CN106061243B

CN106061243B - 用于提高作物产量和防虫害的真菌内生菌

Info

Publication number: CN106061243B
Application number: CN201480072142.7A
Authority: CN
Inventors: G·A·斯沃德
Original assignee: University of Guelph
Current assignee: University of Guelph
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2019-07-26
Anticipated expiration: 2034-11-06
Also published as: US20180092365A1; AU2017254880A1; US10375966B2; US11771090B2; ES2779303T3; US10813359B2; US20150126365A1; EP3068212B1; US9545111B2; US20160286821A1; CA2929487C; IL264942B; AU2018204758A1; US20200163344A1; EP3653056A1; US20160192662A1; AU2014346664A1; MX2016005921A; AU2018204758B2; CA3105900A1

Abstract

本发明提供了作物和至少一种真菌内生菌的合成组合，其中作物是该内生菌的宿主植物。还提供了用于产生所述合成组合的方法和组合物。内生菌繁殖并且增强了作物的农艺学特征。还描述了用内生菌接种宿主植物的方法，用于繁殖宿主‑内生菌组合的方法，以及用于检测宿主植物内内生菌或其代谢产物的存在的方法。

Description

用于提高作物产量和防虫害的真菌内生菌

相关申请的交叉参考

本申请要求均在2013年11月6日提交的美国临时专利申请No.61/900,929和61/900,935的优先权，将其全部按引用并入本文中。

序列表的引入

随同本文一起电子提交了序列表并按引用并入本文中，所述序列表包含在Microsoft Windows操作系统中测量的33千字节并且在2014年11月6日生成的名为TAMC027WO_ST25.txt的文件中。

技术领域

本发明涉及用于提高产量和/或用于防虫害的农作物真菌内生菌。

背景技术

真菌内生菌是定殖在植物组织内部且不引起明显损害或疾病的真菌。特定的真菌内生菌，如菌根，在各种不同的宿主植物组织内存活，常常定殖在宿主的叶、茎、花或根的细胞间隙中。共生的内生菌-宿主关系可以给宿主植物提供几种健康度益处，如营养的增强和/或提高的耐旱性。根定殖菌根依赖于来自植物的光合成碳水化合物存活，并且作为回报，其帮助水和矿物质的增溶并吸收至宿主中，这可以导致促进种子发芽和植物生长。另外，真菌内生菌与宿主植物的关联可以提供对各种生物和非生物胁迫的耐受性。据认为通过内生菌-宿主关联的多个有益特性获得了宿主生长、健康度促进和保护。例如，植物内生生物体可以产生生长调节物质来诱使生物质产生和生物碱或其他代谢产物。另外，真菌内生菌可以直接抑制或对抗致病微生物，保护植物免受可能的致病菌的伤害。

发明内容

在一个方面中，本发明提供了用于改善农业植物性状的方法，包括将所述植物的农业种子接触包含至少一个物种的纯化兼性真菌内生菌的制剂，其中该内生菌能够产生对植物有益或对害虫有害或兼具这两者的物质，并且其中内生菌以与农业环境中种植的参照种子相比有效调节对于从种子生长的农业植物天然的内生菌的定殖频率，并且对种子或从种子生长的农业植物提供益处的量存在于制剂中。

在另一个方面中，本发明提供了用于对农业植物提供益处的方法，包括用包含纯化的兼性真菌内生菌和农业上可接受载体的组合物处理所述植物、所述植物的种子或所述植物或种子的根围，其中该内生菌能够实现以下至少一种：减少害虫繁殖、杀灭害虫和阻止害虫，并且其中内生菌以对种子或从种子产生的农业植物有效地提供益处的量存在于组合物中。

在再另一个方面中，本发明提供了用于对农业植物提供益处的方法，包括获得农业植物种子和纯化的兼性真菌内生菌的合成组合，其中该内生菌能够实现以下至少一种：减少害虫繁殖、杀灭害虫和阻止害虫，并且其中内生菌以对种子或从种子产生的农业植物有效地提供益处的量存在于合成组合中。

在另一个实施方案中，提供了生产具有非天然存在的内生菌比例的植物的方法，其中所述方法包括将植物的农业种子接触包含至少一个物种的兼性真菌内生菌的制剂，其中该内生菌以与农业环境中种植的参照种子相比有效调节对于从种子生长的农业植物天然的内生菌的定殖频率的量存在于制剂中，其中具有非天然存在的内生菌比例的植物与具有天然存在的比例的植物相比具有改善的性状。在进一步的方面中，兼性真菌内生菌能够产生对植物有益或对害虫有害或兼具这两者的物质。

在另一个方面中，本发明提供了用于改变植物中的系统防御途径的方法，包括将所述植物的农业种子接触包含至少一个物种的纯化兼性真菌内生菌的制剂，其中该内生菌能够产生对植物有益或对害虫有害或兼具这两者的物质，并且其中内生菌以有效调节从植物种子生长的农业植物内至少一种植物激素的水平以及对种子或从种子生长的农业植物提供益处的量存在于合成组合中。在进一步的方面中，兼性真菌内生菌能够产生对植物有益或对害虫有害或兼具这两者的物质。

在其他实施方案中，本发明提供了与农业环境中种植的参照种子相比调节对于从种子生长的农业植物天然的内生菌的定殖频率的方法，包括将农业植物的种子接触包含至少一个物种的兼性真菌内生菌的制剂，并且其中内生菌以有效调节天然内生菌的定殖频率以及对种子或从种子生长的农业植物提供益处的量存在于制剂中。在特定的方面中，天然内生菌是链格孢属(Alternaria)的。在进一步的方面中，兼性真菌内生菌能够产生对植物有益或对害虫有害或兼具这两者的物质。

在另一个方面中，本发明提供了用于改变植物中的系统防御途径的方法，包括将所述植物的农业种子接触包含至少一个物种的纯化兼性真菌内生菌的制剂，并且其中该内生菌以有效调节从植物种子生长的农业植物内至少一种植物激素的水平以及对种子或从种子生长的农业植物提供益处的量存在于合成组合中。在进一步的方面中，兼性真菌内生菌能够产生对植物有益或对害虫有害或兼具这两者的物质。

在再另一个方面中，本发明提供了生产具有包含链格孢属的内生菌的真菌内生菌网络的植物的方法，包括(a)将农业植物的种子接触包含至少一个非链格孢属物种的兼性真菌内生菌的制剂，其中该内生菌以对种子或从种子生长的农业植物有效地提供益处的量存在于制剂中，并且其中从种子生长的植物包含链格孢属的内生菌。在进一步的方面中，兼性真菌内生菌能够产生对植物有益或对害虫有害或兼具这两者的物质。

本文中还提供了农业植物种子和包含至少一个物种的纯化的昆虫病原性真菌内生菌的组合物的合成组合，其中该内生菌能够(1)定殖于从植物种子生长的农业植物中，和(2)从农业植物实现以下至少一种：减少害虫繁殖、杀灭害虫和阻止害虫；其中内生菌不是球孢白僵菌(Beauveria bassiana)种，并且其中内生菌以在种子或植物生长于农业环境中时对种子或从种子产生的农业植物有效地提供除了增强的生物胁迫抗性以外的益处的量存在于合成组合中。

在再另一个方面中，本发明提供了农业植物种子和包含至少一个物种的纯化兼性真菌内生菌的组合物的合成组合，其中该内生菌以有效调节从植物种子生长的农业植物内至少一种植物激素的水平以及对种子或从种子生长的农业植物提供益处的量存在于合成组合中。在进一步的方面中，兼性真菌内生菌能够产生对植物有益或对害虫有害或兼具这两者的物质。

在另一个实施方案中，本发明提供了农业植物种子和包含至少一个物种的纯化兼性真菌内生菌的组合物的合成组合，其中兼性真菌内生菌以与农业环境中种植的参照种子相比有效调节对于从种子生长的农业植物天然的内生菌的定殖频率以及对种子或从种子生长的农业植物提供益处的量存在于合成组合中。在进一步的方面中，兼性真菌内生菌能够产生对植物有益或对害虫有害或兼具这两者的物质。在特定的方面中，兼性真菌内生菌以与农业环境中种植的参照种子相比有效调节对于从种子生长的农业植物天然的链格孢属的内生菌的定殖频率的量存在于合成组合中。

在针对这些方法和合成组合中的某些的进一步方面中，包含纯化兼性真菌内生菌的组合物还包含农业上可接受的载体。

在针对这些方法和合成组合中的某些的进一步方面中，兼性真菌内生菌可以是丝状真菌内生菌。在其他实施方案中，兼性内生菌可以是形成孢子的。在进一步的其他实施方案中，兼性内生菌可以是有隔膜真菌内生菌。在再其他实施方案中，兼性真菌内生菌可以是暗色有隔膜真菌内生菌。在一些实施方案中，兼性内生菌可以是昆虫病原体。在一些实施方案中，兼性真菌内生菌可以属于子囊菌门(Ascomycota)或担子菌门(Basidiomycota)。在进一步的方面中，兼性真菌内生菌可以属于盘菌亚门(Pezizomycotina)、伞菌亚门(Agaricomycotina)或黑粉菌亚门(Ustilaginomycotina)。在再另一个方面中，兼性真菌内生菌可以属于粪壳菌纲(Sordariomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、伞菌纲(Agaricomycetes)、黑粉菌纲(Ustilaginomycetes)或散囊菌纲(Eurotiomycetes)。在再另一个方面中，兼性真菌内生菌可以属于肉座菌目(Hypocreales)、格孢腔菌目(Pleosporales)、煤炱菌目(Capnodiales)、粪壳菌目(Sordariales)、多孔菌目(Polyporales)、间座壳菌目(Diaporthales)、黑粉菌目(Ustilaginales)、炭角菌目(Xylariales)、圆盘菌目(Orbiliales)、假毛球壳目(Trichosphaeriales)或散囊菌目(Eurotiales)。

在进一步的方面中，兼性真菌内生菌可以是来自表1的种，即：交互枝顶孢(Acremonium alternatum)、互隔链格孢(Alternaria alternata)、芸苔链格孢(Alternaria brassicae)、密实链格孢(Alternaria compacta)、香石竹链格孢(Alternaria dianthi)、长柄链格孢(Alternaria longipes)、苹果链格孢(Alternariamali)、芝麻链格孢(Alternaria sesami)、茄链格孢(Alternaria solani)、链格孢属、极细链格孢(Alternaria tenuissima)、子囊菌门(Ascomycota sp.)、穗状平脐蠕孢(Bipolarisspicifera)、变灰尾孢(Cercospora canescens)、辣椒尾孢(Cercospora capsici)、菊池尾孢(Cercospora kikuchii)、百日草尾孢(Cercospora zinnia)、球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)、Chaetomium piluliferum、毛壳菌属(Chaetomium sp.)、芽枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides)、枝孢属(Cladosporium sp.)、夏孢生枝孢(Cladosporium uredinicola)、旋孢腔菌属(Cochliobolus sp)、Phanerochaete crassa、Phoma americana、Phoma subherbarum、枫香拟茎点霉(Phomopsis liquidambari)、拟茎点霉属(Phomopsis sp.)、格孢腔菌属(Pleospora sp.)、格孢腔菌科(Pleosporaceae sp.)、多孔菌目、Preussia africana、光黑壳属(Preussia sp.)、Pseudozyma sp.、圆核腔菌(Pyrenophora teres)、辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)、Coniolariella gamsii、油桐盾壳酶(Coniothyrium aleuritis)、盾壳霉属(Coniothyrium sp.)、多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)、间座壳属(Diaporthe sp.)、蕉孢壳属(Diatrype sp.)、Drechslerella dactyloides、Embellisia indefessa、黑附球菌(Epicoccum nigrum)、附球菌属(Epicoccum sp.)、喙状明脐菌(Exserohilum rostratum)、厚孢镰刀菌(Fusariumchlamydosporum)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、Gibellulopsis nigrescens、Gnomoniopsissp.、Lewia infectoria、咖啡球腔菌(Mycosphaerella coffeicola)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae sp.)、稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)、黑孢菌属(Nigrosporasp.)、球孢黑孢霉(Nigrospora sphaerica)、拟青霉属(Paecilomyces sp.)、桔青霉(Penicillium citrinum)、Retroconis sp.、根盘菌属(Rhizopycnis sp.)、Schizotheciuminaequale、壳多孢属(Stagonospora sp.)、Stemphylium lancipes、Thielaviahyrcaniae、梭孢壳属(Thielavia sp.)、Ulocladium chartarum、轮枝孢属(Verticilliumsp.)、球孢白僵菌、寄生曲霉、蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)和淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。

在进一步的方面中，兼性真菌内生菌包含与SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:77任一个中提供的核酸至少97％相同，例如，至少98％相同、至少99％相同、至少99.5％相同或100％相同的核酸，例如，实施例16中所列的那些。

在针对这些方法中的某些的另一个方面中，可以包括将接触的种子包装在容器中的附加步骤。在特定方面中，包装材料可以选自袋子、盒子、箱子、信封、纸盒或容器，并且可以包含干燥剂。

在针对这些方法和合成组合中的某些的进一步方面中，在群体水平测量对处理的种子或从处理的种子生长的植物的益处，如与植物的参照群体比较的。在特定方面中，兼性真菌内生菌可以对作物提供益处，包括从用内生菌处理的种子产生的多种农业植物。在特定方面中，本发明公开了通过种植上述种子的群体产生的基本上均一的植物群体。在一个实施方案中，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或更多植物在一个或多个组织中包含有效量的一种或多种内生菌。在另一个实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、至少80％、至少95％或更多植物包含基本上相似的微生物群体。

在针对这些方法和合成组合中的某些的进一步方面中，植物在农业背景或环境中生长，包括温室。在一个实施方案中，农业背景或环境包括至少100株植物。在另一个实施方案中，群体占据至少约100平方英尺的空间，其中群体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％包含有效量的微生物。在另一个实施方案中，群体占据至少约100平方英尺的空间，其中群体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％在繁殖组织中包含微生物。在再另一个实施方案中，群体占据至少约100平方英尺的空间，其中群体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％包含至少10CFU、100CFU、1,000CFU、10,000CFU或更多本发明的兼性真菌内生菌。在再另一个实施方案中，群体占据至少约100平方英尺的空间，其中群体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％包含本发明的兼性真菌内生菌。

在一个实施方案中，群体中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或更多的种子含有布置在种子表面上的一种或多种活的内生菌。在特定的实施方案中，群体中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或更多的种子含有至少10CFU，例如，至少30CFU、至少100CFU、至少300CFU、至少1,000CFU、至少3,000CFU、至少10,000CFU或更多涂覆到种子表面上的一种或多种内生菌。

在针对这些方法和合成组合中的某些的进一步方面中，对于农业植物天然的并且其定殖频率或比例被改变的内生菌可以属于子囊菌门或担子菌门。在再另一个方面中，农业植物天然的内生菌可以是锤舌菌纲(Leotiomycetes)、座囊菌纲、散囊菌纲、酵母菌纲(Saccharomycetes)、粪壳菌纲、伞菌纲、微球黑粉菌纲(Microbotryomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)。在再另一个方面中，天然内生菌可以属于煤炱菌目、格孢腔菌目、刺盾炱目(Chaetothyriales)、散囊菌目、酵母菌目(Saccharomycetales)、间座壳菌目、肉座菌目、长喙壳菌目(Ophiostomatales)、粪壳菌目、假毛球壳目、炭角菌目、鸡油菌目(Cantharellales)、伏革菌目(Corticiales)、多孔菌目、红菇目(Russulales)、锁掷酵母目(Sporidiobolales)或银耳目(Tremellales)。在进一步的方面中，天然内生菌可以属于新球腔菌科(Davidiellaceae)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae)、格孢腔菌科(Pleosporaceae)、小双腔菌科(Didymellaceae)、荚孢腔菌科(Sporormiaceae)、刺盾炱科(Chaetothyriaceae)、发菌科(Trichocomaceae)、酵母科(Saccharomycetaceae)、日规壳菌科(Gnomoniaceae)、虫草菌科(Cordycipitaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)、肉座菌科(Hypocreaceae)、Plectosphaerellaceae、长喙壳菌科(Ophiostomataceae)、毛壳菌科(Chaetomiaceae)、毛球壳菌科(Lasiosphaeriaceae)、假毛球壳菌科(Trichosphaeriaceae)、角担菌科(Ceratobasidiaceae)、伏革菌科(Corticiaceae)、革菌科(Coriolaceae)、隔孢伏革菌科(Peniophoraceae)、锁掷酵母科(Sporidiobolaceae)或银耳科(Tremellaceae)。在进一步的方面中，农业植物天然的内生菌可以是来自表2的物种，即，枝孢属、芽枝状枝孢、新球腔菌属(Davidiella sp.)、尾孢属(Cercospora sp.)、甜菜生尾孢(Cercospora beticola)、链格孢属、互隔链格孢、柑橘链格孢(Alternaria citri)、极细链格孢、旋孢腔菌属、弯孢霉属(Curvularia sp.)、明脐菌属(Exserohilum sp.)、李维菌属(Lewia sp.)、Lewia infectoria、核腔菌属(Pyrenophora sp.)、偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)、格孢腔菌属、Phoma americana、Preussia africana、青霉属(Penicillium sp.)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces sp.)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、念珠菌属(Candida sp.)、桔假丝酵母(Candidaquercitrusa)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、Cyberlindnera sp.、Cyberlindnerajadinii、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、Gnomoniopsis sp.、球孢白僵菌、虫草属(Cordyceps sp.)、球孢虫草(Cordyceps bassiana)、镰刀菌属、Gibellulopsis nigrescens、肉座菌属(Hypocreasp.)、哈茨木霉(Hypocrea lixii)、绿色木霉菌(Hypocrea virens)、木霉属(Trichodermasp.)、Trichoderma tomentosum、轮枝孢属、长喙壳菌属(Ophiostoma sp.)、Ophiostomadendifundum、毛壳菌属(Chaetomium sp.)、球毛壳菌、Thielavia hyrcaniae、戴氏霉属(Taifanglania sp.)、Taifanglania inflata、Schizothecium inaequale、黑孢菌属、丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、显革菌属(Phanerochaete sp)、栓菌属(Trametes sp.)、毛栓孔菌(Trametes hirsuta)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、红酵母属(Rhodotorula sp.)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、隐球菌属(Cryptococcus sp)、Cryptococcusskinneri或银耳属(Tremella sp.)。

在针对这些方法和合成组合中的某些的进一步方面中，通过兼性真菌内生菌对农业植物提供的益处是选自以下的改善的农艺特性：相对于参照植物增加的生物质、增加的分蘖、增大的根群、增加的开花、提高的产量、提高的水利用效率、产量损失的降低、改变的植物高度、缩短的发芽时间、提高的秧苗高度、增加的根长度、提高的叶绿素水平、发育花的保持、发育果的保持、改变的植物激素水平和增强的对环境胁迫的抗性。在一些方面中，提供的益处是至少两种植物激素的水平的改变。在一些方面中，环境胁迫选自干旱胁迫、冷胁迫、热胁迫、营养缺乏、盐毒性、铝毒性、食草动物的放牧、虫害、线虫侵染及真菌感染、细菌感染和病毒感染。在一些方面中，对于源自种子的农业植物的益处是所述植物群体相对于参照植物群体的产量提高约5％、10％、15％、20％、30％、40％或45％。在其他方面中，对于源自种子的农业植物的益处是所述植物群体相对于参照植物群体的产量损失的降低超过40％、30％、20％、10％、5％或1％。在一些方面中，用兼性真菌内生菌处理种子可以在从处理的种子生长的植物中降低蓟马损害、降低盲蝽损害、提高遮棚温度、提高干旱耐受性、增加地上生物质和增加地下生物质。

在针对这些方法和合成组合中的某些的进一步方面中，兼性真菌内生菌以有效获得从种子生长的农业植物的叶、茎或根的至少50％定殖的量存在于合成组合中。

在针对这些方法和合成组合中的某些的进一步方面中，兼性真菌内生菌能够产生对害虫有害的物质。在特定的方面中，害虫可以是线虫和/或昆虫，例如，根结线虫、蚜虫、草盲蝽、椿象或其组合。

在针对这些方法和合成组合中的某些的进一步方面中，合成组合可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种兼性真菌内生菌。在一个方面中，本发明提供了棉花植物或种子和包括选自表1中那些的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种内生菌的真菌内生菌的合成组合，其中棉花或种子是该内生菌的宿主。

在另一个方面中，提供包含真菌内生菌和至少一种粘着剂的种子包衣，所述真菌内生菌包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种来自表1的内生菌；其中真菌内生菌接触粘着剂。在特定方面中，粘着剂可以包含例如海藻酸、卡拉胶、糊精、葡聚糖、pelgel、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、聚乙烯醇或其组合。在特定方面中，粘着剂可以具有1:1-10、1:10-50、1:50-100、1:100-500、1:500-1000或1:1000-5000的真菌内生菌与粘着剂的重量比。种子包衣可以是固体或流体。在特定方面中，种子包衣是粉末。在特定方面中，真菌内生菌可以包含真菌孢子。在各个不同的方面中，种子包衣可以包含约1、2、5、10、50、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹或更多个集落形成单位/克或孢子/克。

在特定实施方案中，用于叶或土壤应用的组合物可以包含真菌内生菌和至少一种载体、表面活性剂或稀释剂，所述真菌内生菌包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种来自表1的内生菌。在特定方面中，组合物可以包含约1、2、5、10、50、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹或更多个集落形成单位/克或孢子/克。在各个不同的方面中，组合物可以包含例如水、去污剂、Triton X、杀虫剂、杀真菌剂或其组合。在进一步的实施方案中，种子组合物包含植物种子和上述种子包衣。在特定方面中，植物种子包含棉花种子、农艺学优良植物的种子、双子叶植物种子和/或单子叶植物种子。在特定方面中，种子组合物可以抵抗包括昆虫和/或线虫的害虫。

在再另一个方面中，本发明提供了用于预防害虫侵袭或提高产量的方法，其可以包括用本文中所述的包含内生菌的组合物处理植物、植物种子或所述植物或种子的根围。在特定方面中，所述方法还可以包括鉴定需要内生菌处理的植物或种子。害虫可以包括例如线虫和/或昆虫。在特定方面中，害虫可以包括根结线虫、蚜虫、草盲蝽、椿象或其组合。

在再另一个方面中，提供了用于预防害虫侵袭的方法，包括获得本文中所述的种子并种植所述种子。该方法可以进一步包括确认预防害虫侵袭的需要。在特定方面中，害虫可以包括例如线虫和/或昆虫；和/或害虫可以包括根结线虫、蚜虫、草盲蝽、椿象或其组合。

在进一步的实施方案中，一种用于处理害虫侵袭的方法包括鉴定怀疑受害虫侵染的植物，将上述组合物施用于植物，由此产生内生菌处理的植物。在特定方面中，害虫可以包括例如线虫和/或昆虫；和/或害虫可以包括根结线虫、蚜虫、草盲蝽、椿象或其组合。

在再另一个方面中，提供了一种生产抗害虫种子的方法，包括提供包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种来自表1的内生菌的真菌内生菌组合物，提供种子；并将种子与内生菌组合物组合，由此产生抗害虫种子。在特定方面中，该方法提高了从种子发育的植物的内生菌定殖百分比。

在再另一个方面中，公开了提高作物产量或降低损失的方法，包括提供包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种来自表1的内生菌的真菌内生菌组合物；并将内生菌组合物施用于种子、植物或其部分，由此提高作物的产量。在特定方面中，作物可以是棉花，并且产量提高可以为相对于未施用内生菌组合物的作物的至少约2％、3％、5％、15％、20％或25％。在特定方面中，产量提高为相对于未使用内生菌组合物的作物的约2％-5％、3％-5％、5％-10％、10％-15％或高于约20％、30％或更多。在特定方面中，作物是棉花，并且产量的提高包括降低的棉铃损害。在特定方面中，损失的降低包括由于昆虫侵袭或干旱引起的损失的降低，并且降低相对于未施用内生菌组合物的作物低于50％、40％、30％、20％、10％、5％或5％。

本文中还描述了包含植物或植物的部分(包括种子)并且进一步包含以可检测水平(例如，通过PCR检测其核酸的存在)存在的上述兼性真菌内生菌的商业植物产品。在另一个方面中，公开了一种生产商业植物产品的方法，包括从上述合成组合获得植物或植物组织，并且从其生产商业植物产品。可以从种子或从自种子生长的植物(或植物的部分)来生产商业植物产品。也可以从这样的植物或植物部分的后代来生产商业植物产品。商业植物产品可以选自籽粒、面粉、淀粉、种子油、糖汁、粗粉、面粉、油、膜、包装、营养产品、动物饲料、鱼饲料、谷物产品、加工的人食品、糖或者醇和蛋白质。

附图说明

图1：定殖效率证明了内生菌可以在田间操作。描绘了在通过用不同孢子浓度的(左)淡紫拟青霉或(右)球孢白僵菌处理的种子接种的田间条件下，棉花秧苗的平均+/-SE内生菌定殖效率。

图2：在作为内生菌存在于棉花中时，真菌内生菌淡紫拟青霉负面地影响了根结线虫(南方根结线虫(Meloidogyne incognita))的繁殖。在高线虫接种水平(10,000个卵)下，在用含有10⁶或10⁷个孢子/ml的溶液处理种子后，与未处理的对照种子相比，内生菌降低了植物中的卵产生。在田间接种水平(2000个卵)下，内生菌的存在在两个种子处理浓度下都显著降低了虫瘿和卵产生。

图3：内生菌球毛壳菌负面地影响了根结线虫繁殖。棉花种子在0(未处理对照)、10⁶和10⁸个孢子/ml的溶液中浸泡处理后，内生菌球毛壳菌对根结线虫虫瘿形成和卵产生的负效应。秧苗接种1000个线虫卵于温室中生长。60天后定量成功侵染秧苗的孵化线虫的卵产生。

图4A，4B：真菌内生菌对棉花蚜虫(棉蚜(Aphis gossypii))繁殖的作用。图4A证明了棉花中球孢白僵菌的存在负面地影响了棉花蚜虫的繁殖。图4B证明了棉花中淡紫拟青霉的存在负面地影响了棉花蚜虫的繁殖。

图5：球毛壳菌对棉花蚜虫的作用。棉花中的内生菌球毛壳菌负面地影响了棉花蚜虫群体生长率，如通过14天后内生菌定殖相对于对照植物降低的繁殖所证明的。棉花植物从通过在0(对照)、10⁶(低)和10⁸(高)个孢子/ml的孢子溶液中浸泡处理的种子生长得到。

图6A，6B：真菌内生菌球孢白僵菌和淡紫拟青霉对西部牧草盲蝽草盲蝽(Lygushesperus)(盲蝽科(Miridae))的作用。图6A证明了当作为棉花中的内生菌存在时，球孢白僵菌和淡紫拟青霉负面地影响西部牧草盲蝽的宿主植物选择。图6B证明了当作为棉花中的内生菌存在时，球孢白僵菌和淡紫拟青霉负面地影响了西部牧草盲蝽的宿主植物选择行为。

图7A，7B：真菌内生菌球孢白僵菌和淡紫拟青霉对南方绿椿象(稻绿蝽(Nezaraviridula)(蝽科(Pentatomidae))的作用。图7A证明了当作为棉花中的内生菌存在时，球孢白僵菌和淡紫拟青霉负面地影响了南方绿椿象的宿主植物选择。图7B证明了当作为棉花中的内生菌存在时，球孢白僵菌和淡紫拟青霉负面地影响了南方绿椿象的宿主植物选择行为。

图8：在田间试验过程中观察到了棉铃损害的降低。相对于对照植物，在将种子浸泡在10⁶和10⁸孢子/ml浓度下的球孢白僵菌和淡紫拟青霉的孢子溶液中处理的植物中，昆虫相关的棉铃损害水平较低。

图9：对田间棉花叶施用内生昆虫病原性真菌提高了植物性能。将多种典型的杀真菌剂(甲霜灵、三唑醇、三氟敏、2-(thiocyanome-thylthio)苯并噻唑)和杀虫剂(硫双威、吡虫啉、陶斯松(Chloropyrifos))种子处理所处理的棉花(品种FM1740B2F)种子在田间条件下种植并生长。在第5真叶阶段给植物喷洒球孢白僵菌和烟色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)的水溶液。包括蔗糖(1％wt/vol)作为真菌的附加营养源。在喷洒不含蔗糖的球孢白僵菌和加蔗糖的烟色拟青霉的植物中观察到了明显更高的第一位棉铃(发育果)的保持。

图10A，10B：田间条件下真菌内生菌对棉花植物性能的正向作用。图10A证明了处理的植物相对未处理的植物中较高棉蕾保持的早季趋向。图10B证明了在季节中较晚时间内生菌处理组中相对于对照保留了明显更多的棉铃。用所使用的两个内生菌种和所使用的两个种子处理浓度证明这一情况(重复测量ANOVA：时间，P<0.001；时间*内生菌，P＝0.045，内生菌，P＝0.003)。

图11：田间条件下，真菌内生菌对棉花产量的正向作用。数据证明了内生菌处理在处理的棉花植物中获得了高25％的产量。

图12：在生长室秧苗分析下，真菌内生菌对高粱(a)植物高度和(b)总的鲜生物量的正向作用。所示数据是n＝10独立重复的平均植物高度(cm)和总的鲜生物量(g)。误差条表示±1标准误差。所有三种真菌内生菌相对于未处理对照提高了两种性状。

图13：在用真菌内生菌淡紫拟青霉(a，c)和球孢白僵菌(b，d)处理时，(a，b)茎和(c，d)根中内源性棉花内生菌定殖的田间调节。所示数据是相对于未处理的对应对照和植物组织的定殖百分变化。

图14：针对15种兼性真菌内生菌和两个棉花栽培品种(Delta Pine(DP 0912B2RF)和Phytogen(PHY 499WRF))的内生菌处理植物和对照棉花植物之间产量的平均百分比差异(n＝旱地中的6个重复地块，College Station，TX)。在Delta Pine上，测试的15种兼性真菌内生菌中的11种，和在Phytogen上，15种中的14种显示出相对于未处理棉花植物的产量提高。

图15：针对15种兼性真菌内生菌和两个棉花栽培品种(Delta Pine(DP 0912B2RF)和Phytogen(PHY 499WRF))的内生菌处理植物和对照棉花植物之间产量的总体平均百分比差异(n＝旱地中的6个重复地块，College Station，TX)。条表示围绕平均值的95％置信区间。

图16：内生菌处理植物和对照棉花植物之间蓟马损害(A)和盲蝽损害(B)的平均百分差异。在Delta Pine(DP 0912B2RF)栽培品种中针对15种兼性真菌内生菌评价了蓟马损害(n＝旱地中的6个重复地块，College Station，TX)。测试的15种兼性真菌内生菌中12种显示出相对于未处理棉花植物的蓟马损害降低。在Phytogen(PHY 499WRF)栽培品种的棉花植物中针对15种兼性真菌内生菌评价了盲蝽损害(n＝旱地中的6个重复地块，CollegeStation，TX)。测试的15种兼性真菌内生菌中的6种显示出与未处理棉花植物相比的盲蝽损害的平均降低。

图17：在(A)根长度和(B)地下重量的旱地试验中，在6月测量的季中田间性状。呈现的数据是n＝10个独立重复的平均，并且误差条表示±一个标准误差。

图18：在针对(蓝条)Delta Pine和(绿条)Phyton栽培品种的遮棚温度(℃)的旱地试验中，在7月测量的季中田间性状。呈现的数据是相对于对照地块的n＝10个独立重复的块对照平均，并且误差条表示±一个标准误差。

图19：在针对(蓝条)Delta Pine和(绿条)Phyton栽培品种的NDVI的旱地试验中，在8月测量的季中田间性状。呈现的数据是相对于对照地块的n＝10个独立重复的块对照平均，并且误差条表示±一个标准误差。

图20：在针对(蓝条)Delta Pine和(绿条)Phyton栽培品种的第一位棉蕾保持的旱地试验中，在8月测量的季中田间性状。呈现的数据是相对于对照地块的n＝10个独立重复的块对照平均，并且误差条表示±一个标准误差。

图21：在针对(蓝条)Delta Pine和(绿条)Phyton栽培品种的植物高度(cm)的旱地试验中，在8月测量的季中田间性状。呈现的数据是相对于对照地块的n＝10个独立重复的块对照平均，并且误差条表示±一个标准误差。

图22：在针对(蓝条)Delta Pine和(绿条)Phyton栽培品种的植物高度(cm)的旱地试验中，在7月测量的季中田间性状。呈现的数据是相对于对照地块的n＝10个独立重复的块对照平均，并且误差条表示±一个标准误差。

图23：显示了与未处理对照(左半图)相比，用内生菌处理的植物(右半图)中提高的生物量的照片。

图24：显示了针对从用真菌内生菌处理的种子生长的植物和对照，干旱胁迫后以天计的枯萎时间的表。

图25：显示了针对从用真菌内生菌处理的种子生长的植物和对照，干旱胁迫后以天计的死亡时间的表。

具体实施方式

真菌内生菌在自然界中普遍存在，实际上感染自然界和农艺生态系统中的所有植物。植物通常带有在其组织中生活的多样真菌，其作为可以提供针对各种生物和非生物应激原的保护的无症状内生菌。本公开描述了可以是植物病原体、昆虫和线虫害虫的病原体、寄生虫或拮抗剂的特定真菌内生菌，由此对作物提供健康度和性能益处。共生内生菌-宿主关系可以对宿主植物提供几种一般的健康和健康度益处，如营养的增强、提高的干旱耐受性和/或潜在食草动物的化学防御及通常增强的生物量产生。根定殖的菌根依赖于来自植物的光合碳水化合物存活，并且作为回报，帮助水和矿物质的增溶并吸收至宿主中，这可以导致种子发芽和植物生长的促进。另外，真菌内生菌与宿主植物的关联常常提供针对病原体的保护或对各种生物和非生物胁迫的耐受性，如昆虫侵袭、放牧、水或营养缺乏、热胁迫、盐或铝毒性和极冷温度。据认为通过内生菌-宿主关联的多重有益特性获得了宿主生长及健康度促进和保护。

表1中提供的这些真菌内生菌最初作为棉花的真菌内生菌收集。这些真菌内生菌可以使用种子、土壤或叶施用来接种以在棉花内生活，并通过提供对抗害虫侵袭的保护作用呈现令人惊讶的有益效果。害虫可以是线虫和/或昆虫害虫。此外，这些真菌内生菌对棉花产量具有出乎预料的有益效果。

描述了施用有益真菌以在作物内确立内寄生(endophytically)而提高植物性能和产量，同时给予对抗昆虫和线虫害虫的保护。在这一点上，本发明克服了现有技术的限制，如真菌在作为饱和的(inundative)土壤或叶生物杀虫剂施用暴露于环境后对UV光、干燥或热引起的降解的易感性。植物内真菌的接种和内寄生确立保护真菌免受UV光、干燥和不利温度的影响，同时在它们打算保护的特定植物组织中携带真菌。引入真菌以在植物内通过内寄生生活不需要植物或微生物的遗传修饰，并且真菌自身可以是用于自然产品的来源。在各种不同的实施方案中，可以配制并施用真菌接种物，例如，在种植之前或期间在沟施中作为种子的处理，或在植物发芽后作为叶面施用，并且在接种后，真菌内生菌提供整季的保护作用和较高的作物产量(大约高25％)。在特定实施方案中，产量的提高为相对于没有施用内生菌组合物的作物的约5％、10％、15％、20％、30％、40％、45％、50％或高于50％。在进一步的实施方案中，产量的提高为损失降低的结果，包括由于昆虫侵袭或干旱引起的损失的降低，并且相对于没有施用内生菌组合物的作物，损失低于50％、40％、30％、20％、10％、5％或5％。在特定实施方案中，作物是棉花并且损失的降低包括降低的棉铃损害。

因此，在一个方面中，本发明提供了宿主植物和允许宿主植物的改善农艺学特性的内生菌的组合(也称为“symbiotum”)。所述组合可以通过用本发明的真菌内生菌菌株人工接种、施用或以其他方式感染宿主植物或其种子(如棉花植物或其种子)或宿主植物组织来获得。因此，通过这样的接种获得的组合称为“合成”组合(combination)、合成组合物(composition)、合成种子包衣、合成抗害虫种子组合物。真菌内生菌可以存在于植物组织(如根)内的细胞间隙中。通过嫁接或其他接种方法，如用内生菌菌丝或内生菌孢子处理种子、植物或其部分，植物或植物群体内也可以发生真菌内生菌的存在或真菌内生菌也可以在植物或植物群体内维持。在特定实施方案中，在施用内生菌之前，将植物、植物部分、根、种子或叶灭菌以除去微生物。在特定的实施方案中，在添加本文中所述的内生菌组合物之前，将种子灭菌以除去天然的内生菌。在特定方面中，种子发芽的能力不受灭菌影响。

本发明还提供了用于检测宿主植物内本发明的真菌内生菌存在的方法。例如，这可以通过从潜在植物-内生菌组合的组织分离总DNA，接着PCR，或可选地，Southern印迹、western印迹或本领域已知的其他方法，来检测与本发明的真菌内生菌菌株的存在相关的特定核酸或氨基酸序列存在来完成。或者，可以利用生化方法，如ELISA、HPLC、TLC或真菌代谢物分析，来测定作物组织的给定样品中本发明的内生菌菌株的存在。另外，用于鉴定的方法可以包括显微分析，如根染色，或培养方法，如出芽测试或本领域已知的其他方法(Deshmukh等，2006)。在特定的实施方案中，可以用真菌特异性染料，如WGA-Alexa 488，将潜在的草本植物-内生菌组合的根染色，并且通过显微镜分析来确定真菌根共生(fungalroot associate)。

在特定实施方案中，农艺学质量可以选自：增加的生物量、增加的分蘖、增大的根群、提高的开花、提高的种子产量和增强的对生物和/或非生物胁迫的抗性，将这些品质中的每一种与在相同条件下生长且区别仅在于真菌内生菌的存在或不存在的其他方面相同的植物相比进行分级。本发明的合成组合和方法可应用于应答实际或预期的胁迫。这样的胁迫可以包括，例如，干旱(缺水)、寒冷、热胁迫、营养缺乏、盐毒性、铝毒性、食草动物的放牧、虫害、线虫侵染及真菌感染、细菌感染和病毒感染等。

在一个实施方案中，本公开提供了选自表1中那些的真菌内生菌，其负面地影响以地上叶为食的草食昆虫(棉蚜虫，棉蚜)和攻击地下根的植物寄生线虫(根结线虫，南方根结线虫)繁殖。此外，在使用这些内生菌处理种子的田间试验中，相对于未定殖的对照植物，可以在定殖植物中观察到提高的植物性能和产量。例如，使用球毛壳菌作为温室试验中的内生菌，在棉花中证明了植物生长增强和提高的根结线虫抗性。此外并且作为进一步的非限制说明性实例，使用球孢白僵菌作为棉花中的内生菌，在温室和田间试验中证明了昆虫(棉蚜)繁殖的降低。淡紫拟青霉和球孢白僵菌的内生菌存在也对攻击棉花的发育花和果实的关键刺吸式害虫(豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)和稻绿蝽)的宿主选择行为具有负面作用。此外，在使用球孢白僵菌作为棉花中的内生菌的田间试验中，证明了内生菌定殖植物相对于未定殖的对照植物的植物性能和较高产量的正向作用。

可以使用本领域已知的方法检测植物之间的代谢组学差异。例如，基本上可以按照Fiehn等(2000)Nature Biotechnol.，18，1157-1161或Roessner等(2001)Plant Cell，13，11-29中所述的来分析来自内生菌共生的和参照农业植物的生物样品(完整组织、渗出液、韧皮部汁液、木质部汁液、根渗出液等)。这样的代谢组学方法可以用于检测激素水平、营养素、次级代谢产物、根渗出液、韧皮部汁液含量、木质部汁液含量、重金属含量等的差异。

在另一个实施方案中，本发明设想用多种内生菌涂覆植物种子的方法，以及在种子上和/或中包含多种内生菌的种子组合物。根据这个实施方案的方法可以以与本文中用于单一内生菌涂覆的那些相似的方式来进行。在一个实例中，可以在涂覆到种子上的单一制备物中制备多种内生菌。内生菌可以来自共同来源(即，同一植物)。或者，内生菌可以来自不同植物。

在将多种内生菌涂覆于种子上的情况中，任一种或全部内生菌可能能够赋予宿主植物有益性状。在一些情况中，所有内生菌能够赋予宿主植物有益性状。每种内生菌赋予的性状可以相同(例如，都改善宿主植物对特定生物胁迫的耐受性)，或可以显著不同(例如，一种提高宿主植物对干旱的耐受性，而另一种提高磷酸盐利用)。在其他情况中，赋予的性状可以是内生菌之间相互作用的结果。

定义

在本文中的描述和表格中，使用了多种术语。为了提供说明书和权利要求中的清晰和一致的理解，提供了以下定义。除非另外指出，术语根据相关领域中普通技术人员的常规使用来理解。

当以单数提供术语时，发明人还考虑了通过该术语的复数描述的本发明的方面。单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非文中另外明确指出另外的情况。例如，术语“一个细胞”包括一个或多个细胞，包括其混合物。

术语“包含”用来表示组合物和方法包括所述要素，但不排除其他的。“基本上由……组成”用于定义组合物和方法时，应当表示排除对组合物具有任何实质重要性的其他要素。因此，基本上由本文中限定的要素组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的微量污染物和农业上可接受的载体。“由……组成”应当表示排除超过微量的其他成分的要素和用于施用本发明组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个限定的实施方案在本发明的范围内。

生物学控制：如本文中使用的，术语“生物学控制(biological control)”及其缩写“生物控制(biocontrol)”定义为通过使用至少一种内生菌对害虫、病原体或者昆虫或任何其他不需要的生物体的控制。

“组合物”旨在表示活性剂和至少另一种化合物、载体或组合物、惰性(例如，可检测试剂或标记或液体载体)或活性物质(如杀虫剂)的组合。

如本文中使用的，“农业种子”是用于农业中生长植物的种子(“农业植物”)。种子可以是单子叶植物或双子叶植物，并且为了农业产品的生产而种植，所述农业产品例如籽粒、食物、纤维等。如本文中使用的，农业种子是为了种植准备的种子，例如，在农田中用于生长。将农业种子区别于商品种子在于农业种子不是用于生产产品，例如，商业植物产品。

如本文中使用的，“商业植物产品”是指由源自本发明的植物、种子、植物细胞或植物部分的材料组成的任何组合物或产品。商业植物产品可以销售给消费者并且可以是能够存活的或非存活的。非存活的商业产品包括但不限于非存活的种子和籽粒：加工的种子、种子部分和植物部分；脱水植物组织、冷冻植物组织和加工的植物组织；加工为陆地和/或水生动物食用的动物饲料的种子和植物部分、油、粗粉、面粉、薄片、麸皮、纤维以及用于人或动物食用的任何其他食物；以及生物质和燃料产品。源自本发明植物的任何这样的商品植物产品可以含有至少可检测量的特定和独特的对应于本文中所述内生菌的DNA。可以使用用于多核苷酸分子的任何标准检测方法，包括本文中公开的检测方法。

如本文中使用的，短语“农艺学优良植物”是指具有适应于商业栽培的表型的基因型或栽培品种。农艺学优良植物包含的性状可以包括生物量、碳水化合物和/或种子产量；生物或非生物胁迫抗性，包括抗旱性、昆虫抗性、真菌抗性、病毒抗性、细菌抗性、耐寒性和耐盐性；提高的直立性(standability)、增强的营养利用效率和降低的木质素含量。

在特定实施方案中，棉花农艺学优良植物包括，例如，已知的棉花品种AM1550B2RF、NG 1511B2RF、NG 1511B2RF、FM 1845LLB2、FM 1944GLB2、FM 1740B2F、PHY499WRF、PHY 375WRF、PHY 367WRF、PHY 339WRF、PHY 575WRF、DP 1252B2RF、DP 1050B2RF、DP1137B2RF、DP 1048B2RF和/或DP 1137B2RF。

如本文中使用的，短语“培养滤液”是指从接种了真菌菌株并使其生长的培养物获得的培养液或培养基。通常将培养基过滤以除去任何悬浮的细胞，留下营养素、激素或其他化学物质。

如本文中使用的，术语“内生菌”是指能够在植物或植物组织内生活的生物体。内生菌可以包含可以对其宿主植物的产量、生物量、抗性或健康度提高的真菌生物体。真菌内生菌可以占据植物组织(包括叶、茎、花和根)的细胞内或细胞外间隙。

短语“害虫抗性”是指抑制或降低来自害虫的攻击。害虫抗性提供高于植物已经具有的害虫抗性的至少一些提高。

如本文中使用的，术语“基因型”是指细胞或生物体的遗传组成。

如本文中使用的，术语“表型”是指细胞或生物体的可检测特征，所述特征是基因表达的直接或间接表现。

如本文中使用的，短语“宿主植物”是指真菌内生菌定殖的任何植物。在特定实施方案中，宿主植物包括定殖植物的后代。

如本文中使用的，短语“提高的产量”是指生物量或种子重量、种子或果实大小、每株植物的种子数量、每单位面积的种子数量、每英亩的蒲式耳数、每英亩的吨数、每公顷的公斤数、碳水化合物产量或棉花产量的提高。这种提高的产量是相对于没有接种内生菌的植物或作物。在特定实施方案中，产量提高是相对于其他常用的害虫处理或解决生物或非生物胁迫的其他方法。

如本文中使用的，短语“生物量”是指一种植物组织、多种植物组织、整个植物或植物群体在给定时间时的总质量或重量(鲜重或干重)，通常以重量/单位面积给出。该术语还可以指群落中的所有植物或物种(群落生物量)。

如本文中使用的，“粘着剂”是指增强孢子与种子表面结合的化合物。此类化合物的非限制性实例是海藻酸、卡拉胶、糊精、葡聚糖、pelgel、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、聚乙烯醇或明胶。

如本文中使用的，“农业上可接受的”赋形剂或载体是适用于农业中而没有对植物、环境或对食用从其衍生得到的农业产品的人或动物的过度不良副作用且具有相称的合理收益/风险比的赋形剂或载体。

如本文中使用的，术语“合成的”或短语“合成组合”是指包括作为或导致宿主植物和内生菌的真菌内生菌-宿主关系(也称为“symbiotum”)的内生菌的菌丝体和/或孢子的人工组合。例如，可以通过用内生菌人工接种、施用于或其他方式感染宿主植物、宿主植物种子或宿主植物组织来获得合成组合。此外，可以通过接种植物的土壤或生长培养基来获得宿主植物和内生菌的组合。

在一个实施方案中，本发明考虑了“分离的”微生物的用途。如本文中使用的，分离的微生物是从其天然环境分离的微生物，且随之推断分离通过人工操作进行。分离的微生物是已经从至少一些之前与其结合的组分(不管是在自然界或在实验环境中)分离出来的微生物。

如本文中使用的，如果植物或一部分植物含有微生物，例如，在不存在任何与微生物制备物的接触的情况下，认为微生物对于植物或一部分植物是“天然的”，并且称为“天然地”存在于植物或一部分植物中。

本文中所述的一些方法允许植物种子被微生物定殖。如本文中使用的，当微生物可以与植物在植物环境中以共生或无害关系存在时，例如，存在于植物上和/或植物内部(包括种子)时，则称微生物“定殖于”植物或种子。

如本文中使用的，植物“群体”是指从覆盖了本文中所述的内生菌的种子生长的多株植物，或是经历接种方法的植物或植物组的后代的多株植物。群体内的植物通常是相同的物种，并且通常还分享共同的遗传起源。

实施例

实施例1：形成孢子悬浮液和种子的处理

植物和真菌内生菌菌株的培养：特定实施方案中使用的棉花种子品种是品种LA122(可获自All-Tex Seed，Inc.，Levelland，TX 79336)。按照所述的，从棉花植物获得淡紫拟青霉和球毛壳菌(Ek-Ramos等，2013，PLoS ONE 8(6)：e66049.doi:10.1371/journal.pone.0066049)。本领域技术人员可以通过进行其中所述的程序获得适用于进行本发明各种不同实施方案的内生菌。简而言之，将植物样品在自来水中冲洗，并通过浸没在70％乙醇中5min，10％漂白溶液中3min并用高压灭菌的蒸馏水冲洗两次将表面灭菌。使用高压灭菌的纸巾将样品吸干。随机选择五个单独的表面灭菌的叶子、棉蕾和棉铃(N＝15个总样品)并压印在新鲜马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)和V8培养基上作为监控表面灭菌效率的方式。对于内生菌分离，将叶子切成大约1cm²的小段。棉蕾和棉铃切成六片。除去任何存在的纤维并切成六个较小的段。将叶段颠倒放置在PDA和V8培养板上，一式三份。每个平板含有3个叶段，每个植物总共分析9段。对于在季中早期采收的棉蕾，将每个棉蕾的3片放置在PDA和V8培养基上，与叶段相同。由于在植物内的大小和位置的相似性，在季中晚期收集时，将来自给定植物的棉蕾和棉铃一起放置在含有两个棉蕾片、两个棉铃片和两个纤维段的皮氏培养皿中。将抗生素青霉素G(100单位/mL)和链霉素(100μg/mL)(Sigma，St Louis，MO，USA)加入培养基中以抑制细菌生长。所有平板在黑暗中在室温下平均孵育两周，直至检测到从植物组织生长出真菌内生菌菌丝。

使用形态学和分子真菌内生菌鉴定的包括性组合用于鉴定。一旦检测到从植物材料生长出真菌菌丝，取样以获得纯的真菌分离物。对于通过PCR的鉴定，从每个分离的真菌菌株的菌丝体按照氯仿:异戊醇24:1方案提取基因组DNA，并使用真菌特异性引物来扩增核核糖体DNA的ITS(内转录间隔)区。该区域是用于真菌的主要条形码标志物，并包括ITS1和ITS2区，其由5.8S核糖体基因分隔开。为了避免在PCR过程中引入偏差(分类偏差和错配的引入)，已经提出只扩增ITS1区，因此将引物ITS1(5’TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3’)(SEQID NO:5)和ITS2(5’GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC 3’)(SEQ ID NO:6)用于扩增并将分离的真菌菌株每一个的～240bp ITS1区测序。将所得到的序列作为查询序列与公众可利用的数据库GenBank核苷酸、UNITE和PlutoF进行比对。后两个数据库是专门汇编的并用于真菌鉴定。表1提供了本发明中鉴定的并有用的内生菌列表。所有这些内生菌属于子囊菌门，盘菌亚门(除了Phanerochaete crassa，其属于担子菌门，伞菌亚门；以及Pseudozyma sp.，其属于担子菌门，黑粉菌亚门)。表1显示了分离的真菌菌株每一个的种/属、科、目、亚纲、纲以及对应于～240bp ITS1区的SEQ DI NO(除了球孢白僵菌、寄生曲霉、蜡蚧轮枝菌和淡紫拟青霉)，其中所示的序列包括ITS1、ITS2、5.8S、18S和28S序列并且获自UNITE数据库，GenBank编号分别为JF837090、JX857815、FJ643076和EU553283。

表1：本发明中鉴定的并有用的内生菌

表1.内生菌列表

交互枝顶孢、互隔链格孢、芸苔链格孢、密实链格孢、香石竹链格孢、长柄链格孢、苹果链格孢、芝麻链格孢、茄链格孢、链格孢属、极细链格孢、子囊菌门、穗状平脐蠕孢、变灰尾孢、辣椒尾孢、菊池尾孢、百日草尾孢、球毛壳菌、Chaetomium piluliferum、毛壳菌属、芽枝状枝孢、枝孢属、夏孢生枝孢、旋孢腔菌属、Phanerochaete crassa,Phoma americana,Phoma subherbarum,枫香拟茎点霉、拟茎点霉属、格孢腔菌属、格孢腔菌科、多孔菌目、Preussia africana、光黑壳属、Pseudozyma sp.、圆核腔菌、辣椒炭疽菌、Coniolariellagamsii,油桐盾壳霉、盾壳霉属、多主棒孢霉、间座壳属、蕉孢壳属、Drechslerelladactyloides、Embellisia indefessa、黑附球菌、附球菌属、喙状明脐菌、厚孢镰刀菌、镰刀菌属、Gibellulopsis nigrescens、Gnomoniopsis sp.、Lewia infectoria、咖啡球腔菌、球腔菌科、稻黑孢菌、黑孢菌属、球孢黑孢霉、拟青霉属、桔青霉、Retroconis sp.、根盘菌属、Schizothecium inaequale、壳多孢属、Stemphylium lancipes、Thielavia hyrcaniae、梭孢壳属、Ulocladium chartarum、轮枝孢属、球孢白僵菌、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、蜡蚧轮枝菌、淡紫拟青霉。

从商业获得的菌株(可从Botanigard获得)培养球孢白僵菌。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养球孢白僵菌、淡紫拟青霉和球毛壳菌。通过将10ml无菌水加入真菌平板中并用无菌解剖刀刮削而无琼脂，从而制得每种真菌的孢子浓缩原液。然后利用粗滤布将得到的菌丝体和获得的孢子过滤至无菌烧杯中以滤掉菌丝体，由此形成原液。使用血球计来测量和计算原液的孢子浓度。通过稀释形成所需的浓度，并且将种子放入具有所需孢子浓度的孢子悬浮液中。在各种不同的实施方案中，最终处理浓度可以为约10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹个孢子/ml，这可以通过在无菌水中或在合适的溶液或缓冲液中连续稀释来获得。

为了种子接种，在具有所需浓度的孢子悬浮液中浸泡之前，通过持续振荡下将种子浸没在70％乙醇中3分钟，接着在2％NaOCl中孵育3分钟，将种子表面灭菌；接着在无菌水中洗涤三次。将第三次无菌水洗液放置在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上以证实表面灭菌是有效的。然后将种子在含有孢子悬浮液的烧杯中浸泡24小时，所述孢子悬浮液具有两个不同的真菌浓度。对照组种子只用无菌水处理。球孢白僵菌的孢子浓度为零(对照)、1×10⁶(处理1)和1×10⁹(处理2)，而对于淡紫拟青霉或球毛壳菌为零(对照)、1×10⁶(处理1)和1×10⁷(处理2)。将这些烧杯在培养室中在32℃下孵育24小时，直至第二天用于种植(24hr)。

将浸泡的种子在L22混合土壤(Borlaug Institute，Texas A&M)中种植。所有植物在～28℃下在实验室温室中使用天然光照周期生长。植物没有施肥，并且按照需要在所有处理中一致地进行灌溉。

直接种子接种：在特定实施方案中，在用土壤覆盖种子之前，可以在种植时用孢子溶液(10²-10³、10³-10⁴、10⁴-10⁵、10⁶-10⁷或10⁷-10⁸个孢子/ml)直接接种单个种子和周围的土壤。

在各种不同的实施方案中，可以使用适用于将生物制剂施用于种子或植物并且是本领域普通技术人员已知的任何种子或植物处理。

实施例2：作为干粉组合物来施用内生菌孢子

除了使用孢子溶液用于种子处理外，还可以作为干粉或使用粘着剂(如甲基纤维素)来施用内生菌或内生菌孢子用于种子处理。在特定实施方案中，浓度可以为至少10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或更高的菌落形成单位或孢子/g干重。

在特定实施方案中，内生菌可以在发酵罐中的真菌培养基中生长。可以收集、干燥和研磨内生菌丝体片段或孢子。还可以将粘着剂(如羧甲基纤维素)加入研磨过的内生菌材料中。

在特定实施方案中，内生菌材料和粘着剂之间的重量比可以为1:10-50、1:50-100、1:100-500或1:500-1000以获得种子包衣或种子接种材料。这种种子接种材料可以施用于种子。在各种不同的实施方案中，种子接种材料和种子之间的重量比可以为1:10-50、1:50-100、1:100-500、1:500-1000或1:1000-5000。

实施例3：土壤(犁沟中)内生菌处理

可以通过在种植过程中将内生菌组合物施用于土壤和/或种子表面来进行土壤浇灌(犁沟中)应用。在特定实施方案中，内生菌组合物可以包括内生菌悬浮液或内生菌干粉制剂。在各种不同的实施方案中，内生菌可以包括菌丝体和/或孢子。在特定的实施方案中，土壤浇灌应用可以包括将内生菌组合物直接施用于直接在每粒种子上的土壤表面。在特定实施方案中，内生菌组合物可以包括0.01-0.1、0.1-1或1-10ml内生菌悬浮液，其可以是内生菌孢子悬浮液。

土壤接种：在特定实施方案中，可以将种子种植于接过的土壤中。可以通过在真菌生长培养基中繁殖内生菌来获得接种物。真菌生长培养基可以是马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。在其他实施方案中，真菌生长培养基可以为小麦籽粒。在非限制性实例中，可以将100g小麦籽粒洗涤并在无菌水中浸泡过夜。可以排出过量的水，将种子在纸巾上吸干，包装在500ml锥形烧瓶中，并在15psi下高压灭菌1h。可以将一毫升真菌内生菌孢子悬浮液(10⁷孢子/ml)接种至烧瓶中，并且培养物可以在25℃下孵育2周。为了避免结块，可以将烧瓶强烈振荡以分开籽粒并破坏菌丝丛。在种植时，或以将大约5g接种物放入土壤中。在特定实施方案中，接种物可以在种植种子的同时或1个月内放入土壤中。在特定实施方案中，种子可以包括灭菌的种子。

实施例4：叶的内生菌处理

在第三真叶阶段使用手持塑料喷雾器(1L)，通过给完全张开的叶面喷洒孢子悬浮液(10⁸孢子/ml)至流出，经叶面施用来给植物接种。在特定实施方案中，内生菌孢子悬浮液在水中制得。在特定实施方案中，给水补充去污剂。在特定的非限制性实例中，孢子悬浮液含有0.02％Triton X100作为去污剂。

可以使用本领域普通技术人员已知的任何合适方法来进行叶的内生菌处理。特别地，可以使用喷雾器，通过给叶子直接喷洒内生菌悬浮液来进行叶的内生菌处理，所述内生菌悬浮液可以是内生菌孢子悬浮液。

图9证明了田间的棉花叶面施用昆虫病原性真菌内生菌的孢子提高了植物性能。用各种典型的杀真菌剂(甲霜灵、三唑醇、三氟敏、2-(thiocyanome-thylthio)苯并噻唑)和杀虫剂(硫双威、吡虫啉、陶斯松)处理棉花(品种FM1740B2F)种子，并且在田间条件下种植和生长处理种子。在第5真叶阶段，给植物喷洒球孢白僵菌和烟色拟青霉的水溶液。包括蔗糖(1％wt/vol)作为用于真菌的另外营养源。在喷洒了不含蔗糖的球孢白僵菌和加蔗糖的烟色拟青霉的植物中观察到了明显较高的第一位置棉铃(发育果)保持。

实施例5：植物内生菌定殖的验证

将植物单独种植在塑料袋中，其用植物编号、处理和最终蚜虫数标记，并储存在4℃下直至第二天用于内生菌验证。每株植物的一半用于平铺在PDA琼脂上，而另一半冷冻干燥用于进行内生菌验证的诊断性PCR试验。按照以上所述的，进行表面灭菌实验方案以及将第三次无菌水洗液平铺在PDA上以测试表面污染。对于诊断性PCR试验，将植物组织冷冻干燥，并利用CTAB实验方案(Doyle&Doyle，1987，Phytochemistry Bulletin 19:11-15)提取DNA。合成的寡核苷酸引物序列是基于对应于分离的实验室培养物序列结果的NCBI BLAST检索(Ek-Ramos等，2013)。用于球孢白僵菌的正义和反义寡核苷酸序列分别为：5’-CGGCGGACTCGCCCCAGCCCG-3’(SEQ ID NO:1)和5’-CCGCGTCGGGGTTCCGGTGCG-3’(SEQ ID NO:2)。用于扩增淡紫拟青霉的寡核苷酸为：5’CTCAGTTGCCTCGGCGGGAA 3’(SEQ ID NO:3)和5’GTGCAACTCAGAGAAGAAATTCCG 3’(SEQ ID NO:4)。

PCR实验方案由95℃下5min的退火步骤，接着56℃下2min的寡核苷酸比对和72℃下7min的延伸步骤组成，总共35个循环。PCR产物在含有1％溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中可视化。在70伏特下进行电泳30min。

实施例6：真菌内生菌可以在田间维持

在夏季使用淡紫拟青霉和球孢白僵菌的分离物进行田间试验。五个重复地块的随机块设计种植了通过在三个不同的候选内生菌(如淡紫拟青霉或球孢白僵菌)孢子浓度(0、10⁶或10⁸孢子/ml)的溶液水中浸泡9hr接种的种子。每地块由四个15.24m(40ft)的行组成，每行隔开101.6cm(40in)。

定殖效率：在第一真叶阶段，针对每个处理的总共20株植物，将来自每地块的四个植物随机取样并测试每种候选内生菌的定殖。通过在PDA培养基上孵育表面灭菌的根、茎和叶片段并观察真菌生长来测定定殖频率。作为每个处理组具有至少一个阳性定殖植物片段的植物数来记录定殖频率。

秧苗的淡紫拟青霉或球孢白僵菌的高内生菌定殖频率证明了在田间种植条件下可以操纵特定内生菌的存在(图1)。

实施例7：棉花蚜虫繁殖测试

将棉蚜群体在保持在大约28℃下的天然光照周期的温室中在笼子中的棉花上饲养。将第二龄期蛹直接放置在内生菌处理的棉花植物和对照植物上。每个处理组使用十株植物，并且每株植物放置十只蚜虫。植物接种蚜虫后，将植物放置在单个塑料45×20cm杯中，并用no-see-um网(Eastex products，NJ)密封以避免蚜虫在植物间移动。在一个实施方案中，使用的植物为13天大，大致在第一真叶阶段，并且使蚜虫在温室条件下繁殖七天。在另一个实施方案中，使蚜虫在实验开始时在最初20天大的植物(大致第三真叶阶段)上繁殖14天。在每个实施方案结束时，将每株单独的植物的蚜虫数计数并记录。与未处理的对照植物相比，球孢白僵菌或淡紫拟青霉作为棉花中的内生菌的存在显著降低了内生菌处理的植物上的棉花蚜虫的繁殖(图4A、4B和图5)。

实施例8：真菌内生菌降低线虫繁殖

植物在环境室中从处理的种子和未处理的对照种子萌发，然后在种植后11天移栽至罐中的土壤中。对每个处理两株重复秧苗取样以通过表面灭菌和平铺在PDA琼脂上来检查内生菌定殖效率。在移栽后第六天，线虫处理组秧苗用2,000或10,000卵/植物进行处理。线虫接种后6周，采收植物并处理。将针对每株植物的虫瘿数/克根组织和群体中总卵数定量以比较内生菌处理的和未处理的(对照)植物之间的线虫性能。

图2和3证明了作为内生菌存在于棉花中时，真菌内生菌淡紫拟青霉和球毛壳菌负面地影响根结线虫(南方根结线虫)繁殖。在高线虫接种物水平(10,000个卵)下，用含有10⁶或10⁷孢子/ml的溶液处理种子后，与未处理的对照种子相比，淡紫拟青霉降低了植物中的卵产生。在田间接种物水平(2000个卵)下，淡紫拟青霉的存在显著降低了两个种子处理浓度下的虫瘿和卵产生。内生菌球毛壳菌负面地影响了根结线虫繁殖。在0(未处理的对照)、10⁶和10⁸孢子/ml的溶液中的棉花种子浸泡处理后，证明了内生菌球毛壳菌对根结线虫虫瘿形成和卵产生的负面作用。

实施例9：真菌内生菌对昆虫的作用

从非转基因的棉花种子(陆地棉(Gossypium hirsutum))(品种LA122，AllTexSeed Co.)生长内生菌处理的植物和对照植物。将种子在含有所利用真菌的10⁸孢子/ml溶液加无菌水-只作为对照的烧杯中浸泡24小时。将烧杯置于32℃培养室中过夜(大约9h)直至第二天种植。将植物在温室和田间条件下生长。温室植物首先在秧苗盘中发芽，然后转移至30cm罐中。田间生长的植物同时种植和生长。

行为分析：进行无选择和选择行为分析来比较西部牧草盲蝽(豆荚草盲蝽)和绿椿象(稻绿蝽)对来自内生菌处理的和未处理的植物的棉蕾和棉铃的反应。分析在10cm直径皮氏培养皿中在30℃下进行，在底部上使用2％琼脂的薄层以在观察过程中对给予昆虫的实验植物的棉蕾(豆荚草盲蝽分析)和棉铃(稻绿蝽分析)提供水分。对于无选择分析，将单个棉蕾或棉铃通过基部插入培养皿中心的琼脂中。每个培养皿中放置单只年轻成年(蜕皮后1-7天)昆虫，并盖上盖子。在每个试验中观察总共30只昆虫，在球孢白僵菌、淡紫拟青霉和对照处理组中各自N＝10只昆虫。豆荚草盲蝽无选择试验重复四次(N＝40/处理)，除了一个试验外，在所有试验中使用了来自温室生长植物的棉蕾。稻绿蝽无选择试验重复三次(N＝20/处理)，在一个试验中使用了来自温室生长植物的棉铃。

在相似条件下，使用相同场地进行选择测试，但在皮氏培养皿中心隔开4cm放置两个相等大小的棉蕾(豆荚草盲蝽)或棉铃(稻绿蝽)。每个场地的两个棉蕾或棉铃来自未处理的对照植物和球孢白僵菌或淡紫拟青霉处理的植物。在每个试验中观察总共20只昆虫，在球孢白僵菌vs.对照和淡紫拟青霉vs.对照处理组中，各自N＝10。豆荚草盲蝽和稻绿蝽选择试验都是重复两次(N＝20/处理)，在所有试验中使用来自田间生长植物的棉蕾。

对于无选择和选择分析两者使用点取样程序，每个试验观察昆虫6小时。初步观察表明两个种的昆虫在分析开始时更活跃，因此采用分段取样安排，在试验早期(0-60min)以5分钟间隔，中期(61-180min)以15分钟间隔和试验后期(181-360min)以30分钟间隔来记录观察。在每个取样间隔，昆虫记录为离开棉蕾/棉铃或在棉蕾/棉铃上进食或栖息。

数据分析：在无选择分析中，使用Wilcoxon Signed Ranks检验在试验持续过程中的每个观察点比较处理组之间观察到的棉花棉蕾(豆荚草盲蝽)或棉铃(稻绿蝽)上进食或栖息的昆虫比例。为了测试随时间的反应变化，针对分析的早期(0-60min)、中期(61-180min)和后期(181-360min)对于各个体计算进食或在植物样品上的观察的比例，并且使用重复测量的方差分析(ANOVA)以内生菌处理组作为主因素和时间作为重复效应在处理组之间进行比较。使用X2检验，将观察到未能接触内生菌处理的植物的棉蕾或棉铃的个体频率与基于对照组的预期未接触的个体频率进行比较。在接触棉蕾或棉铃的昆虫中，使用单因素ANOVA比较处理组间到第一次接触的时间(潜伏期)。在SPSS 21(SPSS Inc.)中进行了包括方差的常正态性和齐性测试的所有分析。

豆荚草盲蝽无选择分析的结果：在分析持续期间，相对于来自球孢白僵菌或淡紫拟青霉内生菌处理组任一的那些，在来自未处理对照植物的棉蕾上随着时间观察到明显较高比例的豆荚草盲蝽个体接触和进食(Wilcoxon Signed Ranks检验，对于两个比较，P<0.0001)(图6A)。重复测量ANOVA表明明显的时间效应(F_1,116＝86.175；P<0.001)，随着试验进行，更高比例的昆虫接触棉蕾(图6B)。还存在明显的内生菌处理效应(F_2,116＝4.929；P＝0.009)，没有明显的时间X内生菌处理相互作用(F_2,116＝1.015；P＝0.366)。每个处理组中的40只昆虫中，12.5％的对照组在分析过程中未能接触棉蕾，而相应明显更高的35％和32.5％的球孢白僵菌和淡紫拟青霉处理组昆虫未能接触(X2检验，P<0.0001)。在接触棉蕾的昆虫中，在处理组中到第一次接触的潜伏期存在显著差异(F_2,85＝7.225；P＝0.0001)，与球孢白僵菌(posthoc LSD检验；P＝0.001)或淡紫拟青霉内生菌处理组(posthoc LSD检验；P＝0.006)任一相比，对照组呈现出更短的接触潜伏期(图6A)。

豆荚草盲蝽选择分析的结果：在同时选择测试中，与来自内生菌处理植物的那些相比，豆荚草盲蝽个体更常选择来自未处理对照植物的棉蕾。在分析持续期间，反应比例显著大于0.5，表明昆虫相对于来自(A)球孢白僵菌(P<0.0001；Wilcoxon Signed Ranks检验)或(B)淡紫拟青霉(P<0.0001；Wilcoxon Signed Ranks检验)内生菌定殖植物的棉铃(图6B)非随机地选择来自对照植物的棉铃。

稻绿蝽无选择分析的结果：在分析持续期间，相对于来自球孢白僵菌或淡紫拟青霉内生菌处理组任一的那些，观察到在来自未处理对照植物的棉铃上接触和进食的稻绿蝽个体的比例随着时间明显较高(Wilcoxon Signed Ranks检验，对于两个比较，P<0.0001)(图7A)。重复测量ANOVA表明明显的时间效应(F_1,116＝86.175；P<0.001)，随着分析进行，更高比例的昆虫接触棉蕾(图1)。还存在明显的内生菌处理效应(F_2,116＝4.929；P＝0.009)，没有明显的时间X内生菌处理相互作用(F_2,116＝1.015；P＝0.366)。每个处理组中的40只昆虫中，12.5％的对照组在分析过程中未能接触棉蕾，而相应的明显更高的35％和32.5％的球孢白僵菌和淡紫拟青霉处理组昆虫未能接触(X2检验，P<0.0001)。在接触棉蕾的昆虫中，在处理组间到第一次接触的潜伏期存在显著差异(F_2,85＝7.225；P＝0.0001)，与球孢白僵菌(posthoc LSD检验；P＝0.001)或淡紫拟青霉内生菌处理组(posthoc LSD检验；P＝0.006)任一相比，对照组呈现出更短的接触潜伏期(图7B)。

实施例10：内生菌处理后保留更多棉铃

在田间试验过程中，使用为棉花特意研发的植物作图和信息系统来定量棉花物候学和发育，以追踪植物的果实发育和保持作为监控植物发育和胁迫的方式(COTMAN^TM，Cotton Inc.)。棉花胁迫的一种量度是分枝上第一结果位置中发育的花(棉蕾)和果实(棉铃)的保持。针对每个处理组，对五个重复地块(N＝10株植物/地块)中每一个的两行中每行5株植物测量第一位棉蕾和棉铃。

图10证明了在生长季中早期随着花开始发育，观察到内生菌处理植物中相对于对照的较高棉蕾保持的趋势。这种趋势持续至季后期，如相对于未处理对照植物的内生菌处理组中明显较高的棉铃保持所证明的。

图8证明了田间试验过程中棉铃损害的降低。相对于对照植物，在通过将种子浸泡在浓度为10⁶和10⁸孢子/ml的球孢白僵菌和淡紫拟青霉的孢子溶液中处理的植物中，昆虫相关的棉铃损害的水平较低。在田间条件下，真菌内生菌对棉花植物性能具有正向作用。

实施例11：内生菌处理提高了产量

在使用内生菌处理和处理植物的田间试验结束时，地块使用1-排摘棉机机械收获。令人惊讶地，收获时的最终产量显著高于预期的(比未处理对照高25％)。出乎预料的，用淡紫拟青霉或球孢白僵菌的处理获得高于未处理对照植物的产量，与最初的种子处理浓度无关(图11)。

实施例12：高粱的内生菌处理提高了GH中的生长

在秧苗试验中测试了所述微生物浓度对高粱的作用。如实施例1中针对棉花所述的，使用乙醇和漂白剂将高粱双色种子表面灭菌。将三个菌株(球孢白僵菌、烟色拟青霉和淡紫拟青霉)制备成10⁷分生孢子/ml的分生孢子悬浮液，并按照实施例1中所述的涂覆在高粱种子上。将对照种子浸泡在无菌水中而非分生孢子悬浮液中。将种植的种子在恒定的生长室条件下保持两周，重复10个。在两周结束时，从生长室取出植物，并测量植物高度和生物量。图12A显示了相对于对照，施用所述微生物组合物时植物高度的提高(p<0.05)。图12B显示了相对于对照从用所述微生物组合物处理的种子生长的植物中植物生物量的提高(p<0.05)。

实施例13：真菌内生菌的处理调节天然内生菌的定殖频率

为了确定内生菌种子处理是否可改变从种子生长的植物的微生物群系(microbiome)，用淡紫拟青霉或球孢白僵菌的孢子悬浮液处理棉花种子。将植物在田间生长作为在标准农业实践下种植和维持的田间试验的部分。从表面灭菌的地上茎/叶和地下根组织单独地分开在PDA培养基上的真菌内生菌，以评价微生物群落的变化。显示于图13中的比较是相对于未处理对照植物的真菌内生菌群落。结果表明这些处理可以改变天然真菌内生菌的定殖率。

真菌内生菌处理可以改变植物中天然存在的任何真菌内生菌的定殖频率。为了确定通过真菌内生菌处理种子可以影响哪些其他天然内生菌，评估了从两个商业棉花品种CG3787B2RF和PHY499WRF的植物分离的棉花真菌内生菌的特性。在Lubbock，Texas，USA附近的品种试验过程中获得样品，识别为Lubbock-RACE。在设计为田间空间变化对照的随机化块中排列的多个重复地块中从每个品种取样的九株单独植物的每一株收集一片单一健康叶片。为了鉴定真菌内生菌种，提取全基因组DNA并且使用ITS1F正向和ITS2反向通用融合引物扩增核糖体DNA内转录间隔区(ITS)作为用于454焦磷酸测序的条码。这个实验中鉴定的真菌内生菌连同图13中显示的那些列于表2中。

表2：可以通过用其他真菌内生菌的种子处理改变的天然真菌内生菌

实施例14：真菌内生菌种子处理导致从种子生长的植物中植物激素水平的调节

为了确定真菌内生菌种子处理是否影响从种子生长的植物中的植物激素水平，从接种了内生菌球孢白僵菌或淡紫拟青霉的棉花植物的根或第三真叶收获组织。使用三种内生菌处理(未定殖的对照、球孢白僵菌或淡紫拟青霉)并且对于球孢白僵菌，使用两个食草处理(无蚜虫，或蚜虫采食1、4、8、24或48小时)进行了实验。在叶和根组织中，通过LC-MS单独地测定脱落酸(ABA)、块茎酸(tuberonic acid)(12-OH-JA，JA-Ile的氧化产物)(TA)、抗坏血酸(AA)、12-氧代植二烯酸(JA前体)(OPDA)、JA异亮氨酸(JA-Ile)和水杨酸(SA)的植物激素水平。相对未定殖对照组中的植物，使用P<0.05的显著性进行了所述植物激素水平比较。从使用球孢白僵菌处理的种子生长的植物中的激素水平显示于表3中，而从使用淡紫拟青霉处理的种子生长的植物中的激素水平显示于表4中。

表3.从使用球孢白僵菌处理的种子生长的植物中的激素水平

表4：从使用淡紫拟青霉处理的种子生长的植物中的激素水平

实施例15：真菌内生菌种子处理改变了田间试验中特定棉花栽培品种的性状

按照实施例6中所述的相似方式进行了2014年田间试验。在夏季使用以下所列分离物进行田间试验。每地块由四个15.24m(40ft)行组成，每行隔开101.6cm(40in)，并且每个处理6个重复地块。相对于未处理对照地块，比较来自用所述微生物组合物处理的地块的产量。对于蓟马，这种损害评价为0-5的等级，0＝无损害，1＝可见的进食疤痕，但没有萎缩，2＝可见的进食和25％萎缩，3＝具有变黑的叶端的进食和50％萎缩，4＝严重进食和75％萎缩，以及5＝严重进食和90％萎缩。对于盲蝽，作为每地块的平均定量和记录每株植物的昆虫数量。图14显示了分别对于Delta Pine和Phytogen栽培品种，用所述微生物组合物处理时作物的产量提高。图15显示了两个栽培品种中微生物的总计产量提高。条棒表示95％置信区间。图16A显示了在Dealta Pine栽培品种中针对蓟马损害测试的15种微生物中12种的有益效果。在Phytogen栽培品种中，测试的15种微生物组合物中只有2种显示出降低蓟马损害的益处。图16B显示了降低Phytogen栽培品种中盲蝽损害的有益效果，其中测试的15种兼性真菌内生菌中的6种显示出与未处理对照植物相比盲蝽损害的平均降低。在Delta Pine栽培品种中，只有一种微生物组合物显示出对盲蝽损害的有益作用。

在田间还评价了各种其他季中植物性状以确定所述真菌内生菌组合物的作用。图17A显示了所述微生物组合物对季中平均根长度的有益提高。图17B显示了所述真菌内生菌组合物对季中地下重量的有益提高。图18显示了所述真菌内生菌组合物对Delta Pine和Phyton栽培品种的季中遮棚温度的有益提高。图19显示了所述真菌内生菌组合物对DeltaPine和Phyton栽培品种的季中NDVI(标准化差异植被指数)的有益提高。NDVI是叶绿素含量的量度。图20显示了所述真菌内生菌组合物对Delta Pine和Phyton栽培品种的季中第一位置棉蕾保持的有益提高。图21和图22显示了用所述内生菌组合物处理Delta Pine和Phyton栽培品种时，季中植物高度的调节(7月上调和8月下调)。图23显示了与未处理对照(左半图)相比，内生菌处理的植物中提高的生物量(右半图)。

在图15至22中，TAM505是链格孢属，TAM32是黑附球菌，TAM534是夏孢生枝孢，TAM244是枝孢属，TAM514是夏孢生枝孢，TAM474是芽枝状枝孢，TAM554是球毛壳菌，TAM15是明脐菌属，TAM488是黑附球菌，TAM452是夏孢生枝孢，TAM490是淡紫拟青霉，TAMBB是球孢白僵菌，TAM105是旋孢腔菌属，TAM189是离蠕孢属和TAM47是黑附球菌。

实施例16：真菌内生菌种子处理在温室试验中的棉花栽培品种中提供了耐旱性

棉花植物从温室中的内生菌处理的和未处理的对照种子萌发。使用每株植物预定的土壤水饱和体积，将所有种子浇水7天或直至子叶阶段。在7DAP时，从水胁迫植物撤水，而对照继续浇水。在最大21DAP时测量枯萎时间和死亡时间。图24中的数据显示了平均枯萎时间，而图25中的数据显示了平均死亡时间。内生菌处理提高了Delta Pine(DTP)和Phytogen(PHY)栽培品种中经历干旱胁迫的植物的存活。在图24和25中，内生菌编号194是黑附球菌，249是芽枝状枝孢，355是球毛壳菌，46是附球菌属，463是枝孢属，534是夏孢生枝孢，554是球毛壳菌，58是黑附球菌，而对照没有内生菌处理。

实施例17：与表1中那些具有至少97％同一性的真菌内生菌的鉴定

鉴定了与SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:77具有97％同一性的所有已知真菌内生菌，并通过登录号列于此：FJ425672,AY526296,JQ760047,UDB014465,KC662098,HQ649874,JQ764783,EU881906,KF251285,JQ862870,AB019364,AB594796,JF773666,JN034678,KC343142,EU707899,AB627855,GU138704,JN695549,DQ279491,HM776417,AB361643,DQ782839,AF222826,EU682199,DQ782833,EU054429,FJ025275,AY354239,AF222828,GU721921,GU721920,DQ093715,AJ309335,FR774125,JQ747741,EF042603,KC968942,HE584924,AY740158,FJ645268,HQ692590,GQ203786,AY233867,HE579398,AB777497,KF435523,DQ420778,JQ649365,AJ271430,GQ996183,EF070423,FJ172277,AF483612,JX675127,EF070420,EF070421,AB741597,JN225408,DQ019364,KF251279,EF194151,EU977196,JX981477,EU686115,JX021531,FJ527863,AJ302451,AJ302455,JN975370,EU754952,AF284388,KF296855,AF502785,JX317207,AF502781,DQ278915,EU686867,KC179120,HM991270,AF284384,DQ632670,JQ759806,JQ747685,EU885302,GU721781,EF434047,EF505854,JQ666587,JQ619887,GQ919270,KF531831,AB627854,DQ914679,DQ914681,HQ599592,DQ279490,DQ660336,JX069862,AB607957,HE820869,FJ859345,JX966567,GU910230,AB627850,JX144030,DQ914723,HM595556,KC771473,DQ849310,EU179868,KF312152,JN890447,JX042854,EU554174,JN198518,HM992813,JQ845947,KF251310,JQ758707,AM930536,KF296912,JN865204,JN943512,GQ921743,EU245000,EU977304,EU144787,HE579322,HE579402,GU910171,HE792919,KC960885,DQ485941,JN604449,HQ607913,AF502620,DQ468027,JX944132,JN207338,JQ922240,JN207336,JX559559,JN207330,JN207333,HE820882,JX969625,HQ339994,JF744950,HE584937,JN120351,JX298885,DQ872671,AJ877102,JQ081564,DQ019391,AF071342,EF104180,JQ759755,GU827492,JN418769,GU324757,JX984750,JX256420,KF436271,JX205162,JN712450,KF435911,GU367905,JX416919,KC315933,JQ736648,AY904051,AF404126,FJ466722,HE584965,JN890282,HE584966,HQ166312,KC305124,HE977536,KC305128,AY907040,JF710504,AF483609,AJ302460,AJ302461,AJ302462,AY969615,EU685981,U75615,AJ302468,FJ210503,GU237860,JX960591,JX143632,HM044649,EU164404,HE584824,HQ116406,DQ156342,JX416911,U75617,GU721359,KC427041,EU254839,JX262800,KC179307,HQ107993,KF361474,GU721420,HM053659,EF619702,EU686156,HE820839,HQ634617,GU721810,AB277211,AJ302417,KC315945,JQ002571,AM237457,AF009805,JX489795,EU680554,KC507199,FJ236723,HQ692618,JN846717,JX944160,JQ585672,KF435573,EU520590,HM581946,DQ250382,JX243908,KC343184,KC485454,GQ479695,GU237760,KF147147,EF619849,GU237767,GU237766,AB818997,AF502847,EU683672,KF225801,KC965743,AJ488254,DQ825983,JN031007,DQ825985,KF028765,AB818999,HQ238268,EU685984,KC966180,HE998711,HQ533007,AM113729,KF251637,FN394692,KF435172,JN207307,JQ814305,HM770988,KC145175,AB511813,EU552102,AJ309344,EU645686,JQ936328,JN038492,DQ875349,EU977228,JQ814357,KF040480,JX317350,DQ401548,DQ318195,DQ318194,GU721776,KF193449,AF178544,AM262354,AB540567,AY627787,HE792907,HE579333,EU445372,AF362069,GU973687,HM053663,AB374284,DQ062977,GU237797,JQ760783,EF029240,HM751829,FM200445,AY953383,AY233922,JF742784,HM626650,FN610871,JX155902,JX006065,AB566289,AF163078,AY344976,AB566287,AF282089,AY251441,AF395693,JQ761899,AJ315835,HQ187633,KC287233,AJ315831,HE820745,JN418779,M13906,JQ761896,AJ315838,AY536373,HQ328035,JX838793,JQ758986,HQ166357,JN163855,KC965595,JN545789,JN545788,GU944558,HE579247,KF296900,EF377335,KC965954,GU269703,AB095511,EF419913,DQ993641,AB325678,HQ223035,AY513945,FJ197013,FR799277,HM071900,JN207293,FJ025268,JQ758966,GU138733,GU138730,DQ267595,GQ919269,JF770450,GU138734,DQ279488,DQ279486,DQ242472,EU164804,EF104177,GU366726,KF212243,DQ923534,GU079598,JX987761,JX984765,AY585343,JQ769260,GU721919,DQ923538,EU686756,EU040222,U75626,GU004264,EU686753,JQ765651,JX270629,JN943408,EF042604,AJ271588,HE579386,GQ479556,JQ759962,JX317413,EU516867,DQ780361,JQ905644,HQ649792,JQ247355,FN386296,AY004778,DQ102374,KF251383,GU237835,DQ383642,FN868479,GU237814,KC343032,JN943394,HQ450001,KC800573,AB217793,GQ851883,EU330630,JF309198,AY489281,GU325687,JX399008,AB164703,EF159407,AJ302429,UDB008141,UDB008140,FM200496,AJ302426,AJ302422,AJ302423,JQ683725,KF193481,JQ683727,HE792931,AB220252,FJ013057,DQ286207,JQ759811,JF414842,JX088707,JN415754,AY787715,JX559577,KC776206,GU166440,KC460867,FJ515595,KF056850,DQ118964,KC806227,KC631802,EU823315,AY528970,HQ116401,JX317516,KF251313,KC800565,AF502705,AF502810,JQ747697,AY527407,EU680518,AJ621773,AB374285,HQ832827,GU174316,DQ974750,JN198507,JF749806,JQ782739,HQ023202,AY616234,KC965315,AB743781,EU554161,KC507201,HM036624,EF464164,JX391942,AB743995,FJ415474,AY647237,KC965503,AB540553,HQ377280,JX898571,JN969419,DQ166962,HM123519,GU237881,AB683953,AY681487,EU498738,EU687037,AB540550,EF394866,AY853245,EU680532,HQ450006,AM292674,KF435452,AF502638,JN890354,JX256427,JF773646,KC916704,FJ347031,JN572154,AF443850,AY273300,JQ247392,JQ247393,HQ316569,GU324760,AB120858,JF440978,HQ115719,JF440976,DQ124120,HQ022342,AF333138,AB255293,GQ999456,DQ286209,HE820785,AF451751,JN038479,JQ044421,JQ044422,KC968911,KC492447,FM172902,AF437754,HM030631,HM595545,AY510424,JX414184,HQ184179,AB588822,JQ813816,JQ813817,FJ025255,AY745019,EU668292,HM216214,AF427105,EU479799,JQ769257,HM484866,EU301059,EU564808,AY265329,HQ701737,KC677889,AY907030,GU721349,AY304513,GU062277,AY907037,HM484859,AB576865,JX090109,UDB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实施例18：内生菌及其组合

将实施例1-16中所述的实验方案结合表1的内生菌来使用以证实对植物健康的有益特性，如，例如，产量和/或抗虫性。特别地，将来自表1的内生菌用于与植物的合成组合中，如本文中所述的，与作物如棉花一起。表1中所列的任何单一内生菌或内生菌组合也可以以这种方式使用，例如使用种子包衣或叶、土壤或根围施用。种子组合物可以包含种子和表1中所列内生菌的任意组合。表1中所列的内生菌及其组合因此用于防止虫害、提高产量、处理虫害、制造抗虫种子的方法中；或根据实施例1-15方法提高作物产量或降低作物损失的方法中。

Claims

1.一种用于改善棉花植物的性状的方法，该方法包括：

将所述棉花植物的农业种子接触包含选自芽枝状枝孢、夏孢生枝孢和黑附球菌的至少一个物种的纯化的丝状的、孢子形成的、兼性真菌内生菌的制剂，其中所述内生菌以与从未用所述芽枝状枝孢、夏孢生枝孢或黑附球菌兼性真菌内生菌处理的种子生长的棉花植物相比有效调节对于所述棉花植物天然的链格孢属内生菌的定殖频率且对所述棉花植物提供益处的量存在于所述制剂中，其中所述益处是增强的对干旱胁迫的抵抗力。

2.权利要求1的方法，其中所述内生菌以有效获得从所述种子生长的棉花植物的叶、茎或根的至少50%定殖的量存在于所述制剂中。

3.权利要求1或2的方法，进一步包括将接触的种子包装在容器中。

4.权利要求1或2的方法，进一步包括生长所述棉花植物的群体，其中所述益处在群体水平测量，且与参照植物群体相比较。