KR101555270B1

KR101555270B1 - 식물의 바이오매스 생산성 또는 종자 수확량을 증가시키는 애기장대 유래 At3g52740 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101555270B1
Application number: KR1020130150551A
Authority: KR
Inventors: 김정일; 박문영; 신아영; 한윤정
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2013-12-05
Filing date: 2013-12-05
Publication date: 2015-09-25
Also published as: KR20150065994A

Abstract

본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하여 식물체의 바이오매스 생산성을 증가시키거나 또는 종자 수확량을 증가시키는 방법, 상기 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하여 식물체의 바이오매스 생산성이 증가되거나 또는 종자 수확량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 바이오매스 생산성을 증가시키거나 또는 종자 수확량을 증가시키기 위한 조성물, 상기 애기장대 At3g52740 단백질 코딩 유전자 유래 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터 및 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물 세포에 관한 것이다.

Description

식물의 바이오매스 생산성 또는 종자 수확량을 증가시키는 애기장대 유래 At3g52740 유전자 및 이의 용도{At3g52740 gene from Arabidopsis thaliana for enhancing biomass productivity or seed yield of plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 바이오매스 생산성 또는 종자 수확량을 증가시키는 애기장대 유래 At3g52740 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하여 식물체의 바이오매스 생산성을 증가시키거나 또는 종자 수확량을 증가시키는 방법, 상기 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하여 식물체의 바이오매스 생산성이 증가되거나 또는 종자 수확량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 바이오매스 생산성을 증가시키거나 또는 종자 수확량을 증가시키기 위한 조성물, 상기 애기장대 At3g52740 단백질 코딩 유전자 유래 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터 및 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물 세포에 관한 것이다.

최근 세계 인구 증가에 따른 식량 공급 문제, 지구 온난화에 따른 환경 문제, 석유 자원 고갈에 따른 에너지 위기, 인류 보건 문제 등이 사회적 문제로 대두되고 있다. 이들 중에서 식물 자원의 경우, 종자 수확량 증대를 통한 식량 문제 해결, 바이오매스 증산 및 바이오에너지 생산을 통한 에너지 문제 해결 등에 활용될 수 있다. 특히 20세기 이후 크게 진보된 생명공학기술을 이용하여 개량한 생명공학 작물(또는 유전자변형 작물, GM 작물)들은 이들 문제를 해결하기 위한 주요 수단으로 여겨지고 있다. 따라서 유용 유전자를 이용한 고부가가치 생명공학 작물 개발은 향후 식량 증산, 환경 문제 개선, 에너지 문제 해결 등에 기여할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

농업에서 경제적으로 가장 중요한 형질 중 하나가 증가된 종자 수확량이라 할 수 있으며, 이는 식량 생산성을 증대시키기 위해서 우선적으로 고려되는 것이다. 예를 들면, 옥수수, 벼, 밀, 캐놀라 및 대두와 같은 작물들의 종자 자체의 직접적인 소비 또는 가공 종자로 육성된 육류 소비를 통해서 전체 인간 칼로리 흡수량의 절반 이상을 차지하는 것으로 알려졌다. 따라서 종자 수확량 개선은 식물생명공학 분야의 주요 연구 대상이다. 수확량은 보통 작물로부터 경제적 가치의 측정할 수 있는 산물로 정의되며, 이는 양 또는 질적 측면에서 정의될 수 있다. 수확량은 몇몇 요인에 직접적으로 의존되는데, 예를 들면 잎과 같은 기관의 수와 크기, 가지의 수와 같은 식물체 형상, 종자 생산 능력, 개화 및 노화 시기 등의 요인이 있다. 특히 종자 수확량은 식물 개화 지연 또는 노화 지연 등을 통해 증대되어질 수 있다. 따라서 식물 생장 촉진을 포함하여, 개화 또는 노화 지연 등을 통한 종자 수확량 증대 가능한 유용 유전자 및 그 적용 방법 개발 등이 필요하다.

그리고 식물 바이오매스는 통상 건초와 같은 사료작물에 대한 수확량을 의미하는데, 최근에는 비식용작물의 바이오매스를 증대시켜 에탄올과 같은 바이오에너지를 개발하는 연구가 활발히 진행 중에 있다. 식물의 바이오매스 수확량은 식물체 크기와 비례하며, 많은 생물종은 특정 발달 단계에서 식물체의 각 부분 간의 크기에 일정한 비율을 유지한다. 따라서 식물체의 크기 비교에는 한 기관의 크기 측정을 통하여 다른 기관의 크기를 추정할 수 있다. 예를 들어, 보다 큰 잎 면적을 갖는 큰 식물체가 보다 작은 식물체에 비해 전형적으로 많은 광 및 이산화탄소를 흡수하므로, 동일 기간 내에 보다 큰 중량을 얻는 것으로 알려졌다. 또 다른 예로써, 식물 줄기의 부피 생장을 촉진시킬 수 있는 유전자 CKI1의 기능과 바이오매스 증대 가능성이 제시된 바 있다(Hejatko et al., 2009, Plant Cell 21:2008-2021). 이에 식물체의 잎, 줄기, 꽃 등의 기관 크기를 측정함으로써 바이오매스 증산 가능성을 추정할 수 있다. 따라서 식물체의 기관을 크게 만들 수 있는 유용 유전자 및 그 적용 방법 개발 등이 필요하다.

식물의 종자 수확량이나 바이오매스 생산성 증대를 위해서는, 특히 식물의 빠른 생장이 중요하다. 통상 초기 발달 단계에서의 식물체의 크기는 전형적으로 발달 후기의 식물체의 크기와 연관되어 있기에, 식물의 초기 생장을 촉진시킬 수 있다면 종자 수확량 및 바이오매스 생산성 증대를 도모할 수 있다. 한 예로, 초기 식물 생장을 촉진시키는 고추 유래 유전자 CaPLA1의 기능과 종자 수확량 및 바이오매스 생산성 증대 가능성이 제시된 바 있다(Seo et al., 2008, Plant J. 53:895-908). 따라서 고부가가치 생명공학 작물 개발을 위한 바람직한 유용 유전자는 식물 생장 촉진, 개화 지연 및 노화 지연 등의 기능을 지녀 종자 수확량 및 바이오매스 생산성을 증대시킬 수 있어야 한다.

한편, 한국등록특허 제1305277호에는 식물의 바이오매스 증가 방법에 관한 '애기장대 유래의 SDA1 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0877729호는 애기장대 유래 유전자에 의한 종자수 증가에 관한 '종실의 길이 신장과 종자 생산성에 관여하는 두 개의 시토크롬 P450 유전자'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물의 바이오매스 생산성 또는 종자 수확량을 증가시키는 애기장대 유래 At3g52740 유전자 및 이의 용도에 관해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 애기장대 At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체가 비형질전환 식물체보다 생장이 촉진되어 바이오매스 생산량이 증가하고, 개화 및 노화가 지연되어 종자 수확량이 증가되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 바이오매스 생산성을 증가시키거나 또는 종자 수확량을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 바이오매스 생산성이 증가되거나 또는 종자 수확량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 식물체의 바이오매스 생산성이 증가되거나 또는 종자 수확량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 바이오매스 생산성을 증가시키거나 또는 종자 수확량을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 At3g52740 단백질 코딩 유전자 유래 프로모터 및 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물 세포를 제공한다.

본 발명에서는 애기장대 At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체에서 비형질전환 식물체에 비해 식물체의 바이오매스 생산성이 증가되고, 종자 수확량이 증가되는 것을 확인하였다. 바이오매스의 증가는 바이오에너지 생산에 기여할 수 있고, 종자 수확량의 증가는 식량 문제 해결에 기여할 수 있으므로, 본 발명의 애기장대 At3g52740 유전자를 이용한 고부가가치 생명공학 작물 개발은 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 본 발명에 사용된 At3g52740 유전자 형질전환 식물체 제작을 위해 사용된 재조합 벡터의 모식도이다.
도 2는 야생형 애기장대에서 다양한 광 조건에 따른 At3g52740 유전자 및 At3g52740 단백질 발현 양상을 RT-PCR, qRT-PCR 및 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다. A는 RT-PCR 결과이고, B는 qRT-PCR의 결과이며 C는 웨스턴 블랏 결과이다. Dark, 암 조건; Blue, 청색광; Red, 적색광; Far-red, 근적외선광; White, 백색광; ACT, 액틴; AtTCTP, 애기장대 번역 조절 종양 단백질.
도 3은 야생형 애기장대에서 광 조사 시간에 따른 At3g52740 유전자 및 At3g52740 단백질 발현 양상을 RT-PCR 및 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다. A는 RT-PCR 결과이며, B는 웨스턴 블랏 결과이다. Dark→Blue; 암 조건에서 발아시켜 3일 동안 키운 후 청색광 조건으로 옮김, White→Dark; 백색광 조건에서 발아시켜 3일 동안 키운 후 암 조건으로 옮김.
도 4는 At3g52740 프로모터::GUS 재조합 벡터를 이용하여 형질전환한 애기장대 식물체의 발달 단계 및 조직 특이적 발현을 GUS 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 CsVMV::At3g52740-eGFP 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 식물체에서 At3g52740 단백질의 세포 내 위치분포를 공초점 레이저 현미경으로 관찰한 사진이다. GFP; At3g52740-eGFP 형광, Chloroplast; 엽록체 내 엽록소의 자가형광, bar=25㎛.
도 6은 At3g52740 유전자 과발현 및 저발현 형질전환 식물체에 있어서 청색광의 반응성을 분석한 결과로, A는 하배축의 길이를 측정한 사진이며, B와 C는 At3g52740 유전자 과발현 식물체와 저발현 식물체에 있어서 At3g52740 유전자의mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 확인한 결과이다. Col-0, 비형질전환 식물체 대조구; 35S::At3g52740, At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체; CsVMV::At3g52740-eGFP, At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체; At3g52740-RNAi, At3g52740 유전자 저발현 형질전환 식물체, bar=1cm.
도 7은 At3g52740 유전자 과발현 및 저발현 형질전환 식물체의 잎 발달 수준을 측정한 결과이다. A와 B는 장일 조건으로 키운 형질전환 및 비형질전환 식물체를 동일한 시기에 관찰한 사진이고, C는 잎의 길이, D는 잎의 면적을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. Col-0, 비형질전환 식물체 대조구; 35S::At3g52740, At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체; At3g52740-RNAi, At3g52740 유전자 저발현 형질전환 식물체, bar=1cm.
도 8은 At3g52740 유전자 과발현 및 저발현 형질전환 식물체의 줄기 발달 수준을 측정한 결과이다. A는 장일 조건으로 키운 5주령 형질전환 및 비형질전환 식물체의 개화기 줄기(inflorescence stem)의 비교 사진이고, B는 개화기 줄기의 횡단면 사진이며, C는 횡단면 면적 측정 결과를 나타내는 그래프이다. Col-0, 비형질전환 식물체 대조구; 35S::At3g52740, At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체; At3g52740-RNAi, At3g52740 유전자 저발현 형질전환 식물체.
도 9는 At3g52740 유전자 과발현 및 저발현 형질전환 식물체의 크기를 비교한 결과로, A는 비형질전환 식물체와 형질전환 식물체의 크기를 비교한 사진이고, B는 식물체의 크기를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. Col-0, 비형질전환 식물체 대조구; 35S::At3g52740, At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체; At3g52740-RNAi, At3g52740 유전자 저발현 형질전환 식물체.
도 10은 At3g52740 유전자 과발현 및 저발현 형질전환 식물체의 개화 시기 조사 결과로, A는 비형질전환 식물체(Col-0)가 꽃피는 시기에 형질전환 식물체들의 개화 표현형을 비교한 사진이고, B와 C는 추대(bolting) 시기의 로제타 잎의 개수를 비교한 사진이고, C는 그 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다. Col-0, 비형질전환 식물체 대조구; 35S::At3g52740, At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체; At3g52740-RNAi, At3g52740 유전자 저발현 형질전환 식물체, 검은색 bar=1cm.
도 11은 At3g52740 유전자 과발현 및 저발현 형질전환 식물체의 꽃 발달 수준을 비교한 결과로, 장일 조건으로 키운 5주령 형질전환 및 비형질전환 식물체의 꽃을 수집하여 분석한 결과이다. Col-0, 비형질전환 식물체 대조구; 35S::At3g52740, At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체; At3g52740-RNAi, At3g52740 유전자 저발현 형질전환 식물체.
도 12는 At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체의 종자 수확량을 조사한 결과로, A는 비형질전환 식물체와 At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체로부터 수확한 종자의 수확량을 비교한 사진이고, B는 종자 수확량 측정 결과를 나타낸 그래프이다. Col-0, 비형질전환 식물체 대조구; 35S::At3g52740, At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체.
도 13은 CsVMV::At3g52740-eGFP 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체의 표현형을 확인한 결과로, A는 대조구 식물체와 형질전환 식물체의 생장 표현형을 보여주는 사진이고, B는 형질전환 식물체의 로제타 잎 표현형을 보여주는 사진이며, C는 형질전환 식물체의 측분열조직(lateral meristem)으로부터 생성된 추가 영양 조직의 모습을 보여주는 사진이다. Col-0, 비형질전환 식물체 대조구; CsVMV::At3g52740-eGFP, At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 바이오매스 생산성을 증가시키거나 또는 종자 수확량을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 식물체의 바이오매스 생산성의 증가는 하배축 길이, 잎 길이, 잎 면적, 줄기 두께, 지상부 길이, 추대(bolting) 시기의 로제타 잎의 개수, 꽃 크기 등의 증가일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 At3g52740 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 비형질전환체에 비해 식물체의 바이오매스 생산성을 증가시키거나 또는 종자 수확량을 증가시키는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 At3g52740 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 At3g52740 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

At3g52740 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV, 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "지속적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 지속적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 지속적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 단계; 및

본 발명에 따른 At3g52740 단백질의 범위는 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 애기장대 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 바이오매스 생산성을 증가시키거나 또는 종자 수확량을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 At3g52740 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 바이오매스 생산성을 증가시키거나 또는 종자 수확량을 증가시킬 수 있는 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) At3g52740 단백질 코딩 유전자 유래 프로모터를 제공한다.

본 발명의 상기 애기장대 At3g52740 단백질 코딩 유전자 유래 프로모터는 식물체에 도입된 유전자의 전사 개시를 돕거나 전사된 mRNA의 안정성 증가 또는 유전자 해독 효율을 높임으로써 목적 유전자의 발현을 현저히 증가시킬 수 있다.

또한, 상기 프로모터 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체는 염기 서열을 변화되지만, 서열번호 3의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 애기장대 At3g52740 단백질 코딩 유전자 유래 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 상기 벡터는 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 식물 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, "작동가능하게 연결"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.

본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입한 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물 세포를 제공한다. 식물은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. At3g52740 유전자 분리 및 식물 형질전환을 위한 유전자 벡터 제조

본 발명에 사용된 At3g52740 유전자는 애기장대(Arabidopsis thaliana) Col-0(콜롬비아 생태형)에서 분리하였다. 이를 위하여 10일 동안 키운 유식물체들을 RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, 미국)을 사용하여 RNA를 추출하였고, 추출된 RNA 중 5㎍을 올리고(dT)-프라이머와 M-MLV 역전사효소(Promega, 미국)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 100~200ng을 RT-PCR 시스템에서 다음의 유전자 특이적 프라이머들과 함께 사용하여 At3g52740 유전자를 클로닝 하였다; At3g52740 정방향 프라이머: 5'-CGGGATCCATGATGAACATCGACGATACG-3'(서열번호 4, 밑줄 BamHI) 및 At3g52740 역방향 프라이머: 5'-TCCCGAGCTCTCAACGTAAGATCAAGCAACG-3'(서열번호 5, 밑줄 SacI), At3g52740-eGFP 정방향 프라이머: 5'-GCTCTAGAATGATGAACATCGACGATACGAC-3'(서열번호 6, 밑줄 XbaI) 및 At3g52740-eGFP 역방향 프라이머: 5'-CGGGATCCACGTAAGATCAAGCAACGATTATG-3'(서열번호 7, 밑줄 BamHI). At3g52740 유전자를 pBI121 벡터 내로 클로닝하기 위해 사용된 제한효소 사이트는 밑줄로 표시하였다.

그리고 At3g52740 유전자의 결핍(녹아웃) 애기장대를 구할 수 없어, RNA 간섭(RNAi, RNA interference)을 이용한 녹아웃 식물체를 확보하여 분석하였다. 이때 사용한 프라이머들은 다음과 같다; At3g52740-RNAi 정방향 프라이머: 5'-GCTCTAGACCATGGATGATGAACATCGACGATACGACGTCTCC-3'(서열번호 8, 밑줄 AscI/XbaI) 및 AT3g52740-RNAi 역방향 프라이머: 5'-CGGGATCCATTTAAATGCAGTACGTGCAGACGAGATTCCGG-3'(서열번호 9, 밑줄 BamHI/SwaI). pFGC5941 벡터 내 유전자 클로닝에 사용된 제한효소 사이트는 밑줄로 표시하였다.

이들 프라이머와 합성된 cDNA를 주형으로 한 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 통하여 전체 길이 At3g52740 유전자를 증폭하고 분리하였으며, 이후 식물 형질전환용 벡터 pBI121 및 pFGC5941로 클로닝 하였다. 본 발명에서는 At3g52740 유전자 과발현을 위해서는 35S 프로모터를 이용하였으며, At3g52740 유전자에 eGFP를 융합시킨 재조합 유전자는 CsVMV 프로모터를 이용하였다(도 1).

실시예 2. 애기장대 형질전환 및 형질전환 식물체의 선발

애기장대의 형질전환은 꽃대 침지법를 이용하였으며, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 사용하였다. 형질전환체 선발은 At3g52740 유전자 과발현 식물체들은 카나마이신 선택 배지(50㎍/㎖)에서, 저발현 (RNAi) 형질전환체의 경우 바스타 제초제 선택 배지(30μM)에서 이루어졌다. T2 세대 종자를 이용한 3:1 분리 비율로 형질전환체 라인들을 선별하여 T3 세대 동형의(homozygous) 라인들을 확보한 후, T4 또는 T5 세대 종자를 이용하여 분석을 진행하였다.

이렇게 확보된 형질전환체들 중에서 향후 분석을 위한 최종 라인 선발을 위해, 선발된 형질전환 식물체 내에서의 유전자 발현을 검증하였다. 이때 야생형 애기장대(Col-0)를 대조구 식물체로 이용하였다. At3g52740 유전자 발현은 Stratagene Mx 3000P 기기를 이용한 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR, quantitative real-time RT-PCR) 분석 방법을 이용하였으며, 사용한 프라이머들은 하기 표 1과 같다. 액틴 유전자(ACT) 발현을 양성 대조구로 사용하여 발현 수준을 표준화하는데 이용하였다.

프라이머 종류	5'→3' 서열정보(서열번호)
At3g52740 정방향 (35S)	ACGTGCAGACGAGATTCCG (10)
At3g52740 정방향 (RNAi)	GAATCTGCTTTACTATTGTGTCATC (11)
At3g52740 역방향	CGGTCCATCTCAGCCTCCTT (12)
액틴 정방향	TTGACCTTGCTGGACGTG (13)
액틴 역방향	GGAAGCAAGAATGGAACCAC (14)

qRT-PCR 분석을 통하여 대조구 식물체에 비하여 At3g52740 유전자가 300~500배 과발현되는 형질전환체와 0.5~0.01배 발현 감소된 RNAi 형질전환체를 최종 라인으로 확보하여 분석에 사용하였다(도 6B 및 C).

실시예 3. At3g52740 유전자 및 단백질의 발현 특성 분석

본 발명의 유전자는 광(light)에 의해 발현이 유도되는 유전자들의 기능 연구 과정에서 발견된 것이었다. 이에 상기에서 선발된 형질전환체 라인들의 분석에 앞서, At3g52740 유전자 및 단백질 발현 특성을 야생형 애기장대(Col-0)를 이용하여 다양한 광 조건에 대한 반응을 분석하였다. 이를 위해 소독된 종자를 3일 동안 암(Dark) 조건 및 4℃에서 처리한 후, 청색(Blue, 10 μmole·m^-2·s^-1), 적색(Red, 10μmole·m^-2·s^-1), 원적색(Far-red, 10μmole·m^-2·s^-1)의 광조건으로 옮겨 5일 동안 키운 유식물체를 분석하였다. 이때 암 조건 및 배양실의 백색(White)광 조건에서 5일 배양한 유식물체도 함께 이용하였다.

그리고 광 조사 시간별로, 광에 의한 At3g52740 유전자 및 그 단백질 발현 유도를 분석하기 위해, 암 조건에서 3일 동안 키운 유식물체를 청색(10μmole·m^-2·s^-1) 광 조건으로 옮긴 후, 0, 10, 20, 40, 60 및 120분 그리고 6, 12, 24 및 48 시간 동안 조사한 후 유식물체를 액체질소를 이용해 냉각시켜 샘플을 얻었다. 또한 광에 의한 유전자 및 단백질 발현 감소를 분석하기 위해서는 백색광 조건에서 3일 동안 키운 유식물체를 암 조건으로 옮긴 후 0, 12 및 24 시간 배양 후 샘플을 확보하였다.

이렇게 확보된 유식물체 샘플을 이용하여 RT-PCR 및 웨스턴 블랏 분석을 통하여 유전자 발현과 단백질 발현을 분석하였다. 그리고 유전자 발현의 정량적 분석을 위해서는 qRT-PCR도 수행하였다. 먼저 RT-PCR과 qRT-PCR 분석을 위해서 추출한 총 RNA 5㎍을 RNA to cDNA EcoDry^TM Premix(Clontech, 미국)을 이용하여 cDNA를 합성한 후, 전술한 프라이머(표 1)들을 이용하여 PCR을 수행하였다. qRT-PCR의 경우, BrilliantⅢ Ultra-Fast SYBR Green Q.PCR Master Mix(Agilent, 미국)와 함께 Stratagene Mx 3000P 시스템을 이용하였으며, MxPro(Agilent qPCR software) 프로그램으로 결과 분석을 진행하였다. 이때 액틴 유전자를 표준화에 사용하였다. 웨스턴 블랏 분석을 위해서 상기 조건에서 키운 유식물체를 액체질소 조건에서 분쇄한 후, 5x SDS buffer(250 mM Tris, pH 6.8, 10% SDS, 30% 글리세롤, 0.5 M DTT, 0.05% 브로모페놀 블루)를 최종 1X SDS 버퍼가 되도록 첨가하였다. 이렇게 추출된 단백질 분획은 Quant-iT^TM Protein Assay Kit(Invitrogen, 미국)을 이용하여 정량되었으며, 추출된 단백질 30㎍을 14% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 분리한 후 PVDF 멤브레인으로 블랏팅하였다. 이후 본 발명자가 제작한 At3g52740-특이적 다클론성 항체와 멤브레인을 반응시키고, SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Scientific, 미국)를 이용하여 현상하여 At3g52740 단백질의 발현 양상을 분석하였다. 이때 애기장대 TCTP 단백질(AtTCTP)을 양성 대조구로 사용하였다.

그 결과, 다양한 광 조건들에 반응하여 애기장대 At3g52740 유전자 및 그 단백질의 발현이 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 청색광과 백색광에서 At3g52740 유전자의 발현 및 단백질 발현이 암 조건에서 배양한 대조구에 비해 현저히 높은 수준으로 유전자 및 단백질이 발현하고 있음을 확인할 수 있었다(도 2). 또한, 광 조사 시간에 따른 At3g52740 유전자 및 단백질의 발현 역시, 광 조사 시간에 비례하여 발현 수준이 증가함을 확인할 수 있었다(도 3).

실시예 4. At3g52740 유전자의 발달 단계 및 조직 특이적 발현 특성 분석

At3g52740 유전자의 발달 단계 및 조직 특이적 발현 분석을 위하여 먼저 At3g52740 유전자의 프로모터 부분을 클로닝 하였다. 본 발명에서는 At3g52740 유전자 상위 약 489bp 부분을 At3g52740 프로모터 정방향 프라이머 : 5'-CCCAAGCTTGGATCCTCTAGTTGAGTTTGGTCAC-3'(서열번호 15, 밑줄 HindⅢ) 및 At3g52740 프로모터 역방향 프라이머 : 5'-GCTCTAGAGATGACACAATAGTAAAGCAGATTCAG-3'(서열번호 16, 밑줄 XbaI)를 이용하여 클로닝 하였다.

이후 At3g52740 유전자 프로모터를 HindⅢ와 XbaI 제한 효소를 이용하여 GUS 유전자가 발현되도록 pBI101 벡터로 클로닝 하였고, 이 유전자 벡터를 애기장대로 형질전환시켜 순수계통 형질전환체를 확보하였다. 그리고 At3g52740 유전자 발현 분석은 GUS 활성을 조사하여 진행되었으며, 이를 위하여 종자에서부터 시작하여 발아 단계 (1일 및 2일), 유묘 단계 (3일 및 7일) 및 성숙 단계 (3주 및 4주)의 식물체를 준비하였다. GUS 활성 분석은 GUS 염색 방법을 이용하였으며, 이것은 식물 샘플을 GUS 염색 용액(80mM 소디움 포스페이트, pH 7.0, 0.4mM 포타슘 페리시아나이드, 0.4mM 포타슘 페로시아나이드, 8mM 소디움-EDTA, 0.05% 트리톤 X-100, 0.8㎎/㎖ 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠로나이드(X-gluc, USB, 미국), 20% 메탄올)에 처리해 8~24시간 염색한 후, 에탄올(50%, 70%, 100% 순으로 사용) 용액을 이용하여 엽록소를 제거하는 과정을 거쳐 수행되었다. 이후 GUS 발현은 광학 현미경(Olympus SZX-ILLD200, 일본)을 이용해 관찰하였으며, 각 발달 단계에서의 발현을 포함하여 조직 특이적 발현을 함께 조사하였다.

그 결과, At3g52740 유전자는 식물체 발달 단계 전반에 걸쳐 그 발현이 유도되고 있음을 확인할 수 있었으며, 특히 종자 및 유묘의 발달 단계에서는 신장되고 있는 식물체의 뿌리, 떡잎, 하배축 및 잎의 말단 부위에서 주로 발현되고, 성숙 식물체에서는 뿌리 및 잎 조직들과 꽃의 꽃자루 및 수술 부위에서 주로 발현되고 있음이 관찰되었다(도 4).

실시예 5. At3g52740 단백질의 세포 내 위치 분석

도 1B의 벡터(CsVMV::At3g52740-eGFP in pBI121)를 도입시킨 애기장대 형질전환체 순수계통을 이용하여, 식물체 내 At3g52740 단백질의 존재와 위치를 GFP 시그널을 조사하여 분석하였다. 사용된 식물체 샘플은 4℃에서 3일 동안 암 조건에서 배양한 후, 청색(10μmole·m^-2·s^-1) 광 조건에서 4일간 키운 유식물체를 시료로 하여, 공초점 주사 레이저 현미경(Laser Scanning Confocal Microscope, Leica TCS SP5 AOBS/tandem, 독일)을 이용하여 관찰하였다. 이때 유식물체의 하배축을 주로 관찰하였으며, 세포 내 엽록체의 엽록소 자가형광(chlorophyll auto-fluorescence)과 At3g52740 융합-eGFP 형광을 조사하였다. 그리고 차등간섭대비(DIC, differential interference contrast) 이미지도 대조구로 함께 조사하였다.

그 결과, At3g52740 단백질은 주로 식물체의 핵에 존재하는 것으로 확인되었다(도 5).

실시예 6. At3g52740 유전자 형질전환체들의 광 반응성 조사

At3g52740 유전자 및 단백질은 광에 의해 발현이 유도되는 것을 상기에서 확인하였기에, 본 발명에서는 At3g52740 유전자 과발현 및 저발현(At3g52740-RNAi) 형질전환 식물체들의 광 반응성 특성을 분석하였다. 이때 과발현 식물체는 35S 프로모터를 이용한 것(35S::At3g52740)과 35S 보다 강력한 CsVMV 프로모터를 이용한 것(CsVMV::At3g52740-eGFP)의 두 종류를 사용하였으며, 야생형 애기장대(Col-0)를 대조구로 포함하였다. 본 발명에서는 적색, 원적색, 청색광 조건에서 광 반응성을 조사하였으나 적색 및 원적색 광 반응성은 대조구와 동일하여 청색광 반응성을 주로 분석하였다. 식물의 청색광 반응성은 소독된 종자를 3일 동안 4℃, 암 조건 처리 후, 1/2 MS 아가 플레이트에 파종하고 청색광(1 또는10μmole·m^-2·s^-1) 조건에서 4일 동안 배양한 유식물체의 하배축 길이를 측정하여 분석하였다. 하배축 길이는 유식물체 사진을 확보한 후, 이미지 소프트웨어(scion image, www.scioncorp.com/)를 이용하여 측정하였다(표 2). 데이터 수치는 평균±표준편차를 나타내며, n 수는 30이다.

mm (광 세기 = 1μmole·m^-2·s^-1)		mm (광 세기 = 10μmole·m^-2·s^-1)
Col-0 (대조구)	11.08±1.35	Col-0 (대조구)	2.85±0.42
35S::At3g52740	14.09±1.65	35S::At3g52740-1	13.48±1.25
At3g52740-RNAi	8.30±1.22	35S::At3g52740-2	14.45±1.81

도 6A의 결과를 살펴보면 At3g52740 유전자 과발현 식물체(35S::At3g52740 및 CsVMV::At3g52740-eGFP)의 하배축은 대조구(Col-0) 식물체에 비해 하배축의 길이가 긴 것을 확인할 수 있었고, At3g52740 유전자 저발현 식물체(At3g52740-RNAi)의 경우는 대조구 보다 짧은 길이의 하배축을 가지는 것으로 확인되었다.

실시예 7. At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체의 표현형 분석 - 생육 촉진 및 바이오매스 증대 분석

형질전환 식물체의 표현형 분석은 성숙 과정 식물체의 잎과 줄기를 포함한 식물체 크기를 대조구 식물체와 비교하여 분석하였다. 통상 식물의 바이오매스 수확량은 식물체 크기와 비례하며, 특정 발달 단계에서 식물체의 각 기관의 크기를 비교하여 유추 가능하다. 이에 본 발명에서는 식물체의 잎 길이와 면적, 줄기 두께 및 식물체의 지상부 길이를 측정하여 분석하였다. 잎 길이 및 면적 측정은 5주령 식물체를 이용하였으며, 각 식물체의 8번째 로제타 잎을 이용하였다. 잎 길이(mm)의 경우 잎몸과 잎자루를 포함하는 길이를 측정하였으며, 잎 면적(mm²)은 잎 사진에서 이미지 소프트웨어(scion image)를 이용하여 측정하였다(도 7). 줄기의 경우, 각 식물체의 개화기 줄기(inflorescence stem)의 뿌리 위 5mm 부위를 잘라 횡단면 사진을 확보한 후, 그 면적을 이미지 소프트웨어를 이용하여 측정하였다(도 8). 그리고 성숙 식물체 전체의 지상부 길이는 식물체의 가장 긴 길이를 기준으로 측정하였다(도 9).

그 결과, At3g52740 유전자 과발현 식물체(35S::At3g52740)에서는 잎의 길이와 면적이 증가하였고, At3g52740 유전자 저발현 식물체(At3g52740-RNAi)에서는 대조구(Col-0) 식물체에 비해 잎의 길이와 면적이 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 7). 또한, At3g52740 유전자 과발현 식물체는 대조구 식물체(Col-0)에 비해 줄기 두께가 증가한 것을 확인할 수 있고, At3g52740 유전자 저발현 식물체는 줄기 두께가 대조구 식물체의 두께에 비해 감소하였음을 확인할 수 있었으며(도 8), 형질전환 식물체의 지상부 길이 측정 결과, 대조구 식물체에 비해 At3g52740 유전자 과발현 식물체는 전체적인 길이가 증대되어 있음을 확인할 수 있었고, At3g52740 유전자 저발현 식물체는 전체적인 길이가 대조구 식물체에 비해 감소하였음을 확인할 수 있었다(도 9).

이상의 결과를 통해 At3g52740 유전자가 과발현되면 식물체의 생장이 촉진되어 식물체가 커지고, 궁극적으로 바이오매스 생산량이 증대되어 수확량이 증가됨을 의미한다.

실시예 8. At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체의 표현형 분석 - 개화/노화 지연 및 종자 수확량 증대 분석

At3g52740 유전자 과발현 식물체는 개화가 지연되는 표현형을 보였기에, 본 발명의 형질전환 식물체의 개화 시기를 측정하였다. 애기장대 식물의 개화 시기는 통상 추대(bolting) 시기에 형성하는 로제타 잎의 개수를 조사하여 이루어지므로, 추대가 이루어진 개화기 줄기가 약 5cm 크기로 형성되었을 때 로제타 잎의 개수를 측정하여 개화 시기를 분석하였다. 상기 실시예 7에 의하면 At3g52740 유전자 과발현 식물체는 생장이 촉진되어 잎과 줄기, 그리고 식물체 크기가 증대되었음을 알 수 있었다. 이에 본 발명의 형질전환 식물체의 꽃 기관의 크기 또한 측정 및 분석하였다. 이를 위해 약 5주령의 형질전환 식물체에서 꽃이 나오면 꽃을 수집하여 사진을 찍은 후 이미지 소프트웨어를 사용하여 비교하였다. 또한, At3g52740 유전자 발현이 식물체의 종자 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여 대조구 식물체와 At3g52740 유전자 과발현 식물체를 동일한 조건에서 재배한 후 각 식물체 중 하나를 수확하여 종자를 수거하여 무게를 측정하여 분석하였다.

그 결과, 추대(bolting) 시기의 로제타 잎 개수 측정 결과, 대조구 식물체(Col-0)는 평균 10개 정도의 로제타 잎이 형성되면 개화가 일어나는데 반해, At352740 유전자 과발현 식물체(35S::At3g52740)의 개화는 평균 12~13개의 로제타 잎이 형성되는 시기에 개화가 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 반면, At3g52740 유전자 저발현 식물체(At3g52740-RNAi)는 대조구 식물체와 개화 시기가 큰 차이가 없는 것으로 확인되었다(도 10). 또한, At352740 유전자 과발현 식물체(35S::At3g52740)의 꽃 크기는 대조구 식물체에 비해 크기가 증가하였고, At3g52740 유전자 저발현 식물체(At3g52740-RNAi)에서는 큰 차이가 없음을 확인하였다(도 11). 종자 수확량 역시, At352740 유전자 과발현 식물체(35S::At3g52740)의 종자 수확량이 대조구 식물체(Col-0)에 비해 약 36% 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 12).

이상의 결과를 통해 At3g52740 유전자를 과발현 시키면 식물체의 개화가 지연되고, 식물체의 조직 생장을 촉진시켜 꽃의 크기가 증가함을 확인하였으며, 최종적으로 식물의 종자 수확량을 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서는 또한 35S 프로모터 외에 CsVMV 프로모터를 이용한 At3g52740 유전자 과발현 식물체(CsVMV::At3g52740-eGFP)를 제조하였기에, 이들의 표현형 관찰도 함께 수행하였다. 그 결과, 35S 프로모터를 이용한 At3g52740 유전자 과발현 형질전환 식물체의 결과와 유사하게, CsVMV 프로모터를 이용한 At3g52740 유전자 과발현 식물체 또한 대조구 식물체(Col-0)에 비해 생장이 크게 촉진된 표현형을 나타내었으며, 측분열조직(lateral meristem)으로부터 추가적인 영양 조직 형성이 더욱 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 13).

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> At3g52740 gene from Arabidopsis thaliana for enhancing biomass productivity or seed yield of plant and uses thereof <130> PN13351 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 423 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgatgaaca tcgacgatac gacgtctcca atggcccacc cgatcggtcc atctcagcct 60 ccttccgacc aaaccaaaca agatccgcca agtttgcccc aagaagcagc ttcttctgtt 120 tcggccgaca agaaagatct agctttgctt gaagagaaac cgaagcagag tcaagaagaa 180 gatagagtgg acactgggag agagaggtta aagaagcatc ggagagagat cgctggtagg 240 gtttggatac cggagatatg gggacaagaa gagcttctta aggattggat cgattgttca 300 acgtttgaca cgtgtctagt ccctgccgga atctcgtctg cacgtactgc tctcgtagag 360 gaagctaggc gagctgcttc agcttctggt gggttacata atcgttgctt gatcttacgt 420 tga 423 <210> 2 <211> 140 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Met Asn Ile Asp Asp Thr Thr Ser Pro Met Ala His Pro Ile Gly 1 5 10 15 Pro Ser Gln Pro Pro Ser Asp Gln Thr Lys Gln Asp Pro Pro Ser Leu 20 25 30 Pro Gln Glu Ala Ala Ser Ser Val Ser Ala Asp Lys Lys Asp Leu Ala 35 40 45 Leu Leu Glu Glu Lys Pro Lys Gln Ser Gln Glu Glu Asp Arg Val Asp 50 55 60 Thr Gly Arg Glu Arg Leu Lys Lys His Arg Arg Glu Ile Ala Gly Arg 65 70 75 80 Val Trp Ile Pro Glu Ile Trp Gly Gln Glu Glu Leu Leu Lys Asp Trp 85 90 95 Ile Asp Cys Ser Thr Phe Asp Thr Cys Leu Val Pro Ala Gly Ile Ser 100 105 110 Ser Ala Arg Thr Ala Leu Val Glu Glu Ala Arg Arg Ala Ala Ser Ala 115 120 125 Ser Gly Gly Leu His Asn Arg Cys Leu Ile Leu Arg 130 135 140 <210> 3 <211> 489 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 ggatcctcta gttgagtttg gtcacacaaa aaaaaaaatt cctttaattg agagttttac 60 ctggcaaaaa tcattagaat agacttgatc acttgcaaaa aaataaaaaa aatgaattac 120 aatagacttg atcacttgat agaattttag gttatctaat caatagttta attctatatt 180 gactatttat ttatttatat aggctcaaaa aattaagggc caaagcaatt caatctgcaa 240 aaaagacacg taaagttgtc acttaccata caatacaaca aaagcgaaaa taaaaaaagt 300 tattcaccaa acaaaaactt acgtcgacgt gtaagacaac ctcccacccg attttctcat 360 ttccttacat aacccaacaa aaaatacata ttatcaacac cgaatctctc aacacaaaca 420 aaatcacaca tctctcttca tctttttgtt tcctgcaaga atctgaatct gctttactat 480 tgtgtcatc 489 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgggatccat gatgaacatc gacgatacg 29 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcccgagctc tcaacgtaag atcaagcaac g 31 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gctctagaat gatgaacatc gacgatacga c 31 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgggatccac gtaagatcaa gcaacgatta tg 32 <210> 8 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gctctagacc atggatgatg aacatcgacg atacgacgtc tcc 43 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgggatccat ttaaatgcag tacgtgcaga cgagattccg g 41 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 acgtgcagac gagattccg 19 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gaatctgctt tactattgtg tcatc 25 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cggtccatct cagcctcctt 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ttgaccttgc tggacgtg 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggaagcaaga atggaaccac 20 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cccaagcttg gatcctctag ttgagtttgg tcac 34 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gctctagaga tgacacaata gtaaagcaga ttcag 35

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 바이오매스 생산성을 증가시키거나 또는 종자 수확량을 증가시키는 방법.
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서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 At3g52740 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 바이오매스 생산성이 증가되거나 또는 종자 수확량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
삭제
제3항의 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 식물체의 바이오매스 생산성이 증가되거나 또는 종자 수확량이 증가된 형질전환 식물체.
제5항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 또는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제5항에 따른 식물체의 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 At3g52740 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 바이오매스 생산성을 증가시키거나 또는 종자 수확량을 증가시키기 위한 조성물.
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