CN105505798B

CN105505798B - 一种产麦角甾醇内生真菌及其应用

Info

Publication number: CN105505798B
Application number: CN201610027044.2A
Authority: CN
Inventors: 郑承剑; 秦路平; 李秀清; 韩婷; 辛海量; 张巧艳; 蒋益萍
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2016-01-15
Filing date: 2016-01-15
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2036-01-15
Also published as: CN105505798A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体是一种内生真菌在制备麦角甾醇中的应用，所述的内生真菌是从唇形科鼠尾草属植物丹参植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，分类命名为球状茎点霉D14(Phoma glomerata)，保藏编号为CGMCC No.11305。本发明通过内生真菌菌株液体发酵，产生了麦角甾醇。本发明的丹参内生真菌是寻找麦角甾醇新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。

Description

一种产麦角甾醇内生真菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，是一种产麦角甾醇的内生真菌及其应用。

背景技术

维生素D2是哺乳动物生长发育所必需的脂溶性维生素，其主要生理功能是调节体内钙磷代谢。在医药工业上，维生素D2是预防和治疗佝偻病、龋齿及老年骨质疏松症的重要药品。麦角甾醇存在于酵母和一些植物中，是脂溶性维生素D2的前体，在紫外线照射下，转化为维生素D2。从酵母细胞中提取麦角甾醇，然后用紫外线照射是生产维生素D2的主要方法。此外，麦角甾醇还是一种重要的医药化工原料，可用于“可的松”、“黄体酮”等药物的生产。自从Tanret首次从麦角中分离到麦角甾醇以来，研究者们试图通过生物技术方法获得麦角甾醇，随后便开始了对其分离、测定和高产菌株选育等方面的研究。目前，国内外用于生产麦角甾醇的酵母菌种主要采用以下选育方法获得：

一是自然选育，对不同酵母菌种进行筛选，从中选出细胞麦角甾醇含量相对较高的菌种用于生产。

二是采用细胞杂交选育技术，将细胞麦角甾醇含量较高的酵母细胞与细胞生物量高的酵母细胞进行杂交，从杂交子代中筛选细胞生物量和细胞麦角甾醇含量都较高的杂交子代菌株。

三是采用诱变育种技术。由于常规的物理、化学等方法诱变随机性较大，麦角甾醇高产菌的筛选又无快速简便的初筛手段，且麦角甾醇含量测量非常费时，所以诱变育种的菌株选育工作量非常大。

四是原生质体融合技术。此方法可以突破杂交法的一些局限性，使具有不同优良性状的单倍体菌株进行融合，获得优于亲本的融合子。

中国发明专利ZL 200410032719.X公开了一株产麦角甾醇酵母工程菌及其选育方法与应用，是啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH－88CGMCC No.1117，其选育方法包括：1)以啤酒酵母染色体DNA为模板，进行PCR扩增，得到编码甾醇C－24(28)还原酶的ERG4基因；2)将PCR扩增得到的ERG4基因连接到载体质粒上，构建含有ERG4基因的重组质粒；3)用重组质粒转化酵母菌株，筛选转化子，获得高产麦角甾醇的酵母工程菌株。发明所提供的生产麦角甾醇的方法，是对产麦角甾醇啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH－88CGMCC No.1117进行发酵，获得麦角甾醇。发酵培养条件简单，成本低廉，麦角甾醇产量高，具有实用性强、操作简便等优点，易于普遍推广，具有广阔的实际应用前景。中国专利文献CN104694401A公开了一种麦角甾醇5,8过氧化物的生产用菌株，该菌株LPPV001为纯绿青霉Penicillium verrucosum，保藏号为CGMCC NO.4468，可以通过发酵产生麦角甾醇5,8过氧化物且产率极高，经简单提纯即可得到麦角甾醇5,8过氧化物纯净物。

但是关于一种能够通过微生物发酵产生麦角甾醇的丹参内生真菌及其应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够通过微生物发酵产生麦角甾醇的内生真菌及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种内生真菌，命名为球状茎点霉D14(Phomaglomerata)。

所述的内生真菌是从唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为球状茎点霉D14(Phoma glomerata)。该菌株已保藏，保藏号为CGMCC No.11305，保藏日期2015年09月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

本发明所述的内生真菌的固体培养特征为：

在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上28℃培养，生长缓慢，菌落圆形，平坦，最初为白色，渐变为边缘白色，中间灰褐色，绒状，边缘整齐，背面蓝黑色，见图1。

本发明所述的内生真菌的液体培养特征为：

(1)培养基PDB，摇瓶培养7天，培养温度28℃；

(2)发酵培养特征：

培养第1天有少许1-2mm白色菌丝球出现，培养液澄清；培养第2天，菌丝球数量变多，直径增大至3-4mm，培养液澄清；培养第3天，菌丝球明显增多，直径增大至5-6mm；培养第4天，菌丝球开始变黑，培养液也变黑；培养第5天，菌丝球已经明显全部变黑；培养第6天和第7天，菌丝球与第5天没有明显差别，见图2。

本发明所述的内生真菌形态特征为：培养的菌丝体无色、没有分枝，粗1.2-1.6um，平滑，由没有横隔，多核的菌丝体构成。

本发明所述的内生真菌的ITS和5.8S rDNA碱基序列如SEQ ID NO.1所示。将测序结果于NCBI网站进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。同球状茎点霉Phoma glomerata AY183371，同源性100％。

本发明的第二方面，提供上述内生真菌在制备麦角甾醇中的应用。

所述的麦角甾醇是采用所述的内生真菌通过液体发酵制备得到。

所述的液体发酵培养基是马铃薯液体培养基(PDB)，所述的液体发酵培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水

麦角甾醇，别名：麦角固醇，英文名：ergosterol，分子式：C₂₈H₄₄O，CAS：57-87-4，化学结构式如下：

本发明所述的内生真菌，经发酵可得麦角甾醇，其工艺步骤如下：

菌种活化→种子培养→发酵培养→发酵产物甲醇匀浆→超声提取→减压浓缩→HPLC分析→薄层制备分析→麦角甾醇。

其中，发酵原料为马铃薯液体培养基(PDB)，发酵方式为液体摇瓶培养；菌种活化采用平板固体培养基，培养基为PDA；种子培养为马铃薯液体培养基(PDB)；发酵培养基为马铃薯液体培养基(PDB)。培养时间：菌种平板培养活化72小时，种子液摇床培养72小时，发酵培养7天。培养温度：平板活化、种子摇床培养和发酵培养均为28℃。摇床转速：种子摇床培养和发酵培养均为180rpm。发酵物提取：发酵完毕，收集菌丝体，甲醇重悬，匀浆，超声提取，过滤，减压浓缩即得发酵物提取物，甲醇溶解，与标准品保留时间及紫外吸收光谱对照，明确该提取物含麦角甾醇，进一步采用外标一点法进行含量测定，确定提取物中麦角甾醇含量为10mg/g(1.0％)。同时，采用薄层制备法进行制备，经核磁波谱解析鉴定化合物结构为麦角甾醇。

本发明的第三方面，提供采用上述内生真菌经液体发酵制备麦角甾醇的方法，包括以下步骤：

(A)取本发明的内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；

(B)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDB种子培养基中，28℃下180rpm摇床培养72小时，得种子；

(C)配制好的PDB液体培养基，分装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用。无菌条件下，按照10％的接种量接种入种子，28℃下180rpm摇床培养7天；

(D)发酵完毕，收集培养物过滤后，将菌丝体悬于5倍体积的甲醇中匀浆5min，超声处理60min；而后过滤减压蒸干，甲醇复溶既得麦角甾醇。

本发明优点在于：

本发明所述的内生真菌，通过菌株液体发酵能够产生麦角甾醇，是寻找麦角甾醇新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。

生物材料样品的保藏信息：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年9月9日

保藏编号：CGMCC NO.11305

分类命名：球状茎点霉D14(Phoma glomerata)

附图说明

图1.本发明所述内生真菌在PDA平板培养基上的形态图。

图2.本发明所述内生真菌在PDA液体培养基中的形态图。

图3.本发明所述内生真菌菌丝体甲醇提取物(b)中麦角甾醇与标准品(a)HPLC比对图谱。

图4.本发明所述内生真菌菌丝体甲醇提取物(d)中麦角甾醇与标准品(c)的紫外吸收光谱比对图谱。

图5.本发明所述从内生真菌菌丝体甲醇提取物中制备得到的麦角甾醇化合物核磁波谱图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明的内生真菌为从陕西商洛丹参叶中得到的菌株。

本发明的内生真菌按以下步骤分离获得：自来水冲洗30min去净泥沙后，用去离子水洗3次。将叶片按以下程序进行表面消毒：75％乙醇，30s→1.3M次氯酸钠(3-5％有效氯)，1min→75％乙醇，30s→无菌去离子水洗3次。滤纸吸干残留水份后，用灭过菌的手术刀将叶片剪成1cm×1cm大小的组织块，置于含有100mg/L青霉素的PDA(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂，15g/L)培养基上28℃培养。每天观察样品真菌生长的情况。5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，并按形态合并，最终得到本发明的内生真菌菌株。其分类命名为球状茎点霉D14(Phoma glomerata)，保藏编号为CGMCC No.11305。

实施例2

(1)取本发明的内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基平板，于28℃活化培养72小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDB种子培养基中，28℃下180rpm摇床培养72小时，得种子；

(3)配制好的PDB液体培养基，分装入250ml的三角瓶中(每瓶约100ml)，灭菌处理，冷却备用。无菌条件下，按照10％的接种量接种入种子，28℃下180rpm摇床培养7天。

(4)发酵完毕，收集培养物过滤后，将菌丝体悬于5倍体积的甲醇中匀浆5min，超声处理60min；而后过滤减压蒸干，甲醇复溶即得麦角甾醇，产量为1.5mg/g细胞干重。

(5)HPLC色谱条件如下：色谱柱——ZOBAX-EXTEND-C18反相柱(250mm×4.6mm)，流动相——纯甲醇。等度洗脱——﹝时间(min)：(甲醇)﹞＝﹝25.00:100％﹞，流速——1mL/min，进样量——10uL，柱温——25℃，检测波长——283nm。

(6)薄层制备分析如下：展开剂为二氯甲烷：甲醇＝11:1，取600mg提取物溶解后点样，Rf＝0.7，在254nm处有荧光，得到4mg产物，然后经核磁波谱分析。

(7)经以上HPLC和核磁波谱分析，如图3、图4、图5所示，表明本发明的内生真菌菌种液体发酵能够产生麦角甾醇。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.一种内生真菌在制备麦角甾醇中的应用，其特征在于，所述的内生真菌的分类命名为球状茎点霉(Phoma glomerata)D14，保藏编号为CGMCC No.11305。

2.根据权利要求1所述的内生真菌在制备麦角甾醇中的应用，其特征在于，所述的麦角甾醇是采用所述的内生真菌通过液体发酵制备得到。

3.根据权利要求2所述的内生真菌在制备麦角甾醇中的应用，其特征在于，所述的液体发酵中使用的液体发酵培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水。

4.根据权利要求3所述的内生真菌在制备麦角甾醇中的应用，其特征在于，所述的麦角甾醇的制备方法包括以下步骤：

(A)取所述的内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体马铃薯培养基试管，于28℃活化培养72小时；

(B)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm摇床培养72小时，得种子；

(C)配制好所述的液体发酵培养基，分装入250ml的三角瓶中，每瓶100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10％的接种量接种入种子，28℃下180rpm摇床培养7天；

5.一种麦角甾醇的制备方法，其特征在于，所述的麦角甾醇是采用一种内生真菌通过液体发酵制备得到，所述的内生真菌的分类命名为球状茎点霉(Phoma glomerata)D14，保藏编号为CGMCC No.11305。