KR20150074560A

KR20150074560A - 벼 유래 OsMDB1 유전자를 이용한 초장이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체

Info

Publication number: KR20150074560A
Application number: KR1020130162456A
Authority: KR
Inventors: 김연기; 김정숙; 남백희
Original assignee: 주식회사 그린진 바이오텍
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2015-07-02
Also published as: KR101536894B1

Abstract

본 발명은 벼 유래의 OsMDB1(Oryza sativa MYB DNA-binding domain protein 1)단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMDB1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 초장을 조절하는 방법, 상기 벼 유래의 OsMDB1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 초장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 초장이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 OsMDB1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 초장 조절용 조성물에 관한 것이다.

Description

벼 유래 OsMDB1 유전자를 이용한 초장이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing transgenic plant with regulated height using OsMDB1 gene and the plant thereof}

본 발명은 벼 유래 OsMDB1(Oryza sativa MYB DNA - binding domain protein1)유전자를 이용한 초장이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래의 OsMDB1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMDB1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 초장을 조절하는 방법, 상기 벼 유래의 OsMDB1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 초장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 초장이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 OsMDB1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 초장 조절용 조성물에 관한 것이다.

벼농사에서 냉해, 한해, 침관수 피해 등 여러 가지 기상재해가 문제시되나, 그 중에서도 수량감소와 미질에 크게 영향을 주는 것이 생육 후기 집중호우나 태풍에 의하여 발생하는 도복이다. 벼 도복피해는 바람과 강우가 주된 원인이 되지만 재배되는 품종 및 재배기술에 따라서도 영향을 크게 받는다. 특히, 품종적으로 줄기가 약하고 키가 크며 이삭이 큰 품종은 도복에 매우 약한 특성을 지닌다. 도복에 의한 벼의 수량감소 양상을 보면, 이삭이 나온 후 빠르면 빠를수록 도복피해는 더 커지게 된다. 이러한 수량감소에 직접적인 영향을 주는 것은 등숙비율과 천립중의 감소이며, 등숙비율은 도복이 늦어질수록 그 감소가 경미하게 되어 도복피해는 현저하게 낮아지게 된다. 또한, 미질에 미치는 영향은 도복의 발생 시기에 따라 다른데, 호숙기도복의 경우는 청미비율이 크게 증가되어 결국 양질미 생산이 어려워진다고 한다.

이러한 도복에 대한 대책으로는 다양한 품종적, 재배적 조치들이 있으나, 우선적으로 내도복성이 강한 품종을 육성하고 보급하는 것이 절대적으로 요망된다. 내도복성이 강한 품종은 벼의 키가 작으면서 줄기가 강하고 뿌리의 발달이 왕성한 품종적 특성이 요망된다. 이러한 내도복성 품종을 육성하기 위해서는 전통적으로 초장이 작은 왜성의 유전자를 가진 왜성벼와 일반품종의 교배육종을 통하여 반왜성벼를 육종하는 방법이 이용되어 왔다.

한편, MYB 단백질은 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 조절하는 전사조절 인자로서, 모든 진핵생물에 다양하게 존재하고 있다. 특히 R2R3-MYB 전사인자는 1차 및 2차 대사 과정, 식물 발달 과정, 생물학적, 비생물학적 환경 스트레스에 관련하는 것으로 알려져 있다.

한국등록특허 제1250870호에는 '벼 유래의 Myb4 유전자의 과발현에 의한 내냉성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0795372호에는 '벼의 신규 기능성 유전자 RAP7을 이용하여 형질전환된 내도복성 벼 식물'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 벼 유래 OsMDB1 유전자를 이용한 초장이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 벼 OsMDB1은 다른 조직과 비교했을 때 벼 이삭의 초기 단계에서 주로 발현하는 것을 RT-PCR을 통해서 확인했고, 이 유전자를 항시 발현 PGD 프로모터에 연결시킨 운반체를 제작하여 벼에 형질전환 하였고, 출수 시기(Heading stage) 형질전환체의 이삭(panicle), 잎집(sheath), 지엽(flag leaf)에서 각각 OsMDB1의 과발현을 확인하였으며, 이들을 대상으로 마이크로어레이 실험을 수행한 결과, 야생형에 비해 형질전환체에서 ATP 합성(bin9), 세포벽 관련 유전자(bin10), 이차 대사(bin16), 호르몬 대사(bin17) 관련 유전자들의 2배 이상 증가 또는 감소를 확인하였다. 특히, OsMDB1의 과발현 형질전환체는 야생형보다 벼의 간장길이가 55~70% 감소한 것을 확인함으로써 OsMDB1이 벼의 초장을 줄이는데 유용한 유전자로서의 활용성을 입증함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 OsMDB1(Oryza sativa MYB DNA-binding domain protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMDB1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 초장을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벼 유래의 OsMDB1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 초장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 초장이 조절된 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 OsMDB1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 초장 조절용 조성물을 제공한다.

우리나라의 벼농사에서 냉해, 한해, 침관수 피해 등 여러 가지 기상재해가 있으나 그 중에서도 수량감소와 미질에 크게 영향을 주는 것은 생육후기 집중호우나 태풍에 의하여 발생되는 도복이다. 일반적으로 해마다 반복되는 결실기 벼 도복방지의 필요성에 대하여서는 크게 공감하고 있으나, 논 면적의 광활함이나 강한 풍수해와 같은 자연 재난에 대하여서는 확실한 대비책을 강구할 수 없는 형편이었으며, 벼 도복방지의 근본적인 대책은 내도복성 품종재배로 여겨졌다. 이러한 벼 도복은 벼의 초장과 밀접한 관계가 있다. 본 발명을 통해 OsMDB1 과발현된 형질전환체에서 야생형과 비교하여 벼의 간장길이가 55~70% 감소한 것이 확인됨에 따라 OsMDB1 유전자는 벼의 도복에 대한 저항성을 높이는데 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 다른 R2R3-MYB 서브그룹들 간의 관계 모식도이다. 계통수는 총 길이 서열로 ClustalW(http://ebi.ac.uk)와 Phylip 패키지(Neighbor-joining method)에 의해 구축되었고 트리뷰(TreeView)를 이용하여 가시화했다.
도 2는 애기장대(Arabidopsis thaliana)와 벼(Oryza sativa)로부터 보존된 MYB 도메인의 아미노산 서열 정렬을 ClustalW(http://ebi.ac.uk)를 이용하여 구축한 결과이다.
도 3은 캘러스, 재분화된 캘러스, 잎, 뿌리, 출수 20, 18, 6, 및 2일 전 이삭, 출수시기의 벼 전사조절인자의 발현을 보여준다.
도 4는 벼 형질전환에 사용된 발현 벡터에 대한 모식도이다. OsMDB, 벼 MYB DNA 결합 도메인 단백질; PGD pro, 벼 6-글루콘산-6-인산탈수소효소 프로모터; 3'PinII, 감자 단백질가수분해효소 저해제 II 종결자; Wsi, LEA_4, 발생후기 어번던트 프로모터; GFP, 녹색 형광 단백질; 35S pro, 컬리플라워 모자이크바이러스 35S 프로모터; Bar, 포스피노트리신 아세틸트렌스퍼레이즈; Noster, 노팔린 합성 종결자.
도 5는 PGD:MDB 형질전환된 벼의 표현형이다(T3 세대).
도 6은 필드에서 벼의 초장을 측정한 결과이다(T3 세대).
도 7은 출수 시기에 야생형, PGD:MDB 및 PGD:HG-MDB 벼에서 OsMDB1 유전자 발현의 RT-PCR 분석 결과이다. 튜불린은 내부 대조구로 사용되었다.
도 8은 OsMDB1에 의해 조절되는 유전자를 동정하기 위한 발현 프로파일링 결과이다. (a) 지엽(flag leaf), (b) 잎집(sheath) 및 (c) 이삭(panicle)에서 야생형과 비교하여 2배 증가 또는 감소된 유전자의 계층적 클러스터링(Hierarchical clustering)을 나타내었다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래의 OsMDB1(Oryza sativa MYB DNA-binding domain protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMDB1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 초장을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 벼 유래의 OsMDB1 단백질 코딩 유전자를 과발현시켜 야생형에 비해 식물체의 초장을 감소시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 초장이 감소되는 식물체는 도복이 방지되는 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 OsMDB1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 OsMDB1 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 초장을 조절하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 OsMDB1 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 OsMDB1 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 또는 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 OsMDB1 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

OsMDB1 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은

벼 유래의 OsMDB1(Oryza sativa MYB DNA-binding domain protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMDB1 유전자의 발현을 조절하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 초장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일구현 예에 따른 방법은 벼 유래의 OsMDB1 단백질 코딩 유전자를 과발현시켜 야생형에 비해 식물체의 초장을 감소시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 초장이 감소되는 식물체는 도복이 방지되는 효과를 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 OsMDB1 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 초장이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

바람직하게는, 상기 형질전환 식물체 및 이의 종자는 초장이 감소된 형질전환 식물체 및 이의 종자이다.

상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 벼이다.

또한 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsMDB1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 초장 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsMDB1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 초장을 감소시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 플라스미드 제작과 아그로박테리움 매개된 벼의 형질전환

PGD1 프로모터(1.9kb)와 노팔린 신타아제 터미네이터 서열(0.2kb)은 PGD1:gfp 플라스미드를 주형으로 프로모터 특이적 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되었고, Wsi18:GFP 플라스미드(Yi et al, 2011, Transgenic Res. 20: 153-63)로 클로닝되어 결과적으로 pSB-PdWiG 플라스미드를 제조하였다. Wsi18:GFP 플라스미드는 각각의 Wsi 프로모터와 CaMV35S 프로모터의 조절 하에 sGFP와 bar 유전자를 포함하였다. 유전자와 클로람페니콜 내성 유전자에 인접한 attR 재조합 자리를 포함하는 Gateway는 평활 말단(blunt-end) 형태로 SB-PdWiG 플라스미드로 클로닝되었고, 이는 SB-Pd2WiG 플라스미드로 제조되었다. OsMDB 유전자는 유전자 특이적인 프라이머 쌍과 PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa, Japan)을 사용한 RT-PCR에 의해 증폭 및 분리되었고, 아답터 프라이머 쌍에 의해 재증폭되었다. 사용된 모든 프라이머 쌍들은 표 1에 정리하였다. 분리된 OsMDB 유전자는 제조사(GatewayCloning Technology, Invitrogen, Carlsbad, CA)의 지시에 따라 LR 반응에 의해 바이너리(binary) 벡터 pSB-Pd2GW로 삽입되었고, 플라스미드 PGD:MDB로 제조되었다. 마지막으로 구축물들은 삼친교배(triparental mating) (Hiei et al., Plant J., 1994, 6(2): 271~82)에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404로 도입되었다. 벼의 성숙 종자(O. sativa L. cv. Ilmi)로부터 얻은 배아 캘러스는 아그로박테리움 투메파시엔스와 공동배양되었고, 4mg/ℓ 포스피노트리신으로 선별되었다. 이는 손 등(Korean J. Breed., 2006, 38(3): 173~179)의 방법으로 형질전환 식물을 재분화하기 위해 사용되었다.

프라이머 염기서열

Primer name	direction	5'→3'(서열번호)
Actin1_F	F	GCCAAGAGGAGCTGTTATCG (3)
Actin1_R	R	CCGCATCAGGCATCTGATTA (4)
tubulin_F	F	ACCGTGATTGATGAGGTGAG (5)
tubulin_R	R	CAGCGTTGAACACAAGGAAG (6)
Myb4_attB1	F	AAAAAGCAGGCTGATATCATGGGACGGCACG (7)
Myb4_attB2	R	AGAAAGCTGGGTTCAGTGGTGGTGGTGGT (8)
Myb4_700F	F	GTGAACAATGCGCTCGAGA (9)
Myb4_906R	R	TCATCGGAAGTACTCGAAG (10)

실시예 2: RNA 분리와 RT - PCR

총 RNA는 TRI REAGENT(Molecular Research Center, 미국)를 사용하여 형질전환 벼 및 야생형 벼로부터 추출했고, Qiagen RNeasy mini kit(Qiagen, 독일)로 정제되었다. cDNA 주형은 RevertAid H minus M-MulV 역전사 효소(Fermentas, 미국)에 의해 합성되었다. 반정량적 RT-PCR을 위해 PCR 증폭은 20㎕ 부피로 다음의 방법을 따라 수행되었다: 95℃ 2분 1회, 94℃ 30초 30회, 60℃ 30초, 72℃ 30초. 벼 튜불린 유전자(Os11g0247300)와 액틴(Os03g0718100)은 내부 대조구으로 사용되었다. 모든 프라이머 쌍들은 표 1에 정리했다.

총 RNA는 형질전환 벼(7 및 23 라인)와 야생형 벼의 출수 6일 전에 지엽(flag leaf), 잎집(sheah), 그리고 이삭(panicle)로부터 추출되었다. 발현 프로파일링은 NimbleGen(http://www.nimblegen.com/)에서 제조된 벼 135k 마이크로어레이로 수행되었다. 벼 마이크로어레이를 위한 프로브들은 IRGSP, RAP2 데이타베이스 (http://rapdb.lab.nig.ac.jp)에 등록된 31,439개의 유전자로부터 디자인했다. 60개 뉴클레오타이드의 네 개의 프로브들은 유전자의 3' 영역내 150bp 부분에 해당되도록 정지코돈의 60bp 위쪽에서 시작하는 각각의 염기서열과 30 bp 이동하여 결합하는 염기서열로 디자인되었다. 마이크로어레이는 Cy3 시그널에 대해 5㎛ 해상도로 Genepix 4000 B(Molecular Devices, 미국) 프리셋으로 스캔되었다. 시그널은 Nimblescan으로 디지털화되고 분석되었다. 결과는 칩 사이에 시그널 변동을 보정하기 위해 분위수(quantile)를 이용한 큐빅 스플라인(cubic spline) 정규화로 표준화하여 진행하였다(Workman et al., Genome Biol., 2002, 3(9): research0048). NimbleScan(NimbleGen, 미국)에서 수행된 Median polish algorithm을 이용한 RMA(Robust Multi-Chip Analysis)에 의한 프로브 레벨 요약은 컬스 파일(calls files)을 도출하는데 사용되었다. 통계학적 분석을 포함한 마이크로어레이에 대한 자세한 정보는 http://www.ggbio.com(Green Gene Biotech, 한국)에서 가능하다.

OsMDB1과 기존에 알려진 애기장대의 MYB 단백질들과 단백질들간의 유사성을 비교해 본 결과 OsMDB1은 R2R3-MYB 전사인자 중에서 서브그룹 13과 16에 속하는 단백질들과 40-50% 유사성을 가지는 것을 확인했다(도 1 및 도 2). OsMDB1은 다른 조직과 비교했을 때 벼 이삭의 초기 단계에서 주로 발현하는 것을 RT-PCR을 통해서 확인했고(도 3), 이 유전자를 도 4의 항시 발현 PGD 프로모터에 연결시킨 운반체를 제작하여 벼에 형질전환 하였다. PGD:MDB 운반체가 1 카피로 인터제닉(intergenic)에 삽입된 7, 22, 그리고 23번 독립 라인들과 PGD:HG-MDB 운반체가 1 카피로 인터제닉에 삽입된 27번 독립 라인을 선발하였다. 이 네 라인에서 모두 야생형보다 형질전환체에서 벼 간장길이가 55~70% 감소한 것을 확인 하였다(도 5 및 도 6). 출수 시기의 형질전환체에서 OsMDB1의 과발현을 지엽(flag leaf), 잎집(sheah), 그리고 이삭 (panicle)에서 각각 확인하였고(도 7), 이를 이용하여 마이크로어레이 실험을 수행 하였다(도 8). 야생형과 비교해서 형질전환체에서 2배 이상 증가하거나 감소한 유전자를 이용하여 MapMan 분석을 실시하였다. 분석을 통해 ATP 합성(bin9), 세포벽 관련 유전자(bin10), 이차 대사(bin16), 호르몬 대사(bin17) 관련 유전자들이 증가하거나 감소한 것을 관찰하였다(표 2).

<110> GREENGENE BIOTECH INC. <120> Method for producing transgenic plant with regulated height using OsMDB1 gene and the plant thereof <130> PN13338 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 906 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgggacggc acgcgtgctc tgccgccggt gtccagcaga agctgcgcaa ggggctctgg 60 tctcccgagg aagacgagaa gctctacaat cacatctacc gctacggcgt cggttgctgg 120 agctccgttc ccaagctcgc agggctccag aggtgcggca agagctgcag gctgcggtgg 180 atcaactacc tgcgccccga cctgaagcgg ggcagcttct cgcagcagga ggaggacgcc 240 atcgtcggcc tgcatgagat cctaggcaac aggtggtcgc aaatcgcgtc gcacttgccg 300 gggaggacgg acaacgagat caagaacttc tggaacagct gcctcaagaa gaagctgagg 360 cagcgcggca tcgaccccag cacccaccag cccatctcca cggctgctgc tgctgcggcg 420 gcggcattgg acacgtcgac gcaggaccag aagccgccgg ccaccgccga cggcttcgcc 480 ctgaagcagc agcagcaggt gttcgacccg ttcccggtga tcgacagctt cggcagcggg 540 ttcgacgcca cgggcatgcc attgtacggc cacctcggcg gcaaggacgc ggccgggttc 600 gtggactaca gcagcgtgct tgacgtgtcg gagaacctgg gctacggcga gagctccagc 660 aacagcagca actggaactg cggcgtgggc gcgccggagg tgaacaatgc gctcgagagc 720 gagccgctgc attgggccac cgagagcaag gtcgagcctt tcgtgggcta cggcgaggcg 780 gacgccatgg agcacaagtt cgggctgccc tgccatgggc agcaagagca gggcatgaca 840 catttcgact tcgacgtcag ccggagcatg gtggtcggcg acttcaactt cgagtacttc 900 cgatga 906 <210> 2 <211> 301 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Gly Arg His Ala Cys Ser Ala Ala Gly Val Gln Gln Lys Leu Arg 1 5 10 15 Lys Gly Leu Trp Ser Pro Glu Glu Asp Glu Lys Leu Tyr Asn His Ile 20 25 30 Tyr Arg Tyr Gly Val Gly Cys Trp Ser Ser Val Pro Lys Leu Ala Gly 35 40 45 Leu Gln Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu 50 55 60 Arg Pro Asp Leu Lys Arg Gly Ser Phe Ser Gln Gln Glu Glu Asp Ala 65 70 75 80 Ile Val Gly Leu His Glu Ile Leu Gly Asn Arg Trp Ser Gln Ile Ala 85 90 95 Ser His Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Phe Trp Asn 100 105 110 Ser Cys Leu Lys Lys Lys Leu Arg Gln Arg Gly Ile Asp Pro Ser Thr 115 120 125 His Gln Pro Ile Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Asp 130 135 140 Thr Ser Thr Gln Asp Gln Lys Pro Pro Ala Thr Ala Asp Gly Phe Ala 145 150 155 160 Leu Lys Gln Gln Gln Gln Val Phe Asp Pro Phe Pro Val Ile Asp Ser 165 170 175 Phe Gly Ser Gly Phe Asp Ala Thr Gly Met Pro Leu Tyr Gly His Leu 180 185 190 Gly Gly Lys Asp Ala Ala Gly Phe Val Asp Tyr Ser Ser Val Leu Asp 195 200 205 Val Ser Glu Asn Leu Gly Tyr Gly Glu Ser Ser Ser Asn Ser Ser Asn 210 215 220 Trp Asn Cys Gly Val Gly Ala Pro Glu Val Asn Asn Ala Leu Glu Ser 225 230 235 240 Glu Pro Leu His Trp Ala Thr Glu Ser Lys Val Glu Pro Phe Val Gly 245 250 255 Tyr Gly Glu Ala Asp Ala Met Glu His Lys Phe Gly Leu Pro Cys His 260 265 270 Gly Gln Gln Glu Gln Gly Met Thr His Phe Asp Phe Asp Val Ser Arg 275 280 285 Ser Met Val Val Gly Asp Phe Asn Phe Glu Tyr Phe Arg 290 295 300 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gccaagagga gctgttatcg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ccgcatcagg catctgatta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 accgtgattg atgaggtgag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cagcgttgaa cacaaggaag 20 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aaaaagcagg ctgatatcat gggacggcac g 31 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 agaaagctgg gttcagtggt ggtggtggt 29 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gtgaacaatg cgctcgaga 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 tcatcggaag tactcgaag 19

Claims

벼 유래의 OsMDB1(Oryza sativa MYB DNA-binding domain protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMDB1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 초장을 조절하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 OsMDB1 단백질 코딩 유전자를 과발현시켜 야생형에 비해 식물체의 초장을 감소시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 초장을 조절하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 벼 유래의 OsMDB1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 초장을 조절하는 방법.
벼 유래의 OsMDB1(Oryza sativa MYB DNA-binding domain protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMDB1 유전자의 발현을 조절하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 초장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제4항에 있어서, 상기 OsMDB1 단백질 코딩 유전자를 과발현시켜 야생형에 비해 식물체의 초장을 감소시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조 방법.
제4항에 있어서, 상기 OsMDB1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 초장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제4항의 방법에 의해 제조된 초장이 조절된 형질전환 식물체.
제7항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제7항에 따른 식물체의 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsMDB1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 초장 조절용 조성물.