CN103484421A - 一种液体发酵中试生产粉红粘帚霉厚垣孢子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，提供了一种液体发酵中试生产粉红粘帚霉厚垣孢子的方法，包括培养基配方和发酵参数控制。由蔗糖40-50克/升、豆饼粉20-25克/升、磷酸二氢钾0.5-2克/升、硫酸镁0.2-1克/升、硫酸锌0.01-0.5克/升及水组成的液体培养基，发酵生产粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子，接种量0.2％-2％(体积比)，培养条件pH4-6，温度26℃-30℃，搅拌速度180-250转/分，通气量1∶0.2-0.8。培养时间从接种开始计算，8小时孢子萌发，24-40小时形成大量厚垣孢子。液体发酵3-5天，厚垣孢子浓度达到1.5×108个/毫升。本发明的目的是提供一种较廉价、原料来源丰富的培养基配方及高效、易于调控的液体发酵技术，利用这种方法能够实现粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子稳定规模化生产，为其大面积的生防应用提供保证。

Description

一种液体发酵中试生产粉红粘帚霉厚垣孢子的方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种液体发酵中试生产粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子的方法，包括培养基配方和发酵参数的控制。
背景技术：
粘帚霉(Gliocladium spp.)作为一类重要的菌寄生菌，可以侵染核盘菌、丝核菌、灰霉等多种植物病原真菌，并且能产生抑菌物质，或通过竞争、诱导植物抗性等方式控制或减弱病害的发生程度，被认为是最有希望的植病生防拮抗微生物之一。目前，国外已有一些商品化粘帚霉制剂登记注册，如美国的绿色粘帚霉(G.virens)产品
Figure BSA00000873026500011
主要用于盆栽和苗圃土壤的预防性处理；芬兰农业研究中心和Kemira公司联合开发的链孢粘帚霉(G.catenulatum)颗粒剂
Figure BSA00000873026500012
主要用于蔬菜育苗，防治土壤里腐霉和丝核菌引起的病害。但国内至今还未见商品化的制剂问世。缺乏高致病力菌株、缺少优良菌株规模化培养关键技术、产品稳定性不足是制约粘帚霉生防制剂在植物病害防治领域广泛应用的关键因素。
目前生产上常用的真菌农药制剂多为分生孢子和菌丝混合物，但由于其存活期短、稳定性差，很难达到商品化生物农药所规定的货架期要求。而真菌厚垣孢子是在不良环境条件下形成的一种特殊的结构，一般由菌丝细胞内的原生质收缩而成，孢子外面包裹一层厚壁，表面一般具有刺或瘤状突起。厚垣孢子作为抵抗不良环境的休眠体，具有耐高温、耐干燥、存活期长、易于加工和贮存等优点，因而可以有效减少真菌农药加工损失、提高其作用效果、延长货架期。并且厚垣孢子较分生孢子在土壤中更宜于存活、增殖和萌发。
目前已有研究表明，粘帚霉在特定条件下可以产生厚垣孢子。刘富平、朱天辉发现绿粘帚霉(G.virens)菌株产厚垣孢子最佳条件为PD培养基、pH3，30℃下光照、振荡培养，转速120转/分，1周内厚垣孢子产量达到8.0×106个/毫升。但所列培养基质和条件不适合规模化生产，且厚垣孢子产量较低。中国专利(专利号ZL 2007 1 0195587.6)提供了一种制备粘帚霉属真菌厚垣孢子的方法，以葡萄糖、豆饼粉、尿素等为培养基主要成分，采用液体发酵培养粘帚霉，但目前也仅限于摇瓶培养，并且未涉及总体产孢水平。中国专利(申请号201110024322，公开号CN 102174460A)提供了一种采用固体发酵技术培养粉红粘帚霉厚垣孢子的方法，以20％-30％的麦麸，4％-6％的玉米粉和水为基质，培养6-10d，孢子含量达到5-9×108个/克。但固体培养不可避免存在着过程控制困难、占地大、周期长、易污染等问题。
国外Eyal等人(1997)研究了绿粘帚霉(G.virens)GL-21菌株规模化液体发酵技术，在特定培养基中，pH6.0、26℃，转速150-300转/分，溶氧量大于10％的条件下培养1周，厚垣孢子产量为1.25×108个/毫升。但粉红粘帚霉的发酵研究还很少见报道。
粉红粘帚霉(Clonostachys rosea(syn Gliocladium roseum))HLD-1(中国微生物菌种保藏中心保藏编号CGMCC 1037)是本实验室分离到的一株高效菌寄生菌，对严重危害农作物生产的核盘菌、灰霉病菌、立枯丝核菌有明显的抑制作用，表现出良好的生防潜力。前期，本实验室对该菌株已申报专利(专利号ZL2005 1 0089087.5)。进一步研究筛选高效廉价的营养基质、确定适宜的发酵参数，对实现粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子工厂化规模生产，推动我国粘帚霉生物农药产业化具有重要意义。
发明内容：
针对粉红粘帚霉产孢技术问题，本发明提供了一种液体发酵中试生产粉红粘帚霉厚垣孢子的方法，包括培养基配方和发酵工艺。因此，本发明的目的是提供一种较廉价、原料来源丰富的培养基配方和高效、易于调控的发酵生产工艺，所述方法能够稳定规模化生产粉红粘帚霉厚垣孢子，以保证粉红粘帚霉在病害生防中的应用。
本发明的一个实施方案是提供一种能中试发酵生产粉红粘帚霉厚垣孢子的液体培养基。所述培养基由蔗糖、豆饼粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌及水组成。
本发明的一个实施方案是提供一种能中试发酵生产粉红粘帚霉厚垣孢子的液体培养基。所述培养基由蔗糖40-50克/升、豆饼粉20-25克/升、磷酸二氢钾0.5-2克/升、硫酸镁0.2-1克/升、硫酸锌0.01-0.5克/升及水组成。
本发明的一个实施方案是提供由蔗糖40-50克/升、豆饼粉20-25克/升、磷酸二氢钾0.5-2克/升、硫酸镁0.2-1克/升、硫酸锌0.01-0.5克/升及水组成的液体培养基和用其液体发酵生产粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子。生物材料粉红粘帚霉HLD-1菌株分类命名为Clonostachysrosea，已于2003年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏编号为CGMCC No.1037)，该保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的一个实施方案是提供由蔗糖40-50克/升、豆饼粉20-25克/升、磷酸二氢钾0.5-2克/升、硫酸镁0.2-1克/升、硫酸锌0.01-0.5克/升及水组成的液体培养基和用其液体发酵中试生产粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子，接种量为0.2％-2％(体积比)。
本发明的一个实施方案是提供由蔗糖40-50克/升、豆饼粉20-25克/升、磷酸二氢钾0.5-2克/升、硫酸镁0.2-1克/升、硫酸锌0.01-0.5克/升及水组成的液体培养基和用其液体发酵中试生产粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子，接种量为0.2％-2％，培养条件为pH4-6，温度26℃-30℃，搅拌速度180-250转/分，通气量1∶0.2-0.8。
本发明的一个实施方案是提供山蔗糖40-50克/升、豆饼粉20-25克/升、磷酸二氢钾0.5-2克/升、硫酸镁0.2-1克/升、硫酸锌0.01-0.5克/升及水组成的液体培养基和用其液体发酵中试生产粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子，接种量为0.2％-2％，培养条件为pH4-6，温度26℃-30℃，搅拌速度180-250转/分，通气量1∶0.2-0.8。培养时间从接种开始计算，8小时孢子萌发，24小时产生大量菌丝，并在菌丝中部出现原生质浓缩，40小时形成大量厚垣孢子，且孢子各自单独分开，72小时孢子成熟。液体发酵3-5天，发酵结束时厚垣孢子浓度达到1.5×108个/毫升。
具体实施方式：
实施例1：50升发酵罐制备粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子的配方
组分 含量(每升体积)
蔗糖 40克
豆饼粉 24克
磷酸二氢钾 1克
硫酸镁 0.5克
硫酸锌 0.1克
水 1升
将蔗糖、豆饼粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌按上述比例依次加入发酵罐中，然后加入自来水至30升，搅拌至各组分完全混合均匀。
实施例2：500升发酵罐液体生产粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子的配方
组分 含量(每升体积)
蔗糖 50克
豆饼粉 19.8克
磷酸二氢钾 1克
硫酸镁 0.5克
硫酸锌 0.1克
水 1升
将蔗糖、豆饼粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌按上述比例依次加入发酵罐中，然后加入自来水300升，边加入边搅拌，直至各组分完全混合均匀。
实施例3：500升发酵罐液体生产粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子的方法
组分 含量(每升体积)
蔗糖 40克
豆饼粉 20克
磷酸二氢钾 1克
硫酸镁 0.2克
硫酸锌 0.05克
水 1升
发酵罐中先放入250升自来水，将蔗糖、豆饼粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌按上述比例依次加入发酵罐中，再补加自来水至300升。打开电机搅拌，直至各组分完全混合均匀，加入磷酸调节pH为6。121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，按1％(体积比)的量接入HLD-1摇瓶种子液(浓度为108孢子/毫升)，27℃培养72小时后，得到含厚垣孢子的发酵液，厚垣孢子浓度为1.5×108个/毫升。

Claims (5)

1.一种液体发酵中试生产粉红粘帚霉厚垣孢子的方法，其特征在于，所述粉红粘帚霉菌株是HLD-1菌株，保藏号为CGMCC No.1037。
2.一种发酵生产粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子的液体培养基，其特征在于，所述培养基由蔗糖、豆饼粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌及水组成。
3.一种发酵生产粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子的液体培养基，其特征在于，所述培养基由蔗糖40-50克/升、豆饼粉20-25克/升、磷酸二氢钾0.5-2克/升、硫酸镁0.2-1克/升、硫酸锌0.01-0.5克/升及水组成。
4.如权利要求3所述的液体培养基，其特征在于，用其可以液体发酵生产对多种植物病原真菌，例如菌核病菌、灰霉病菌、纹枯病菌、根腐病菌等有重寄生作用的粉红粘帚霉的厚垣孢子。
5.一种液体发酵中试生产粉红粘帚霉HLD-1厚垣孢子的发酵条件，其特征在于，所述发酵条件为接种量0.2％-2％，发酵过程pH4-6，温度26℃-30℃，搅拌速度180-250转/分，通气量1∶0.2-0.8，发酵时间3-5天。
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