CN114940948B - 一种松口蘑、松茸菌丝体发酵培养基及发酵液的制备方法 - Google Patents

一种松口蘑、松茸菌丝体发酵培养基及发酵液的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种松口蘑，所述菌株的名称为：SM002，分类命名为：松口蘑（Tricholoma matsutake），保藏编号为：CGMCC No.23289，保藏日期为：2021年10月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明方法采用松茸菌丝体进行液态发酵，可以获得大量富含活性物质的发酵产物、提高目标产物的含量，且具有培养周期短，不受气候、季节和环境影响，可以常年生产等优势。

Description

一种松口蘑、松茸菌丝体发酵培养基及发酵液的制备方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，尤其是一种松口蘑、松茸菌丝体发酵培养基及发酵液的制备方法。
背景技术
松茸，学名松口蘑，别名松蕈、合菌、台菌，隶属担子菌亚门、口蘑科，是松栎等树木外生的菌根真菌，具有独特的浓郁香味，是世界上珍稀名贵的天然药用菌，我国二级濒危保护物种。松茸的营养价值和药用价值极高。现代医学表明，松茸具有提高免疫力、抗癌抗肿瘤、治疗糖尿病及心血管疾病、抗衰老养颜、促肠胃保肝脏等多种功效，因此又在全球范围内被广泛用于研发药品、保健品和化妆品。
松茸含有18种氨基酸、14种人体必需微量元素、49种活性营养物质、5种不饱和脂肪酸、8种维生素、2种糖蛋白、丰富的膳食纤维和多种活性酶，另含有3种珍贵的活性物质，分别是双链松茸多糖、松茸多肽和全世界独一无二的抗癌物质——松茸醇，是世界上最珍贵的天然药用菌类。
松茸是菌根菌，子实体生长周期长达5-6年，且生长环境复杂，受到温度、气候的影响，尚不能实现人工栽培，使得价格居高不下，这些都限制了松茸的进一步开发利用。研究表明，发酵液中营养成分与松茸子实体中含量接近，因此可以采用松茸菌丝体进行液态发酵，可以获得大量富含活性物质的发酵产物，且具有培养周期短，不受气候、季节和环境影响，可以常年生产等优势，此外，松茸菌丝体的液态发酵技术可以控制松茸菌丝体的生长环境，改变其生长状态和产物的组成比例，提高目标产物的含量；严格控制生产原料和工艺不仅可以保证其安全性避免环境污染和重金属的残留，避免其他微生物的污染，还可以保证稳定的品质，提供可持续和安全的供应链，显著降低原料成本等。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种松口蘑、松茸菌丝体发酵培养基及发酵液的制备方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种松口蘑，所述菌株的名称为：SM002，分类命名为：松口蘑（Tricholoma matsutake），保藏编号为：CGMCC No. 23289，保藏日期为：2021年10月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
一种如上所述的松口蘑的松茸菌丝体发酵培养基，其制备步骤如下：
去皮马铃薯，切成小块，加入纯水煮沸20-30 min，去皮马铃薯：纯水的质量比为1:2-2:1，使用8层纱布过滤，收集滤液，加热至溶解；将溶液用纯水定容，制成土豆浸提液，再向土豆浸提液中添加甘露糖、海藻糖、酪蛋白胨，甘露糖的终浓度为10-30 g/L，海藻糖的终浓度为10-30 g/L，酪蛋白胨的终浓度为5-15 g/L，用酸调节溶液的pH至5.5～6.2，121℃灭菌20 min，即得。
进一步地，所述调节pH用酸为柠檬酸或H2SO4。
进一步地，所述松茸为SM 002。
利用如上所述的松茸菌丝体发酵培养基的松茸菌丝体发酵液的制备方法，步骤如下：
使用接种铲将斜面培养基中的松茸菌苔切碎，向松茸种子培养基中接入0.5 cm2切碎的菌苔，22-26℃摇床120-170 r/min培养15~30天，获得松茸菌丝体的摇瓶液体菌种；
将摇瓶液体菌种按体积比5-7%的接种量接入松茸菌丝体发酵培养基中，22-26℃摇床120-170 r/min培养25~35天，即得松茸菌丝体发酵液；
其中，所述松茸菌苔的名称为：SM002，分类命名为：松口蘑（Tricholoma matsutake），保藏编号为：CGMCC No. 23289，保藏日期为：2021年10月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步地，所述获得松茸菌丝体的摇瓶液体菌种时22℃摇床150 r/min培养15~30天。
进一步地，所述松茸菌丝体发酵液发酵时22℃摇床150 r/min培养25~35天。
进一步地，每1 L斜面培养基为：
称取39 g马铃薯葡萄糖琼脂、5g乳糖或甘露糖和5g琼脂粉，加入500 mL纯水，加热至溶解，将溶液用纯水定容至1 L，121℃灭菌20 min。
进一步地，每1 L种子培养基为：
去皮马铃薯200 g，切成小块，加入1 L纯水煮沸30 min；使用8层纱布过滤，收集滤液，加入20 g葡萄糖和5 g乳糖，加热至溶解；将溶液用纯水定容至1 L，121℃灭菌20 min。
本发明取得的有益效果是：
1、本发明方法采用松茸菌丝体进行液态发酵，可以获得大量富含活性物质的发酵产物、提高目标产物的含量，且具有培养周期短，不受气候、季节和环境影响，可以常年生产等优势。
2、本发明将我国传统的中医药优势与现代发酵技术相结合的发酵技术，将为进行独具中国特色的化妆品的开发提供一个新的思路。发酵技术几乎是对中药全成分进行转化，体现出了中药成分作用于机体的整体观，因此，本发明方法在化妆品中的应用具有很好的发展前景。发酵化妆品因其显著的产品功效，良好的肤感，安全无毒，低刺激，并且成分更加简单和天然，在美白、保湿、抗衰老等方面都有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明中松口蘑SM002的一个角度的菌落形态照片图；
图2为本发明中松口蘑SM002的另一个角度的菌落形态照片图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种松口蘑，所述菌株的名称为：SM002，分类命名为：松口蘑（Tricholoma matsutake），保藏编号为：CGMCC No. 23289，保藏日期为：2021年10月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
一种如上所述的松口蘑的松茸菌丝体发酵培养基，其制备步骤如下：
去皮马铃薯，切成小块，加入纯水煮沸20-30 min，去皮马铃薯：纯水的质量比为1:2-2:1，使用8层纱布过滤，收集滤液，加热至溶解；将溶液用纯水定容，制成土豆浸提液，再向土豆浸提液中添加甘露糖、海藻糖、酪蛋白胨，甘露糖的终浓度为10-30 g/L，海藻糖的终浓度为10-30 g/L，酪蛋白胨的终浓度为5-15 g/L，用酸调节溶液的pH至5.5～6.2，121℃灭菌20 min，即得。
较优地，所述调节pH用酸为柠檬酸或H2SO4。
较优地，所述松茸为SM 002。
利用如上所述的松茸菌丝体发酵培养基的松茸菌丝体发酵液的制备方法，步骤如下：
使用接种铲将斜面培养基中的松茸菌苔切碎，向松茸种子培养基中接入0.5 cm2切碎的菌苔，22-26℃摇床120-170 r/min培养15~30天，获得松茸菌丝体的摇瓶液体菌种；
将摇瓶液体菌种按体积比5-7%的接种量接入松茸菌丝体发酵培养基中，22-26℃摇床120-170 r/min培养25~35天，即得松茸菌丝体发酵液；
其中，所述松茸菌苔的名称为：SM002，分类命名为：松口蘑（Tricholoma matsutake），保藏编号为：CGMCC No. 23289，保藏日期为：2021年10月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
较优地，所述获得松茸菌丝体的摇瓶液体菌种时22℃摇床150 r/min培养15~30天。
较优地，所述松茸菌丝体发酵液发酵时22℃摇床150 r/min培养25~35天。
较优地，每1 L斜面培养基为：
称取39 g马铃薯葡萄糖琼脂、5g乳糖或甘露糖和5g琼脂粉，加入500 mL纯水，加热至溶解，将溶液用纯水定容至1 L，121℃灭菌20 min。
较优地，每1 L种子培养基为：
去皮马铃薯200 g，切成小块，加入1 L纯水煮沸30 min；使用8层纱布过滤，收集滤液，加入20 g葡萄糖和5 g乳糖，加热至溶解；将溶液用纯水定容至1 L，121℃灭菌20 min。
具体地，相关的制备及检测如下：
1、实验材料
松茸（Tricholoma matsutake），所使用的菌种为：使用的菌种采集地为吉林安图石门镇柳河村，分离基物为子实体，经过组织分离法（松茸子实体用70%酒精表面消毒，用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。用手将子实体掰开为二，在菌盖与菌褶交界处，用无菌镊子切取1～5毫米的细块，移放在斜面培养基中央）分离菌种、菌种培养、ITS片段测序完成菌种鉴定后保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC23289，松口蘑Tricholoma matsutake。其菌落形态如图1和图2所示。
2、主要仪器
立式恒温振荡器（IS-RDV3）：美国精骐有限公司；
洁净工作台（SW-CJ-2F）：苏州安泰空气技术有限公司；
立式压力蒸汽灭菌器（Yamato SQ810C）：重庆雅马拓科技有限公司；
多参数测试仪（SevenExcellence S470-B）：梅特勒-托利多仪器有限公司；
组织捣碎机（HGBTWTS3）：WARING；
红外线加热电磁搅拌器（SCHOTT SLR）：肖特（SCHOTT）精密材料和设备国际贸易有限公司；
皮肤测试仪MPA580，皮肤水分含量测试探头Corneometer CM825，经皮水分流失和蒸发热损失测试探头 Tewameter TM Hex，皮肤弹性测试探头Cutomerter：德国Courage+khazaka electronic GmbH(CK)公司；
面部图像分析仪VISIA：美国Canfield公司。
3、主要试剂
马铃薯葡萄糖琼脂：美国BD公司；
琼脂粉、酪蛋白胨：北京索莱宝科技有限公司；
葡萄糖（分析纯）、柠檬酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；
乳糖（分析纯）、半乳糖（分析纯）、果糖（分析纯）、甘露糖（分析纯）、木糖（分析纯）、蔗糖（分析纯）、阿拉伯糖（分析纯）、海藻糖（分析纯）、甘油（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；
实施例1
一种松茸菌丝体发酵液的制备方法，发酵液碳源的确定，步骤如下：
1.1 培养基：
①斜面培养基
称取39 g马铃薯葡萄糖琼脂、5g乳糖和5g琼脂粉，加入500 mL纯水，加热至溶解，将溶液用纯水定容至1 L。分装于试管和茄形瓶，121℃灭菌20 min。
②种子培养基
去皮马铃薯200 g，切成小块，加入1 L纯水煮沸30 min。使用8层纱布过滤，收集滤液，加入20 g葡萄糖和5 g乳糖，加热至溶解。将溶液用纯水定容至1 L，测定溶液的pH。分装于500 mL三角瓶，每瓶装液量150 mL，121℃灭菌20 min。
摇瓶发酵培养基
③去皮马铃薯1900 g，切成小块，加入5 L纯水煮沸30 min。使用8层纱布过滤，收集滤液，加热至溶解。将溶液用纯水定容至9.5 L，制成土豆浸提液。按照25 g/L葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、海藻糖、甘油，用稀H2SO4调节溶液的pH至5.5～6.2。分装于500 mL三角瓶，每瓶装液量150 mL，121℃灭菌20 min。
1.2 松茸菌丝体的摇瓶发酵
使用接种铲将SM 002斜面的菌苔切碎，每瓶种子培养基接入约0.5 cm2切碎的菌苔，22℃摇床150 r/min培养25天，获得松茸菌丝体的摇瓶液体菌种。
将摇瓶液体菌种按体积比6.6%的接种量接入配制的发酵培养基中，22℃摇床150r/min培养30天。用多参数测试仪测发酵液初始pH，用阿贝折光仪测发酵液初始固溶物含量。
1.3 实验结果与讨论
表1 发酵培养基碳源检测结果
碳源 发酵液pH 初始固溶物含量% 发酵液固溶物含量% 平均生物量干重g/L
果糖 6.936/7.115/7.224 3.0 2.0 7.09
半乳糖 6.909/7.030/7.136 3.0 2.5 4.83
木糖 7.061/7.066/7.015 2.4 1.5 8.08
乳糖 7.237/7.204/7.285 3.0 2.5 4.86
蔗糖 6.809/6.829/6.965 3.0 2.5 5.05
阿拉伯糖 7.196/7.396/7.201 3.0 2.0 5.15
葡萄糖 7.096/6.996/6.969 2.5 1.8 5.40
甘露糖 7.229/7.148/7.193 3.1 1.5 9.73
甘油 7.103/7.094/7.144 2.5 1.8 6.67
海藻糖 7.101/7.288/6.776 3.6 1.4 10.05
根据生物量和发酵液固溶物含量分析，碳源最佳为海藻糖。
实施例2
在确定碳源的基础上，从半胱氨酸、胱氨酸、酪蛋白胨、甘氨酸、组氨酸、大豆蛋白胨、蛋氨酸等氮源做了筛选，发现酪蛋白效果最佳，在此基础上，对海藻糖和酪蛋白胨进行添加量的优化。
分别以海藻糖和酪蛋白胨为碳氮源进行了添加量的优化。
斜面培养基、种子培养基同实施例1，摇瓶发酵培养基如下：
2.1 摇瓶发酵培养基
去皮马铃薯1900 g，切成小块，加入5 L纯水煮沸30 min。使用8层纱布过滤，收集滤液，加热至溶解。将溶液用纯水定容至9.5 L，制成土豆浸提液。按照表2中海藻糖、酪蛋白胨含量添加到土豆浸提液中，用稀H2SO4调节溶液的pH至5.5～6.2。分装于500 mL三角瓶，每瓶装液量150 mL，121℃灭菌20 min。
表2 松茸菌丝体摇瓶发酵碳氮源优化实验设计
序号 海藻糖含量（g/L） 酪蛋白胨含量（g/L） 序号 海藻糖含量（g/L） 酪蛋白胨含量（g/L）
1 30 5 11 15 7.5
2 35 7.5 12 15 10
3 25 2.5 13 35 10
4 35 2.5 14 15 2.5
5 20 5 15 15 5
6 25 10 16 30 2.5
7 30 10 17 20 10
8 25 5 18 20 2.5
9 20 7.5 19 30 7.5
10 35 5 20 25 7.5
2.2 松茸菌丝体的摇瓶发酵
使用接种铲将SM 002斜面的菌苔切碎，每瓶种子培养基接入约0.5 cm2切碎的菌苔，22℃摇床150 r/min培养25天，获得松茸菌丝体的摇瓶液体菌种。
将摇瓶液体菌种按体积比6.6%的接种量接入配制的20种发酵培养基，22℃摇床150 r/min培养30天。用多参数测试仪测发酵液初始pH，用阿贝折光仪测发酵液初始固溶物含量。
2.3 松茸菌丝体发酵液的检测
20种松茸菌丝体发酵液，用多参数测试仪测每瓶发酵液pH，然后分别定容至150mL，用100目尼龙滤布过滤，分别收集菌丝体和滤液，菌丝体快速用纯化水清洗两次，然后平铺到称重的培养皿上，放置到105℃烘箱中烘干至恒重；用阿贝折光仪测发酵液固溶物含量。结果如表3所示。
2.4 实验结果与讨论
表3 松茸菌丝体摇瓶发酵碳氮源优化实验结果
名称 发酵液pH 初始固溶物含量% 发酵液固溶物含量% 平均生物量干重g/L
1 7.509/8.408/7.723 4.2 2.5 13.56
2 7.842/6.302/7.330 4.8 3.5 14.12
3 8.361/8.309/8.250 3.5 2.3 13.51
4 8.308/8.227/8.070 4.1 3.4 13.65
5 8.497/8.369/8.384 3.5 2.6 10.32
6 8.117/8.147/7.980 4.5 3.2 14.03
7 8.019/8.027/7.373 4.7 3.7 14.33
8 8.376/8.360/8.453 3.8 2.9 13.77
9 8.312/8.016/7.974 3.7 2.7 13.10
10 8.421/8.007/7.685 4.5 3.5 13.81
11 8.316/8.089/8.073 3.0 2.5 12.64
12 7.908/8.132/8.127 3.3 2.4 13.36
13 7.528/6.804/6.559 5.0 4.0 13.07
14 7.364/6.985/6.855 2.6 2.1 11.06
15 8.471/8.423/8.281 2.8 2.0 12.74
16 8.409/8.251/8.219 3.8 2.4 13.60
17 6.443/7.958/6.744 4.0 3.2 13.51
18 8.288/8.317/8.267 2.7 2.1 13.64
19 8.291/8.264/8.314 4.5 3.4 14.85
20 8.304/8.153/8.213 4.2 3.4 14.25
通过对20种松茸发酵液的结果分析，最佳添加量为19号发酵培养基：海藻糖30 g/L，酪蛋白胨7.5 g/L。
实施例3
松茸菌丝体摇瓶发酵条件优化，配方条件同实施例1。
斜面培养基、种子培养基同实施例1，摇瓶发酵培养基如下：
3.1 摇瓶发酵培养基
去皮马铃薯1400 g，切成小块，加入7.0 L纯化水煮沸30 min。使用8层纱布过滤，收集滤液，加热至溶解。将溶液用纯化水定容至7.0 L，制成土豆浸提液。将土豆浸提液中加入30g/L海藻糖、7.5 g/L酪蛋白胨，用稀H2SO4调节溶液的pH至5.5～6.2。分装于500 mL三角瓶，每瓶装液量150 mL/ 180 mL/ 210 mL/ 240 mL，121℃灭菌20 min。
3.2 松茸菌丝体的摇瓶发酵
使用接种铲将SM 002斜面的菌苔切碎，每瓶种子培养基接入约0.5 cm2切碎的菌苔，22℃摇床150 r/min培养25天，获得松茸菌丝体的摇瓶液体菌种。
将摇瓶液体菌种按体积比6.6%的接种量接入配制的发酵培养基中，装液量为150mL的发酵液分别22℃、24℃、26℃摇床150 r/min培养30天。其他装液量22℃摇床150 r/min培养30天。用多参数测试仪测发酵液pH，用阿贝折光仪测发酵液初始固溶物含量。
3.3 松茸菌丝体发酵液的检测
松茸菌丝体发酵液用多参数测试仪测每瓶发酵液pH，然后分别定容至初始体积，用100目尼龙滤布过滤，分别收集菌丝体和滤液，菌丝体快速用纯化水清洗两次，然后平铺到称重的培养皿上，放置到105℃烘箱中烘干至恒重；用阿贝折光仪测发酵液固溶物含量。
3.4 实验结果与讨论
松茸菌丝体发酵优化实验结果见表4。
表4 松茸菌丝体摇瓶发酵条件优化实验结果
名称 发酵液pH 初始固溶物含量% 发酵液固溶物含量% 平均生物量干重g/L
海藻糖（150ml，22℃） 6.693/6.330/6.259 4.5 1.4 14.90
海藻糖（180ml，22℃） 6.836/6.767/6.786 4.5 1.4 14.50
海藻糖（210ml，22℃） 6.750/6.736/6.803 4.5 1.5 13.84
海藻糖（240ml，22℃） 6.656/6.479/6.298 4.5 1.9 12.46
海藻糖（150ml，24℃） 6.895/6.878/6.838 4.5 1.5 14.83
海藻糖（150ml，26℃） 6.753/6.846/6.874 4.5 1.6 14.80
装液量150 mL/ 180 mL/ 210 mL/ 240 mL，摇床转速不变，随着装液量的增加，但生物量并没有变大，装液量为150 mL的生物量最大，因此装液量选择150 mL。150 mL装液量的发酵培养基进行22℃、24℃、26℃摇床150 r/min培养，生物量随着培养温度升高变小，但变化量不大，因此选择22℃培养。
实施例4
将实施例3优选的发酵液进行后处理：
4.1将发酵液以100目尼龙滤布过滤，得到发酵液上清滤液，编号SQ；将发酵液用组织捣碎机，低速匀浆3次，每次1 min，以100目尼龙滤布过滤得到匀浆液，编号YJ；将发酵液煮沸1 h，以100目尼龙滤布过滤，得到发酵液浸提液，编号JT；将装有发酵液的蓝盖瓶置入蒸汽灭菌器，于0.08 MPa灭菌15 min，以100目尼龙滤布过滤得到溶胞液，编号RB。
4.2 发酵液功效评价
对4种发酵液进行稀释，浓度分别为16%、8%、4%、2%、1%，进行清除DPPH自由基实验，实验结果见表5。
表5 清除DPPH自由基实验结果
样品浓度 16% 8% 4% 2% 1%
SQ 45.2% 32.7% 28.6% 16.9% 10.6%
YJ 70.3% 43.5% 31.6% 19.3% 13.8%
JT 65.7% 41.3% 30.5% 17.9% 11.3%
RB 95.1% 62.7% 46.3% 35.8% 27.6%
人体新陈代谢是一个氧化的过程，人体与金属一样，每天都在“生锈”，而促使人体“生锈”的元凶叫做“自由基”。人体内会自然形成自由基，它是人体代谢过程的正常产物，十分活跃又极不稳定，它们会附着于健康细胞之上，再慢慢瓦解健康细胞。随着年龄的增长，人体便会产生更多的自由基，慢慢的对人体内的细胞产生破坏，导致细胞加速衰老。自由基首先攻击皮肤细胞膜，破坏细胞膜的弹性和柔韧性，失去其应有的功能，而维持皮肤平衡的细胞破坏和减少，皮肤细胞免疫能力就会迅速下降，最后导致皮肤衰老、变皱、失去弹性、光泽，严重还会导致病变。清除自由基有助于保护细胞，起到延缓皮肤衰老，保障皮肤健康的作用。由表5可知，经过四种后处理的发酵液中溶胞液清除DPPH自由基的效果最佳。
4.3 发酵液体外保湿功效评价
室温下，将2%SQ溶液、2%YJ溶液、2%JT溶液、2%RB溶液以及去离子水分别称取10g，装入平皿中，放置于硅胶干燥器中，待放置12h后、24h后称量装样品的平皿重量，计算保湿率。保湿率=（装样品的平皿重量-平皿的重量）/10×100%，实验结果见表6。
表6保湿率测试结果
时间间隔 12h后 24h后
2%SQ溶液 72.8% 45.6%
2%YJ溶液 79.9% 56.2%
2%JT溶液 75.1% 47.3%
2%RB溶液 85.7% 63.5%
去离子水 65.3% 41.5%
四种经过后处理的发酵液均具有一定的保湿性，其中2%发酵液溶胞液保湿率最佳。
实施例5
对实施例4优选的发酵液溶胞液进行安全性和人体功效评价。
5.1 安全性评价
对发酵液溶胞液进行微生物检测、刺激性测试和人体斑贴试验。检测依据：SN/T2329-2009《化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验》、《化妆品安全技术规范》（2015年版）人体皮肤斑贴试验——皮肤封闭型斑贴试验。测试结果见表7。
表7安全性测试结果
测试项 菌落总数（CFU/ml） 霉酵总数（CFU/ml） 刺激性测试 人体斑贴试验
发酵液溶胞液 ＜10 ＜10 无刺激 阴性
发酵液溶胞液微生物指标合格，鸡胚绒毛尿囊膜试验验证无刺激性，人体皮肤斑贴试验反应为阴性，安全性可靠。
5.2 人体功效评价试验
选择36名年龄在30至55周岁之间的女性健康志愿者，随机平均分三组，分别使用发酵液溶胞液添加量为0%、2%、4%的精华液，连续使用4周，在使用产品后的2周后和4周后进行回访测试。分析皮肤角质层水分含量、经皮水分流失量、皮肤弹力（R2）、皮肤紧实度（F4）、皱纹分值、皮肤红区分值在使用产品前后的变化情况。实验结果见表8。
表8三款精华液在使用周期内相对基础值的变化率统计表（n=12）
注：变化率=（使用后-使用前）/使用前
皮肤角质层水分含量数值越高越好，本次测试添加发酵液溶胞液的精华液保湿功效明显增强，且添加量越高功效越强；经皮水分流失量数值越低越好，本次测试添加发酵液溶胞液的精华液修护皮肤屏障功效明显增强，且添加量越高功效越强；皮肤弹性数值越高越好（通常不大于1），本次测试添加发酵液溶胞液的精华液增强皮肤弹性功效明显增强，且添加量越高功效越强；皮肤紧实度数值越低越好，本次测试添加发酵液溶胞液的精华液紧致功效明显增强，且添加量越高功效越强；皱纹分值数值越低越好，本次测试添加发酵液溶胞液的精华液抗皱功效明显增强，且添加量越高功效越强；皮肤红区分值数值越低越好，本次测试添加发酵液溶胞液的精华液改善皮肤敏感度功效明显增强，且添加量越高功效越强。通过本次人体功效测试，证明发酵液溶胞液具有保湿、修护、紧致、抗皱等功效，且添加量越高效果越明显。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (8)

1. 一种松口蘑（Tricholoma matsutake），其特征在于：所述菌株的名称为：SM002，分类命名为：松口蘑，保藏编号为：CGMCC No. 23289，保藏日期为：2021年10月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种如权利要求1所述的松口蘑的松茸菌丝体发酵培养基，其特征在于：其制备步骤如下：
去皮马铃薯，切成块，加入纯水煮沸20-30 min，去皮马铃薯：纯水的质量比为1:2-2:1，使用8层纱布过滤，收集滤液，加热至溶解；将溶液用纯水定容，制成土豆浸提液，再向土豆浸提液中添加甘露糖、海藻糖、酪蛋白胨，甘露糖的终浓度为10-30 g/L，海藻糖的终浓度为10-30 g/L，酪蛋白胨的终浓度为5-15 g/L，用酸调节溶液的pH至5.5～6.2，121℃灭菌20min，即得。
3.根据权利要求2所述的松茸菌丝体发酵培养基，其特征在于：所述调节pH用酸为柠檬酸或H2SO4。
4.利用如权利要求2至3任一项所述的松茸菌丝体发酵培养基培养的松茸菌丝体发酵液的制备方法，其特征在于：步骤如下：
使用接种铲将斜面培养基中的松茸菌苔切碎，向松茸种子培养基中接入0.5 cm2切碎的菌苔，22-26℃摇床120-170 r/min培养30~41天，获得松茸菌丝体的摇瓶液体菌种；
将摇瓶液体菌种按体积比5-7%的接种量接入松茸菌丝体发酵培养基中，22-26℃摇床120-170 r/min培养15~35天，即得松茸菌丝体发酵液；
其中，所述松茸菌苔的名称为：SM002，分类命名为：松口蘑（Tricholoma matsutake），保藏编号为：CGMCC No. 23289，保藏日期为：2021年10月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
5. 根据权利要求4所述的松茸菌丝体发酵液的制备方法，其特征在于：所述获得松茸菌丝体的摇瓶液体菌种时22℃摇床150 r/min培养30~41天。
6. 根据权利要求5所述的松茸菌丝体发酵液的制备方法，其特征在于：所述松茸菌丝体发酵液发酵时22℃摇床150 r/min培养15~35天。
7. 根据权利要求4至6任一项所述的松茸菌丝体发酵液的制备方法，其特征在于：每1L斜面培养基为：
称取39 g马铃薯葡萄糖琼脂、5g乳糖或甘露糖和5g琼脂粉，加入500 mL纯水，加热至溶解，将溶液用纯水定容至1 L，121℃灭菌20 min。
8. 根据权利要求4至6任一项所述的松茸菌丝体发酵液的制备方法，其特征在于：每1L种子培养基为：
去皮马铃薯200 g，切成小块，加入1 L纯水煮沸30 min；使用8层纱布过滤，收集滤液，加入20 g葡萄糖和5 g乳糖，加热至溶解；将溶液用纯水定容至1 L，121℃灭菌20 min。
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