CN112125965A - 水稻株型调控相关sd11基因、表达载体、表达产物及应用 - Google Patents

水稻株型调控相关sd11基因、表达载体、表达产物及应用 Download PDF

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    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Abstract

本发明公开了一种水稻株型调控相关SD11基因、表达载体、表达产物及应用。本发明SD11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示,以及其重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。此外,该SD11基因编码的SD11蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明SD11基因可在作物中稳定表达,可应用于转基因植物培育以及水稻株型遗传改良中。本发明提供一种新的植物矮源基因,可以有效地解决目前植物育种矮源基因单一的问题,为培育优质高产的植物新品种提供种质资源。

Description

水稻株型调控相关SD11基因、表达载体、表达产物及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,尤其涉及一种水稻株型调控相关SD11基因、其表达载体、表达产物及其应用。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物,稳定并提高水稻的产量对保障我国的粮食安全具有重要意义。株型是水稻重要的农艺性状,直接影响水稻的产量。水稻株型主要包括株高、分蘖数、叶夹角和穗部形态,挖掘克隆水稻株型调控相关基因,对培育水稻新品种具有重要意义。
在决定植物株型的过程中,有许多因素,特别是植物激素,可以影响叶倾角、株高和分蘖数的发育,从而调控水稻的株型。植物激素赤霉素、生长素、油菜素内酯以及独角金内酯影响植物株高、分蘖角、叶倾角以及分蘖的发育。“绿色革命”基因Sd1编码GA20氧化酶,参与赤霉素的生物合成,是赤霉素合成途径中的关键酶。油菜素内酯信号受体OsBRI1参与控制水稻节间伸长、叶倾角以及暗形态建成。D53编码一个与I类Clp ATP酶类似的蛋白,负调控独脚金内酯信号转导,其突变体表现为株高矮化、分蘖增多。然而,植物株型的调控网络及其复杂,仍然有许多未知的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可在作物中稳定表达、且表达量高、水稻株型调控效果好的水稻株型调控相关SD11基因及其编码SD11蛋白,并将其应用于表达载体、宿主细胞的转化构建等;
本发明的另一目的在于将改造的水稻株型调控相关SD11基因转化水稻或其他植物,从而提高水稻等植物的株型特性。通过转基因及常规育种手段,把水稻株型调控相关SD11基因转入生产中普遍应用的自交系中,为水稻等植物的株型改造提供一条有效的途径。
本发明是这样实现的,一种水稻株型调控相关SD11基因,其核苷酸序列如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示。
本发明进一步公开了一种将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与株型相关的由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2衍生的基因。
本发明进一步公开了一种由上述SD11基因编码的SD11蛋白,其氨基酸序列如SEQID NO:3所示。
本发明进一步公开了一种将SEQ ID NO:3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与株型相关的由SEQ ID NO:3衍生的蛋白质。
本发明进一步公开了一种含有上述SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的SD11基因或所述衍生的基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
优选地,所述重组表达载体是在pCUBi1390的多克隆位点HindⅢ和BamHI之间插入上述SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的SD11基因或所述衍生的基因后得到的重组质粒。
本发明进一步公开了上述SD11基因、所述衍生的基因或所述植物表达载体在培育转基因植物中的应用。
本发明进一步公开了上述SD11基因、所述衍生的基因或所述植物表达载体在水稻株型遗传改良中的应用。
相比于现有技术的缺点和不足,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明克隆鉴定得到一个新的编码水稻株型相关蛋白的SD11基因,将编码该水稻株型相关蛋白的SD11基因导入发生植株矮化的植物中,可以得到株高变高的转基因植物,取得了预料不到的技术效果,所述SD11蛋白及其编码SD11基因可以应用于作物的株型遗传改良,且能在植物细胞中稳定的表达;
(2)本发明提供一种新的植物矮源基因,可以有效地解决目前植物育种矮源基因单一的问题,为培育优质高产的植物新品种提供种质资源。
附图说明
图1是突变体sd11的分子鉴定;
图2是突变体sd11的表型;
图3是野生型和突变体sd11主要的农艺性状;
图4是SD11转基因互补验证T1代纯和家系。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1、控制植物株型相关蛋白及其编码基因的发现
一、水稻矮化突变体sd11的分子鉴定与表型观察
水稻矮化突变体sd11来自粳稻品种日本晴CRISPR/Cas9敲除突变体库中筛选获得的。
图1基因测序表明,相比野生型,sd11缺失2个碱基,图2为野生型和突变体sd11抽穗期表型图,表现为相比野生型,sd11植株矮化。
图3为野生型和突变体sd11成熟期主要农艺性状比较,包括株高、穗长、分蘖数、结实率,相比野生型,突变体sd11株高降低,结实率下降,穗长变短。
其中,基因测序分析的流程如下:
1、提取野生型和突变体sd11的总DNA作为模板,具体方法如下:
(1)取50mg左右的水稻叶片剪碎,置于100μL的离心管中,加入20-30μL的DNA提取液(北京聚合美生物科技有限公司;MF848),立即用枪头捣碎,置于恒温器95℃加热5min,然后离心1min。
(2)吸取上清液2μL作为模板进行PCR扩增;PCR反应体系(50μL):DNA 2μL,引物2μL,10×Buffer 25μL,dNTP(10mM)10μL,KOD 1μL,ddH2O10μL。
PCR反应程序:94.0℃变性2min;98.0℃变性10s、55℃退火30s、68℃延伸90s,循环数为33;68℃延伸5min;4℃保存5min。
(3)将上述扩增产物委托安徽通用生物进行测序,测序引物序列为:
sd11-F TTGTCCCTTTCCTTCTAATC(SEQ ID NO.4)
sd11-R AAGTTGTCAATCGCCCTCAC(SEQ ID NO.5)
(4)利用DANMAN软件对测序结果进行比对,找出差异位点,如图1。
实施例2、转基因互补植株的获得和鉴定
一、重组表达载体构建
以水稻品种日本晴的DNA为模板,进行PCR,用含HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶位点的引物扩增获得SD11基因的启动子和基因组,PCR引物序列如下:
SD11-Com-F:CCGGCGCGCCAAGCTTCAGATGACGGCTCAACGGAA(SEQ ID NO.6)
SD11-Com-R:GAATTCCCGGGGATCCTGAAGGACTGAAGGCACAAA(SEQ ID NO.7)
扩增程序为:94℃变性2min;98℃变性10s、58℃退火30s、68℃延伸6min,循环数为33;68℃延伸5min;4℃保存10min。
载体pCUBi1390酶切反应体系(50μL):载体1μg,HindⅢ2μL,BamHⅠ2μL,Buffer 5μL,无菌水补足至50μL,37℃水浴30min。而后进行1%的琼脂糖凝胶电泳,切取目的片段与载体,利用南京诺唯赞公司的胶回收/DNA纯化试剂盒(DC301)进行DNA纯化。
采用Infusion重组试剂盒(Clontech)将PCR产物克隆到载体pCUBi1390中,构建成pCUBi1390-SD11pro-gSD11;重组反应体系(10μL):片段5μL,载体2μL,5×Infusionbuffer2μL,Infusion enzyme mix 1μL,50℃水浴30min,取10μL反应体系加入到50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(上海昂羽生物;G6016),冰水浴30min,42℃水浴热激45s,加入300mL LB液体培养基,37℃/150rpm恢复培养45min。将转化细胞全部均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上,37℃倒置培养16h,挑取单克隆进行测序。
二、重组表达载体的遗传转化
上述重组质粒加入100μL农杆菌EHA105感受态中,液氮冷冻2min,37℃水浴5min,加入500μLYEP液体培养基,28℃恢复3h,将转化细胞全部均匀涂布在含50mg/L卡那霉素与利福平的YEP固体培养基上,28℃倒置培养48h,挑取单克隆备用。继而导入株高矮化的受体植物材料sd11中。选用突变体sd11植株的成熟种子制备胚性愈伤组织。
三、转基因植株的鉴定
1、潮霉素抗性基因鉴定
本研究中提取转基因植株的DNA,利用PCR扩增擦潮霉素抗性基因进行琼脂糖凝胶电泳,鉴定转基因植株。DNA提取参照上述基因测序部分。PCR反应体系(10μL):DNA 2μL,引物2μL,10×Buffer 1μL,dNTP(10mM)1μL,KOD 0.1μL,ddH2O 3.9μL。
PCR反应程序:94.0℃变性2min;98.0℃变性10s、55℃退火30s、68℃延伸40s,循环数为33;68℃延伸5min;4℃保存5min。将扩增出潮霉素基因的家系命名为互补。
2、表型鉴定
分别将T1代转基因阳性植株,野生型和突变体sd11种植在淮阴师范学院生物科技园内。在抽穗期选机测量20个T1代阳性转基因单株的株高,结果表明,T1代转基因阳性家系的株高恢复到了野生型的水平,由此验证了转基因前的矮化表型是由SD11基因控制的,即SD11基因为控制株型的相关基因(图4)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 淮阴师范学院
<120> 水稻株型调控相关SD11基因、表达载体、表达产物及应用
<141> 2020-09-17
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1128
<212> DNA
<213> Oryza sativa L
<400> 1
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gaacctccgc aagatggctc tgtcccacct gtggtttcct ctaatatgga ggtccttcat 180
gacaaagtta aaaaacaagt catcaaagaa ggccatggca agaaaccatc aaagttcgcg 240
acgtgctttt tgcactatag agcttgggtt caaggctctc tgcataaatt cgaggatact 300
tggcaagaac agcatcccat tgaactagta attggaaaag agaaaaaaca aatgtctggt 360
ttaggcattg gtgttggtaa catgagaagt ggggagcgtg cactgttgca tgttggctgg 420
gagctaggct atgggaaaga agggagcttt tcattcccaa atgtccctcc aatggcagat 480
cttttatatg aagttgaact tattgggttt gatgatgtca aagaggggaa agcccgaagt 540
gacatgacag tagaggaaag gattgaagca gcggacagga ggaagattga gggcaatgag 600
tatttcaaag aaaagaagtt tgaggaggcc atgcagcaat atgaaatggc gattgcatac 660
atgggagatg acttcatgtt tcaattgttc gggaaataca gagatatggc cttggctgtg 720
aaaaatccat gtcatctcaa catggccgca tgcctaatca aactgaagag attcgatgaa 780
gctatcgcac agtgtagtat tgtgttggca gaggatgaaa acaatgtgaa agcattgttc 840
agacgaggaa aagcaagagc tgaacttggt cagacagaat cagcgaggga ggacttcctg 900
aaagccaaga aacattcccc agaagacaag gagatccagc gtgagcttcg gtctctcgcg 960
gaacaggata aagctctgta ccaaaaacag aaggagctgt acaaaggcct ctttggtcca 1020
aggcccgaac ccaaaccgaa ggcgtcaaat tccatcgttc gcttctggca gtggctcgtg 1080
tccttgattg gttatctcat aaaactgttc aaacccaaga atgaatga 1128
<210> 2
<211> 4139
<212> DNA
<213> Oryza sativa L
<400> 2
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ggtgtcaaat tctacaatct ctcggcattt ttgtgccttc agtccttcac tgcattgtga 4020
cttgagcttt gggagctaaa agttcagaca tttttcctat gaacaataca ttgcctttat 4080
ggtgtcaatg atttggtatg ttatgcggtg ctgaatagtt gaatgatttg ttacgatta 4139
<210> 3
<211> 375
<212> PRT
<213> Oryza sativa L
<400> 3
Met Ala Val Val Glu Glu Glu Glu Gly Ser Pro Pro Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Asp Pro Ala Ser Ser Gly Ser Ser Asp Asn Glu Ile Thr Val
20 25 30
Glu Glu Ala Ser Phe Val His Thr Glu Pro Pro Gln Asp Gly Ser Val
35 40 45
Pro Pro Val Val Ser Ser Asn Met Glu Val Leu His Asp Lys Val Lys
50 55 60
Lys Gln Val Ile Lys Glu Gly His Gly Lys Lys Pro Ser Lys Phe Ala
65 70 75 80
Thr Cys Phe Leu His Tyr Arg Ala Trp Val Gln Gly Ser Leu His Lys
85 90 95
Phe Glu Asp Thr Trp Gln Glu Gln His Pro Ile Glu Leu Val Ile Gly
100 105 110
Lys Glu Lys Lys Gln Met Ser Gly Leu Gly Ile Gly Val Gly Asn Met
115 120 125
Arg Ser Gly Glu Arg Ala Leu Leu His Val Gly Trp Glu Leu Gly Tyr
130 135 140
Gly Lys Glu Gly Ser Phe Ser Phe Pro Asn Val Pro Pro Met Ala Asp
145 150 155 160
Leu Leu Tyr Glu Val Glu Leu Ile Gly Phe Asp Asp Val Lys Glu Gly
165 170 175
Lys Ala Arg Ser Asp Met Thr Val Glu Glu Arg Ile Glu Ala Ala Asp
180 185 190
Arg Arg Lys Ile Glu Gly Asn Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Lys Phe Glu
195 200 205
Glu Ala Met Gln Gln Tyr Glu Met Ala Ile Ala Tyr Met Gly Asp Asp
210 215 220
Phe Met Phe Gln Leu Phe Gly Lys Tyr Arg Asp Met Ala Leu Ala Val
225 230 235 240
Lys Asn Pro Cys His Leu Asn Met Ala Ala Cys Leu Ile Lys Leu Lys
245 250 255
Arg Phe Asp Glu Ala Ile Ala Gln Cys Ser Ile Val Leu Ala Glu Asp
260 265 270
Glu Asn Asn Val Lys Ala Leu Phe Arg Arg Gly Lys Ala Arg Ala Glu
275 280 285
Leu Gly Gln Thr Glu Ser Ala Arg Glu Asp Phe Leu Lys Ala Lys Lys
290 295 300
His Ser Pro Glu Asp Lys Glu Ile Gln Arg Glu Leu Arg Ser Leu Ala
305 310 315 320
Glu Gln Asp Lys Ala Leu Tyr Gln Lys Gln Lys Glu Leu Tyr Lys Gly
325 330 335
Leu Phe Gly Pro Arg Pro Glu Pro Lys Pro Lys Ala Ser Asn Ser Ile
340 345 350
Val Arg Phe Trp Gln Trp Leu Val Ser Leu Ile Gly Tyr Leu Ile Lys
355 360 365
Leu Phe Lys Pro Lys Asn Glu
370 375
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ttgtcccttt ccttctaatc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aagttgtcaa tcgccctcac 20
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ccggcgcgcc aagcttcaga tgacggctca acggaa 36
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gaattcccgg ggatcctgaa ggactgaagg cacaaa 36

Claims (8)

1.一种水稻株型调控相关SD11基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
2.将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与株型相关的由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2衍生的基因。
3.权利要求1所述SD11基因编码的SD11蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.将SEQ ID NO:3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与株型相关的由SEQ ID NO:3衍生的蛋白质。
5.含有权利要求1或权利要求2所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体,其特征在于:所述重组表达载体是在pCUBi1390的多克隆位点HindⅢ和BamHI之间插入权利要求1所述基因或权利要求2所述基因得到的重组质粒。
7.权利要求1所述SD11基因、权利要求2所述基因或权利要求6所述植物表达载体在培育转基因植物中的应用。
8.权利要求1所述SD11基因、权利要求2所述基因或权利要求6所述植物表达载体在水稻株型遗传改良中的应用。
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