CN114525230A - 发酵培养物及嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及嗜热栖热菌发酵领域，公开了发酵培养物及嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法。发酵培养物用于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的发酵培养，发酵培养物包括基底液、耐热组合物；基底液由胰蛋白胨和牛肉浸取物的混合物、酵母粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化盐、硫酸盐、纯净水、pH调节剂组成；基底液的pH值为7.5‑8.0；耐热组合物由多胺复配物、核糖体小亚基蛋白、海藻糖、山梨醇、谷氨酰胺、脯氨酸、胰蛋白胨组成；多胺复配物由腐胺、精胺、亚精胺组成。发酵方法中采用定时定量添加耐热组合物，与基底液形成相互配合，使嗜热栖热菌达到较好的耐热性且提高发酵能力，从而提高发酵产物中的微量元素、还原型谷胱甘肽、氨基酸、多肽等成分的含量并且提升护肤效果。
Description
技术领域
本申请涉及嗜热栖热菌发酵技术领域，尤其是涉及一种发酵培养物及嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法。
背景技术
生物发酵产物中含有一定的氨基酸、多肽等成分，作为护肤品原料使用时，可达到一定的润滑、渗透效果，使用之后不黏腻。因此，生物发酵产物，如嗜热栖热菌发酵产物，受到较多护肤人群的喜爱。
嗜热栖热菌发酵产物中含有微量元素、还原型谷胱甘肽、氨基酸、多肽等成分，可使皮肤达到保湿和修复的效果。
然而，传统的嗜热栖热菌的发酵通常在50-60℃的环境温度下进行，发明人发现通过该方式发酵获得的发酵产物中的微量元素、还原型谷胱甘肽、氨基酸、多肽等成分的含量较少，达到的护肤效果较为有限。
申请内容
为了解决相关技术中嗜热栖热菌发酵产物中的微量元素、还原型谷胱甘肽、氨基酸、多肽等成分的含量较少而达到的护肤效果较为有限的问题，本申请提供了一种发酵培养物及嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法。
第一方面，本申请提供的一种发酵培养物，采用如下的技术方案：
一种发酵培养物，用于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的发酵培养，所述发酵培养物包括基底液、耐热组合物；所述基底液由胰蛋白胨和牛肉浸取物的混合物、酵母粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化盐、硫酸盐、纯净水、pH调节剂组成；所述基底液的pH值为7.5-8.0；
所述耐热组合物由多胺复配物、核糖体小亚基蛋白、海藻糖、山梨醇、谷氨酰胺、脯氨酸、胰蛋白胨组成；所述多胺复配物由腐胺、精胺、亚精胺组成。
本申请中采用的基底液中，富含了嗜热栖热菌Thermus thermophilus发酵过程所需的营养物质，促使发酵过程的顺利进行。
与此同时，通过采用由多胺复配物、核糖体小亚基蛋白、海藻糖、山梨醇、谷氨酰胺、脯氨酸、胰蛋白胨组成的耐热组合物，一同与基底液形成配合，有利于促进嗜热栖热菌Thermus thermophilus在发酵过程中提高抗热能力，不影响在较高温度条件下发酵的进行，且通过该种发酵方式得到的发酵液的浓度更高，且最终获得的发酵产物具有较好的耐热性。
本申请中，基底液和耐热组合物的配合方式有多种，可以先采用基底液进行发酵，再配合耐热组合物一同进行发酵培养，即将基底液和耐热组合物分开添加；也可以同时采用基底液和耐热组合物一同进行发酵培养，即将基底液和耐热组合物一同添加。
进一步地，所述耐热组合物由如下组分及其用量组成：
多胺复配物0.1-0.5％；
核糖体小亚基蛋白0.1-0.3％；
海藻糖0.5-1％；
山梨醇1-2％；
谷氨酰胺0.3-1％；
脯氨酸0.5-1％；
胰蛋白胨1-1.5％；
余量为纯净水；
所述多胺复配物中，腐胺、精胺、亚精胺的用量比例为1:1:2。
按照上述添加量比例获得的耐热组合具有更好的促进嗜热栖热菌Thermusthermophilus在较高温度下发酵的效果，并且能使得到的发酵液的浓度也更高。从侧面也表明了通过耐热组合物与基底液配合形成的发酵培养物能减缓嗜热栖热菌能在较高温度下发酵并且产生更耐热的营养成分。
进一步地，所述基底液中的组分及其对应的用量如下：
胰蛋白胨和牛肉浸取物的混合物0.1-3％；
酵母粉0.1-3％；
硫酸铵0.1-1％；
磷酸二氢钾0.1-0.25％；
氯化盐0.081-0.805％；
硫酸盐0.06225-0.5255％；
余量为纯净水和pH调节剂。
进一步地，所述氯化盐由以下用量的组分组成：
氯化镁0.05-0.5％
氯化铁0.03-0.3％；
CoCl2·6H2O为0.001-0.005％。
进一步地，所述硫酸盐由以下用量的组分组成：
CaSO4·2H2O为0.012-0.3％；
MnSO4·2H2O为0.05-0.22％；
Na2MoO4·2H2O为0.00025-0.0025％。
进一步地，嗜热栖热菌Thermus thermophilus的菌种编号为CICC10347。
本申请中的基底液中的组分及其对应的用量相互配合，有利于为嗜热栖热菌Thermus thermophilus发酵提供充足的养分，从而有利于产生充足的微量元素、还原型谷胱甘肽、氨基酸、多肽等成分，从而对皮肤起到更好的保湿、修复、防护等效果。其中，胰蛋白胨和牛肉浸取物的混合物由质量比为2:1的胰蛋白胨和牛肉浸取物组成。
第二方面，本申请还提供了一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，采用如下的技术方案：
一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，包括如下步骤：
准备操作：
配制基底液：将基底液中的组分进行充分混合，再进行高温高压灭菌处理；
配制耐热组合物：将耐热组合物中的组分进行充分混合，再进行高温高压灭菌处理；
复苏嗜热栖热菌；
步骤一，嗜热栖热菌Thermus thermophilus增菌：将含有嗜热栖热菌Thermusthermophilus的含菌液体接种于第一培养容器内，含菌液体与基底液的添加量比例为1:3-5，在55-60℃的恒温条件下静止增菌培养24h，获得第一增菌液；将第一增菌液接种于第二培养容器中，第一增菌液与基底液的添加量比例为1：100-150，在55-60℃恒温、180-200rpm的条件下，增菌培养24-40h，获得最终增菌液；
步骤二，发酵培养：将最终增菌液接种到第一发酵容器内，最终增菌液与基底液的添加量比例为1:12-15，形成发酵培养体系A，在100-200rpm、75-85℃的条件下，每小时向每50L发酵培养体系A加入50ml耐热组合物，发酵培养过程中的溶解氧含量＞50mg/L，发酵培养14-20h，获得发酵液A；
步骤三，菌液分离、脱色除味、粗滤、精滤：将步骤二中获得的发酵液进行离心分离，获得发酵上清液，采用活性炭进行脱色、除味，再进行粗滤、精滤，获得嗜热栖热菌发酵产物；所述第一、第二培养容器为培养试管、锥形瓶、烧杯中的任意一种或多种。
在准备阶段，分别将基底液、耐热组合物配制好，且对嗜热栖热菌进行复苏操作，利于后续操作顺利进行。
步骤一中，本申请中所采用的第一培养容器、第二培养容器为培养试管、锥形瓶、烧杯中的任意一种，包括但不限于上述几种容器，主要目的是有足够的空间让嗜热栖热菌实现增菌。
步骤一中的含菌液体为嗜热栖热菌和无菌水形成的混合物，之所以与无菌水进行配合，是为了增大接种过程中的便利性。
在第一培养容器内，含菌液体与基底液具有一定添加量比例范围，目的是为了能为嗜热栖热菌的增菌提供足够的营养物质。此处的基底液采用上述配方进行配制获得，本申请中多处采用了基底液进行培养嗜热栖热菌，每次基底液的添加跟添加的含有嗜热栖热菌的液态体系有关联。
步骤二的发酵过程中，基底液与最终增菌液按照一定比例配合，提供充足的养分，利于发酵的进行。且每小时向每50L发酵培养体系A加入50ml耐热组合物，通过加入的耐热组合物，促使嗜热栖热菌在发酵过程中能形成更耐热的成分，并且在较高的温度下依旧能使发酵产物中的成分保持较高的活性，在应用过程中可达到良好的保湿、修复的效果。
且向第一发酵容器内加入耐热组合物的时间是从开始升温时开始计算，可以在开始升温时按照相同的添加量添加一次，即当达到75-85℃时，已经加入了耐热组合物并且参与了发酵培养的过程。
进一步地，在所述步骤二之后，将发酵液A接种到第二发酵容器中，发酵液A与基底液的添加量比例为1:5.8-6.7，形成发酵培养体系B，在100-200rpm、75-85℃的条件下，每小时向每50L发酵培养体系B加入50ml耐热组合物，发酵培养过程中的溶解氧含量＞50mg/L，发酵培养14h，获得发酵液B；
所述步骤二中，在阶段1发酵第0-4h时，通气量维持在2-6m3/h，溶解氧含量值为＞100；在阶段2发酵第4-12h时，通气量维持在6-10m3/h，保证溶解氧含量为＞50；在阶段3发酵第12-14h时，通气量维持在3-8m3/h，溶氧量控制在＞100。
本申请中，在每个阶段都按照时间、发酵培养体系B的总量，向发酵培养体系B中加入一定量的耐热组合物，从而使嗜热栖热菌在耐热组合物的帮助下，逐步适应较高的发酵温度。在较高的发酵温度下，并且在不同阶段保持一定的通气量，使溶解氧含量保持在较为合理的范围内，从而促使嗜热栖热菌发酵产生更多微量元素、还原型谷胱甘肽、氨基酸、多肽等成分。
进一步地，在所述步骤二之后，将发酵液B接种到第三发酵容器中，发酵液B与基底液的添加量比例为1:10-11，形成发酵培养体系C，在100-200rpm、75-85℃的条件下，每小时向每50L发酵培养体系C加入50ml耐热组合物，发酵培养过程中的溶解氧含量＞50mg/L，发酵培养20h，获得发酵液C；
在阶段1'发酵第0-6h时，通气量维持在20m3/h，溶解氧含量值为＞100；在阶段2'发酵第6-14h时，通气量维持在60m3/h，溶解氧含量为＞50；在阶段3'发酵第14-20h时，通气量维持在40m3/h，溶氧量控制在＞100。
上述操作是将发酵液B进行进一步接种发酵，此次接种的发酵液的总量比发酵液A的接种量更大，因此，与发酵液配合的基底液的添加量也对应调整，但发酵的温度依旧保持在75-85℃的较高条件下，配合一定的通气量，使发酵培养体系中的溶解氧含量维持在较为合理的水平，使发酵继续保持良好的状态。
进一步地，所述步骤一中，在获得第一增菌液后，先将第一增菌液接种到第三培养容器内，第一增菌液与发酵培养物的添加量为1：25-49，在55-60℃、180-200rpm的条件下，增菌培养20h，获得第二增菌液；将第二增菌液接种到第四培养容器内，第二增菌液与发酵培养物的添加量为1：1-1.5，在55-60℃、180-200rpm的条件下培养20h，获得最终增菌液；所述第三、第四培养容器为培养试管、锥形瓶、烧杯中的任意一种或多种。
上述操作采用两步发酵的方式，接种时，第一增菌液与发酵培养物的添加量、第二增菌液与发酵培养物的添加量有不同的要求，且第一增菌液的添加量大于含菌液体的添加量但少于第二增菌液的添加量，即在逐步的增菌过程中，将接种的增菌液的体积进行不断扩大，并且配合添加一定量的基底液，为嗜热栖热菌提供充足的营养成分，并且配合较为合适的温度、振荡速度，以综合提高增菌的效果。
综上所述，本申请具有一下有益效果：
1、本申请中采用多胺复配物、核糖体小亚基蛋白、海藻糖、山梨醇、谷氨酰胺、脯氨酸、胰蛋白胨组成耐热组合物，与基底液进行相互配合，进而使形成的发酵培养物能用于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的发酵培养，并且有利于提升嗜热栖热菌Thermusthermophilus的耐高温性，即在较高温度下依旧能进行发酵并且发酵产物中依旧包含多微量元素、还原型谷胱甘肽、氨基酸、多肽等成分，且含量比在50-60℃发酵温度下获得的发酵产物中对应含量要更高。
2、本申请中，先对嗜热栖热菌Thermus thermophilus进行增菌处理，再进行接种发酵，并且在发酵过程中，加入耐热组合物，逐步使嗜热栖热菌Thermus thermophilus适应75-85℃的发酵温度，达到较好的耐热性能，最终获得的发酵产物浓度较高，且其中细胞成活率较高，减缓了嗜热栖热菌Thermus thermophilus的衰亡速度；
且发酵产物中最终的微量元素、还原型谷胱甘肽、氨基酸、多肽等成分的含量相比较在50-60℃环境下获得的发酵产物中对应成分含量更高，表明发酵产物中的有效成分也具有一定的耐热性，最高能承受85℃的高温，利于后续对皮肤的保湿、修复作用。
具体实施方式
基底液制备例
制备例1：一种基底液，其中所含有的组分及其对应的用量如表1所示，将除纯净水以外的其他所有组分加入到纯净水中，并在200rpm的转速下混合20min，再在121℃、0.1MPa的条件下灭菌30min，降温至70℃，添加10％的氢氧化钠水溶液(pH调节剂)调节pH值至7.6±0.1，获得基底液。
该操作可以直接在发酵罐或者种子发酵罐中进行。
制备例2-3：一种基底液，与制备例1的区别在于，其中所含有的组分及其对应的用量不同，详见表1。
表1制备例1-3中含有的组分及其对应的用量(％)
耐热组合物制备例
制备例4：一种耐热组合物，其中所含有的组分及其对应的用量如表2所示，其中，多胺复配物由质量比为1:1:2的腐胺：精胺：亚精胺组成；核糖体小亚基蛋白为线粒体核糖体小亚基蛋白S10，购自艾美捷科技有限公司。
制备方法：将除纯净水以外的其他所有组分加入到纯净水中，并在200rpm的转速下混合20min，再在90℃、0.1MPa的条件下灭菌30min，获得耐热组合物，降温至70℃备用。
制备例5-6：一种耐热组合物，与制备例3的区别在于，其中所含有的组分及其对应的用量不同，详见表2。
表2制备例1-3中含有的组分及其对应的用量(％)
实施例
实施例1：一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，具体步骤如下：
准备操作：
配制基底液：采用制备例1中的方式获得的制备例1作为基底液；
配制耐热组合物：采用制备例4中的方式获得的制备例4作为耐热组合物；
复苏嗜热栖热菌Thermus thermophilus：从液氮菌种保存罐中取出嗜热栖热菌Thermus thermophilus(菌种编号为CICC10347)冻存管，在37℃温水浴中解冻回温1h，使嗜热栖热菌Thermus thermophilus复苏；
步骤一，嗜热栖热菌Thermus thermophilus增菌：在生物安全柜中，将含有嗜热栖热菌Thermus thermophilus的含菌液体(指将2mL无菌水加入到冻存管中与其中的嗜热栖热菌Thermus thermophilus形成的混合物)一同接种于含有10mL基底液的培养试管中，在65℃的恒温条件下静止增菌培养24h，获得第一增菌液；
将第一增菌液接种于含有基底液的锥形瓶中，且第一增菌液与基底液的添加量比例为1:100，在60℃、200rpm的条件下，增菌培养24h，获得最终增菌液；
步骤二，发酵培养：将5L最终增菌液接种到含有60L基底液的发酵罐内，形成发酵培养体系A，在100rpm、75℃的条件下，每小时按照每50L发酵培养体系A加入50ml耐热组合物，发酵培养过程中的溶解氧含量＞50mg/L，发酵培养14h，获得发酵液A；
步骤三，菌液分离：采用管式连续流离心机，在进料速度4-6L/min、离心15000rpm的条件下，经过滤膜过滤，获得发酵上清液；
脱色除味：对发酵上清液采用活性炭进行吸附，脱色除味处理，脱色温度为55℃，脱色时间1h；其中，活性炭粒径为1-3mm，活性炭添加比例占发酵上清液的4％；
粗滤、精滤：采用160目的脱脂纱布粗滤掉活性炭颗粒，再用0.45微米的活性炭柱膜过滤较大颗粒，再用管式离心机，在进料速度3L/min，离心15000rpm的条件下进行离心处理，获得澄清上清液，再采用0.45μm的精聚醚砜除菌膜进行粗滤，再通过0.22μm精聚醚砜除菌膜过滤，最终得到嗜热栖热菌发酵产物。
实施例2-3：一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，与实施例1的区别在于，准备操作中，依次分别采用制备例2-3中的方式获得的制备例2-3作为基底液。
实施例4：一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，与实施例1的区别在于，准备操作中，采用制备例5中的方式获得的制备例5作为耐热组合物。
实施例5：一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，与实施例1的区别在于，准备操作中，采用制备例6中的方式获得的制备例6作为耐热组合物，且其中的多胺复配物由1:1:1的腐胺、精胺、亚精胺组成。
实施例6：一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，与实施例1的区别在于，步骤一中，培养的温度为55℃。
实施例7：一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，与实施例1的区别在于，步骤一中，取10mL第一增菌液接种于含有250mL基底液的锥形瓶中，在恒温摇床里，在60℃、200rpm的条件下，培养20h，获得第二增菌液；再取500mL第二增菌液接种于含有500mL基底液的锥形瓶中，在恒温摇床里，在60℃、200rpm的条件下，培养20h，获得最终增菌液。
实施例8：一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，与实施例1的区别在于，步骤一中，取10mL第一增菌液接种于含有490mL基底液的锥形瓶中，在恒温摇床里，在55℃、180rpm的条件下，培养20h，获得第二增菌液；再取500mL第二增菌液接种于含有750mL基底液的锥形瓶中，在恒温摇床里，在55℃、180rpm的条件下，培养20h，获得最终增菌液。
实施例9：一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，与实施例7的区别在于，步骤二中的发酵培养中，将5L最终增菌液接种到含有60L基底液的100L种子发酵罐内，形成发酵培养体系A，在200rpm、85℃的恒温条件下进行发酵培养14h，获得发酵液B。
其中，在阶段1发酵第0-4h时，通气量维持在2m3/h，维持溶解氧含量值为＞100；在阶段2发酵第4-12h时，通气量维持在6m3/h，维持溶解氧含量为＞50；在阶段3第12-14h时，通气量维持在3m3/h，维持溶氧含量为＞100。
实施例10：一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，与实施例9的区别在于，步骤二的发酵培养中，将60L发酵液A接种到含有350L基底液的500L种子发酵罐内，形成发酵培养体系B，在200rpm、85℃的恒温条件下进行发酵培养14h，获得发酵液B。
其中，在阶段1发酵第0-4h时，通气量维持在6m3/h，维持溶解氧含量值为＞100；在阶段2发酵第4-12h时，通气量维持在10m3/h，维持溶解氧含量为＞50；在阶段3第12-14h时，通气量维持在8m3/h，维持溶氧含量为＞100。
实施例11：一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，与实施例10的区别在于，步骤二的发酵培养中，将350L发酵液A接种到含有3500L基底液的5000L种子发酵罐内，形成发酵培养体系C，在200rpm、85℃的恒温条件下进行发酵培养20h，获得发酵液C。
其中，在阶段1'发酵第0-6h时，通气量维持在20m3/h，维持溶解氧含量值为＞100；在阶段2'发酵第6-14h时，通气量维持在60m3/h，维持溶解氧含量为＞50；在阶段3'第14-20h时，通气量维持在40m3/h，维持溶氧含量为＞100。
对比例
对比例1：一种嗜热栖热菌的发酵方法，与实施例1的区别在于，不添加耐热组合物。——发酵在75-85℃时，活性成分失活了。
对比例2：一种嗜热栖热菌的发酵方法，与实施例1的区别在于，不添加耐热组合物，且发酵的温度为50℃。
对比例3：一种嗜热栖热菌的发酵方法，与实施例1的区别在于，不添加耐热组合物，且发酵的温度为60℃。
表征实验试验一：嗜热栖热菌发酵产物中细胞成活率试验、嗜热栖热菌发酵产物HACAT细胞划痕试验试验样品：实施例1-11获得的嗜热栖热菌发酵产物作为试验样1-11，对比例1-3获得的发酵产物作为对照样1-3。
试验方法：
1、嗜热栖热菌发酵产物中细胞成活率试验：采用MTT比色法分别对试验样1-11和对照样1-3进行检测。
2、嗜热栖热菌发酵产物HACAT细胞划痕试验：
仪器：仪器：超净工作台、离心机、恒温水浴锅、冰箱(-80℃)、倒置显微镜、培养箱；试剂耗材：PBS(PH＝7.4)溶液(无水NaCL 8g，KCL 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g(Na2HPO4·12H2O 3.5g)，KH2PO4 0.2g用超纯水配制成1000ml，121℃灭菌15分钟)、1640培养液及其它相应培养液、0.25％胰酶化液、DMSO、96孔板、8通道移液器、1000ul移液器、200ul枪头、1000ul枪头、电动吸液器。
将试验样1溶于无菌蒸馏水中，开始如下操作：
(1)成纤维细胞培养：用含10％胎牛血清的1640(含双抗)培养液与37℃，5％CO2的饱和湿度培养至对数生长期；
(2)6孔板标记：6孔细胞培养板板底中央用MARK笔做标记；
(3)接种：以每孔2×105个细胞接种于6孔板中；
(4)1640全培养液常规培养，细胞单层融合时，弃去培养液，用无菌200μL移液器枪头在细胞层按照标记垂直划痕，建立体外细胞创伤模型，PBS反复冲洗，至划痕区域干净；
(5)6孔板加入含药的无胎牛血清的培养基及对照加入无胎牛血清的培养基2.0mL；
(6)常规培养，于0，6，12，24小时取样；
(7)观察愈合时间，计算愈合面积的大小，判断药物的愈合能力，平均处理数据后进行记录分析。
采用同样的操作方法分别对试验样2-11和对照样1-3进行测定，平均处理数据后进行记录分析。
试验结果：试验样1-11和对照样1-3中细胞成活率、HACAT细胞划痕的检测结果如表3所示。
表3试验样1-11和对照样1-4中细胞成活率、HACAT细胞划痕的检测结果
| 试验样品 | 细胞成活率/％ | 修复平均值/％ |
| 试验样1 | 142.547 | 31.3 |
| 试验样2 | 142.326 | 31.2 |
| 试验样3 | 135.358 | 25.3 |
| 试验样4 | 142.431 | 31.1 |
| 试验样5 | 142.55 | 30.8 |
| 试验样6 | 142.545 | 31.2 |
| 试验样7 | 142.521 | 31.3 |
| 试验样8 | 142.532 | 31.3 |
| 试验样9 | 142.551 | 31.7 |
| 试验样10 | 142.553 | 31.8 |
| 试验样11 | 142.551 | 31.9 |
| 对照样1 | 100 | 1.3 |
| 对照样2 | 100 | 3.8 |
| 对照样3 | 100 | 4.1 |
由表3可知，试验样1-11中细胞成活率要高于对照样1-3中的细胞成活率，在此基础上，试验样1-11的修复平均值也均高于对照样1-3的修复平均值，表明试验样1-11中的活性成分较多，且具有较好的修复作用；也表明了添加耐热组合物进行发酵后，嗜热栖热菌在发酵过程中最大耐受85℃的高温，不易发生衰亡的现象，且发酵获得的发酵产物中的活性成分不易变性失活的现象。
试验二：嗜热栖热菌发酵产物浓度测定试验试验样品：实施例1-11中获得的嗜热栖热菌发酵产物作为试验样1-11，对比例1-3中获得的嗜热栖热菌发酵产物作为对照样1-3。
试验方法：采用OD值法分别对试验样1-11和对照样1-3进行测定。
试验结果：试验样1-11和对照样1-3中浓度测定结果如表4所示。
表4试验样1-11和对照样1-3中浓度测定结果
| 试验样品 | 浓度(cfu/mL) | 试验样品 | 浓度(cfu/mL) |
| 试验样1 | 11.5*10^9 | 试验样8 | 11.6*10^9 |
| 试验样2 | 11.5*10^9 | 试验样9 | 11.7*10^9 |
| 试验样3 | 10.4*10^9 | 试验样10 | 11.8*10^9 |
| 试验样4 | 11.0*10^9 | 试验样11 | 12*10^9 |
| 试验样5 | 10.9*10^9 | 对照样1 | 6*10^7 |
| 试验样6 | 11.5*10^9 | 对照样2 | 9.1*10^9 |
| 试验样7 | 11.6*10^9 | 对照样3 | 9.1*10^9 |
由表4可知，试验样1-11中的浓度要远高于对照样1-3中的浓度，这表明，在嗜热栖热菌发酵过程中加入耐热组合物，有利于提高最终的获得的嗜热栖热菌发酵产物的浓度。
试验三：嗜热栖热菌发酵产物中成分含量检测试验样品：实施例1-11中获得的嗜热栖热菌发酵产物作为试验样1-11，对比例1-3中获得的嗜热栖热菌发酵产物作为对照样1-3。
试验方法：
1、还原型谷胱甘肽测定：采用微量酶标法测试试验样1-11、对照样1-3中的还原型谷胱甘肽的含量，同时，将未采用耐热组合物进行发酵获得的对照样1的检测结果进行比对，记录并分析，详见表5。
2、总氨基酸含量值测定：
2.1仪器和试剂耗材
分光光度计(570nm)、水浴锅、移液器(1mL、5mL、10mL)、容量瓶(25mL)；
无水乙醇、茚三酮粉末、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、L-精氨酸。
2.2试剂配制
2.2.1 100mg/L L-精氨酸标准溶液：
精确称取L-精氨酸对照品0.06g，溶于水中并定容至100mL，摇匀。
2.2.2 2％茚三酮溶液：
称取茚三酮1.0g用乙醇溶解并定容至50mL，冷藏备用。
2.2.3 pH＝8.04磷酸缓冲液
准确称取磷酸二氢钾(KH2PO4)4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。
准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。
取上述配好的KH2PO4溶液10.0mL与190mLNa2HPO4溶液混合均匀，即为pH为8.04的磷酸缓冲溶液。
2.3实验步骤
2.3.1标准曲线的制作。
分别取L-精氨酸标准溶液(600mg/L)0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，置25mL容量瓶中，分别加入水6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0mL，得到标准溶液的浓度为：0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L。再分别加入0.5ml磷酸盐缓冲液(pH＝8.04)，再分别加入0.5mL 2％茚三酮溶液，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，放冷，分别加入蒸馏水定容至25mL，摇匀，以第1份(不含L-精氨酸标准溶液)为空白，在分光光度计570nm波长处测定吸光度。以L-精氨酸加入量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2.3.2样品含量的测定
吸取试验样1.0mL于25mL容量瓶中，加水5.0mL，0.5mL磷酸盐缓冲液(pH＝8.04)，再加0.5mL 2％茚三酮乙醇溶液，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，放冷，加蒸馏水定容至25mL，摇匀，以第1份(不含L-精氨酸标准溶液)为空白，在570nnm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算氨基酸浓度。
这个操作，当试验样品的吸光度值超出标准曲线的范围，需将试验样品稀释后再进行测试。
2.3.3结果计算：
X＝C*N；
X—样品中总氨基酸含量(mg/L)；
C—根据标准曲线计算的氨基酸浓度(mg/L)；
N—样品稀释倍数。
采用上述相同的方法，对试验样2-11、对照样1-3中的总氨基酸含量进行测定。同时，将未采用耐热组合物进行发酵获得的对照样1的检测结果进行比对，记录并分析，详见表5。
3、采用双缩脲法测定多肽含量：采用微量酶标法测试试验样1-11、对照样1-3中的还原型谷胱甘肽的含量，同时，将未采用耐热组合物进行发酵获得的对照样1的检测结果进行比对，记录并分析，详见表5。
表5相对于对照样1的检测结果，试验样1-11、对照样2-3中还原型谷胱甘肽含量、总氨基酸含量、多肽含量增减情况
由表5可知，相比较不添加耐热组合物发酵获得的对照样1而言，试验样1-11中还原型谷胱甘肽含量、总氨基酸含量、多肽含量都有较为明显的增长，但对照样2-3跟对照样1类似，并未添加耐热组合物，其中所含有的还原型谷胱甘肽含量、总氨基酸含量、多肽含量跟对照样1中的差别不大。这表明采用耐热组合物可有利于提高嗜热栖热菌发酵产生的还原型谷胱甘肽含量、总氨基酸含量、多肽含量。
试验样四：嗜热栖热菌发酵产物中微量元素、维生素含量测定试验样品：实施例1-11获得的嗜热栖热菌发酵产物作为试验样1-11，对比例1-3获得的发酵产物作为对照样1-3。
试验方法：
根据GB5009.241-2017进行镁元素含量的测定；
根据GB5009.14-2017进行锌元素含量的测定；
根据GB5009.13-2017进行铜元素含量的测定；
根据GB5009.93-2017进行硒元素含量的测定；
根据GB14754-2010进行维生素C含量的测定；
根据GB5009.85-2016进行维生素B2含量的测定；
根据GB5009.154-2016进行维生素B6含量的测定；
根据GB1886.233-2016进行维生素E含量的测定；
根据GB5009.82-2016进行维生素A、D含量的测定。
试验结果：试验样1-11、对照样1-3中微量元素、维生素含量检测结果如表6所示。
表6试验样1-11、对照样1-3中微量元素、维生素含量(mg/L)检测结果
由表6中可知，通过本申请中的制备后的发酵产物中，所具有的微量元素、维生素含量要多于采用对比例中制备获得的发酵产物中对应成分的含量。这表明，采用本申请中的耐热组合物进行配合发酵，有利于促进嗜热栖热菌发酵并产生更多有利的微量元素、维生素。
试验五：嗜热栖热菌发酵产物对皮肤角质层水分含量和经表皮水分流失率的影响试验试验样品：实施例1-11获得的嗜热栖热菌发酵产物作为试验样1-11，对比例1-3获得的发酵产物作为对照样1-3。
试验方法：选择皮肤类型为皮肤屏障相对较差、偏干性肌肤、年龄范围在28-50周岁的中国健康女性受试者42名，平均分成14组，每组3名受试者，第1-11组依次采用试验样1-11，第12-14组依次采用对照样1-3。
第一步，受试者先采用同一款丝塔芙洁面乳进行面部清洁，在温度为22℃、相对湿度为55％的恒温恒湿环境下静候30min，并且采用经表皮水分流失测量仪Tewameter(Courage&Khazaka,德国)对脸颊上的经表皮水分流失率进行测试，以及采用皮肤角质层水分含量测量仪Corneometer(Courage&Khazaka,德国)对脸颊上的角质层水分含量进行测试，分别进行记录。
第二步，每组受试者对应涂抹1mL对应的试验样品。使用试验样品的频率为早晚洁面后各涂抹一次，每次涂抹1mL。
试验周期持续四周，即28天。在试验第14天和第28天时，分别对每位受试者进行经表皮水分流失率、角质层水分含量的检测，记录并进行平均处理，获得每组受试者经表皮水分流失率和角质层水分含量，进行分析。
试验结果：第1-14组的受试者经过28天试验所发生的经表皮水分流失率和角质层水分含量详见表7。
表7第1-14组的受试者经过28天试验所发生的经表皮水分流失率和角质层水分含量
由表7可知，第1-11组受试者经过14天和28天分别使用对应的试验样品后，经表皮水分流失率依次得到较大程度的下降，角质层水分含量则依次得到较大程度的上升。而第12-14组受试者第14天和第28天的经表皮水分流失率和角质层水分含量跟未使用对应对照样时的经表皮水分流失率和角质层水分含量接近，表明对照样1-3对降低经表皮水分流失率和提升角质层水分含量的效果较差。
从表7中也可得知，采用本申请中的耐热组合物后，当发酵的温度越高，最高可高达85℃，最终获得的发酵产物对人体面颊上的皮肤具有更好的保湿效果。而当不采用本申请中的耐热组合物时，最终得到的发酵产物所具有的保湿效果较差，表明耐热组合物有利于提高嗜热栖热菌在发酵过程中产生更多具有保湿效果的成分，从而提高发酵产物对皮肤的保湿效果。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种发酵培养物，其特征在于，用于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的发酵培养，所述发酵培养物包括基底液、耐热组合物；所述基底液由胰蛋白胨和牛肉浸取物的混合物、酵母粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化盐、硫酸盐、纯净水、pH调节剂组成；所述基底液的pH值为7.5-8.0；
所述耐热组合物由多胺复配物、核糖体小亚基蛋白、海藻糖、山梨醇、谷氨酰胺、脯氨酸、胰蛋白胨组成；所述多胺复配物由腐胺、精胺、亚精胺组成。
2.根据权利要求1所述的一种发酵培养物，其特征在于，所述耐热组合物由如下组分及其用量组成：
多胺复配物0.1-0.5%；
核糖体小亚基蛋白0.1-0.3%；
海藻糖0.5-1%；
山梨醇1-2%；
谷氨酰胺0.3-1%；
脯氨酸0.5-1%；
胰蛋白胨1-1.5%；
余量为纯净水；
所述多胺复配物中，腐胺、精胺、亚精胺的用量比例为1:1:2。
3.根据权利要求1所述的一种发酵培养物，其特征在于，所述基底液中的组分及其对应的用量如下：
胰蛋白胨和牛肉浸取物的混合物0.1-3%；
酵母粉0.1-3%；
硫酸铵0.1-1%；
磷酸二氢钾0.1-0.25%；
氯化盐0.081-0.805%；
硫酸盐0.06225-0.5255%；
余量为纯净水和pH调节剂。
4.根据权利要求3中所述的一种发酵培养物，其特征在于，所述氯化盐由以下用量的组分组成：
氯化镁0.05-0.5%
氯化铁0.03-0.3%；
CoCl2·6H2O为0.001-0.005%。
5.根据权利要求3中所述的一种发酵培养物，其特征在于，所述硫酸盐由以下用量的组分组成：
CaSO4·2H2O为0.012-0.3%；
MnSO4·2H2O为0.05-0.22%；
Na2MoO4·2H2O为0.00025-0.0025%。
6.根据权利要求1中所述的一种发酵培养物，其特征在于，嗜热栖热菌Thermusthermophilus的菌种编号为CICC10347。
7.根据权利要求1-6中任一所述的一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
准备操作：
配制基底液：将基底液中的组分进行充分混合，再进行高温高压灭菌处理；
配制耐热组合物：将耐热组合物中的组分进行充分混合，再进行高温高压灭菌处理；
复苏嗜热栖热菌；
步骤一，嗜热栖热菌Thermus thermophilus增菌：将含有嗜热栖热菌Thermusthermophilus的含菌液体接种于第一培养容器内，含菌液体与基底液的添加量比例为1:3-5，在55-60℃的恒温条件下静止增菌培养24h，获得第一增菌液；将第一增菌液接种于第二培养容器中，第一增菌液与基底液的添加量比例为1：100-150，在55-60℃恒温、180-200rpm的条件下，增菌培养24-40h，获得最终增菌液；
步骤二，发酵培养：将最终增菌液接种到第一发酵容器内，最终增菌液与基底液的添加量比例为1:12-15，形成发酵培养体系A，在100-200rpm、75-85℃的条件下，每小时向每50L发酵培养体系A加入50ml耐热组合物，发酵培养过程中的溶解氧含量＞50mg/L，发酵培养14-20h，获得发酵液A；
步骤三，菌液分离、脱色除味、粗滤、精滤：将步骤二中获得的发酵液进行离心分离，获得发酵上清液，采用活性炭进行脱色、除味，再进行粗滤、精滤，获得嗜热栖热菌发酵产物；
所述第一、第二培养容器为培养试管、锥形瓶、烧杯中的任意一种或多种。
8.根据权利要求7中所述的一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，其特征在于，在所述步骤二之后，将发酵液A接种到第二发酵容器中，发酵液A与基底液的添加量比例为1:5.8-6.7，形成发酵培养体系B，在100-200rpm、75-85℃的条件下，每小时向每50L发酵培养体系B加入50ml耐热组合物，发酵培养过程中的溶解氧含量＞50mg/L，发酵培养14h，获得发酵液B；
所述步骤二中，在阶段1发酵第0-4h时，通气量维持在2-6m³/h，溶解氧含量值为＞100；在阶段2发酵第4-12h时，通气量维持在6-10m³/h，保证溶解氧含量为＞50；在阶段3发酵第12-14h时，通气量维持在3-8m³/h，溶氧量控制在＞100。
9.根据权利要求8中所述的一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，其特征在于，在所述步骤二之后，将发酵液B接种到第三发酵容器中，发酵液B与基底液的添加量比例为1:10-11，形成发酵培养体系C，在100-200rpm、75-85℃的条件下，每小时向每50L发酵培养体系C加入50ml耐热组合物，发酵培养过程中的溶解氧含量＞50mg/L，发酵培养20h，获得发酵液C；
在阶段1'发酵第0-6h时，通气量维持在20m³/h，溶解氧含量值为＞100；在阶段2'发酵第6-14h时，通气量维持在60m³/h，溶解氧含量为＞50；在阶段3'发酵第14-20h时，通气量维持在40m³/h，溶氧量控制在＞100。
10.根据权利要求7中所述的一种嗜热栖热菌采用发酵培养物的发酵方法，其特征在于，所述步骤一中，在获得第一增菌液后，先将第一增菌液接种到第三培养容器内，第一增菌液与发酵培养物的添加量为1：25-49，在55-60℃、180-200rpm的条件下，增菌培养20h，获得第二增菌液；将第二增菌液接种到第四培养容器内，第二增菌液与发酵培养物的添加量为1：1-1.5，在55-60℃、180-200rpm的条件下培养20h，获得最终增菌液；
所述第三、第四培养容器为培养试管、锥形瓶、烧杯中的任意一种或多种。
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