究序列的比对中末个保守的氨基酸。给定的X数目表示保守氨基酸残基之间的距离，例如Y-x(21，23)-F表示在所有研究序列的比对中，比对中保守的酪氨酸和苯丙氨酸残基彼此之间相距最少21个且最多23个氨基酸残基。
由所有的序列鉴定了保守结构域，并利用标准Prosite符号子集来描述，例如，Y-x(21，23)-[FW]模式表示保守酪氨酸与苯丙氨酸或色氨酸相隔最少21个且最多23个氨基酸残基。模式必须与至少80％所研究的蛋白质匹配。保守模式用软件工具3.5.1版MEME或人工鉴定。MEME由美国圣地亚哥加利福尼亚大学计算科学与工程系(Dept.of Computer Scienceand Engeneering，University of California，San Diego，USA)的Timothy L.Bailey和Charles Elkan开发，并由Timothy L.Bailey和Charles Elkan(Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs inbiopolymers，Proceedings of the Second International Conference onIntelligent Systems for Molecular Biology，28-36页，AAAI Press，MenloPark，California，1994)描述。该独立运行程序的源代码可由圣地亚哥超级计算机中心(San Diego Supercomputer centre)(http://meme.sdsc.edu)公共获得。为用软件工具MEME来鉴定所有序列中的共同基序，应用如下设置：-maxsize 500000，-nmotifs 15，-evt 0.001，-maxw 60，-distance 1e-3，-minsites用于分析的序列数。MEME的输入序列是Fasta形式的未比对序列。以此软件版本的默认设置应用其他参数。保守结构域的Prosite模式用软件工具2.1版Pratt或人工生成。Pratt由挪威卑尔根大学信息学系(Dept.of Informatics，University of Bergen，Norway)的Inge Jonassen开发，并由Jonassen等(I.Jonassen，J.F.Collins和D.G.Higgins，Findingflexible patterns in unaligned protein sequences，Protein Science 4(1995)，1587-1595页；I.Jonassen，Efficient discovery of conserved patterns using apattern graph，1997年2月递交给CABIOS]描述。该独立运行程序的源代码(ANSI C)可由例如确立的生物信息中心像EBI(欧洲信息学研究所，European Bioinformatics Institute)公共获得。为用软件工具Pratt来生成模式，应用如下设置：PL(最大模式长度)：100，PN(最大模式符号数)：100，PX(最大连续X数)：30，FN(最大柔性间隔臂数)：5，FL(最大柔性)：30，FP(最大柔性产物)：10，ON(最大模式数)：50。Pratt的输入序列是经软件工具MEME鉴定为呈现出高相似性的蛋白质序列的独特区域。必须与生成的模式匹配的最小序列数(CM，最小匹配序列数)设置为所提供的序列的至少80％。此处未提及的参数以其默认设置应用。保守结构域的Prosite模式可用来搜索与该模式匹配的蛋白质序列。多家确立的生物信息学中心提供公共互联网端口，在数据库搜索中利用这些模式(例如，PIR(蛋白质信息源(Protein Information Resource)，位于乔治敦大学医学中心(Georgetown University Medical Center))或ExPASy(专家蛋白质分析系统))。可选地，有独立运行的软件可用，像Fuzzpro程序，其为EMBOSS软件包的一部分。例如，Fuzzpro程序不仅允许搜索精确的模式-蛋白质匹配，而且允许在进行的搜索中设置各种模糊。
比对利用ClustalW(1.83版)软件进行，并由Thompson等(NucleicAcids Research 22，4673(1994))描述。该独立运行程序的源代码可由德国海德尔堡的欧洲分子生物学实验室(European Molecular BiologyLaboratory；Heidelberg，Germany)公共获得。分析利用ClustalW v1.83的默认参数进行(空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.2；蛋白质矩阵：Gonnet；蛋白质/DNA endgap：-1；蛋白质/DNA gapdist：4)。
然后可利用简并引物通过PCR扩增新蛋白质的片段，所述新蛋白质具有上述活性，例如在增加表达或活性之后，与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，尤其是增强的非生物环境胁迫耐受性，例如低温耐受性、周期性干旱耐受性、水利用效率、养分(例如氮)利用效率和/或增加的固有产量，或者具有表II第3栏所示蛋白质或来自其他生物的本发明多肽的其它功能同源物的活性。
然后可利用这些片段作为杂交探针分离完整的基因序列。作为备选，可通过RACE-PCR分离缺少的5’和3’序列。根据本发明的核酸分子可利用cDNA或者作为备选利用基因组DNA作为模板以及使用适宜的寡核苷酸引物按照标准PCR扩增技术来扩增。如此扩增的核酸分子可克隆到适宜的载体中，并通过DNA序列分析来表征。对应于所述方法中使用的核酸分子之一的寡核苷酸可通过标准合成方法，例如利用自动化DNA合成仪来生成。
有利地用于根据本发明方法的核酸分子可基于其与本文公开的核酸分子的同源性，利用所述序列或其部分作为杂交探针或生成杂交探针，并按照标准杂交技术在严格杂交条件下来分离。在此，可以应用例如分离的一个或多个如下核酸分子，所述核酸分子长度至少15、20、25、30、35、40、50、60或更多个核苷酸，优选至少15、20或25个核苷酸，并且其可以在严格条件与上述核酸分子(尤其是，包含本发明方法中使用的核酸分子或编码本发明中使用的蛋白质的核酸分子或者本发明核酸分子的核苷酸序列的那些)杂交。也可以应用具有30、50、100、250或更多核苷酸的核酸分子。
术语“同源”表示相应的核酸分子或编码的蛋白质在功能上和/或结构上等同。与上文所述核酸分子同源的核酸分子和所述核酸分子的衍生物是例如所述核酸分子的变异，所述变异为具有相同生物功能(尤其是编码具有相同或基本上相同的生物功能的蛋白质)的修饰。它们可以是天然存在的变异例如来自其他植物品种或物种的序列或者是突变。这些突变可以天然存在或者可以通过诱变技术获得。等位基因变异可以是天然存在的等位基因变体，以及合成产生的或遗传工程化的变体。结构等同体可例如通过测试所述多肽与抗体的结合或者基于计算机的预测来鉴定。结构等同体具有相似的免疫学特征，例如包含相似的表位。
“杂交”表示这样的核酸分子在常规杂交条件、优选在严格条件下，例如如Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中所述的条件下，杂交。
根据本发明，本发明核酸的DNA以及RNA分子可用作为探针。进而，作为模板用于鉴定功能同源物，可进行Northern印迹试验以及Southern印迹试验。Northern印迹试验有利地提供有关表达的基因产物的更多信息：例如，表达模式、加工步骤的发生，像剪接和加帽等。Southern印迹试验提供有关编码本发明核酸分子的基因的染色体定位和组织的另外信息。
严格杂交条件的一个优选非限制性的实例是在大约45℃6×氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中杂交，接着在50-65℃、例如在50℃、55℃或60℃在0.2×SSC，0.1％SDS中进行一个或多个洗涤步骤。技术人员知晓这些杂交条件可以，随核酸类型以及例如当存在有机溶剂时，在温度和缓冲液的浓度方面有所不同。例如，“标准杂交条件”的温度随核酸类型而变，在0.1×、0.5×、1×、2×、3×、4×或5×SSC(pH 7.2)浓度的水性缓冲液中42℃-58℃，优选45℃-50℃。如果上述缓冲液中存在有机溶剂，例如50％甲酰胺，则标准条件的温度为大约40℃、42℃或45℃。DNA:DNA杂合体的杂交条件优选为例如0.1×SSC和20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，优选30℃-45℃。DNA:RNA杂合体的杂交条件优选为例如0.1×SSC和30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃，优选45℃-55℃。前述杂交温度是针对例如不存在甲酰胺时长度大约100bp(＝碱基对)、G+C含量50％的核酸确定的。技术人员知晓借助例如上述那些的教科书或根据如下教科书来确定所需的杂交条件：Sambrook等，”Molecular Cloning”，Cold SpringHarbor Laboratory，1989；Hames和Higgins(编辑)1985，”Nucleic AcidsHybridization：A Practical Approach”，IRL Press at Oxford UniversityPress，Oxford；Brown(编辑)1991，”Essential Molecular Biology：APractical Approach”，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
一种此类严格杂交条件的另一实例是在65℃4×SSC中杂交，接着在65℃0.1×SSC中洗涤1小时。可选地，例示性的严格杂交条件是42℃50％甲酰胺、4×SSC。此外，洗涤步骤期间的条件可从低严格条件(大约2×SSC，50℃)和高严格条件(大约0.2×SSC 50℃，优选65℃)(20×SSC：0.3M柠檬酸钠，3M NaCl，pH 7.0)所界定的条件范围中选择。另外，洗涤步骤期间的温度可由室温大约22℃的低严格条件升至大约65℃的更高严格条件。盐浓度和温度两个参数均可同时改变，或者两参数中的一个保持恒定，而仅改变另一个。杂交期间也可以采用变性剂例如甲酰胺或SDS。在存在50％甲酰胺时，杂交优选在42℃实施。相关因素像1)处理的长度、2)盐条件、3)去污剂条件、4)竞争DNA、5)温度和6)探针选择可根据情况组合，所以不可能在此述及所有的可能性。
因而，在一个优选的实施方案中，Northern印迹用Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth，Karlsruhe)在68℃预杂交2h。用放射性标记探针于68℃杂交过夜。随后的洗涤步骤在68℃用1×SSC进行。对于Southern印迹测定，膜用Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth，Karlsruhe)在68℃预杂交2h。用放射性标记探针于68℃杂交过夜。随后弃去杂交缓冲液，杂交膜用2×SSC；0.1％SDS短暂洗涤。弃去洗涤缓冲液之后，添加新2×SSC；0.1％SDS缓冲液，并在68℃孵育15分钟。此洗涤步骤进行两次，接着是另一洗涤步骤，用1×SSC；0.1％SDS在68℃进行10分钟。
用于DNA杂交(Southern印迹测定)和洗涤步骤的一些条件实例示于下文：
(1)杂交条件可例如自如下条件选择：
(a)4×SSC 65℃，
(b)6×SSC 45℃，
(c)6×SSC，100mg/ml变性鲑精DNA片段68℃，
(d)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性鲑精DNA 68℃，
(e)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性鲑精DNA片段，50％甲酰胺42℃，
(f)50％甲酰胺，4×SSC 42℃，
(g)50％(v/v)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠42℃，
(h)2×或4×SSC 50℃(低严格条件)，或
(i)30-40％甲酰胺，2×或4×SSC 42℃(低严格条件)。
(2)洗涤步骤可例如自如下条件选择：
(a)0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS 50℃。
(b)0.1×SSC 65℃。
(c)0.1×SSC，0.5％SDS 68℃。
(d)0.1×SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺42℃。
(e)0.2×SSC，0.1％SDS 42℃。
(f)2×SSC 65℃(低严格条件)。
具有上述活性(即，与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如本文述及的增加的产量相关性状，例如增加的非生物胁迫耐受性，例如低温耐受性，例如增加的养分利用效率和/或水利用效率和/或增加的固有产量)、源自其他生物的多肽可由与表I第5和7栏所示序列在松弛杂交条件下杂交的其他DNA序列编码，所述其它DNA序列在表达时编码如下肽，该肽可以赋予与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的产量，例如本文述及的增加的产量相关性状，例如增加的非生物胁迫耐受性，例如低温耐受性或增强的冷耐受性，以及例如增加的养分利用效率和/或水利用效率和/或增加的固有产量。
此外，一些应用需要在低严格杂交条件下进行，杂交的特异性不是重要的。例如，总DNA的Southern印迹分析可用本发明的核酸分子探测并在低严格条件(55℃2×SSPE，0.1％SDS)洗涤。该杂交分析可揭示编码本发明多肽或在本发明方法中使用的基因的简单模式，所述基因例如具有本文述及的活性：与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增强产量，例如本文述及的增加的产量相关性状，例如增加的非生物胁迫耐受性，例如低温耐受性或增强的冷耐受性，以及例如增加的养分利用效率和/或水利用效率和/或增加的固有产量。此类低严格杂交条件的另一实例是4×SSC 50℃或用30-40％甲酰胺在42℃杂交。此类分子包括本发明多肽或本发明方法中使用的多肽的片段、类似物或衍生物，其由于例如单独或者组合的氨基酸和/或核苷酸缺失、插入、取代、添加和/或重组或本领域已知的任何其他修饰，而与上述氨基酸序列或其潜在的核苷酸序列有所不同。然而，优选应用高严格杂交条件。
杂交应当有利地用至少5、10、15、20、25、30、35或40bp，有利地至少50、60、70或80bp，优选至少90、100或110bp的片段进行。最优选至少15、20、25或30bp的片段。还优选与长度至少100bp或200，极特别优选至少400bp杂交。在特别优选的实施方案中，杂交应当用完整核酸序列以上文所述条件进行。
术语“片段”、“序列的片段”或“序列的一部分”表示所述原始序列截短的序列。该截短的序列(核酸或蛋白质序列)的长度可广泛变化；其中最小序列长度应足以提供具有所述的原始序列或分子的至少一种相当的功能和/或活性、或与本发明的或本发明方法中使用的核酸分子在严格条件下杂交的序列，而最大序列长度不是关键的。在一些应用中，最大长度通常并不显著大于提供原始序列的期望活性和/或功能所需的大小。
一般，截短的氨基酸序列或分子的长度为约5至约310个氨基酸。不过，更典型的，序列长度最大约250个氨基酸，优选最大约200或100个氨基酸。通常期望选择至少约10、12或15个氨基酸、直至最大约20或25个氨基酸的序列。
术语“表位”是指抗原中的特异性免疫活性位点，也称为抗原决定簇。这些表位可为聚合物组成中线性排列的单体--例如蛋白质中的氨基酸--或包含或由更为复杂的二级或三级结构组成。技术人员将会意识到免疫原(即，能够激发免疫反应的物质)是抗原；然而，一些抗原，例如半抗原，不是免疫原，但是可以通过与载体分子偶联而具有免疫原性。术语“抗原”包括针对其能够生成抗体和/或该抗体针对其具有特异性地免疫活性的物质。
在一个实施方案中，本发明涉及本发明或本发明方法中使用的多肽的表位，其中与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，所述多肽赋予增加的产量，例如本文述及的增加的产量相关性状，例如增加的非生物胁迫耐受性，例如低温耐受性或增强的冷耐受性，以及例如增加的养分利用效率和/或水利用效率和/或增加的固有产量等。
术语“一个或多个氨基酸”是指至少一个氨基酸但是不超过导致同源性低于50％同一性的氨基酸数目。优选同一性大于70％或80％，更优选85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％，甚至更优选96％、97％、98％或99％同一性。
此外，本发明的核酸分子包含为上文所述核酸分子或其部分的核苷酸序列之一的互补物的核酸分子。与表I第5和7栏所示核苷酸分子或序列之一互补的核酸分子或其序列将与表I第5和7栏所示核苷酸分子或序列之一充分互补，以致于能够与表I第5和7栏所示核苷酸序列之一杂交，由此形成稳定双链体。优选杂交在严格杂交条件下进行。不过，本文公开的序列之一的互补物优选是符合技术人员公知的核酸分子碱基配对的其序列互补物。例如，碱基A和G分别与碱基T和U或C进行碱基配对，反之亦然。对碱基的修饰可影响碱基配对的配偶体。
本发明的核酸分子包含如下核苷酸序列或其部分，所述核苷酸序列或其部分与表I第5和7栏所示核苷酸序列具有至少约30％、35％、40％或45％，优选至少约50％、55％、60％或65％，更优选至少约70％、80％或90％，甚至更优选至少约95％、97％、98％、99％或更高同源性，且优选具有上述活性，尤其是具有增加产量的活性，增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状，例如通过在胞浆或细胞质或细胞器(例如质体或线粒体或两者，优选质体)中表达，而增加该活性或表I所示基因的活性或基因产物(例如表II第3栏所示)的活性之后。
在一个实施方案中，在表I第6栏中标记为“质体”的核酸分子或所述核酸分子编码的基因产物与本文所述的靶向信号组合表达。
本发明的核酸分子包含如下核苷酸序列或分子或其部分，该核苷酸序列或分子或其部分可以与表I第5和7栏所示核苷酸序列或分子之一杂交，优选在本文定义的严格条件下杂交，并编码具有上述活性的蛋白质，所述活性为例如，通过例如在胞浆或细胞器(例如质体或线粒体或两者，优选质体)中表达，与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率，增加的固有产量和/或其他述及的产量相关性状，以及任选地所述活性选自包含所述活性的下组，即3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白。
而且，本发明的核酸分子可仅包含表I第5和7栏所示序列之一的编码区的一部分，例如可用作为探针或引物的片段，或编码本发明多肽的或本发明方法中使用的多肽的生物活性部分的片段，即具有上述活性，例如当通过例如在胞浆或细胞器(例如质体或线粒体或两者，优选质体)中表达增加其活性时，与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率，增加的固有产量和/或其他述及的产量相关性状。利用从根据本发明蛋白质的编码基因的克隆中确定的核苷酸序列，可以产生设计用以在其他细胞类型和生物体中鉴定和/或克隆其同源物的探针和引物。探针/引物一般包含基本上纯的寡核苷酸。该寡核苷酸一般包含这样的核苷酸序列区域，其在严格条件下与例如表I第5和7栏所示序列之一的有义链、例如表I第5和7栏所示序列之一的反义链、或其天然存在的突变体的至少约12、15，优选约20或25，更优选约40、50或75个连续核苷酸杂交。基于本发明核苷酸的引物可在PCR反应中用于克隆本发明多肽的或本发明方法中使用的多肽的同源物，例如，象本发明实施例中所述的引物一样，例如如实施例所示。用表III第7栏所示引物进行PCR将会产生表II第3栏所示基因产物的片段。
引物对可互换。本领域技术人员知晓如何组合所述引物以得到期望的产物，例如得到全长克隆或部分序列。基于本发明或本发明方法所用核酸分子的序列的探针可用来检测编码相同或同源蛋白质的转录物或基因组序列。探针还可含有与之相连的标记基团，例如标记基团可为放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可用作为基因组标记测试试剂盒的一部分，用于鉴定表达本发明或本发明方法所用多肽的细胞，例如通过测量细胞样品中编码性核酸分子的水平，例如检测mRNA水平，或者确定包含本发明或本发明方法所用多核苷酸的序列的基因组基因是否已经突变或缺失。
本发明的核酸分子编码包括与表II第5和7栏所示氨基酸序列足够同源的氨基酸序列的多肽或其部分，从而所述蛋白质或其部分维持参与增加产量的能力，例如，与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状，尤其是增加如上文所述的或如实施例中所述的活性。
如本文所用，用语“足够同源”是指蛋白质或其部分具有这样的氨基酸序列，该序列包括最低数目的与表II第5和7栏所示氨基酸序列完全相同或等同的氨基酸残基(例如与本发明多肽序列之一中的氨基酸残基具有相似侧链的氨基酸残基)，从而所述蛋白质或其部分能够参与增加产量，例如与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状，例如具有表II第3栏所示蛋白质的以及如本文所述的活性。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含编码本发明蛋白质一部分的核酸。所述蛋白质与表II第5和7栏所示的完整氨基酸序列具有至少约30％、35％、40％、45％或50％，优选至少约55％、60％、65％或70％，更优选至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％或94％，最优选至少约95％、97％、98％、99％或更高的同源性，且具有上述活性，例如通过例如在胞浆或细胞器(例如质体或线粒体或两者，优选质体)中表达，与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状。
由本发明核酸分子编码的蛋白质的部分优选是生物活性的，优选具有上述活性，例如在增加活性后，与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状。
如本文所述，术语“生物活性部分”旨在包括这样的蛋白质的部分，例如结构域/基序，其赋予与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加的产量、例如增加的产量相关性状、例如增强的非生物环境胁迫耐受性、例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状；或具有免疫学活性，从而其可以结合与用于如下用途的本发明多肽或本发明方法所用多肽特异性结合的抗体，所述用途为与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比增加产量，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状
本发明还涉及这样的核酸分子，所述核酸分子由于遗传密码简并性而与表IA第5和7栏所示核苷酸序列之一(及其部分)有所不同，因而编码本发明的多肽，尤其是具有上述活性的多肽，例如表II第5和7栏所示序列描述的多肽或功能同源物。有利地，本发明的核酸分子包含或在另一实施方案中具有这样的核苷酸序列，其编码包含或在另一实施方案中具有表II第5和7栏所示的氨基酸序列的多肽或功能同源物。又在另一实施方案中，本发明的核酸分子编码与表II第5和7栏所示氨基酸序列基本上同源的全长蛋白质或功能同源物。然而，在一个实施方案中，本发明的核酸分子并不是由表I、优选表IA第5和7栏所示的序列组成的。
另外，本领域技术人员将会理解，群体中可以存在引起氨基酸序列变化的DNA序列多态性。编码本发明多肽或包含本发明核酸分子的基因的此类遗传多态性可以因为自然变异而存在于群体的个体之中。
如本文所用，术语“基因”和“重组基因”是指包含编码本发明多肽的开放读框、或包含本发明的核酸分子、或编码本发明方法所用多肽的核酸分子，优选来自作物植物或来自微生物，可用于本发明的方法。此类自然变异一般可在基因核苷酸序列中导致1-5％的变异。在编码本发明多肽或包含本发明核酸分子的基因中，作为自然变异的结果且不改变所述功能活性的任何及所有此类核苷酸变异和所产生的氨基酸多态性，均旨在落入本发明的范围内。
对应于本发明核酸分子的天然变体同源物的核酸分子(也可为cDNA)可基于其与本文公开的核酸分子的同源性，利用本发明的核酸分子或其部分作为杂交探针，按照标准杂交技术在严格杂交条件下分离。
从而，在另一实施方案中，本发明的核酸分子长度至少15、20、25或30个核苷酸。优选其在严格条件下与包含本发明、或本发明方法中所用核酸分子的核苷酸序列(例如包含表I第5和7栏所示序列)的核酸分子杂交。该核酸分子优选长度至少20、30、50、100、250或更多个核苷酸。
术语“在严格条件下杂交”在上文定义。在一个实施方案中，术语“在严格条件下杂交”旨在描述这样的杂交和洗涤条件，在该条件下彼此至少30％、40％、50％或65％相同的核苷酸序列一般保持互相杂交。优选这样的条件，在该条件下彼此至少约70％，更优选至少约75％或80％，甚至更优选至少约85％、90％或95％或更高相同的核苷酸序列一般保持互相杂交。
优选，与表I第5和7栏所示序列在严格条件下杂交的本发明核酸分子对应于天然存在的本发明核酸分子。如本文所用，“天然存在的”核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，编码天然蛋白质)。优选，核酸分子编码具有上述活性的天然蛋白质，所述活性为例如通过例如在胞浆和/或细胞器(例如质体或线粒体，优选质体)中表达所述基因产物的核酸序列，而增加其表达或活性或增加本发明的或本发明方法所用的蛋白质的活性之后，赋予增加的产量，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状。
除了群体中可能存在的本发明多肽或核酸分子的、以及本发明方法所用多肽或核酸分子的序列的天然变体之外，技术人员将会理解，可通过突变将变化引入到编码本发明的、或本发明方法所用的多肽的核酸分子的核苷酸序列之中，由此导致所述编码多肽的氨基酸序列的变化，而不改变多肽的功能活性，优选不降低所述活性。
例如，可在本发明的或本发明方法所用的(例如表I第5和7栏所示的)核酸分子的序列中进行核苷酸取代，导致“非必需”氨基酸残基处氨基酸取代。
“非必需”氨基酸残基是能够自野生型序列改变而不会改变所述多肽活性的残基，而“必需”氨基酸残基是上述活性所必需的，其中所述活性为例如在增加所述多肽的活性之后，与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，导致增加产量，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状。不过，其他氨基酸残基(例如，在具所述活性的结构域中不保守或仅半保守的那些)可能不是活性所必需的，因为可能易于接受改变而不会改变所述活性。
此外，本领域技术人员知晓生物之间的密码子使用可有所不同。因此，可以改变本发明核酸分子的密码子使用以适应表达该多核苷酸或多肽的生物或细胞区室(例如质体或线粒体)的使用。
从而，本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述多肽具有上述活性(在生物或其部分中例如通过例如在胞浆和/或细胞器(例如质体或线粒体或两者，优选质体)中表达)、含有对于所述活性并非必须的氨基酸残基的变化。此类多肽的氨基酸序列有别于表II第5和7栏所示序列中所含的序列，但保留本文描述的所述活性。核酸分子可包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含与表II第5和7栏所示氨基酸序列具有至少约50％相同的氨基酸序列，并能够参与增加产量，例如通过例如在胞浆或细胞器(例如质体或线粒体或两者，优选质体)中表达而增加其活性(例如其表达)之后，与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状。优选所述核酸分子编码的蛋白质与表II第5和7栏所示的序列之一具有至少约60％的同一性，更优选与表II第5和7栏所示序列之一具有至少约70％的同一性，甚至更优选与表II第5和7栏所示的序列具有至少约80％、90％、95％的同一性，最优选与表II第5和7栏所示的序列具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。
为确定两氨基酸序列或两核酸分子的同源性(＝同一性，本文可互换使用)百分比，将两序列以一个写在另一个的下方的方式进行书写以便最佳比较(例如，可以向一个蛋白质或核酸的序列中插入空位，以产生与另一蛋白质或另一核酸的最佳比对)。
然后，比较对应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核酸分子。如果一个序列的某位置上与另一序列的对应位置上由相同氨基酸残基或相同核酸分子占据，则所述分子在此位置上同源(即，如本上下文所用的氨基酸或核酸“同源性”相当于氨基酸或核酸“同一性”)。两序列之间的同源性百分比是所述序列所共享的相同位置数的函数(即，同源性％＝相同位置数/总位置数×100)。因而，术语“同源性”和“同一性”应视为同义词。
为确定两个或更多个氨基酸或两个或更多个核苷酸序列的同源性(＝同一性)百分比，已经开发了若干计算机软件程序。两个或更多个序列的同源性可以使用例如fasta软件计算，目前使用的版本是fasta 3(W.R.Pearson和D.J.Lipman，PNAS 85，2444(1988)；W.R.Pearson，Methods inEnzymology 183，63(1990)；W.R.Pearson和D.J.Lipman，PNAS 85，2444(1988)；W.R.Pearson，Enzymology 183，63(1990))。另一种计算不同序列同源性的有用程序是标准blast程序，其包含在Biomax pedant软件(Biomax，Munich，Federal Republic of Germany)中。不幸的是，有时这会产生次佳结果，因为blast并不总是包括目标序列和查询序列的完整序列。尽管如此，鉴于此程序极其有效，其可用于巨大数目序列的比较。一般使用如下设置进行这样的序列比较：-p程序名[字符串]；-d数据库[字符串]；默认＝nr；-i查询文档[文档输入]；默认＝stdin；-e预期值(E)[实数]；默认＝10.0；-m比对视图选项：0＝成对；1＝锚定查询序列，显示相同之处；2＝锚定查询序列，不显示相同之处；3＝平铺，锚定查询序列，显示相同之处；4＝平铺，锚定查询序列，不显示相同之处；5＝锚定查询序列，不显示相同之处，且为钝端；6＝平铺，锚定查询序列，不显示相同之处，且为钝端；7＝XML Blast输出；8＝表格；9表格，带注释行[整数]；默认＝0；-o BLAST报告输出文档[文档输出]，任选；默认＝stdout；-F过滤查询序列(blastn为DUST，其他为SEG)[字符串]；默认＝T；-G开放空位的代价(0调用默认行为)[整数]；默认＝0；-E延伸空位的代价(0调用默认行为)[整数]；默认＝0；-X空位比对的X下降值(以字节计)(0调用默认行为)；blastn 30，megablast 20，tblastx 0，所有其他15[整数]；默认＝0；-I以deflines形式显示GI[T/F]；默认＝F；-q核苷酸错配罚分(仅blastn)[整数]；默认＝-3；-r核苷酸匹配的奖分(仅blastn)[整数]；默认＝1；-v待显示一行说明的数据库序列数(V)[整数]；默认＝500；-b待显示比对的数据库序列数(B)[整数]；默认＝250；-f扩展命中事件的阈值，如为0则默认；blastp 11，blastn 0，blastx 12，tblastn 13；tblastx 13，megablast 0[整数]；默认＝0；-g进行空位比对(tblastx不可用)[T/F]；默认＝T；-Q待使用的查询遗传密码[整数]；默认＝1；-D数据库(DB)遗传密码(仅用于tblast[nx])[整数]；默认＝1；-a待使用的处理器数[整数]；默认＝1；-O序列比对(SeqAlign)文档[文档输出]，任选；-J信任查询defline[T/F]；默认＝F；-M矩阵[字符串]；默认＝BLOSUM62；-W字长，如为0则默认(blastn 11，megablast 28，所有其他3)[整数]；默认＝0；-z数据库的有效长度(对于实际大小使用0)[实数]；默认＝0；-K区域中欲保持的最佳命中串件数(默认关闭，如果使用建议取100的值)[整数]；默认＝0；-P 0代表多个命中事件，1代表单个命中事件[整数]；默认＝0；-Y搜索空间的有效长度(对于实际大小，使用0)[实数]；默认＝0；-S欲对数据库进行搜索的查询链(用于blast[nx]和tblastx)；3为两条链，1为上方的链，2为下方的链[整数]；默认＝3；-T产生HTML输出[T/F]；默认＝F；-l使数据库搜索限于GI列表[字符串]，任选；-U使用小写字母过滤FASTA序列[T/F]，任选；默认＝F；-y以字节计的用于非空位延伸的X下降值(0.0调用默认行为)；blastn 20，megablast 10，所有其他7[实数]；默认＝0.0；-Z以字节计的用于最终空位比对的X下降值(0.0调用默认行为)；blastn/megablast 50，tblastx 0，所有其他25[整数]；默认＝0；-R PSI-TBLASTN检验点文档[文档输入]，任选；-n MegaBlast搜索[T/F]；默认＝F；-L查询序列上定位[字符串]，任选；-A多个命中事件视窗大小，如为0则默认(blastn/megablast 0，所有其他40[整数]；默认＝0；-w移码罚分(对于blastx为OOF算法)[整数]；默认＝0；-t在tblastn中允许用于连接HSP的最大内含子长度(0使得不能连接)[整数]；默认＝0。
高质量的结果通过使用Needleman和Wunsch算法或Smith和Waterman算法而达成。因此优选基于所述算法的程序。有利地，序列的比较可利用PileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351(1987)，Higgins等，CABIOS 5，151(1989))、或优选利用均基于Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48；443(1970))的“Gap”和“Needle”程序以及基于Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.2；482(1981))的“BestFit”进行。“Gap”和“BestFit”为GCG软件包(Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)；Altschul等，(Nucleic Acids Res.25，3389(1997))的一部分，“Needle”为欧洲分子生物学开放软件集(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite，EMBOSS)(Trends inGenetics 16(6)，276(2000))的一部分。因此，优选确定序列同源性百分比的计算利用“Gap”或“Needle”程序在整个序列范围内进行。对于“Needle”，核酸序列比较使用如下标准调适：矩阵：EDNAFULL，空位罚分：10.0，延伸罚分：0.5。对于“Gap”，核酸序列比较使用如下标准调适：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000，平均错配：0.000。
例如，在核酸水平上与序列SEQ ID NO：63具有80％同源性的序列应理解为表示该序列在通过上述“Needle”程序利用上述参数设置与序列SEQID NO：63比较之后具有80％的同源性。
两多肽之间的同源性应理解为表示在每一情况下完整序列长度上的氨基酸序列同一性，其通过借助上述“Needle”程序应用矩阵：EBLOSUM62，空位罚分：8.0，延伸罚分：2.0比较而计算。
例如，在蛋白质水平上与序列SEQ ID NO：64具有80％同源性的序列应理解为表示该序列在通过上述“Needle”程序利用上述参数设置与序列SEQ ID NO：64比较之后具有80％的同源性。
通过取代、插入或缺失而源自根据本发明表I第5和7栏所示核酸序列的功能等同物与根据本发明表II第5和7栏所示多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，极特别优选至少95％、97％、98％或99％的同源性，并编码与表II第5和7栏所示多肽具有基本上相同特性的多肽。由根据本发明表II第5和7栏所示多肽之一通过取代、插入或缺失而获得的功能等同物与根据本发明表II第5和7栏所示多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，极特别优选至少95％、97％、98％或99％的同源性，并与表II第5和7栏所示多肽具有基本上相同的特性。
功能等同体的“基本上相同的特性”首先应理解为表示所述功能等同体具有上述活性，当通过例如在胞浆或细胞器(例如质体或线粒体或两者，优选质体)中表达，而在生物例如微生物、植物或植物组织或动物组织、植物或动物细胞或其部分中增加所述功能等同体的蛋白质量、活性或功能时。
编码表II第5和7栏蛋白质序列的同源物的核酸分子可通过在本发明核酸分子的核苷酸序列中，尤其是表I第5和7栏核酸分子的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而创建，从而在所编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。可通过标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变向表I第5和7栏的编码序列中引入突变。
优选，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
从而，优选，本发明多肽或本发明方法所用多肽中推定的非必需氨基酸残基替换为来自相同家族的其他氨基酸残基。可选地，在另一实施方案中，可沿全部或部分本发明或本发明方法所用核酸分子的编码序列，随机引入突变，例如通过饱和诱变，且可筛选所得突变体是否存在本文所述的活性，以鉴定保留或甚至具有增加的上述活性的突变体，所述活性为例如与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状。
在诱变如本文所示的序列之一后，可重组表达编码的蛋白质，并利用例如本文所述的测定法(见实施例)确定蛋白质的活性。
通过Gap搜索如下数据库录入，发现了根据本发明的方法中使用的核酸分子的最高同源性。
具有表I第5和7栏所示序列的所用核酸序列的同源物也包括等位基因变体，其与所示核苷酸序列或上述衍生的核酸序列或其同源物、衍生物或类似物或它们的部分具有至少约30％、35％、40％或45％的同源性，优选至少约50％、60％或70％，更优选至少约90％、91％、92％、93％、94％或95％，甚至更优选至少约96％、97％、98％、99％或更高的同源性。等位基因变体尤其包括功能性变体，其可通过核苷酸缺失、插入或取代而由所示序列(优选表I第5和7栏的序列)或由衍生的核酸序列获得，不过宗旨是合成得到的蛋白质的酶活或生物活性有利地得以保留或增加。
在本发明的一个实施方案中，本发明或本发明方法中所用的核酸分子包含表I第5和7栏中任一所示的序列。优选核酸分子包含尽可能少的并非表I第5和7栏中任一所示的其他核苷酸。一个实施方案中，核酸分子包含少于500、400、300、200、100、90、80、70、60、50或40个其他核苷酸。在另一实施方案中，核酸分子包含少于30、20或10个其他核苷酸。在一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子与表I第5和7栏所示的序列完全相同。
同样优选本发明方法中使用的核酸分子编码包含表II第5和7栏所示序列的多肽。在一个实施方案中，核酸分子编码少于150、130、100、80、60、50、40或30个其他氨基酸。在另一实施方案中，编码的多肽包含少于20、15、10、9、8、7、6或5个其他氨基酸。在本发明方法所用的一个实施方案中，编码多肽与表II第5和7栏所示的序列完全相同。
在一个实施方案中，本发明或本发明方法所用的核酸分子编码包含表II第5和7栏所示序列的多肽，包含少于100个其他核苷酸。在另一实施方案中，所述核酸分子包含少于30个其他核苷酸。在一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子与表I第5和7栏所示序列的编码序列完全相同。
仍然具有本发明多肽的基本生物活性或酶活(与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率，固有产量和/或其他述及的产量相关性状)的多肽(＝蛋白质)，即其活性基本上不减小的多肽，是具有至少10％或20％，优选30％或40％，特别优选50％或60％，非常特别优选80％或90％或更高的野生型生物活性或酶活的多肽，有利地，该活性与在完全相同条件下表达的表II第5和7栏所示多肽的活性相比基本上不减小。
表I第5和7栏的同源物或表II第5和7栏的衍生序列也指该编码及非编码DNA序列的截短的序列、cDNA、单链DNA或RNA。所述序列的同源物也理解为表示衍生物，其包含非编码区，例如UTR、终止子、增强子或启动子变体。所述核苷酸序列上游的启动子可通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰，而不会干扰启动子、开放读框(＝ORF)或3’调控区例如终止子、或远离ORF的其他3’调控区的功能或活性。此外还有可能通过修饰启动子序列来增加其活性，或将其完全替换为更高活性的启动子，甚至是来自异源生物的启动子。适当的启动子为本领域技术人员已知，并在下文述及。
除了编码上文所述YRP的核酸分子之外，本发明另一方面还涉及选自表I第5和7栏、优选第7栏的核酸分子的活性的负调控因子。其反义多核苷酸被认为可以通过特异性地结合该靶多核苷酸并干扰靶多核苷酸的转录、剪接、运输、翻译和/或稳定性而抑制这些负调控因子的下调活性。现有技术描述了使反义多核苷酸靶向染色体DNA、初级RNA转录物或加工的mRNA的方法。优选靶区域包括剪接位点、翻译起始密码子、翻译终止密码子以及开放读框内的其他序列。
出于本发明的目的，术语“反义”是指包含这样的多核苷酸的核酸分子，其与基因、初级转录物或加工的mRNA的全部或部分充分互补，从而干扰该内源基因的表达。“互补”多核苷酸是能够按照标准Watson-Crick互补原则进行碱基配对的那些。具体地，嘌呤与嘧啶碱基配对形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C、以及在DNA的情况下腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)、或在RNA的情况下腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。人们理解即使两条多核苷酸彼此并不完全互补也可以互相杂交，只要分别具有与另一方基本上互补的至少一个区域即可。术语“反义核酸”包括单链RNA以及能够转录产生反义RNA的双链DNA表达盒。“活性”反义核酸是能够与编码如下多肽的核酸分子的活性的负调控因子选择性地杂交的反义RNA分子，所述多肽与选自表II第5和/或7栏、优选第7栏的多肽具有至少80％的序列同一性。
反义核酸分子可与完整的负调控因子链互补，或仅与其部分互补。在一实施方案中，反义核酸分子与编码YRP的核苷酸序列的编码链的“非编码区”互补。术语“非编码区”是指侧接编码区、并不翻译成氨基酸的5’和3’序列(即，也称为5’和3’非翻译区)。反义核酸分子可仅与YRPmRNA非编码区的一部分互补。例如，反义寡核苷酸可与YRP mRNA翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸长度可以是例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。一般，本发明的反义分子包含与表I核酸之一的非编码区的至少14个连续核苷酸具有60-100％的序列同一性的RNA。优选序列同一性为至少70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％，最优选99％。
本发明的反义核酸可利用本领域已知的方法利用化学合成和酶促连接反应来构建。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可利用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸(设计用以增加分子的生物稳定性或者增加反义和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性)进行化学合成，例如可应用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用来生成反义核酸的修饰的核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q苷(queosine)、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)-尿嘧啶、acp3和2，6-二氨基嘌呤。可选地，反义核酸可利用其中核酸已经以反义取向进行了亚克隆的表达载体通过生物学产生(即，由插入的核酸转录的RNA将与目的靶核酸呈反义取向，在下面小节中进一步描述)。
又在另一实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特异性双链杂合体，其中与常见的β-单位相反，各条链彼此平行走向(Gaultier等，Nucleic Acids.Res.15，6625(1987))。反义核酸分子还可包含2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等，NucleicAcids Res.15，6131(1987))或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，FEBS Lett.215，327(1987))。
本发明的反义核酸分子一般施用于细胞或者原位生成，从而它们与细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合。杂交可通过常规的核苷酸互补性形成稳定双链体，或者例如在结合DNA双链体的反义核酸分子的情况下，通过在双螺旋大沟中的特异性相互作用而进行。反义分子可进行修饰，从而与选择的细胞表面上所表达的受体或抗原特异性结合，例如通过使反义核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体连接。反义核酸分子还可利用本文所述的载体递送到细胞中。为达到反义分子足够的细胞内浓度，优选其中反义核酸分子置于强的原核、病毒或真核(包括植物)启动子控制之下的载体构建体。
作为反义多核苷酸的备选方案，可利用核酶、有义多核苷酸或双链RNA(dsRNA)来减小YRP多肽的表达。“核酶”表示基于催化性RNA的、具有核糖核酸酶活性的酶，其能够切割与之具有互补区域的单链核酸例如mRNA。核酶(例如Haselhoff和Gerlach，Nature 334，585(1988)中描述的锤头状核酶)可用来催化切割YRP mRNA转录物，由此抑制YRP mRNA的翻译。对YRP编码核酸具有特异性的核酶可基于本文所公开的YRPcDNA的核苷酸序列、或者基于待根据本发明教导的方法分离的异源序列来设计。例如，可构建四膜虫(Tetrahymena)L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与YRP编码mRNA中待切割的核苷酸序列互补。参见例如授予Cech等的美国专利No.4,987,071和5,116,742。可选地，可利用YRP mRNA从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。参见例如Bartel D.和Szostak J.W.，Science 261，1411(1993)。在优选的实施方案中，核酶将含有这样的部分，其有至少7、8、9、10、12、14、16、18或20个核苷酸，更优选7或8个核苷酸与靶RNA的一部分具有100％的互补性。制备核酶的方法为本领域技术人员已知。参见例如美国专利No.6,025,167、5,773,260和5,496,698。
如本文所用的术语“dsRNA”是指含有两条RNA链的RNA杂合体。dsRNA在结构上可以是线性或环状的。在优选的实施方案中，dsRNA特异于编码根据表II的多肽或与根据表II的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸。该杂交的RNA可以基本上或完全互补。“基本上互补”表示当利用如上文所述的BLAST程序对两杂交的RNA进行最佳比对时，杂交部分至少95％互补。优选dsRNA长度至少100个碱基对。一般，杂交的RNA长度完全相同，没有突出的5’或3’末端，没有空位。不过本发明的方法可以使用具有长达100个核苷酸的5’或3’突出端的dsRNA。
dsRNA可以含有核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物，例如2’-O-甲基核糖基残基或其组合。参见例如美国专利No.4,130,641和4,024,222。dsRNA聚肌苷酸:聚胞苷酸在美国专利4,283,393中描述。制备和利用dsRNA的方法在本领域已知。一种方法包括在体内或在单个体外反应混合物中同时转录两条互补DNA链。参见例如美国专利No.5,795,715。在一个实施方案中，dsRNA可通过标准转化方法引入到植物或植物细胞中。可选地，dsRNA可通过转录两条互补的RNA在植物细胞中表达。
抑制内源基因表达的其他方法，例如三螺旋形成(Moser等，Science238，645(1987)和Cooney等，Science 241，456(1988))和共抑制(Napoli等，The Plant Cell 2，279，1990)在本领域已知。部分和全长cDNA已经用于内源植物基因的共抑制。参见例如美国专利No.4,801,340、5,034,323、5,231,020和5,283,184；Van der Kroll等，The Plant Cell 2，291，(1990)；Smith等，Mol.Gen.Genetics 224，477(1990)和Napoli等，The Plant Cell 2，279(1990)。
关于有义抑制，据认为引入有义多核苷酸阻断相应靶基因的转录。有义多核苷酸与靶植物基因或RNA将具有至少65％的序列同一性。优选同一性百分比至少80％、90％、95％或更高。引入的有义多核苷酸相对于靶基因或转录物而言无需是全长的。优选有义多核苷酸将与1号申请中表I所示核酸之一的至少100个连续核苷酸具有至少65％的序列同一性。同一性区域可包含内含子和/或外显子及非翻译区。引入的有义多核苷酸可以瞬时存在于植物细胞中，或者可以稳定整合到植物染色体或染色体外复制子中。
本发明另一目的是含有核酸分子的表达载体，所述核酸分子包含选自下组的核酸分子：
(a)编码1号申请中表II第5或7栏所示多肽的核酸分子；
(b)1号申请中表I第5或7栏所示的核酸分子；
(c)核酸分子，其由于遗传密码简并性可由表II第5或7栏所示的多肽序列获得，且与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状；
(d)核酸分子，其与包含表I第5或7栏所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％的同一性，优选至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一性，且与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状；
(e)核酸分子，其编码与(a)、(b)、(c)或(d)中核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％的同一性，优选至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一性的多肽，并具有包含表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性，且与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状；
(f)核酸分子，其与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中的核酸分子在严格杂交条件下杂交，且与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状；
(g)核酸分子，其编码可借助于针对(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中核酸分子之一编码的多肽所制备的单克隆或多克隆抗体分离的多肽，并具有包含1号申请中表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；
(h)核酸分子，其编码包含表IV第7栏所示的共有序列或一种或多种多肽基序，且优选具有包含1号申请中表II或IV第5栏所示多肽的蛋白质所呈现的活性的多肽；
(i)核酸分子，其编码具有表II第5栏所示蛋白质所呈现的活性的多肽，且与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比，赋予增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状；
(j)核酸分子，其包含通过利用表III第7栏的引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得的多核苷酸，且优选具有包含1号申请中表II或IV第5栏所示多肽的蛋白质所呈现的活性；和
(k)核酸分子，其可通过在严格杂交条件下、用包含(a)或(b)中核酸分子的互补序列的探针或用其片段来筛选适宜的核酸文库，例如cDNA文库和/或基因组文库而获得，且编码具有包含1号申请中表II第5栏所示多肽的蛋白质所呈现的活性的多肽，其中所述片段具有与(a)至(e)中所表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt、500nt、750nt 或1000nt。
本发明还提供了分离的、含有上文所述YRP编码核酸分子的重组表达载体，其中与相应例如未转化的野生型宿主细胞相比，所述载体或YRP编码核酸在宿主细胞中的相应表达导致增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状。如本文所用，术语“载体”是指能够运输与之相连的其他核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其是指其中能够连入其他DNA区段的环形双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可连入病毒基因组中。其他类型的载体可为线性化的核酸序列，例如转座子，其为能够自身拷贝和插入的DNA片段。已经发现了2类转座子：简单转座子，称为插入序列；和复杂转座子，其可具有若干个基因以及转座所需的基因。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导与之有效连接的基因表达。此类载体在本文称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体往往是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。不过，本发明旨在包括其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)，他们发挥等同的功能。
植物表达载体优选含有能够驱动在植物细胞中基因表达的调控序列，其有效连接从而每个序列能够实现其功能，例如，通过多聚腺苷酸化信号的转录终止。优选的多聚腺苷酸化信号是来源于根癌农杆菌T-DNA的那些，例如Ti质粒pTiACH5的称为章鱼碱合酶的基因3(Gielen等，EMBO J.3，835(1984))或其功能等同物，但所有其他在植物中有功能活性的终止子都是适宜的。由于植物基因表达十分常见地不受限于转录水平上，故植物表达盒优选含有其他有效连接的序列，像翻译增强子，例如含烟草花叶病毒5’-非翻译前导序列的过驱动序列，以增强蛋白质/RNA比(Gallie等，Nucl.Acids Research 15，8693(1987))。
植物基因表达需要有效连接于适当的启动子，其以时间、细胞或组织特异性的方式赋予基因表达。优选驱动组成型表达的启动子(Benfey等，EMBO J.8，2195(1989))，像来源于植物病毒像35S CaMV(Franck等，Cell21，285(1980))、19S CaMV(还请参见美国专利No.5,352,605和PCT申请号WO 84/02913)的那些，或者植物启动子像美国专利No.4,962,028中所述的来自核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基的那些。
其他有利的调控序列有例如植物启动子例如CaMV/35S(Franck等，Cell 21285(1980))、PRP1(Ward等，Plant.Mol.Biol.22，361(1993))、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、LEB4、nos、泛素、napin或菜豆蛋白启动子。就此而言同样有利的是诱导型启动子，例如EP 388 186(苯磺酰胺诱导型)、Gatz等，Plant J.2，397(1992)(四环素诱导型)、EP-A-0 335 528(脱落酸诱导型)或WO 93/21334(乙醇或环己醇诱导型)中所述的启动子。其他有用的植物启动子有马铃薯的细胞质FBPase启动子或ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8，2445(1989))、大豆的磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶启动子(基因库登录号U87999)或EP-A-0 249 676中所述的noden特异性启动子。其他尤其有利的启动子有种子特异性启动子，其可用于单子叶植物或双子叶植物，并在US 5,608,152(来自油菜籽的napin启动子)、WO98/45461(来自拟南芥的菜豆蛋白启动子)、US 5,504,200(来自菜豆的菜豆蛋白启动子)、WO 91/13980(来自芸苔属的Bce4启动子)和Baeumlein等，Plant J.，2(2)，233(1992)(来自豆科植物的LEB4启动子)中描述。所述启动子可用于双子叶植物。如下启动子可用于例如单子叶植物：来自大麦的lpt-2-或lpt-1-启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或来自大麦的大麦醇溶蛋白启动子。其他有用的启动子在WO 99/16890中描述。原则上本发明新方法中有可能使用所有天然启动子以及其调控序列，像上文所述的那些。还有可能且还有利地使用合成启动子，
基因构建体还可以包含待插入生物体中且例如参与胁迫耐受性和产量增加的其他基因。可以且有利的是，在宿主生物体中插入和表达调控基因例如诱导因子、阻遏因子或通过其酶活干预调控的酶的基因，或生物合成通路的一个或多个或所有基因。这些基因在来源上可以是异源或同源的。插入的基因可以具有其自己的启动子或者与表I核酸或其同源序列处于相同的启动子的控制之下。
为表达存在的其他基因，基因构建体有利地还包含3’和/或5’端调控序列以增强表达，它们取决于选择的宿主生物和基因而选择以用于最佳表达。
这些调控序列旨在如上文所述使基因特异性表达和蛋白质表达成为可能。这可能意味着，取决于宿主生物，例如基因仅在诱导后表达或过表达，或者立即表达和/或过表达。
而且调控序列或因子可以优选对引入的基因的表达具有有益效果从而增加其表达。以这种方式有可能通过利用强转录信号例如启动子和/或增强子在转录水平上有利地增强调控元件。不过，另外，还可能通过例如提高mRNA的稳定性来增强翻译。
植物基因表达盒中可以使用的其他优选序列是使基因产物定向于其适宜细胞区室中所需的靶向序列(综述参见Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15(4)，285(1996)及其中引述的参考文献)，所述区室例如液泡、细胞核、所有类型的质体像造粉体、叶绿体、有色体、细胞外间隙、线粒体、内质网、油体、过氧物酶体和植物细胞的其他区室。
植物基因表达还可借助诱导型启动子而被促进(综述参见Gatz，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，89(1997))。如果期望基因表达以时间特异性方式发生，化学诱导型启动子特别合适。
表VI列出了可用来调控编码本发明序列的核酸的转录的若干启动子实例。
表VI：植物中组织特异性和诱导型启动子的实例
Figure BDA0000062525460001791
其他启动子例如超级启动子(Ni等，Plant Journal 7，661(1995))、泛素启动子(Callis等，J.Biol.Chem.，265，12486(1990)；US 5,510,474；US6,020,190；Kawalleck等，Plant.Molecular Biology，21，673(1993))或34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)同样可用于本发明且为本领域技术人员已知。发育阶段偏好型启动子优先在某些发育阶段表达。组织和器官偏好型启动子包括优先在某些组织或器官例如叶子、根、种子或木质部中表达的那些。组织偏好型和器官偏好型启动子的实例包括但不限于果实偏好型、胚珠偏好型、雄性组织偏好型、种子偏好型、珠被偏好型、块茎偏好型、茎秆偏好型、果皮偏好型和叶子偏好型、柱头偏好型、花粉偏好型、花药偏好型、花瓣偏好型、萼片偏好型、花梗偏好型、长角果偏好型、茎偏好型、根偏好型启动子等。种子偏好型启动子优先在种子发育和/或萌发期间表达。例如，种子偏好型启动子可以是胚偏好型、胚乳偏好型和种皮偏好型。参见Thompson等，BioEssays 10，108(1989)。种子偏好型启动子的实例包括但不限于纤维素合酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉蜀黍19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等等。
可用于本发明表达盒的其他启动子包括但不限于：主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-conglycin启动子、napin启动子、大豆凝集素启动子、玉蜀黍15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、waxy、shrunken 1、shrunken 2和bronze启动子、Zm13启动子(美国专利No.5,086,169)、玉蜀黍多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利No.5,412,085和5,545,546)、和SGB6启动子(美国专利No.5,470,359)，以及合成或其他天然启动子。
在植物中控制异源基因表达的额外灵活性可以通过利用来自异源来源的DNA结合结构域和效应元件(即来自非植物来源的DNA结合结构域)来获得。此类异源DNA结合结构域的实例是LexA DNA结合结构域(Brent和Ptashne，Cell 43，729(1985))。
本发明还提供了含有以反义取向克隆到表达载体中的本发明YRPDNA分子的重组表达载体。即，DNA分子以允许与YRP mRNA反义的RNA分子表达(通过该DNA分子的转录)的方式有效连接于调控序列。可选择与反义取向克隆的核酸分子有效连接的调控序列，指导反义RNA分子在多种细胞类型中持续表达。例如，可选择病毒启动子和/或增强子或调控序列，指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体可为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中在高效调控区的控制之下产生反义核酸。调控区的活性可由引入载体的细胞类型来确定。关于利用反义基因调控基因表达的讨论，参见Weintraub H.等，Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)，23(1986)和Mol等，FEBS Letters 268，427(1990)。
本发明另一方面涉及分离的YRP及其生物活性部分。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分当通过重组DNA技术产生时不含一些细胞物质或者当化学合成时不含化学前体或其他化学品。用语“基本上不含细胞物质”包括YRP制品，其中该多肽与天然或重组产生其的细胞中的一些细胞组分分离。在一个实施方案中，用语“基本上不含细胞物质”包括YRP制品，其具有少于约30％(以干重计)的非YRP物质(在本文也称为“杂质多肽”)，更优选少于约20％的非YRP物质，还更优选少于约10％的非YRP物质，最优选少于约5％的非YRP物质。
当重组产生YRP或其生物活性部分时，还优选基本上不含培养基，即培养基占少于约20％，更优选少于约10％，最优选少于约5％的多肽制品体积。用语“基本上不含化学前体或其他化学品”包括YRP制品，其中多肽与参与合成多肽的化学前体或其他化学品分离。在一个实施方案中，用语“基本上不含化学前体或其他化学品”包括YRP制品，其具有少于约30％(以干重计)的化学前体或非YRP化学品，更优选少于约20％的化学前体或非YRP化学品，还更优选少于约10％的化学前体或非YRP化学品，最优选少于约5％的化学前体或非YRP化学品。在优选的实施方案中，分离的多肽或其生物活性部分，不含来自与YRP的来源生物相同的生物的杂质多肽。一般，此多肽通过在微生物像酿酒酵母、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、纤毛虫、藻类、真菌或植物中重组表达例如酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻YRP而产生，只要该多肽在不同于原始生物的生物中重组表达即可。
本文所述的核酸分子、多肽、多肽同源物、融合多肽、引物、载体和宿主细胞可用在一种或多种如下方法中：鉴定酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻及相关生物；对与酿酒酵母、大肠杆菌相关的生物的基因组作图；鉴定和定位酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻的目的序列；进化研究；确定功能所需的YRP区域；调节YRP活性；调节一种或多种细胞功能的代谢；调节一种或多种化合物的跨膜运输；调节产量，例如产量相关性状，例如非生物环境胁迫耐受性，例如低温耐受性、干旱耐受性、水利用效率、养分利用效率和/或固有产量；以及调节YRP核酸的表达。
本发明的YRP核酸分子还可用于进化研究和多肽结构研究。本发明分子所参与的代谢和运输过程被广泛种类的原核和真核细胞利用；通过将本发明核酸分子的序列与编码来自其他生物的相似酶的核酸序列进行比较，可评估生物的进化相关性。与之相似，这样的比较允许评估序列的哪些区域保守而哪些不保守，这有助于确定多肽中对于酶行使功能而言必需的那些区域。这类确定对于多肽工程研究具有价值，并可以给出有关多肽能够耐受何种突变而不丧失功能的指示。
操纵本发明的YRP核酸分子可以导致产生与野生型YRP具有功能差异的SRP。这些多肽可以提高效率或活性，可以以比通常更高的数目存在于细胞中，或者可以降低效率或活性。
存在多种机制，通过该机制，改变本发明的YRP可以直接影响产量，例如产量相关性状，例如非生物环境胁迫耐受性，例如干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状。
植物中遗传修饰的效应，就产量例如产量相关性状，例如非生物环境胁迫耐受性，例如干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状而言，可通过在较不适宜的条件下生长该修饰的植物、然后分析植物的生长特征和/或代谢来评估。此类分析技术为本领域技术人员公知，并包括干重、鲜重、多肽合成、糖合成、脂质合成、蒸腾速率、总体植物和/或作物产量、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸速率、光合作用速率等等(Applications of HPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第17卷；Rehm等，1993 Biotechnology，第3卷，第III章：Product recovery andpurification，第469-714页，VCH：Weinheim；Belter P.A.等，1988，Bioseparations：downstream processing for biotechnology，John Wiley andSons；Kennedy J.F.和Cabral J.M.S.，1992，Recovery processes forbiological materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz J.A.和Henry J.D.，1988，Biochemical separations，in Ulmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry，B3卷，11章，1-27页，VCH：Weinheim；以及Dechow F.J.，1989，Separation and purification techniques in biotechnology，NoyesPublications)。
例如，可利用标准方法构建含有本文公开的核酸或其片段的酵母表达载体，并转化到酿酒酵母中。所得的转基因细胞可随之测定其产量的生成或改变，例如其产量相关性状，例如非生物环境胁迫耐受性，例如干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状。与之类似，可利用标准方法构建含有本文公开的核酸或其片段的植物表达载体，并转化到适当的植物细胞中，例如拟南芥、大豆、油菜、玉蜀黍、棉花、稻、小麦、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)等。所得的转基因细胞和/或由其衍生的植物可随之测定其产量的生成或改变，例如其产量相关性状，例如非生物环境胁迫耐受性，例如干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状。
对根据表I及编码本发明表II YRP的一个或多个基因的工程化也可以产生具有改变的活性的YRP，其直接和/或间接影响藻类、植物、纤毛虫、真菌或其他微生物像谷氨酸棒杆菌的非生物环境胁迫耐受性。
另外，本文公开的序列或其片段可用来在多种生物例如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞的基因组中生成敲除突变(Girke，T.，ThePlant Journal 15，39(1998))。所得的敲除细胞可随之评价其增加产量的能力，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状；其对各种非生物环境胁迫条件的反应，以及突变对表型和/或基因型的影响。关于基因失活的其他方法，参见美国专利No.6,004,804和Puttaraju等，Nature Biotechnology 17，246(1999)。
前述用于导致增加产量，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状的YRP突变策略并非是限制性的；这些策略的变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。利用此类策略，结合本文公开的机制，可利用本发明的核酸和多肽分子来生成表达突变的YRP核酸和多肽分子的藻类、纤毛虫、植物、真菌或其他微生物像谷氨酸棒杆菌，从而提高非生物环境胁迫耐受性和/或产量。
本发明还提供了特异性结合由本文所述核酸编码的YRP或其部分的抗体。抗体可通过许多公知的方法制备(参见例如Harlow和Lane，“Antibodies；A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1988))。简言之，可按足以引发免疫反应的量和间隔向动物注射纯化的抗原。抗体可直接纯化，或者可由动物获得脾细胞。脾细胞可随之与永生化细胞系融合，并就抗体分泌进行筛选。抗体可用来自核酸克隆文库中筛选分泌抗原的细胞。然后可对阳性克隆进行测序。参见例如Kelly等，Bio/Technology 10，163(1992)；Bebbington等，Bio/Technology 10，169(1992)。
短语与多肽“选择性结合”和“特异性结合”是指可确定该多肽在多肽或其他生物品异质群中存在的结合反应。因而，在指定的免疫测定条件下，与特定多肽结合的特异性抗体与样品中存在的其他多肽并不以显著的量结合。此类条件下抗体的选择性结合可能需要针对特定多肽的特异性而被选择的抗体。多种免疫测定形式可用来选择与特定多肽选择性结合的抗体。例如，固相ELISA免疫测定法常规用来选择与多肽选择性地免疫反应的抗体。参见Harlow和Lane，“Antibodies，A Laboratory Manual，”ColdSpring Harbor Publications，New York，(1988)中关于可用来确定选择性结合的免疫测定形式和条件的说明。
在一些情况下，期望由各种宿主制备单克隆抗体。关于制备此类单克隆抗体的技术的说明可见Stites等编辑，“Basic and Clinical Immunology，”(Lange Medical Publications，Los Altos，Calif.，第四版)及其中引述的参考文献，以及Harlow和Lane，“Antibodies，A Laboratory Manual，”ColdSpring Harbor Publications，New York，(1988)。
植物中的基因表达由蛋白转录因子与基因调控区内的特定核苷酸序列之间的相互作用调控。转录因子的一个实例是含有锌指(ZF)基序的多肽。每一个ZF模块围绕锌离子折叠，长约30个氨基酸。ZF蛋白的DNA识别结构域是可以插在DNA双螺旋大沟中的α-螺旋结构。模块含有与DNA结合的三个氨基酸，其中每个氨基酸与靶DNA序列中的单个碱基对接触。ZF基序以模块重复的方式排列，形成一系列手指识别一个连续的DNA序列。例如，三指ZF基序将识别9bp的DNA。上百个蛋白质已经证明含有ZF基序，每个蛋白质中具有2-37个ZF模块(Isalan M.等，Biochemistry37(35)，12026(1998)；Moore M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(4)，1432(2001)和Moore M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(4)，1437(2001)；美国专利US 6,007,988和US 6,013,453)。
植物基因的调控区含有许多短DNA序列(顺式作用元件)，作为转录因子包括ZF蛋白的识别结构域。不同基因中相似的识别结构域允许通过共同的转录因子协调编码代谢通路中的酶的若干基因的表达。基因家族成员之间识别结构域的差异有助于相同基因家族中基因表达的差异，例如，在不同组织和发育阶段以及响应环境条件而不同。
典型的ZF蛋白不仅含有DNA识别结构域，而且含有使ZF蛋白能够激活或阻遏特定基因转录的功能结构域。实验上，已经利用激活结构域激活靶基因的转录(美国专利5,789,538和专利申请WO 95/19431)，而且还可以使转录阻遏结构域与ZF相连，从而抑制转录(专利申请WO 00/47754和WO 01/002019)。已经报道酶促功能例如核酸切割可与ZF相连(专利申请WO 00/20622)。
本发明提供了方法，该方法允许技术人员从植物细胞基因组中分离一个或多个YRP编码基因的调控区，并设计与该基因调控区相互作用的、连接有功能结构域的锌指转录因子。可设计锌指蛋白与该植物基因的相互作用，从而改变基因的表达，并优选由此赋予增加的产量，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状。
尤其是，本发明提供了产生YRP编码核酸的转基因植物的方法，其中所述核酸在植物中的表达导致与野生型植物相比增加的产量，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状，所述方法包括：(a)用含有YRP编码核酸的表达载体转化植物细胞，和(b)由植物细胞生成与野生型植物相比具有增强的非生物环境胁迫耐受性和/或增加的产量的转基因植物。对于此类植物转化，可利用双元载体例如pBinAR 和Willmitzer，Plant Science 66，221(1990))。而且适宜的双元载体有例如pBIN19、pBI101、pGPTV或pPZP(Hajukiewicz P.等，Plant Mol.Biol.，25，989(1994))。
双元载体的构建可通过将cDNA连接到T-DNA中进行。cDNA 5’的植物启动子激活cDNA的转录。多聚腺苷酸化序列位于cDNA的3’。组织特异性表达可通过利用如上文所列的组织特异性启动子来实现。同样可利用任何其他启动子元件。对于整株植物中的组成型表达，可利用CaMV 35S启动子。表达的蛋白质可利用信号肽靶向细胞区室，例如质体、线粒体或内质网(Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.4(15)，285(1996))。信号肽以符合读框的方式克隆到cDNA的5’以实现融合蛋白的亚细胞定位。本领域技术人员将会意识到所使用的启动子应当与核酸有效连接，从而启动子引起核酸转录，导致合成编码多肽的mRNA。
备选的转染方法包括借助电穿孔或者农杆菌介导的基因转移，将DNA直接转移到发育中的花中。农杆菌介导的植物转化可利用例如GV3101(pMP90)进行(Koncz和Schell，Mol.Gen.Genet.204，383(1986))或LBA4404(Ooms等，Plasmid，7，15(1982)；Hoekema等，Nature，303，179(1983))根癌农杆菌菌株进行。转化可通过标准转化和再生技术进行(Deblaere等，Nucl.Acids.Res.13，4777(1994)；Gelvin和Schilperoort，Plant Molecular Biology Manual，第二版-Dordrecht：Kluwer AcademicPubl.，1995.-in Sect.，Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-P ISBN0-7923-2731-4；Glick B.R.和Thompson J.E.，Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology，Boca Raton：CRC Press，1993.-360S.，ISBN0-8493-5164-2)。例如，油菜籽可借助子叶或下胚轴转化法来转化(Moloney等，Plant Cell Reports 8，238(1989)；De Block等，Plant Physiol.91，694(1989))。用于农杆菌和植物选择的抗生素应用取决于转化所用的双元载体和农杆菌菌株。油菜籽选择通常利用卡那霉素作为可选择的植物选择标记来进行。农杆菌介导的亚麻基因转移可利用例如Mlynarova等，Plant CellReport 13，282(1994))所述的技术进行。另外，大豆转化可利用例如欧洲专利No.424047、美国专利No.5,322,783、欧洲专利No.397687、美国专利No.5,376,543或美国专利No.5,169,770中所述的技术进行。玉蜀黍转化可通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或借助碳化硅纤维(siliconcarbide fibre)技术实现(参见例如，Freeling和Walbot“The maizehandbook”Springer Verlag：New York(1993)ISBN 3-540-97826-7)。玉蜀黍转化的具体实例可见美国专利No.5,990,387，而小麦转化的具体实例可见PCT申请WO 93/07256。
在规定的N条件下、在一个具体实施方案中在非生物环境胁迫条件下生长修饰的植物，然后筛选和分析生长特征和/或代谢活性，评估植物中的遗传修饰对增加产量的影响，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状。此类分析技术为本领域技术人员公知。它们包括筛选(
Figure BDA0000062525460001881
Lexikon Biotechnologie，Stuttgart/New York：Georg Thieme Verlag 1992，″screening″701页)干重、鲜重、蛋白质合成、糖类合成、脂质合成、蒸腾速率、总体植物和/或作物产量、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸率、光合作用率等等(Applicationsof HPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，17卷；Rehm等，1993 Biotechnology，3卷，III章：Product recovery and purification，469-714页，VCH：Weinheim；Belter，P.A.等，1988 Bioseparations：downstream processing for biotechnology，John Wiley and Sons；Kennedy J.F.和Cabral J.M.S.，1992 Recoveryprocesses for biological materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz J.A.和Henry J.D.，1988 Biochemical separations，in：Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，B3卷，11章，1-27页，VCH：Weinheim以及DechowF.J.(1989)Separation and purification techniques in biotechnology，NoyesPublications)。
在一个实施方案中，本发明涉及鉴定基因产物的方法，所述基因产物在生物例如植物的细胞中赋予与相应例如未转化的野生型细胞相比增加的产量，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状，所述方法包括如下步骤：
(a)使可能含有编码如下基因产物的候选基因的样品例如细胞、组织、植物或微生物或核酸文库中的一些或所有核酸分子与表I A或B第5或7栏所示的核酸分子或其功能同源物接触例如杂交，所述基因产物赋予增加的产量，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量；
(b)鉴定在松弛严格条件下与所述核酸分子尤其是表I第5或7栏所示核酸分子序列杂交的核酸分子，和任选地分离全长cDNA克隆或全长基因组克隆；
(c)在宿主细胞优选植物细胞中鉴定该候选核酸分子或其片段；
(d)在期望增强非生物环境胁迫耐受性和/或增加产量的宿主细胞中增加所鉴定核酸分子的表达；
(e)测定宿主细胞增强的非生物环境胁迫耐受性和/或增加的产量的水平；和
(f)鉴定与野生型相比赋予宿主细胞增加的产量，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状的核酸分子及其基因产物。
松弛杂交条件为：在标准杂交程序后，洗涤步骤可在低至中等严格条件下进行，通常洗涤条件为40℃-55℃，且盐条件为2×SSC至0,2×SSC加0,1％SDS，相比之下严格洗涤条件为例如60℃-68℃加0,1％SDS。更多实例可见上文有关严格杂交条件所列的参考文献。通常以递增的严格度和长度重复洗涤步骤，直至检测到有益的信噪比，这取决于许多因素，例如靶标(例如其纯度、GC含量、大小等)，探针(例如其长度、其为RNA还是DNA探针)，盐条件，洗涤或杂交温度，洗涤或杂交时间等等。
在另一实施方案中，本发明涉及鉴定基因产物的方法，所述基因产物的表达赋予细胞增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状，所述方法包括如下步骤：
(a)在生物体中鉴定与编码如下蛋白质或如本文所述的其同源物的核酸分子具有至少20％，优选25％，更优选30％，甚至更优选35％、40％或50％，甚至更优选60％、70％或80％，最优选90％或95％或更高同源性的核酸分子，其中所述蛋白质包含表II第5或7栏所示的多肽分子，或者包含表IV第7栏所示的共有序列或多肽基序，或者由包含1号申请中表I第5或7栏所示多核苷酸的核酸分子编码，所述鉴定例如借助于数据库同源搜索来进行；
(b)在宿主细胞中增强所鉴定的核酸分子的表达；
(c)测定宿主细胞在如下方面的增强水平：增加产量，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状；和
(d)鉴定与野生型相比该增强的表达赋予宿主细胞增加的产量，例如增加产量相关性状，例如增强非生物环境胁迫耐受性，例如增加干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率，增加固有产量和/或其他述及的产量相关性状的宿主细胞。
此外，本文公开的核酸分子尤其是表I A或B第5或7栏所示的核酸分子，可以与相关物种的序列充分同源，从而这些核酸分子可以作为标记用来构建相关生物的基因组图谱或用于关联作图(association mapping)。此外，与本文公开的核酸、尤其是表I A或B第5或7栏所示的核酸分子或其同源物相对应的基因组区域的天然变异可能导致本文公开的蛋白质(尤其是包含表II A或B第5或7栏所示的多肽、或者包含表IV第7栏所示的共有序列或多肽基序的蛋白质及其同源物)的变异，结果导致增加产量的天然变异，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率，和/或其他述及的产量相关性状。
所以，天然变异最终也以已导致相对增加的产量的更活跃等位基因变体的形式存在，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或养分利用效率，和/或其他述及的产量相关性状。可以鉴定对应于不同水平增加的产量(例如不同水平增加的产量相关性状，例如不同水平增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加养分利用效率和/或增加固有产量，和/或其他述及的产量相关性状)的本文公开的核酸分子[尤其是包含表I A或B第5或7栏所示核酸分子的核酸]的不同变体，并用作为标记辅助进行增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率，和/或其他述及的产量相关性状的育种。
从而，本发明涉及育种植物的方法，所述植物具有增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状，所述方法包括：
(a)基于本文公开的本发明核酸[尤其是包含表I A或B第5或7栏所示核酸分子的核酸分子]、或包含表II A或B第5或7栏所示多肽的多肽或者包含表IV第7栏所示共有序列或多肽基序的多肽或本文所述其同源物的增加的表达，选择第一植物品种，所述第一植物品种具有增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状；
(b)将增加的产量(例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状)的水平与编码所述多肽或所述核酸分子的基因的表达水平或基因组结构关联起来；
(c)使第一植物品种与第二植物品种杂交，它们在增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率、和/或其他述及的产量相关性状的水平上显著不同；和
(d)鉴定哪些子代品种由于所述多肽或核酸分子的表达水平或编码所述多肽或所述核酸分子的基因的基因组结构，而已经具有增加水平的增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率和/或其他述及的产量相关性状。
在一个实施方案中，增加根据步骤(b)的基因的表达水平。
而本发明的又一实施方案涉及鉴定与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予植物细胞、植物或其部分增加的产量、例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率和/或其他述及的产量相关性状的化合物的方法，所述方法包括步骤：
(a)培养植物细胞；植物或其部分，维持植物表达多肽(所述多肽为表II第5或7栏所示的多肽、或所述多肽由包含如下多核苷酸的核酸分子编码，所述多核苷酸为表I第5或7栏所示多核苷酸、或本文所述的其同源物、或编码所述多肽并与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予增加的产量、例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率、固有产量和/或其他述及的产量相关性状的多核苷酸)；在允许表达读出系统以及表达表II第5或7栏所示的蛋白质、或由包含1号申请中表I第5或7栏所示多核苷酸的核酸分子编码的蛋白质、或本文所述的其同源物的条件下，提供读出系统，所述读出系统能够在适宜条件下与所述多肽相互作用，所述适宜条件允许所述多肽与所述读出系统在化学化合物或含有多个化学化合物的样品的存在下相互作用，且所述读出系统能够响应化学化合物与所述多肽的结合而提供可检测的信号；和
(b)通过检测所述读出系统所产生的信号的存在或不存在或降低或增加，来鉴定所述化合物是否为有效的激动剂。
所述化合物可以化学合成或微生物产生和/或包含在例如样品之中，例如来自例如植物、动物或微生物的细胞提取物，例如病原体。此外，所述化合物可以在本领域已知，但迄今不知道能够抑制本发明的多肽。反应混合物可以是无细胞提取物，或者可以含有细胞或组织培养物。鉴定本发明化合物的方法的适宜设置为本领域技术人员已知，并且例如总体性地在Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第三版(1994)，尤其是第17章中描述。化合物可以例如添加到反应混合物中、培养基中、注射到细胞中或喷洒到植物上。
如果在所述方法中鉴定含有化合物的样品，则可以从鉴定为含有能够与相应例如未转化的野生型相比激活或增强或增加产量、例如产量相关性状，例如非生物环境胁迫耐受性，例如干旱耐受性和/或低温耐受性，和/或增加的养分利用效率，和/或其他述及的产量相关性状的化合物的原始样品中分离该化合物，或者可以进一步细分原始样品，例如，如果其由多个不同的化合物组成，由此减小每样品中不同物质的数目，用细分的原始样品重复所述方法。取决于样品的复杂度，上文所述的步骤可进行数次，优选直至根据所述方法鉴定的样品仅含有有限数目的或者仅一种物质。优选所述样品含有化学和/或物理特性相似的物质，最优选所述物质完全相同。优选根据上文所述方法鉴定的化合物或其衍生物进一步配制成适合于在植物育种或植物细胞和组织培养中应用的形式。
可根据所述方法测试和鉴定的化合物可以是表达文库，例如cDNA表达文库、肽、蛋白质、核酸、抗体、小的有机化合物、激素、肽模拟物、PNA等等(Milner，Nature Medicine 1，879(1995)；Hupp，Cell 83，237(1995)；Gibbs，Cell 79，193(1994)，以及前文引述的参考文献)。所述化合物还可以是已知抑制剂或激活剂的功能衍生物或类似物。制备化学衍生物和类似物的方法为本领域技术人员公知，并且描述在例如Beilstein，Handbook of Organic Chemistry，Springer，New York Inc.，175 FifthAvenue，New York，N.Y.10010 U.S.A.和Organic Synthesis，Wiley，NewYork，USA中。此外，所述衍生物和类似物可根据本领域已知的方法测试其技术效果。此外，可例如根据上文所述的方法使用肽模拟物和/或计算机辅助设计的适当衍生物和类似物。可以在所述方法中采用的细胞或组织优选是前文实施方案中所述的本发明的宿主细胞、植物细胞或植物组织。
因而，在另一实施方案中，本发明涉及根据鉴定本发明激动剂的方法所获得或鉴定的化合物，所述化合物为本发明多肽的拮抗剂。
从而，在一个实施方案中，本发明还涉及通过鉴定本发明化合物的方法所鉴定的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性地识别本发明的化合物或激动剂的抗体。
本发明还涉及诊断组合物，其包含至少一种前述的本发明核酸分子、反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、载体、蛋白质、抗体或化合物，和任选的适宜的检测手段。
本发明的诊断组合物适用于从细胞中分离mRNA，和使如此获得的mRNA与包括如上文所述的核酸探针的探针在杂交条件下接触，检测与探针杂交的mRNA的存在，由此检测细胞中蛋白质的表达。检测根据本发明蛋白质存在的更多方法包括本领域公知的免疫技术，例如酶联免疫吸附试验。此外，有可能在植物育种中应用根据本发明的核酸分子作为分子标记或引物。适宜的检测手段为本领域技术人员公知，例如用于杂交测定的缓冲液和溶液，例如前述溶液和缓冲液、其他以及用于Southern、Western、Northern等印迹的手段，例如如Sambrook等所述均是已知的。在一个实施方案中，诊断组合物含有PCR引物，其经设计特异性地检测待在本发明的方法中减少的核酸分子(例如本发明的核酸分子)的存在或表达水平、或者区分本发明或待在本发明方法中减小其活性的核酸分子的不同变体或等位基因。
在另一实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含核酸分子、载体、宿主细胞、多肽、或反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、或核酶分子、或病毒核酸分子、抗体、植物细胞、植物或植物组织、可收获部分、繁殖材料和/或根据本发明方法鉴定的化合物和/或激动剂。
本发明试剂盒中的化合物可以包装在容器、例如瓶中，任选地带有/处于缓冲液和/或溶液中。如果合适，一种或多种所述组分可以包装在一个相同的容器中。另外地或可选地，一种或多种所述组分可以吸附在固相支持物，例如硝酸纤维素滤膜、玻璃板、芯片或尼龙膜上或微量滴定板的孔中。试剂盒可用于任何本文所述的方法和实施方案，例如用于产生宿主细胞、转基因植物、药物组合物、检测同源序列、鉴定拮抗剂或激动剂、作为粮食或饲料或作为其增补剂，或作为处理植物的增补剂等。此外，试剂盒可包含关于使用试剂盒用于任何所述实施方案的说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含编码一种或多种前述蛋白质的核酸分子，和/或抗体、载体、宿主细胞、反义核酸、植物细胞或植物组织或植物。在另一实施方案中，所述试剂盒包含PCR引物，以检测和区分待在本发明方法中减少的核酸分子例如本发明的核酸分子。
在另一实施方案中，本发明涉及产生农业组合物的方法，即，提供根据本发明方法使用的核酸分子、本发明的核酸分子、本发明的载体、本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、或抗体、本发明的病毒核酸分子、或本发明的多肽，或包括根据本发明鉴定所述化合物或激动剂的方法的步骤；并配制本发明的核酸分子、载体或多肽、或根据本发明方法所鉴定的激动剂或化合物，或以适用作植物农业组合物的形式应用本发明的主题。
在另一实施方案中，本发明涉及产生植物培养物组合物的方法，包括本发明方法的步骤；以及以可接受为农业组合物的形式配制所鉴定的化合物。
“可接受为农业组合物”应理解为指这样的组合物，其符合管理农药、植物养分、除草剂等的含量的法律要求。优选这样的组合物对所保护的植物和以其饲喂的动物(包括人类)无任何危害。
本申请通篇引述了多篇出版物。所有这些出版物及那些出版物中引述的参考文献的公开内容整体在此作为参考并入本申请中，以便更充分地说明本发明所述领域的状态。
还应当理解前文涉及本发明的优选实施方案，并且其中可进行众多变化和改变而不偏离本发明的范围。本发明进一步通过如下实施例举例说明，其不应以任何方式解释为限制。相反，应当清楚理解，在阅读本文的说明之后，各种其他实施方案、修饰及其等同体对于本领域技术人员是显而易见的，而不会偏离本发明的精神和/或权利要求书的范围。
在一个实施方案中，增加的产量导致特定成分的产出增强，包括但不限于增强和/或改善的糖含量或糖组成，增强或改善的淀粉含量和/或淀粉组成，增强和/或改善的油含量和/或油组成(例如增强的种子油含量)，增强或改善的蛋白质含量和/或蛋白质组成(例如增强的种子蛋白质含量)，增强和/或改善的维生素含量和/或维生素组成，等等。
此外，在一个实施方案中，本发明的方法包括收获产生或种植的植物或植物部分，并用或由所收获的植物或其部分生产燃料。此外，在一个实施方案中，本发明的方法包括收获可以用于淀粉分离的植物部分，并由该植物部分分离淀粉，其中所述植物是可以用于淀粉生产的植物，例如马铃薯。此外，在一个实施方案中，本发明的方法包括收获可以用于油分离的植物部分，并由该植物部分分离油，其中所述植物是可以用于生产油的植物，例如油菜籽油菜或芸苔、棉花、大豆或向日葵。
例如，在一个实施方案中，玉米种子中的油含量增加。因而，本发明涉及每英亩油含量(可收获油)增加的植物的生产。
例如，在一个实施方案中，大豆种子中的油含量增加。因而，本发明涉及每英亩油含量(可收获油)增加的大豆植物的生产。
例如，在一个实施方案中，OSR种子中的油含量增加。因而，本发明涉及每英亩油含量(可收获油)增加的OSR植物的生产。
例如，本发明涉及每英亩油含量(可收获油)增加的棉花植物的生产。
并入作为参考的还有本申请的如下申请：2008年9月23日提交的EP专利申请P 08164899.0，2008年11月21日提交的EP专利申请EP08169680.9和2008年11月25日提交的EP专利申请EP 08169875.5。
实施例
本发明通过如下实施例举例说明，并非旨在被实施例的公开所限制。
实施例1：通过过表达YLR蛋白基因，例如表达本发明的基因而工程化构建产量增加的拟南芥植物，例如产量相关性状增加，例如非生物环境胁迫耐受性增强，例如干旱耐受性和/或低温耐受性增加，和/或养分利用效率增加，和/或其他述及的产量相关性状增加。
克隆表I第5和7栏所示的本发明序列，用于植物中表达。
除非另有说明，使用Sambrook等，Molecular Cloning：A laboratorymanual，Cold Spring Harbor 1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press中所述的标准方法。
表I第5和7栏所示的本发明序列按照Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶(Stratagene)的方案通过PCR扩增。用于Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶方案的组合物如下：1×PCR缓冲液(Stratagene)，dNTP各0.2mM，100ng酿酒酵母(菌株S288C；ResearchGenetics，Inc.，现名Invitrogen)、大肠杆菌(菌株MG1655；E.coli GeneticStock Center)、集胞藻属物种(PCC6803株)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)(菌株N.R.Smith，16)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(HB8)的基因组DNA或者50ng来自拟南芥(哥伦比亚生态型)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、大豆(Resnick品种)或玉蜀黍(B73、Mo17、A188品种)的各种组织和发育阶段的cDNA，50pmol正向引物，50pmol反向引物，有或无1M甜菜碱，2.5u Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶。
扩增循环如下：
1个循环的94-95℃2-3分钟；然后是25-36个循环的94-95℃30-60秒、50-60℃30-45秒以及72℃210-480秒；接下来1个循环的72℃5-10分钟，然后是4-16℃-优选用于酿酒酵母、大肠杆菌、集胞藻属物种、棕色固氮菌、嗜热栖热菌。
至于拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、小立碗藓、玉蜀黍，扩增循环如下：
1个循环的94℃30秒、61℃30秒、72℃15分钟；然后是2个循环的94℃30秒、60℃30秒、72℃15分钟；然后是3个循环的94℃30秒、59℃30秒、72℃15分钟；然后是4个循环的94℃30秒、58℃30秒、72℃15分钟；然后是25个循环的94℃30秒、57℃30秒、72℃15分钟；然后是1个循环的72℃10分钟，然后是最终的4-16℃。
RNA利用RNeasy植物试剂盒按照标准方案(Qiagen)生成，并利用SuperscriptII反转录酶按照标准方案(Invitrogen)产生双链cDNA。
待表达基因的ORF特异性引物对示于表III第7栏。为了克隆的目的，将以下衔接子序列加入酿酒酵母ORF特异性引物(见表III)：
i)正向引物：5-GGAATTCCAGCTGACCACC-3’SEQ ID NO：1
ii)反向引物：5-GATCCCCGGGAATTGCCATG-3’SEQ ID NO：2
这些衔接子序列允许将ORF克隆到含有Resgen衔接子的各种载体中，参见表VII的E栏。
为了克隆的目的，将以下衔接子序列加入酿酒酵母、大肠杆菌、集胞藻属物种、棕色固氮菌、嗜热栖热菌、拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、小立碗藓或玉蜀黍ORF特异性引物：
iii)正向引物：5’-TTGCTCTTCC-3’SEQ ID NO：3
iiii)反向引物：5’-TTGCTCTTCG-3’SEQ ID NO：4
所述衔接子序列允许将ORF克隆到含有Colic衔接子的各种载体中，参见表VII的E栏。
因此为扩增和克隆酿酒酵母SEQ ID NO：1206，使用由衔接子序列i)和ORF特异性序列SEQ ID NO：1238组成的第一引物和由衔接子序列ii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：1239组成的第二引物。
为扩增和克隆大肠杆菌SEQ ID NO：63，使用由衔接子序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：73组成的一个引物、以及由衔接子序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：74组成的第二引物。
为扩增和克隆集胞藻属物种SEQ ID NO：1105，使用由衔接子序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：1199组成的一个引物、以及由衔接子序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：1200组成的第二引物。
为扩增和克隆大豆SEQ ID NO：1702，使用由衔接子序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：1762组成的一个引物、以及由衔接子序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：1763组成的第二引物。
遵循这些实施例，表I、优选第5栏公开的每一序列都可利用表VII所示的相应载体、通过将衔接子序列与表III第7栏所公开的相应特异性引物序列融合而克隆。
表VII.用于克隆ORF的不同载体的概览，并显示了其SEQID (A栏)、其载体名称(B栏)、其所含的用于表达ORF的启动子(C栏)、附加的人工靶向序列(D栏)、衔接子序列(E栏)、B栏述及的启动子所赋予的表达类型(F栏)和附图编号(G栏)。
Figure BDA0000062525460001991
Figure BDA0000062525460002001
实施例1b)：构建双元载体用于蛋白质的非靶向表达
“非靶向”表达在本文上下文中是指待表达的ORF未添加额外的靶向序列。
用于非靶向表达，用于克隆的双元载体是分别是VC-MME220-1qczSEQ ID NO 41(图1)，VC-MME221-1qcz SEQ ID NO 46(图2)，VC-MME489-1QCZ SEQ ID NO：56(图5)。用于克隆靶向序列的双元载体分别是VC-MME489-1QCZ SEQ ID NO：56(图5)，和pMTX0270p SEQID NO：9(图6)。其他可用的双元载体为技术人员已知；有关双元载体及其应用的综述可见Hellens R.、Mullineaux P.和Klee H.(Trends in PlantScience，5(10)，446(2000))。此类载体需要等同地配以适当的启动子和靶向序列。
实施例1c)：由菠菜(Spinacia oleracea)扩增FNR基因的质体靶向序列，并构建优先在绿色组织或优先在种子中进行质体靶向表达的载体。
为了由菠菜扩增FNR基因的靶向序列，由四周龄菠菜植物的叶子提取基因组DNA(DNeasy植物小量制备试剂盒，Qiagen，Hilden)。所述gDNA用作为模板进行PCR。
为了能够将转运序列克隆到VC-MME489-1QCZ和VC-MME301-1QCZ载体中，在正向引物和反向引物中均添加EcoRI限制性酶识别序列，而为了克隆到pMTX0270p，VC-MME220-1qcz，VC-MME221-1qcz和VC-MME289-1qcz载体中，在正向引物中添加PmeI限制性酶识别序列，在反向引物中添加NcoI位点。
FNR5EcoResgen ATA gAA TTC gCA TAA ACT TAT CTT CAT AgTTgC C
SEQ ID NO：5
FNR3EcoResgen ATA gAA TTC AgA ggC gAT CTg ggC CCT SEQID NO：6
FNR5PmeColic ATA gTT TAA ACg CAT AAA CTT ATC TTC ATAgTT gCC SEQ ID NO：7
FNR3NcoColic ATA CCA Tgg AAg AgC AAg Agg CgA TCT gggCCC T
SEQ ID NO：8
所得的由菠菜基因组DNA扩增的序列SEQ ID NO：29含有5’UTR(bp1-165)和编码区(bp 166-273和351-419)。编码序列被从bp 274到bp 350的内含子序列打断：
gcataaacttatcttcatagttgccactccaatttgctccttgaatctcctccacccaatacataatccactcctccatcaccc
acttcactactaaatcaaacttaactctgtttttctctctcctcctttcatttcttattcttccaatcatcgtactccgccatgaccac
cgctgtcaccgccgctgtttctttcccctctaccaaaaccacctctctctccgcccgaagctcctccgtcatttcccctgaca
aaatcagctacaaaaaggtgattcccaatttcactgtgttttttattaataatttgttattttgatgatgagatgattaatttgggt
gctgcaggttcctttgtactacaggaatgtatctgcaactgggaaaatgggacccatcagggcccagatcgcctct
(SEQ ID NO：29)
由引物FNR5EcoResgen和FNR3EcoResgen获得的PCR片段用EcoRI消化，并连接到已经用EcoRI消化的载体VC-MME489-1QCZ和VC-MME301-1QCZ中。通过测序检测FNR靶向序列的正确方向。此连接步骤中生成的载体分别是VC-MME354-1QCZ和pMTX461korrp。
由引物FNR5PmeColic和FNR3NcoColic获得的PCR片段用PmeI和NcoI消化，并连接到已经用SmaI和NcoI消化的载体pMTX0270p，VC-MME220-1qcz，VC-MME221-1qcz和VC-MME289-1qcz中。此连接步骤中生成的载体分别是VC-MME432-1qcz，VC-MME464-1qcz和pMTX447korr。
为优先在绿色组织中进行质体靶向的组成型表达，在VC-MME354-1QCZ载体中对来自酿酒酵母的ORF和在VC-MME432-1qcz载体中对来自大肠杆菌的ORF使用人工启动子A(ocs)3AmasPmas启动子(超级启动子))(Ni等.Plant Journal 7，661(1995)，WO 95/14098)，分别得到FNR靶向序列与ORF“符合读框”的融合。
为优先在种子中进行质体靶向表达，在pMTX461korrp载体中对来自酿酒酵母的ORF和在VC-MME464-1qcz载体中对来自大肠杆菌的ORF使用USP启动子(
Figure BDA0000062525460002021
et al.，Mol Gen Genet.225(3)：459-67(1991))，分别得到FNR靶向序列与ORF“符合读框”的融合。
为优先在绿色组织和种子中进行质体靶向的组成型表达，在pMTX447korr载体中对来自酿酒酵母、大肠杆菌、集胞藻属物种、棕色固氮菌、嗜热栖热菌、拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、小立碗藓或玉蜀黍的ORF使用PcUbi启动子，分别得到FNR靶向序列与ORF“符合读框”的融合。
实施例1d)：构建双元载体用于蛋白质的线粒体靶向表达：扩增来自拟南芥的IVD基因的线粒体靶向序列和构建优先在绿色组织或优先在种子中线粒体靶向表达的载体。
为了扩增来自拟南芥的IVD基因的靶向序列，从拟南芥植物叶中提取基因组DNA(DNeasy Plant Mini Kit，Qiagen，Hilden)。使用gDNA作为PCR的模板。
为了将转运序列克隆到VC-MME489-1QCZ和VC-MME301-1QCZ载体，在正向和反向引物中均添加了EcoRI限制性内切酶识别序列，而为了克隆到VC-MME220-1qcz，VC-MME221-1qcz和VC-MME289-1qcz载体中，在正向引物中添加PmeI限制性酶识别序列，在反向引物中添加NcoI位点。
IVD5EcoResgen ATA gAA TTC ATg CAg Agg TTT TTC TCC gC
SEQ ID NO：57
IVD3EcoResgen ATAg AAT TCC gAA gAA CgA gAA gAg AAA g
SEQ ID NO：58
IVD5PmeColic ATA gTT TAA ACA TgC AgA ggT TTT TCT CCg C
SEQ ID NO：59
IVD3NcoColic ATA CCA Tgg AAg AgC AAA ggA gAg ACg AAg AACgAg
SEQ ID NO：60
用IVD5EcoResgen和IVD3EcoResgen从拟南芥基因组DNA上扩增得到的序列(SEQ ID NO：61)含有81bp：
Atgcagaggtttttctccgccagatcgattctcggttacgccgtcaagacgcggaggaggtctttctcttctcgttcttcg
SEQ ID NO：61
用IVD5PmeColic和IVD3NcoColic从拟南芥基因组DNA上扩增得到的序列(SEQ ID NO：62)含有89bp：
Atgcagaggtttttctccgccagatcgattctcggttacgccgtcaagacgcggaggaggtctttctcttctcgttcttcgtctctcct
SEQ ID NO：62
由引物IVD5EcoResgen和IVD3EcoResgen获得的PCR片段用EcoRI消化，并连接到已经用EcoRI消化的载体VC-MME489-1QCZ和VC-MME301-1QCZ中。通过测序检测IVD靶向序列的正确方向。此连接步骤中生成的载体分别是VC-MME356-1QCZ和VC-MME462-1QCZ。
由引物IVD5PmeColic和IVD3NcoColic获得的PCR片段用PmeI和NcoI消化，并连接到已经用PmeI和NcoI消化的载体VC-MME220-1qcz，VC-MME221-1qcz和VC-MME289-1qcz。此连接步骤中生成的载体分别是VC-MME431-1qcz，VC-MME465-1qcz和VC-MME445-1qcz。
为优先在绿色组织中进行线粒体靶向的组成型表达，在VC-MME356-1QCZ载体中对来自酿酒酵母的ORF和在VC-MME431-1qcz载体中对来自大肠杆菌的ORF使用人工启动子A(ocs)3AmasPmas启动子(超级启动子))(Ni等.Plant Journal 7，661(1995)，WO 95/14098)，分别得到IVD序列与各ORF“符合读框”的融合。
为优先在种子中进行线粒体靶向的组成型表达，在VC-MME462-1QCZ载体中对来自酿酒酵母的ORF和在VC-MME465-1qcz载体中对来自大肠杆菌的ORF使用USP启动子(
Figure BDA0000062525460002041
et al.，Mol Gen Genet.225(3)：459-67(1991))，分别得到IVD序列与各ORF“符合读框”的融合。
为优先在绿色组织和种子中进行线粒体靶向的组成型表达，在VC-MME445-1qcz载体中对来自酿酒酵母、大肠杆菌、集胞藻属物种、棕色固氮菌、嗜热栖热菌、拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、小立碗藓或玉蜀黍的ORF使用PcUbi启动子，分别得到IVD序列与各ORF“符合读框”的融合。
其他可用的双元载体为技术人员已知；有关双元载体及其应用的综述可见Hellens R.、Mullineaux P.和Klee H.(Trends in Plant Science，5(10)，446(2000))。此类载体需要等同地配以适当的启动子和靶向序列。
实施例1e)：在不同表达载体中克隆表I第5和7栏所示的本发明序列。
为将来自酿酒酵母的SEQ ID NO：1206的ORF克隆到含有Resgen衔接子序列的载体中，各载体DNA用限制性酶NcoI处理。为将来自酿酒酵母的ORF克隆到含有Colic衔接子序列的载体中，各载体DNA用限制性酶PacI和NcoI按照标准方案(MBI Fermentas)处理。为克隆来自大肠杆菌、集胞藻属物种、棕色固氮菌、嗜热栖热菌、拟南芥、欧洲油菜、大豆、稻、小立碗藓或玉蜀黍的ORF，载体DNA用限制性酶PacI和NcoI按照标准方案(MBI Fermentas)处理。在所有情况下，反应通过在70℃失活20分钟而终止，并由QIAquick或NucleoSpin Extract II柱按照标准方案(Qiagen或Macherey-Nagel)纯化。
然后由扩增的ORF和相应衔接子序列组成的PCR产物以及载体DNA用T4 DNA聚合酶按照标准方案(MBI Fermentas)处理以产生单链突出端，对于载体，参数为1单位T4DNA聚合酶37℃2-10分钟，而对于表现SEQID NO：1206的PCR产物，参数为1-2u T4 DNA聚合酶15-17℃10-60分钟。
反应通过添加高盐缓冲液而终止，并由QIAquick或NucleoSpinExtract II柱按照标准方案(Qiagen或Macherey-Nagel)纯化。
根据该实施例，技术人员能够克隆表I、优选第5栏公开的所有序列。
大约30-60ng制备的载体和确定量的制备的扩增物混合，并在65℃杂交15分钟，接着是37℃0,1℃/1秒，接着是37℃10分钟，接着是0,1℃/1秒，然后4-10℃。
连接的构建体在相同的反应容器中通过添加感受态大肠杆菌细胞(菌株DH5α)，在1℃孵育20分钟，接着在42℃热击90秒并冷却至1-4℃，而进行转化。然后添加完全培养基(SOC)，且混合物在37℃孵育45分钟。随后将全部的混合物涂布到具有0.05mg/ml卡那霉素的琼脂板上，并在37℃孵育过夜。
克隆步骤的结果通过借助结合整合位点上游和下游的引物进行扩增(从而允许扩增插入物)来验证。扩增按照Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL)方案中所述进行。扩增循环如下：
1个循环的94℃1-5分钟；接着是35个循环，每个循环为94℃15-60秒、50-66℃15-60秒、和72℃5-15分钟；接着是1个循环的72℃10分钟；然后是4-16℃。
检查了若干菌落，但如下步骤中仅使用了检测到预期大小PCR产物的一个菌落。
该阳性菌落的一部分转移到装有补加了卡那霉素的完全培养基(LB)的反应容器中，并在37℃孵育过夜。
质粒制备如Qiaprep或NucleoSpin Multi-96 Plus标准方案(Qiagen或Macherey-Nagel)所说明的那样进行。
实施例1f)：生成表达SEQ ID NO：1206或表I、优选第5栏公开的任何其他序列的转基因植物。
1-5ng分离的质粒DNA通过电穿孔转化，或转化到根癌农杆菌菌株GV 3101 pMP90(Koncz和Schell，Mol.Gen.Gent.204，383(1986))感受态细胞中。其后，添加完全培养基(YEP)，并将混合物转移到新反应容器中28℃3小时。其后，所有反应混合物涂布到补加有相应抗生素例如利福平(0.1mg/ml)、庆大霉素(0.025mg/ml)和卡那霉素(0.05mg/ml)的YEP琼脂板上，并在28℃孵育48小时。
含有该质粒构建体的农杆菌随之用于转化植物。
借助于移液管吸头从琼脂板上挑取菌落，并加入也含有如上文所述的适宜抗生素的3ml液体TB培养基。预培养物在28℃120rpm生长48小时。
400ml含有上述相同抗生素的LB培养基用于主培养。将预培养物转移到主培养物中。其在28℃120rpm生长18小时。4000rpm离心后，将沉淀重悬于浸润培养基(MS培养基，10％蔗糖)中。
为了培养植物进行转化，盘(Piki Saat 80，绿色，提供有网筛底，30×20×4.5cm，购自Wiesauplast，Kunststofftechnik，德国)用GS 90基质(标准土壤，Werkverband E.V.，德国)填充一半。盘用0.05％Proplant液(Chimac-Apriphar，比利时)浇灌过夜。拟南芥C24种子(NottinghamArabidopsis Stock Centre，UK；NASC Stock N906)分散在盘中，大约每盘1000粒种子。盘用罩盖住，并放置在层积设施(8h，110μmol/m2s1，22℃；16h，黑暗，6℃)中。5天后，盘放置在短白昼控制的环境箱(8h，130μmol/m2s1，22℃；16h，黑暗，20℃)中，在其中它们保持大约10天，直至形成第一片真叶。
幼苗转移到含有相同基质的花盆(Teku花盆，7cm，LC系列，由德国GmbH & Co公司生产)中。五棵植物竖立在每个花盆中。花盆随之送回到短白昼控制的环境箱中以让植物继续生长。
10天后，植物转移到温室生长箱(补充光照，16h，340μE/m2s，22℃；8h，黑暗，20℃)中，在其中允许它们再生长17天。
为进行转化，将刚开始开花的6周龄拟南芥植物在上述事先已经用10μl Silwett L77(Crompton S.A.，Osi Specialties，瑞士)处理过的农杆菌悬液中浸泡10秒。所讨论的方法由Clough J.C.和Bent A.F.(Plant J.16，735(1998))描述。
植物随后在潮湿生长箱中放置18小时。其后，花盆送回到温室中让植物继续生长。植物在温室中保持另外10周，直至准备收获种子。
取决于用来选择转化植物的耐受性标记，将收获的种子种植在温室中并进行喷雾选择，或者首先消毒然后在补加相应选择剂的琼脂板上生长。由于载体含有bar基因作为耐受性标记，小植株以2-3天的时间间隔用0.02％
Figure BDA0000062525460002071
喷雾四次，并允许转化的植物结籽。
转基因拟南芥植物的种子储存在冰箱中(-20℃)。
实施例1g)：在有限氮源供应条件下生长的植物筛选(拟南芥)
检测了每个转基因构建体的4个独立的转基因品系(＝事件)(每个构建体25-28株植物)。
拟南芥种子播种在含有养分耗竭的土(“Einheitserde Typ 0”，30％粘土，Tantau，Wansdorf德国)和砂子的1∶1(v∶v)混合物的花盆中。为期四天在4℃黑暗中诱导发芽。随后植物在标准生长条件(光周期为16h光照和8h黑暗，20℃，60％相对湿度，且光子通量密度150-200μE)下生长。长出并培养植物，其中每隔一天用N耗竭的营养液浇灌。
N耗竭的营养液除水之外含有例如：
  矿物养分   终浓度
  KCl   3.00mM
  MgSO4×7H2O   0.5mM
  CaCl2×6H2O   1.5mM
  K2SO4   1.5mM
  NaH2PO4   1.5mM
  Fe-EDTA   40μM
  H3BO3   25μM
  MnSO4×H2O   1μM
  ZnSO4×7H2O   0.5μM
  Cu2SO4×5H2O   0.3μM
  Na2MoO4×2H2O   0.05μM
9-10天后，植物单株化。总计28-31天后收获植物，并通过植物地上部分的鲜重进行评定。生物量增加已经衡量为相应转基因植物和非转基因野生型植物的地上部分鲜重的比值。
限制氮源供应条件下生长的转基因拟南芥的生物量产量示于表VIII-A：生物量产量通过称重植物莲座(rosettes)来衡量。生物量增加计算为转基因植物的平均重量与来自相同实验的野生型对照植物的平均重量相比的比值。给出了转基因构建体的平均生物量增加(显著性值＜0.3和生物量增长＞5％(比值＞1.05))。
表VIII-A：在有限氮源供应条件下生长的转基因拟南芥的生物量产量(增加的NUE)
  SeqID   靶向   座位   生物量增加
  1772   质体   SLL1091   1.096
  1938   质体   SLR1293   1.084
  2042   细胞质   YDR461W   1.155
  2056   质体   YER170W   1.142
  2558   质体   YGR247W   1.22
  2628   细胞质   YJR095W   1.095
  2711   细胞质   YNR047W   1.1
  2738   质体   YOL103W   1.437
  2818   细胞质   YOR095C   1.234
  3437   质体   B2414_2   1.211
  4473   质体   SLL1091_2   1.096
  4639   质体   SLR1293_2   1.084
  4743   细胞质   YDR049W_2   1.259
  63   细胞质   B1670   1.112
  80   质体   B2414   1.211
  1105   细胞质  SLL1237   1.259
  1206   细胞质  YDR049W   1.259
实施例1h)：低温条件下生长的植物筛选
在标准实验中，土壤制备为养分富集土(GS90，Tantau，Wansdorf，德国)和砂子的3.5∶1(v/v)混合物。花盆装上土壤混合物，放到托盘中。往盘中加水，让土壤混合物吸收适量的水用于播种步骤。转基因拟南芥植物的种子播种在花盆(6cm直径)中。收集花盆直到其占满用于生长箱的托盘。然后用透明盖子盖上已经装满的盘，并转移到预冷(4℃-5℃)生长箱的储架系统上。4℃-5℃黑暗中2-3天建立层化。于20℃、60％相对湿度、16h光周期和约200μmol/m2s荧光光照的生长条件，起始种子萌发和生长。播种后7天揭开盖。BASTA选择通过在播种后第9天从顶部喷雾具小植株的花盆而进行。所以，喷雾BASTA浓缩物(183g/l草铵膦-铵盐)于自来水中的0.07％溶液(v/v)。转基因事件和野生型对照植物在生长箱中随机分布。从播种后第7天起在工作日变更托盘在生长箱中的位置。在从托盘上揭开盖之后每两天进行浇灌。播种后12-13天，通过在花盆中留下一株幼苗而移出多余的幼苗，使植物单株化。播种后14天施加寒冷(冷至11℃-12℃)直至实验结束。为测量生物量表现，在收获时(例如播种后29-37天，例如播种后29-30天，或优选的，播种后35-36天)通过切下苗(shoot)并称重之来确定植物鲜重。除了称重，在植物有别于野生型对照的情况下还加上表型信息。植物收获时处于开花前以及花序生长前的阶段。转基因植物与在同一天收获的非转基因野生型对照植物进行比较。用于生物量变化的统计学显著性的显著性值，通过应用“student”t检验(参数：双侧，不等方差(unequal variance))来计算。
进行3次连续的实验。在第一个实验中，检测了各转化品系的1个个体。
在第二个实验中，根据相同实验程序对在第一个实验中已测定为寒冷耐受性或抗性的构建体，即与野生型相比显示了增加产量，在此情况下为增加的生物量产量的构建体进行确认筛选。在此实验中，将每个构建体的3个或更多品系(每个构建体26-45株植物)如以前一样培养、处理和测量。
在前两个实验中，将寒冷耐受性或耐受性和生物量产量与野生型植物比较。
在第三个实验中，对在第二个实验中已测定为耐受性或抗性的构建体如以前一样培养、处理和打分。在此实验中，检测了每个构建体的2个或更多品系(每个构建体24-60株植物)。其结构总结于表VIII。
生物量产量通过称重植物莲座来衡量。生物量增加计算为转基因植物的平均重量与同日收获的野生型对照植物的平均重量相比的比值。对显示显著性值＜0.1和生物量增加＞1.1的座位的所有事件，给出了转基因事件组中所见的最小和最大生物量增加。
表VIII：在施加寒冷胁迫下的转基因拟南芥的生物量产量(具有最小/最大值的LT)
Figure BDA0000062525460002101
Figure BDA0000062525460002111
实施例1i)：周期性干旱条件下生长的植物筛选
在周期性干旱测定试验中，可对植物施加重复胁迫而不引起脱水。在标准实验中，土壤制备为养分富集土(GS90，Tantau，Wansdorf，德国)和石英砂1∶1(v/v)的混合物。花盆(6cm直径)可装上该混合物，放到盘中。往盘中加水，让土壤混合物吸收足量的水用于播种步骤(第1天)，随后可在花盆中播种转基因拟南芥植物及其野生型对照的种子。然后用透明盖盖上装满的盘，并转移到预冷(4℃-5℃)黑暗的生长箱中。在4℃-5℃黑暗中为期3-4天，建立层化。于20℃、60％相对湿度、16h光周期和约200μmol/m2s荧光光照的生长条件下，开始种子发芽和生长。播种后7-8天揭开盖。通过在第10天或第11天(播种后9或10天)从顶部喷雾小植株的花盆进行BASTA选择。在标准实验中，可喷雾BASTA浓缩液(183g/l草铵膦-铵盐)于自来水中的0.07％(v/v)溶液一次，或者可喷雾0.02％(v/v)的BASTA液三次。野生型对照植物可仅用自来水喷雾(而不是用溶于自来水的BASTA喷雾)，但其余处理相同。可在播种后13-14天通过除去多余的幼苗而在土壤中留下一株幼苗，使植物单株化。转基因事件和野生型对照植物可在生长箱中均匀分布。
在整个实验中可限制水供应，并对植物进行周期性干旱和重新浇灌。浇灌可在第1天(播种前)、第14天或第15天、第21天或第22天以及最后第27天或第28天进行。为测量生物量产量，在末次浇灌后一天(第28天或第29天)通过切下苗并称重之来确定植物鲜重。除了称重，在植物有别于野生型对照的情况下还可以加上表型信息。收获时植物可处于开花前以及花序生长前的阶段。用于生物量变化的统计学显著性的显著性值，可通过应用“student”t检验(参数：双侧，不等方差)来计算。对YOL103W，在2次连续实验的水平上检测了每个转基因构建体的4个品系(事件)。在第一个水平上检测了每个品系的1株植物(每个构建体4株植物)，在下一个水平上检测了每个品系的8-10株植物(每个构建体38株植物)。生物量表现可如上文所述进行评价。显示在至少两个连续实验水平上展示出增加的生物量表现的构建体的数据。
表VIIIc显示了在周期性干旱生长条件下生长的转基因拟南芥的生物量产量。生物量产量可通过称重植物莲座来衡量。生物量增加计算为转基因植物的平均重量与来自相同试验的野生型对照植物的平均重量相比的比值。给出了转基因构建体的平均生物量增加(显著性值＜0.05)。表VIII-C：在周期性干旱生长条件下生长的转基因拟南芥的生物量产量(增加的CD耐受性)
 SeqID  靶向  座位   生物量增加
 2738  细胞质  YOL103W   1.772
实施例1j)：标准化生长条件下产量增加的植物筛选
在该实验中，进行了在无实质非生物胁迫的标准化生长条件下产量增加(在本案中：生物量产量增加)的植物筛选。在标准实验中，土壤制备为养分富集土(GS90，Tantau，Wansdorf，德国)和石英砂3.5∶1(v/v)的混合物。可选地，植物播种在养分富集土(GS90，Tantau，德国)中。花盆装上土壤混合物，放到盘中。往盘中加水，让土壤混合物吸收足量的水用于播种步骤。在花盆(6cm直径)中播种转基因拟南芥植物及其非转基因野生型对照的种子。然后用透明盖盖上装满的盘，并转移到预冷(4℃-5℃)黑暗的生长箱中。4℃-5℃黑暗中为期3-4天确立层积。种子发芽和生长始于20℃、60％相对湿度、16h光周期和150-200μmol/m2s荧光光照的生长条件。播种后7-8天揭开盖。通过在第10天或第11天(播种后9或10天)从顶部喷雾小植株的花盆进行BASTA选择。在标准实验中，喷雾BASTA浓缩液(183g/l草铵膦-铵盐)溶于自来水中的0.07％(v/v)溶液一次，或者喷雾0.02％(v/v)的BASTA液三次。野生型对照植物仅用自来水喷雾(而不是用溶于自来水的BASTA喷雾)，但其余处理完全相同地。在播种后13-14天通过移出多余的幼苗而在土壤中留下一株幼苗，使植物单株化。转基因事件和野生型对照植物可在生长箱中均匀分布。
在标准实验中在揭开盖后每两天进行浇灌，或者每天进行。为测量生物量表现，在收获时(播种后24-29天)通过切下枝条并称重之来确定植物鲜重。植物收获时处于开花前以及花序生长前的阶段。转基因植物与在同一天收获的非转基因野生型对照植物进行比较。用于生物量变化的统计学显著性的显著性值，通过应用“student”t检验(参数：双侧，不等方差)来计算。
进行了2种不同类型的实验程序：
程序1)：每个转基因构建体检验了3-4个独立的转基因品系(＝事件)(每个构建体22-30株植物)，并如上文所述评价了生物量表现。
程序2)：在2次连续的实验水平上检测了每个转基因构建体的4个品系。只有展示了阳性表现的构建体进入下一实验水平。在第一个水平上检测了每个品系的1株植物(每个构建体4株植物)，在下一个水平上检测了每个品系的10株植物(每个构建体40株植物)。生物量表现可如上文所述进行评价。显示在至少两个连续实验水平上展示出增加的生物量表现的构建体的此类型实验(程序2)的数据。
表VIII-D显示了在标准化生长条件下生长的转基因拟南芥的生物量产量。生物量产量通过称重植物莲座来衡量。生物量增加计算为转基因植物的平均重量与来自相同试验的野生型对照植物的平均重量相比的比值。给出了转基因构建体的平均生物量增加(显著性值＜0.3和生物量增加＞5％(比值＞1.05))。
表VIII-D在标准化生长条件下生长的转基因拟南芥的生物量产量(增加的BM；固有产量)
 SeqID   靶向  座位   生物量产量
 1938   质体  SLR1293   1.088
  2628   质体   YJR095W   1.316
  2711   细胞质   YNR047W   1.161
  2738   质体   YOL103W   1.313
  3437   质体   B2414_2   1.204
  4639   质体   SLR1293_2   1.088
  4743   细胞质   YDR049W_2   1.166
  63   细胞质   B1670   1.117
  80   质体   B2414   1.204
  1076   细胞质   B2758   1.071
  1105   细胞质   SLL1237   1.068
  1206   细胞质   YDR049W   1.166
  1245   质体   YIL074C   1.209
实施例2：
通过利用组织特异性和/或胁迫诱导型启动子，过表达来自酿酒酵母或集胞藻或大肠杆菌的编码增加产量的蛋白、例如YRP蛋白、例如低温抗性和/或耐受性相关蛋白质的基因，从而工程化构建具有增加的产量的拟南芥植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，和/或其他述及的产量相关性状。
如实施例1那样创建转基因拟南芥植物，以在组织特异性和/或胁迫诱导型启动子的控制下表达编码YRP，例如增加产量的、例如低温抗性和/或耐受性相关的蛋白质的转基因。
产生T2代植物，并在胁迫条件下、优选低温条件下生长。生物量产量在自播种时起总计29-30天后确定。转基因拟南芥植物比非转基因对照植物产生更多的生物量。
实施例3：过表达增加产量的蛋白、例如YRP蛋白、例如低温抗性和/或耐受性相关蛋白质、例如来自酿酒酵母或集胞藻或大肠杆菌的胁迫相关基因，提供多重非生物胁迫耐受性。
呈现一种非生物胁迫耐受性的植物往往呈现出对另一种环境胁迫的耐受性。这种交叉耐受性现象在机制水平上尚不清楚(McKersie和Leshem，1994)。尽管如此，可以合理预期，由于转基因表达而呈现出增强的低温例如寒冷温度和/或冰冻温度耐受性的植物可能也呈现出对干旱和/或盐和/或其他非生物胁迫的耐受性。对这种假说的支持，若干基因的表达可以被多种非生物胁迫因素，包括低温、干旱、盐、渗压剂、ABA等，上调或下调(例如Hong等，Plant Mol Biol 18，663(1992)；Jagendorf和Takabe，PlantPhysiol 127，1827(2001))；Mizoguchi等，Proc Natl Acad Sci U S A 93，765(1996)；Zhu，Curr Opin Plant Biol 4，401(2001))。
为确定盐耐受性，对拟南芥种子消毒(100％漂白剂，0.1％TritonX消毒5分钟两次，并用ddH2O漂洗5次)。种子种在非选择培养基(1/2MS，0.6％phytagar，0.5g/L MES，1％蔗糖，2μg/ml苯菌灵(benamyl))中。使种子萌发大约10天。在4-5叶期，转基因植物栽到5.5cm直径的花盆中，并使之生长(22℃，持续光照)大约7天，根据需要浇灌。为开始测定，向花盆底下的托盘中加入2L 100mM NaCl和1/8MS。向含有对照植物的托盘中加入3L 1/8MS。NaCl添加物的浓度每4天逐步增加50mM直至200mM。在200mM盐处理后，确定植物的鲜重、存活和生物量产量。
为确定干旱耐受性，转基因的低温品系的种子如上所述萌发和生长大约10天至4-5叶期。植物随之转移到干旱条件下，并且可从发育的开花期长到结种期。可利用叶绿素荧光作为光合作用适合度(fitness)和光系统完整性的指标来衡量光合作用。确定存活和植物生物量产量，作为对种子产量的指示。
具有盐度或低温耐受性的植物比敏感植物具有更高的存活率和生物量产量，包括种子产量和干物质产量。
实施例4：通过过表达编码增加产量的蛋白例如YRP蛋白的基因、例如来自酿酒酵母或集胞藻或大肠杆菌的低温抗性和/或耐受性相关基因，工程化构建具有增加的产量的苜蓿植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，和/或其他述及的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性和/或增加的生物量产量。
利用本领域的方法转化(例如McKersie等，Plant Physiol 119，839(1999))苜蓿(紫花苜蓿)的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生植物。获得再生植物的方法已有描述。例如，这些可选自Rangelander(加拿大农业)栽培种或如Brown D.C.W.和Atanassov A.(Plant Cell Tissue Organ Culture 4，111(1985))所述的任何其他商业苜蓿品种。可选地，选择RA3品种(University of Wisconsin)用于组织培养(Walker等，Am.J.Bot.65，654(1978))。
柄外植体与含双元载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，Plant Physiol 119，839(1999))或LBA4404的过夜培养物共培养。许多不同的双元载体系统已经描述用于植物转化(例如An G.，in AgrobacteriumProtocols，Methods in Molecular Biology，44卷，47-62页，Gartland K.M.A.和Davey M.R.编辑Humana Press，Totowa，New Jersey)。许多基于Bevan(Nucleic Acid Research.12，8711(1984))所述的pBIN19载体，其包括侧接根癌农杆菌Ti质粒左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒包括至少两种基因--选择标记基因和调控性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可利用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,7673,666和6,225,105)。与此类似，多种启动子可用来调控性状基因，提供对基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，利用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
外植体在黑暗中在含288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/LK2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基中共培养3天。在半强度Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤外植体，并铺在相同的SH诱导培养基中，该培养基不含有乙酰丁香酮但含有适宜的选择剂和适宜的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，将体细胞胚转移到不含生长调节剂、不含抗生素、含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。随后使体细胞胚在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植到花盆中并在温室中生长。
产生T1或T2代植物，并进行低温实验，例如如上文实施例1所述。为评估产量增加，例如低温耐受性，生物量产量，固有产量和/或干物质产量和/或种子产量与没有转基因的植物例如相应的非转基因野生型植物相比较。
实施例5：通过过表达编码增加产量的蛋白例如YRP蛋白的基因、例如来自酿酒酵母或集胞藻或大肠杆菌的低温耐受性相关基因，工程化构建具有增加的产量的黑麦草植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，和/或其他述及的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性、优选低温耐受性和/或增加的生物量产量。
若干不同黑麦草品种的种子可用作为转化的外植体来源，包括可购自
Figure BDA0000062525460002171
Weibull种子公司的商业品种Gunne或品种Affinity。种子相继用1％Tween-20表面消毒1分钟，用100％漂白剂消毒60分钟，用去离子的蒸馏水漂洗3次，每次5分钟，然后在潮湿无菌滤纸上在黑暗中萌发3-4天。幼苗进一步用1％Tween-20消毒1分钟，用75％漂白剂消毒5分钟，并用dd H2O漂洗3次，每次5分钟。
表面消毒的种子放在含有Murashige和Skoog基础盐和维生素、20g/L蔗糖、150mg/L天冬酰胺、500mg/L酪蛋白水解物、3g/L Phytagel、10mg/LBAP和5mg/L麦草畏(dicamba)的愈伤组织诱导培养基中。板在25℃黑暗中孵育4周进行种子萌发和胚胎发生愈伤组织诱导。
放在愈伤组织诱导培养基上4周后，修剪掉幼苗的芽和根，将愈伤组织转移到新鲜培养基中，另外维持培养4周，然后转移到MSO培养基中光照培养2周。多块愈伤组织(11-17周龄)要么通过10目网筛滤筛并放在愈伤组织诱导培养基上，要么在250ml摇瓶的100ml液体黑麦草愈伤组织诱导培养基(与琼脂愈伤组织诱导相同的培养基)中培养。摇瓶裹在锡箔中，并在23℃黑暗中以175rpm摇1周。用40目网筛滤筛液体培养物，收集细胞。网筛上收集的级分铺板在固体黑麦草愈伤组织诱导培养基上并在25℃黑暗中培养1周。然后将愈伤组织转移到含1％蔗糖的MS培养基上并培养2周。
转化可用农杆菌或用粒子轰击法实现。创建表达载体，其在pUC载体中含有组成型植物启动子和该基因的cDNA。利用Qiagen试剂盒按照制造商的说明由大肠杆菌细胞制备质粒DNA。大约2g胚胎发生愈伤组织铺在皮氏培养皿中无菌滤纸的中央。向滤纸添加带有10g/L蔗糖的液体MSO等分试样。金颗粒(1.0μm大小)按照Sanford等，1993的方法用质粒DNA包裹，并以如下参数递送到胚胎发生愈伤组织中：每枪500μg颗粒和2μgDNA、1300psi，从制动板到愈伤组织板的靶距离为8.5cm，且每板愈伤组织1枪。
轰击后，愈伤组织转移回到新鲜的愈伤组织发育培养基中，并在室温黑暗中维持1周。然后将愈伤组织转移到25℃光照的生长条件以用适当的选择剂例如250nMArsenal、5mg/L PPT或50mg/L卡那霉素起始胚胎分化。出现对选择剂具有抗性的芽，一旦生根则转移到土壤中。
原代转基因植物(T0)样品通过PCR分析以确认T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交确认，其中DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。利用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR来制备地高辛标记的探针，并如制造商所建议的那样使用。
转基因T0黑麦草植物通过切蘖进行无性繁殖。移植的蘖在温室中维持2个月，直至充分建殖。除去枝条上的叶，并使之生长2周。
产生T1或T2代植物，并进行低温实验，例如如上文实施例1所述。为评估产量增加，例如低温耐受性，生物量产量，固有产量和/或干物质产量和/或种子产量与没有转基因的植物例如相应的非转基因野生型植物相比较。
实施例6：通过过表达编码增加产量的蛋白例如YRP蛋白的基因、例如来自酿酒酵母或集胞藻或大肠杆菌的低温耐受性相关基因，工程化构建具有增加的产量的大豆植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，和/或其他述及的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性、优选低温耐受性和/或增加的生物量产量。
根据在德克萨斯农工大学(Texas A&M)专利US 5,164,310中所述方法的如下改良方案转化大豆。若干商业大豆品种可以通过该方法转化。栽培种Jack(得自伊利诺斯种子公司(the Illinois Seed foundation))通常用于转化。种子通过在70％(v/v)乙醇中浸泡6分钟和在补加0.1％(v/v)Tween的25％商业漂白剂(NaOCl)中浸泡20分钟，接着用无菌双蒸馏水漂洗4次，进行消毒。七日龄幼苗通过从各幼苗切下胚根、下胚轴和一个子叶来繁殖。然后将具有一个子叶的上胚轴转移到皮氏培养中新鲜的萌发培养基上，并在25℃以16小时的光周期(约100μmol/m2s)孵育三周。从3-4周龄的植物切下腋结(约4mm长)。切下腋结并与农杆菌LBA4404培养物一起孵育。
许多不同的双元载体系统已经描述用于植物转化(例如An G.，inAgrobacterium Protocols，Methods in Molecular Biology，44卷，47-62页，Gartland K.M.A.和Davey M.R.编辑Humana Press，Totowa，NewJersey)。许多基于Bevan(Nucleic Acid Research.12，8711(1984))所述的pBIN19载体，其包括侧接根癌农杆菌Ti质粒左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒包括至少两种基因--选择标记基因和调控性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可利用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,7673,666和6,225,105)。与此类似，多种启动子可用来调控性状基因，以提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，利用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
在共培养处理后，洗涤外植体并转移到补加500mg/L特美汀(timentin)的选择培养基中。切下芽并置于芽伸长培养基中。将长度大于1cm的芽置于生根培养基中2-4周，之后移植到土壤中。
原代转基因植物(T0)通过PCR分析以确认T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交确认，其中DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。利用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR来制备地高辛标记的探针，并如制造商所建议的那样使用。
产生T1或T2代植物，并进行低温实验，例如如上文实施例1所述。为评估产量增加，例如低温耐受性，生物量产量，固有产量和/或干物质产量和/或种子产量与没有转基因的植物例如相应的非转基因野生型植物相比较。
实施例7.通过过表达编码增加产量的蛋白例如YRP蛋白的基因、例如来自酿酒酵母或集胞藻或大肠杆菌的低温耐受性相关基因，工程化构建具有增加的产量的油菜籽/芸苔植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，和/或其他述及的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性、优选低温耐受性和/或增加的生物量产量。
利用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为外植体进行组织培养，并根据Babic等(Plant Cell Rep 17，183(1998))进行转化。商业栽培种Westar(加拿大农业(Agriculture Canada))是用作转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。
含双元载体的根癌农杆菌LBA4404可用于芸苔转化。许多不同的双元载体系统已经描述用于植物转化(例如An G.，in AgrobacteriumProtocols，Methods in Molecular Biology，44卷，47-62页，Gartland K.M.A.和Davey M.R.编辑Humana Press，Totowa，New Jersey)。许多基于Bevan(Nucleic Acid Research.12，8711(1984))所述的pBIN19载体，其包括侧接根癌农杆菌Ti质粒左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒包括至少两种基因--选择标记基因和调控性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可利用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,7673,666和6,225,105)。与此类似，多种启动子可用来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，可利用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
芸苔种子在70％乙醇中表面消毒2分钟，然后在30％Clorox中加一滴Tween-20消毒10分钟，接着用无菌蒸馏水漂洗3次。种子随之在无激素、含1％蔗糖、0.7％phytagar的半强度MS培养基中于23℃、16小时光照，体外萌发5天。从体外幼苗切下附着有子叶的子叶柄外植体，并通过将子叶柄外植体的切割端浸入细菌悬液中来接种农杆菌。然后将外植体在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％phytagar的MSBAP-3培养基中于23℃、16小时光照，培养2天。与农杆菌共培养2天后，将子叶柄外植体转移到含有3mg/l BAP、头孢噻肟(cefotaxime)、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基中培养7天，然后在具有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到芽再生。当芽长5-10mm时，将其切下并转移到芽伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)中。将约2cm长的芽转移到生根培养基(MSO)中进行根诱导。
原代转基因植物(T0)样品通过PCR分析以确认T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交确认，其中DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。利用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR来制备地高辛标记的探针，并如制造商所建议的那样使用。
产生T1或T2代植物，并进行低温实验，例如如上文实施例1所述。为评估产量增加，例如低温耐受性，生物量产量，固有产量和/或干物质产量和/或种子产量与没有转基因的植物例如相应的非转基因野生型植物相比较。
实施例8：通过过表达编码增加产量的蛋白例如YRP蛋白的基因、例如来自酿酒酵母或集胞藻或大肠杆菌的低温抗性和/或耐受性相关基因，工程化构建具有增加的产量的玉米植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，和/或其他述及的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性、优选低温耐受性和/或增加的生物量产量。
用Ishida等(Nature Biotech 14745(1996))所述方法的改良方案进行玉米(玉蜀黍)的转化。在玉米中转化是基因型依赖性的，并且只有特定的基因型才能转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学(University ofMinnesota))或以A188为亲本的杂种是转化供体材料的优秀来源(Fromm等Biotech 8，833(1990))，但是也可以成功使用其它基因型。大约授粉后11天(DAP)，当未成熟胚的长度约1至1.2mm时，从玉米植物中收获穗。未成熟胚与携带“超级双元”载体的根癌农杆菌进行共培养，并通过器官发生回收转基因植物。日本烟草的超级双元载体系统在WO专利WO94/00977和WO 95/06722中描述。载体按照所说明的那样构建。可利用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉蜀黍基因(美国专利6,025,541)。与此类似，多种启动子可用来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，利用了34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
切下的胚在愈伤组织诱导培养基、然后玉米再生培养基(含有咪唑啉酮作为选择剂)上生长。皮氏培养皿于25℃在光照下孵育2-3周，或直到发育出芽。从每个胚中将绿芽转移到玉米生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对咪唑啉酮除草剂呈现出耐受性且为转基因PCR阳性的植物产生T1种子。
然后根据实施例1中所述的方法来评价T1转基因植物的增强的胁迫耐受性，像低温耐受性和/或增加的生物量产量。具有T-DNA单基因座插入的T1代将以3∶1的比率发生转基因的分离。含有1或2拷贝转基因的那些子代耐受咪唑啉酮除草剂，且与缺乏转基因的那些子代相比呈现出增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性，像低温耐受性和/或增加的生物量产量。
产生T1或T2代植物，并进行低温实验，例如如上文实施例2所述。为评估产量增加，例如低温耐受性，生物量产量，固有产量和/或干物质产量和/或种子产量与例如相应的非转基因野生型植物比较。
纯合的T2植物呈现出相似的表型。纯合的转基因植物和非转基因植物的杂交植物(F1子代)也呈现出增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或增加的养分利用效率，和/或其他述及的产量相关性状，例如增强的低温耐受性。
实施例9：通过过表达编码增加产量的蛋白例如YRP蛋白的基因、例如来自酿酒酵母或集胞藻或大肠杆菌的低温抗性和/或耐受性相关基因，工程化构建具有增加的产量的小麦植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的非生物环境胁迫耐受性，例如增加的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或增加的养分利用效率，和/或其他述及的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性、优选低温耐受性和/或增加的生物量产量。
通过Ishida等(Nature Biotech.14745(1996))所述的方法进行小麦的转化。转化常用栽培种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT公司获得)。未成熟胚和携带“超级双元”载体的根癌农杆菌进行共培养，并通过器官发生回收转基因植株。日本烟草的超级双元载体系统在WO专利WO 94/00977和WO 95/06722中描述。载体按照所说明的那样构建。可利用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉蜀黍基因(美国专利6,025,541)。与此类似，多种启动子可用来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，利用了34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
在与农杆菌孵育后，胚在愈伤组织诱导培养基、然后再生培养基(含有咪唑啉酮作为选择剂)上培养。皮氏培养皿于25℃在光照下孵育2-3周，或直到发育出芽。从每个胚中将绿芽转移到生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对咪唑啉酮除草剂呈现出耐受性且为转基因PCR阳性的植物产生T1种子。
然后根据实施例2中所述的方法来评价T1转基因植物的增强的低温耐受性和/或增加的生物量产量。T-DNA单基因座插入的T1代将以3∶1的比率发生转基因的分离。含有1或2拷贝转基因的那些子代耐受咪唑啉酮除草剂，且与缺乏转基因的子代相比呈现出增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如增强的低温耐受性和/或增加的生物量产量。纯合T2植物呈现出相似的表型。
为评估产量增加，例如低温耐受性，生物量产量、固有产量和/或干物质产量和/或种子产量与例如相应的非转基因野生型植物比较。例如，具有增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高的胁迫耐受性，例如增加的养分利用效率，或增加的固有产量，例如更高的低温耐受性的植物，与无转基因的植物、例如相应的非转基因野生型植物相比时，在低温下可以显示出增加的生物量产量和/或干物质产量和/或种子产量。
实施例10：鉴定相同的及异源的基因
可利用基因序列从cDNA或基因组文库中鉴定相同的或异源的基因。相同的基因(例如全长cDNA克隆)可利用例如cDNA文库借助核酸杂交而分离。取决于目的基因的丰度，铺板100,000直至1,000,000个重组噬菌体并转移到尼龙膜上。用碱变性后，通过例如紫外交联使DNA固定在膜上。杂交在高严格条件下进行。在水性溶液中，杂交和洗涤在1M NaCl的离子强度和68℃的温度进行。杂交探针通过例如放射性(32P)缺刻转录标记(High Prime，Roche，Mannheim，德国)生成。信号通过放射自显影检测。
相关但不相同的部分相同的或异源的基因可按类似于上述方法的方式利用低严格杂交和洗涤条件来鉴定。对于水性杂交，离子强度通常保持在1M NaCl，而温度逐渐从68℃降至42℃。
仅在独特结构域(例如10-20个氨基酸)具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列的分离，可通过利用合成的放射性标记的寡核苷酸探针进行。放射性标记的寡核苷酸通过用T4多核苷酸激酶磷酸化两个互补寡核苷酸的5-引发端(5-prime end)而制备。该互补寡核苷酸退火并连接以形成多联体。双链多联体随之通过例如缺刻转录进行放射性标记。杂交通常在低严格条件下利用高寡核苷酸浓度来进行。
寡核苷酸杂交溶液：
6×SSC
0.01M磷酸钠
1mM EDTA(pH 8)
0.5％SDS；100μg/ml变性鲑精DNA
0.1％脱脂奶粉
在杂交期间，温度逐步降至比估算的寡核苷酸Tm低5-10℃，或降至室温，接着是洗涤步骤和放射自显影。洗涤用低严格条件进行，例如利用4×SSC的3个洗涤步骤。更多细节由Sambrook J.等，1989，“MolecularCloning：A Laboratory Manual，”Cold Spring Harbor Laboratory Press或Ausubel F.M.等，1994，“Current Protocols in Molecular Biology，”JohnWiley & Sons所述。
实施例11：通过用抗体筛选表达文库来鉴定相同的基因
可利用c-DNA克隆在例如大肠杆菌(例如Qiagen QIAexpress pQE系统)中产生重组多肽。重组多肽随之一般借助Ni-NTA亲和层析(Qiagen)进行亲和纯化。重组多肽随之用来例如通过利用标准的兔子免疫技术来产生特异性抗体。抗体如Gu等，BioTechniques 17，257(1994)所述利用由重组抗原饱和的Ni-NTA柱进行亲和纯化。抗体可随之用来筛选表达cDNA文库，以借助免疫筛选法(Sambrook，J.等，1989，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual，”Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel，F.M.等，1994，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley &Sons)鉴定相同的或异源的基因。
实施例12：体内诱变
微生物的体内诱变可通过在维持遗传信息完整性的能力受损的大肠杆菌或其他微生物(例如芽孢杆菌属菌种或酵母如酿酒酵母)中传代质粒(或其他载体)DNA来进行。典型的增变株在DNA修复系统的基因中具有突变(例如，mutHLS、mutD、mutT等；参考文献参见Rupp W.D.，DNA repairmechanisms，in：E.coli and Salmonella，2277-2294页，ASM，1996，Washington)。此类菌株为本领域技术人员公知。此类菌株的使用在例如GreenerA.和Callahan M.，Strategies 7，32(1994)中举例说明。优选在于微生物中进行选择和检验后，将突变DNA分子转移到植物中。根据本文件例证的多种实施例，产生转基因植物。
实施例13：通过利用组织特异性或胁迫诱导型启动子过表达YRP编码基因、例如来自拟南芥、欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻的基因，工程化构建具有增加的产量的拟南芥植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性、优选低温耐受性和/或增加的生物量产量。
如实施例1所述创建过表达YRP基因、例如低温抗性和/或耐受性相关蛋白质编码基因，例如来自欧洲油菜、大豆、玉蜀黍和稻的基因，的转基因拟南芥植物，以在组织特异性或胁迫诱导型启动子的控制下表达编码YRP的转基因。产生T2代植物，并在胁迫或非胁迫条件例如低温条件下生长。具有增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高的胁迫例如低温耐受性，或具有增加的养分利用效率或增加的固有产量的植物，与无转基因的植物、例如相应的非转基因野生型植物相比时，在低温条件下显示出增加的生物量产量和/或干物质产量和/或种子产量。
实施例14：通过过表达YRP基因、例如低温抗性和/或耐受性相关基因，例如来自拟南芥、欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻的基因，来工程化构建具有增加的产量的苜蓿植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性、优选低温耐受性和/或增加的生物量产量。
苜蓿(紫花苜蓿)的再生克隆利用McKersie等，(Plant Physiol.119，839(1999))的方法转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生植物。获得再生植物的方法已有描述。例如，这些可选自Rangelander(加拿大农业)栽培种或如Brown和Atanassov(Plant Cell Tissue OrganCulture 4，111(1985))所述的任何其他商业苜蓿品种。可选地，选择RA3品种(University of Wisconsin)用于组织培养(Walker等，Am.J.Bot.65，654(1978))。
柄外植体与含双元载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，Plant Physiol 119，839(1999))或LBA4404的过夜培养物共培养。许多不同的双元载体系统已经描述用于植物转化(例如An G.，in AgrobacteriumProtocols，Methods in Molecular Biology，44卷，47-62页，Gartland K.M.A.和Davey M.R.编辑Humana Press，Totowa，New Jersey)。许多基于Bevan(Nucleic Acid Research.12，8711(1984))所述的pBIN19载体，其包括侧接根癌农杆菌Ti质粒左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒包括至少两种基因--选择标记基因和调控性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可利用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,7673,666和6,225,105)。与此类似，多种启动子可用来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，利用了34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
外植体在黑暗中在含288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/LK2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基中共培养3天。在半强度Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤外植体，并铺在相同的SH诱导培养基中，该培养基不含有乙酰丁香酮但含有适宜的选择剂和适宜的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，将体细胞胚转移到不含生长调节剂、不含抗生素、含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。随后使体细胞胚在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植到花盆中并在温室中生长。
T0转基因植物通过茎节扦插繁殖，并在Turface生长培养基中生根。产生T1或T2代植物，并进行包括胁迫或非胁迫条件的实验，例如如前面实施例所述的低温条件。
为评估产量增加，将例如低温耐受性，生物量产量、固有产量和/或干物质产量和/或种子产量与例如相应的非转基因野生型植物相比较。
例如，具有增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高的胁迫耐受性，例如具有增加的养分利用效率或增加的固有产量，例如具有更高的低温耐受性的植物，与无转基因的植物、例如相应的非转基因野生型植物相比时，在低温条件下可以显示出增加的生物量产量和/或干物质产量和/或种子产量。
实施例15：通过过表达YRP基因、例如低温抗性和/或耐受性相关基因，例如来自拟南芥、欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻的基因，来工程化构建具有增加的产量的黑麦草植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性、优选低温耐受性和/或增加的生物量产量。
若干不同黑麦草品种的种子可用作为转化的外植体来源，包括可购自
Figure BDA0000062525460002281
Weibull种子公司的商业品种Gunne或品种Affinity。种子相继用1％Tween-20表面消毒1分钟，用100％漂白剂消毒60分钟，用去离子的蒸馏水漂洗3次，每次5分钟，然后在潮湿无菌滤纸上在黑暗中萌发3-4天。幼苗进一步用1％Tween-20消毒1分钟，用75％漂白剂消毒5分钟，并用双蒸水漂洗3次，每次5分钟。
表面消毒的种子放在含有Murashige和Skoog基础盐和维生素、20g/L蔗糖、150mg/L天冬酰胺、500mg/L酪蛋白水解物、3g/L Phytagel、10mg/LBAP和5mg/L麦草畏的愈伤组织诱导培养基中。板在25℃黑暗中孵育4周进行种子萌发和胚胎发生愈伤组织诱导。
放在愈伤组织诱导培养上4周后，修剪掉幼苗的芽和根，将愈伤组织转移到新鲜培养基中，另外维持培养4周，然后转移到MSO培养基中光照培养2周。多块愈伤组织(11-17周龄)要么通过10目网筛滤筛并放在愈伤组织诱导培养基上，要么在250ml摇瓶的100ml液体黑麦草愈伤组织诱导培养基(与琼脂愈伤组织诱导相同的培养基)中培养。摇瓶裹在锡箔中，并在23℃黑暗中以175rpm摇1周。用40目网筛滤筛液体培养物，收集细胞。网筛上收集的级分铺板在固体黑麦草愈伤组织诱导培养基上并在25℃黑暗中培养1周。然后将愈伤组织转移到含1％蔗糖的MS培养基上并培养2周。
转化可用农杆菌或用粒子轰击法实现。创建表达载体，在pUC载体中含有组成型植物启动子和基因的cDNA。利用Qiagen试剂盒按照制造商的说明由大肠杆菌细胞制备质粒DNA。大约2g胚胎发生愈伤组织铺在皮氏培养皿中无菌滤纸的中央。向滤纸添加带有10g/L蔗糖的液体MSO等分试样。金颗粒(1.0μm大小)按照Sanford等，1993的方法用质粒DNA包裹，并以如下参数递送到胚胎发生愈伤组织中：每枪500μg颗粒和2μg DNA、1300psi，从制动板到愈伤组织板的靶距离为8.5cm，且每板愈伤组织1枪。
轰击后，将愈伤组织转移回到新鲜的愈伤组织发育培养基中，并在室温黑暗中维持1周的时间。然后将愈伤组织转移到25℃光照的生长条件以用适当的选择剂例如250nM Arsenal、5mg/L PPT或50mg/L卡那霉素起始胚胎分化。出现对选择剂具有抗性的芽，一旦生根则转移到土壤中。
原代转基因植物(T0)样品通过PCR分析以确认T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交确认，其中DNA可以在1％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。利用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR来制备地高辛标记的探针，并如制造商所建议的那样使用。
转基因T0黑麦草植物通过切蘖进行无性繁殖。移植的蘖在温室中维持2个月，直至充分建殖。产生T1或T2代植物，并进行胁迫或非胁迫条件，例如低温实验，例如如上文实施例1所述。
为评估产量增加，将例如低温耐受性，生物量产量、固有产量和/或干物质产量和/或种子产量与例如相应的非转基因野生型植物相比较。例如，具有增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高的胁迫耐受性，例如具有增加的养分利用效率或增加的固有产量以及例如具有更高的低温耐受性的植物，与无转基因的植物、例如相应的非转基因野生型植物相比时，在低温条件下可以显示出增加的生物量产量和/或干物质产量和/或种子产量。
实施例16：通过过表达YRP基因、例如低温抗性和/或耐受性相关基因，来自拟南芥、欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻的基因，工程化构建具有增加的产量的大豆植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性、优选低温耐受性和/或增加的生物量产量。
根据在德克萨斯农工大学(Texas A&M)专利US 5,164,310中所述方法的如下改良方案转化大豆。若干商业大豆品种通过该方法转化。栽培种Jack(得自伊利诺斯种子公司(the Illinois Seed foundation))通常用于转化。种子通过在70％(v/v)乙醇中浸泡6分钟和在补加0.1％(v/v)Tween的25％商业漂白剂(NaOCl)中浸泡20分钟，接着用无菌双蒸馏水漂洗4次进行消毒。七日龄幼苗通过从各幼苗切下胚根、下胚轴和一个子叶来繁殖。然后将具有一个子叶的上胚轴转移到皮氏培养中新鲜的萌发培养基上，并在25℃以16小时的光周期(约100μmol/m2s)孵育三周。从3-4周龄的植物切下腋结(约4mm长)。可切下腋结并与农杆菌LBA4404培养物一起孵育。
许多不同的双元载体系统已经描述用于植物转化(例如An G.，inAgrobacterium Protocols，Methods in Molecular Biology，44卷，47-62页，Gartland K.M.A.和Davey M.R.编辑Humana Press，Totowa，NewJersey)。许多基于Bevan(Nucleic Acid Research.12，8711(1984))所述的pBIN19载体，其包括侧接根癌农杆菌Ti质粒左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒包括至少两种基因--选择标记基因和调控性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可利用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,7673,666和6,225,105)。与此类似，多种启动子可用来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，利用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
在共培养处理后，洗涤外植体并转移到补加500mg/L特美汀的选择培养基中。切下芽并置于芽伸长培养基中。将长度大于1cm的芽置于生根培养基中2-4周，之后移植到土壤中。
原代转基因植物(T0)通过PCR分析以确认T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交确认，其中DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。利用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR来制备地高辛标记的探针，并如制造商所建议的那样使用。
过表达YRP基因、例如来自拟南芥、欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻的低温抗性和/或耐受性相关基因的大豆植物显示出增加的产量，例如具有更高的种子产量。
产生T1或T2代植物，并进行胁迫和非胁迫条件，例如低温实验，例如如上文实施例1所述。
为评估产量增加，将例如低温耐受性，生物量产量、固有产量和/或干物质产量和/或种子产量与例如相应的非转基因野生型植物相比较。例如，具有增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高的胁迫耐受性，例如具有增加的养分利用效率或增加的固有产量以及例如具有更高的低温耐受性的植物，与无转基因的植物、例如相应的非转基因野生型植物相比时，在低温条件下可以显示出增加的生物量产量和/或干物质产量和/或种子产量。
实施例17：通过过表达YRP基因、例如低温抗性和/或耐受性相关基因，例如来自拟南芥、欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻的基因，来工程化构建具有增加的产量的油菜籽/芸苔植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性、优选低温耐受性和/或增加的生物量产量。
利用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为外植体进行组织培养，并根据Babic等(Plant Cell Rep 17，183(1998))进行转化。商业栽培种Westar(加拿大农业(Agriculture Canada))是用作转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。
含双元载体的根癌农杆菌LBA4404用于芸苔转化。许多不同的双元载体系统已经描述用于植物转化(例如An G.，in Agrobacterium Protocols，Methods in Molecular Biology，44卷，47-62页，Gartland K.M.A.和DaveyM.R.编辑Humana Press，Totowa，New Jersey)。许多基于Bevan(NucleicAcid Research.12，8711(1984))所述的pBIN19载体，其包括侧接根癌农杆菌Ti质粒左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒包括至少两种基因--选择标记基因和调控性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可利用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,7673,666和6,225,105)。与此类似，多种启动子可用来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，利用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
芸苔种子在70％乙醇中表面消毒2分钟，然后在加有一滴Tween-20的30％Clorox中消毒10分钟，接着用无菌蒸馏水漂洗3次。种子随之在无激素、含1％蔗糖、0.7％phytagar的半强度MS培养基中于23℃、16小时光照，体外萌发5天。从体外幼苗切下附着有子叶的子叶柄外植体，并通过将柄外植体的切割端浸入细菌悬液中来接种农杆菌。然后将外植体在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％phytagar的MSBAP-3培养基中于23℃、16小时光照培养2天。与农杆菌共培养2天后，将柄外植体转移到含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基中培养7天，然后在具有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到芽再生。当芽长5-10mm时，将其切下并转移到芽伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)中。将约2cm长的芽转移到生根培养基(MSO)中进行根诱导。
原代转基因植物(T0)样品通过PCR分析以确认T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交确认，其中DNA可在1％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。利用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR来制备地高辛标记的探针，并如制造商所建议的那样使用。
转基因植物随之根据实施例2中所述的方法评价其增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高的胁迫耐受性，例如增强的低温耐受性和/或增加的生物量产量。发现过表达YRP基因、例如来自拟南芥、欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻的低温抗性和/或耐受性相关基因的转基因油菜籽/芸苔，与无转基因的植物、例如相应的非转基因对照植物相比，显示出增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高的胁迫耐受性，例如具有增强的低温耐受性和/或增加的生物量产量。
实施例18：通过过表达YRP基因、例如低温耐受性相关基因，来自拟南芥、欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻的基因，来工程化构建具有增加的产量的玉米植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性、优选低温耐受性和/或增加的生物量产量。
用Ishida等(Nature Biotech 14745(1996))所述方法的改良方案进行玉米(玉蜀黍)的转化。在玉米中转化是基因型依赖性的，并且只有特定的基因型才能转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学(University ofMinnesota))或以A188为亲本的杂种是转化供体材料的优秀来源(Fromm等Biotech 8，833(1990))，但是也可以成功使用其它基因型。大约授粉后11天(DAP)，当未成熟胚的长度约1至1.2mm时，从玉米植物中收获穗。未成熟胚与携带“超级双元”载体的根癌农杆菌进行共培养，并通过器官发生回收转基因植物。日本烟草的超级双元载体系统在WO专利WO94/00977和WO 95/06722中描述。载体按照所说明的那样构建。可利用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(美国专利6,025,541)。与此类似，多种启动子可用来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，利用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
切下的胚在愈伤组织诱导培养基、然后玉米再生培养基(含有咪唑啉酮作为选择剂)上生长。皮氏培养皿于25℃在光照下孵育2-3周，或直到发育出芽。从每个胚中将绿芽转移到玉米生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对咪唑啉酮除草剂呈现出耐受性且为转基因PCR阳性的植物产生T1种子。
然后根据实施例2中所述的方法来评价T1转基因植物增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高的胁迫耐受性，例如具有增强的低温耐受性和/或增加的生物量产量。T-DNA单基因座插入的T1代将以1∶2∶1的比率发生转基因的分离。含有1或2拷贝转基因的那些子代(3/4的子代)耐受咪唑啉酮除草剂，且与缺乏转基因的那些子代相比呈现出增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高的胁迫耐受性，例如具有增强的低温耐受性和/或增加的生物量产量。耐受性植物具有更高的种子产量。纯合的T2植物呈现出相似的表型。纯合的转基因植物和非转基因植物的杂交植物(F1子代)也呈现出增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高的胁迫耐受性，例如具有增强的低温耐受性和/或增加生物量产量。
实施例19：通过过表达YRP基因、例如低温抗性和/或耐受性相关基因，来自拟南芥、欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻的基因，来工程化构建具有增加的产量的小麦植物，例如增加的产量相关性状，例如增强的胁迫耐受性、优选低温耐受性和/或增加的生物量产量。
通过Ishida等(Nature Biotech.14745(1996))所述的方法进行小麦的转化。转化常用栽培种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT公司获得)。未成熟胚和携带“超级双元”载体的根癌农杆菌进行共培养，并通过器官发生回收转基因植株。日本烟草的超级双元载体系统在WO专利WO 94/00977和WO 95/06722中描述。载体按照所说明的那样构建。可利用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉蜀黍基因(美国专利6,025,541)。与此类似，多种启动子可用来调控性状基因，提供基因转录的组成型、发育、组织或环境调控。在该实施例中，利用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。
在与农杆菌孵育后，胚在愈伤组织诱导培养基、然后再生培养基(含有咪唑啉酮作为选择剂)上培养。皮氏培养皿于25℃在光照下孵育2-3周，或直到发育出芽。从每个胚中将绿芽转移到生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对咪唑啉酮除草剂呈现出耐受性且为转基因PCR阳性的植物产生T1种子。
然后根据实施例2中所述的方法来评价T1转基因植物增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高胁迫耐受性，例如增强的低温耐受性和/或增加的生物量产量。T-DNA单基因座插入的T1代将以1∶2∶1的比率发生转基因的分离。含有1或2拷贝转基因的那些子代(3/4的子代)耐受咪唑啉酮除草剂，且与缺乏转基因的那些子代相比呈现出增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高的胁迫耐受性，例如具有增强的低温耐受性和/或增加的生物量产量。
为评估产量增加，将例如低温耐受性，生物量产量、固有产量和/或干物质产量和/或种子产量与例如相应的非转基因野生型植物相比较。例如，具有增加的产量，例如增加的产量相关性状，例如更高的胁迫耐受性，例如具有增加的养分利用效率或增加的固有产量以及例如具有更高的低温耐受性的植物，与无转基因的植物、例如相应的非转基因野生型植物相比时，可以在低温条件下显示出增加的生物量产量和/或干物质产量和/或种子产量。
实施例20：通过过表达来自酿酒酵母或大肠杆菌或集胞藻的胁迫相关基因，工程化构建在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有增加的产量的稻植物。
稻转化：用含本发明表达载体的农杆菌转化稻植物。将梗稻栽培种日本晴的成熟干种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，接着在0.2％HgCl2中孵育30分钟，继之用无菌蒸馏水洗6次，每次15分钟，进行消毒。然后使无菌的种子在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育四周之后，切下胚胎发生性盾片来源的愈伤组织并在相同的培养基中增殖。两周之后，通过在相同培养基中继代培养另外2周，增殖或者说繁殖愈伤组织。在共培养之前3天，在新鲜培养基上传代培养胚胎发生愈伤组织块(以加强细胞分裂活性)。
将含有本发明表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培养。农杆菌接种于含有适当抗生素的AB培养基中并在28℃培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中至约1(OD600)的密度。接着将悬浮液转移至皮氏培养皿，并将愈伤组织浸于悬浮液15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固体共培养基，并在黑暗中于25℃孵育3天。在选择剂的存在下，共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基中于28℃暗培养四周。在此期间，发育出快速生长的抗性愈伤组织岛。将该物质转移至再生培养基之后在光照下孵育，释放胚胎发生潜力，并在接下来的四至五周发育出芽。将芽从愈伤组织切下并在含有生长素的培养基中孵育2到3周，之后将其从培养基转移至土壤。变硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温室中培养。
对于一个构建体产生约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移到温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留对选择剂呈现出耐受性的单拷贝转基因植物用以收获T1种子。在移植三至五个月后收获种子。该方法以超过50％的比率提供单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996；Chan等人，1993；Hiei等人，1994)。
对于周期性干旱测定，对植物施加重复胁迫而不引起脱水。在整个实验中限制水供应，并对植物进行周期性干旱和重新浇灌。为测量生物量产量，在末次浇灌后一天通过切下枝条并称重之来确定植物鲜重。
实施例21：通过过表达例如来自拟南芥、欧洲油菜、大豆、玉蜀黍或稻的产量和胁迫相关基因，工程化构建在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有增加的产量的稻植物。
稻转化：用含本发明表达载体的农杆菌转化稻植物。将梗稻栽培种日本晴的成熟干种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，接着在0.2％HgCl2中孵育30分钟，继之用无菌蒸馏水洗6次，每次15分钟，进行消毒。然后无菌的种子在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育四周之后，切下胚胎发生性盾片来源的愈伤组织并在相同的培养基中增殖。两周之后，通过在相同培养基中继代培养另外2周，增殖或者说繁殖愈伤组织。在共培养之前3天，在新鲜培养基上传代培养胚胎发生愈伤组织块(以加强细胞分裂活性)。
将含有本发明表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培养。农杆菌接种于含有适当抗生素的AB培养基中并在28℃培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中至约1(OD600)的密度。接着将悬浮液转移至皮氏培养皿，并将愈伤组织浸于悬浮液15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固体共培养基，并在黑暗中于25℃孵育3天。在选择剂的存在下，共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基中于28℃暗培养四周。在此期间，发育出快速生长的抗性愈伤组织岛。将该物质转移至再生培养基之后在光照下孵育，释放胚胎发生潜力，并在接下来的四至五周发育出芽。将芽从愈伤组织切下并在含有生长素的培养基中孵育2到3周，将其从培养基转移至土壤。变硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温室中培养。
对于一个构建体产生约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移到温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留对选择剂呈现出耐受性的单拷贝转基因植物用以收获T1种子。在移植三至五个月后收获种子。该方法以超过50％的比率提供单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996；Chan等人，1993；Hiei等人，1994)。
对于周期性干旱测定，对植物施加重复胁迫而不引起脱水。在整个实验中限制水供应，并对植物进行周期性干旱和重新浇灌。为测量生物量产量，在末次浇灌后一天通过切下枝条并称重之来确定植物鲜重。
在等同程度的干旱胁迫下，耐受性植物能够恢复正常的生长，而敏感植物已经死亡或遭受重大的损伤，导致叶子更为短小以及干物质更少。
附图：
图1.载体VC-MME220-1qcz(SEQ ID NO：41)，用于克隆目的基因进行非靶向表达。
图2.载体VC-MME221-1qcz(SEQ ID NO：46)，用于克隆目的基因进行非靶向表达。
图3.载体VC-MME354-1QCZ(SEQ ID NO：32)，用于克隆目的基因进行质体靶向表达。
图4.载体VC-MME432-1QCZ(SEQ ID NO：42)，用于克隆目的基因进行质体靶向表达。
图5.载体VC-MME489-1QCZ(SEQ ID NO：56)，用于克隆目的基因进行非靶向表达和克隆靶向序列。
图6.载体pMTX0270p(SEQ ID NO：9)，用于克隆靶向序列。
图7.载体pMTX155(SEQ ID NO：31)，用于克隆目的基因进行非靶向表达。
图8.载体VC-MME356-1QCZ(SEQ ID NO：34)，用于线粒体靶向表达。
图9.载体VC-MME301-1QCZ(SEQ ID NO：36)，用于优先在种子中的非靶向表达。
图10.载体pMTX461korrp(SEQ ID NO：37)，用于优先在种子中的质体靶向表达。
图11.载体VC-MME462-1QCZ(SEQ ID NO：39)，用于优先在种子中的线粒体靶向表达。
图12.载体VC-MME431-1qcz(SEQ ID NO：44)，用于线粒体靶向表达。
图13.载体pMTX447korr(SEQ ID NO：47)，用于质体靶向表达。
图14.载体VC-MME445-1qcz(SEQ ID NO：49)，用于线粒体靶向表达。
图15.载体VC-MME289-1qcz(SEQ ID NO：51)，用于优先在种子中的非靶向表达。
图16.载体VC-MME464-1qcz(SEQ ID NO：52)，用于优先在种子中的质体靶向表达。
图17.载体VC-MME465-1qcz(SEQ ID NO：54)，用于优先在种子中的线粒体靶向表达。
Figure BDA0000062525460002401
Figure BDA0000062525460002411
Figure BDA0000062525460002421
Figure BDA0000062525460002431
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Figure BDA0000062525460002481
Figure BDA0000062525460002491
Figure BDA0000062525460002501
Figure BDA0000062525460002511
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Figure BDA0000062525460002621
Figure BDA0000062525460002631

Claims (38)

1.产生与相应的野生型植物相比产量增加的植物的方法，所述方法包括至少如下步骤：在植物或其部分中增加或生成选自以下的一种或多种活性：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白活性。
2.产生与相应野生型植物相比产量增加的植物的方法，包括选自以下的至少一个步骤：
(i)增加或生成包含分别如表II或表IV第5或7栏所示的多肽、共有序列或至少一种多肽基序的多肽的活性；
(ii)增加或生成包含一种或多种表I第5或7栏所示多核苷酸的核酸分子的表达产物的活性，和
(iii)增加或生成(i)或(ii)的功能等同物的活性。
3.权利要求1或2的方法，包含
(i)增加或生成至少一种核酸分子的表达；和/或
(ii)增加或生成至少一种核酸分子表达产物的表达；和/或
(iii)增加或生成至少一种核酸分子编码的表达产物的一种或多种活性，其中所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：
(a)编码表II第5或7栏所示多肽的核酸分子；
(b)表I第5或7栏所示的核酸分子；
(c)核酸分子，其由于遗传密码简并性可由表II第5或7栏所示的多肽序列获得，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(d)核酸分子，其与包含表I第5或7栏所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少约95％的同一性，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(e)核酸分子，其编码的多肽与(a)至(c)中核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少约95％的同一性，并具有包含表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(f)核酸分子，其与(a)至(c)中的核酸分子在严格杂交条件下杂交，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(g)核酸分子，其编码的多肽可借助于针对(a)至(e)中核酸分子之一所编码的多肽制备的单克隆或多克隆抗体分离，并具有包含表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；
(h)核酸分子，其编码的多肽包含表IV第7栏所示的共有序列或一种或多种多肽基序，且优选具有包含表II或IV第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；
(i)核酸分子，其编码的多肽具有表II第5栏所示蛋白质所呈现的活性，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(j)核酸分子，其所包含通过利用表III第7栏的引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得的多核苷酸，且优选具有包含表II或IV第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；和
k)核酸分子，其可通过在严格杂交条件下、用包含(a)或(b)中核酸分子的互补序列的探针或用其片段来筛选适宜的核酸文库而获得，且编码具有包含表II第5栏所示多肽的蛋白质所呈现的活性的多肽，其中所述探针片段具有(a)至(e)中所表征的核酸分子序列的互补核酸分子的至少约50nt。
4.产生与相应未转化野生型植物相比产量增加的转基因植物的方法，所述方法包括用核酸分子转化植物细胞或植物细胞核或植物组织，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：
(a)编码表II第5或7栏所示多肽的核酸分子；
(b)表I第5或7栏所示的核酸分子；
(c)核酸分子，其由于遗传密码简并性可由表II第5或7栏所示的多肽序列获得，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(d)核酸分子，其与包含表I第5或7栏所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少约95％的同一性，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(e)核酸分子，其编码的多肽与(a)至(c)中核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少约95％的同一性，并具有包含表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(f)核酸分子，其与(a)至(c)中的核酸分子在严格杂交条件下杂交，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(g)核酸分子，其编码的多肽可借助于针对(a)至(e)中核酸分子之一所编码的多肽制备的单克隆或多克隆抗体分离，并具有包含表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；
(h)核酸分子，其编码的多肽包含表IV第7栏所示的共有序列或一种或多种多肽基序，且优选具有包含表II或IV第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；
(i)核酸分子，其编码的多肽具有表II第5栏所示蛋白质所呈现的活性，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(j)核酸分子，其所包含通过利用表III第7栏的引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得的多核苷酸，且优选具有包含表II或IV第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；和
k)核酸分子，其可通过在严格杂交条件下、用包含(a)或(b)中核酸分子的互补序列的探针或用其片段来筛选适宜的核酸文库而获得，且编码具有包含表II第5栏所示多肽的蛋白质所呈现的活性的多肽，其中所述探针片段具有(a)至(e)中所表征的核酸分子序列的互补核酸分子的至少约400nt；
并从转化的植物细胞核、植物细胞或植物组织再生具有增加产量的转基因植物。
5.根据权利要求2至4中任一项的方法，其中增加或生成的一种或多种活性分别为3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白活性。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，与相应野生型植物相比在标准生长条件、低温、干旱或非生物胁迫条件下导致增加的产量。
7.分离的核酸分子，其包含选自以下的核酸分子：
(a)编码表II B第5或7栏所示多肽的核酸分子；
(b)表I B第5或7栏所示的核酸分子；
(c)核酸分子，其由于遗传密码简并性可由表II第5或7栏所示的多肽序列获得，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(d)核酸分子，其与包含表I第5或7栏所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少约95％的同一性，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(e)核酸分子，其编码的多肽与(a)至(c)中核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少约95％的同一性，并具有包含表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(f)核酸分子，其与(a)至(c)中的核酸分子在严格杂交条件下杂交，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(g)核酸分子，其编码的多肽可借助于针对(a)至(e)中核酸分子之一所编码的多肽制备的单克隆或多克隆抗体分离，并具有包含表I第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；
(h)核酸分子，其编码的多肽包含表IV第7栏所示的共有序列或一种或多种多肽基序，且优选具有包含表II或IV第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；
(i)核酸分子，其编码的多肽具有表II第5栏所示蛋白质所呈现的活性，且赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量；
(j)核酸分子，其所包含通过利用表III第7栏的引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得的多核苷酸，且优选具有包含表II或IV第5栏所示多核苷酸的核酸分子所呈现的活性；和
(k)核酸分子，其可通过在严格杂交条件下、用包含(a)或(b)中核酸分子的互补序列的探针或用其片段来筛选适宜的核酸文库而获得，且编码具有包含表II第5栏所示多肽的蛋白质所呈现的活性的多肽，其中所述片段具有(a)至(e)中所表征的核酸分子序列的互补核酸分子的至少约400nt。
8.权利要求7的核酸分子，其中根据(a)至(k)的核酸分子与表1A第5或7栏所示的序列具有至少一个或多个核苷酸的差异，优选的所述核酸分子编码与表IIA第5或7栏所示的蛋白质序列具有至少一个或多个氨基酸差异的蛋白质。
9.赋予权利要求7或8的所述核酸分子的表达的核酸构建体，其包含一种或多种调控元件。
10.包含权利要求7或8所述的核酸分子或权利要求9的核酸构建体的载体。
11.产生多肽的方法，其中所述多肽在如权利要求11所述的宿主细胞核或宿主细胞中表达。
12.多肽，其由权利要求12所述的方法产生，或由权利要求7或8所述的核酸分子编码，或如表II B所示，其中所述多肽与表IIA所示的序列具有一个或多个氨基酸的差异。
13.抗体，其与如权利要求13所述的多肽特异性结合。
14.植物细胞核、植物细胞、植物组织、繁殖材料、花粉、子代、收获材料或植物，其包含如权利要求7或8所述的核酸分子或如权利要求11所述的宿主细胞核或宿主细胞。
15.植物细胞核、植物细胞、植物组织、繁殖材料、种子、花粉、子代、或植物部分，再生后能够得到产量增加的植物；或产量增加的植物；或其部分；其与相应野生型相比增加的产量通过根据权利要求1至6中任一项的方法，或通过转化如权利要求7或8所述的核酸分子或权利要求9的核酸构建体而产生。
16.权利要求15的转基因植物细胞核、转基因植物细胞、转基因植物或其部分，来源于单子叶植物。
17.权利要求15的转基因植物细胞核、转基因植物细胞、转基因植物或其部分，来源于双子叶植物。
18.权利要求15的转基因植物细胞核、转基因植物细胞、转基因植物或其部分，其中相应的植物选自玉米(玉蜀黍)、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽油菜、包括芸苔和冬油菜籽油菜、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻子、樱草、油菜籽、球茎甘蓝(turnip rape)、万寿菊、茄科植物、包括马铃薯、烟草、茄子、番茄；蚕豆属、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属、油棕、椰子、多年生草、饲料作物和拟南芥。
19.权利要求15的转基因植物细胞核、转基因植物细胞、转基因植物或其部分，其中植物选自：玉米、大豆、油菜籽油菜(包括芸苔和冬油菜籽油菜)、棉花、小麦和稻。
20.包含权利要求14至19任一项的一种或多种植物细胞核或植物细胞、子代、种子或花粉，或由权利要求14至19中任一项的转基因植物产生的转基因植物。
21.包含源自权利要求6至9中任一项的转基因植物或由权利要求6至9中任一项的转基因植物产生的一种或多种所述转基因植物细胞核或植物细胞、子代、种子或花粉的转基因植物、转基因植物细胞核、转基因植物细胞、植物，其中所述包含一种或多种所述转基因植物细胞核或植物细胞、子代、种子或花粉的转基因植物、转基因植物细胞核、转基因植物细胞、植物在遗传上对于如下转基因而言是纯合的，所述转基因赋予转基因植物或其部分与相应未转化的野生型植物细胞相比增加的产量。
22.用于在植物细胞、转基因植物或其部分中鉴定在转基因植物或其部分中赋予与相应未转化的野生型植物细胞相比增加产量的化合物的方法，包括步骤：
(a)培养植物细胞；表达权利要求12的多肽和读出系统的转基因植物或其部分，其中所述读出系统能够在允许所述多肽与所述读出系统在化合物或含有多种化合物的样品的存在下相互作用的适宜条件下与所述多肽相互作用，且能够在允许表达读出系统以及表达由权利要求12的核酸分子编码的多肽的条件下，响应化学化合物与所述多肽的结合而提供可检测的信号；
(b)通过检测所述读出系统所产生的信号的存在或不存在或增加，来鉴定所述化合物是否为有效的激动剂。
23.产生农业组合物的方法，包括权利要求22的方法的步骤，和以农业应用可接受的形式配制权利要求22的方法中所鉴定的化合物。
24.组合物，其包含权利要求7或8的核酸分子，权利要求9的核酸构建体，权利要求10的载体，权利要求12的多肽，权利要求22的化合物，和/或权利要求13的抗体；和任选的可农业使用的载体。
25.权利要求12的多肽或核酸分子，其选自酵母或大肠杆菌。
26.权利要求7或8的核酸在制备与相应未转化野生型植物相比产量增加的植物中的用途。
27.根据权利要求7或8的核酸作为标记物在鉴定或选择与相应未转化野生型植物相比产量增加的植物中的用途。
28.根据权利要求17的核酸或其部分作为标记物在检测植物或植物细胞产量增加中的用途。
29.鉴定产量增加的植物的方法，包括对一种或多种植物细胞核、植物细胞、植物组织或植物或其部分的群体筛选选自以下的活性：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白活性，将所述活性水平与参照的活性水平进行比较；鉴定与参照相比活性增加的一种或多种植物细胞核、植物细胞、植物组织或植物或其部分，任选地由所鉴定的植物细胞核、细胞或组织产生植物。
30.鉴定产量增加的植物的方法，包括对一种或多种植物细胞核、植物细胞、植物组织或植物或其部分的群体筛选编码赋予选自以下活性的多肽的核酸的表达水平：3-磷酸甘油酸脱氢酶、腺苷酸激酶、B2758-蛋白质、环核苷酸磷酸二酯酶、半胱氨酸合酶、多磷酸外切酶、牻牛儿基牻牛儿基还原酶、交配激素A-因子前体、线粒体琥珀酸-反丁烯二酸转运蛋白、修饰甲基化酶HemK家族蛋白、肌醇转运蛋白、氧化还原酶亚基、肽基脯氨酰顺反异构酶、蛋白激酶、核糖-5-磷酸异构酶、slr1293-蛋白、YDR049W-蛋白、YJL181W-蛋白和YPL109C-蛋白活性，将所述表达水平与参照进行比较；鉴定与参照相比表达水平增加的一种或多种植物细胞核、植物细胞、植物组织或植物或其部分，任选地由所鉴定的植物细胞核、细胞或组织产生植物。
31.根据权利要求1至6中任一项的方法或根据权利要求14至20中任一项的植物，其中所述植物显示改进的产量相关性状。
32.根据权利要求1至6中任一项的方法或根据权利要求14或15中任一项的植物，其中所述植物显示改进的养分利用效率和/或非生物胁迫耐受性。
33.根据权利要求1至6中任一项的方法或根据权利要求14至20中任一项的植物，其中所述植物显示改进的增加的低温耐受性。
34.根据权利要求1至6中任一项的方法或根据权利要求14至20中任一项的植物，其中所述植物显示可收获产量的增加。
35.根据权利要求1至6中任一项的方法或根据权利要求14至20中任一项的植物，其中所述植物显示改进，其中产量增加基于每株植物或相对于特定的可耕作面积来计算。
36.增加植物群体产量的方法，其包含检查种植地区的生长温度，将所述温度与考虑种植的植物物种或品种的最佳生长温度进行比较，如果生长温度对于该考虑种植的植物物种或品种的种植和生长不是最佳的，则种植和生长权利要求14至20或31至35中任一项的植物。
37.前述权利所述的方法，其包含收获产生或种植的植物的植物或部分，并用收获的植物或其部分或从其中产生燃料。
38.前述权利所述的方法，其中所述植物可用于淀粉生产，包括收获可以用于淀粉分离的植物部分，并由该植物部分分离淀粉。
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