CN103288941A - 一种调节叶绿体蛋白翻译效率及改善植物耐热性的相关蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种调节叶绿体蛋白翻译效率及改善植物耐热性的相关蛋白及其应用。具体地，本发明人从各种不同的拟南芥突变体中筛选了一种与调节叶绿体蛋白翻译效率及植物耐热性性状相关的突变体rps1，并从所述突变体中鉴定了植物叶绿体核糖体小亚基S1(RPS1)基因，所述基因及多肽能够有效维持类囊体膜的热稳定性，提高植物叶绿体蛋白的翻译效率，提高植物在热胁迫下的生存能力及光合效率，有效避免或减少高温对植物产生的不利影响。

Description

一种调节叶绿体蛋白翻译效率及改善植物耐热性的相关蛋白及其应用

技术领域

本发明属于植物学和生物技术领域，具体地，本发明涉及一种调节叶绿体蛋白翻译效率及改善植物耐热性的相关蛋白及其应用。

背景技术

由于二氧化碳排放量的增加，地球温室效应不断加剧，导致全球性的气候变暖。在自然环境下生长的植物都受到温度升高的影响，使植物的生长出现障碍，特别是一些大春作物，如水稻、玉米等在抽穗、灌浆期间，很容易受到高温天气的影响，造成农作物的减产。国际水稻研究所的数据表明，1998-2003年，气温每升高1℃，全球农作物减产10％。据专家预测，未来100年全球气温可能上升5-6℃，我国到了2050年，全国平均气温将上升2.2℃。

另一方面，根据国际粮农组织(FAO)的分析数据，到2050年，世界人口将突破100亿。随着人口的进一步增加，农业尤其是粮食生产面临的压力进一步增加，世界范围内的粮食短缺状况将长期存在。受到全球气候变暖的影响，大量的植物会出现生长障碍、甚至死亡，不仅生态平衡遭到破坏，粮食安全也受到威胁。

类囊体膜是光合作用的场所，也是逆境因子作用的敏感位点，光系统II(PS II)是植物对热最敏感的膜蛋白复合体之一，热胁迫会在极短的时间内导致类囊体膜的结构发生改变，从而对光合作用和植物其他生理过程产生影响。深入理解类囊体膜稳定性的机制，有助于提高在逆境环境，尤其是高温胁迫的条件下植株的光合效率。

迄今为止，本领域还未发现能够调节叶绿体蛋白翻译效率、改善植物耐热性以及维持类囊体膜稳定性的耐热蛋白。因此本领域迫切需要大量筛选并开发相关基因或蛋白，以准确有效地改变植物农艺性状，实现植物的品系改良，更好地调控植物的生长发育。

发明内容

本发明的目的就是提供一种调节叶绿体蛋白翻译效率及改善植物耐热性的相关蛋白及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的RPS1多肽或其编码基因的用途，所述用途是选自下组的一种或多种用途：

(1)所述多肽或其编码基因用于提高植物类囊体膜的热稳定性；

(2)所述多肽或其编码基因用于提高植物抵抗高温胁迫的能力；

(3)所述多肽或其编码基因用于提高植物叶绿体蛋白的翻译效率。

在另一优选例中，所述的RPS1多肽任选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.：3所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有调节叶绿体蛋白翻译效率及改善植物耐热性功能的由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.：3所示氨基酸序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，具有调节叶绿体蛋白翻译效率及改善植物耐热性功能的多肽。

在另一优选例中，所述的RPS1多肽的编码基因任选自下组：

(A)编码如SEQ ID NO.：3所示多肽的多核苷酸；

(B)序列如SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：2所示的多核苷酸；

(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：2所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(D)如SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的编码基因编码上述选自(i)、(ii)或(iii)的RPS1多肽。

在另一优选例中，所述的RPS1多肽或其编码基因来源于十字花科植物。

在另一优选例中，所述的RPS1多肽或其编码基因来源于拟南芥(如Col-O型拟南芥)或其变体。

在本发明的第二方面，提供了一种提高植物抵抗高温胁迫能力的方法，包括步骤：提高所述植物中RPS1多肽的表达或活性。

在本发明的第三方面，提供了一种提高植物类囊体膜热稳定性的方法，包括步骤：提高所述植物中RPS1多肽的表达或活性。

在本发明的第四方面，提供了一种提高植物高温下的光合效率的方法，包括步骤：提高所述植物中RPS1多肽的表达或活性。

在本发明的第五方面，提供了一种提高植物高温下叶绿体蛋白翻译效率的方法，包括步骤：提高所述植物中RPS1多肽的表达或活性。

在另一优选例中，适用于上述方法的所述植物包括(但并不限于)：水稻、小麦、玉米、大豆、高粱、棉花、蔬菜、及十字花科植物(如拟南芥)。

在另一优选例中，第二-第五方面任一所述的方法包括步骤：

(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体含有RPS1多肽的编码序列；

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使RPS1多肽的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c)选择已转入RPS1多肽编码序列的植物细胞、或组织、或器官；

(d)将步骤(c)中的植物细胞、或组织、或器官再生为植株。

在另一优选例中，所述的RPS1多肽的编码基因编码选自(i)、(ii)或(iii)的RPS1多肽。

在本发明的第六方面，提供了一种改造植物的方法，包括步骤：

(a1)提高所述植物中RPS1多肽的表达水平或活性；或

(a2)降低所述植物中RPS1多肽的表达水平或活性。

在另一优选例中，所述方法(a1)用于提高植物抵抗高温胁迫，提高植物类囊体膜热稳定性，提高植物高温下光合效率，和/或提高植物高温下叶绿体蛋白翻译效率。

在另一优选例中，所述方法(a2)用于降低植物抵抗高温胁迫，降低植物类囊体膜热稳定性，或降低植物高温下光合效率，和/或降低植物高温下叶绿体蛋白翻译效率。

在另一优选例中，所述方法(a1)用于提高植物中光合作用相关蛋白的表达水平，其中所述的光合作用相关蛋白包括(但并不限于)：D1、D2、CP43、CP47、PsaA、PsaB、以及ATPase的β-亚基。

在另一优选例中，所述方法(a2)用于降低植物中光合作用相关蛋白的表达，其中所述的光合作用相关蛋白包括(但并不限于)：D1、D2、CP43、CP47、PsaA、PsaB、以及ATPase的β-亚基。

在另一优选例中，在步骤(a2)中包括步骤：特异性敲除或干扰RPS1多肽的编码基因的表达。

在另一优选例中，所述植物选自下组：水稻、小麦、玉米、大豆、高粱、棉花、蔬菜、及十字花科植物(如拟南芥)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1为rps1突变体表型分析结果，图1A显示Col-O野生型和rps1突变体植株表型；图1B和图1C为以长至21d的野生型和rps1为材料，RT-PCR分析RPS1基因(图1B)和Western blot分析RPS1蛋白(图1C)的表达差异；图1D为在rps1突变体中，T-DNA插入RPS1基因的具体位置。

图2显示了rps1突变体叶绿体生理、生化和超微结构，图2A为WT和rps1叶肉细胞的叶绿体超微结构，下排图片是对应上排图片的局部放大图，棒状基线(Bar)＝1μm；图2B为类囊体垛叠度结果，与WT相比，rps1类囊体垛叠度明显降低，仅为对照组的65％；图2C为叶片类囊体膜蛋白western blot分析结果，以等质量叶绿素为上样标准，1代表含2μg叶绿素的类囊体膜蛋白。

图3显示诱导型RPS1-RNAi转基因植株表型分析，图3A中，依据诱导型RNAi植株出现斑叶强弱程度的不同，转基因植物分成typeA和typeB两种类型；图3B为RT-PCR结果，显示了WT、typeA和typeB植株中RPS1的表达变化。

图4为转基因植株Comp rps1-2，Comp rps1-3，Comp rps1-4的qRT-PCR分析结果，三种植株中RPS1表达量明显上升。

图5为在激光共聚焦显微镜下观察转基因植株结果，RPS1在叶肉细胞原生质体中，绿色荧光信号集中在叶绿体内，并能够与叶绿体自发荧光很好的重叠，表明RPS1定位于叶绿体。

图6为叶绿体翻译效率分析结果，RPS 1作为核糖体亚基蛋白参与类囊体膜光合蛋白(如D1，CP43等)的翻译，rps1植株中D1蛋白的合成速率仅为WT的44％，CP43蛋白的合成速率仅为WT的55％。

图7为利用RPS1多克隆抗体进行Western blot分析结果，显示在热处理的0h、0.5h、1h和2h四个时间点RPS 1的动力学表达变化。

图8为植株的耐热性实验结果，在热处理的条件下，RPS1过表达的植株比野生型植株的存活率高40-50％。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，从大量的T-DNA插入拟南芥突变体中，首次鉴定并筛选到一种与调节叶绿体蛋白翻译效率及植物耐热性性状相关的突变体rps1，并从所述突变体中鉴定了植物叶绿体核糖体小亚基S1(RPS1)基因，本发明的RPS1基因及蛋白能够有效维持类囊体膜的热稳定性，提高植物叶绿体蛋白的翻译效率，提高植物在热胁迫下的生存能力及光合效率，提高作物产量，避免或有效减少高温对植物产生的不利影响。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“本发明基因”、“RPS1基因”、“本发明的维持类囊体膜稳定基因”、“本发明的耐热相关基因”可以互换使用，都是指来源于植物(较佳地来自拟南芥或类似植物)的叶绿体核糖体小亚基S1基因及其变体。本发明的基因一种典型的核苷酸序列如SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：2所示。

如本文所用，术语“本发明多肽”、“RPS1多肽”、“本发明的维持类囊体膜稳定多肽”、“本发明的耐热相关多肽”可以互换使用，都是指来源于植物(较佳地来自拟南芥或类似植物)的叶绿体核糖体小亚基S1及其变体。本发明多肽的一种典型的氨基酸序列如SEQ ID NO.：3所示。

如本文所用，术语“植物”没有特别的限制，包括(但不限于)：花卉植物、水果植物、林业植物、蔬菜、农作物等，例如水稻、小麦、玉米、大豆、高粱等。

水果植物包括(但不限于)：柑橘科、蔷薇科、葫芦科、芭蕉科的植物等。

蔬菜植物包括(但不限于)：菊科、茄科、唇形科、伞形科、十字花科的植物。

农作物例如但不限于：禾本科、石蒜科的植物等。

在本发明的一个优选例中，所述植物选自十字花科，更佳地为拟南芥属植物。

本发明提供了一种维持类囊体膜稳定性相关的植物耐热基因，所述基因为来源于野生型Col-0拟南芥或其变体的RPS1基因，RPS1基因也称为叶绿体核糖体小亚基S1基因。一种优选的基因全长核苷酸序列如SEQ ID NO.：1所示，CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示。本发明的基因可以有效维持类囊体膜的热稳定性，提高植物在热胁迫下的生存能力，提高作物产量，避免或减少高温对植物产生的不利影响。因此本发明的基因可以用于特异性改善植物的耐热性能。

本发明还包括与本发明的优选基因序列(SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：2)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，所述核酸也能有效地维持类囊体膜的热稳定性，提高植物在热胁迫下的生存能力，蛋白质翻译效率，及光合效率。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

在本发明中，SEQ ID NO.：l或SEQ ID NO.：2中的核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个，生成SEQ ID NO.：l或SEQ ID NO.：2的衍生序列，由于密码子的简井性，即使与SEQ ID NO.：l或SEQ ID NO.：2的同源性较低，也能基本编码出如SEQ ID NO.：3所示的氨基酸序列。另外，“在SEQ ID NO.：l中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.：l或SEQ ID NO.：2的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于拟南芥，但是来源于其它类似的植物(尤其是与拟南芥属于同一科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：2所示)具有一定同源性(保守性)的叶绿体核糖体小亚基S1基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。

本发明提供了一种维持类囊体膜稳定性相关的植物耐热多肽及其变体，在本发明的一个优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.：3所示。本发明的多肽能够有效维持类囊体膜的热稳定性，提高植物在热胁迫下的生存能力，调节叶绿体蛋白翻译效率及光合效率，提高作物产量，避免或有效减少高温对植物产生的不利影响。

本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.：3所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。

所述“相同或相似功能”是指：“维持类囊体膜的热稳定性、调节叶绿体蛋白翻译效率、抗热胁迫”。

本发明中，所述的多肽变体是如SEQ ID NO.：3所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

表1

本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO.：3差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。在本发明的实例中，所述的重组载体是双元载体pBI101.1。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用。

包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

作为本发明的一种优选方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子和目的基因(两者可操作地连接)的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是拟南芥、烟草、果树等。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的基因及多肽能够有效地维持类囊体膜的热稳定性；

(2)本发明的基因及多肽可以提高植物叶绿体多肽的翻译效率；

(3)本发明的基因及多肽可以提高植物在热胁迫下的生存能力及光合效率，提高作物产量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

rps1 T-DNA突变体的鉴定

本发明人从Salk网站购买了rps1 T-DNA突变体，在种植的当代，rps1T-DNA突变体就分离出叶色发黄的植株。根据Salk的预测，rps1的T-DNA插入位点在RPS1基因的第一个外显子中。

本发明人基于序列信息，合成了RPS1(CS874869)T-DNA插入突变体的鉴定引物序列：

LP(874869-L)：5′-GACTCCAGCTGGTTTAGAGGG-3′(SEQ ID NO.：4)；

RP(874869-R)：5′-CAAGTAAGCCGATGACTTTGC-3′(SEQ ID NO.：5)；

LB1：5′-GCCTTTTCAGAAATGGATAAATAGCCTTGCTTCC-3′(SEQ IDNO.：6)；和

LB2：5′-GCTTCCTATTATATCTTCCCAAATTACCAATACA-3′(SEQ IDNO.：7)。

用以上引物作为引物对，以rps1 T-DNA突变体的基因组DNA为模板，进行PCR反应，鉴定rps1突变体中T-DNA插入位置(PCR产物连到T载体上，测序后进行序列比确定)及插入纯合的突变体，同时对鉴定到正确的突变体与野生型进行回交，验证是否为单个T-DNA插入。

用RT-PCR实验检测rps1-1中RPS1的表达情况。按照RNeasyPlant MiniKit(QIAGEN)的方法提取被测样品的总RNA，用使用M-MLV逆转录酶(TOYOBO)合成cDNA的第一链，以此为模板进行PCR扩增RPS1基因。

所用引物为：

上游RPS1-rt-F：5′-TGTAGCAGATAGCCAAGCTCAG-3′(SEQ ID NO.：8)

下游RPS1-rt-R：5′-CTAAATATCAACTGCAGAAGGAATG-3′(SEQ IDNO.：9)。

以actin基因(拟南芥AT3G18780)做为RT-PCR的内标，所用引物为：

上游actin2-1F：5′-gcc atc caa gct gtt ctc tc-3′(SEQ ID NO.：10)；

下游actin2-1R：5′-gct cgt agt caa cag caa caa-3′(SEQ ID NO.：11)。

结果表明，在以叶色发黄植株叶片的DNA为模板的PCR反应中都能够得到阳性结果，提示叶色发黄的植株可能是RPS1基因位点T-DNA插入纯合突变体。由于RPS1纯合突变体表现叶色微黄的表型，因此将PCR鉴定为杂合体的植株进行单株收种，并种到营养土中统计有表型植株的比例，得到的分离比为213(近野生型表型)∶69(叶色微黄表型)，符合卡方检验的3∶1分离，表明该突变体为单位点突变。

本实施例的结果表明，与Salk预测的T-DNA插在RPS1基因ATG后第一个外显子中不同，发明人的PCR产物测序鉴定显示，rps1突变体中T-DNA插在5′-UTR之前的6bp处(图1D)，导致突变体中RPS1基因无论是在转录水平还是在多肽水平都明显下调(knockdown)(图1B，图1C)。在16h光照/8h黑暗的光照周期生长条件下，rps1莲座叶叶面积较小，叶色微黄，并且在发育后期，rps1莲座叶表现早衰表型(图1A)。

将rps1突变体与野生型(Col-O)进行回交，F2代的纯合突变体单株回收种子，扩繁后用于后面的生理、生化及遗传分析。

实施例2

RPS1表达下调以剂量依赖的方式降低类囊体膜系统的稳定性

1.类囊体垛叠度测定方法：参考文献(Khatoon et al.，2009)，并作适当修改：

1).取3-4g拟南芥叶片加20ml冰浴冷的GB缓冲液，在预冷的研钵上迅速研磨至匀浆状；

2).匀浆液用无尘纸(2-4层)过滤；

3).滤液经4℃，2600g，3min离心；

4).弃上清，加入10ml RB缓冲液，重悬；

5).4℃，2600g，3min离心；

6).重复4、5步骤一次；

7).Solution C重悬沉淀，丙酮法测叶绿素浓度，并用Solution C调叶绿素浓度至0.25mg/ml；

8).4℃，避光孵育15min；

9).加入工作浓度0.5％(W/V)毛地黄皂苷，冰浴、避光、震荡处理30min；

10).加5倍上述反应体积的Solution C以终止反应；

11).4℃，10000g，30min离心，弃上清；

12).用等体积(第9步)的Solution C重悬沉淀，丙酮法测叶绿素浓度。

Solution C：0.2M山梨醇，1.5mM K₂HPO₄(pH 7.0)

利用毛地黄皂苷处理野生型和rps1突变体的去膜叶绿体，分析类囊体的垛叠程度，结果显示rps1突变体的类囊体垛叠度(Stacking)仅为野生型的65％(图2B)。

2.利用透射电镜观察野生型和rps1突变体叶肉细胞的叶绿体超微结构，结果(图2A)显示在淀粉粒累积以及叶绿体形态和大小等方面二者并没有明显差别；但WT类囊体系统基质片层清晰可见，基粒片层叠垛整齐，而rps1突变体基质片层在多处发生断裂，基粒垛叠变薄并呈现些许不规则的排列。

3.对定位在类囊体膜上的光合作用多肽的Western blot分析表明，在rps1突变体中，当rps1表达下调时，许多重要光合作用多肽的表达都显著降低了(50-60％)，代表性的多肽有D1，D2，CP43，CP47，PsaA，PsaB以及ATPase的β-亚基(图2C)。

上述结果表明：RPSl表达下调，导致类囊体膜多肽合成减少，从而降低了rps1突变体类囊体的垛叠度。

实施例3

构建雌激素诱导型的RPS1-RNAi二元载体，构建方法如下：

利用RT-PCR的方法扩增RPS1的cDNA起始密码子ATG上游25bp和下游457bp之间的序列。

正义片段引物为：

上游引物：5′AAACCCGGGCTCGAGCTGTGTGAGTGAGTGAGACTC-3′

(SEQ ID NO.：14)

下游引物：5′-CGCTCTAGATGACAAACTCTTCCACCATAC-3′

(SEQ ID NO.：15)

反义片段引物为：

上游引物：5′-AAAGAGCTCCTCGAGCTGTGTGAGTGAGTGAGACTC-3′

(SEQ ID NO.：16)

下游引物：5′-CACGCGGCCGCTGACAAACTCTTCCACCATAC-3′

(SEQ ID NO.：17)

PCR条件：54℃退火15s，72℃延伸0.5min，30个循环。

扩增的正义片段和反义片段通过TA克隆法连接到市售的pMD19-T载体中，转入市售的宿主细胞DH5α中，通过amp^r和蓝白斑筛选后，再经PCR鉴定，选鉴定正确的克隆测序，测序正确后再分别用Sma I/Xba I和Sac I/Not I切下正义片段和反义片段，相继亚克隆到pBluescript SK+载体(购于美国Clontech公司)(pBluescript SK+载体的Xba I和Not I之间已经连有AtRTM基因120bp的内含子序列)对应的酶切位点中，形成pBS-SPR1-RTM-1RPS载体。用SmaI和SacI释放pBS-SPR1-RTM-1RPS载体中的SPR1-RTM-1RPS序列，连入同样经Sma I/Sac I双酶切的市售的双元表达载体pCAMBIA1300s中，形成组成型RPS1-dsRNAi载体。而用Xho I单酶切释放的SPR1-RTM-1RPS序列，连入同样经Xho I单酶切的双元表达载体中，形成诱导型RPS1-dsRNAi载体。之后两个二元载体分别转化拟南芥产生转基因植株。

总共得到78个转化子，随机选取12个转化子的种子，将转基因植株种子在1/2MS培养基上培养12d，之后向培养基中添加工作浓度为10μM的雌激素(β-雌二醇1，用DMSO溶解配成50mM的储液)，再继续培养7天，移到营养土中拍照。

结果表明，依据诱导型RNAi植株出现斑叶强弱程度的不同，可以将转基因植物分成typeA(6个)、typeB(4个)两种类型(图3A)，还有2个雌激素诱导后无表型。RT-PCR检测显示，转基因植株经雌激素诱导后RPS1的表达明显下调，并且RPS1的表达量与植株斑叶表型负相关(图3B)。

上述结果表明，RPS1多肽及其编码基因在类囊体膜多肽的合成过程中扮演关键角色，而这些类囊体膜多肽以表达水平依赖的方式维持类囊体膜系统的稳定性和完整性。

实施例4

gRPS1克隆及pRPS1:gRPS1载体构建

在起始密码子ATG上游2139bp和终止密码子下游496bp范围内设计上下游引物，以拟南芥Col-O型14天苗提取的基因组DNA为模板进行PCR。

引物见下：

上游引物(下划线为酶切位点KpnI)

5′AAAGGTACCGTCTCCGACCTATTATGACGAAC-3′(SEQID NO.：12)

下游引物(下划线为酶切位点Xba I)

5′AGGTCTAGATCTGAAGATATCCATACCCAACAC-3′(SEQID NO.：13)

将得到的DNA扩增产物，连接到市售的pMD19-T载体上，经测序，测序结果与GenBanK序列完全符合。

测序正确后，用Kpn I/Xba I I切下gRPS1，连入经Kpn I/Xba I双酶切的市售的双元表达载体pCAMBIA1300中，转入大肠杆菌DH5α。提取质粒，酶切鉴定正确的质粒转入市售的农杆菌GV3101。从农杆菌中提取质粒再转入DH5α中，提取质粒并且酶切验证，确定正确的质粒已经转入农杆菌中。

将构建好的载体转化至农杆菌GV3101菌株，然后通过花浸法对野生型拟南芥进行转化。种子收获后，在含25μg/ml潮霉素的PNS培养基上筛选转基因植株。选取以下三个株系：Comp rps1-2，Comp rps1-3，Comp rps1-4用于后续分析实验。

qRT-PCR分析(图4)表明，Comp rps1-2，Comp rps1-3，Comp rps1-4转基因之中的RPS1表达量明显上升，这些植株可以作为RPS1过表达转基因植株用于后续分析。

实施例5

RPS1定位于叶绿体

用PCR扩增RPS1基因的全长编码区，将之克隆到带有35S启动子和GFP基因的载体中，形成RPS1-GFP型的融合多肽。将得到的融合表达载体转化野生型拟南芥植株，获得组成型表达RPS1-GFP融合多肽的转基因植株。

在激光共聚焦显微镜下观察转基因植株。

结果(图5)表明，RPS1在叶肉细胞原生质体中，绿色荧光信号集中在叶绿体内，并能够与叶绿体自发荧光很好的重叠，说明RPS1定位于叶绿体。

实施例6

RPS1参与蛋白质翻译

叶绿体翻译效率的分析方法参照(Schwanhaeusser et al.，2009)，用200mg/L¹³C₆ ¹⁵N₄L-arginine(“heavy”，H)和200mg/L¹⁵N₄L-arginine(“medium heavy”，M)分别标记WT和rps1植株长至15天的离体叶片；或者分别标记WT和Comp rps1-3植株长至15天的离体叶片。标记时间为4h。

pSILAC实验结果(图6)，表明，RPS1作为核糖体亚基多肽参与类囊体膜光合多肽(如D1，CP43等)的翻译，rps1植株中D1多肽的合成速率仅为WT的44％，CP43多肽的合成速率仅为WT的55％。

实施例7

RPS1是热诱导多肽

利用RPS1的多克隆抗体通过Western blot分析，观察在热处理的0h、0.5h、1h和2h这四个时间点RPS1的动力学表达变化。

结果表明(图7)，随着热处理时间的增加，RPS1多肽水平逐渐增加，并在2h达到一个峰值，表明RPS1是一个受热胁迫诱导的多肽。

实施例8

RPS1能提高叶绿体蛋白的翻译效率

类囊体膜多肽提取：以实施例4制备的Comp rps1-2，Comp rps1-3，Comprps1-4植株叶片为材料，方法提取类囊体膜多肽，并用LC-MS/MS法进行多肽质翻译效率的定量。类囊体膜多肽提取方法参考文献(Peng et al.，2006)。

1).取1-2株拟南芥叶片加入预冷的isolation buffer中，冰上研磨；

2).四层尼龙布过滤(或2-4层擦镜纸)；

3).4℃，5000g，10min离心两次；

4).500μl isolation buffer悬浮；

5).测定叶绿素含量；

6).取适量(50μg叶绿素)用2×loading buffer，50℃水浴30min变性(也可采用沸水浴)，取上清，放置于-20℃保存；或者测定叶绿素含量后，直接置于-80℃保存；

7).查看多肽loading用SDS-PAGE凝胶电泳，考染；进行WB，用SDS-PAGEUrea Gel电泳，充分变性。

pSILAC实验分析表明，组成型表达RPS1能显著提高叶绿体类囊体膜多肽的翻译效率，并且组成型表达RPS1的转基因植株在热胁迫条件下翻译效率得到很好的维持。用200mg/L¹³C₆ ¹⁵N₄L-arginine(“heavy”，H)和200mg/L¹⁵N₄L-arginine(“medium heavy”，M)分别标记WT和Comp rps1-3植株长至15天的离体叶片。标记时间为4h。结果显示在Comp rps1-3植株中D1，D2，CP43，CP47，PsaA，PsaB以及ATPase的β-subunit多肽的合成速率与WT相比都不同程度的提高了(见表2)。

表2

实施例9

RPS1基因过表达提高植株的耐热性

拟南芥幼苗获得性耐热分析：1/2MS培养基培养至2.5d的幼苗，经38℃热驯化1h，22℃光下恢复2h，45℃热处理4.5h，之后转到正常生长条件下恢复7d，拍照并统计存活率。

图8为植株的耐热性实验结果，表明，在热处理的条件下，RPS1过表达的植株比野生型植株的存活率高40-50％。

参考文献：

1.Clough，S.J.，and Bent，A.F.(1998).Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16，735-743.

2.Khatoon，M.，Inagawa，K.，Pospisil，P.，Yamashita，A.，Yoshioka，M.，Lundin，B.，Horie，J.，Morita，N.，Jajoo，A.，Yamamoto，Y.，and Yamamoto，Y.(2009).Qualitycontrol of photosystem II：Thylakoid unstacking is necessary to avoid furtherdamage to the D1 protein and to facilitate D1 degradation under light stress inspinach thylakoids.J Biol Chem 284，25343-25352.

3.Clough，S.J.，and Bent，A.F.(1998).Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16，735-743.

4.Peng，L.，Ma，J.，Chi，W.，Guo，J.，Zhu，S.，Lu，Q.，Lu，C.，and Zhang，L.(2006).LOW PSII ACCUMULATION1 is involved in efficient assembly of photosystem IIin Arabidopsis thaliana.Plant Cell 18，955-969.

5.Cavina，G.，Gallinella，B.，La Torre，F.，and Porra，R.(1989).Analytical andregulatory considerations for ferritin-containing pharmaceutical products.Ann IstSuper Sanita 25，471-479.

6.Schwanhaeusser B，Gossen M，Dittmar G，Selbach M(2009).Global analysis ofcellular protein translation by pulsed SILAC.Proteomics 9：205-209.

Larkindale J，Hall JD，Knight MR，Vierling E(2005).Heat stress phenotypes ofarabidopsis mutants implicate multiple signaling pathways in the acquisition ofthermotolerance.Plant Physiology 138：882-897.

7.Hong SW，Vierling E(2000).Mutants of Arabidopsis thaliana defective in theacquisition of tolerance to high temperature stress.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 97：4392-4397.

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种分离的RPS1多肽或其编码基因的用途，其特征在于，所述用途是选自下组的一种或多种用途：

(1)所述多肽或其编码基因用于提高植物类囊体膜的热稳定性；

(2)所述多肽或其编码基因用于提高植物抵抗高温胁迫的能力；

(3)所述多肽或其编码基因用于提高植物叶绿体蛋白的翻译效率。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的RPS1多肽任选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.：3所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有调节叶绿体蛋白翻译效率及改善植物耐热性功能的由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.：3所示氨基酸序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，具有调节叶绿体蛋白翻译效率及改善植物耐热性功能的多肽。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的RPS1多肽的编码基因任选自下组：

(A)编码如SEQ ID NO.：3所示多肽的多核苷酸；

(B)序列如SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：2所示的多核苷酸；

(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：2所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(D)如SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的RPS1多肽或其编码基因来源于十字花科植物。

5.一种提高植物抵抗高温胁迫能力的方法，其特征在于，包括步骤：提高所述植物中RPS1多肽的表达或活性。

6.一种提高植物类囊体膜热稳定性的方法，其特征在于，包括步骤：提高所述植物中RPS1多肽的表达或活性。

7.一种提高植物高温下的光合效率的方法，其特征在于，包括步骤：提高所述植物中RPS1多肽的表达或活性。

8.一种提高植物高温下叶绿体蛋白翻译效率的方法，其特征在于，包括步骤：提高所述植物中RPS1多肽的表达或活性。

9.如权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体含有RPS1多肽的编码序列；

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使RPS1多肽的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c)选择已转入RPS1多肽编码序列的植物细胞、或组织、或器官；

(d)将步骤(c)中的植物细胞、或组织、或器官再生为植株。

10.一种改造植物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a1)提高所述植物中RPS1多肽的表达水平或活性；或

(a2)降低所述植物中RPS1多肽的表达水平或活性。

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