WO2017202293A1 - 一种蝉花的人工培养方法 - Google Patents

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张忠亮
王玉芹
董建飞
王莹
刘艳菊
尹彬
陈桃宝
徐煜
孙长胜
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Abstract

一种蝉花的人工培养方法，所述方法包括如下步骤：步骤1，将蝉花菌种进行扩大培养；步骤2，将步骤1扩大培养得到的菌种进行固体培养；步骤3，对子实体进行采收；其中，在步骤1菌种扩大培养及步骤2固体培养过程中使用低氘水，其氘含量不超过100ppm。本方法使用低氘水，能显著提高蝉花子实体的产量和质量。

Description

一种蝉花的人工培养方法 技术领域
本发明涉及一种蝉花的人工培养方法。
背景技术
蝉花(Isaria cicadae Miquel)属于真菌界(FUNGI)的子囊菌门(Ascomycota)、盘菌亚门(Pezizomycotina)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、虫草科(Cordycipitaceae)、棒束孢属(Isaria)，是我国名贵的中药材，是寄生在蝉(俗称“知了”)上的一种虫草菌。其药用已有1000多年历史，是我国传统的名贵药材之一，具有多方面的药用价值。主要成分有腺苷、虫草多糖、虫草酸(甘露醇)、虫草素、尿嘧啶、甾醇、生物碱、维生素、无机盐、矿物质元素等。
蝉花具有独特而广泛的功效，如改善肾功能，抗肿瘤，调节免疫系统，滋补强壮，提高细胞能力、抗疲劳，降血压、血糖，解热、镇痛、改善睡眠，改善脂质代谢，促进造血，抗真菌，抗衰老等。
自然界里存在的水一般由2个氢原子和1个氧原子组成，但氢原子有质量不同的3个同位素，原子量量分别为1，2，3的氢(H)、氘(D,重氢)、氚(超重氢)。自然界的水中，重氢的含量约为150ppm，由D代替H结合的水就是重水。在地球上一切自然水体中都含有氘，不管氘含量多少，对生物体都是有害的。水中正常的氘含量虽没有引起明显的危害性，但只要正常的水中稍微脱去一部分氘，对人体健康的作用都无法估量，所以越来越多的人选择了低氘水。国外学者研究发现，长期饮用氘含量低的水可抑制动物恶性肿瘤的发展，并延长动物的寿命。因此，提出了低氘水对生命体具有着极强的促进作用。
现有技术多集中与低氘水抑制肿瘤和免疫调剂的相关研究，尚未见将低氘水应用于虫生真菌的人工栽培领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蝉花的人工培养方法，该方法培养得到的蝉花子实体粗壮、产量和活性成分含量高。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种蝉花的人工培养方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1，将蝉花菌种进行扩大培养；
步骤2，将步骤1扩大培养得到的菌种进行固体培养；
步骤3，对子实体进行采收；
其中，在步骤1菌种扩大培养及步骤2固体培养过程中使用低氘水。
优选的，所述培养过程中使用的低氘水其氘含量不超过100ppm；进一步优选的，所述培养过程中使用的低氘水其氘含量在20～100ppm；进一步优选的，所述培养过程中使用的低氘水其氘含量为20ppm、50ppm、100ppm。
优选的，步骤1所述扩大培养的培养温度为20～25℃。
优选的，步骤2所述固体培养的接种量为5％～15％；更进一步，接种量为7％～12％。
优选的，步骤2所述固体培养阶段培养基的含水量为55～65％。
优选的，步骤2所述固体培养的培养条件为：暗培养阶段培养温度20-25℃，相对湿度为70-80％；光培养阶段培养温度为20-22℃，相对湿度为70-80％。
优选的，步骤2光培养阶段光照强度为100-200Lx。
优选的，步骤2光培养阶段每天通风2～3次，每次0.5～1小时。
在一些实施方式中，步骤1所述“扩大培养”包括斜面培养和液体培养；所述液体培养包括摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养中的任意一种或几种。扩大培养各阶段的培养基均为本领域常规的培养基，如所述斜面培养的培养基选自PDA(马铃薯-葡萄糖-琼脂-水，pH自然)、PSA(土豆煮汁-白砂糖-琼脂粉-水)、SDAY(酵母浸出粉-葡萄糖-蛋白胨-琼脂)、MPA(麦芽糖-蛋白胨-琼脂-水)、CA(玉米粉-琼脂粉-水)、Czapek(NaNO3-K2HPO4-KCl-MgSO4 7H2O-FeSO4 7H2O-蔗糖-琼脂-蒸馏水)、SDA(葡萄糖-蛋白胨-琼脂-水)。优选PDA培养基。所述液体培养的培养基选自PS(马铃薯-蔗糖-水)、Richard(KNO3-KH2PO4-MgSO4-蔗糖-FeCl3-水)、PGY(蛋白胨-葡萄糖-酵母膏-水)、YSPS(酵母抽提物-大豆分离蛋白/复合氨基酸-白砂糖-水)。优选YSPS培养基。
在一些实施方式中，所述的“固体培养”分为暗培养和光培养阶段，在菌丝体生长阶段为暗培养；从子实体始发至采收阶段为光培养。所述固体培养的培养基为本领域常规的培养基，如选自谷物培养基、农作物秸杆培养基、农作物皮壳培养基、经济林木树枝培养基等。所述谷物培养基选自以小麦、玉米、 大米、小米、黄豆粉、荞麦、大麦、燕麦、糙米、粳米中的任意一种或几种为主要原料的培养基；所述农作物秸秆培养基选自以麦秆、玉米杆、棉杆、豆杆、芝麻杆中的任意一种或几种为主要原料的培养基；所述农作物皮壳培养基选自以麸皮、大豆皮、棉籽壳中的任意一种或几种为主要原料的培养基。优选的，所述固体培养基优选谷物培养基；进一步优选的，所述固体培养基优选小麦培养基。
在一些实施方式中，在步骤3对子实体进行采收后还包括步骤4对子实体进行干燥。
本发明创造性的发现在蝉花人工培养的各阶段使用低氘水对最终子实体生长及活性成分的含量产生显著影响，相对于普通过滤水(氘含量150ppm)，使用低氘水(20～100ppm)培养得到的子实体其形态、收率及营养成分的含量显著提高。
具体实施方式
以下实施例1～8中所用蝉花菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No 3453(该菌种已在申请号为201110120603.1的发明专利中公开，为已知菌种)；实施例9～20采用的蝉花菌种为自制菌种，制备过程见实施例21。本发明研究表明蝉花菌种类型并不构成影响本发明效果的因素，本发明人工培养方法对不同蝉花菌种均能够实现效果。
以下实施例所用低氘水由上海联泓同位素科技有限公司提供，随产品提供氘含量检验报告。
实施例1
1、培养过程
斜面培养→摇瓶培养→种子罐培养→发酵罐培养→固体培养；
2、培养基
斜面培养基：PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，低氘水20ppm补足1L，pH自然)。
液体培养基：YSPS培养基(酵母提取物5g、大豆分离蛋白10g、白砂糖35g，低氘水20ppm补足1L)；
固体培养基：小麦和低氘水(20ppm)按1：1.5的比例混合均匀；
培养基要经过灭菌，确保达到无菌状态；
3、培养条件
斜面培养阶段：温度22℃，时间：7天左右；
摇瓶培养阶段：转速：150r/min，温度：25℃，时间：培养55～60h；
种子罐(发酵罐)培养阶段：转速：150r/min，1.5vvm，温度：25℃，时间：培养24～36h。
固体培养基阶段：接种量10％；暗培养：温度为25℃，相对湿度80％，至菌丝长满培养基(约3～5天)；光培养：温度为22℃，相对湿度80％，光照强度100lux，每天通风2次(上、下午各通风1次，每次半小时)，培养时间约20～24天；及时采收并干燥。
实施例2
与实施例1基本相同，区别仅在于培养用水为低氘水，氘的含量为50ppm。
实施例3
与实施例1基本相同，区别仅在于培养用水为低氘水，氘的含量为100ppm。
实施例4
与实施例1基本相同，区别仅在于培养用水为普通过滤水。
对实施例1～4培养的蝉花子实体进行采收，计算产量，并测量子实体的高度和直径，测定有效成分含量。结果见表1。
表1 实施例1～4不同培养用水对子实体生长及有效成分含量的影响
Figure PCTCN2017085480-appb-000001
结果表明，使用低氘水对最终子实体生长及活性成分的含量产生显著影响，相对于普通过滤水，使用低氘水培养得到的子实体其形态、收率及营养成分的 含量显著提高。
实施例5
与实施例1基本相同，区别仅在于液体培养基为：Richard培养基(KNO3 10g，KH2PO45g，MgSO4 2.5g，蔗糖50g，FeCl3 0.02g，低氘水20ppm补足1L)。
实施例6
与实施例5基本相同，区别仅在于低氘水氘含量为50ppm。
实施例7
与实施例5基本相同，区别仅在于低氘水氘含量为100ppm。
实施例8
与实施例5基本相同，区别仅在于培养用水为普通过滤水。
对实施例5～8培养的蝉花子实体进行采收，计算产量，并测量子实体的高度和直径，测定有效成分含量。结果见表2。
表2 实施例5～8不同培养用水对子实体生长及有效成分含量的影响
Figure PCTCN2017085480-appb-000002
结果表明，使用低氘水对最终子实体生长及活性成分的含量产生显著影响，相对于普通过滤水，使用低氘水培养得到的子实体其形态、收率及营养成分的含量显著提高。
实施例9
与实施例1基本相同，区别仅在于液体培养基为：PGY培养基(蛋白胨5g，葡萄糖10g，酵母膏10g，低氘水20ppm补足1L)。
实施例10
与实施例9基本相同，区别仅在于低氘水氘含量为50ppm。
实施例11
与实施例9基本相同，区别仅在于低氘水氘含量为100ppm。
实施例12
与实施例9基本相同，区别仅在于培养用水为普通过滤水。
对实施例9～12培养的蝉花子实体进行采收，计算产量，并测量子实体的高度和直径，测定有效成分含量。结果见表3。
表3 实施例9～12不同培养用水对子实体生长及有效成分含量的影响
Figure PCTCN2017085480-appb-000003
结果表明，使用低氘水对最终子实体生长及活性成分的含量产生显著影响，相对于普通过滤水，使用低氘水培养得到的子实体其形态、收率及营养成分的含量显著提高。
实施例13
与实施例1基本相同，区别仅在于液体培养基为：PS培养基(马铃薯200g，蔗糖20g，低氘水20ppm补足1L)。
实施例14
与实施例13基本相同，区别仅在于低氘水氘含量为50ppm。
实施例15
与实施例13基本相同，区别仅在于低氘水氘含量为100ppm。
实施例16
与实施例14基本相同，区别仅在于培养用水为普通过滤水。
对实施例13～16培养的蝉花子实体进行采收，计算产量，并测量子实体的高度和直径，测定有效成分含量。结果见表4。
表4 实施例13～16不同培养用水对子实体生长及有效成分含量的影响
Figure PCTCN2017085480-appb-000004
结果表明，使用低氘水对最终子实体生长及活性成分的含量产生显著影响，相对于普通过滤水，使用低氘水培养得到的子实体其形态、收率及营养成分的含量显著提高。
实施例17
与实施例1基本相同，区别仅在于固体培养基：大麦和低氘水(20ppm)按1:1.5的比例混合均匀，灭菌；
实施例18
与实施例17基本相同，区别仅在于低氘水氘含量为50ppm。
实施例19
与实施例17基本相同，区别仅在于低氘水氘含量为100ppm。
实施例20
与实施例17基本相同，区别仅在于培养用水为普通过滤水。
对实施例17～20培养的蝉花子实体进行采收，计算产量，并测量子实体的高度和直径，测定有效成分含量。结果见表5。
表5 实施例17～20不同培养用水对子实体生长及有效成分含量的影响
Figure PCTCN2017085480-appb-000005
结果表明，使用低氘水对最终子实体生长及活性成分的含量产生显著影响，相对于普通过滤水，使用低氘水培养得到的子实体其形态、收率及营养成分的含量显著提高。
实施例21
在我国长江以南的亚热带和热带地区低洼地带，7月，按照一般中药材的方法采集。在超镜工作台上，在无菌条件下，将采来的新鲜虫草用无菌水冲洗干净，置于已灭菌的直径为15cm的培养皿中，虫草的内菌核部分(虫体)用打湿的脱脂棉包裹，以保湿。虫草的子实体下方放置一灭菌的载玻片，虫草菌核部分用小玻片垫起，以使可孕部分不要直接接触载玻片，其距离约0.5cm左右。然后将培养皿放置于20℃±0.5℃的光照培养箱培养，待蝉花孢子弹射于载玻片上时，在孢子周围滴加刚溶化的PDA培养基少许，移出玻片，置于另一灭菌的培养皿中保湿培养，待长出菌丝后用接种针挑取少量菌丝转另一平皿(SDAY培养基)培养(同上)，直至长出单一的纯化的菌落为止。并经形态学或分子生物学方法验证，该菌株为蝉花虫草(Isaria cicadae Miquel)无性型。

Claims (10)

  1. 一种蝉花的人工培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
    步骤1，将蝉花菌种进行扩大培养；
    步骤2，将步骤1扩大培养得到的菌种进行固体培养；
    步骤3，对子实体进行采收；
    其中，步骤1菌种扩大培养及步骤2固体培养过程中所用水为低氘水，其氘含量不超过100ppm。
  2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养过程中使用的低氘水其氘含量在20～100ppm。
  3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养过程中使用的低氘水其氘含量为20ppm或50ppm或100ppm。
  4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述扩大培养的培养温度为20～25℃。
  5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述固体培养的接种量为5％～15％；优选的，接种量为7％～12％。
  6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述固体培养阶段培养基的含水量为55～65％。
  7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述固体培养的培养条件为：暗培养阶段培养温度20-25℃，相对湿度为70-80％；光培养阶段培养温度为20-22℃，相对湿度为70-80％。
  8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2光培养阶段光照强度为100-200Lx。
  9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2光培养阶段每天通风2～3次，每次0.5～1小时。
  10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3对子实体进行采收后还包括步骤4对子实体进行干燥。
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