CN104304328A - 一种核盘菌的重寄生真菌菌剂制备方法 - Google Patents

Abstract

一种核盘菌的重寄生真菌菌剂制备方法。包括分离培养、液体发酵和菌剂制备三个步骤。从土壤中筛选分离培养对核盘菌具有拮抗作用的重寄生真菌，通过改变投放菌核数量，培养时间，液体发酵碳氮比，发酵液接种浓度，菌浆与硅藻土配比，提高核盘菌的重寄生真菌有效活菌数量。筛选培养出特定的拮抗微生物并制备菌剂可防治核盘菌病害，菌剂重寄生真菌生物活性强。该菌剂可克服化学农药防治效果差、陈本高、污染环境和影响食品安全等诸多弊端。

Description

一种核盘菌的重寄生真菌菌剂制备方法

技术领域

本发明涉及一种真菌菌剂制备方法，具体地说是一种核盘菌的重寄生真菌菌剂制备方法。

背景技术

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌。可侵染多种农作物、果树、蔬菜和经济作物，特别是造成油菜、大豆、向日葵、花生、芹菜和黄瓜等作物产量和品质的严重损失。这种病原菌通过产生菌核在土壤中越冬和越夏存活，并成为下一季的重要初侵染源。目前对菌核病的防治主要依靠化学农药，然而化学防治不仅成本高、污染环境，而且防效也不理想；同时，食品的安全性也受到严重影响。国外大量研究结果表明，土壤中存在着丰富的重寄生真菌，对菌核有着天然的控制作用。筛选土壤中对菌核具强烈重寄生作用的真菌是对这一病害生物防治的重要基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种核盘菌的重寄生真菌菌剂制备方法，筛选培养出特定的拮抗微生物并制备菌剂来防治核盘菌病害，菌剂重寄生真菌生物活性强且含量高，以克服化学农药防治效果差、陈本高、污染环境和影响食品安全等诸多弊端。

本发明的技术方案包括分离培养、液体发酵和菌剂制备三个步骤。

所述分离培养步骤为：

采集根际土样，以30-50粒/100克土样加入菌核并混匀，最好以40粒/100克加入核盘菌菌核并混匀，25℃恒温诱捕寄生菌，3-4周后取出，最好3.5周后取出，经自来水漂洗、1% NaCIO表面灭菌1分钟和无菌水充分漂洗后，置于放置在培养皿内的滤纸片上，25℃保温培养2周后，在体现镜下检查菌核表面的重寄生菌，挑单孢至PDA平板培养，纯化分离获得；

所述液体发酵步骤包括：

试管培养：采用固体马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基，将贴帚霉HLD-1菌株接种在试管培养基上，22-28℃下培养4-5天；

扩大培养：采用液体马铃薯葡萄糖PD培养基，将试管中粘帚霉HLD-1菌株接种在锥形瓶中，置于摇床上22-28℃振荡黑暗培养3-4天作为种子液；

发酵培养：以葡萄糖和尿素分别作为碳、氮源，C/N 为6:1-15:1，最好C/N为12:1，其它组分及用量同查彼Czapek培养液，121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，将锥形瓶中的培养物按6-8%的比例接入发酵液，最好按7%的比例接入发酵液，22-28℃振荡黑暗培养3-4天得到相应拮抗菌的菌浆。

所述菌剂制备步骤为：

硅藻土121℃高压湿热灭菌30分钟，晾干2-3天，将液体发酵获得的菌浆与硅藻土按1：1-1.5：1（V/W）混匀，最好按1.2:1（V/W）混匀，晾干即可。

本发明的有益效果是：

培养特征：

在PDA上25℃培养，3-10天观察，菌落生长速度不是很快，早期形成大量密集白色生菌丝，绒絮状。后产孢逐渐变成灰绿色，孢子聚集成束状突起。7天后，整个菌落中央逐渐塌陷，呈现暗绿至墨绿色。从接种中心至菌落外缘呈塌陷，束状突起及最外边的毛绒状白色生菌丝。菌落背面淡黄色。

在CMA上25℃培养，气生菌丝下发达，较均匀地着生孢子，孢子团浅绿色。不产色素。

镜检形态：

分生孢子梗及分生孢子：分生孢子梗无色透明，上部着生帚状分枝，在水中镜检观察共有两种类型；一种象青霉菌一样较密集，形成“毛刷”；另一种像轮枝菌，分枝对称轮生。分生孢子（瓶梗孢子）2.5-5.5×2.5-3.5μm，无色透明，单细胞，连续向顶端产生孢子并集聚于粘液滴中。

该菌株属于粘帚霉HLD-1（Gliocladium sp.）。

所述重寄生真菌孢子悬液（浓度为10⁶-10⁹个孢子/ml），菌核浸泡其中，5分钟后取出，保湿寄生培养24小时，然后用1%NaCIO表现消毒1分钟，无菌水清洗3次，再保湿培养约5-7天，在体视境下观察到90%以上菌核上长出上述微生物。这表明上述所述重寄生真菌的孢子在保湿条件下24小时内能够寄生大部分菌核，所述重寄生真菌对核盘菌表现强寄生能力。

由低到高逐渐改变制备工艺参数时，所述分离培养步骤中采集根际土样，以30-50粒/100克土样加入菌核并混匀，25℃恒温诱捕寄生菌，3-4周后取出。所述液体发酵步骤中发酵培养以葡萄糖和尿素分别作为碳、氮源，C/N 为6:1-15:1。所述液体发酵步骤中将锥形瓶中的培养物按6-8%的比例接入发酵液。所述菌剂制备步骤中将液体发酵获得的菌浆与硅藻土按1：1-1.5:1（V/W）混匀。所述重寄生真菌有效活菌数量为20-30亿/克上升到40-50亿/克，然后又逐渐下降到30-40亿/克。所述重寄生真菌有效活菌数量最好可达40-50亿/克。

具体实施方式

实施例1

分离培养：

采集根际土样，以30粒/100克土样加入菌核并混匀，25℃恒温诱捕寄生菌；3周后取出，经自来水漂洗、1%NaCIO表面灭菌1分钟和无菌水充分漂洗后，置于放置在培养皿内的滤纸片上，25℃保湿培养2周后，在体视镜下检查菌核表面的重寄生菌，挑单孢至PDA平板培养，纯化分离。

液体发酵：

试管培养：采用固体马铃薯葡萄琼脂（PDA）培养基，将所述重寄生真菌菌株接种在试管培养基上，26℃下培养4天；

扩大培养：采用液体马铃薯葡萄糖（PD）培养基，将试管中所述重寄生真菌菌株接种在锥形瓶中，置于摇床上26℃振荡黑暗培养4天作为种子液；

发酵培养：以葡萄糖和尿素分别作为碳、氮源，C/N为6:1，其它组分及用量同查彼（Czapek）培养液，121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，将锥形瓶中的培养物按6%的比例接入发酵液，26℃振荡黑暗培养4天得到相应拮抗菌的菌浆。

菌剂制备：

硅藻土121℃高压湿热灭菌30分钟，晾干3天。将液体发酵获得的菌浆与硅藻土按1：1（V/W）混匀，晾干即可。有效活菌量20-30亿/克。

实施例2

工艺步骤如实施例1，所述分离培养步骤中采集根际土样，以40粒/100克土样加入菌核并混匀，25℃恒温诱捕寄生菌，3.5周后取出。所述液体发酵步骤中发酵培养以葡萄糖和尿素分别作为碳、氮源，C/N 为12:1。所述液体发酵步骤中将锥形瓶中的培养物按7%的比例接入发酵液。所述菌剂制备步骤中将液体发酵获得的菌浆与硅藻土按1.2：1（V/W）混匀。有效活菌量40-50亿/克。

实施例3

工艺步骤如实施例1，所述分离培养步骤中采集根际土样，以50粒/100克土样加入菌核并混匀，25℃恒温诱捕寄生菌，4周后取出。所述液体发酵步骤中发酵培养以葡萄糖和尿素分别作为碳、氮源，C/N 为15:1。所述液体发酵步骤中将锥形瓶中的培养物按8%的比例接入发酵液。所述菌剂制备步骤中将液体发酵获得的菌浆与硅藻土按1.5：1（V/W）混匀。有效活菌量30-40亿/克。

Claims (5)

1.一种核盘菌的重寄生真菌菌剂制备方法，包括分离培养、液体发酵和菌剂制备三个步骤，其特征在于

所述分离培养步骤为：

采集根际土样，以30-50粒/100克土样加入菌核并混匀，25℃恒温诱捕寄生菌，3-4周后取出，经自来水漂洗、1% NaCIO表面灭菌1分钟和无菌水充分漂洗后，置于放置在培养皿内的滤纸片上，25℃保温培养2周后，在体现镜下检查菌核表面的重寄生菌，挑单孢至PDA平板培养，纯化分离获得；

所述液体发酵步骤包括：

试管培养：采用固体马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基，将贴帚霉HLD-1菌株接种在试管培养基上，22-28℃下培养4-5天；

扩大培养：采用液体马铃薯葡萄糖PD培养基，将试管中粘帚霉HLD-1菌株接种在锥形瓶中，置于摇床上22-28℃振荡黑暗培养3-4天作为种子液；

发酵培养：以葡萄糖和尿素分别作为碳、氮源，C/N 为6:1-15:1，其它组分及用量同查彼Czapek培养液，121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，将锥形瓶中的培养物按6-8%的比例接入发酵液，22-28℃振荡黑暗培养3-4天得到相应拮抗菌的菌浆；

所述菌剂制备步骤为：

硅藻土121℃高压湿热灭菌30分钟，晾干2-3天，将液体发酵获得的菌浆与硅藻土按1：1-1.5：1（V/W）混匀，晾干即可。

2.根据权力要求1所述的一种核盘菌的重寄生真菌菌剂制备方法，其特征是所述分离培养步骤中采集根际土样，以40粒/100克土样加入菌核并混匀，25℃恒温诱捕寄生菌，3.5周后取出。

3.根据权力要求1所述的一种核盘菌的重寄生真菌菌剂制备方法，其特征是所述液体发酵步骤中发酵培养以葡萄糖和尿素分别作为碳、氮源，C/N 为12:1。

4.根据权力要求3所述的一种核盘菌的重寄生真菌菌剂制备方法，其特征是所述液体发酵步骤中将锥形瓶中的培养物按7%的比例接入发酵液。

5.根据权力要求1所述的一种核盘菌的重寄生真菌菌剂制备方法，其特征是所述菌剂制备步骤中将液体发酵获得的菌浆与硅藻土按1.2：1（V/W）混匀。