CN111543440A - 一种小麦增产防病的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种小麦增产防病的方法及其应用，涉及农作物培育技术领域，本发明所述方法以核盘菌的发酵液对小麦种子进行引发，所述核盘菌的发酵液的活菌数在1.4×105cfu/mL以上。本发明利用核盘菌对小麦种子引发，核盘菌能够在小麦植株内生性生长，诱导小麦抗病和发育相关基因的表达，从而达到控制小麦赤霉病等病害和提高小麦产量的目的。

Description

一种小麦增产防病的方法及其应用
技术领域
本发明涉及农作物培育技术领域，尤其涉及一种小麦增产防病的方法及其应用。
背景技术
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，为人类提供约20％的食物，养活40％的世界人口。我国小麦种植面积约为2400万公顷(刘志勇等，2018)，产量130000万吨，种植总面积和总产量分别占世界的11％和17％左右，是世界上最主要的小麦生产国之一。真菌病害是小麦生产中的巨大威胁，以赤霉病和锈病发生普遍，危害最为严重。
小麦赤霉病由禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)和燕麦镰孢菌(F.asiaticum)等真菌引起，我国是小麦赤霉病高发的“重灾区”，发病范围广，程度重，造成了巨大的经济损失，长江中下游地区通常年份引起的产量损失平均为5％～10％，严重流行的年份甚至颗粒无收(Cheng et al.,2012)。小麦赤霉病的危害除籽粒干瘪造成大幅减产之外，感染赤霉病的小麦籽粒带有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)毒素，从而导致籽粒品质下降，并且染病籽粒通过降低种子萌发率和引起苗立枯病等造成进一步的危害(Tuite etal.,1990)。由于世界范围内缺乏赤霉病的有效抗源，目前对小麦赤霉病的防治以花期喷施化学药剂的化学防治为主。
小麦条锈病是我国小麦生产上最重要的病害之一，常大面积流行，对我国小麦生产带来了巨大挑战。小麦条锈病由小麦条锈病菌(Puccinia striiformis)引起，是典型的气传病害，可通过高空气流远距离传播，发展和扩散非常迅速。对于条锈病的防治，种植抗病品种是最为经济有效的防病途径，在实际生产中使用化学农药进行种子包衣和叶面喷施仍然是控制小麦条锈病的重要举措。
化学药剂的使用会起到控制病害的目的，与此同时化学药剂的使用也会对有益微生物的生存和人类的健康构成威胁，其次化学药剂的长时间、过度使用易使病原菌产生抗药性，另一方面目前农业生产面临着劳动力缺乏的社会难题。
发明内容
为了配合小麦绿色轻简化栽培技术，本发明建立了新型绿色、应用简单、省力的防病增产方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种小麦增产防病的方法，以核盘菌的发酵液对小麦种子进行引发，所述核盘菌的发酵液的活菌数在1.4×105cfu/mL以上。
优选的，所述核盘菌包括核盘菌弱毒菌株DT-8和/或核盘菌菌株DT-8VF。
优选的，所述核盘菌的发酵液的制备方法包括：
将核盘菌接种于液体真菌培养基中，18～22℃条件下发酵，得到活菌数在1.4×105cfu/mL以上的核盘菌弱毒菌的发酵液。
优选的，所述发酵时间为70～96h。
优选的，所述发酵时还伴随搅拌，所述搅拌的转速为180～210r/min。
优选的，所述小麦种子的引发包括以下步骤：
(1)将待处理的小麦种子表面消毒后浸泡于水中，待小麦种子吸水膨胀但未开始露白，得到吸水的小麦种子；
(2)用核盘菌的发酵液对吸水的小麦种子浸泡3～6h，然后干燥至恒重。
优选的，所述步骤(1)中，水中的浸泡时间为5～8h。
优选的，所述步骤(2)中，所述核盘菌的发酵液的剂型为水悬浮剂。
优选的，所述步骤(2)中，所述水悬浮剂中除了核盘菌的发酵液外还包括防腐剂、保护剂和防霉剂。
优选的，所述核盘菌的发酵液的体积与待处理的小麦种子的质量之比为80～150mL:1kg。
本发明还提供了上述方案所述方法在核盘菌促进小麦生长、提高小麦产量、提高小麦抗病性中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明利用核盘菌对小麦种子进行引发，核盘菌能够在小麦植株内生性生长，诱导小麦抗病相关基因和发育相关基因的表达，从而达到控制小麦赤霉病等病害和提高小麦产量的目的。
(2)如本发明的具体实施例所示，采用本发明所述方法处理后的小麦植株开花期的株高、旗叶长、穗长、千粒重相对于未处理的小麦植株均有显著提高；还能够提高小麦旗叶的叶绿素含量和光合速率；提高小麦植株根系活力。
(3)如本发明的具体实施例所示，采用本发明所述方法处理后的小麦植株对赤霉病、条锈病抗性有显著提高。
(4)如本发明的具体实施例所示，采用本发明处理后的小麦产量显著优于未处理的小麦，增产幅度在4.28％～17.19％。
生物保藏信息
核盘菌弱毒菌株DT-8(Sclerotinia sclerotiorum)于2019年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2019328。
核盘菌菌株DT-8VF(Sclerotinia sclerotiorum)于2019年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2019929。
附图说明
图1为实施例2中小麦叶片内的核盘菌内生性情况电泳图；其中1～7分别为核盘菌根部接种后的小麦植株叶片；未处理为阴性对照；核盘菌为阳性对照；
图2为实施例2中电镜观察小麦根内部的核盘菌DT-8菌丝；其中，A：扫描电镜观察核盘菌在小麦根部的定殖，B和C为A的局部放大；D-F：透射电镜观察核盘菌在小麦根部的定殖。pc：小麦根细胞；is：根细胞间的间隙；h：核盘菌菌丝；
图3为实施例2中免疫电镜观察小麦根内部的核盘菌DT-8RFP菌丝；其中，A和D显示SsCaf1和RFP抗体信号分别在小麦根部和菌丝中的分布；B和C分别为A的局部放大，E和F分别为D的局部放大；
图4为实施例2中原位杂交显示核盘菌在小麦茎秆中内生性生长情况；
图5为实施例3中核盘菌弱毒菌株DT-8处理对小麦种子发芽率的影响；
图6为实施例3中核盘菌弱毒菌株DT-8处理对小麦生长的促进作用；其中，A为幼苗期小麦；B为开花期小麦；C为幼苗期小麦株高；D为开花期小麦株高；E为开花期小麦旗叶长度；F为小麦穗长；G为小麦千粒重；
图7为实施例3中核盘菌弱毒菌株DT-8处理提高小麦旗叶叶绿素含量和光合作用速率；其中A为小麦旗叶的光合速率；B为小麦旗叶叶绿素含量；
图8为实施例3中核盘菌弱毒菌株DT-8处理提高小麦根系活力；
图9为实施例4中核盘菌菌株DT-8种子引发提高小麦对赤霉病的抗性；其中，A为禾谷镰刀菌菌株PH-1接种DT-8处理和对照小麦穗部14天后的发病示意图；B和C分别为2017年和2018年小麦赤霉病病小穗率；
图10为实施例4中核盘菌弱毒菌株DT-8种子引发提高田间小麦对赤霉病的抗性；其中，A和B为2017年湖北省鄂州市和甘肃省天祝县试验田小麦赤霉病病小穗率；C为2018年湖北省荆门和襄阳试验田小麦赤霉病病小穗率；
图11为实施例4中核盘菌弱毒菌株DT-8种子引发处理降低田间小麦种子中毒素含量；其中，A和B分别为2018年湖北省荆门市和襄阳市自然条件下小麦种子中DON的含量；C和D分别为2018年湖北省荆门市和襄阳市自然条件下小麦种子中ZEN的含量；
图12为实施例4中核盘菌弱毒菌株DT-8种子引发提高小麦对条锈病的抗性；A为小麦条锈病的发病情况；B为2017年湖北省鄂州市和甘肃省天祝县小麦条锈病的病情指数；
图13为实施例7中电镜观察小麦根内部的核盘菌DT-8VF菌丝；其中，A：扫描电镜观察核盘菌在小麦根部的定殖，B为A的局部放大；C：投射电镜观察核盘菌在小麦根部的定殖，D为C的局部放大；
图14为实施例8中核盘菌菌株DT-8VF处理对小麦种子发芽率的影响；
图15为实施例8中核盘菌菌株DT-8VF处理对小麦生长的促进作用；其中，A为幼苗期小麦；B为开花期小麦；C为幼苗期小麦株高；D为开花期小麦株高；E为开花期小麦旗叶长度；F为小麦穗长；G为小麦千粒重；
图16为实施例8中核盘菌菌株DT-8VF处理提高小麦旗叶光合作用速率和叶绿素含量；其中A为小麦旗叶的光合速率；B为小麦旗叶的叶绿素含量；
图17为实施例9中核盘菌菌株DT-8VF种子引发提高小麦对赤霉病的抗性；其中，A为禾谷镰刀菌接种DT-8VF处理和对照小麦穗部14天后的发病示意图；B和C分别为2017年和2018年小麦赤霉病病小穗发生率；
图18为实施例9中核盘菌菌株DT-8VF种子引发提高田间小麦对赤霉病的抗性；其中，A为2017年湖北省鄂州市试验田小麦赤霉病病小穗率，B和C分别为2018年湖北省荆门市和襄阳市试验田小麦赤霉病病小穗率；
图19为实施例9中核盘菌菌株DT-8VF种子引发处理降低田间小麦种子中毒素含量；其中，A和B分别为2018年湖北省荆门市和襄阳市自然条件下小麦种子中DON的含量；C和D分别为2018年湖北省荆门市和襄阳市自然条件下小麦种子中ZEN的含量；
图20为实施例9中核盘菌菌株DT-8VF种子引发提高小麦植株对条锈病的抗性；A为小麦条锈病的发病程度示意图；B为2017年湖北省鄂州市小麦条锈病的病情指数。
具体实施方式
本发明提供了一种小麦增产防病的方法，以核盘菌的发酵液对小麦种子进行引发，所述核盘菌的发酵液的活菌数在1.4×105cfu/mL以上。
在本发明中，所述核盘菌包括核盘菌弱毒菌株DT-8和/或核盘菌菌株DT-8VF；所述核盘菌弱毒菌株DT-8携带有弱毒相关的DNA病毒SsHADV-1，核盘菌DT-8菌株来源于自然田间油菜植株，DT-8VF来源于DT-8菌株脱去DNA病毒SsHADV-1的菌株(Yu et al.,2010)。本发明所述核盘菌菌株DT-8和DT-8VF已按要求保存于位于武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号分别为：CCTCC M 2019328和CCTCC M 2019929。
如本发明的具体实施例所示，所述核盘菌弱毒菌株DT-8或核盘菌菌株DT-8VF(毒力正常)对小麦种子引发后，能够在小麦植株内部进行内生性生长，进而能够诱发小麦植株与抗病反应密切关联的先天免疫、系统获得抗性、防卫反应等基因本体(GO)和脱落酸和茉莉酸等通路(KEGG)相关的58个基因的差异表达(表1)；诱发与植物促生密切关联的叶绿体、光合系统、叶绿体淀粉粒、叶黄素循环等基因本体(GO)相关的107个基因的差异表达(表2)，实现提高小麦产量和增强小麦植株抗病性的目的。
表1诱导表达的抗病相关基因
Figure BDA0002463292850000061
表2诱导表达的促生相关基因
Figure BDA0002463292850000062
在本发明中，所述核盘菌的发酵液的制备方法包括：将核盘菌接种于液体真菌培养基上，18～22℃下发酵，得到活菌数在1.4×105cfu/mL以上的核盘菌的发酵液。
在本发明中，所述液体真菌培养基包括但不限制于PDB培养基或肉汤培养基。在本发明中，所述核盘菌的发酵温度优选为20℃；发酵的时间优选为55～70h，更优选为60～65h。在本发明中，所述发酵时还伴随搅拌；更优选的，所述搅拌的速率优选为120～200r/min，更优选为150r/min。
具体的，本发明所述小麦种子的引发包括以下步骤：
(1)对待处理的小麦种子消毒后浸泡水中，待小麦种子吸水膨胀但未开始露白，得到吸水的小麦种子；
(2)用核盘菌的发酵液对吸水的小麦种子混匀、浸泡3～6h，干燥至恒重。
在本发明中，所述消毒优选的采用84消毒液进行消毒。在本发明中，所述消毒的次数优选为2～3次；所述消毒的时间优选为5～15min，更优选为10min。所述消毒后还以无菌水进行冲洗，以去除种子表面的消毒剂。
在本发明中，所述浸泡的时间优选为5～8h，更优选为6h。
本发明优选的，先将所述核盘菌的发酵液制成水悬浮剂，再进行浸种。在本发明中，所述水悬浮剂中除了核盘菌的发酵液外，优选的还包括防腐剂、保护剂和防霉剂。在本发明的具体实施例中，所述防腐剂、保护剂和防霉剂依次为硫酸链霉素、海藻糖和液体石蜡油。在本发明中，所述防腐剂和保护剂在水悬浮剂中所占的质量百分比优选的分别为0.03～0.08％和2～6％。所述防霉剂优选的在水悬浮剂表面添加一层即可。
在本发明中，所述核盘菌的发酵液的体积与待处理的小麦种子的质量之比优选为80～150mL:1kg，更优选为100mL:1kg。
本发明还提供了上述技术方案所述方法在核盘菌促进小麦生长、提高小麦产量、提高小麦抗病性中的应用。在本发明中，所述促进小麦生长包括但不限于促进小麦旗叶叶绿素含量、光合速率、根系活力、株高、旗叶长、穗长以及千粒重等。在本发明中，所述小麦抗病性包括但不限于小麦赤霉病和小麦锈病。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：核盘菌弱毒菌株DT-8对小麦种子的引发
1、试验材料
小麦品种：冬小麦郑9023和春小麦永良4号，市售。
核盘菌弱毒菌株DT-8：携带DNA病毒SsHADV-1。
2、菌株DT-8水悬浮剂的制备：将核盘菌弱毒菌株DT-8在50L发酵罐中，20℃、150r/min、自然pH的条件下进行60h的培养。添加0.05％硫酸链霉素、4％海藻糖而成，其中活菌数为1.4×105cfu/mL。
3、小麦种子引发：利用5％的84消毒液对小麦种子消毒10min，无菌水冲洗三次，每次1min；小麦种子在无菌水中浸泡6h，待小麦种子吸水膨胀但未开始露白时，利用核盘菌弱毒菌株DT-8水悬浮剂在室温条件下对小麦种子进行混匀、浸种4h，500mL发酵液/5kg小麦种子，随后立即风干至恒重。
实施例2：核盘菌弱毒菌株DT-8种子引发使核盘菌在小麦中内生生长
1、PCR检测麦苗叶片中的核盘菌
将实施例1中制备的小麦种子郑9023在无菌培养土栽培45天，将小麦样品表面消毒(0.5％次氯酸钠10min)，蒸馏水冲洗后用磷酸盐缓冲液(pH7.2)冲洗3次，对麦苗中的核盘菌进行检测。
CTAB法提取小麦叶片的基因组DNA作为模板，以核盘菌特异性引物XJJ21和XJJ222(如中国专利ZL200810236958.5所示，XJJ21：5'-GTTGCTTTGGCGTGCTGCTC-3'(如SEQ ID NO：1所示)；XJJ222：5'-CTGACATGGACTCAATAC CAATCTG-3'(如SEQ ID NO：2所示)为引物，以核盘菌基因组DNA为阳性对照，未处理的小麦为阴性对照，对小麦叶片中的核盘菌进行PCR检测。PCR程序为：95℃退火5min，33个循环包括94℃变性1min、63℃退火30s和72℃延伸30s后，72℃延伸5min，16℃保温5min。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(0.5μg/mL)染色，利用凝胶成像系统成像观察。同时，将PCR扩增产物送至北京天一辉远生物科技有限公司进行测序验证。
基因组DNA的提取方法如下：收集于20℃培养2d的核盘菌菌株DT-8菌丝和小麦叶片，分别用液氮迅速研磨后转移至2mL的离心管中，加入800μL预热的4％CTAB提取缓冲液[配方：4％CTAB，2％PVP，100mM Tris·HCl(pH 8.0)，20nM EDTA(pH 8.0)，1.4M NaCl]，65℃水浴15-30min；12,000r/min，常温离心10min；取上清，加入2-2.5倍体积的CTAB沉淀缓冲液(配方：1％CTAB，50mM Tris·HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]，70℃温浴10min，期间颠倒混匀数次；12,000r/min，常温离心10min；小心弃上清，加入500μL的1M NaCl溶解沉淀；加入500μL氯仿抽提，颠倒混匀，12,000r/min离心10min；取上清，加入等体积预冷的异丙醇进行核酸沉淀；于12,000r/min，常温离心10min；弃上清，加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀，重复此步骤一次，弃残液，并将其置于37℃烘箱干燥10min；加入50μL去离子水(含有25μg/mLRNaseA)于37℃溶解5～10min。
结果(图1)表明，小麦叶片中核盘菌的检出率为100％，表明通过种子引发处理，核盘菌菌丝能够进入小麦植株，并随着小麦的生长而在小麦体内进行内生性生长。
2、电镜观察核盘菌内生于小麦根部
将核盘菌弱毒菌株DT-8引发的小麦在MS培养基(青岛海博生物)上培养15天。对小麦根部样品进行扫描电镜和透射电镜观察，扫描电镜观察结果显示：从小麦根表皮到中柱细胞都有核盘菌菌丝的存在，主要集中于表皮细胞；透射电镜观察结果(图2)显示：核盘菌DT-8菌株菌丝在根细胞的细胞间隙和根细胞内部均有分布。
SsCaf1为核盘菌的分泌蛋白，能够分泌到核盘菌细胞外(Xiao et al.,2014)。前期我们制备了SsCaf1的多克隆抗体。为了进一步验证核盘菌的内生，研究核盘菌在小麦根部的定殖，将菌株DT-8进行了荧光蛋白标记，得到荧光蛋白标记后的菌株，命名为DT-8RFP。采用RFP蛋白标记的核盘菌菌株DT-8RFP对小麦进行接种，对接种7天后的小麦根部组织通过免疫电镜进一步对核盘菌的内生生长进行验证。免疫胶体金结果显示：SsCaf1信号分布在核盘菌的菌丝体和小麦根细胞的细胞壁以及根细胞组织中，RFP信号分布在核盘菌菌丝中(图3)，表明小麦根中的管状物为核盘菌DT-8RFP菌株的菌丝体，进一步说明核盘菌能够作为内生真菌存在于小麦根部。
3、原位杂交证明核盘菌内生于小麦茎秆
将核盘菌弱毒菌株DT-8引发的对核盘菌接种45天后的小麦茎秆样品进行原位杂交实验。以核盘菌基因组DNA为模板，使用引物XJJ21和XJJ222(专利号：ZL200810236958.5)进行PCR扩增。以该扩增产物为模板，使用BioPrime DNALabeling System(invitrogen)随机引物法进行Biotin-14-dUTP标记(Feinberg,1984)作为探针，利用原位杂交技术对小麦茎秆样品中的核盘菌进行原位杂交检测。利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma，使用浓度为1μg/mL)(蓝色荧光)对核盘菌以及小麦茎秆的核酸进行染色，利用核盘菌的DNA片段探针标记的CY3(红色荧光)来检测核盘菌，蓝色和红色重叠的部位则为核盘菌菌丝所在的部位。原位杂交结果(图4)显示：种子引发处理的小麦植株茎秆中通过荧光和叠加图像能够观察到粉红色的部位即为核盘菌存在的部位，而在未接种核盘菌的小麦茎秆中未观察到核盘菌的存在。
实施例3：核盘菌弱毒菌株DT-8种子引发促进小麦生长
1、核盘菌处理对小麦种子发芽率没有显著影响
将实施例1中制备的小麦种子和未处理的小麦种子郑9023置于无菌滤纸片并于20℃恒温条件保湿培养催芽5天，每个处理设置三个平行重复，每个重复100颗小麦种子。统计每个平行重复中已发芽的种子数量。结果(图5)显示：核盘菌处理的小麦种子发芽率为83％，未处理的小麦种子发芽率为84％，此结果表明核盘菌处理对小麦种子的发芽率没有显著影响。
2、核盘菌处理对小麦生长的促进作用
将实施例1中制备的小麦种子和未处理的小麦种子郑9023在20℃条件下盆钵栽培，分别对小麦植株生长情况进行观察并对种植45天后的小麦植株株高，开花期植株株高、旗叶长和穗长及成熟期小麦千粒重分别进行统计。结果(图6)显示：核盘菌种子处理小麦植株苗期株高显著高于未处理小麦；核盘菌种子处理小麦植株开花期株高、旗叶长、穗长、千粒重均显著高于未处理小麦。
3、核盘菌处理提高小麦旗叶叶绿素含量和光合速率
将实施例1中制备的小麦种子和未处理的小麦种子郑9023在湖北省鄂州市试验田进行种植，对开花期小麦旗叶中叶绿素含量和旗叶的光合速率进行测定，结果(图7)显示：核盘菌DT-8菌株处理的小麦植株旗叶中叶绿素含量和光合速率都显著高于未处理小麦，叶绿素含量提高51.56％，旗叶光合速率提高7.65％。
4、核盘菌处理提高小麦根系活力
将实施例1中制备的小麦种子和未处理的小麦种子郑9023在湖北省鄂州市试验田进行种植，对开花期的小麦植株根系活力进行了测定。结果(图8)显示：与未处理小麦植株相比，核盘菌处理的小麦植株根系活力显著高于未处理小麦，提高约65.74％。
因此，核盘菌弱毒菌株DT-8种子引发处理对小麦种子萌发没有显著影响，其能够显著提高旗叶叶绿素含量、光合速率和根系活力，提高小麦株高、旗叶长、穗长、千粒重，对小麦生长具有明显的促进作用。
实施例4：核盘菌弱毒菌株DT-8种子引发提高小麦抗病性
1、核盘菌弱毒菌株DT-8种子引发提高小麦对赤霉病的抗性
将实施例1中制备的小麦种子和未经处理的小麦种子郑9023于2017年和2018年种植于湖北省鄂州市试验田，常规田间管理，整个生育期不使用任何杀菌剂对真菌病害进行防治。将禾谷镰刀菌(F.gramincarum)PH-1菌株接种于CMC培养基[羧甲基纤维素钠(CMC)15g，酵母提取物1g，硫酸镁0.5g，硝酸铵1g，磷酸二氢钾1g，蒸馏水定容至1L]中于20℃条件下摇培5天，使用血球计数板统计孢子数量后调整PH-1菌株孢子液浓度为105/mL。在小麦初花期于对麦穗进行人工接种：选取自下往上第四个小穗，将内颖拨开，使用移液器滴加10μL制备的孢子液，喷水套袋保湿培养3天，接种14天后统计赤霉病病小穗数。结果(图9)显示：与未处理小麦相比，核盘菌处理的小麦植株人工接种条件下赤霉病病小穗率降低约50％，显著低于对照小麦植株的病小穗率。
将实施例1中制备的小麦种子和未经处理的小麦种子郑9023于2017年在湖北省鄂州市、2018年在湖北省荆门市和襄阳市试验田进行栽培。将实施例1中制备的小麦种子和未经处理的小麦种子永良4号于2017年在甘肃省天祝县试验田进行栽培。常规管理，但不使用任何杀菌剂进行真菌病害的防治。于小麦收获前一周随机对1500个麦穗自然发生的赤霉病的病小穗率进行调查，调查方法参考赤霉病田间调查统计国家标准(小麦赤霉病测报技术规范，GB/T 15796-2011)。
调查统计结果显示(图10)：2017年湖北省鄂州、甘肃省天祝县及2018年湖北省荆门市和襄阳市试验田种植的核盘菌处理的小麦自然发生的赤霉病病小穗率与未处理对照小麦相比降低程度均超过56％，显著低于对照小麦植株赤霉病的病小穗率。
禾谷镰刀菌在侵染麦穗过程中不仅会导致麦粒空秕，同时还会在染病的麦粒中形成大量的禾谷镰刀菌毒素如DON和ZEN等，DON又称致呕毒素，是一种神经毒素，会导致人畜呕吐和腹泻，破坏免疫系统。对2018年湖北省荆门市、襄阳市试验田核盘菌处理和未处理的小麦种子中毒素含量的测定结果(图11)显示：荆门市、襄阳市试验田核盘菌处理的小麦种子中毒素含量明显低于为未处理对照小麦种子，DON含量分别降低35.25％和23.88％，ZEN含量分别降低80.89％和13.36％。
上述试验表明核盘菌弱毒菌株DT-8种子引发处理在人工接种和田间自然发病条件下，均能够大幅度降低至少45％的赤霉病的发病严重度，同时也能够大幅度降低小麦种子中禾谷镰刀菌毒素的含量。
2、核盘菌弱毒菌株DT-8种子引发提高小麦对条锈病的抗性
小麦锈病是中国小麦生产上分布广、传播快、危害面积大的重要病害，常会在全国大范围流行，一般减产20％～30％，最严重时几乎颗粒无收，造成严重损失。2017年将实施例1中制备的小麦种子和未经处理的小麦种子郑9023和永良4号分别种植于湖北省鄂州市和甘肃省天祝县试验田，2017年湖北省鄂州市试验田条锈病爆发季节为初花期，甘肃省天祝县试验田条锈病爆发季节为盛花期，分别在条锈病爆发期对小麦旗叶条锈病的发病等级进行统计分析。结果(图12)显示：相比于未处理对照小麦植株，鄂州和天祝试验田核盘菌处理的小麦植株旗叶条锈病病情指数分别下降73.4％和57.4％。
实施例5：核盘菌弱毒菌株DT-8种子引发提高小麦产量
将实施例1中制备的小麦种子和未经处理的小麦种子于2016年10月下旬在湖北省鄂州市试验田种植进行小区实验(冬小麦，郑9023)，每处理设置6个小区，每个小区2×25m；2017年4月中旬在甘肃省民勤县和天祝县试验田种植进行小区实验(春小麦，永良4号)，每处理设置6个小区，每个小区2×35m；2017年10月下旬分别在湖北省鄂州市试验田、湖北省荆门市五三农场、湖北省襄阳市试验田种植进行小区实验(冬小麦，郑9023)，其中湖北省鄂州市、湖北省襄阳市试验田每处理设置6个小区，每个小区2×30m，湖北省荆门市五三农场每处理设置4个小区，每个小区2×45m。对所有小区5平米面积的小麦产量进行统计，测定结果(表3)显示：核盘菌引发处理的小麦产量显著高于未处理小麦，增产幅度由4.28％到17.19％。
表3核盘菌弱毒菌株DT-8处理小麦的田间小区试验产量
Figure BDA0002463292850000131
实施例6：核盘菌菌株DT-8VF对小麦种子的引发
1、试验材料
小麦品种：冬小麦郑9023，市售。
核盘菌菌株DT-8VF：携带DNA病毒SsHADV-1的核盘菌DT-8的脱毒菌株。
2、菌株DT-8VF水悬浮剂的制备：将核盘菌菌株DT-8VF在50L发酵罐中，20℃、150r/min、自然pH的条件下进行60h的培养。添加0.05％硫酸链霉素、4％海藻糖而成，其中活菌数为1.4×105cfu/mL。
3、小麦种子引发：利用5％的84消毒液对小麦种子消毒10min，无菌水冲洗三次，每次1min；小麦种子在无菌水中浸泡6h，待小麦种子吸水膨胀但未开始露白时，利用核盘菌菌株DT-8VF水悬浮剂在室温条件下对小麦种子进行混匀、浸种4h，500mL发酵液/5kg小麦种子，随后立即风干至恒重。
实施例7：核盘菌菌株DT-8VF种子引发使核盘菌在小麦中内生生长
1、电镜观察核盘菌内生于小麦根部
小麦在MS培养基(青岛海博生物)上培养7天后接种核盘菌，对接种7天后的小麦根部样品进行扫描电镜和透射电镜观察，观察结果(图13)显示：从小麦根细胞和细胞间均都有核盘菌菌丝的存在，主要集中于表皮细胞。因此核盘菌DT-8VF菌株能够在小麦根组织中生长。
实施例8：核盘菌菌株DT-8VF种子引发促进小麦生长
1、核盘菌DT-8VF处理对小麦种子发芽率没有显著影响
将实施例6中制备的小麦种子和未处理的小麦种子郑9023置于无菌滤纸片并于20℃恒温条件保湿培养催芽5天，每个处理设置三个平行重复，每个重复100颗小麦种子。统计每个平行重复中已发芽的种子数量。结果(图14)显示：核盘菌DT-8VF处理的小麦种子发芽率为85％，未处理的小麦种子发芽率为84％，此结果表明核盘菌DT-8VF处理对小麦种子的发芽率没有显著影响。
2、核盘菌DT-8VF处理对小麦生长的促进作用
将实施例6中制备的小麦种子和未处理的小麦种子郑9023在20℃条件下盆钵栽培，分别对小麦植株生长情况进行观察并对种植45天小麦植株株高，开花期植株株高、旗叶长和穗长及成熟期小麦千粒重分别进行统计。结果(图15)显示：核盘菌DT-8VF种子处理小麦植株苗期株高显著高于未处理小麦；核盘菌种子处理小麦植株开花期株高、旗叶长、穗长和千粒重均显著高于未处理小麦。
3、核盘菌DT-8VF处理提高小麦旗叶叶绿素含量和光合作用速率将实施例6中制备的小麦种子和未处理的小麦种子郑9023在湖北省鄂州市试验田进行种植，对开花期小麦旗叶中叶绿素含量和旗叶的光合速率进行测定，结果(图16)显示：核盘菌DT-8VF处理的小麦植株旗叶中叶绿素含量和光合速率都显著高于未处理小麦，叶绿素含量提高48.43％，旗叶光合速率提高3.98％。
因此，核盘菌菌株DT-8VF种子引发处理对小麦种子萌发没有显著影响，其能够显著提高旗叶叶绿素含量和光合作用速率，提高小麦株高、旗叶长、穗长、千粒重，对小麦生长具有明显的促进作用。
实施例9：核盘菌菌株DT-8VF种子引发提高小麦抗病性
1、核盘菌菌株DT-8VF种子引发提高小麦对赤霉病的抗性
将实施例6中制备的小麦种子和未经处理的小麦种子郑9023于2017年和2018年种植于湖北省鄂州市试验田，常规田间管理，整个生育期不使用任何杀菌剂对真菌病害进行防治。将禾谷镰刀菌(F.gramincarum)PH-1菌株接种于CMC培养基[羧甲基纤维素钠(CMC)15g，酵母提取物1g，硫酸镁0.5g，硝酸铵1g，磷酸二氢钾1g，蒸馏水定容至1L]中于20℃条件下摇培5天，使用血球计数板统计孢子数量后调整PH-1菌株孢子液浓度为105/mL。在小麦初花期于对麦穗进行人工接种：选取自下往上第四个小穗，将内颖拨开，使用移液器滴加10μL制备的孢子液，喷水套袋保湿培养3天，接种14天后统计赤霉病病小穗数。结果(图17)显示：与未处理相比，核盘菌DT-8VF处理的小麦植株人工接种条件下赤霉病病小穗率降低约50％，显著低于对照小麦植株的病小穗率。
将实施例6中制备的小麦种子和未经处理的小麦种子郑9023于2017年在湖北省鄂州市、2018年在湖北省荆门市和襄阳市试验田进行栽培。常规管理，但不使用任何杀菌剂进行真菌病害的防治。于小麦收获前一周随机对1500个麦穗自然发生的赤霉病的病小穗率进行调查，调查方法参考赤霉病田间调查统计国家标准(小麦赤霉病测报技术规范，GB/T15796-2011)。
调查统计结果显示(图18)：2017年湖北省鄂州及2018年湖北省荆门市和襄阳市试验田种植的核盘菌DT-8VF菌株处理的小麦自然发生的赤霉病病小穗率与未处理对照小麦相比降低程度均超过42％，显著低于对照小麦植株赤霉病的病小穗率。
对2018年湖北省荆门市、襄阳市试验田核盘菌处理和未处理的小麦种子中毒素含量的测定结果(图19)显示：荆门市、襄阳市试验田核盘菌DT-8VF菌株处理的小麦种子中毒素含量明显低于为未处理对照小麦种子，DON含量分别降低23.71％和27.57％，ZEN含量分别降低70.21％和14.91％。
上述试验表明核盘菌菌株DT-8VF种子引发处理在人工接种和田间自然发病条件下，均能够大幅度降低至少42％的赤霉病的发病严重度，同时也能够大幅度降低小麦种子中禾谷镰刀菌毒素的含量。
2、核盘菌菌株DT-8VF种子引发提高小麦对条锈病的抗性
2017年将实施例6中制备的小麦种子和未经处理的小麦种子郑9023种植于湖北省鄂州市，2017年在湖北省鄂州市试验田条锈病爆发季节为初花期，在条锈病爆发期对小麦旗叶条锈病的发病等级进行统计分析。结果(图20)显示：相比于未处理对照小麦植株，鄂州试验田核盘菌DT-8VF菌株处理的小麦植株旗叶条锈病病情指数下降79.59％。
实施例10：核盘菌菌株DT-8VF种子引发提高小麦产量
将实施例6中制备的小麦种子和未经处理的小麦种子于2016年10月下旬在湖北省鄂州市试验田种植进行小区实验(冬小麦，郑9023)，每处理设置6个小区，每个小区2×25m；2017年10月下旬分别在湖北省鄂州市试验田、湖北省荆门市五三农场、湖北省襄阳市试验田种植进行小区实验(冬小麦，郑9023)，其中湖北省鄂州市、湖北省襄阳市试验田每处理设置6个小区，每个小区2×30m，湖北省荆门市五三农场每处理设置4个小区，每个小区2×45m。对所有小区5平米面积的小麦产量进行统计，测定结果(表4)显示：核盘菌DT-8VF菌株引发处理的小麦产量显著高于未处理小麦，增产幅度由2.33％到16.81％。
表4核盘菌菌株DT-8VF处理小麦的田间小区试验产量
Figure BDA0002463292850000161
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还能够做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种小麦增产防病的方法及其应用
<150> 201910435218.2
<151> 2019-05-23
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttgctttgg cgtgctgctc 20
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgacatgga ctcaatacca atctg 25

Claims (11)

1.一种小麦增产防病的方法，其特征在于，以核盘菌的发酵液对小麦种子进行引发，所述核盘菌的发酵液的活菌数在1.4×105cfu/mL以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核盘菌包括核盘菌弱毒菌株DT-8和/或核盘菌菌株DT-8VF。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核盘菌的发酵液的制备方法包括：
将核盘菌接种于液体真菌培养基中，18～22℃条件下发酵，得到活菌数在1.4×105cfu/mL以上的核盘菌的发酵液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵时间为70～96h。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵时还伴随搅拌，所述搅拌的转速为180～210r/min。
6.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述小麦种子的引发包括以下步骤：
(1)将待处理的小麦种子表面消毒后浸泡于水中，待小麦种子吸水膨胀但未开始露白，得到吸水的小麦种子；
(2)用核盘菌的发酵液对吸水的小麦种子浸泡3～6h，然后干燥至恒重。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，水中的浸泡时间为5～8h。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述核盘菌的发酵液的剂型为水悬浮剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述水悬浮剂中除了核盘菌的发酵液外还包括防腐剂、保护剂和防霉剂。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述核盘菌的发酵液的体积与待处理的小麦种子的质量之比为80～150mL:1kg。
11.权利要求1～10任意一项所述方法在核盘菌促进小麦生长、提高小麦产量、提高小麦抗病性的应用。
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