CN105274013B

CN105274013B - 汉逊德巴利酵母及其在处理高浓度硫酸铵的工业废水中的应用

Info

Publication number: CN105274013B
Application number: CN201510823517.5A
Authority: CN
Inventors: 陈园; 杨博磊; 赵晨; 张晓琳; 黎琪
Original assignee: Academy of State Administration of Grain
Current assignee: Academy of Sciences, State Bureau of Food and Materials Reserve
Priority date: 2015-11-24
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2035-11-24
Also published as: CN105274013A

Abstract

本发明公开了汉逊德巴利酵母及其在处理高浓度硫酸铵的工业废水中的应用。该汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)ASAGFY31，其保藏编号为CGMCC No.11237。本发明还提供了该汉逊德巴利酵母处理高浓度硫酸铵的工业废水的方法。利用本发明提供的汉逊德巴利酵母可有效解决废水污染问题，还可以获得大量的菌体蛋白用于饲料和养殖行业，实现废弃物的资源化利用。

Description

汉逊德巴利酵母及其在处理高浓度硫酸铵的工业废水中的应用

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，涉及一株汉逊德巴利酵母及其在处理高浓度硫酸铵的工业废水中的应用。

背景技术

高浓度硫酸铵废水是一类常见的工业废水，其硫酸铵浓度高，氨氮含量高，为了防止氨氮的超标排放引起水体富营养化，造成环境污染，这类废水必须经过处理达到排放标准后才能排放。最常见的高浓度硫酸铵废水，例如味精废水，它是味精企业发酵生产味精而产生的一种难处理的高浓度有机废水，具有高COD、高BOD、高SO₄ ^2-、高氨氮、高悬浮物、低pH等特点。根据资料统计，味精厂每生产1t味精约排放高浓度废水4.5t左右，味精废水中含有大量氨氮，可造成河口、近海海域的富营养化问题；味精发酵废液pH值很低，水体受到酸碱污染时pH发生变化，严重时将消灭或抑制水体中微生物的生长，妨碍水体自净等问题，不合理的处理及排放给环境带来污染，造成难以估量经济损失的同时制约了味精行业的发展。

目前处理高浓度硫酸铵废水的方法有很多，如物理法、生物法、化学法等。但这些方法都有各自的不足，例如物理法和化学法处理步骤繁琐且费用高，可能导致二次污染。当前味精厂对发酵废液的处理方法是，首先提取发酵液中谷氨酸棒杆菌的菌体蛋白，然后分别进行四效、二效浓缩，冷却结晶后提取硫酸铵，将剩余的废水喷在玉米皮等上干燥后做肥料，从整个工艺流程来看，能耗高，因此，处理成本也比较高。废水在不同处理环节中硫铵含量是不同的，初始废液中硫铵含量约为5.3％-5.5％，经过四效浓缩后硫铵含量在25％左右，二效浓缩后硫铵含量约50％，冷却结晶提取硫酸铵之后的废液，其中硫铵含量约30％，还原糖5％-6％，谷氨酸3％-4％，还有乳酸、丙酮酸等有机酸，钙、镁等离子。

近年来，生物法处理工业废水越来越受到青睐。湖北工业大学公开了一种利用高含盐氨基酸废水发酵生产饲料用汉逊德巴利酵母的方法(中国专利公开号CN103642706A)，所述的汉逊德巴利酵母来源于中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC2.33，经过连续驯化培养后应用在全氮含量75-150g/L，氨基酸含量为150-300g/L，氯离子含量为80-180g/L的氨基酸废水中。该菌株主要针对高盐的氨基酸废水。此外，也有报道有些微生物菌株可以处理低浓度硫酸铵工业废水，但是当硫酸铵浓度超过10％时，微生物的生长会受到抑制，甚至死亡。因此，急需找到可转化高浓度硫铵的微生物菌株应用在此类工业废水处理中。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株汉逊德巴利酵母及其在处理高浓度硫酸铵的工业废水中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种利用本发明分离的汉逊德巴利酵母处理高浓度硫酸铵的味精废水的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一株汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)，编号为ASAGFY 31，是从味精厂废水污泥中分离得到的，已于2015年8月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC No.11237，分类学命名为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)。与其它生物的情况一样，本发明的汉逊德巴利酵母菌株ASAGFY 31仍然易发生变异。因此，可以利用本领域已知的物理和化学方法得到该菌株的突变株。例如，可以通过化学药剂如N-甲基-Nˊ-硝基-N-亚硝基胍处理得到其突变株，这些诱变突变株，只要保留了高浓度硫酸铵的耐受力，和转化工业废水中氨氮的能力，也属于本发明的一部分。

本发明还要求保护所述汉逊德巴利酵母ASAGFY 31在处理高浓度硫酸铵的工业废水中的应用。特别是在处理味精废水中的应用。

进一步地，所述工业废水的硫酸铵浓度为5-50％，优选为5-35％。通常情况下，所述工业废水的pH为2.5-4.0。本文中工业废水中硫酸根浓度采用中华人民共和国环境保护行业标准HJ/T342-2007铬酸钡分光光度法，NH₄ ⁺采用上海苏泊信息技术有限公司的FC-100型多用分析测定仪(氨电极及氨氮的测量)。

所述处理高浓度硫酸铵的工业废水包括：将所述汉逊德巴利酵母ASAGFY31接种于高浓度硫酸铵的工业废水中进行培养。

进一步地，所述汉逊德巴利酵母ASAGFY31的接种量为1％-10％，培养条件为28-32℃，振荡或搅拌通气培养。

本发明还提供了一种处理高浓度硫酸铵的味精废水的方法，该方法包括：

(1)将所述汉逊德巴利酵母ASAGFY31接种于固体培养基上进行活化；

(2)将步骤(1)制得的活化菌接种于液体培养基中，在温度28-32℃的条件下通气培养，获得液体种子；

(3)将步骤(2)制得的液体种子接种于味精废水中，在温度28-32℃的条件下通气培养，获得发酵液；

(4)取步骤(3)制得的发酵液，经离心分离或者加入絮凝剂后板框压滤，获得菌体蛋白，上清液为处理后的味精废水。

上述方法中，味精废水的硫酸铵浓度为5-50％，优选为5-35％。优选地，每升味精废水添加5-30g葡萄糖，调节pH至4.5-7.0，121℃蒸汽灭菌20-30min。

本发明所述方法在发酵培养过程中可以使用任何已经公开的适于培养汉逊德巴利酵母的培养基配方，但是从细胞生物量、转化氨氮角度看，优选某些培养基。例如，优选的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，但也可以使用玉米淀粉、麦芽汁等。可掺入培养基的营养无机盐有能够产生下列离子的常规可溶性盐：钾离子、钙离子、镁离子、碳酸根离子、磷酸根离子等。

进一步地，在上述步骤(1)中活化培养基，组分为PDA培养基，如下(g/L)：葡萄糖20，土豆浸出粉6，(NH₄)₂SO₄ 150，琼脂20，121℃蒸汽灭菌20-30min。

所述步骤(1)中的活化培养基条件为在温度28-32℃的条件下培养2-3d。

在上述步骤(2)中液体种子培养基，组分如下(g/L)：葡萄糖20，土豆浸出粉6，(NH₄)₂SO₄ 150，pH自然，121℃蒸汽灭菌20-30min。

在步骤(3)中，汉逊德巴利酵母ASAGFY31的接种量为1％-10％。

在步骤(4)中，离心分离条件为：4000rpm以上，10-20min。

本发明的优点在于：本发明提供的保藏编号为CGMCC No.11237的汉逊德巴利酵母能在pH 2.5以上、含有50％浓度硫酸铵的培养基中生长。其不仅可以处理高浓度硫酸铵的味精废水，还可以高效转化味精废水中的氨氮，获得大量菌体蛋白。因此，利用本发明提供的汉逊德巴利酵母可有效解决废水污染问题，还可以获得大量的菌体蛋白用于饲料和养殖行业，实现废弃物的资源化利用。

附图说明

图1：ASAGFY 31的显微照片(×1000)和菌落形态照片。

图2：基于18S rDNA基因序列采用临近法构建的ASAGFY 31和相近菌株的系统发育进化树。

图3：基于ITS基因序列采用临近法构建的ASAGFY 31和相近菌株的系统发育进化树。

图4：ASAGFY 31在含有不同浓度硫铵的PDA培养基中的生长曲线。

图5：ASAGFY 31和CGMCC 2.33在含有15％硫铵PDA固体培养基中的耐受情况对比(左图：ASAGFY 31，右图：CGMCC 2.33)。

图:6：ASAGFY 31在不同浓度废水中的代谢情况(废水1硫铵含量5.3％-5.5％，是味精厂初始废液；废水2硫铵含量5.3％-5.5％，是提取菌体蛋白后的废液；废水3是经浓缩提取硫酸铵后的废液，其中硫铵含量约30％，实验中将其1:1稀释后利用)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不是限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。

实施例1汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)获得与鉴定

从味精厂废液池中采样，通过PDA平板(含15％硫酸铵)筛选，挑选分离程度良好且菌落形态、颜色不同的单菌落，之后接种于含有不同浓度硫酸铵的PDA液体培养基中观察生长情况，筛选耐高浓度硫铵的菌株；将筛选到的耐高浓度硫铵的菌株接种在味精废液中，进行发酵实验，验证各个单菌落在废水中的代谢生长情况。最终成功获得能够利用废水中氨氮的菌株。挑取单菌落于PDA(含30％硫酸铵)液体培养基中，培养至对数期时，用40％的甘油与培养物等体积混合后置于-80℃保存。

采用18S rDNA、ITS序列分析，Biolog鉴定等方法对菌株进行分类鉴定，结果表明该菌株的分类地位属于真菌酵母科德巴利酵母属汉逊德巴利酵母。

培养特征和形态特征：该菌株在PDA固体培养基上，在28℃经过2天的培养，其菌落形态为：象牙白，中部突起较规则的圆形，表面湿润而平滑，不透明，边缘整齐；显微形态：圆形，大小2.5-3.5μm(图1)。

生理特征：可以在含有50％硫酸铵的PDA培养基中生长，pH耐受范围2.5-11。

Biolog鉴定结果显示为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)SIM值0.917。18S rDNA和ITS序列分析：分别利用引物EF3(5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'，SEQ IDNo.1)、EF4(5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3'，SEQ ID No.2)和ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'SEQ ID No.3)ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，SEQ IDNo.4)进行PCR扩增，长度为1563bp的18S rDNA序列(如序列表中SEQ ID No.5所示)、642bp的ITS序列(如序列表中SEQ ID No.6所示)与Genbank数据库中已有的序列进行Blast比对，该序列与德巴利酵母属18S rDNA序列相似度较高。系统发育树显示(图2、图3)，该菌株被聚类在德巴利酵母属，与Debaryomyces hansenii strain JCM1990^T被分在一个分支中。

该菌株已于2015年8月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC No.11237，分类学命名为汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)。

实施例2ASAGFY 31在含有不同浓度硫铵的PDA液体培养基中的生长

将活化后的ASAGFY 31单菌落接种于含有15％硫酸铵PDA液体培养基中，在28℃200rpm的条件下振荡培养24h，转接于含有不同浓度硫酸铵的PDA液体培养基中，使初始OD600为0.05，28℃200rpm的条件下振荡培养，每4h取样测OD600，结果表明：ASAGFY 31在含有25％、35％硫酸铵的PDA液体培养基中均能生长良好，分别在培养48h、72h后平板菌落计数法(colony forming unit,cfu)检测活菌数达到10⁸CFU/mL(如图4所示)。在50％硫酸铵的PDA液体培养基中，96h后开始生长，144h后平板菌落计数法(colony forming unit,cfu)检测活菌数达到10⁷CFU/mL。

实施例3ASAGFY 31和CGMCC 2.33在含有不同浓度硫铵的PDA培养基中的耐受情况对比

将活化后的ASAGFY 31和CGMCC 2.33的汉逊德巴利酵母(中国专利公开号CN103642706A)单菌落分别转接至含有1mL无菌水的ep管中，于漩涡混合器上震荡均匀后，取100μL悬浮液涂布在含有15％硫酸铵PDA固体平板上，在28℃生化培养箱中静置培养，培养3d后，ASAGFY 31长满整个平板，CGMCC2.33在平板中的菌落数明显少于ASAGFY 31(如图5所示)。进一步，将活化后的两株汉逊德巴利酵母分别接种于含有15％硫酸铵PDA液体培养基中，在28℃200rpm的条件下振荡培养后，分别转接于含有25％硫酸铵的PDA液体培养基中，使初始OD600为0.05，28℃200rpm的条件下振荡培养分别观察生长情况，结果表明：ASAGFY 31在含有25％硫酸铵的PDA液体培养基中生长良好，16h时OD600值超过1，培养48h后平板菌落计数法(colony forming unit,cfu)检测活菌数达到10⁸CFU/mL，CGMCC 2.33在15％硫酸铵PDA液体培养基中生长缓慢，在25％硫酸铵PDA液体培养基中，120h时仍然没有生长。

实施例4ASAGFY 31对味精废水中氨氮的利用

将活化后的ASAGFY 31单菌落接种于含有15％硫酸铵的PDA液体培养基中，在28℃200rpm的条件下培养48h，2％的接种量接种于味精废水发酵培养基中，28℃200rpm的条件下培养，分别在发酵1、4、7天时取样，4000rpm、20min离心法测其湿重；80℃、烘干24小时，测菌体的干重；利用FC-100型多用分析测定仪(氨电极及氨氮的测量)测铵根离子含量，结果表明：ASAGFY31在味精废水1、2、3(废水1为味精厂初始废液；废水2为提取菌体蛋白后的废水；废水3为1:1稀释的经浓缩提取硫酸铵后的废液)发酵4天时的氨氮利用率分别为71.85％、76.83％、72.75％，7天时的利用率分别为81.04％、82.58％、77.62％(如图6所示)。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一株汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）ASAGFY31，其保藏编号为 CGMCCNo. 11237。

2.权利要求1所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）ASAGFY31在处理高浓度硫酸铵的工业废水中的应用，其中，所述工业废水中的硫酸铵浓度为5-50%。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述工业废水中的硫酸铵浓度为5-35%。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高浓度硫酸铵的工业废水为味精废水。

5.根据权利要求2-4任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述处理高浓度硫酸铵的工业废水包括：将所述汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）ASAGFY31接种于高浓度硫酸铵的工业废水中进行培养。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）ASAGFY31的接种量为1%-10%。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，培养条件为28-32℃，振荡或搅拌通气培养。

8.一种处理高浓度硫酸铵的味精废水的方法，其特征在于，该方法包括：

（1）将权利要求1所述的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）ASAGFY31接种于固体培养基上进行活化；

（2）将步骤（1）制得的活化菌接种于液体培养基中，在温度28-32℃的条件下通气培养，获得液体种子；

（3）将步骤（2）制得的液体种子接种于味精废水中，在温度28-32℃的条件下通气培养，获得发酵液，其中，味精废水的硫酸铵浓度为5-50%；

（4）取步骤（3）制得的发酵液，经离心分离或者加入絮凝剂后板框压滤，获得菌体蛋白，上清液为处理后的味精废水。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，味精废水的硫酸铵浓度为5-35%。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，每升味精废水添加5-30 g葡萄糖，调节pH至 4.5-7.0；进一步，所述汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）ASAGFY31的接种量为1%-10%。