CN101990822B - 银耳孢子发酵物生物活性饲料添加剂 - Google Patents
银耳孢子发酵物生物活性饲料添加剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种银耳孢子发酵液的制备方法,其步骤是先从野生或人工培养的银耳子实体中分离获得银耳孢子,分离纯化后,经孢子接种在新鲜土豆100g/L,4%葡萄糖,0.3%玉米浆,1%酵母硒粉,0.05%磷酸盐,pH自然的培养基中,生长发酵,制备获得银耳孢子发酵液。本发明还公开了所得的银耳孢子发酵液按1kg麦麸+5kg银耳孢子发酵液(1∶5)比例混合,≤65℃烘干制备获得银耳孢子发酵物生物活性饲料添加剂产品,每克添加剂干粉含银耳孢子数13×108-26×108/克,添加剂干粉银耳孢子发酵物占12±1%。
Description
技术领域
本发明涉及动物微生态制剂的制备,特别涉及饲用微生物发酵制备饲料用添加剂。
背景技术
银耳(Tremella fuciformis Berk)又称白木耳,为担子菌纲银耳科植物的子实体,作为药用已有悠久历史。银耳是具有滋补调养功能、可用于治疗虚证的珍贵药物。目前除人工栽培银耳子实体供药用外,还进行银耳孢子的深层发酵培养,将其发酵液经提取、纯化后所获得的银耳多糖供药用。初步临床试验证明,银耳多糖对一些呼吸系统疾病如慢性支气管炎、肺心病等有一定疗效,研究发现其可代替人工栽培银耳子实体作为药用。
我国目前批准的可应用的12种动物微生态制剂的饲用微生物添加剂有:干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌、啤酒酵母菌、产脱假丝酵母、沼泽红假单胞菌。
本发明银耳孢子是一类酵母型细胞,其本身可作为饲用微生物添加剂(即饲用微生态制剂),其发酵主要代谢产物多糖又可作为聚糖类饲料添加剂,是两者兼得的新型的绿色饲料添加剂。
本发明是利用药食两用真菌——银耳,从其子实体中分离出银耳孢子,经深层发酵培养生产银耳孢子发酵液,再进一步制备成银耳孢子发酵物生物活性添加剂。将其使用于猪、奶牛等动物饲料中喂饲,可增强动物免疫功能,促进动物生长,提高奶牛的产奶量及动物对饲料养分的利用。促生长和提高饲料利用的效果可与抗生素相当,有望作为抗生素的取代物。
本发明具有生物活性功能的银耳孢子发酵物作为使用于动物饲料添加剂至今未见有关专利和相关文献报导。
另外,银耳孢子是一类酵母型细胞,如同啤酒酵母菌,产朊假丝酵母一样,将其作为饲用微生物添加剂(即饲用微生态制剂)至今也未见专利及相关文献报导。
发明内容
发明人采用从人工栽培的银耳或从自然界天然野生的银耳子实体中分离银耳孢子,利用发酵技术大规模生产银耳发酵液,其方法如下:
一、银耳孢子的分离采集与保存
从人工栽培银耳子实体或自然界天然野生的银耳子实体中分离采集银耳孢子。银耳孢子接种于土豆汁琼脂斜面上,25℃±1℃培养7-10天后待用。
二、纯种银耳孢子的制备
取少许银耳孢子于1-2ml无菌生理盐水中,经适当稀释后涂布于载有土豆汁琼脂培养基的9厘米培养皿上,25℃±1℃培养,待肉眼在培养皿上能观察到小白点样菌落时,无菌取样,在显微镜下能观察到类似于酵母样的孢子细胞时,并接种于土豆汁琼脂斜面上,25℃±1℃培养7-10天后待用。
三、种子培养基及发酵培养基的选择与制备
发明人根据酵母菌发酵的一般条件及原理,设定了四种培养基的组成进行了培养基的筛选研究:
A培养基:4%可溶性淀粉,2%葡萄糖,2%黄豆粉,0.1%玉米浆,0.05%磷酸盐,pH自然。
B培养基:4%可溶性淀粉,2%葡萄糖,2%酵母硒粉,0.1%玉米浆,0.05%磷酸盐,pH自然。
C培养基:新鲜土豆100g/L,4%葡萄糖,0.3%玉米浆,0.05%磷酸盐,pH自然。
D培养基:新鲜土豆100g/L,4%葡萄糖,0.3%玉米浆,1%酵母硒粉,0.05%磷酸盐,pH自然。
将上述4种培养基分装于三角瓶中,121℃灭菌30分钟,备用。将前述的制备的纯种银耳孢子接种于上述四种培养基,25℃±1℃生长培养7天观察其生长情况。
研究试验结果表明D培养基明显优于其它3种培养基,分别在B和D培养基中加入特殊酵母硒粉均显现有利于银耳孢子发酵物的产生。
发明人最终综合各种因素考虑选择C培养基作为种子培养基,D培养基作为发酵培养基。
四、工业化生产的研究:
1、种子罐生长培养:
从生长良好的银耳孢子接种于上述C培养基灭菌的种子罐中,25℃±1℃生长培养3-4天,即为银耳孢子培养液。
2、发酵罐生长培养
A、培养基制备同上述D培养基制备方法。
B、取上述培养良好的银耳孢子培养液3%-5%接种量,接种于发酵罐容器中,通气流量1∶1,转速150-200rpm,25℃±1℃培养6-8天。取样后,银耳孢子经计数达到3×108-6×108/ml,停止发酵生长,即为银耳孢子发酵液。
五、银耳孢子发酵物生物活性饲料添加剂产品的制备
将上述银耳孢子3×108-6×108/ml发酵液5kg加1kg麦麸比例混合,≤65℃烘箱中烘干,将烘干物粉碎,过筛,即为最终银耳孢子发酵物生物活性饲料添加剂干粉产品。
添加剂干粉产品的组成
添加剂干粉,水分≤10%
每克添加剂干粉含银耳孢子数13×108-26×108/g
添加剂干粉银耳孢子发酵物占12±1%
添加剂干粉辅料麦麸占78±1%。
六、本发明专利添加剂用途和效果
银耳孢子发酵物生物活性添加剂0.4%,目前应用于猪动物的饲料中,增重10-15%,并可取代抗生素,达到与抗生素同样的效果;不仅如此,还能改善动物肠道内菌群数量,增强动物免疫功能。
银耳孢子发酵物发酵原液500-600ml(或115克-135克添加剂干粉),目前应用于奶牛动物的饲料中,增加奶产量,每头每天增产0.5-1.0kg。
将来逐步扩大可应用于羊、兔、鸡、鸭、鱼等饲料中。
具体实施方式
实施例1银耳孢子的分离采集和纯化
发明人采用从人工栽培的银耳或从自然界天然野生的银耳子实体中分离银耳孢子,利用发酵技术大规模生产银耳发酵液,其方法如下:
一、银耳孢子的分离采集
从人工栽培银耳子实体或自然界天然野生的银耳子实体中分离采集银耳孢子。
二、纯种银耳孢子的制备
取少许银耳孢子于1-2ml无菌生理盐水中,经适当稀释后涂布于载有土豆汁琼脂培养基的9厘米培养皿上,25℃±1℃培养,待肉眼在培养皿上能观察到小白点样菌落时,无菌取样,在显微镜下能观察到类似于酵母样的孢子细胞时,并接种于土豆汁琼脂斜面上,25℃±1℃培养7-10天后待用。
三、种子培养基及发酵培养基的选择与制备
发明人根据酵母菌发酵的一般条件及原理,设定了四种培养基的组成进行了培养基的筛选研究:
A培养基:4%可溶性淀粉,2%葡萄糖,2%黄豆粉,0.1%玉米浆,0.05%磷酸盐,pH自然。
B培养基:4%可溶性淀粉,2%葡萄糖,2%酵母硒粉,0.1%玉米浆,0.05%磷酸盐,pH自然。
C培养基:新鲜土豆100g/L,4%葡萄糖,0.3%玉米浆,0.05%磷酸盐,pH自然。
D培养基:新鲜土豆100g/L,4%葡萄糖,0.3%玉米浆,1%酵母硒粉,0.05%磷酸盐,pH自然。
将上述4种培养基分装于三角瓶中,121℃灭菌30分钟,备用。将前述的制备的纯种银耳孢子接种于上述四种培养基,25℃±1℃生长培养7天观察其生长情况,结果见表1。
表1银耳孢子在不同培养基中生长状况
培养基 | 孢子数 | 生长外观 | 生物量10ml,10分4000rpm |
A | 1-2×106/ml | 稀 | 2/10ml |
B | 1-2×107/ml | 稀稠 | 3/10ml |
C | 0.5-1×108/ml | 稠 | 4.5/10ml |
D | 3.5-7×108/ml | 粘稠 | 6/10ml |
研究试验结果表明D培养基明显优于其它3种培养基,分别在B和D培养基中加入特殊酵母硒粉均显现有利于银耳孢子发酵物的产生。
发明人最终综合各种因素考虑选择C培养基作为种子培养基,D培养基作为发酵培养基。
实施例2银耳孢子发酵液的制备
1、种子罐生长培养:
从生长良好的银耳孢子接种于上述C培养基灭菌的种子罐中,25℃±1℃生长培养7天,即为银耳孢子培养液。
2、发酵罐生长培养
A、培养基制备同上述D培养基制备方法。
B、取上述培养良好的银耳孢子培养液3%-5%接种量,接种于发酵罐容器中,通气流量1∶1,转速150-200rpm,25℃±1℃培养6-8天。取样后,银耳孢子经计数达到3×108-6×108/ml,停止发酵生长,即为银耳孢子发酵液。
实施例3银耳孢子发酵物生物活性饲料添加剂产品的制备
将上述银耳孢子3×108-6×108/ml发酵液5kg加1kg麦麸比例混合,≤65℃烘箱中烘干,将烘干物粉碎,过筛,即为最终银耳孢子发酵物生物活性饲料添加剂干粉产品。
添加剂干粉产品的组成
添加剂干粉,水分≤10%
每克添加剂干粉含银耳孢子数13×108-26×108/g
添加剂干粉银耳孢子发酵物占12±1%
添加剂干粉辅料麦麸占78±1%。
实施例4银耳孢子发酵物在断奶仔猪上的适宜添加剂量及其对断奶仔猪生产性能和肠道菌群的影响。
试验动物:选用杜洛克×(长白×大白)三元杂交28日龄断奶仔猪40头。
银耳孢子发酵物分为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%4个处理组。
试验结果见表2、表3:
表2不同水平银耳孢子发酵物对断奶仔猪生产性能的影响
肩注不同小写字母表示差异显著(P≤0.05),肩注不同大写字母表示差异极显著(P≤0.01)。
表3银耳孢子发酵物对断奶仔猪肠道菌群的影响
肩注不同小写字母表示差异显著(P≤0.05),肩注不同大写字母表示差异极显著(P≤0.01)。
结论:
(1)随着银耳孢子发酵物添加剂量的增加,断奶仔猪生产性能得到改善,其中以0.4%剂量组最佳。
(2)以0.4%剂量组对断奶仔猪生产性能的分析,末重比对照组提高9.5%,全期日增重(ADG)比对照组提高16.74%,全期料肉比(F/G)比对照组下降7.65%。
(3)0.4%剂量组结肠中双歧杆菌数量显著高于对照组(P<0.05),盲肠中双岐杆菌极显著高于对照组(P<0.01)。
(4)乳酸杆菌数量在结肠中,0.4%试验组极显著高于对照组(P<0.01),盲肠中差异不显著(P>0.05)。
(5)大肠杆菌数量在结肠中,试验组极显著低于对照组(P<0.01),盲肠中也显著低于对照组(P<0.05)。
银耳孢子发酵物促进了肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖,抑制有害菌大肠杆菌的繁殖。
实施例5银耳孢子发酵物对断奶仔猪免疫功能的影响。
试验动物:选择体重6.99±0.45kg,28日龄断奶仔猪的PIC去势仔猪24头,随机分成对照组,0.4%银耳孢子发酵物试验组,高铜加喹烯铜组,0.4%银耳孢子发酵物加高铜组。试验结果见表4、表5:
表4银耳孢子发酵物对胰岛素生长因子IGF-1影响
指标 | 对照组 | 0.4%银耳孢子发酵物 | 高铜加喹烯铜 | 0.4%银耳孢子发酵物加高铜 |
IGF-1浓度(ng/ml) | 4.29±0.37Ab | 8.13±0.81Bb | 5.87±0.58ACa | 7.83±0.58BCb |
表5银耳孢子发酵物对断奶仔猪T细胞亚群及免疫功能的影响
组别 | 对照组 | 0.4%银耳孢子发酵物 | 高铜加喹烯铜 | 0.4%银耳孢子发酵物加高铜 |
CD4+% | 17.7±1.91Aa | 24.66±2.74Bb | 24.03±3.01Bb | 22.25±3.74ABb |
结论:
(1)0.4%银耳孢子发酵物组IGF-1浓度极显著高于对照组和高铜加喹烯铜组(P<0.01)。
(2)0.4%银耳孢子发酵物组与0.4%银耳孢子发酵物加高铜组之间,差异不显著(P>0.05),但IGF-1浓度前者比后者高3.7%。
(3)0.4%银耳孢子发酵物组和高铜加喹烯铜组CD4+值极显著高于对照组(P<0.01)
(4)0.4%银耳孢子发酵物加高铜组显著高于对照组(P<0.05)。
胰岛素生长因子IGF-1是动物体内主要的促生长因子,主要功能是促进各类细胞分化及细胞中DNA、RNA、蛋白质合成,银耳孢子发酵物能促进IGF-1的分泌,且促进作用优于高铜加喹烯铜。
T淋巴细胞是重要的免疫调节细胞,本结果银耳孢子发酵物能提高机体细胞免疫功能。
实施例6银耳孢子发酵物、恩拉霉素、硫酸抗敌素对生长育肥猪的影响
试验动物:选用40日龄DLY仔猪40头,随机分成对照组,恩拉霉素组,硫酸抗敌素组,恩拉霉素加硫酸抗敌素组,0.4%银耳孢子发酵物组,饲喂16周。试验结果见表6:
表6银耳孢子发酵物和抗生素对生长育肥猪生产性能的影响
组别 | 初重(kg) | 16周末重(kg) | 日增重(ADG)g | 采食量(ADF1)g | 料肉比周(F/G) |
对照组 | 9.87±0.74 | 77.42±2.21 | 603±18 | 1640±81 | 2.72±0.17 |
恩拉霉素组 | 9.98±0.63 | 83.75±6.71 | 659±62 | 1758±144 | 2.67±0.06 |
硫酸抗敌素组 | 9.97±0.59 | 72.04±6.15 | 554±55 | 1507±119 | 2.73±0.11 |
恩拉霉素加硫酸抗敌素组 | 9.97±0.64 | 81.19±5.96 | 636±51 | 1676±139 | 2.64±0.18 |
0.4%银耳孢子发酵物组 | 9.98±0.61 | 87.55±7.76 | 693±65 | 1804±175 | 2.60±0.08 |
结论:
(1)16周末重0.4%银耳孢子发酵物组可提高生长育肥猪的生产性能,且效果均优于对照组和各抗生素组。比对照组增重13.1%,日增重(ADG)14.9%,料肉比(F/G)下降4.4%。比抗生素组增重4.5%-21.5%,日增重(ADG)5.2%-25.1%,料肉比(F/G)下降1.5%-4.8%。
(2)银耳孢子发酵物可以取代动物饲料中的抗生素。
实施例7银耳孢子发酵物对奶牛产奶量的影响
为考察银耳孢子发酵物对奶牛产奶量的影响,共进行了三次试验,各试验前10天计量每头奶牛10天产奶量后,分成对照组和试验组,试验组每天每头喂饲500-600ml发酵原液(银耳孢子数3×108-6×108/ml)。试验1选用10头奶牛,饲喂31天;试验2选用12头奶牛,饲喂27天;试验3选用10头奶牛,饲喂34天。
试验结果见表7:
表7银耳孢子发酵物对奶牛产奶量的影响
结论:
银耳孢子发酵物生物活性添加剂应用于奶牛动物饲料中,能使奶牛增加奶产量,平均每天能增奶0.5-1.0kg。
Claims (3)
1.一种银耳孢子发酵液的制备方法,其步骤如下:
1)银耳孢子的分离采集与保存
从人工栽培银耳子实体或自然界天然野生的银耳子实体中分离采集银耳孢子;银耳孢子接种于土豆汁琼脂斜面上,25℃±1℃培养7-10天后待用;
2)纯种银耳孢子的制备
取少许银耳孢子于1-2ml无菌生理盐水中,经适当稀释后涂布于载有土豆汁琼脂培养基的9厘米培养皿上,25℃±1℃培养,待肉眼在培养皿上能观察到小白点样菌落时,无菌取样,在显微镜下能观察到类似于酵母样的孢子细胞时,并接种于土豆汁琼脂斜面上,25℃±1℃培养7-10天后待用;
3)种子罐生长培养
将生长良好的银耳孢子接种于培养基为新鲜土豆100g/L,4%葡萄糖,0.3%玉米浆,0.05%磷酸盐,pH自然的灭菌的种子罐中,25℃±1℃生长培养3-4天,即为银耳孢子培养液;
4)发酵罐生长培养
发酵培养基的制备:新鲜土豆100g/L,4%葡萄糖,0.3%玉米浆,1%酵母硒粉,0.05%磷酸盐,pH自然;取上述培养良好的银耳孢子培养液3%-5%接种量,接种于发酵罐容器中,通气流量1∶1,转速150-200rpm,25℃±1℃培养6-8天;取样后,银耳孢子经计数达到3×108-6×108/ml,停止发酵生长,即为银耳孢子发酵液。
2.一种银耳孢子发酵物生物活性饲料添加剂,其特征在于由权利要求1方法所得的银耳孢子发酵液按麦麸:银耳孢子发酵液重量比1∶5比例混合,≤65℃烘干制备获得银耳孢子发酵物生物活性饲料添加剂产品,每克添加剂干粉含银耳孢子数13×108-26×108/克,添加剂干粉银耳孢子发酵物占12±1%。
3.如权利要求2所述的生物活性饲料添加剂,其特征在于银耳孢子发酵物生物活性饲料添加剂可广泛应用于猪、奶牛的饲料中喂饲,并能够取代动物饲料中的抗生素。
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