KR101462076B1 - OsSNDP1 유전자를 이용한 식물체의 뿌리털 신장을 조절하는 방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 유래 OsSNDP1(Oryza sativa Sec14-nodulin domain-containing protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털 신장을 조절하는 방법, 상기 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털의 신장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 뿌리털 신장이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 뿌리털 신장 조절용 조성물을 제공한다.

Description

OsSNDP1 유전자를 이용한 식물체의 뿌리털 신장을 조절하는 방법 및 그에 따른 식물체{Method for controlling root hair elongation of plant using OsSNDP1 gene and the plant thereof}

본 발명은 OsSNDP1 유전자를 이용한 식물체의 뿌리털 신장을 조절하는 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래 OsSNDP1(Oryza sativa Sec14-nodulin domain-containing protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털 신장을 조절하는 방법, 상기 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 뿌리털의 신장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 뿌리털의 신장이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 뿌리털 신장 조절용 조성물에 관한 것이다.

뿌리털은 뿌리의 표피 세포로부터 만들어지는 원통형의 돌출부위이다. 뿌리털은 뿌리의 표면적을 효과적으로 넓히며, 수분 및 영양분의 흡수, 식물체와 미생물간 상호작용, 대기의 질소 고정 및 근권으로 혼합물의 분비에 중요한 역할을 한다. 주요 영양소, 중금속 그리고 확산 제한적 이온들의 흡수에 대한 능력을 고려하면, 뿌리털은 농업, 환경 및 인간 건강 안전에 큰 기여를 한다.

식물 뿌리 표피세포층은 뿌리털 세포와 비뿌리털 세포 두 가지 종류의 세포로 구성되어 있다. 속씨식물에서 이들 두 종류의 세포들의 구별되는 형태학적 특징은 뿌리털 개시 동안에 설명된다. 심지어 벼과 식물들 사이에서도 세포 분할 경향과 뿌리털의 세포 확장에 있어 다양성을 보인다. 유전 또는 세포의 요소들의 다양성은 속씨식물에서 뿌리털 형태 형성동안 관찰되는 차이점들의 원인이 된다. 뿌리털 발달은 다음의 세 가지 단계로 나뉜다 : (1)세포 운명 결정, (2)뿌리털 개시 및 (3)뿌리털 신장. 애기장대는 뿌리털 발달을 분석하는 모델 식물체로서 광범위하게 사용되었다. 따라서, 뿌리털 정형화 및 발달의 과정을 조절하고 관여하는 조절 네트워크와 그들의 유전의 구성요소들이 밝혀져 왔다. 뿌리털 개시는 뿌리털 생장의 자리에 벌지(bulge, 부풀어오름)의 형성을 나타낸다. 옥신과 에틸렌과 같은 식물 호르몬이 벌지 형성에 관여하는 것으로 예측된다. 미세소관은 뿌리털 개시 동안에 중요한 역할을 하는 것으로 예측된다. 뿌리털 신장은 편중된 칼슘 이온 농도의 형성, 활성산소종의 생산, 세포벽 팽창, 세포골격 재편성 및 세포외막과 세포벽 구성요소들의 트래픽킹을 요구한다. 인지질 신호는 뿌리털의 편중된 신장을 조절하는 역할을 한다. 벼는 논에서 재배되는데, 전체 수명 동안, 벼의 뿌리는 애기장대 또는 옥수수와 같은 밭작물의 뿌리털과 비교하여 다른 호기성의 조건들, 질소종의 산화 환원 상태, 다른 영양소들 그리고 금속들에 노출된다. 벼의 뿌리털 발달에 대한 연구는 상대적으로 많지 않게 이루어졌다. 벼로부터 뿌리털 발달을 조절하는 몇몇의 유전자들이 보고되었다.

본 발명에서는 유전적 접근법(forward genetics)을 사용하여, 트랜스포존 돌연변이 유발 군집에서 뿌리털 돌연변이체를 확인하였다. 유전체지도 기반 클로닝과 벼 돌연변이체와 애기장대 COW1 / Atsfh1 돌연변이체의 상보성 실험은 벼 유래 OsSNDP1(Oryza sativa Sec14-nodulin domain-containing protein 1)이 짧은 뿌리털 표현형의 원인임을 밝혔다. 뿌리털의 형태에 OsSNDP1 유전자의 돌연변이가 미치는 영향은 극저온 동결 주사전자현미경을 이용하여 분석하였다.

한국등록특허 제0788439호에는 '뿌리 및 뿌리털의 신장을 유도하는 유전자 및 이 유전자에 의한 형질전환 식물체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1112703호에서는 '식물의 뿌리털 발달 조절 유전자 RHS1 및 이를 이용한 식물의 뿌리털 발달 조절 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 OsSNDP1에 의한 식물체의 뿌리털 신장을 조절하는 방법 및 그에 따른 식물체에 관해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 벼의 뿌리털 발달이 저해된 돌연변이체를 선별하고 유전체 분석을 통해 돌연변이 유전자를 동정하고, 벼 유래 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자의 벼 식물체와 애기장대 식물체에서 상보성 검증 실험을 통하여, 벼에서 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자의 발현 조절은 벼 식물체의 뿌리털의 신장 조절을 가능하게 하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래 OsSNDP1(Oryza sativa Sec14-nodulin domain-containing protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털 신장을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털의 신장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 뿌리털의 신장이 조절된 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 뿌리털 신장 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 분리된 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 단백질은 식물체의 뿌리털 신장과 관련된 형질의 개선 및 타 식물체에서 뿌리털의 신장을 조절하는 유전자의 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자를 이용하여 식물체의 뿌리털 신장이 조절된 식물체를 창출할 수 있다.

도 1은 5일된 야생형 벼와 돌연변이체 벼의 뿌리털을 입체 현미경으로 관찰한 사진(A)과 뿌리털의 길이를 측정하여 도표화한 것(B)이다.
도 2는 짧은 뿌리털 돌연변이체의 유전체지도 기반 클로닝의 결과로, 야생형과 돌연변이체의 OsSNDP1을 암호화하는 Os10g03400 좌 위의 cDNA 및 아미노산 서열의 비교를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 3은 짧은 뿌리털 표현형을 가진 돌연변이체에 대한 OsSNDP1의 상보성 실험에 관한 것으로, (A)는 야생형(OsSNDP1), 돌연변이체(Ossndp1), 형질전환된 식물체(OsSNDP1 OX-1,2)의 뿌리털을 입체현미경으로 관찰한 사진이며(bar; 500㎛), (B)는 상기 식물체들의 파생된 단편 증폭 다형성 서열 실험의 결과이며, (C)는 상기 식물체들의 뿌리털 길이를 측정하여 도표화한 것이고, (D)는 OsSNDP1 유전자의 발현 수준을 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응을 통해 측정한 결과이다.
도 4는 벼 유래 OsSNDP1 유전자와 애기장대의 COW1 / AtSFH1 유전자의 기능상의 상보성을 검정한 결과이다. (A)는 야생형 애기장대(AtSHF1), 돌연변이 애기장대(Atsfh1), 벼 유래 야생형 OsSNDP1 유전자를 형질전환한 돌연변이 애기장대(AtSFH1+OsSNDP1) 그리고 벼 유래 돌연변이 Ossndp1 유전자를 형질전환한 돌연변이 애기장대(AtSFH1+Ossndp1)의 뿌리털 표현형을 확인한 사진이고, (B)는 상기 식물체들의 뿌리털 길이를 측정하여 도표화한 것이다.
도 5는 5일간 키운 야생형(OsSNDP1)과 돌연변이체(Ossndp1)의 뿌리에서 성숙부위(A)와 신장 부위(B)의 뿌리털의 형태를 극저온 동결 주사전자현미경을 이용하여 관찰한 사진들이다. (C)는 이상 형태의 뿌리털을 확대한 사진이며, 하얀 실선 표시는 돔 모양의 뿌리털을, 하얀 점선 표시는 부풀어진 결절을 가진 뿌리털을 보여주는 것이다. (D)는 (C)의 표시부분들을 근접 촬영한 사진이다. bar; 50㎛.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래 OsSNDP1(Oryza sativa Sec14-nodulin domain-containing protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털의 신장을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 벼 유래 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하여 식물체의 뿌리털 신장을 저해시킬 수 있으며, 상기 OsSNDP1 유전자 발현의 저해는 예를 들면, 서열번호 2의 아미노산 서열 중 331번째 아미노산을 치환함으로써 수행될 수 있으며, 상기 331번째 아미노산 치환은 예를 들면, 글리신을 발린으로 치환함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자의 발현의 저해는 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자의 돌연변이에 의해 수행될 수 있다. 상기에서 "유전자 돌연변이"란 하나의 유전자좌의 범위 내에서 유전자의 염기배열에 어떤 이상(치환, 부가, 결실, 역위, 전좌등)이 발생한 것을 말하며, 이러한 돌연변이에는 DNA 상의 하나의 염기의 변화에 의한 점 돌연변이와 염기의 삽입 또는 결실에 의해서 아미노산의 서열 전체가 변화되는 해독틀 돌연변이가 있으며, 발생 원인에 따라 자연적으로 발생하는 자연 돌연변이와 인위적인 환경의 작용 또는 화학물질에 의해 유도되는 유도성 돌연변이가 있다.

본 발명에 따른 OsSNDP1 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 뿌리털의 신장을 조절하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 OsSNDP1 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 OsSNDP1 단백질을 암호화하는 게놈 DNA(서열번호 33)와 cDNA(서열번호 1)를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 벼 유래 OsSNDP1(Oryza sativa Sec14-nodulin domain-containing protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털의 신장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

상기 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 뿌리털 신장이 조절된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함된다. 상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두가 있다. 상기 식물체는 바람직하게는 벼(Oryza sativa) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana)이다.

또한, 본 발명은 벼 유래 OsSNDP1(Oryza sativa Sec14-nodulin domain-containing protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 뿌리털 신장 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 뿌리털의 신장을 조절할 수 있는 것이다.

본 발명은 삽입변이 유도 체계인 Ac / Ds 태깅 시스템을 통하여 벼에서의 뿌리털에 생성 및 성장에 연관된 유전자를 선발하였고, 유전자에 대한 분자학적 연구를 통하여 유전자의 뿌리털 특이적 발현 특성을 구명함으로써 완성된 것이다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 벼에서의 뿌리털에 생성 및 성장에 연관된 단백질 및 OsSNDP1 유전자에 관한 것이다. 즉, 본 발명자들이 개발한 벼에서의 삽입 변이 유도체계인 Ac / Ds 태깅 시스템(Kim et al., 2004 Plant J. 39: 252-263)을 통해 식물 변이체를 얻었으며 그로부터 기능 분석을 실시하였다. Ac / Ds 태깅 시스템은 옥수수의 전이인자인 Ac와 Ds를 유전자조작한 후 벼의 게놈상에 형질전환 방법으로 삽입시켜 확립했다. Ds는 Ac가 같은 게놈상에 존재할 때 전이된다는 사실에 착안하여 시스템을 구축하였다. 이 태깅 시스템은 유전자의 기능을 변이를 통해 동정하고 동시에 형질발현을 리포터 유전자를 통해 관찰할 수 있는 매우 강력한 연구 방법이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

식물체 재료 및 성장 조건

큰 규모의 Ds 트렌스포존 군집은 조직 배양을 통하여 Ac를 가지는 재생되는 유전자 트랩 Ds 스타터 라인으로부터 만들었다. 뿌리털 돌연변이체를 선별하기 위해, Ds 라인을 임의로 선발하고 그들의 자손 종자를 16시간 명/8시간 암 조건의 생장 챔버에서 1/2 MS(Murashige & Skoog) 배지에서 25℃ 온도 조건으로 발아시키고 배양하였다. Ds 군집을 생성하기 위한 부모세대의 품종으로 자포니카 품종인 동진벼가 사용되었다.

애기장대 종자는 20%(v/v)의 상업적인 표백제를 사용하여 30분 동안 표면을 멸균하였다. 상기 종자를 비타민, 1% 수크로스(w/v) 및 0.8%(w/v) 파이토아가를 포함하는 MS 배지(pH 5.8)에 놓아둔 후 3일 동안 암 조건에서 저온 처리를 하고 7일 동안 23℃에서 배양하였다.

뿌리털 길이 측정

1/2 MS 용액에서 키운 5일된 벼 식물체의 뿌리를 올림푸스 SZX12 입체현미경 시스템을 사용하여 관찰하고 이미지를 촬영하였다. 이미지는 ImageJ(http://rsbweb.nih.gov/ij/)를 사용하여 처리하였다. 7일된 애기장대의 뿌리털 역시 동일한 방법으로 관찰하였다. 뿌리털의 길이는 ImageJ 프로그램을 사용하여 측정하였다.

유전체지도 기반 클로닝

자포니카 품종의 Ds24419를 인디카 품종의 밀양23호와 교배하였다. F1 세대를 자가수분하여 F2 자손을 생성하였다. 개개의 F2 식물체의 뿌리털 표현형을 확인하기 위하여 현미경하에서 관찰하였다. 짧은 뿌리털을 나타내는 F2 식물체들을 Ds24419의 돌연변이 좌(locus) 매핑(mapping)을 위해 선발하였다. 짧은 뿌리털 F2 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하였다. SSR, SNP 및 dCAP 다형성 마커들을 검출하기 위해 데이터베이스를 이용하여 찾았다. 다형성 인자들을 검색하기 위해 사용한 프라이머 세트들의 정보는 다음 표와 같다.

Ds24419 돌연변이체의 정교한 매핑 후에, 마커들 사이에 돌연변이 좌의 양 사이드에 플랭킹된 후보 유전자들을 PCR을 통해 클로닝하고 서열분석을 하였다. 서열분석 결과는 공개 데이터베이스(NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, 및 Rice Genome Annotation Project: http://rice.plantbiology.msu.edu/)에서 이용가능한 벼의 서열과 비교하였다. 염기 차이가 있는 유전자들을 후보들로 선택하고 추가 유전학적 분석을 수행하였다.

형질전환

벼 형질전환은 Toki 방법(Toki et al., 2006, Plant J. 47:969-976)을 따라 아그로박테리움 LBA4404에 의해 수행되었다. 애기장대의 형질전환은 꽃대 침지법( Clough et al., 1998, Plant J. 16:735-743)을 사용하여 수행하였다.

상보성 검정 실험

Ds24419 돌연변이체의 상보성 검정을 위해, 옥수수 유비퀴틴 프로모터의 하위에 야생형 OsSNDP1 cDNA를 삽입하여 T-DNA 벡터(UBI-pCAMBIA1381::OsSNDP1)를 제작하였다. Ds24419의 동형(호모)의 돌연변이체를 두 개의 독립적인 형질전환 OsSNDP1 라인과 교배하였다.

AtSHF1 돌연변이체의 상보성 검정을 위해, 약 1.4kb의 애기장대 내인성 프로모터에 야생형 OsSNDP1 cDNA 또는 OsSNDP1 돌연변이 cDNA를 융합하여 T-DNA 벡터(pCAMBIA1381::Pro AtSFH1::OsSNDP1)를 제작하였다.

RNA 추출 및 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응( qRT - PCR )

5일 된 식물체의 전체 묘목을 샘플링하고 제조자의 설명에 따라 RiboEx(GeneAll) 또는 RNeasy Plant Mini 키트(QIAGEN)를 사용하여 RNA를 추출하였다. RNA는 37℃에서 30분간 RQ1 DNase(Promega)로 처리하고, 총 RNA는 페놀/클로로포름을 사용하여 정제하였다. 그런 후, 2㎍의 RNA를 주형으로하여 ReverTra Ace 역전사효소와 올리고-dT(TOYOBO)를 사용하여 첫 번째 가닥을 합성하였다. 20㎕의 역전사 산물을 100㎕가 되도록 희석하고, 5㎕를 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응에 주형으로 사용하였다. 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응은 Eco-real time PCR(Illumina)을 사용하여 수행하였고, 사용된 프라이머는 다음 표와 같다.

실시예 1: 뿌리털 변이체의 선별을 위한 유전학적 접근법( Forward genetics approach )

벼에서 뿌리털 형태형성에 관여하는 유전자를 동정하기 위해서, Ds 트랜스포존 라인에서 짧은 뿌리털 또는 뿌리털이 없는 표현형을 스크리닝하였다. 706개 라인의 각 종자들을 발아시키고 1/2 MS 배지에서 5일간 키웠다. 묘목의 뿌리를 현미경으로 확인하였다. Ds24419로 표기된 하나의 라인이 뿌리털 성장에 극적인 영향을 보였다. 하지만 추가의 연구를 통해 Ds24419 라인이 Ds 삽입이 없음을 밝혔다. 이에 상기 돌연변이체는 자연발생적인 돌연변이에 의해 유발되었거나 Ds 재이동을 위한 조직배양 동안에 돌연변이가 유발된 것으로 추측됐다.

뿌리털 성숙부위에서 뿌리털의 길이를 야생형과 5일된 돌연변이체의 묘목에서 비교관찰하였다(도 1). 돌연변이체의 뿌리털의 길이는 야생형의 뿌리털 길이에 16%에 불과했다. 상기 돌연변이체의 뿌리털은 더 오랫동안 키우더라도 완전히 신장되지 않았다. 이는 뿌리털의 짧음이 느린 성장 속도 때문이 아님을 의미했다.

실시예 2: 뿌리털 돌연변이체의 유전체지도 기반 클로닝

상기 뿌리털 성장의 원인이 되는 유전자를 확인하고자 유전체지도 기반 클로닝을 실시하였다. 자포니카 품종의 동진벼로부터 만들어진 Ds 라인이었기 때문에, 분리된 군집에서 고도의 다형성 게놈을 얻기 위해 돌연변이체 Ds24419를 인디카 품종의 유전의 배경을 가진 밀양23호 벼와 교배시켰다. 778개의 2세대 식물체 중 200개에서 짧은 뿌리털 표현형을 나타냈다. 카이제곱 검정을 통해 짧은 뿌리털 표현형은 하나의 열성 유전자에 의해 결정됨을 알았다. 돌연변이의 좌를 동정하기 위해, 단순 서열 반복(SSR)과 단일 염기 다형성(SNP) 마커들을 사용하였다. 그 결과 하나의 염기 변화를 포함하는 Os10g03400 전사 해독틀을 발견하였고, 상기 염기 변화는 단일 염기전환으로 구아닌이 티민으로 바뀐 것임을 확인하였다(도 2). Os10g03400는 Sec14와 nodulin 도메인으로 구성된 단백질을 암호화하며, OsSNDP1(Oryza sativa Sec14-nodulin domain-containing protein 1)으로 명명된다. 상기 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자의 점 돌연변이는 Sec14 유사 도메인 상의 331번째 아미노산인 글리신을 발린으로 대체하는 아미노산 서열 변화를 일으켰다.

실시예 3: 벼에서 짧은 뿌리털 표현형의 표현형 상보성 검증

Ds24419 돌연변이체의 뿌리털 결함 표현형이 Os10g03400이 코딩하는 OsSNDP1단백질의 돌연변이에 의한 것인지 확인하기 위해, Ds24419 돌연변이체를 형질전환 라인과 교배하여 표현형의 상보성 검증을 수행하였다. 돌연변이체(Ossndp1)를 두 개의 독립적인 OsSNDP1 과발현 형질전환 식물체(OsSNDP1 OX-1 및 -2)와 교배하였다. 이중의 유전적 조합의 두 라인(Ossndp1+OsSNDP1 OX-1 및 Ossndp1+OsSNDP1 OX-2)은 야생형(OsSNDP1)과 유사한 뿌리털 표현형을 보였으며(도 3A), 뿌리털 길이 역시 야생형과 유사한 수준을 보였다(도 3C). 야생형 유전자에 점 돌연변이가 일어난 돌연변이 대립형질 유전자는 HaeIII 제한효소 인식자리를 만들기 때문에 상기 제한효소 처리시, 야생형과 돌연변이 대립형질 유전자는 각기 다른 크기의 DNA 단편들을 생성한다. 내인성의 야생형 유전자와 돌연변이의 대립형질 유전자간의 다른 DNA 배열차이를 파생된 단편 증폭 다형성 서열 실험을 통해 확인하였다(도 3B). 또한 야생형(OsSNDP1), 돌연변이체(Ossndp1), 형질전환 식물체(OsSNDP1 OX-1) 및 이중의 유전적 조합을 가진 형질전환 식물체(Ossdp1+OsSNDP1 OX-1)에서 OsSNDP1의 mRNA의 정량적인 수준을 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응을 통해 확인하였다(도 3D). 이와 같은 결과들을 통해서 돌연변이체의 짧은 뿌리털 표현형은 OsSNDP1 유전자의 결함에 의한 것임을 확인하였다.

실시예 4: 애기장대 COW1 / AtSFH1 과 OsSNDP1 의 기능적 상보성 검증

Sec14 및 nodulin 도메인과 높은 서열 유사성을 보이는 일군의 유전자들이 애기장대에서 보고되었다. 이 유전자들은 AtSFH1 , AtSFH3 및 AtSFH12를 포함하는데, 유전자 서열 정렬을 통해 OsSNDP1 유전자의 아미노 말단의 Sec14 유사 도메인이 AtSFH1 유전자와 높은 서열 유사성을 보임을 알았다. 뿌리털 발달에 AtSFH1 유전자와 OsSNDP1 유전자의 기능의 종분화적 상동성을 확인하기 위해, 야생형과 짧은 뿌리털 표현형을 가진 돌연변이체 벼로부터 각각 OsSNDP1 단백질을 코딩하는 유전자의 cDNA를 포함하는 재조합 벡터를 만든 후 AtSFH1 돌연변이 애기장대에 형질전환하였다. 뿌리털의 길이를 측정해 본 결과, 야생형 OsSNDP1 cDNA로 형질전환된 라인(Atsfh1+OsSNDP1)은 돌연변이체(Atsfh1)에서 나타났던 짧은 뿌리털 표현형이 회복되었다. 하지만 돌연변이 OsSNDP1 cDNA로 형질전환된 라인(Atsfh1+Ossndp1)에서는 짧은 뿌리털 결함이 회복되지 못하였다(도 4). 이와 같은 벼와 애기장대를 이용한 상보성 실험 결과를 통해 OsSNDP1 유전자와 COW1 / AtSFH1 유전자가 뿌리털 발달에 있어 기능적으로 종분화적 상동성이 있음을 확인하였고, 뿌리털 신장에 작용하는 것을 확인하였다.

실시예 5: 뿌리털 세포의 형태 분석

벼 식물체에서 OsSNDP1 유전자의 뿌리털 형태에 미치는 영향을 알아보기 위해, 5일된 식물체 뿌리의 표피의 층을 극저온 동결 주사전자현미경을 사용하여 관찰하였다. 뿌리털의 개시부위, 신장부위 및 성숙부위를 야생형(OsSNDP1)과 돌연변이체(Ossndp1)의 뿌리에서 비교하였다. 개시부위에서는 뿌리털 벌지를 만들어내는 표피 세포의 수나 형태에 대해서 야생형과 돌연변이체 사이에 큰 차이가 없었다. 그러나, 돌연변이체는 신장부위 및 성숙부위에서 뿌리털의 길이 및 세포 모양이 극적으로 영향을 받았다(도 5A, B). 야생형의 뿌리털은 원통형 모양에 일정한 직경을 보였지만, 돌연변이체의 뿌리털은 부풀어오른 결절들을 보여주었다. 짧은 뿌리털 세포들은 일정한 직경을 보이지 않으며, 길이를 따라 폭의 다양성을 나타내고, 같은 발달상의 부위에서 뿌리털의 길이와 모양이 매우 다양하게 관찰되었다. 또한 돌연변이체의 많은 표피세포들은 돔 모양의 뿌리털을 생산하였다(도 5C, D). 이는 뿌리털의 일부가 초기 발달단계 동안 성장이 멈춘 것을 의미하며, OsSNDP1이 뿌리털의 편중된 성장과 세포 신장의 중요한 조절자임을 의미한다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for controlling root hair elongation of plant using OsSNDP1 gene and the plant thereof <130> PN13102 <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1797 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgacagaag tcctgtcgag accgctcgaa caccgtctaa gctctgcaac cttagacggt 60 cactatgaag agaagaggaa atccaatgtt gaatactcag aggatgagaa gaaagccaaa 120 atcatgtcac tgaagaagaa ggcaatgagt tcttcacaaa aattaaggca ttcaatgaag 180 aaggggagga ggagtagcaa ggtcatgtcc atctcaattg ccgatgaacg tgatcctgaa 240 gaggtgcagg ctgtagatgc cttccgtcag ctccttatac ttgaagagtt gctaccatct 300 cagcatgatg attaccacat gatgctaagg tttttgaagg caagaaagtt tgatgttgag 360 aaggcaaagc aaatgtgggc tgacatgttg cggtggagaa aggaatttgg tgcagatacc 420 attcttgagg attttgaatt tgaagaagct ggcaaggtgg cagaatgcta tcctcaaggt 480 tatcatgggg ttgataagga aggaaggcct gtctacattg aacgacttgg acagatcgat 540 gtcaataggc taatgcaggt caccacaatg gatcgtttta tcaagaacca tgttagggag 600 tttgagaaga actttgctgt 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Ala Lys Gln Met Trp Ala Asp 115 120 125 Met Leu Arg Trp Arg Lys Glu Phe Gly Ala Asp Thr Ile Leu Glu Asp 130 135 140 Phe Glu Phe Glu Glu Ala Gly Lys Val Ala Glu Cys Tyr Pro Gln Gly 145 150 155 160 Tyr His Gly Val Asp Lys Glu Gly Arg Pro Val Tyr Ile Glu Arg Leu 165 170 175 Gly Gln Ile Asp Val Asn Arg Leu Met Gln Val Thr Thr Met Asp Arg 180 185 190 Phe Ile Lys Asn His Val Arg Glu Phe Glu Lys Asn Phe Ala Val Lys 195 200 205 Phe Pro Ala Cys Ser Ile Ala Thr Lys Cys His Ile Asp Gln Ser Thr 210 215 220 Thr Ile Leu Asp Val Gln Gly Val Gly Met Lys Gln Phe Ser Lys Ala 225 230 235 240 Ala Arg Asp Leu Ile Gly Gln Leu Gln Lys Ile Asp Gly Asp Asn Tyr 245 250 255 Pro Glu Thr Leu Cys Arg Met Phe Ile Ile Asn Ala Gly Pro Gly Phe 260 265 270 Arg Leu Leu Trp Ser Thr Val Lys Ser Phe Leu Asp Pro Lys Thr Thr 275 280 285 Ala Lys Ile His Val Leu Gly Asn Lys Tyr Gln Ser Lys Leu Leu Glu 290 295 300 Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Pro Glu Phe Phe Gly Gly Thr Cys Gln 305 310 315 320 Cys Glu Gly Gly Cys Met Lys Ala Asp Lys Gly Pro Trp Lys Asp Asp 325 330 335 Glu Val Met Lys Met Val Gln Ser Gly Val Gly Trp Cys Gly Asn Leu 340 345 350 Asn Leu Asn His Leu Glu Ala Glu Glu Lys Met Met Ile Cys Glu Asp 355 360 365 Asp Thr Met Tyr Thr Lys Lys Gln Glu Ser Phe Lys Asp Glu Gly Arg 370 375 380 Thr Leu Ser Arg Lys Ile Ser Arg Ala Arg Ile Glu His Pro Thr Leu 385 390 395 400 Ser Pro Val Cys Glu Glu Leu Pro Pro Met Met Leu Pro Thr Pro Gly 405 410 415 Ser Pro Tyr Ser Cys Asp Val Pro Met Val Glu Lys Ala Ile Asp Ala 420 425 430 Ile Cys Gln Ser Lys Gly Ser Arg Asp Glu Asn Val Ala Ile Thr Lys 435 440 445 Ala Ile Val Asn Ala Ser Asn Gly Ser Asn Pro Pro Leu Phe Gly Gly 450 455 460 Val Met Ala Leu Val Met Ser Ile Ala Thr Met Leu Arg Val Ser Arg 465 470 475 480 Asn Met Pro Lys Lys Val Leu Gly Ala Thr Leu Gly Ala Gln Ser Thr 485 490 495 Ser Lys Ile Gln Ala Gln Gln Leu Ser Lys Ile Ser Met Glu Ala Val 500 505 510 Ser Ala Ala Glu Tyr Ala Ser Ser Thr Lys Arg Leu Ser Asp Ile Glu 515 520 525 Glu Lys Val Ile Ala Ile Leu Thr Lys Pro Ala Glu Met Pro Ala Asp 530 535 540 Lys Glu Glu Met Leu Lys Thr Ala Val Ser Arg Val Ser Ala Leu Glu 545 550 555 560 Glu Glu Leu Ala Ala Thr Lys Lys Ala Leu Gln Glu Thr Leu Glu Arg 565 570 575 Gln Glu Glu Ile Met Ala Tyr Ile Glu Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser 580 585 590 Lys Arg Leu Phe Arg Trp 595 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaagaacgat gtggtagcag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccttgccctt gcatataggc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctaaaaaata cgtaaggttt cc 22 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcgacgctag gggttagat 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctaaaaaata cgtaaggttt cc 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 taagggtagt gggtctttag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims (11)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열 중 331번째 아미노산인 글리신이 발린으로 치환된 벼 유래 OsSNDP1(Oryza sativa Sec14-nodulin domain-containing protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsSNDP1 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털 신장을 저해하는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 서열번호 2의 아미노산 서열 중 331번째 아미노산인 글리신이 발린으로 치환된 벼 유래 OsSNDP1(Oryza sativa Sec14-nodulin domain-containing protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털의 신장이 저해된 형질전환 식물체의 제조 방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제5항의 방법에 의해 제조된 뿌리털의 신장이 저해된 형질전환 식물체.
10. 제9항에 따른 식물체의 종자.
11. 서열번호 2의 아미노산 서열 중 331번째 아미노산인 글리신이 발린으로 치환된 벼 유래 OsSNDP1(Oryza sativa Sec14-nodulin domain-containing protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 뿌리털 신장 저해용 조성물.

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