CN103756916A - 一种地顶孢霉诱变株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种地顶孢霉诱变株及其应用。该地顶孢霉诱变株（MKL18）的保藏编号为CCTCC No.M2013654，所述应用是其在制备饲料添加剂、药品、保健品中的应用。本发明通过紫外诱变筛选获得地顶孢霉MKL18，其菌丝体提取物具有体外抗肿瘤活性以及增强动物体内免疫活性的功能，可用于药品和保健食品的制备；地顶孢霉MKL18经过液固二相发酵，其发酵产物经干燥、粉碎后可直接作为饲料添加剂，该饲料添加剂不仅显著提高断奶仔猪的生产性能，而且显著改善断奶仔猪的健康状况。

Description

一种地顶孢霉诱变株及其应用

技术领域

本发明属于微生物种质资源利用技术领域，具体涉及一种地顶孢霉诱变株及其应用。 

背景技术

虫草是真菌感染昆虫幼虫后形成的一种生物复合体，目前全世界发现的虫草有350余种，仅中国发现的就有70余种。其中最为著名的冬虫夏草长期以来被视为珍贵中药，科学研究也证实冬虫夏草中含有多种药理活性成分。 

在虫草及相关真菌的次生代谢产物中，腺苷、甾醇和多糖等成分与冬虫夏草的许多药理活性有关。其中，腺苷有多种生物活性，包括镇静、扩张血管和抗缺氧等作用；腺嘌呤还有促进造血功能；脱氧核苷一般有抗肿瘤、抗菌等作用。从虫草中分离得到的多种麦角甾醇化合物中，有些具抗肿瘤活性；有些麦角甾醇氧化物还有免疫抑制、抗动脉硬化和抗菌等活性；有些能抑制由PAF诱导的兔血小板的聚集，并影响到细胞形态的变化和细胞因子的表达，被认为能增强肺功能，具有预防和治疗哮喘病的作用；还有一些麦角甾醇具有维生素D还原作用及降胆固醇作用；甾类化合物还有抗炎免疫等多种活性。真菌多糖则被认为能够刺激免疫，并在临床上已经广泛应用（胡丰林、李增智，菌物学报2007,26:607）。一些药用真菌中还能合成具备直接抗肿瘤活性的功能蛋白（梁一、白娟Medical Diagnosis,2012，2（2）：12）。 

利用深层发酵技术生产有用的生物活性物质，是虫草真菌开发利用的趋势和热点（汤亚杰、钟建江，华东理工大学学报，2001,27:704；杨海龙、陈高洪等，中国中药杂志，2005,30:1717）。但野生虫草资源极其稀有，而人工栽培则因条件模拟非常困难而难以开展。分离纯化虫草真菌，利用深层发酵技术获取大量菌丝体并加以利用，却完全可行。 

目前分离鉴定的虫草真菌，大多在实验室条件下生长缓慢，培养周期 长，而且其菌丝体中营养物质和功能活性物质的含量也较低。与其他虫草真菌相比，地顶孢霉（Acremonium terricola）则不要求严格的高营养条件，而且生长快、虫体外培养和发酵周期均较短，因而成为众多科研工作者的热门研究对象。 

公开号为CN1091150C的中国专利文献公开了一种地顶孢霉及分离培养方法和发酵工艺方法，该地顶孢霉的保藏编号为CGMCC No.0346，其发酵工艺方法为常规的真菌发酵工艺，分为三步，（1）一级斜面菌种培养，（2）液体种子培养，（3）发酵罐培养。利用这种发酵工艺获得的地顶孢霉培养物具有多种生物学功能，中国文献（魏建忠等，地顶孢霉培养物对保育仔猪生产性能及免疫水平的影响，动物营养与饲料科学，2009,36（2）：33-35.）公开了地顶孢霉培养物能够提高保育仔猪的生产性能及免疫水平。 

但目前发现的地顶孢霉菌株，其次级代谢产物腺苷、甾醇和营养物质粗蛋白、多糖等含量均不高，限制了对地顶孢霉的进一步利用。 

发明内容

本发明公开了一种地顶孢霉诱变株，该地顶孢霉菌诱变株是经紫外诱变并筛选获得的，与野生出发菌株相比，具备明显的生长优势，其菌丝体中营养物质及生物活性物质的含量大大提高。 

一种地顶孢霉诱变株，分类命名为地顶孢霉（Acremonium terricola），株号为MKL18，已于2013年12月12日保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2013654。 

MKL18菌株是经紫外诱变并筛选获得的诱变株，该诱变株在PDA培养基上培养7天时，菌落呈圆形，紧实，直径13～18mm，顶部粉状，边缘整齐，菌落正面呈白色，背面由外至内呈淡黄至棕色；菌丝无色光滑，具隔膜，直径1.0-2.0微米；孢子梗顶生或侧生于营养菌丝，单生或束生，呈长锥形，基部收缩，有隔，中部微膨胀，顶尖锐，长6至20微米；分生孢子成链状，表面光滑，圆形至卵圆形，2.0至3.5微米。 

与出发菌株相比，MKL18菌株表现出明显的生长优势，具体表现为，在PDA平板上培养，产孢时间提前1至2天，在察氏培养基中摇瓶发酵， 生物量提高32%；菌丝体中腺苷、麦角甾醇、粗蛋白和多糖的含量，则分别提高12%（腺苷）、42%（麦角甾醇）、8%（粗蛋白）和35%（多糖）；并且这些特性都能随菌株增殖而稳定遗传。 

本发明还提供了所述的地顶孢霉在制备饲料添加剂中的应用，包括以下步骤： 

（1）将所述地顶孢霉接种到种子培养液中进行增殖培养，获得种子液； 

4℃保藏的MKL18菌株，接种于PDA斜面，于25～28℃下培养6～8天；斜面菌落转接至种子培养液中，于25～28℃、120～150rpm下震荡培养4～5天；为获得菌体生长状态更佳的种子液，可以按8～10%接种量将培养液再转接一次，在相同条件下震荡培养2～3天，获得种子液。 

所述种子培养液可选用液体察氏培养基。 

（2）将所述种子液转接到发酵培养液中进行液体发酵，获得发酵液； 

所述种子液的接种量优选为1～3%；发酵培养液的配方可选用：白糖2.0%，酵母粉1.0%，蚕蛹蛋白粉2.0%，其余为水，pH自然。液体发酵在发酵罐中进行，液体发酵的条件优选为：温度25～28℃，每分钟通气量为1:0.4～0.6（发酵培养液体积：通入的空气体积），时间45～50小时；更优选为：温度26℃，每分钟通气量1:0.5，时间48小时。在该发酵条件下，可以获得含有大量菌丝体的发酵液。 

所述发酵液可以直接接种到固体基质中进行固体发酵，也可以作为种子液在转接到发酵培养液中进行10倍体积的扩大发酵。发酵条件与上述相同，扩大发酵过程中，因为接种量增大为10%，因此可以相应缩短发酵时间至36小时。 

（3）将所述发酵液与固体基质混合均匀，调节混合物的含水量至75～80%后进行固体发酵，将固体发酵产物烘干、粉碎，获得所述饲料添加剂。 

本发明中，固体基质由以下成分组成：30-45%玉米粉、30-45%麸皮和10-30%豆粕，更优选为40%玉米粉、40%麸皮和20%豆粕。 

将液体发酵获得的发酵液通过无菌管道输送至万级洁净车间内，与洁净车间内经蒸汽灭菌的固体基质混合，发酵液与固体基质的混合比例优选 为1L：8～10kg，更优选为1L:10kg；使混合物的含水量保持在75～80%，为混合物中菌丝体的生长和增殖提供良好的水分条件。 

含水量调节完成后，将混合物均匀摊薄至5～10cm的疏松薄层后再进行固体发酵，适宜的厚度可以保证混合物良好的通气条件，为混合物中菌丝体的生长和增殖提供良好的氧气。 

作为优选，所述固体发酵的条件为：温度25～28℃，湿度75～80%，时间5～7天；作为进一步优选，所述固体发酵的条件为：温度26℃，湿度80%，时间5天。发酵期间，根据需要间歇喷射无菌水雾至混合物上，保持混合物含水量，并以混合物表面和间隙完全被白色紧实菌丝充满为发酵终点。获得的固体发酵产物于50至60℃烘干并粉碎，必要时过筛，即获得所述饲料添加剂。 

本发明还提供了一种利用所述地顶孢霉诱变株通过上述的液固二相发酵获得的饲料添加剂。该饲料添加剂中，腺苷含量高于350mg/kg，麦角甾醇含量高于550mg/kg，粗蛋白高于20%，水分低于8%，重金属含量也都符合饲料添加剂的相关法定指标的要求。经烘干粉碎过筛后的成品添加剂，色泽好，气味佳。 

本发明还提供了所述饲料添加剂在制备猪饲料中的应用。在猪基础日粮中添加0.25～0.75%的饲料添加剂，获得所述猪饲料。作为优选，在猪基础日粮中添加0.5～0.75%的饲料添加剂，获得所述猪饲料。 

按0.25%、0.5%、0.75%的比例将本发明所制备的饲料添加剂添加到断奶仔猪的日料中，断奶仔猪的日增重分别提高了18.51%、22.22%和29.6%，采食量分别提高了6.02%、9.63%和7.22%，料肉比分别降低了10.40%、10.09%和17.2%；死淘率分别降低了66.67%、66.67%和100%，腹泻指数分别降低了58.82%、47.06%、76.47%。 

本发明还提供了所述地顶孢霉诱变株在制备药品、保健品中的应用。地顶孢霉是一种虫草真菌，能够合成多种药理活性物质，菌丝体和发酵液可以用于提取分离药理活性成分，经测试，这些药理活性成分具有体外抗肿瘤活性以及增强动物体内免疫活性的功能，因此可用于药品和保健食品的制备。 

与现有技术相比，本发明的有益效果为： 

（1）本发明通过紫外诱变筛选获得地顶孢霉诱变株MKL18，该诱变株在保有出发菌株原有性状的同时，菌丝体中腺苷、麦角甾醇、粗蛋白和多糖的含量，则分别提高12%（腺苷）、42%（麦角甾醇）、8%（粗蛋白）和35%（多糖）；并且这些特性都能随菌株增殖而稳定遗传，可用于发酵制备品质更好的饲料添加剂； 

（2）本发明利用液固二相发酵技术对地顶孢霉MKL18进行发酵，固体发酵产物经干燥、粉碎后可以直接作为饲料添加剂，其色泽、气味都非常适合动物进食； 

（3）将添加有本发明饲料添加剂的猪饲料饲喂断奶仔猪时，不仅显著提高断奶仔猪的生产性能，而且显著改善断奶仔猪的健康状况。 

附图说明

图1a为本发明地顶孢霉MKL18在PDA平板上生长的菌落形态图（正面）； 

图1b为本发明地顶孢霉MKL18在PDA平板上生长的菌落形态图（背面）； 

图2为本发明地顶孢霉MKL18的菌丝和孢子的显微形态图。 

具体实施方式

实施例1诱变筛选获得地顶孢霉诱变株 

1出发菌株分离 

（1）虫草采集 

虫草采自安徽省岳西县温泉镇三公尖，带有新鲜子座。经鉴定，为一种古尼虫草小孢变种（Cordyceps gunnii var.minor）。 

（2）虫草真菌的分离纯化和鉴定 

在无菌条件下，将新鲜的虫草子座用无菌水彻底冲洗，然后用0.5%氯胺T浸泡15min，再用无菌水彻底冲洗；用无菌手术刀将虫草子座小心纵向切开成4瓣，分置于4个铺有SDAY培养基的平皿；20℃培养两周左右，直至长出肉眼可见菌落；用接种针将菌落菌丝挑出转接至另一块新鲜SADY平板，20℃培养一周左右长出纯化的单一菌落；挑取纯化的菌落转 接至PDA培养基上连续传代5次以上；观察其菌落形态和生长周期，稳定后，将纯化菌种分置于液氮和4℃保存。 

经鉴定，所分离纯化的真菌为地顶孢霉（Acremonium terricola），属于半知菌类、丛梗孢目、丛梗孢科。 

SDAY培养基配方：葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，琼脂18g，水1000ml； 

PDA培养基：200g马铃薯（煮沸浸出液），葡萄糖20g，琼脂18g，水1000ml。 

2紫外诱变 

（1）原生质体制备 

取4℃保藏的地顶孢霉菌种，接种于PDA斜面，26℃培养7天；斜面菌落转接至装有200ml的液体察氏培养基的1000ml三角瓶中，26℃、125r/min震荡培养4天；按10%接种量将培养液再转接一次，在相同条件下震荡培养4～5天。 

无菌条件下，3000r/min离心10min，去上清收集菌丝，菌丝用过滤除菌的0.6M甘露醇溶液（11%）洗涤两次，将菌丝按1:20（g/ml）的比例加到4ml酶解液中，于35℃酶解3小时；酶解完成后，用两层无菌擦镜纸过滤酶解产物，收集原生质体，血球计数板计数，约为1.5×10⁸个/ml。 

液体察氏培养基配方：NaNO₃0.2%，K₂HPO₄0.2%，KCl0.5%，MgSO₄0.4%，FeSO₄0.001%，蔗糖2%，其余为水； 

酶解液配方：蜗牛酶0.5%，纤维素酶0.3%，0.6M甘露醇，过滤除菌。 

（2）紫外诱变和原生质体再生 

将制备好的原生质体用0.6M甘露醇溶液稀释成浓度为10⁶个/ml原生质体溶液，取3ml原生质体溶液加入至9cm无菌培养皿，40W紫外灯距离45cm，辐射30秒。预实验结果显示在此辐射条件下，原生质体再生率约为0.01%，致死率98%以上。 

原生质体再生率和致死率的计算公式为： 

原生质体再生率（%）=再生菌落数/原生质体总数×100； 

致死率（%）=（Z-z）/Z×100； 

其中，Z为未经紫外辐射的原生质体再生率，z为经一定时间紫外辐 射后的原生质体再生率。 

取经过辐射的原生质体溶液0.1ml，均匀轻柔涂布于再生培养基表面，置于24℃条件下培养至长出肉眼可见菌落。 

再生培养基配方：在1000ml PDA培养基中加入：蛋白胨10g、K₂HPO₄1.0g，MgSO₄1.0g，ZnSO₄1.0g，0.5M甘露醇。 

与未经过辐射诱变的再生菌落相比较，挑取生长更旺盛、菌落直径更大的30个诱变后的再生菌落，分别编号并接种于PDA斜面，26℃培养5天。 

3优势诱变株的筛选 

（1）生物量比较 

将上述30个PDA斜面培养5天的诱变再生菌落，转接至200ml液体察氏培养基中，26℃、125r/min震荡培养4天，3000r/min离心10min收集菌丝，水洗3次后冷冻干燥，称量菌丝干重（干菌丝可用于下述（2）至（5）项的测定）。每个菌落编号设置6个重复，取干重均值，同时设立出发菌株为对照，比较结果如表1所示。 

（2）菌丝体中腺苷含量比较 

参照《中华人民共和国药典》第一部2010年版冬虫夏草项下的方法进行。 

干菌丝经粉碎、过筛后，精确称取0.2g，利用10ml90%甲醇超声提取（250W、33KHz、超声3秒间歇3秒，持续超声1小时），提取液经10000r/min离心15min后，过0.22μm滤膜，供高效液相色谱测定用。 

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.01mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇（85:15）为流动相，检测波长为260nm，理论塔板数应达到2600。 

腺苷标准溶液：准确称量腺苷标准品（Sigma公司，纯度99%），加入0.01mol/L磷酸钠溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含20μg腺苷的腺苷标准溶液。 

按外标法以峰面积计算样品提取液中的腺苷浓度，并计算每克干菌丝中的腺苷含量。结果如表1所示。 

（3）菌丝体中麦角甾醇含量比较 

参照《中华人民共和国药典》第一部2010年版冬虫夏草项下的方法进行。 

干菌丝经粉碎、过筛后，精确称取0.2g，利用50ml100%甲醇超声提取（400W、40KHz、连续超声1小时），提取液10000r/min离心15min后，过0.22μm滤膜，供高效液相色谱测定用。 

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，100%甲醇为流动相，检测波长为283nm，理论塔板数应达到6000。 

麦角甾醇标准溶液：精确称量麦角甾醇（Sigma公司，纯度99%），用甲醇溶解后稀释至每1ml中约含20μg麦角甾醇的麦角甾醇标准溶液溶液。 

按外标法以峰面积计算样品提取液腺苷浓度，并计算每克干菌丝腺苷含量。结果如表1所示。 

（4）菌丝体中粗蛋白含量比较 

在全自动凯氏定氮仪（VS-KT-P）上采用微量凯式定氮法测定。 

精密称取0.5g干菌丝于消化管中，加入6ml的硫酸，浸泡2小时后，加入硫酸铜1g、硫酸钾2g。将消化管置于消化器上，150℃消化半小时，继之400℃消化至溶液呈天清亮蓝绿色（大约1小时）。消化液冷却后，置于自动定氮仪上蒸馏、滴定。结果如表1所示。 

（5）菌丝体中多糖含量比较 

采用苯酚-硫酸法测定。 

葡萄糖标准曲线：准确称取干燥至恒质量的分析纯葡萄糖200mg于100ml容量瓶中，定容，获得母液；吸取1ml母液于50ml容量瓶中，定容，获得稀释液；分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml稀释液于具塞试管，以水补至2.0ml，加入6%苯酚1.0ml并迅速加浓硫酸5.0ml，静置10min，摇匀，沸水浴加热15min，室温放置20min后在波长490nm处测吸光度；以2.0ml水为空白对照。以多糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并计算直线回归方程。 

干菌丝粉碎后过筛，精确称取0.2g于50ml容量瓶中，加水定容，混匀；然后从中吸取1ml于50ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，获得样品溶液备用。精密吸取样品溶液1ml，补水至2ml，按标准曲线制作方法， 在波长490nm处测定其吸光度，根据标准曲线回归方程计算样品溶液中的多糖含量。计算结果如表1所示。 

表1：诱变菌株各项指标的变化比较（n=6） 

由表1可见，挑取的30株地顶孢霉诱变株中，生物量最高的为13号（比野生出发菌株提高43.1%），腺苷含量最高的为26号（比野生出发菌株提高20.9%），麦角甾醇含量最高的为18号（比野生出发菌株提高42.0%），粗蛋白含量最高的为19号（比野生出发菌株提高14.7%），多糖含量最该的为23号（比野生出发菌株提高54.1%）。 

但是综合各项指标，18号诱变株为本发明的优势菌株，较之野生出发菌株，其生物量提高32.2%，腺苷含量提高11.6%，麦角甾醇含量提高42.0%，粗蛋白含量提高8.0%，多糖含量提高35.4%。另外，在PDA平板上培养，18号诱变株在第5-6天即开始形成分生孢子，较之于出发菌提前1至2天。 

因此，本发明将18号优选突变菌株命名为地顶孢霉诱变株（Acremonium terricola MKL18）。 

4诱变株MKL18性状观察和稳定性考察 

（1）性状观察 

由图1a、图1b可见，将地顶孢霉诱变株（Acremonium terricola MKL18）转接至PDA培养基上培养7天时，菌落呈圆形，紧实，直径13～18毫米，顶部粉状，边缘整齐，菌落正面呈白色，背面由外至内呈淡黄至棕色；菌丝无色光滑，具隔膜，直径1.0-2.0微米； 

由图2可见，孢子梗顶生或侧生于营养菌丝，单生或束生，呈长锥形，基部收缩，有隔，中部微膨胀，顶尖锐，长6至20微米；分生孢子成链状，表面光滑，圆形至卵圆形，2.0至3.5微米。 

（2）稳定性考察 

将诱变株MKL18在PDA斜面连续传代20代，每代次培养时间4天。 

取第1代、第5代、第10代、第15代和第20代菌种，同时再经PDA斜面活化后，转接种至200ml液体察氏培养基（1000ml三角瓶中），26℃、 125r/min震荡培养天；按10%接种量将培养液再转接一次，在相同条件下震荡培养4天。 

按照与上述第3项下描述的方法，进行生物量和腺苷、麦角甾醇、粗蛋白、多糖含量的测定。测定结果如表2所示。 

表2地顶孢霉诱变株MKL18稳定性考察（n=3） 

由表2可见，不同代次的地顶孢霉诱变株（Acremonium terricola MKL18）在同一条件下同时发酵，其生物量、腺苷、麦角甾醇、粗蛋白和多糖等生物学指标，均无显著变异。结果表明，在常规条件下传代保种，地顶孢霉诱变株（Acremonium terricola MKL18）是稳定的。 

实施例2利用地顶孢霉诱变株（Acremonium terricola MKL18）制备饲料添加剂 

1制备种子液 

取4℃保藏的地顶孢霉诱变株（Acremonium terricola MKL18），接种于PDA斜面，26℃培养7天；斜面菌落转接至装有200ml的液体察氏培养基的1000ml三角瓶中，26℃、125r/min震荡培养4天；按10%接种量将培养液再转接一次，在相同条件下震荡培养4～5天，获得种子液。 

2液体发酵 

在50L气升式发酵罐中，加入30L发酵培养液，并加入适量泡敌，115℃保温灭菌20分钟；待温度降至26℃，接入600ml种子液；保持罐内温度26℃，通气量15L/min，发酵48h放罐，得一级发酵液。 

一级发酵液可直接接种固体基质进行液固二相发酵，也可作为种子液 接种500L发酵罐进行扩大发酵。 

扩大发酵时，在500L发酵罐中，加入300L发酵培养液，并加入适量泡敌，115℃保温灭菌20分钟，待温度降至26℃，接入30L一级发酵液，保持温度26℃，通气量160L/min，发酵36h放罐，得二级发酵液。 

发酵培养液配方：白糖2.0%，酵母粉1.0%，蚕蛹蛋白粉2.0%，其余为水，pH自然。 

3固体发酵 

将二级发酵液通过无菌管道接种至位于万级洁净车间内、经过蒸汽灭菌的固体基质中，以1L：10kg混合均匀，调节混合物的含水量在75—80%之间，然后将混合物均匀摊薄为5至10cm疏松薄层。 

保持车间内温度为26℃，湿度80%，根据需要间歇喷射无菌水雾至固体发酵物上。以混合物表面和间隙完全被白色紧实菌丝充满为发酵终点，获得固体发酵产物。将固体发酵产物置于50至60℃烘干，粉碎、过筛后，获得饲料添加剂。 

4结果分析 

（1）以出发菌株为对照，利用步骤1～2的方法进行30L发酵（不进行液体扩大发酵和固体发酵），各自连续做三批次发酵，比较发酵获得的菌丝干重腺苷、麦角甾醇、粗蛋白、多糖的含量，比较结果见表3。 

表3：出发菌株和诱变株深层发酵产物的比较（n=3） 

注：a、b分别表示诱变株和出发菌株之间各发酵指标对比的差异显著性（P<0.05,P<0.01）。 

表3的结果显示，在同一发酵条件下，诱变株各种指标均显著优于出发菌株，其趋势和摇瓶培养条件下基本一致。 

（2）本实施例中固体基质组成为：玉米粉30-45%，麸皮30-45%，豆粕10-30%，由表4可见，不同的固体基质组成会对固体发酵发酵终点的到达时间有影响。 

表4不同固体基质组成对发酵的影响 

由此可见，以配方2进行固体发酵，仅需5天即可达到发酵终点，经烘干粉碎过筛后的成品添加剂，色泽好，气味佳，腺苷含量高于350mg/kg，麦角甾醇含量高于550mg/kg，粗蛋白高于20%，水分低于8%，重金属含量也都符合饲料添加剂的相关法定指标的要求。 

实施例3饲料添加剂对仔猪生长性能和健康状况的影响 

选取30日龄、体重（7.95±0.87kg）相近的健康杜-长-大三元杂交仔猪200头，公母各半，按大小、性别相近原则随机分成4组，每组50头； 

将实施例2利用诱变株发酵制备的饲料添加剂（配方2的固体基质）分别按0.25%、0.5%、0.75%的比例添加到基础日粮中，分别饲喂其中的3组仔猪，为试验组；直接以基础日粮饲喂其中的1组仔猪，为对照组。观察、记录试验组和对照组仔猪的生长性能和健康状况，结果分别见表5和表6。 

表5饲料添加剂对仔猪生长性能的影响 

注：a、b分别表示相同日龄内3个添加组与对照组之间生产性能指标对比的差异显著性（P<0.05,P<0.01）。 

由表5可以看出，试验期（30-69日龄）内本发明所制备的饲料添加 剂使肉猪日增重分别提高了18.51%、22.22%和29.6%，采食量分别提高了6.02%、9.63%和7.22%，料肉比分别降低了10.40%、10.09%和17.2%；日增重的提高和料肉比的降低，均达到差异显著水平。试验期（30-99日龄）内，基本延续了类似的促生长效果。 

表6饲料添加剂对仔猪健康状况的影响 

由表6结果可看出，本发明所制备的饲料添加剂可以改善断奶仔猪健康状况，与对照组相比，试验组仔猪的死淘率和腹泻率均明显下降。 

实施例4利用地顶孢霉诱变株（Acremonium terricola MKL18）菌丝体提取药理活性成分 

1药理活性成分的提取 

取冻干菌丝体，研磨粉碎，按1:20（g/ml）加入PBS溶液（20mM磷酸缓冲液，pH7.0，0.9%NaCl），冰浴超声（250W、33KHz、超声3秒间歇3秒，持续1小时），10000r/m离心15分钟。上清液加4倍体积无水乙醇，4℃沉淀过夜，10000r/m离心15分钟。沉淀冷冻干燥。精密定量称取提取物，用生理盐水复溶（0.9%NaCl），配制成1mg/ml的溶液，过内毒素去除预装柱（Thermo Science），0.22微米滤膜过滤除菌，备用。 

2菌丝提取物体外抗肿瘤活性 

1）细胞复苏和培养 

选择肝癌细胞（BEL-7402）、结肠癌细胞株（HT-29）、乳腺癌细胞株（MCF-7）、肺癌细胞（A549）、胃癌细胞株（SGC-7901）（安徽医科大学细胞教研室提供）为研究对象，从超低温冰箱中取冻存的肿瘤细胞，迅速投入预先加热到37℃的灭菌水中，待冻存液溶化后，2000r/min离心3min，收集细胞。然后以含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃、5%CO₂培养箱中培养。RPMI1640培养基和小牛血清均为Hyclone产品。 

2）细胞生长抑制试验 

贴壁80%以上、生长旺盛的细胞用胰酶消化液（含0.02%EDTA）消化，以1×10⁴个细胞每孔接种于96孔板中。待96孔板中的细胞长满单层后，弃掉培养液； 

对照组加100μl无血清的培养液，阳性对照组加入含有5μg/ml顺铂（齐鲁制药产品，10mg注射用冻干制剂）的无血清培养液，其他实验组每孔分别加入含2μg/ml（低剂量组）、10μg/ml（中剂量组）、50μg/ml（高剂量组）菌丝体提取物的无血清培养液100μl，每个药物浓度设5个复孔； 

然后细胞在37℃、5%CO₂培养箱中培养24h； 

每孔加入5mg/ml MTT（噻唑蓝）水溶液10μl于培养箱内避光继续培养4h。然后吸去培养液，加入100μl DMSO，轻微震荡30秒，用酶标仪于492nm测定OD值，计算细胞存活率： 

细胞存活率（%）＝（实验组组或阳性对照组A490/对照组A490）×100%。实验结果见表3。 

表7菌丝体提取物对肿瘤细胞的生长抑制作用(n=5) 

由表7可见，菌丝提取物和顺铂对结肠癌细胞株（HT-29）均无明显抑制作用；对于另外三种肿瘤细胞，菌丝体提取物均显示有生长抑制作用，且呈现了一定剂量依赖性，其中对于肺癌细胞（A549）中高剂量菌丝体提取物的抑制效果优于阳性对照顺铂组。结果提示本发明提供的地顶孢霉诱变株发酵菌丝提取物具有一定的体外抗肿瘤活性，能用于抗肿瘤药物的制备。 

3菌丝提取物的免疫活性 

取上述菌丝体提取液，用注射用生理盐水稀释配制成20、40、80μg/ml的溶液。取体重18～20g的C57小鼠（上海西普尔—必凯实验动物有限公司，SCXK（沪）2003-0002），雌雄各半，随机分组和对照组，每组10只。 低、中、高剂量给药组每只动物隔日大腿内侧肌肉注射20、40、80μg/ml的菌丝体提取液0.5ml，对照组隔日注射生理盐水，共注射7次。注射完成后两周，逐组处死动物，摘取脾脏，取脾细胞，测定相关免疫学指标。 

具体步骤如下： 

1）分离的小鼠脾脏，100目金属网研磨，得到单细胞悬液，1500rmp离心去上清，红细胞裂解液（Yeasen，USA）裂解，用PBS洗涤两遍，调整细胞浓度为10⁷/ml，培养于完全RPMI1640（Hyclone）培养基中。 

2）加入刺激剂PMA(佛波酯)，离子霉素（Ionomycin）以及蛋白转运抑制剂莫能霉素（Monensin）至终浓度分别为30ng/ml、1μg/ml、1.7μg/ml。37℃CO₂刺激培养4小时。 

3）收获细胞于EP管中，100μl/管，PBS缓冲液洗两遍，小鼠脾细胞重悬于100μl PBS缓冲液中并加入新鲜大鼠血清或者大鼠IgG放置30min以封闭细胞表面Fc段受体，然后加入抗-CD₃，-CD₄，-CD₈，-NK1.1，-γδ的抗体，4℃，避光染色30min，用PBA洗三次，加入100μl固定液，4℃，避光固定30min。 

4）用穿膜液洗一次，重悬于100μl穿膜液中，加入新鲜大鼠血清或者大鼠IgG放置封闭30min后，分别加入PE标记抗胞内因子抗体（抗-IL-4和-IFNγ），染色1小时。穿膜液和PBS各洗一遍后重悬于PBA中，用流式细胞仪检测。 

上述个步骤中所用的各种抗体和标记物等试剂，均为美国Santa Cruz公司产品。免疫学指标测定结果如表3所示。 

表8菌丝提取物对小鼠免疫学指标的影响（n=10） 

注：a、b分别表示与对照组相比各免疫学指标的差异显著性（P<0.05,P<0.01） 

表8结果显示：连续7次隔日注射菌丝体提取物，高剂量组CD3细 胞比例显著增加，CD4和γδT细胞比例则在各个剂量组都显著增加，其中CD4IFNγ也均显著升高，CD4IL-4在中高剂量组显著降低；NK和NKT细胞则没有明显变化。 

结果表明，地顶孢霉突变株发酵菌丝体提取物，能刺激CD4细胞的增殖，促进其分泌IFNγ、抑制IL4合成，调整Th1/Th2平衡，进而显著改善小鼠的适应型细胞介导的免疫功能。提示本发明提供的地顶孢霉诱变株的菌丝体提取物，具备免疫促进活性，可用于药物或者保健食品的制备。 

Claims (10)

1.一种地顶孢霉诱变株，其特征在于，命名为地顶孢霉MKL18（Acremonium terricola MKL18），保藏编号为CCTCC No.M2013654。

2.如权利要求1所述的地顶孢霉诱变株在制备饲料添加剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将所述地顶孢霉接种到种子培养液中进行增殖培养，获得种子液；

（2）将所述种子液转接到发酵培养液中进行液体发酵，获得发酵液；

（3）将所述发酵液与固体基质混合均匀，调节混合物的含水量至75～80%后进行固体发酵，将固体发酵产物烘干、粉碎，获得所述饲料添加剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述液体发酵的条件为：温度25～28℃，每分钟通气量为1:0.4～0.6，时间30～50小时。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述固体基质由以下成分组成：30-45%玉米粉、30-45%麸皮和10-30%豆粕。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，发酵液与固体基质的混合比例为1L：8～10kg。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，调节含水量后，将混合物均匀摊薄至5～10cm的疏松薄层后再进行固体发酵。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述固体发酵的条件为：温度25～28℃，湿度75～80%，时间5～7天。

9.利用如权利要求1所述的地顶孢霉诱变株进行液固二相发酵获得的饲料添加剂。

10.如权利要求1所述的地顶孢霉诱变株在制备药品、保健品中的应用。

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