CN116836820B - 一株耐铀产酸黄曲霉菌及其应用 - Google Patents
一株耐铀产酸黄曲霉菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株耐铀产酸黄曲霉菌及其应用，该菌于2023年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC NO.40560。本发明还提供黄曲霉菌(Aspergillus flavus)ZJ‑6在制备用于淋洗铀污染土壤发酵修复液中的应用，发酵液能够有效的淋洗铀矿区场地土壤，生物安全性高，无污染，适合铀矿区土壤的修复。本发明为微生物淋滤技术修复实际铀矿区污染土壤的发展提供了良好的菌种资源。使用该微生物菌剂具有绿色环保、无农药残留的特点，生物安全性高，在使用后避免了致病菌产生抗药性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株耐铀产酸黄曲霉菌及其应用。
背景技术
随着社会工业化的发展，核能作为一种低碳清洁能源，已成为我国重要的能源之一。随着核能的迅速发展，加速了铀矿的开采和冶炼，导致了铀矿周边环境污染问题日益严重，尤其是对土壤环境的污染。生物修复法既经济实用又无二次污染，是修复污染土壤的重要途径。
在此形势下寻找一种低成本、绿色环保、效率高的修复技术尤为关键，而微生物淋滤技术兼具以上优点，可以对铀矿区周边污染土壤进行治理。生物淋滤技术的核心在于筛选出耐重金属的产酸菌株，然后利用菌株产生的有机酸与土壤中的重金属发生络合反应，使得土壤中的重金属从固相进入液相，最终达到修复土壤的目的。但是目前运用生物淋滤技术修复实际铀矿区污染土壤的研究较少。因此，获得适用矿区铀污染土壤的生物淋洗技术具有积极意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株耐铀产酸黄曲霉菌(Aspergillus flavus)ZJ-6，该菌于2023年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCCNO.40560。
本发明的黄曲霉菌(Aspergillus flavus)ZJ-6是从铀矿区污染土壤中分离筛选出来的，为好氧真菌，菌落直径达2cm～3cm，结构疏松，边缘不规则，由分支状菌丝组成，菌丝生长初期为白色短绒状，向四周平铺生长，生长后期菌落中央长出大量黄绿色孢子，基内菌丝具有分隔，深入培养基内部；气生菌丝长在培养基上方的空气中，其顶端形成长而粗糙的分生孢子梗，分生孢子梗顶端膨大形成椭圆形的顶囊，由顶囊向外辐射长出1-2层小梗，最上层小梗顶端生成成串的圆形分生孢子(如图1和图2所示)。
本发明通过ITS rDNA序列方法对菌株进行了分类鉴定，将所得菌株序列通过Genebank序列比对，利用MEGA6建立系统发育树，结果表明：所述黄曲霉菌株基因序列与菌株Aspergillus flavus最为接近，同源性达到100％(如图3所示)，确定属于黄曲霉菌属，将其命名为耐铀产酸黄曲霉菌(Aspergillus flavus)ZJ-6。
本发明的第二个目的是提供黄曲霉菌(Aspergillus flavus)ZJ-6在制备用于淋洗铀污染土壤发酵修复液中的应用，发酵液能够有效的淋洗铀矿区场地土壤，生物安全性高，无污染，适合铀矿区土壤的修复。
进一步的，所述用于淋洗铀污染土壤发酵修复液的制备方法，包括以下步骤：
1)制备马铃薯蔗糖琼脂培养基液体培养基，高温灭菌20-30min，备用；
2)在灭过菌的超净台内，以种量为2‰进行接种，用移液器取黄曲霉菌(Aspergillus flavus)ZJ-6母液加入到马铃薯蔗糖琼脂培养基液体培养基内，备用；
3)将步骤2)得到的接种后的培养基置于30℃的培养箱内培养72h，即得到用于淋洗铀污染土壤发酵修复液。
与现有技术相比，本发明有益效果如下：
本发明为微生物淋滤技术修复实际铀矿区污染土壤的发展提供了良好的菌种资源。使用该微生物菌剂具有绿色环保、无农药残留的特点，生物安全性高，在使用后避免了致病菌产生抗药性。
附图说明
图1为实施例1中黄曲霉菌ZJ-6在PSA培养基上培养3d后的菌落生长形态图；
图2为实施例1中黄曲霉菌ZJ-6菌株在光学显微镜下放大1000倍的孢子梗形态图；
图3为实施例1中黄曲霉菌ZJ-6系统发育树图；
图4为实施例2中黄曲霉菌ZJ-6的耐铀性能统计图；
图5为实施例2中黄曲霉菌ZJ-6pH值变化图；
图6为实施例2中黄曲霉菌ZJ-6发酵液在pH为4.35时有机酸色谱图；
图7为实施例4中黄曲霉菌ZJ-6在最佳产酸条件下的淋洗效果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：菌株的筛选与鉴定
1.菌株筛选
1)采集铀污染土壤样品，除去杂质、过100目筛、称取1g样品于紫外超净台备用；
2)无菌条件下，将1g样品移入装有99mL无菌水的三角瓶中，加入玻璃珠振荡使其均匀分散开，取1mL土壤悬液加入9mL无菌水内进行梯度稀释，以此类推，分别将土壤悬液样品稀释到10-2g/mL、10-3g/mL、10-4g/mL、10-5g/mL、10-6g/mL等不同浓度梯度的样品，备用；
3)马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)培养基:将新鲜的土豆去皮洗净后称取200g，然后切成小块，加入1000ml蒸馏水煮沸20～30min，用8层纱布过滤得到土豆浸汁；称取20g蔗糖、15～20g琼脂(固体培养基加琼脂，液体不加)，加入土豆浸汁中搅拌融化，最后加入蒸馏水补充至1000mL，充分溶解定容后于高温灭菌锅内121℃灭菌20min；
4)每个浓度样品取100μL涂布于马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)固体培养基上，每组浓度设置三个平行，并设置对照组；
5)置于30℃的恒温培养箱中倒置培养3-5d；
6)反复划线纯化直至得到单菌落；
7)置于4℃保藏备用。
2.菌株ZJ-6的生物学鉴定
本实施例通过ITS rDNA序列方法对菌株进行了分类鉴定。
1)提取本实施例中分离得到的菌株的DNA，扩增ITS rDNA的序列。ITS rDNA基因PCR扩增中所使用的引物委托杭州美迪贝生物科技有限公司合成，其序列为：
ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；
ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，扩增片段大小约500bp～1000bp；
2)扩增产物进行sanger双向测序，测序结果在Genebank上比对分析，利用MEGA6建立系统发育树，结果表明：所述黄曲霉菌株基因序列与菌株Aspergillus flavus最为接近，同源性达到100％(如图3所示)。
本实施例还结合形态学特征对所述黄曲霉菌株进行了分类鉴定。菌株ZJ-6在PSA培养基上培养3d后的菌落生长形态如图1所示。在光学显微镜下放大1000倍的孢子、孢子梗的形态如图2所示，呈现的形态学特征为：菌株生长迅速，菌落直径达2cm～3cm，结构疏松，边缘不规则，由分支状菌丝组成，菌丝生长初期为白色短绒状，向四周平铺生长，生长后期菌落中央长出大量黄绿色孢子，基内菌丝具有分隔，深入培养基内部；气生菌丝长在培养基上方的空气中，其顶端形成长而粗糙的分生孢子梗，分生孢子梗顶端膨大形成椭圆形的顶囊，由顶囊向外辐射长出1-2层小梗，最上层小梗顶端生成成串的圆形分生孢子。
结合菌株形态观察、培养特性及ITS rDNA的鉴定结果，将本发明所述黄曲霉菌命名为黄曲霉菌ZJ-6。
实施例2：黄曲霉菌ZJ-6的耐铀产酸活性
1.黄曲霉菌ZJ-6的耐铀活性
将PSA固体培养基经过121℃、20min高温灭菌后，分别加入不同体积的铀标准溶液(1g/L)，混合均匀后倒入平板得到0mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、125mg/L、150mg/L铀浓度的固体培养基，每个浓度设置三个平行样，当含重金属的平板凝固后，在平板中央接入真菌母液并且设置未接种真菌母液的培养基作为空白对照，将培养基置于恒温培养箱中，培养温度设为30℃，等到无铀培养基上菌落的直径不再变化时，采用十字交叉的方法测定不同铀浓度培养基上菌落的直径，通过抑制率来表示真菌对于铀的耐受程度。计算公式为：
抑制率＝(无铀培养基中菌落的直径-含铀培养基中菌落的直径)/无铀培养基中菌落的直径
黄曲霉菌ZJ-6在不同铀浓度固体培养基中所受到的抑制率如图4所示，随着铀浓度的不断上升，黄曲霉菌ZJ-6受到的抑制程度也在不断加深。当铀浓度为50mg/L时，对于黄曲霉菌ZJ-6的抑制程度为25.9％，当铀浓度为75mg/L和100mg/L时，对于黄曲霉菌ZJ-6的抑制程度分别为48.27％和67.18％，当铀浓度为125mg/L和150mg/L时，对于黄曲霉菌ZJ-6的抑制程度为87.16％和100％，此时抑制明显。
2.黄曲霉菌ZJ-6的产酸活性
向100ml PSA液体培养基中接种2‰的黄曲霉菌ZJ-6母液，培养基初始pH设置为7.0，然后置于恒温振荡培养箱中培养，转速设置为160rpm/min，培养温度设为30℃，每个样品设置3个平行，且设置空白对照，培养12h、24h、36h、48h、60h、72h取样并测定发酵液的pH。
黄曲霉菌ZJ-6发酵液pH的变化情况表明：黄曲霉菌ZJ-6在0-24h范围内pH保持稳定，24-60h范围内pH快速降低，60-84h范围内pH缓慢降低，84h以后pH保持稳定，黄曲霉ZJ-6在72h时pH降到最低为4.35(如图5所示)。说明黄曲霉菌ZJ-6在生长代谢过程中能够产生大量的有机酸，且黄曲霉菌ZJ-6能够快速适应酸性环境，不断代谢产生有机酸。
在最佳产酸条件下培养时，发酵液pH越低产生的有机酸种类越丰富，浓度越高。黄曲霉菌ZJ-6在培养72h后产生的有机酸浓度最高主要产生草酸(24.49μg/ml)、苹果酸(462.46μg/ml)、乳酸(14.60μg/ml)、柠檬酸(2493.42μg/ml)和琥珀酸(151.80μg/ml)(如图6所示)。
实施例3：黄曲霉菌ZJ-6发酵液的制备
1)制备马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)液体培养基1000mL，高温灭菌20-30min，备用；
2)在灭过菌的超净台内，用移液器取黄曲霉菌ZJ-6母液2mL加入到PSA液体培养基内，定容至1000mL(即以种量为2‰进行接种)，备用；
3)上述接种后的培养基置于30℃的培养箱内，培养72h，即为用于淋洗铀污染土壤发酵修复液。
实施例4：黄曲霉菌ZJ-6的生物淋洗效能
在30℃条件下，精确称量8.00g土样置于三角瓶中，固液比设置1g：10ml，加入黄曲霉菌ZJ-6发酵液，并置于恒温振荡培养箱中180rpm/min，30℃，淋洗0.17h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、36h，48h，60h，72h和84h取样，测定铀浓度，铀浓度测定之前将样品置于离心管中，利用高速冷冻离心机离心4000rpm/min，10min，取上清液加入5％稀硝酸酸化，过0.22um滤膜，利用ICP测定，每个样品设置三个平行样和空白对照。
结果表面，黄曲霉ZJ-6发酵液淋洗率随时间的变化情况表明：黄曲霉ZJ-6发酵液淋洗率在0-1h内的淋洗率呈直线上升趋势，在1-12h内土壤中铀的淋洗率上升趋势变缓，12h之后土壤中铀的淋洗率趋于平稳。黄曲霉ZJ-6发酵液的最大淋洗率依此为56.76％(如图7所示)，由此可以看出，黄曲霉ZJ-6发酵液具有淋洗铀污染土壤的作用，为之后深入探索铀污染土壤的修复研究提供重大意义。
Claims (3)
1.一株耐铀产酸黄曲霉菌(Aspergillus flavus)ZJ-6，其特征在于，黄曲霉菌(Aspergillus flavus)ZJ-6于2023年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 40560。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉菌(Aspergillus flavus)ZJ-6在制备用于淋洗铀污染土壤发酵修复液中的应用。
3.一种用于淋洗铀污染土壤发酵修复液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1) 制备马铃薯蔗糖琼脂培养基液体培养基，高温灭菌20-30min，备用；
2) 在灭过菌的超净台内，以种量为2‰进行接种，用移液器取权利要求1中所述的黄曲霉菌(Aspergillus flavus)ZJ-6的母液加入到马铃薯蔗糖琼脂培养基液体培养基内，备用；
3）将步骤2)得到的接种后的培养基置于30℃的培养箱内培养72h，即得到用于淋洗铀污染土壤发酵修复液。
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