BR122020008356B1 - Combinação sintética, pluralidade de combinações sintéticas, e produto agrícola - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a materiais e métodos para aprimorar traços vegetais e para fornecer benefícios a plantas. Em algumas modalidades, os materiais e métodos que empregam os mesmos podem compreender endófitos. Um método para preparação de uma composição de semente de agricultura, compreendendo contatar a superfície de uma pluralidade de sementes com uma formulação compreendendo uma população microbiana purificada que compreende pelo menos dois endófitos que são heterologos da semente, em que o primeiro endófito é capaz de metabolizar pelo menos um de D- alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D-treonina, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L- serina, L-treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico, e salicina, em que os endófitos estão presentes na formulação em uma quantidade capaz de modular um traço de importância agronômica, em comparação com plantas de isolina desenvolvidas a partir de sementes que não entram em contato com a dita formulação.

Description

[0001] Este pedido reivindica o benefício de Pedido Provisório No U.S. 62/017.796, depositado em 26 de junho de 2014, e Pedido Provisório No U.S. 62/017.809, depositado em 26 de junho de 2014, e Pedido Provisório No U.S. 62/017.816, depositado em 26 de junho de 2014, e Pedido Provisório No U.S. 62/017.813, depositado em 26 de junho de 2014, e Pedido Provisório No U.S. 62/017.815, depositado em 26 de junho de 2014, e Pedido Provisório No U.S. 62/017.818, depositado em 26 de junho de 2014, cada um está incorporado por meio deste a título de referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada através de EFS-Web e está incorporada por meio deste a título de referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 26 de junho de 2015, é nomeada 29809_PCT_CRF_Sequence_Listing, e tem 2.972.740 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] Esta invenção refere-se a composições e métodos para aprimorar o cultivo de plantas, particularmente plantas agrícolas. Por exemplo, essa invenção descreve bactérias e fungos benéficos que são capazes de viver em uma planta, os mesmos podem ser usados para conferir traços agronômicos aprimorados a plantas. A invenção revelada também descreve métodos para aprimorar as características de plantas introduzindo-se tais bactérias e/ou fungos benéficos naquelas plantas. Ademais, essa invenção também fornece métodos para tratar sementes e outros elementos vegetais com bactérias e/ou fungos benéficos que são capazes de viver dentro de uma planta, para conferir características agronômicas a plantas, particularmente plantas agrícolas.

ANTECEDENTES

[0004] A agricultura enfrenta inúmeros desafios que estão tornando- a cada vez mais difíceis de fornecer alimentos, materiais e combustíveis à população mundial. O crescimento da população e desafios na dieta associados a aumento de rendimentos estão aumentando a demanda global de alimentos, enquanto muitos recursos fundamentais de agricultura estão se tornando cada vez mais escassos. Em 2050, a FAO projeta que a produção de alimentos total deve aumentar em 70% para satisfazer as necessidades da população crescente, um desafio que é exacerbado por vários fatores, incluindo redução de recursos de água doce, aumento de competição por terra arável, aumento de preços de energia, aumento de custos de insumos, e a provável necessidade de culturas para se adaptar às pressões de um clima global mais extremo. A necessidade de desenvolver quase duas vezes mais alimento em climas mais incertos está levando a uma necessidade crítica de novas inovações.

[0005] Atualmente, o desempenho da cultura é otimizado através de tecnologias voltadas para a interação entre o genótipo da cultura (por exemplo, criação de plantas, culturas geneticamente modificadas (GM)) e seu ambiente circundante (por exemplo, fertilizante, herbicidas sintéticos, pesticidas). Embora estes paradigmas tenham ajudado a dobrar a produção mundial de alimentos nos últimos cinquenta anos, as taxas de crescimento de rendimento estagnaram em muitas culturas importantes e os desvios no clima foram ligados a declínios de produção em culturas importantes como o trigo. Além dos longos prazos de desenvolvimento e regulamentares, os temores do público em relação às culturas GM e produtos químicos sintéticos desafiaram seu uso em muitas culturas essenciais e países, resultando em uma total falta de aceitação de traços GM no trigo e na exclusão de culturas GM e muitas químicas sintéticas dos mercados europeus. Assim, há uma necessidade significativa de abordagens inovadoras, eficazes e publicamente aceitáveis para melhorar o rendimento intrínseco e a resistência de culturas a estresses severos.

[0006] Tal como os seres humanos, que se beneficiam de um complemento de simbiontes microbianos benéficos, supõe-se que as plantas se beneficiem da vasta gama de bactérias e fungos que vivem dentro e ao redor dos seus tecidos para manter a sua saúde e crescimento. Endófitos são organismos fúngicos ou bacterianos que vivem dentro das plantas. Os endófitos bacterianos e fúngicos parecem habitar vários tecidos de plantas hospedeiras e foram isolados de folhas, hastes ou raízes de plantas.

[0007] Supõe-se que um pequeno número destas relações simbióticas endófito-hospedeiro em estudos limitados proporcione benefícios agronómicos ao modelo de plantas hospedeiras em ambientes laboratoriais controlados, tais como o aumento de produção de biomassa (isto é, rendimento) e nutrição, tolerância aumentada ao estresse, como de seca e/ou pragas.

[0008] Contudo, demonstrou-se que estes endófitos são ineficazes para conferir benefícios a uma variedade de plantas agricolamente importantes; como tal, não abordam adequadamente a necessidade de proporcionar rendimento e tolerância aumentados a estresses ambientais presentes em muitas situações agrícolas para tais culturas.

[0009] Dessa forma, há a necessidade de composições e métodos para fornecer culturas agrícolas com rendimento aprimorado e resistência a vários estresses ambientais. São fornecidas no presente documento composições inovadoras de bactérias e endófitos fúngicos e composições de plantas endofíticas sintéticas com base na análise das propriedades fundamentais que aumentam a utilidade e comercialização de uma composição endofítica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] As descrições de PCT/US2014/044427, depositado em 26 de junho de 2014, e Pedido No de série U.S. 14/316,469, depositado em 26 de junho de 2014, estão incorporadas por meio desta a título de referência em sua totalidade, incluindo a listagem de sequências contendo SEQ ID NOs: 1 a 1448.

[0011] A presente invenção está baseada na constatação surpreendente que vários táxons bacterianos e fúngicos de micróbios endófitos são conservados em diversas espécies e/ou cultivares de plantas agrícolas, e podem ser derivados das mesmas e associadas de forma heteróloga a diversos novos cultivares para proporcionar benefícios. A presente invenção também se baseia na constatação que um elemento vegetal de uma planta pode ser efetivamente aumentado revestindo-se sua superfície com tais endófitos em uma quantidade que não é normalmente encontrada no elemento vegetal. Os endófitos podem ser isolados da parte interna da mesma planta ou uma planta diferente, ou da parte interna de uma parte ou tecido da mesma planta ou uma planta diferente. Dessa forma, o elemento vegetal revestido com o endófito pode ser usado para conferir traço ou traços agronômicos aprimorados à semente ou à planta que é desenvolvida a partir do elemento vegetal.

[0012] Os inventores consideraram que tentativas de selecionar cultivares com certos traços aprimorados e alterações nas condições ambientais e químicas de agricultura resultaram na perda inadvertida de micróbios em variedades modernas que podem fornecer traços benéficos a plantas agrícolas. A presente invenção se baseia na constatação surpreendente que muitos cultivares modernos de plantas agrícolas exibem distinções marcantes em suas comunidades microbianas em comparação com variedades antigas. A presente invenção também se baseia na observação que, em alguns casos, fornecer os táxons microbianos presentes em tais cultivares antigos, porém ausentes ou subrepresentados em variedades modernas pode resultar em grandes aperfeiçoamentos em vários traços agronômicos nos cultivares modernos.

SUMÁRIO

[0013] São descritos no presente documento métodos para preparar uma composição de semente agrícola que compreendem colocar a superfície de uma pluralidade de sementes em contato com uma formulação que compreende uma população microbiana purificada que compreende pelo menos dois endófitos que são heterólogos à semente. O primeiro endófito é capaz de metabolizar pelo menos um dentre D-alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D-treonina, ácido glicil-L- aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L- aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L- treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico, e salicina e os endófitos estão presentes na formulação em uma quantidade capaz de modular um traço de importância agronômica, em comparação com plantas de isolina desenvolvidas a partir de sementes que não entraram em contato com a formulação.

[0014] Também são descritos métodos para a preparação de uma composição de semente agrícola, que compreende colocar a superfície de uma pluralidade de sementes em contato com uma formulação que compreende uma população microbiana purificada que compreende pelo menos dois endófitos que são heterólogos à semente, em que o primeiro endófito é capaz de pelo menos uma função ou atividade selecionada do grupo que consiste em produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobiano, solubilização de fosfato mineral, produção de sideróforo, produção de celulase, produção de quitinase, produção de xilanase e produção de acetoína, em que os endófitos estão presentes na formulação em uma quantidade capaz de modular um traço de importância agronômica, em comparação com plantas de isolina desenvolvidas a partir de sementes que não entraram em contato com a formulação.

[0015] Também são descritos métodos de aperfeiçoamento de um fenótipo durante condições limitadas de água de uma pluralidade de plantas hospedeiras desenvolvidas a partir de uma pluralidade de sementes, que compreendem tratar as sementes com uma formulação que compreende pelo menos dois endófitos que são heterólogos às sementes. O primeiro endófito é capaz de metabolizar pelo menos um dentre D-alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D-treonina, ácido glicil L- aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L- aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L- treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico, e salicina. O aperfeiçoamento de fenótipo é selecionada do grupo que consiste em: resistência à doença, tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância à salinidade, tolerância ao metal, tolerância ao herbicida, tolerância química, utilização de nitrogênio aprimorada, resistência a estresse por nitrogênio aprimorada, fixação de nitrogênio aprimorada, resistência a pragas, resistência a herbívoros, resistência a patógenos, rendimento aumentado, melhora da saúde, melhora de vigor, melhora de crescimento, melhora da capacidade fotossintética, melhora da nutrição, teor de proteína alterado, teor de óleo alterado, biomassa aumentada, comprimento de broto aumentado, comprimento de raiz aumentado, arquitetura de raiz aprimorada, peso de semente aumentado, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, número de vagens, senescência retardada, stay-green, e composição de proteína de semente alterada, peso seco aumentado de sementes maduras, peso fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta, teor de clorofila aumentado, número de vagens por planta aumentado, comprimento de vagens por planta aumentado, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta e número aumentado de folhas não murchas por planta.

[0016] A semente ou planta pode ser uma dicotiledônea, por exemplo, soja, algodão, tomate e pimenta ou uma monocotiledônea, por exemplo, milho, trigo, cevada e arroz. Em algumas modalidades, a semente é uma semente transgênica.

[0017] Os métodos descritos no presente documento incluem um primeiro endófito e um segundo endófito. O primeiro endófito e/ou o segundo endófito pode(m) ser, por exemplo, um endófito bacteriano ou, por exemplo, um endófito fúngico. Exemplos de endófitos bacterianos incluem, por exemplo, aqueles de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Methylobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas e Stenotrophomonas. Em algumas modalidades, o endófito bacteriano tem uma sequência de 16S rRNA que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 3588, 3589, 3590, 3591, 3592, 3593, 3594, 3595, 3596, 3598, 3599, 3600, 3601, 3603, 3604, 3606, 3607, 3608, 3609, 3619, 3620, 3621, 3622, 3623, 3624, 3625, 3626, 3627, 3628, 3629, 3630, 3631, 3632, 3633, 3634, 3635, 3636, 3637, 3638, 3639, 3641, 3645, 3646, 3648, 3649, 3651, 3652, 3653, 3656, 3663, 3664, 3665, 3666, 3667, 3668, 3669, 3670, 3671.

[0018] Exemplos de endófitos fúngicos incluem, por exemplo, aqueles de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em: Acremonium, Alternaria, Cladosporium, Cochliobolus, Embellisia, Epicoccum, Fusarium, Nigrospora, Phoma e Podospora. Em algumas modalidades, o endófito fúngico tem um ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 3597, 3602, 3605, 3610, 3611, 3612, 3613, 3614, 3615, 3616, 3617, 3618, 3640, 3642, 3643, 3644, 3647, 3650, 3654, 3655, 3657, 3658, 3659, 3660, 3661, 3662, 3672, 3673, 3674, 3675, 3676, 3677, 3678, 3679, 3680, 3681, 3682, 3683, 3684, 3685, 3686, 3687, 3688, 3689, 3690, 3691, 3692, 3693, 3694, 3695, 3696, 3697, 3698, 3699, 3700.

[0019] Em algumas modalidades, a formulação compreende pelo menos duas entidades microbianas endofíticas fornecidas na Tabela 11.

[0020] Em algumas modalidades dos métodos descritos no presente documento, o primeiro endófito é capaz de metabolizar pelo menos dois dentre D-alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D-treonina, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L- treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico e salicina. Em algumas modalidades dos métodos descritos no presente documento, o segundo endófito é capaz de metabolizar pelo menos um dentre D-alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D-treonina, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L- glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L-alanina, L-alanil- glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L-treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico e salicina.

[0021] Os métodos descritos no presente documento incluem uma formulação. Em algumas modalidades, a formulação compreende a população microbiana purificada em uma concentração de pelo menos cerca de 10A2 CFU/ml ou esporos/ml em uma formulação líquida ou cerca de 10A2 CFU/gm ou esporos/ml em uma formulação não líquida. Em algumas modalidades, a formulação compreende adicionalmente um ou mais dos seguintes: um estabilizante, ou um conservante, ou um veículo, ou um tensoativo, ou um agente anticomplexo, ou qualquer combinação dos mesmos e/ou um ou mais dos seguintes: fungicida, nematicida, bactericida, inseticida e herbicida.

[0022] Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento modulam um traço de importância agronômica. O traço de importância agronômica pode ser, por exemplo, resistência a doenças, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância à salinidade, tolerância a metal, tolerância a herbicida, tolerância química, resistência a estresse por nitrogênio aprimorada, fixação de nitrogênio aprimorada, resistência a pragas, resistência a herbívoros, resistência a patógenos, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições limitadas de água, melhora da saúde, melhora de vigor, melhora de crescimento, melhora da capacidade fotossintética, melhora da nutrição, teor de proteína alterado, teor de óleo alterado, biomassa aumentada, comprimento de broto aumentado, comprimento de raiz aumentado, arquitetura de raiz aprimorada, peso de semente aumentado, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, número de vagens, senescência retardada, stay-green, e composição de proteína de semente alterada.

[0023] Os métodos descritos no presente documento podem incluir pelo menos um endófito capaz de localização em um elemento vegetal de uma planta desenvolvida a partir da dita semente, o dito elemento vegetal selecionado a partir do grupo que consiste em: planta inteira, muda, tecido meristemático, tecido do solo, tecido vascular, tecido dérmico, semente, folha, raiz, broto, caule, flor, fruto, estolho, bulbo, tubérculo, cormo, keikis e botão.

[0024] Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento incluem adicionalmente colocar a pluralidade de sementes em um substrato que promove crescimento vegetal, incluindo, mas não se limitando a, solo. Por exemplo, as sementes são colocadas no solo em fileiras, com espaçamento substancialmente igual entre cada semente dentro de cada fileira.

[0025] Também é descrita no presente documento uma planta derivada da preparação de semente agrícola dos métodos descritos no presente documento, em que a dita planta compreende em pelo menos um de seus elementos vegetais os ditos endófitos, e/ou em que a dita progênie compreende em pelo menos um de seus elementos vegetais os ditos endófitos. Também é descrita no presente documento uma pluralidade de composições de sementes preparadas de acordo com os métodos descritos no presente documento, em que as ditas composições de semente são confinadas dentro de um objeto selecionado a partir do grupo que consiste em: garrafa, campânula, ampola, caixote, vaso, bolsa, caixa, cesto, invólucro, caixa de papelão, recipiente, silo, contentor de transporte, carroceria de caminhão e bainha.

[0026] São descritos no presente documento métodos de preparação de uma semente que compreende uma população de endófitos, sendo que o dito método compreende aplicar a uma superfície externa de uma semente uma formulação que compreende uma população de endófitos que consiste essencialmente em um endófito que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 3700; métodos de tratamento de mudas, sendo que o método compreende colocar a folhagem ou a rizosfera de uma pluralidade de mudas de plantas agrícolas com uma semente em contato com uma formulação que compreende uma população de endófitos consistindo essencialmente em um endófito que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 3700; desenvolver as mudas contatadas; métodos para modular um traço vegetal que compreende aplicar à vegetação ou uma área adjacente à vegetação, uma semente uma formulação que compreende uma população de endófitos consistindo essencialmente em um endófito que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 3700, em que a formulação é capaz de proporcionar um benefício à vegetação, ou a uma cultura produzida a partir da vegetação; e métodos para modular um traço vegetal que compreende aplicar uma formulação ao solo, à semente uma formulação que compreende uma população de endófitos que consiste essencialmente em um endófito que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 3700, em que a formulação é capaz de proporcionar um benefício a sementes plantadas dentro do solo, ou a uma cultura produzida a partir de plantas desenvolvidas no solo. Em algumas modalidades, o método inclui aplicação ou contato ao aspergir, imergir, revestir, encapsular ou pulverizar as sementes ou mudas com a formulação.

[0027] São descritos no presente documento métodos para aperfeiçoar um traço agrícola em uma planta agrícola, sendo que o método compreende fornecer uma planta agrícola moderna, colocar a dita planta em contato com uma formulação que compreende um endófito derivado de uma planta antiga em uma quantidade eficaz para colonizar a planta e permitir que a planta se desenvolva sob condições que permitam que o endófito colonize a planta, e métodos para aperfeiçoar um traço agrícola em uma planta agrícola, sendo que o método compreende fornecer uma planta agrícola, colocar a dita planta em contato com uma formulação que compreende um endófito que é comum a pelo menos dois tipos de plantas doadoras que está presente na formulação em uma quantidade eficaz para colonizar a planta, e desenvolver as plantas sob condições que permitam que endófito aperfeiçoe um traço na planta. Em algumas modalidades, o endófito compreende uma sequência de ácidos nucleicos de 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 3700. Em algumas modalidades, o método inclui aplicar ou colocar em contato ao aspergir, imergir, revestir, encapsular ou pulverizar as sementes ou mudas com a formulação.

[0028] A semente ou planta pode ser uma dicotiledônea, por exemplo, soja, algodão, tomate e pimenta ou uma monocotiledônea, por exemplo, milho, trigo, cevada e arroz. Em algumas modalidades, a semente é uma semente transgênica.

[0029] Em algumas modalidades, o endófito é capaz de exibir a produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase, e produção de acetoína, por exemplo, o endófito exibe pelo menos dois dentre: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase, e produção de acetoína. Em outras modalidades, o endófito é capaz de metabolizar pelo menos um dentre D-alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D- treonina, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L- asparagina, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L-treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico, e salicina. Em modalidades adicionais, o endófito é capaz de metabolizar pelo menos dois dentre D-alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D- treonina, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L- asparagina, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L-treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico, e salicina.

[0030] Em algumas modalidades, o endófito compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 97% idêntica a qualquer ácido nucleico fornecido nas Tabelas 1 a 10 e 12 a 19, em que o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz para colonizar a planta agrícola madura. Em outras modalidades, pelo menos um dos endófitos compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 97% idêntica a qualquer ácido nucleico fornecido nas Tabelas 1 a 10 e 12 a 19, em que o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz para colonizar a planta agrícola madura.

[0031] O endófito pode estar presente em uma concentração de, por exemplo, pelo menos 102 CFU ou esporos/semente sobre a superfície das sementes após o contato.

[0032] Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento modulam um traço de importância agronômica. O benefício ou traço agrícola pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: biomassa de raiz aumentada, comprimento de raiz aumentado, altura aumentada, comprimento de broto aumentado, número de folhas aumentado, eficiência de uso de água aumentada, tolerância aumentada a baixo estresse por nitrogênio, eficiência de uso de nitrogênio aumentada, biomassa total aumentada, rendimento de grão aumentado, taxa de fotossíntese aumentada, tolerância aumentada à seca, tolerância ao calor aumentada, tolerância ao sal aumentada, resistência aumentada a estresse por nematódeo, resistência aumentada a um patógeno fúngico, resistência aumentada a um patógeno bacteriano, resistência aumentada a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabólito, e uma modulação detectável no proteoma, em relação a sementes de referência ou plantas agrícolas derivadas de sementes de referência. Em algumas modalidades, o benefício ou traço agrícola compreende pelo menos dois benefícios ou traços agrícolas selecionados a partir do grupo que consiste em: biomassa de raiz aumentada, comprimento de raiz aumentado, altura aumentada, comprimento de broto aumentado, número de folhas aumentado, eficiência de uso de água aumentada, tolerância aumentada a baixo estresse por nitrogênio, eficiência de uso de nitrogênio aumentada, biomassa total aumentada, rendimento de grão aumentado, taxa de fotossíntese aumentada, tolerância aumentada à seca, tolerância ao calor aumentada, tolerância ao sal aumentada, resistência aumentada a estresse por nematódeo, resistência aumentada a um patógeno fúngico, resistência aumentada a um patógeno bacteriano, resistência aumentada a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabólito, e uma modulação detectável no proteoma, em relação a sementes de referência ou plantas derivadas de sementes de referência. Exemplos incluem, mas não se limitam a, tolerância aumentada a baixo estresse por nitrogênio ou eficiência de uso de nitrogênio aumentada e o endófito é não- diazotrófico ou tolerância aumentada a baixo estresse por nitrogênio ou eficiência de uso de nitrogênio aumentada e o endófito é diazotrófico.

[0033] Em algumas modalidades, a formulação compreende pelo menos um membro selecionado a partir do grupo que consiste em um veículo agricolamente compatível, um acentuador de pegajosidade, um estabilizante microbiano, um fungicida, um agente bactericida, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento vegetal, um rodenticida, e um nutriente.

[0034] Os métodos descritos no presente documento podem incluir colocar a semente ou planta em contato com pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, pelo menos 1.000.000 CFU ou esporos ou mais, do endófito.

[0035] Em algumas modalidades dos métodos descritos no presente documento, o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz que será detectável dentro de um tecido alvo da planta agrícola selecionado a partir de um fruto, semente, folha, raiz ou porção do mesmo. Por exemplo, a população é detectada em uma quantidade de pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, pelo menos 1.000.000 CFU ou esporos, ou mais, no tecido alvo. Alternativamente ou adicionalmente, o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa e/ou rendimento do fruto ou semente produzido pela planta em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, ou mais, quando comparado com o fruto ou semente de uma planta agrícola de referência. Alternativamente ou adicionalmente, o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz para aumentar detectavelmente a biomassa da planta, ou uma parte ou um tipo de tecido da mesma, por exemplo, detectavelmente aumentada em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência. Alternativamente ou adicionalmente, o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz para aumentar detectavelmente a taxa de germinação da semente, por exemplo, aumentada em pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[0036] Também são descritas no presente documento composições sintéticas que compreendem uma população microbiana purificada em associação a uma pluralidade de sementes ou mudas de uma planta agrícola, em que a população microbiana purificada compreende um primeiro endófito capaz de pelo menos um dentre: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase, e produção de acetoína, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, em que o primeiro endófito compreende uma sequência de ácidos nucleicos de 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 3700, e em que o endófito está presente na combinação sintética em uma quantidade eficaz para fornecer um benefício às sementes ou mudas ou às plantas derivadas das sementes ou mudas. Em algumas modalidades, a formulação compreende pelo menos dois endófitos fornecidos na Tabela 11.

[0037] Também são descritas no presente documento composições sintéticas que compreendem uma população purificada em associação a uma pluralidade de sementes ou mudas de uma planta agrícola, em que a população microbiana purificada compreende um primeiro endófito em que o primeiro endófito é capaz de metabolizar pelo menos um dentre D-alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D-treonina, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L- aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L- treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico, e salicina, em que o primeiro endófito compreende uma sequência de ácidos nucleicos de 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 3700, e em que o endófito está presente na combinação sintética em uma quantidade eficaz para fornecer um benefício às sementes ou mudas ou às plantas derivadas das sementes ou mudas. Em algumas modalidades, a população microbiana compreende adicionalmente um segundo endófito, em que o primeiro e o segundo endófitos são independentemente capazes de metabolizar pelo menos um dentre D- alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D-treonina, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L- alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L-treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D- glucosamina, trealose, ácido oxálico, e salicina, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos. Em algumas modalidades, os dois endófitos são fornecidos na Tabela 11.

[0038] Também são descritas no presente documento composições sintéticas que compreendem pelo menos dois endófitos associados a uma semente, em que pelo menos o primeiro endófito é heterólogo à semente e é capaz de produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase, ou produção de acetoína, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, em que os endófitos estão presentes na formulação em uma quantidade eficaz para fornecer um benefício às sementes ou mudas das plantas derivadas das sementes ou mudas. Em algumas modalidades, ambos os endófitos são heterólogos à semente. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo endófitos são independentemente capazes de pelo menos um dentre a produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase, ou produção de acetoína, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos. Em algumas modalidades, o primeiro endófito compreende uma sequência de ácidos nucleicos de 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 3700. Em algumas modalidades, a formulação compreende pelo menos dois endófitos fornecidos na Tabela 11.

[0039] Também são descritas no presente documento composições sintéticas que compreendem pelo menos dois endófitos associados a uma semente, em que pelo menos o primeiro endófito é heterólogo à semente e é capaz de metabolizar pelo menos um dentre D-alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D-treonina, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L-alanina, L- alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido L- glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L-treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico, e salicina, em que os endófitos estão presentes na formulação em uma quantidade eficaz para fornecer um benefício às sementes ou mudas das plantas derivadas das sementes ou mudas. Em algumas modalidades, ambos os endófitos são heterólogos à semente. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo endófitos são independentemente capazes de metabolizar pelo menos um dentre D- alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D-treonina, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L- alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L-treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D- glucosamina, trealose, ácido oxálico, e salicina, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos. Em algumas modalidades, o primeiro endófito compreende uma sequência de ácidos nucleicos de 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 3700.

[0040] Em algumas modalidades, as combinações sintéticas descritas no presente documento ficam dispostas dentro de um material para embalagem selecionado a partir de uma bolsa, caixa, depósito, invólucro, caixa de papelão ou recipiente. Em algumas modalidades, as combinações sintéticas descritas no presente documento compreendem uma quantidade em peso de sementes de 1000 sementes, em que o material para embalagem compreende opcionalmente um dessecante, e em que a combinação sintética compreende opcionalmente um agente fungicida.

[0041] Em algumas modalidades, as combinações sintéticas descritas no presente documento compreendem um primeiro endófito que é localizado sobre a superfície das sementes ou mudas; e/ou obtido a partir de uma espécie de planta diferente das sementes ou mudas da combinação sintética; e/ou obtido a partir de um cultivar de planta diferente do cultivar das sementes ou mudas da combinação sintética; e/ou obtido a partir de um cultivar de planta que é igual ao cultivar das sementes ou mudas da combinação sintética.

[0042] Em algumas modalidades, as composições sintéticas que compreendem uma população purificada em associação a uma pluralidade de sementes ou mudas de uma planta agrícola da população microbiana compreende adicionalmente um segundo endófito, por exemplo, um segundo endófito microbiano tendo uma sequência de ácidos nucleicos de 16S rRNA ou ITS rRNA menos que 95% idêntica àquela do primeiro endófito microbiano. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo endófitos são independentemente capazes de pelo menos um dentre a produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase, e produção de acetoína, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

[0043] Em algumas modalidades, as combinações sintéticas descritas no presente documento compreendem, por exemplo, um primeiro endófito que é um endófito bacteriano; um primeiro endófito que é um endófito bacteriano e um segundo endófito que é um endófito bacteriano; um primeiro endófito que é um endófito bacteriano e um segundo endófito que é um endófito fúngico; um primeiro endófito que é um endófito fúngico; e/ou um primeiro endófito que é um endófito fúngico e um segundo endófito que é um endófito fúngico.

[0044] Nas modalidades com um segundo endófito, o endófito bacteriano pode ser, por exemplo, de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Methylobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas e Stenotrophomonas; e/ou o endófito bacteriano pode ser um com uma sequência de 16S rRNA que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ IDNOs:3588, 3589, 3590, 3591, 3592, 3593, 3594, 3595, 3596, 3598, 3599, 3600, 3601, 3603, 3604, 3606, 3607, 3608, 3609, 3619, 3620, 3621, 3622, 3623, 3624, 3625, 3626, 3627, 3628, 3629, 3630, 3631, 3632, 3633, 3634, 3635, 3636, 3637, 3638, 3639, 3641, 3645, 3646, 3648, 3649, 3651, 3652, 3653, 3656, 3663, 3664, 3665, 3666, 3667, 3668, 3669, 3670, 3671.

[0045] O endófito fúngico pode ser, por exemplo, de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em: Acremonium, Alternaria, Cladosporium, Cochliobolus, Embellisia, Epicoccum, Fusarium, Nigrospora, Phoma e Podospora e/ou tem um ITS rRNA pelo menos 95% idêntico a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 3597, 3602, 3605, 3610, 3611, 3612, 3613, 3614, 3615, 3616, 3617, 3618, 3640, 3642, 3643, 3644, 3647, 3650, 3654, 3655, 3657, 3658, 3659, 3660, 3661, 3662, 3672, 3673, 3674, 3675, 3676, 3677, 3678, 3679, 3680, 3681, 3682, 3683, 3684, 3685, 3686, 3687, 3688, 3689, 3690, 3691, 3692, 3693, 3694, 3695, 3696, 3697, 3698, 3699, 3700.

[0046] As combinações sintéticas descritas no presente documento podem incluir, por exemplo, um primeiro endófito capaz de pelo menos dois dentre: a produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase, utilização de arabinose como uma fonte de carbono e produção de acetoína; e/ou capaz de metabolizar pelo menos dois dentre D-alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D-treonina, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L- aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L- treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico, e salicina, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

[0047] As combinações sintéticas descritas no presente documento podem incluir, por exemplo, um primeiro endófito compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 97% idêntica a qualquer ácido nucleico fornecido nas Tabelas 1 a 10 e 12 a 19.

[0048] As combinações sintéticas descritas no presente documento podem incluir, por exemplo, primeiros endófitos presentes em uma quantidade de pelo menos cerca de 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, pelo menos 1.000.000 CFU esporos por semente.

[0049] Em algumas modalidades, as combinações sintéticas descritas no presente documento compreendem um benefício selecionado a partir do grupo que consiste em biomassa de raiz aumentada, comprimento de raiz aumentado, altura aumentada, comprimento de broto aumentado, número de folhas aumentado, eficiência de uso de água aumentada, biomassa total aumentada, rendimento de grão aumentado, taxa de fotossíntese aumentada, tolerância aumentada à seca, tolerância ao calor aumentada, tolerância ao sal aumentada, resistência aumentada a estresse por nematódeo, resistência aumentada a um patógeno fúngico, resistência aumentada a um patógeno bacteriano, resistência aumentada a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabólito, e uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência. Em algumas modalidades, as combinações sintéticas descritas no presente documento compreendem pelo menos dois benefícios selecionados a partir do grupo que consiste em biomassa de raiz aumentada, comprimento de raiz aumentado, altura aumentada, comprimento de broto aumentado, número de folhas aumentado, eficiência de uso de água aumentada, tolerância aumentada a baixo estresse por nitrogênio, eficiência de uso de nitrogênio aumentada, biomassa total aumentada, rendimento de grão aumentado, taxa de fotossíntese aumentada, tolerância aumentada à seca, tolerância ao calor aumentada, tolerância ao sal aumentada, resistência aumentada a estresse por nematódeo, resistência aumentada a um patógeno fúngico, resistência aumentada a um patógeno bacteriano, resistência aumentada a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabólito, e uma modulação detectável no proteoma, em relação a uma planta de referência.

[0050] Em algumas modalidades, as combinações sintéticas descritas no presente documento compreendem sementes e o primeiro endófito está associado às sementes como um revestimento sobre a superfície das sementes e/ou compreende mudas e o primeiro endófito é colocado em contato com as mudas como uma aspersão aplicada a uma ou mais folhas e/ou uma ou mais raízes das mudas; e/ou compreende adicionalmente uma ou mais espécies de endófitos adicionais.

[0051] A quantidade eficaz das combinações sintéticas descritas no presente documento pode ser, por exemplo, 1x10A3 CFU ou esporos/por semente; a partir de cerca de 1x10A2 CFU ou esporos/por semente a cerca de 1x10A8 CFU ou esporos/por semente.

[0052] Em algumas modalidades, a semente é uma semente de uma planta agrícola. Em algumas modalidades, a semente é uma semente transgênica.

[0053] As combinações sintéticas descritas no presente documento podem compreender adicionalmente, por exemplo, um ou mais dos seguintes: um estabilizante, ou um conservante, ou um veículo, ou um tensoativo, ou um agente anticomplexo, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, as combinações sintéticas descritas no presente documento que compreendem adicionalmente um ou mais dos seguintes: fungicida, nematicida, bactericida, inseticida e herbicida.

[0054] Também é descrita no presente documento uma pluralidade de qualquer uma das combinações sintéticas descritas no presente documento, colocada em um meio que promove o crescimento vegetal, o dito meio selecionado a partir do grupo que consiste em: solo, aparelho hidropônico, e meio de crescimento artificial. Em algumas modalidades, a pluralidade de combinações sintéticas é colocada no solo em fileiras, com espaçamento substancialmente igual entre cada semente dentro de cada fileira. Também é descrita no presente documento uma pluralidade de combinações sintéticas confinada dentro de um objeto selecionado a partir do grupo que consiste em: garrafa, campânula, ampola, caixote, vaso, bolsa, caixa, cesto, invólucro, caixa de papelão, recipiente, silo, contentor de transporte, carroceria de caminhão e bainha; em algumas modalidades, as combinações sintéticas são não perecíveis.

[0055] Também são descritas no presente documento plantas desenvolvidas a partir das combinações sintéticas descritas no presente documento, sendo que a dita planta exibe um fenótipo aprimorado de interesse agronômico, selecionado a partir do grupo que consiste em: resistência a doenças, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância à salinidade, tolerância a metal, tolerância a herbicida, tolerância química, eficiência de uso de água aumentada, utilização de nitrogênio aprimorada, fixação de nitrogênio aprimorada, resistência a pragas, resistência a herbívoros, resistência a patógenos, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições de água limitadas, melhora da saúde, melhora de vigor, melhora de crescimento, melhora da capacidade fotossintética, melhora da nutrição, teor de proteína alterado, teor de óleo alterado, biomassa aumentada, comprimento de broto aumentado, comprimento de raiz aumentado, arquitetura de raiz aprimorada, peso de semente aumentado, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, número de vagens, senescência retardada, stay-green, e composição de proteína de semente alterada. Em uma modalidade, é descrita no presente documento uma planta ou progênie da planta das combinações sintéticas descritas no presente documento, em que a dita planta ou progênie da planta compreende em pelo menos um de seus elementos vegetais os ditos endófitos.

[0056] É descrito no presente documento uma planta agrícola, ou porção ou tecido da mesma, que compreende uma formulação que compreende um endófito que é comum a pelo menos dois tipos de plantas doadoras que fica disposto sobre uma superfície externa de ou dentro da planta em uma quantidade eficaz para colonizar a planta, e em uma quantidade eficaz para fornecer um benefício à planta agrícola moderna. Em algumas modalidades, o endófito compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos fornecida nas Tabelas 1 a 10. Também é descrita no presente documento uma planta agrícola moderna, ou porção ou tecido da mesma, que compreende uma formulação compreendendo uma entidade microbiana endofítica derivada de uma planta agrícola antiga que fica disposta sobre uma superfície externa de ou dentro da planta em uma quantidade eficaz para colonizar a planta, e em uma quantidade eficaz para proporcionar um benefício à planta agrícola moderna. Em algumas modalidades, o endófito compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos fornecida nas Tabelas 12 a 19.

[0057] As plantas descritas no presente documento têm um benefício que é, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste em biomassa de raiz aumentada, comprimento de raiz aumentado, altura aumentada, comprimento de broto aumentado, número de folhas aumentado, eficiência de uso de água aumentada, biomassa total aumentada, rendimento de grão aumentado, taxa de fotossíntese aumentada, tolerância aumentada à seca, tolerância ao calor aumentada, tolerância ao sal aumentada, resistência aumentada a estresse por nematódeo, resistência aumentada a um patógeno fúngico, resistência aumentada a um patógeno bacteriano, resistência aumentada a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabólito, e uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência. Em algumas modalidades, pelo menos dois benefícios são fornecidos à planta agrícola.

[0058] Em algumas modalidades, a planta é colocada em contato com pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300,000 CFU ou esporos, pelo menos 1.000.000 CFU ou esporos ou mais, do endófito.

[0059] Em algumas modalidades, a planta é uma semente. Em algumas modalidades, a planta é uma semente e a população fica disposta sobre a superfície da semente.

[0060] As plantas descritas no presente documento podem incluir pelo menos duas entidades microbianas endofíticas que compreendem uma sequência de ácido nucleicos que é pelo menos 97% idêntica a qualquer ácido nucleico fornecido nas Tabelas 1 a 10 em uma quantidade eficaz para colonizar a planta agrícola madura.

[0061] Em algumas modalidades, a planta é uma monocotiledônea, por exemplo, selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, cevada e arroz. Em algumas modalidades, a planta é uma dicotiledônea, por exemplo, selecionada a partir do grupo que consiste em uma soja, canola, algodão, tomate e pimenta.

[0062] Em algumas modalidades das plantas descritas no presente documento, o endófito pode ficar disposto em uma quantidade eficaz que será detectável dentro de um tecido alvo do tecido maduro da planta agrícola madura selecionada a partir de um fruto, semente, folha, raiz ou porção da mesma.

[0063] Em algumas modalidades das plantas descritas no presente documento, o tecido alvo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste na raiz, broto, folha, flor, fruto e semente.

[0064] Em algumas modalidades das plantas descritas no presente documento, a população pode ser detectada em uma quantidade de pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, pelo menos 1.000.000 CFU ou esporos, ou mais, na planta ou tecido alvo da mesma.

[0065] Em algumas modalidades as plantas descritas no presente documento, a população fica disposta em uma quantidade eficaz para ser detectável na rizosfera que circunda a planta. Por exemplo, a população pode ser detectada em uma quantidade de pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, pelo menos 1.000.000 CFU ou esporos, ou mais, na rizosfera que circunda a planta.

[0066] Em algumas modalidades das plantas descritas no presente documento, a população fica disposta em uma quantidade eficaz para aumentar detectavelmente a biomassa da planta. Por exemplo, a biomassa da planta pode ser detectavelmente aumentada em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[0067] Em algumas modalidades das plantas descritas no presente documento, a população fica disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa de um fruto ou semente da planta. Por exemplo, a biomassa do fruto ou semente da planta pode ser detectavelmente aumentada em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, ou mais, quando comparado com o fruto ou semente de uma planta agrícola de referência.

[0068] Em algumas modalidades das plantas descritas no presente documento, a população fica disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a altura da planta. Por exemplo, a altura da planta pode ser detectavelmente aumentada em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, ou mais, quando comparado com a altura de uma planta agrícola de referência.

[0069] Em algumas modalidades das plantas descritas no presente documento, a população fica disposta em uma quantidade eficaz para aumentar efetivamente a resistência a qualquer uma das condições de estresse selecionadas a partir do grupo que consiste em um estresse por seca, estresse por calor, estresse por frio, estresse por sal, e estresse por baixo teor de minerais. Por exemplo, a população pode ficar disposta em uma quantidade eficaz para aumentar eficazmente a resistência a qualquer uma das condições de estresse biótico selecionadas a partir do grupo que consiste em um estresse por nematódeo, estresse por inseto, estresse por patógeno fúngico, estresse por patógeno bacteriano, e estresse por patógeno viral.

[0070] Também são descritos no presente documento produtos agrícolas que compreendem uma quantidade em peso de sementes de 1000 sementes de uma planta descrita no presente documento. Em algumas modalidades dos produtos agrícolas descritos no presente documento, os endófitos estão presentes em uma certa concentração. Por exemplo, a concentração de endófitos no produto agrícola é de cerca de 102 a cerca de 105 CFU ou esporos/ml. Em outro exemplo, a concentração de endófitos no produto agrícola é de cerca de 105 a cerca de 108 CFU ou esporos/ml.

[0071] Também é descrita no presente documento uma formulação agrícola que compreende uma combinação sintética descrita no presente documento. Em algumas modalidades, a formulação é um gel ou pó e a concentração microbiana é de cerca de 10A3 a cerca de 10A11 CFU ou esporos/gm. Em algumas modalidades, o produto agrícola ou formulação que proporciona um benefício é selecionado a partir do grupo que consiste em: biomassa de raiz aumentada, comprimento de raiz aumentado, altura aumentada, comprimento de broto aumentado, número de folha aumentado, eficiência de uso de água aumentada, tolerância aumentada a baixo estresse por nitrogênio, eficiência de uso de nitrogênio aumentada, biomassa total aumentada, rendimento de grão aumentado, taxa de fotossíntese aumentada, tolerância aumentada à seca, tolerância ao calor aumentada, tolerância ao sal aumentada, resistência aumentada a estresse por nematódeo, resistência aumentada a um patógeno fúngico, resistência aumentada a um patógeno bacteriano, resistência aumentada a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabólito, e uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência, ou combinações dos mesmos.

[0072] Descritos no presente documento são produtos vegetais de consumo que compreendem as plantas descritas no presente documento. Em algumas modalidades, o produto é um grão, uma farinha, um amido, um xarope, uma refeição, um óleo, um filme, uma embalagem, um produto nutracêutico, uma polpa, uma ração animal, uma forragem para peixe, um material a granel para produtos químicos de uso industrial, um produto de cereais, um produto alimentício para humano processado, um açúcar ou um álcool e proteína. Também são descritos no presente documento métodos para produzir um produto vegetal de consumo, que compreendem: obter uma planta ou tecido vegetal a partir de qualquer uma das plantas descritas no presente documento, ou progênie ou derivado do mesmo, e produzir o produto vegetal de consumo a partir do mesmo

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0073] Figura 1. Gráfico de dimensionamento multidimensional não métrico que mostra as diferenças em composição bacteriana de consumo total entre (A) sementes de milho selvagens e modernas e (B) sementes de trigo selvagens e modernas. Os pontos representam a composição de consumo para uma amostra individual. Os pontos mais próximos representam produtos mais similares enquanto os pontos mais afastados representam produtos mais diferentes.

[0074] Figura 2. Gráfico de dimensionamento multidimensional não métrico que mostra as diferenças em composição fúngica de consumo total entre (A) sementes de milho selvagens e modernas e (B) sementes de trigo selvagens e modernas. Os pontos representam a composição de consumo para uma amostra individual. Os pontos mais próximos representam produtos mais similares enquanto os pontos mais afastados representam produtos mais diferentes.

[0075] Figura 3. Diferenças em diversidade bacteriana de semente entre vários cultivares de milho. São mostrados os índices de Diversidade de Shannon de produtos bacterianos encontrados em cultivares de Teosinto, Locais, Endocruzados e modernos de milho.

[0076] Figura 4. Diferenças em diversidade bacteriana de semente entre vários cultivares de trigo. São mostrados os índices de Diversidade de Shannon de produtos bacterianos encontradas em cultivares Selvagems, Locais e modernos de trigo.

[0077] Figura 5. Diferenças em diversidade fúngica de semente em diferentes cultivares de milho. São mostrados os índices de Diversidade de Shannon de produtos fúngicos encontrados em Teosinto, Landrace, Inbred e cultivares modernos de milho, ilustrando a densidade mais baixa de produtos fúngicos dentro de milho moderno.

[0078] Figura 6. Diferenças em diversidade fúngica de semente em diferentes cultivares de trigo. São mostrados os índices de Diversidade de Shannon de produtos fúngicos encontrados em cultivares Selvagems, Locais e modernos de trigo que, conforme com o milho, demonstram uma diversidade reduzida de produtos fúngicos dentro do milho moderno.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0079] Os inventores realizaram uma comparação sistemática dos produtos microbianos que residem dentro de uma ampla diversidade de plantas agrícolas. A presente invenção se baseia na notável descoberta que os principais constituintes do microbioma vegetal podem ser compartilhados entre diversas variedades de culturas, e a identificação de espécies bacterianas e fúngicas que fornecem diversas vantagens a hospedeiros de cultura inovadores através de administração heteróloga. Com isso, os micróbios endofíticos úteis para a invenção, em geral, se referem a micróbios endofíticos que estão presentes em plantas agrícolas.

[0080] Atualmente, a visão geralmente aceita de comunidades endofíticas de plantas se concentra em sua derivação homóloga, predominantemente das comunidades de solo em que as plantas estão se desenvolvendo (Hallman, J., et al., (1997) Canadian Journal of Microbiology. 43(10): 895 a 914). Observando-se a sobreposição taxonômica entre a microbiota endofítica e do solo em A. thaliana, foi afirmado, "Our rigorous definition of an endophytic compartment microbiome should facilitate controlled dissection of plant-microbe interactions derived from complex soil communities" (Lundberg et al., (2012) Nature. 488, 86 a 90). Há um forte apoio na técnica de solo que representa o repositório a partir do qual os endófitos vegetais são derivados. New Phytologist (2010) 185: 554 a 567. Interações planta- micróbio notáveis como fungos micorrízicos e rizóbios bacterianos se ajustam ao paradigma de colonização baseada em solo de hospedeiros vegetais e parecem se estabelecer independentemente de semente. Como resultado de concentração da atenção na derivação de endófitos a partir do solo no qual a planta agrícola alvo está atualmente se desenvolvendo, tem havido uma incapacidade de alcançar melhorias comercialmente significativas em rendimentos de plantas e outras características de plantas como teor de óleo alterado, teor de proteína alterada, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, e composição de proteína de semente alterada, tolerância a produtos químicos, tolerância ao frio, senescência retardada, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da espiga, melhora do crescimento, melhora da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicida, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, arquitetura de raiz aprimorada, eficiência de uso de água aumentada, biomassa aumentada, comprimento de raiz aumentado, peso de semente aumentado, comprimento de broto aumentado, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições limitadas de água, massa de núcleo, teor de umidade de núcleo, tolerância a metal, número de espigas, número de núcleos por espiga, número de vagens, melhora da nutrição, resistência a patógenos, resistência a pragas, melhora da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, stay-green, melhora de vigor, peso seco aumentado de sementes maduras, peso fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta, teor de clorofila aumentado, número de vagens por planta aumentado, comprimento de vagens por planta aumentado, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta, e número aumentado de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de uma transcrição, e uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência.

[0081] Em parte, a presente invenção descreve preparações de endófitos inovadores derivados de sementes ou plantas e a criação de combinações sintéticas de sementes agrícolas e/ou mudas com endófitos heterólogos derivados de sementes ou plantas e formulações contendo as combinações sintéticas, bem como o reconhecimento que tais combinações sintéticas exibem uma diversidade de propriedades benéficas presentes nas plantas agrícolas e as populações de endófitos associadas recentemente criadas pelos presentes inventores. Tais propriedades benéficas incluem metabolismo, expressão de transcrição, alterações de proteoma, morfologia e a resiliência a uma variedade de estresses ambientais, e a combinação de uma pluralidade de tais propriedades.

[0082] Pouca atenção tem sido dada na técnica para compreender a função de elementos vegetais como reservatórios de micróbios que podem ocupar eficientemente a endosfera de plantas agrícolas. Embora o conceito que os elementos vegetais podem abrigar patógenos vegetais seja promovido por Baker e Smith (Annu Rev Phytopathol 14: 311 a 334(1966)), e a compreensão que patógenos bacterianos e fúngicos são conhecidos por serem capazes de infectar elementos vegetais, a capacidade de aproveitar os endófitos derivados de um amplo espectro de elementos vegetais para conferir de forma heteróloga vantagens únicas ou múltiplas a culturas agrícolas era anteriormente não reconhecida. Visto que a presença de patógenos detectáveis em um lote de elementos vegetais pode necessitar de destruição de um grande número de germoplasma agrícola (Gitaitis, R. and Walcott, R. (2007) Annu. Rev. Phytopathol. 45:371 a 97), preocupações com a segurança abrangeram a consideração de micróbios associados a sementes ou endófitos não solo. Além disso, quando patógenos de semente são detectados, sua transferência para a planta em desenvolvimento pode ser altamente ineficiente. Por exemplo, um estudo de transmissão baseada em semente do patógeno de semente, Pantoea stewartii, constatou que a semente produzida a partir de uma população de plantas infectadas por patógenos deu origem a mudas infectadas em apenas 0,0029% dos casos (1 de 34.924 plantas) e núcleos artificialmente infectados deram origem a mudas infectadas em 0,022% dos casos (Block, C. C., el al., (1998). Plant disease. 82(7). 775 a 780). Dessa forma, a eficiência com a qual as plantas introduzem micróbios em suas sementes, e com a qual os micróbios dentro das sementes se propagam dentro dos tecidos vegetais resultantes, foi anteriormente considerada baixa e muitas vezes substancialmente variável. Dessa forma, o potencial de teor microbiano dentro das sementes para ocupar a planta resultante tem sido pouco claro.

[0083] O potencial para elementos vegetais servirem como reservatórios para micróbios não patogênicos também permanece controverso (Hallman, J., et al., (1997) Canadian Journal of Microbiology. 43(10): 895 a 914). Sato, et al., não detectaram quaisquer bactérias dentro de sementes de arroz ((2003) In. Morishima, H. (ed.) The Natural History of Wild Rice - Evolution Ecology of Crop. p.91-106) e Mundt e Hinkle obtiveram apenas endófitos de amostras de semente em que as cascas de sementes foram quebradas ou fraturadas em 29 tipos de sementes de plantas (Appl Environ Microbiol. (1976) 32(5):694 a 8). Outro grupo detectou simplesmente populações bacterianas dentro de sementes de arroz que se situam na faixa de tamanho de população de 10A2 a 10A6 CFU/g de peso fresco (Okunishi, S., et al., (2005) Microbes and Environment. 20:168 a 177). Rosenblueth et al descreveram sementes para abrigar comunidades microbianas muito simples com variabilidade significativa das comunidades microbianas entre sementes de milho individuais, incluindo variabilidade substancial entre sementes retiradas da mesma espiga (Rosenblueth, M. et al, Seed Bacterial Endophytes: Common Genera, Seed-to-Seed Variability and Their Possible Role in Plants; Proc. XXVIIIth IHC - IS on Envtl., Edaphic & Gen. Factors; Affecting Plants, Seeds and Turfgrass; Eds.: G.E. Welbaum et al. Acta Hort. 938, ISHS 2012).

[0084] Essas constatações demonstram limitações reconhecidas na técnica referentes à tentativa de uso de endófitos derivados de sementes; isto é, as sementes de milho parecem conter diversidade taxonômica limitada, e que a microbiota de sementes individuais produzidas por plantas muitas vezes é distinta, indicando que pode não haver simbiontes simples derivados de sementes ou plantas capazes de proporcionar benefícios em uma grande população de plantas agrícolas e especificamente, na utilização de endófitos em semente. Por exemplo, a caracterização de ~15 sementes agrupadas de dentro de vários cultivares do gênero Zea mostrou que populações de sementes de milho tendem a abrigar um número muito limitado de táxons que parecem ser conservados em variantes modernas e antigas, e que o teor de semente de milho de tais táxons é baixo e substancialmente variável. Não está claro se a presença de tais táxons limitados resultou de condições de armazenamento comuns, contaminação ambiental, ou uma potencial transmissão vertical de micróbios através de sementes, e também era incerta a aplicabilidade de tais táxons limitados para aumentar o rendimento agrícola. Particularmente, 99% dessas cepas se revelaram prejudiciais ou não têm efeito benéfico sobre plantas agrícolas, por exemplo, quando testadas em um ensaio de crescimento de batata (Johnston-Monje D, Raizada MN (2011) Conservation and Diversity of Seed Associated Endophytes in Zea across Boundaries of Evolution, Ethnography and Ecology. PLoS ONE 6(6): e20396. doi:10.1371/journal.pone.0020396). Adicionalmente, alguns micróbios isolados têm relação evolutiva próxima a patógenos vegetais, tornando possível que tais micróbios representem um reservatório latente de patógenos, em vez de constituintes potencialmente benéficos.

[0085] Surpreendentemente, foi constatado que endófitos derivados de sementes ou plantas podem conferir vantagens significativas a culturas agrícolas, estendendo o crescimento sob condições normais e de estresse, expressão alterada de hormônios vegetais essenciais, expressão alterada de transcrições essenciais na planta, e outras características desejadas. São fornecidas composições, métodos e produtos inovadores relacionados à capacidade de a presente invenção superar as limitações da técnica anterior para fornecer aumentos confiáveis em rendimento de cultura, biomassa, germinação, vigor, resiliência ao estresse, e outras propriedades a culturas agrícolas.

[0086] A presente invenção é surpreendente por vários motivos com base nas demonstrações anteriores na técnica. Particularmente, houve uma falta de clareza relacionada à possibilidade de os endófitos serem associados a elementos vegetais saudáveis, à possibilidade de os micróbios isolados de elementos vegetais colonizarem eficazmente o hospedeiro se o mesmo estiver disposto no exterior de um elemento vegetal ou muda, e à possibilidade de tais micróbios conferirem um efeito benéfico ou prejudicial sobre os hospedeiros. Ainda está pouco claro se a aplicação heteróloga de tais micróbios a elementos vegetais distintos dos quais os mesmos foram derivados poderia proporcionar efeitos benéficos.

[0087] Constatou-se que os micróbios benéficos de dentro dos táxons microbianos conservados podem ser fortemente derivados de elementos vegetais agrícolas, opcionalmente cultivados, administrados de forma heteróloga a elementos vegetais agrícolas ou mudas, e colonizam os tecidos vegetais resultantes com alta eficiência para conferir múltiplas propriedades benéficas. Isto é surpreendente dada a variabilidade observada na técnica em isolamento de micróbios de elementos vegetais saudáveis e as observações anteriores de colonização ineficiente de patógenos de elementos vegetais de tecidos do hospedeiro da planta. Adicionalmente, a capacidade de os endófitos derivados de sementes ou plantas dispostos de forma heteróloga colonizarem sementes e mudas a partir do exterior de sementes é surpreendente, dado que tais endófitos podem ser isolados de dentro de tecidos de semente internos e, portanto, não precisam nativamente da capacidade de penetrar e invadir externamente os tecidos hospedeiros.

[0088] A caracterização anterior de teor microbiano de sementes indicou que as concentrações microbianas em sementes podem ser variáveis e são, em geral, muito baixas (isto é, menores que 10, 100, 10A3, 10A4, 10A5 CFUs/semente). Com isso, não ficou claro se as concentrações alteradas ou aumentadas associadas a sementes poderiam ser benéficas. Constatou-se que os micróbios podem conferir propriedades benéficas em uma gama de concentrações.

[0089] Uma limitação significativa da técnica existente em endófitos é a perspectiva mais limitada em composições de comunidades de endófitos em uma diversidade de genótipos e vegetais e ambientes. Isso resultou em isolamentos de endófito desprovidos da capacidade de colonizar múltiplos hospedeiros ou conferir de modo reproduzível benefícios em múltiplos locais e tipos de solo.

[0090] Os inventores conceberam que a microbiota bacteriana e fúngica de grandes números de sementes agrícolas e sementes selvagens de uma diversidade de localizações geográficas poderia ter uma capacidade aprimorada de colonizar e beneficiar múltiplos genótipos vegetais em múltiplos ambientes. Os inventores desenvolveram um método para introduzir endófitos isolados em outra planta revestindo-se os micróbios sobre a superfície de uma semente de uma planta. Combinando-se um endófito proveniente de uma planta, é possível transferir novos traços agronômicos benéficos para uma planta agrícola que, portanto, é uma grande promessa para aumentar a produtividade agrícola. Adicionalmente, conforme demonstrado no presente documento, os endófitos microbianos em muitos casos capazes de conferir aditivamente benefícios a sementes, mudas ou plantas receptoras.

[0091] Combinando-se uma espécie de planta selecionada, OTU, cepa ou cultivar com um ou mais tipos de endófitos, dessa forma, fornece mecanismos por meio dos quais, individualmente ou em paralelo com melhoramento de planta e tecnologias transgênicas, proporciona-se um rendimento aprimorado de culturas e geração de produtos das mesmas. Portanto, em um aspecto, a presente invenção fornece uma combinação sintética de uma semente de uma primeira planta e uma preparação de um endófito que é revestido sobre a superfície da semente da primeira planta de modo que o endófito esteja presente em um nível mais alto sobre a superfície da semente do que está presente sobre a superfície de uma semente de referência não- revestida, em que o endófito é isolado da parte interna da semente de uma segunda planta. Conforme descrito no presente documento, a combinação é realizada por revestimento artificial, aplicação ou outra infecção de uma semente de uma planta com uma cepa de endófitos. Em algumas modalidades, os endófitos são introduzidos sobre a superfície de sementes de plantas hospedeiras, que mediante o cultivo conferem traços agronômicos aprimorados à dita planta hospedeira, que pode, então, gerar sementes de progênie.

Definições

[0092] Uma "combinação sintética" inclui uma combinação de uma planta hospedeira e um endófito. A combinação pode ser realizada, por exemplo, revestindo-se a superfície da semente de uma planta, como uma planta agrícola, ou tecidos de planta hospedeira com um endófito.

[0093] Conforme usado no presente documento, uma "semente agrícola" é uma semente usada para desenvolver uma planta em agricultura (uma "planta agrícola"). A semente pode ser de uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, e é plantada para a produção de um produto agrícola, por exemplo, grão, alimento, ração, fibra, combustível, etc. Conforme usado no presente documento, uma semente agrícola é uma semente que é preparada para plantio, por exemplo, em fazendas para cultivo.

[0094] Um "endófito" ou "entidade endofítica" ou "micróbio endofítico" é um organismo capaz de viver dentro de uma planta ou está, de outro modo, associado à mesma, e não causa doença ou dano à planta de outro modo. Os endófitos podem ocupar os espaços intracelulares ou extracelulares de tecido vegetal, incluindo as folhas, caules, flores, frutas, sementes ou raízes. Um endófito pode ser, por exemplo, um organismo bacteriano ou fúngico e, pode conferir uma propriedade benéfica à planta hospedeira como um aumento no rendimento, biomassa, resistência ou adequação. Um endófito pode ser um fungo ou uma bactéria. Conforme usado no presente documento, o termo "micróbio", às vezes, é usado para descrever um endófito. Adicionalmente, "endófito" significa um micróbio (tipicamente um fungo ou uma bactéria) que está associado a um tecido vegetal e está em uma relação simbiótica ou outra relação benéfica com o dito tecido vegetal. Conforme usado no presente documento, um "componente endofítico" refere-se a uma composição ou estrutura que é parte do endófito.

[0095] Conforme usado no presente documento, o termo "bactérias" ou "bactéria" refere-se, em geral, a qualquer organismo procariótico e pode fazer referência a um organismo de Reino Eubacteria (Bacteria), Reino Archaebacteria (Archae), ou ambos.

[0096] "Espaçador Transcrito Interno" (ITS) refere-se ao DNA espaçador (DNA não codificante) situado entre os genes de RNA ribossômico de subunidade pequena (rRNA) e rRNA de subunidade grande no cromossomo ou a região transcrita correspondente na transcrição de precursor de rRNA policistrônico.

[0097] Uma "rede complexa" significa uma pluralidade de entidades de endófito (por exemplo, bactérias simples ou fungos simples, fungos complexos, ou combinações dos mesmos) colocalizadas em um ambiente, como sobre ou dentro de uma planta agrícola. De preferência, uma rede complexa inclui dois ou mais tipos de entidades de endófito que interagem de modo sinérgico, tais populações endofíticas sinérgicas são capazes de proporcionar um benefício à semente agrícola, muda ou planta derivada da mesma.

[0098] Uma "população" de endófitos se refere à presença de mais de um endófito em um ambiente particular. A população pode compreender mais de um indivíduo da mesma taxonomia ou mais de uma taxonomia de indivíduos. Por exemplo, uma população pode compreender 10A2 colônias de Cladosporium. Em um outro exemplo, uma população pode compreender 10A2 colônias de Cladosporium e 10A3 colônias de Penicillium. Uma população pode, em geral, mas não se limita a, compreender indivíduos que estão relacionados por alguma característica, como sendo no mesmo ambiente ao mesmo tempo, ou em virtude de compartilhar algum fenótipo como a capacidade de metabolizar um substrato particular.

[0099] Os termos "patógeno" e "patogênico" em referência a uma bactéria ou fungo inclui qualquer organismo que é capaz de causar ou afetar uma doença, distúrbio ou condição de um hospedeiro que compreende o organismo.

[00100] Um "esporo" ou uma população de "esporos" refere-se a bactérias ou fungos que são, em geral, viáveis, mais resistentes a influências ambientais como calor e agentes bactericidas ou fungicidas exceto outras formas das mesmas bactérias ou fungos e, tipicamente, capazes de germinação e crescimento pós-germinativo. As bactérias e fungos que são "capazes de formar esporos" são aquelas bactérias e fungos que compreendem os genes e outras capacidades necessárias de produzir esporos sob condições ambientais adequadas.

[00101] Conforme usado no presente documento, uma "unidade formadora de colônia" ("CFU") é usada como uma medição de microrganismos viáveis em uma amostra. Uma CFU é uma célula viável individual capaz de formar em um meio sólido uma colônia visível cujas células individuais são derivadas por divisão celular de uma célula parental.

[00102] O termo "isolado" tem por objetivo se referir especificamente a um organismo, célula, tecido, polinucleotídeo ou polipeptídeo que é removido de sua fonte original e purificado a partir de componentes adicionais aos quais o mesmo estava originalmente associado. Por exemplo, um endófito pode ser considerado isolado de uma semente se o mesmo for removido daquela fonte de semente e purificado de modo que seja isolado de quaisquer componentes adicionais aos quais o mesmo estava originalmente associado. De modo similar, um endófito pode ser removido e purificado de uma planta ou elemento vegetal de modo que o mesmo seja isolado e não mais associado à sua planta ou elemento vegetal de origem.

[00103] Um "elemento vegetal" tem por objetivo se referir genericamente a uma planta inteira ou um componente de planta, incluindo, mas não se limitando a, tecidos, partes e tipos de células vegetais. Um elemento vegetal é, de preferência, um dos seguintes: planta inteira, muda, tecido meristemático, tecido do solo, tecido vascular, tecido dérmico, semente, folha, raiz, broto, caule, flor, fruta, estolho, bulbo, tubérculo, cormo, keikis, botão. Conforme usado no presente documento, um "elemento vegetal" é sinônimo a uma "porção" de uma planta, e refere-se a qualquer parte da planta, e pode incluir tecidos e/ou órgãos diferentes, e pode ser usado de forma intercambiável com o termo "tecido".

[00104] De modo similar, um "elemento reprodutivo vegetal" tem por objetivo fazer referência genericamente a qualquer parte de uma planta que seja capaz de iniciar outras plantas através de reprodução sexuada ou assexuada daquela planta, por exemplo, mas não se limitando a: semente, muda, raiz, broto, estolho, bulbo, tubérculo, cormo, keikis ou botão.

[00105] Uma "população" de plantas, como usado no presente documento, pode se referir a uma pluralidade de plantas que foram submetidas aos mesmos métodos de inoculação descritos no presente documento, ou uma pluralidade de plantas que são progênie de uma planta ou grupo de plantas que foram submetidas aos métodos de inoculação. Além disso, uma população de plantas pode ser um grupo de plantas que são desenvolvidas a partir de sementes revestidas. As plantas dentro de uma população serão, tipicamente, da mesma espécie e também irá, tipicamente, compartilhar uma derivação genética comum.

[00106] Conforme usado no presente documento, uma "semente agrícola" é uma semente usada para desenvolver uma planta, tipicamente, usada em agricultura (uma "planta agrícola"). A semente pode ser de uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, e pode ser plantada para a produção de um produto agrícola, por exemplo, ração, alimento, fibra, combustível, etc. Conforme usado no presente documento, uma semente agrícola é uma semente que é preparada para plantio, por exemplo, em fazendas para cultivo.

[00107] "Plantas agrícolas", ou "plantas de importância agronômica", incluem plantas que são cultivadas por humanos para propósitos de alimento, ração, fibra e combustível. As plantas agrícolas incluem espécies monocotiledôneas como: milho (Zea mays), trigo comum (Triticum aestivum), espelta (Triticum spelta), trigo einkorn (Triticum monococcum), trigo emmer (Triticum dicoccum), trigo durum (Triticum durum), arroz asiático (Oryza sativa), arroz africano (Oryza glabaerreima), arroz selvagem (Zizania aquatica, Zizania latifolia, Zizania palustris, Zizania texana), cevada (Hordeum vulgare), Sorgo (Sorghum bicolor), milheto Finger (Eleusine coracana), milheto Proso (Panicum miliaceum), milheto Pearl (Pennisetum glaucum), milheto Foxtail (Setaria italica), Aveia (Avena sativa), Triticale (Triticosecale), centeio (Secale cereal), centeio selvagem (Psathyrostachys juncea), bambu (Bambuseae), ou cana-de-açúcar (por exemplo, Saccharum arundinaceum, Saccharum barberi, Saccharum bengalense, Saccharum edule, Saccharum munja, Saccharum officinarum, Saccharum procerum, Saccharum ravennae, Saccharum robustum, Saccharum sinense, ou Saccharum spontaneum); bem como espécies de dicotiledôneas espécies como: cultivares de soja (Glycine max), canola e semente de colza (Brassica napus), algodão (gênero Gossypium), alfafa (Medicago sativa), aipim (genus Manihot), batata (Solanum tuberosum), tomate (Solanum lycopersicum), ervilha (Pisum sativum), grão-de-bico (Cicer arietinum), lentilha (Lens culinaris), linhaça (Linum usitatissimum) e muitas variedades de legumes.

[00108] Uma "planta hospedeira" inclui qualquer planta, particularmente uma planta de importância agronômica, que uma entidade endofítica como um endófito pode colonizar. Conforme usado no presente documento, diz-se que um endófito "coloniza" uma planta ou semente quando o mesmo pode ser estavelmente detectado dentro da planta ou semente durante um período de tempo, como um ou mais dias, semanas, meses ou anos, em outras palavras, uma entidade de colonização não está temporariamente associada à planta ou semente. Tais plantas hospedeiras são, de preferência, plantas de importância agronômica. É contemplado que qualquer elemento, ou mais de um elemento, da planta hospedeira pode ser colonizado com um endófito para, dessa forma, conferir uma condição de hospedeiro à planta. O elemento inoculado inicial pode ser adicionalmente diferente do elemento em que o endófito é localizado. Um endófito pode se localizar em diferentes elementos da mesma planta de maneira espacial ou temporal. Por exemplo, uma semente pode ser inoculada com um endófito, e mediante germinação, o endófito pode se localizar no tecido radicular.

[00109] Um "alvo não hospedeiro" significa um organismo ou composto químico que é alterado de alguma forma após o contato de uma planta hospedeira ou fungo hospedeiro que compreende um endófito, como resultado de uma propriedade conferida à planta hospedeira ou fungo hospedeiro pelo endófito.

[00110] Conforme usado no presente documento, uma variedade "antiga" de uma planta refere-se, em geral, a uma variedade ou espécie de uma planta que é um ancestral selvagem ou espécie não domesticada de plantas agrícolas. Tais variedades antigas são, em geral, distinguidas de plantas agrícolas usadas em práticas agrícolas de grande escala em uso atualmente pelo fato de que as variedades antigas não foram extensivamente reproduzidas e são, em geral, de polinização aberta. Conforme usado no presente documento, as variedades antigas incluem variedades locais, variedades de heirloom e espécies progenitoras.

[00111] Uma variedade "moderna" de uma planta refere-se a uma variedade não antiga de uma planta.

[00112] Conforme usado no presente documento, uma "planta híbrida" refere-se, em geral, a uma planta que é o produto de um cruzamento entre duas plantas parentais geneticamente diferentes. Uma parte híbrida é gerada tanto por um processo natural como artificial de hibridização por meio do qual todo o genoma de uma espécie, variedade de cultivar, linha de reprodução ou planta individual é combinada de modo intra ou interespecífico no genoma de espécie, variedade ou cultivar ou linha, linha de reprodução ou planta individual por cruzamento.

[00113] Uma "planta endocruzada", conforme usado no presente documento, refere-se a uma planta ou linhagem vegetal que foi repetidamente cruzada ou endocruzada para alcançar um grau de uniformidade genética, e baixa heterozigosidade, como conhecido na técnica.

[00114] O termo "isolina" é um termo comparativo, e se refere a organismos que são geneticamente idênticos, porém podem ser diferentes em tratamento. Em um exemplo, dois embriões de planta de milho geneticamente idênticos podem ser separados em dois grupos diferentes, sendo que um recebe um tratamento (como transformação com um polinucleotídeo heterólogo, para gerar uma planta genéticamente modificada) e um controle que não recebe tal tratamento. Quaisquer diferenças fenotípicas entre os dois grupos podem ser, dessa forma, atribuídas exclusivamente ao tratamento e não a qualquer inerência da constituição genética da planta. Em um outro exemplo, duas sementes geneticamente idênticas podem ser tratadas com uma formulação que introduz uma composição de endófito. Quaisquer diferenças fenotípicas entre as plantas desenvolvidas a partir dessas sementes podem ser atribuídas ao tratamento, dessa forma, formando uma comparação com isolina.

[00115] De modo similar, pelo termo "planta agrícola de referência" entende-se uma planta agrícola da mesma espécie, cepa, ou cultivar ao qual um tratamento, formulação, composição ou preparação de endófito conforme descrito no presente documento não é administrada/colocada em contato. Uma planta agrícola de referência, portanto, é idêntica à planta tratada com a exceção da presença do endófito e pode servir como um controle para detectar os efeitos do endófito que são conferidos à planta.

[00116] Um "ambiente de referência" refere-se ao ambiente, tratamento ou condição da planta em que uma medição é feita. Por exemplo, a produção de um composto em uma planta associada a um endófito pode ser medida em um ambiente de referência de estresse de seca, e em comparação com os níveis do composto em uma planta agrícola de referência sob as mesmas condições de estresse de seca. Alternativamente, os níveis de um composto na planta associada a um endófito e planta agrícola de referência podem ser medidos sob condições idênticas sem estresse.

[00117] Em algumas modalidades, a invenção contempla o uso de micróbios que são "exógenos" a uma semente ou planta. Conforme usado no presente documento, um micróbio é considerado exógeno à semente ou planta se a semente ou muda que é não modificada (por exemplo, uma semente ou muda que não é tratada com a população microbiana endofítica descrita no presente documento) não contiver o micróbio.

[00118] Em algumas modalidades, um micróbio pode ser "endógeno" a uma semente ou planta. Conforme usado no presente documento, um micróbio é considerado "endógeno" a uma planta ou semente, se o endófito ou componente endófito for derivado de, ou de outro modo, encontrado em, um elemento de planta do espécime de planta a partir do qual o mesmo é proveniente. Em modalidades em que um endófito endógeno é aplicado, o micróbio endógeno é aplicado em uma quantidade que se difere dos níveis encontrados na planta.

[00119] Em algumas modalidades, a invenção usa endófitos que são heterólogos a um elemento vegetal, por exemplo, para produzir combinações sintéticas ou formulações agrícolas. Um micróbio é considerado heterólogo à semente ou planta se a semente ou muda que é não modificada (por exemplo, uma semente ou muda que não é tratada com a população endofítica descrita no presente documento) não contiver níveis detectáveis do micróbio. Por exemplo, a invenção contempla as combinações sintéticas de sementes ou mudas de plantas agrícolas e uma população de micróbios endofíticos (por exemplo, uma bactéria isolada), em que a população microbiana é "disposta de modo heterólogo" sobre a superfície exterior ou dentro de um tecido da semente agrícola ou muda em uma quantidade eficaz para colonizar a planta. Um micróbio é considerado "disposto de modo heterólogo" sobre a superfície ou dentro de uma planta (ou tecido) quando o micróbio é aplicado ou disposto na planta em um número que não é encontrado naquela planta antes da aplicação do micróbio. Por exemplo, uma população de endófitos que fica disposta sobre uma superfície exterior ou dentro da semente pode ser uma bactéria endofítica que pode estar associada à planta madura, mas não é encontrada sobre a superfície ou dentro da semente. Com isso, um micróbio é considerado disposto de modo heterólogo quando aplicado sobre a planta que não tem naturalmente o micróbio sobre sua superfície ou dentro do tecido particular no qual o micróbio fica disposto, ou não tem naturalmente o micróbio sobre sua superfície ou dentro do tecido particular no número que está sendo aplicado. O termo "exógeno" pode ser usado de forma intercambiável com "heterólogo". Por exemplo, um endófito fúngico que está normalmente associado ao tecido foliar de uma amostra de árvore cupressácea poderia ser considerado heterólogo ao tecido foliar de uma planta de milho. Em um outro exemplo, um endófito que está naturalmente associado ao tecido foliar de uma planta de milho é considerado heterólogo a um tecido foliar de outra planta de milho que é naturalmente desprovida do dito endófito. Em um outro exemplo, um endófito fúngico que está normalmente associado a baixos níveis em uma planta é considerado heterólogo àquela planta se uma concentração mais alta daquele endófito for introduzida na planta. Em um outro exemplo, um endófito que é compreendido dentro de um fungo poderia ser considerado heterólogo se colocado em um fungo diferente. Em ainda outro exemplo, um endófito que está associado a uma espécie de gramíneas tropicais poderia ser considerado heterólogo a uma planta de trigo.

[00120] A título de esclarecimento, "disposto de modo heterólogo" contempla o uso de micróbios que são "exógenos" a uma semente ou planta.

[00121] Em alguns casos, a presente invenção contempla o uso de micróbios que são "compatíveis" com produtos químicos agrícolas, por exemplo, um fungicida, um composto antibacteriano, ou qualquer outro agente amplamente usado na agricultura que tem o efeito de interferir no crescimento ideal de micróbios. Conforme usado no presente documento, um micróbio é "compatível" com um produto químico agrícola, quando o micróbio for modificado ou, de outro modo, adaptado para se desenvolver, ou, de outro modo, sobreviver, a concentração do produto químico agrícola usado na agricultura. Por exemplo, um micróbio disposto sobre a superfície de uma semente é compatível com o fungicida metalaxil se o mesmo for capaz de sobreviver às concentrações que são aplicadas sobre a superfície da semente.

[00122] "Biomassa" significa a massa total ou peso (fresco ou seco), em um determinado momento, de um tecido vegetal, tecidos vegetais, uma planta inteira, ou população de plantas, geralmente determinados como peso por unidade de área. O termo também pode se referir a todas as plantas ou espécies na comunidade (biomassa da comunidade).

[00123] Algumas composições e métodos descritos no presente documento envolvem micróbios endofíticos em uma quantidade eficaz para colonizar uma planta. Conforme usado no presente documento, diz-se que um micróbio "coloniza" uma planta ou semente quando o mesmo se apresenta em uma relação endofítica com a planta no ambiente da planta, por exemplo, dentro da planta ou uma parte ou tecido da mesma, inclusive a semente.

[00124] As composições e métodos no presente documento podem fornecer um "traço agronômico" aprimorado ou "traço de importância agronômica" a uma planta hospedeira, que pode incluir, mas não se limita a, os seguintes: teor de óleo alterado, teor de proteína alterada, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, e composição de proteína de semente alterada, tolerância a produtos químicos, tolerância ao frio, senescência retardada, resistência a doenças, tolerância á seca, peso da espiga, melhora do crescimento, melhora da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicida, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, arquitetura de raiz aprimorada, eficiência de uso de água aumentada, biomassa aumentada, comprimento de raiz aumentado, peso de semente aumentado, comprimento de broto aumentado, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições limitadas de água, massa de núcleo, teor de umidade de núcleo, tolerância a metal, número de espigas, número de núcleos por espiga, número de vagens, melhora da nutrição, resistência a patógenos, resistência a pragas, melhora da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, stay-green, melhora de vigor, peso seco aumentado de sementes maduras, peso fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta, teor de clorofila aumentado, número de vagens por planta aumentado, comprimento de vagens por planta aumentado, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta, e número aumentado de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de uma transcrição, e uma modulação detectável no proteoma, em comparação com uma planta isolina desenvolvida a partir de uma semente sem a dita formulação de tratamento de semente.

[00125] Conforme usado no presente documento, os termos "condição hídrica limitada" e "condição de seca", ou "água limitada" e "seca", podem ser usados de forma intercambiável. Por exemplo, um método ou composição para aprimorar a capacidade da planta de se desenvolver sob condições de seca significa a capacidade de se desenvolver sob condições hídricas limitadas. Em tais casos, pode-se dizer adicionalmente que a planta exibe tolerância à seca aprimorada.

[00126] Adicionalmente, "função metabólica alterada" ou "função enzimática alterada" pode incluir, mas não se limita a, os seguintes: produção alterada de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção alterada de um composto antimicrobiano, solubilização alterada de fosfato mineral, produção alterada de um sideróforo, produção alterada de uma celulase, produção alterada de uma quitinase, produção alterada de uma xilanase e produção alterada de acetoína.

[00127] Um "rendimento aumentado" pode se referir a qualquer aumento na biomassa ou peso de semente ou fruto, tamanho de semente, número de sementes por planta, número de sementes por unidade de área, alqueires por acre, toneladas por acre, quilo por hectare, ou rendimento de carboidrato. Tipicamente, a característica particular é designada quando refere-se ao rendimento aumentado, por exemplo, rendimento de grão aumentado ou tamanho de semente aumentado.

[00128] "Potencial traço agronômico" se destina a significar uma capacidade de um elemento vegetal exibir um fenótipo, de preferência, um traço agronômico aprimorado, em algum momento durante seu ciclo de vida, ou transportar o dito fenótipo para outro elemento vegetal ao qual o mesmo está associado na mesma planta. Por exemplo, uma semente pode compreender um endófito que irá proporcionar um benefício ao tecido foliar de uma planta a partir da qual a semente é desenvolvida; nesse caso, a semente que compreende tal endófito tem o potencial traço agronômico para um fenótipo particular (por exemplo, biomassa aumentada na planta) mesmo que a própria semente não exiba o dito fenótipo.

[00129] Pelo termo "capaz de metabolizar" um substrato de carbono particular, entende-se que o endófito é capaz de utilizar aquele substrato de carbono como uma fonte de energia.

[00130] O termo "combinação sintética" significa uma pluralidade de elementos associados por esforço humano, em que a dita associação não é encontrada na natureza. Na presente invenção, "combinação sintética" é usada para se referir a uma formulação de tratamento associada a um elemento vegetal.

[00131] Uma "formulação de tratamento" refere-se a uma mistura de produtos químicos que facilita a estabilidade, armazenamento, e/ou aplicação da(s) composição(ões) de endófito. Em algumas modalidades, um veículo agricolamente compatível pode ser usado para formular uma formulação agrícola ou outra composição que inclui uma preparação de endófito purificada. Conforme usado no presente documento um "veículo agricolamente compatível" refere-se a qualquer material, exceto água, que pode ser adicionado a um elemento vegetal sem causar ou exercer um efeito adverso sobre o elemento vegetal (por exemplo, redução da germinação de semente) ou a planta que se desenvolve a partir do elemento vegetal, ou similares.

[00132] Em alguns casos, a presente invenção contempla o uso de composições que são "compatíveis" com produtos químicos agrícolas, por exemplo, um fungicida, um composto anticomplexo, ou qualquer outro agente amplamente usado na agricultura que tem o efeito de matar ou, de outro modo, interferir no crescimento ideal de outro organismo. Conforme usado no presente documento, uma composição é "compatível" com um produto químico agrícola quando o organismo é modificado, como por modificação genética, por exemplo, contém um transgene que confere resistência a um herbicida, ou é adaptado para se desenvolver em, ou de outro modo, sobreviver, a concentração do produto agrícola usado na agricultura. Por exemplo, um endófito disposto sobre a superfície de uma semente é compatível com o fungicida metalaxil se o mesmo for capaz de sobreviver às concentrações que são aplicadas sobre a superfície da semente.

[00133] Algumas composições descritas no presente documento contemplam o uso de um veículo agricolamente compatível. Conforme usado no presente documento um "veículo agricolamente compatível" tem por objetivo se referir a qualquer material, exceto água, que possa ser adicionado a uma semente ou uma muda sem causar/exercer um efeito adverso sobre a semente, a planta que se desenvolve a partir da semente, germinação de semente ou similares.

[00134] Uma "planta transgênica" inclui uma planta ou progênie de qualquer geração subsequente derivada da mesma, em que o DNA da planta ou progênie da mesma contém um segmento de DNA exógeno introduzido não naturalmente presente em uma planta não transgênica da mesma cepa. A planta transgênica pode conter adicionalmente sequências que são nativas da planta que está sendo transformada, porém em que o gene "exógeno" foi alterado para alterar o nível ou padrão de expressão do gene, por exemplo, pelo uso de um ou mais elementos reguladores heterólogos ou outros elementos.

[00135] Conforme usado no presente documento, um ácido nucleico tem "homologia" ou é "homólogo" a um segundo ácido nucleico se a sequência de ácidos nucleicos tiver uma sequência similar à segunda sequência de ácidos nucleicos. Os termos "identidade", "porcentagem de identidade de sequência" ou "idêntico" no contexto de sequências de ácidos nucleicos se referem aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para máxima correspondência. Há vários algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade de sequência de nucleotídeos. Por exemplo, as sequências de polinucleotídeo podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou Bestfit, que são programas em Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis. FASTA fornece alinhamentos e a porcentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa. Pearson, Methods Enzymol. 183:63 a 98 (1990). O termo "homologia substancial" ou "similaridade substancial", quando se refere a um ácido nucleico ou fragmento do mesmo, indica que, quando idealmente alinhado com inserções ou deleções de nucleotídeo adequadas com outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), há identidade de sequência de nucleotídeos em pelo menos cerca de 76%, 80%, 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases nucleotídicas, como medido por qualquer algoritmo bem conhecido de identidade de sequência, como FASTA, BLAST ou Gap, como discutido acima.

[00136] Conforme usado no presente documento, os termos "unidade taxonômica operacional", "OTU", "táxon", "agrupamento hierárquico", e "agrupamento" são usados de forma intercambiável. Uma unidade taxonômica operacional (OTU) refere-se a um grupo de um ou mais organismos que compreende um nó em uma árvore de agrupamento. O nível de um agrupamento é determinado por sua ordem hierárquica. Em uma modalidade, uma OTU é um grupo supostamente considerado um táxon válido para propósitos de análise filogenética. Em uma outra modalidade, uma OTU é qualquer uma das unidades taxonômicas existentes sob estudo. Em ainda outra modalidade, uma OTU recebe um nome e uma classificação. Por exemplo, uma OTU pode representar um domínio, um subdomínio, um reino, um sub-reino, um filo, um subfilo, uma classe, uma subclasse, uma ordem, uma subordem, uma família, uma subfamília, um gênero, um subgênero, ou uma espécie. Em algumas modalidades, as OTUs podem representar um ou mais organismos do reino eubacteria, protista, ou fungi em qualquer nível de uma ordem hierárquica. Em algumas modalidades, uma OTU representa uma ordem procariótica ou fúngica.

[00137] Os termos "reduzido", "menos", "mais lento" e "aumentado" "mais rápido" "acentuado" "mais" como usado no presente documento refere-se a uma redução ou aumento em uma característica da semente tratada com endófito ou planta resultante em comparação com uma semente não tratada ou planta resultante. Por exemplo, uma redução em uma característica pode ser pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou mais, inferior ao controle não tratado e um aumento pode ser pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou mais, superior ao controle não tratado.

[00138] A presente invenção é direcionada a métodos e composições de endófitos, e combinações de planta-endófito que conferem um benefício agronômico em plantas agrícolas.

Micróbios Endofíticos

[00139] Em parte, a presente invenção descreve preparações de endófitos inovadores derivados de sementes ou plantas, inclusive aqueles que são conservadas em diversas espécies e/ou cultivares de plantas agrícolas, e a criação de combinações sintéticas de sementes agrícolas e/ou mudas com endófitos heterólogos derivados de sementes ou plantas e formulações contendo as combinações sintéticas, bem como o reconhecimento que tais combinações sintéticas exibem uma diversidade de propriedades benéficas presentes nas plantas agrícolas e as populações de endófitos associadas recentemente criadas pelos presentes inventores. Tais propriedades benéficas incluem metabolismo, expressão de transcrição, alterações de proteoma, morfologia e a resiliência a uma variedade de estresses ambientais, e a combinação de uma pluralidade de tais propriedades.

[00140] Em um segundo aspecto, os inventores realizaram uma comparação sistemática das comunidades microbianas que residem dentro de variedades antigas e modernas estreitamente relacionadas de plantas agrícolas. A presente invenção se baseia nas diferenças marcantes da composição microbiana entre as variedades antigas e modernas, e a identificação de espécies bacterianas e fúngicas que estão ausentes ou vastamente sub-representadas em variedades modernas. Com isso, os micróbios endofíticos úteis para a invenção se refere genericamente a micróbios endofíticos que estão presentes em variedades antigas de plantas.

[00141] Atualmente, a visão geralmente aceita de comunidades endofíticas de plantas se concentra em sua derivação homóloga, predominantemente das comunidades de solo em que as plantas estão se desenvolvendo (Hallman, J., et al., (1997) Canadian Journal of Microbiology. 43(10): 895 a 914). Observando-se a sobreposição taxonômica entre a microbiota endofítica e do solo em A. thaliana, foi afirmado, "Our rigorous definition of an endophytic compartment microbiome should facilitate controlled dissection of plant-microbe interactions derived from complex soil communities" (Lundberg et al., (2012) Nature. 488, 86 a 90). Há um forte apoio na técnica de solo que representa o repositório a partir do qual os endófitos vegetais são derivados. New Phytologist (2010) 185: 554 a 567. Interações planta- micróbio notáveis como fungos micorrízicos e rizóbios bacterianos se ajustam ao paradigma de colonização baseada em solo de hospedeiros vegetais e parecem se estabelecer independentemente de semente. Como resultado de concentração da atenção na derivação de endófitos a partir do solo no qual a planta agrícola alvo está atualmente se desenvolvendo, tem havido uma incapacidade de alcançar melhorias comercialmente significativas em rendimentos de plantas e outras características de plantas como teor de óleo alterado, teor de proteína alterada, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, e composição de proteína de semente alterada, tolerância a produtos químicos, tolerância ao frio, senescência retardada, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da espiga, melhora do crescimento, melhora da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicida, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, arquitetura de raiz aprimorada, eficiência de uso de água aumentada, biomassa aumentada, comprimento de raiz aumentado, peso de semente aumentado, comprimento de broto aumentado, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições limitadas de água, massa de núcleo, teor de umidade de núcleo, tolerância a metal, número de espigas, número de núcleos por espiga, número de vagens, melhora da nutrição, resistência a patógenos, resistência a pragas, melhora da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, stay-green, melhora de vigor, peso seco aumentado de sementes maduras, peso fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta, teor de clorofila aumentado, número de vagens por planta aumentado, comprimento de vagens por planta aumentado, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta, e número aumentado de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de uma transcrição, ou uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência.

[00142] Pouca atenção tem sido dada na técnica para compreender a função de sementes como reservatórios de micróbios que podem ocupar eficientemente a endosfera de plantas agrícolas. Embora o conceito que as sementes podem abrigar patógenos vegetais seja promovido por Baker e Smith (Annu Rev Phytopathol 14: 311 a 334(1966)), e a compreensão que patógenos bacterianos e fúngicos são conhecidos por serem capazes de infectar a semente, a capacidade de aproveitar os endófitos derivados de um amplo espectro de sementes para conferir de forma heteróloga vantagens únicas ou múltiplas a culturas agrícolas era anteriormente não reconhecida. Visto que a presença de patógenos detectáveis em um lote de sementes pode necessitar de destruição de um grande número de germoplasma agrícola (Gitaitis, R. and Walcott, R. (2007) Annu. Rev. Phytopathol. 45:371 a 97), preocupações com a segurança abrangeram a consideração de micróbios associados a sementes ou endófitos não solo. Além disso, quando patógenos de semente são detectados, sua transferência para a planta em desenvolvimento pode ser altamente ineficiente. Por exemplo, um estudo de transmissão baseada em semente do patógeno de semente, Pantoea stewartii, constatou que a semente produzida a partir de uma população de plantas infectadas por patógenos deu origem a mudas infectadas em apenas 0,0029% dos casos (1 de 34.924 plantas) e núcleos artificialmente infectados deram origem a mudas infectadas em 0,022% dos casos (Block, C. C., el al., (1998). Plant disease. 82(7). 775 a 780). Dessa forma, a eficiência com a qual as plantas introduzem micróbios em suas sementes, e com a qual os micróbios dentro das sementes se propagam dentro dos tecidos vegetais resultantes, foi anteriormente considerada baixa e muitas vezes substancialmente variável. Dessa forma, o potencial de teor microbiano dentro das sementes para ocupar a planta resultante tem sido pouco claro.

[00143] O potencial para sementes agrícolas servirem como reservatórios para micróbios não patogênicos também permanece controverso (Hallman, J., et al., (1997) Canadian Journal of Microbiology. 43(10): 895 a 914). Sato, et al., não detectaram quaisquer bactérias dentro de sementes de arroz ((2003) In. Morishima, H. (ed.) The Natural History of Wild Rice - Evolution Ecology of Crop. p.91-106) e Mundt e Hinkle obtiveram apenas endófitos de amostras de semente em que as cascas de sementes foram quebradas ou fraturadas em 29 tipos de sementes de plantas (Appl Environ Microbiol. (1976) 32(5):694 a 8). Outro grupo detectou simplesmente populações bacterianas dentro de sementes de arroz que se situam na faixa de tamanho de população de 10A2 a 10A6 CFU/g de peso fresco (Okunishi, S., et al., (2005) Microbes and Environment. 20:168 a 177). Rosenblueth et al descreveram sementes para abrigar comunidades microbianas muito simples com variabilidade significativa das comunidades microbianas entre sementes de milho individuais, incluindo variabilidade substancial entre sementes retiradas da mesma espiga (Rosenblueth, M. et al, Seed Bacterial Endophytes: Common Genera, Seed-to-Seed Variability and Their Possible Role in Plants; Proc. XXVIIIth IHC - IS on Envtl., Edaphic & Gen. Factors; Affecting Plants, Seeds and Turf; Eds.: G.E. Welbaum et al. Acta Hort. 938, ISHS 2012).

[00144] Essas constatações demonstram limitações reconhecidas na técnica referentes à tentativa de uso de endófitos derivados de sementes; isto é, as sementes de milho parecem conter diversidade taxonômica limitada, e que a microbiota de sementes individuais produzidas por plantas muitas vezes é distinta, indicando que pode não haver simbiontes simples derivados de sementes ou plantas capazes de proporcionar benefícios em uma grande população de plantas agrícolas e especificamente, na utilização de endófitos em semente. Por exemplo, a caracterização de ~15 sementes agrupadas de dentro de vários cultivares do gênero Zea mostrou que populações de sementes de milho tendem a abrigar um número muito limitado de táxons que parecem ser conservados em variantes modernas e antigas, e que o teor de semente de milho de tais táxons é baixo e substancialmente variável. Não está claro se a presença de tais táxons limitados resultou de condições de armazenamento comuns, contaminação ambiental, ou uma potencial transmissão vertical de micróbios através de sementes, e também era incerta a aplicabilidade de tais táxons limitados para aumentar o rendimento agrícola. Particularmente, 99% dessas cepas se revelaram prejudiciais ou não têm efeito benéfico sobre plantas agrícolas, por exemplo, quando testadas em um ensaio de crescimento de batata (Johnston-Monje D, Raizada MN (2011) Conservation and Diversity of Seed Associated Endophytes in Zea across Boundaries of Evolution, Ethnography and Ecology. PLoS ONE 6(6): e20396. doi:10.1371/journal.pone.0020396). Adicionalmente, alguns micróbios isolados têm relação evolutiva próxima a patógenos vegetais, tornando possível que tais micróbios representem um reservatório latente de patógenos, em vez de constituintes potencialmente benéficos.

[00145] Constatou-se no presente documento que endófitos derivados de sementes ou plantas podem conferir vantagens significativas a culturas agrícolas, estendendo o crescimento sob condições normais e de estresse, expressão alterada de hormônios vegetais essenciais, expressão alterada de transcrições essenciais na planta, e outras características desejadas. São fornecidas composições, métodos e produtos inovadores relacionados à capacidade de a presente invenção superar as limitações da técnica anterior para fornecer aumentos confiáveis em rendimento de cultura, biomassa, germinação, vigor, resiliência ao estresse, e outras propriedades a culturas agrícolas.

[00146] A presente invenção é surpreendente por vários motivos com base nas demonstrações anteriores na técnica. Particularmente, há uma falta de clareza relacionada à possibilidade de os endófitos serem associados a sementes saudáveis, à possibilidade de os micróbios isolados de sementes colonizarem eficazmente o hospedeiro se o mesmo estiver disposto no exterior de uma semente ou muda, e à possibilidade de tais micróbios conferirem um efeito benéfico ou prejudicial sobre os hospedeiros. Ainda está pouco claro se a aplicação heteróloga de tais micróbios a sementes distintas das quais os mesmos foram derivados poderia proporcionar efeitos benéficos.

[00147] Constatou-se que os micróbios benéficos podem ser fortemente derivados de sementes agrícolas, opcionalmente cultivados, administrados de forma heteróloga a sementes agrícolas ou mudas, e colonizam os tecidos vegetais resultantes com alta eficiência para conferir múltiplas propriedades benéficas. Isto é surpreendente dada a variabilidade observada na técnica em isolamento de micróbios de sementes saudáveis e as observações anteriores de colonização ineficiente de patógenos de semente de tecidos do hospedeiro da planta. Adicionalmente, a capacidade de os endófitos derivados de sementes ou plantas dispostos de forma heteróloga colonizarem sementes e mudas a partir do exterior de sementes é surpreendente, dado que tais endófitos podem ser isolados de dentro de tecidos de semente internos e, portanto, não precisam nativamente da capacidade de penetrar e invadir externamente os tecidos hospedeiros.

[00148] A caracterização anterior de teor microbiano de sementes indicou que as concentrações microbianas em sementes podem ser variáveis e são, em geral, muito baixas (isto é, menores que 10, 100, 10A3, 10A4, 10A5 CFUs/semente). Com isso, não está claro se as concentrações alteradas ou aumentadas associadas a sementes poderiam ser benéficas. Constatou-se que os micróbios podem conferir propriedades benéficas em uma gama de concentrações.

[00149] Constatou-se que os endófitos derivados de sementes ou plantas podem estar dispostos de modo heterólogo sobre as mudas de um cultivar, espécie, ou tipo de cultura diferente e conferir benefícios a esses novos receptores. Por exemplo, os endófitos derivados de sementes ou plantas de cultivares de milho são fornecidos de modo heterólogo a cultivares de trigo para conferir um benefício. Isso é surpreendente tendo em conta as observações de preferências de microbioma diferentes em hospedeiros vegetais e de mamíferos diferentes e, em particular, a probabilidade que os micróbios derivados de sementes foram co-evoluídos para serem especializados para um hospedeiro específico.

[00150] Conforme usado no presente documento, os endófitos podem ser isolados de sementes de muitas plantas diferentes. Em uma modalidade, o endófito pode ser isolado da semente da mesma cultura, e pode pertencer ao mesmo cultivar ou variedade que a semente sobre a qual o mesmo será revestido. Por exemplo, os endófitos de semente de uma variedade de milho particular podem ser isolados e revestidos sobre a superfície de uma semente de milho da mesma variedade. Em uma modalidade específica, a semente da primeira planta que será revestida com o endófito pode compreender uma quantidade detectável do mesmo endófito no interior da semente. Em uma outra modalidade, a semente da primeira planta que será revestida com o endófito pode compreender uma quantidade detectável do mesmo endófito no exterior da semente. Por exemplo, uma semente de referência não-revestida pode conter uma quantidade detectável do mesmo endófito dentro de sua semente. Em ainda outra modalidade, o endófito que será revestido sobre a semente da planta é um micróbio que está detectavelmente presente no interior e exterior da semente a partir da qual o endófito é derivado.

[00151] Em uma outra modalidade, o endófito pode ser isolado de uma espécie relacionada (por exemplo, um endófito isolado de Triticum monococcum (trigo einkorn) pode ser revestido sobre a superfície de uma semente de T. aestivum (trigo comum); ou um endófito de Hordeum vulgare (cevada) pode ser isolado e revestido sobre a semente de outro membro da família Triticeae, por exemplo, sementes da planta de centeio, Secale cereale). Em ainda outra modalidade, o endófito pode ser isolado da semente de uma planta que está distantemente relacionada à semente sobre a qual o endófito será revestido. Por exemplo, um endófito derivado de tomate e revestido sobre uma semente de arroz.

[00152] Em uma modalidade, o endófito é um micróbio endofítico que foi isolado de uma planta diferente da planta inoculada. Por exemplo, em uma modalidade, o endófito pode ser um endófito isolado de uma planta diferente da mesma espécie que a planta inoculada. Em alguns casos, o endófito pode ser isolado de uma espécie relacionada à planta inoculada.

[00153] Constatou-se ainda que as combinações de endófitos derivados de sementes ou plantas dispostos de modo heterólogo conferem vantagens adicionais a plantas, incluindo múltiplas propriedades funcionais e resultando em semente, muda e hospedeiros de plantas que exibem propriedades agronômicas aprimoradas únicas ou múltiplas.

[00154] Em uma outra modalidade, o micróbio endofítico está ausente em uma semente de uma variedade moderna de uma planta. Ainda em uma outra modalidade, o micróbio endofítico é detectável- mente sob-representado na semente de uma variedade moderna de uma planta quando comparado com uma variedade antiga relacionada.

[00155] De acordo com a presente invenção, o micróbio endofítico pode ser uma bactéria. Em algumas modalidades da presente invenção, o endófito é um membro de um dos seguintes táxons: Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Acidovoraz, Acinetobacter, Actinoplanes, Adlercreutzia, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agromyces, Ancylobacter, Arthrobacter, Atopostipes, Azospirillum, Bacillus, Bdellovibrio, Beijerinckia, Bosea, Bradyrhizobium, Brevibacillus, Brevundimonas, Burkholderia, Candidatus Haloredivivus, Caulobacter, Cellulomonas, Cellvibrio, Chryseobacterium, Citrobacter, Clostridium, Coraliomargarita, Corynebacterium, Cupriavidus, Curtobacterium, Curvibacter, Deinococcus, Delftia, Desemzia, Devosia, Dokdonella, Dyella, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Escherichia/Shigella, Exiguobacterium, Ferroglobus, Filimonas, Finegoldia, Flavisolibacter, Flavobacterium, Frigoribacterium, Gluconacetobacter, Hafnia, Halobaculum, Halomonas, Halosimplex, Herbaspirillum, Hymenobacter, Klebsiella, Kocuria, Kosakonia, Lactobacillus, Leclercia, Lentzea, Luteibacter, Luteimonas, Massilia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Microvirga, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Oceanibaculum, Ochrobactrum, Okibacterium, Oligotropha, Oryzihumus, Oxalophagus, Paenibacillus, Panteoa, Pantoea, Pelomonas, Perlucidibaca, Plantibacter, Polynucleobacter, Propionibacterium, Propioniciclava, Pseudoclavibacter, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoxan- thomonas, Psychrobacter, Ralstonia, Rheinheimera, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Roseateles, Ruminococcus, Sebaldella, Sediminibacillus, Sediminibacterium, Serratia, Shigella, Shinella, Sinorhizobium, Sinosporangium, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Sphingosinicella, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Strenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Stygiolobus, Sulfurisphaera, Tatumella, Tepidimonas, Thermomonas, Thiobacillus, Variovorax, WPS-2_genera_incertae_sedis, Xanthomonas, Zimmermannella.

[00156] Em uma modalidade, a bactéria endofítica é de uma família selecionada a partir do grupo que consiste em: Bacillaceae, Burkhol- deriaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudo- monnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae.

[00157] Em uma modalidade, a bactéria endofítica é de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacte- rium, Enterobacter, Escherichia, Methylobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas e Stenotrophomonas.

[00158] Em uma modalidade, a bactéria endofítica que compreende em seu genoma uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ IDNOs:3588, 3589, 3590, 3591, 3592, 3593, 3594, 3595, 3596, 3598, 3599, 3600, 3601, 3603, 3604, 3606, 3607, 3608, 3609, 3619, 3620, 3621, 3622, 3623, 3624, 3625, 3626, 3627, 3628, 3629, 3630, 3631, 3632, 3633, 3634, 3635, 3636, 3637, 3638, 3639, 3641, 3645, 3646, 3648, 3649, 3651, 3652, 3653, 3656, 3663, 3664, 3665, 3666, 3667, 3668, 3669, 3670, 3671.

[00159] Em uma modalidade, a bactéria endofítica compreende em seu genoma uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99.5% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 3588, 3589, 3590, 3591, 3592, 3593, 3594, 3595, 3596, 3598, 3599, 3600, 3601, 3603, 3604, 3606, 3607, 3608, 3609, 3619, 3620, 3621, 3622, 3623, 3624, 3625, 3626, 3627, 3628, 3629, 3630, 3631, 3632, 3633, 3634, 3635, 3636, 3637, 3638, 3639, 3641, 3645, 3646, 3648, 3649, 3651, 3652, 3653, 3656, 3663, 3664, 3665, 3666, 3667, 3668, 3669, 3670, 3671.

[00160] Em uma outra modalidade, o micróbio endofítico é um fungo. Em algumas modalidades da presente invenção, o endófito é um membro de um dos seguintes táxons: Acidomyces acidophilus, Acremonium alternatum, Acremonium pteridii, Acremonium strictum, Acrodictys elaeidicola, Acrostalagmus luteoalbus, Albatrellus higanensis, Albonectria rigidiuscula, Alternaria alternata, Alternaria arborescens, Alternaria conjuncta, Alternaria helianthi, Alternaria longipes, Alternaria malorum, Alternaria metachromatica, Alternaria oregonensis, Alternaria photistica, Alternaria protenta, Alternaria tenuissima, Alternaria triticina, Alternaria zinniae, Amorphotheca resinae, Ampelomyces humuli, Anthostomella proteae, Apiognomonia errabunda, Aposphaeria populina, Arthrinium sacchari, Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Aspergillus versicolor, Athelia bombacina, Aureobasidium pullulans, Bartalinia laurinia, Bartalinia pondoensis, Bartalinia robillardoides, Beauveria bassiana, Bionectria ochroleuca, Bipolaris papendorfii, Boeremia exigua var. exigua, Botryosphaeria rhodina, Botrytis cinerea, Brachysporium nigrum, Cadophora (Phialophora) finlandica, Camarosporium palliatum, Camarosporium propinquum, Candida tropicalis, Capnodium coffeae, Ceratobasidium cornigerum, Ceratobasidium obscurum, Cercophora terricola, Chaetomium globosum, Chaetomium sphaerale, Chaetosphaeria endophytica, Chaetosphaeria ovoidea, Chaunopycnis alba, Chaunopycnis pustulata, Chloridium phaeosporum, Chloridium preussii, Chromelosporium fulvum, Cladorrhinum bulbillosum, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium edgeworthrae, Cladosporium herbarum, Cladosporium orchidis, Cladosporium oxysporum, Cladosporium tenuissimum, Clonostachys rosea, Clonostachys rosea f. catenulate, Cochliobolus australiensis, Cochliobolus geniculatus, Cochliobolus hawaiiensis, Cochliobolus lunatus, Cochliobolus tuberculatus, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum capsici, Colletotrichum crassipes, Colletotrichum dematium, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum magna, Colletotrichum musae, Colletotrichum orbiculare, Colletotrichum truncatum, Coniella minima, Coniochaeta tetraspora, Coniochaeta velutina, Coniophora puteana, Coprinellus disseminates, Coprinellys radians, Cordyceps sinensis, Corynascus kuwaitiensis, Corynespora cassiicola, Crinipellis roreri, Cryphonectria parasitica, Cryptococcus victoriae, Curvularia affinis, Curvularia oryzae, Curvularia senegalensis, Curvularia sichuanensis, Cytosphaera mangiferae, Cytospora eucalypticola, Daldinia eschscholzi., Davidiella tassiana, Debaryomyces hansenii, Deightoniella torulosa, Diaporthe cynaroidis, Diaporthe eres, Diaporthe helianthi, Diaporthe phaseolorum, Dictyochaeta triseptata, Dothiorella aromatica, Dothiorella dominicana, Drechslera ellisii, Elsinoe veneta, Embellisia eureka, Emericella nidulans, Engyodontium album, Epicoccum nigrum, Epulorhiza anaticula, Epulorhiza repens, Eurotium amstelodami, Exserohilum rostratum, Fasciatispora petrakii, Fimetariella rabenhorstii, Fomes fomentarius, Fomes fomentarius, Fomitopsis ostreiformis, Fomitopsis pinicola, Fusarium anthophilum, Fusarium aquaeductuum, Fusarium avenaceum, Fusarium bulbicola, Fusarium chlamydosporum, Fusarium culmorum, Fusarium equiseti, Fusarium incarnatum, Fusarium lichenicola, Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporum, Fusarium poae, Fusarium polyphialidicum, Fusarium proliferatum, Fusarium pulverosum, Fusarium semitectum var. majus, Fusarium solani, Fusarium sporotrichioides, Fusarium tricinctum, Fusarium verticillioides, Fusicladium britannicum, Ganoderma tsugae, Geomyces vinaceus, Gibberella avenacea, Gibberella baccata, Gibberella fujikuroi, Gibberella moniliformis, Gibberella zeae, Gliomastix murorum, Glomerella cingulata, Glomerella cingulate, Guignardi bidwelli, Guignardia camelliae, Guignardia citricarpa, Guignardia cocoicola, Guignardia mangiferae, Guignardia manqiferae, Guignardia vaccinii, Haematonectria haematococca, Haplotrichum minitissimum, Helgardia anguioides, Helminthosporium chlorophorae, Hypocrea virens, Hypoxylon fragiforme, Hypoxylon serpens, Hypoxylon stygium, Idriella amazonica, Idriella asaicola, Idriella euterpes, Idriella licualae, Ilyonectria radicicola, Kabatiella caulivora, Kluyveromyces marxianus, Kretzschmaria deusta, Lasiodiplodia pseudotheobromae, Lasiodiplodia theobromae, Laspora coronate, Leiosphaerella cocoes, Lentinus squarrosulus, Lepteutypa cupressi, Leptosphaeria coniothyrium, Leptosphaerulina trifolii, Letendraeopsis palmarum, Leucostoma niveum, Lewia eureka, Lewia eureka, Lunulospora curvula, Macrophomina phaseolina, Malbranchea circinata, Massarina arundinariae, Melanospora zamiae, Melanotus subcuneiformis, Melanotus subcuneiformis, Microascus cinereus, Minimidochium setosum, Moniliopsis anomala, Monodictys levis, Morchella elata, Mortierella alpine, Mucor fragilis, Mucor racemosus, Muscodor albus, Mycena murina, Mycocentrospora acerina, Myriangium duriaei, Nectria haematococca, Nemania aenea, Nemania bipapillata, Nemania serpens, Neofusicoccum mangiferae, Neotyphodium lolii, Neurospora crassa, Nigrospora oryzae, Nigrospora sphaerica, Nodulisporium anamorph of Hypoxylon fragiforme, Nodulisporium anamorph of Hypoxylon fuscum, Nodulisporium gregarium, Ochrocladosporium elatum, Ophiocordyceps sobolifera, Ophiostoma stenoceras, Oxydothis poliothea, Paecilomyces formosus, Papulosa amerospora, Paraconiothyrium minitans, Paraphaeosphaeria quadriseptata, Penicillium biourgeianum, Penicillium brevicompactum, Peniophora cinerea, Periconia anamorph of Didymosphaeria igniaria, Periconia digitata, Periconia hispidula, Periconia prolifica, Pestalotiopsis adusta, Pestalotiopsis caudata, Pestalotiopsis guepinii, Pestalotiopsis maculiformans, Pestalotiopsis microspora, Pestalotiopsis palmarum, Pestalotiopsis versicolor, Petriella sordida, Peziza varia, Peziza vesiculosa, Phaeangium lefebvrei, Phaedothis winteri, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeotrichoconis crotalariae, Phanerochaete affinis, Phanerochaete sordida, Phialemonium dimorphosporum, Phlebia radiate, Phlogicylindrium eucalypti, Phoma glomerata, Phoma herbarum, Phoma leveillei, Phoma moricola, Phoma radicina, Phoma sorghina, Phoma subglomerata, Phoma tracheiphila, Phoma tropica, Phomatospora bellaminuta, Phomatospora berkeleyi, Phomopsis anacardii, Phomopsis casuarinae, Phomopsis leptostromiformis, Phomopsis mangiferae, Phomopsis manilkarae, Phomopsis orchidophila, Phyllosticta capitalensis, Phyllosticta colocasiicola, Phyllosticta minima, Phyllosticta sapotae, Piptarthron macrosporum, Piricauda pelagica, Piriformospora indica, Plagiostoma euphorbiae, Plenodomus fuscomaculans, Pleurophoma cava, Pleurotus ostreatus, Podospora fimbriata, Porosphaerella borinquensis, Preussia mediterranea, Preussia minima, Pseudocercospora punicae, Pseudocochliobolus pallescens, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus, Pyriculariopsis parasitica, Ramichloridium apiculatum, Ramichloridium biverticillatum, Rhizopus stolonifer, Rhizopycnis vagum, Rhizosphaera kalkhoffii, Rhodotorula minuta, Schizophyllum commune, Scolecobasidium terreum, Scolicotrichum musae, Scopuloides hydnoides, Scytalidium lignicola, Sebacina vermifera, Septoria anacardii, Setosphaeria rostrata, Sordaria fimicola, Sordaria tomento- alba, Sporormiella minima, Stagonosporopsis dorenboschii, Stemphylium botryosum, Stemphylium solani, Stilbohypoxylon quisquiliarum var. quisquiliarum, Streptomyces albosporus, Streptomyces aureus, Streptomyces cinereus, Streptomyces glaucus, Streptomyces globisporus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces griseorubroviolaceus, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces roseosporus, Sydowia polyspora, Talaromyces flavus, Talaromyces ohiensis, Talaromyces ohiensis, Tetracladium furcatum, Thanatephorus cucumeris, Thanatephorus pennatus, Thermomyces lanuginosus, Thumenella cubispora, Torula herbarum f. quaternella, Trametes hirsuta, Trematosphaeria pertusa, Trichoderma hamatum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichothecium roseum, Triscelophorus acuminatus, Triscelophorus konajensis, Triscelophorus monosporus, Truncatella angustata, Truncatella conorum-piceae, Tulasnella calospora, Ulocladium atrum, Ulocladium cucurbitae, Ustilago williamsii, Valsa ceratosperma, Verruculina enalia, Verticillium lecanii, Wiesneriomyces laurinus, Wrightoporia tropicalis, Xylaria acuta, Xylaria adscendens, Xylaria allantoidea, Xylaria anisopleura, Xylaria arbuscula, Xylaria castorea Berk., Xylaria coccophora, Xylaria cubensis, Xylaria curta, Xylaria hypoxylon, Xylaria microceras, Xylaria multiplex, Xylaria obovata, Xylaria palmicola, Xylaria telfairii, Zalerion maritimum, Zygosporium echinosporum, Zygosporium gibbum.

[00161] Em uma modalidade, o fundo endofítico é de uma família selecionada a partir do grupo que consiste em: Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae, Pleosporaceae.

[00162] Em uma modalidade, o fungo endofítico é de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em: Acremonium, Alternaria, Cladosporium, Cochliobolus, Embellisia, Epicoccum, Fusarium, Nigrospora, Phoma, e Podospora. Em algumas modalidades, o fungo endofítico é da espécie Acremonium strictum, Acremonium zeae, Alternaria alternata, Alternaria epidermidis, Alternaria infectoria, Alternaria tenuissima, Cladosporium tenuissimum, Epicoccum nigrum, Epicoccum sorghinum, Fusarium nigrum, Fusarium udum, Fusarium verticillioides, e Nigrospora oryza.

[00163] Em uma modalidade, a bactéria endofítica que compreende em seu genoma uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ IDNOs:3597, 3602, 3605, 3610, 3611, 3612, 3613, 3614, 3615, 3616, 3617, 3618, 3640, 3642, 3643, 3644, 3647, 3650, 3654, 3655, 3657, 3658, 3659, 3660, 3661, 3662, 3672, 3673, 3674, 3675, 3676, 3677, 3678, 3679, 3680, 3681, 3682, 3683, 3684, 3685, 3686, 3687, 3688, 3689, 3690, 3691, 3692, 3693, 3694, 3695, 3696, 3697, 3698, 3699, 3700.

[00164] Em uma modalidade, o fundo endofítico compreende em seu genoma uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99.5% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 3597, 3602, 3605, 3610, 3611, 3612, 3613, 3614, 3615, 3616, 3617, 3618, 3640, 3642, 3643, 3644, 3647, 3650, 3654, 3655, 3657, 3658, 3659, 3660, 3661, 3662, 3672, 3673, 3674, 3675, 3676, 3677, 3678, 3679, 3680, 3681, 3682, 3683, 3684, 3685, 3686, 3687, 3688, 3689, 3690, 3691, 3692, 3693, 3694, 3695, 3696, 3697, 3698, 3699, 3700.

[00165] Em uma modalidade, o endófito compreende em seu genoma uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idêntica, por exemplo, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99.5% idêntica ou 100% idêntica, a uma sequência de ácidos nucleicos encontrada entre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 3700.

[00166] Em alguns aspectos, o endófito de qualquer método ou composição da presente invenção compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idêntica, por exemplo, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99.5% idêntica ou 100% idêntica a qualquer ácido nucleico fornecido nas Tabelas 1 a 10 e 12 a 19.

[00167] Endófitos Exógenos. Em uma modalidade, o endófito é um micróbio endofítico que foi isolado de uma planta diferente da planta inoculada. Por exemplo, em uma modalidade, o endófito pode ser um endófito isolado de uma planta diferente da mesma espécie que a planta inoculada. Em alguns casos, o endófito pode ser isolado de uma espécie relacionada à planta inoculada.

[00168] A reprodução de plantas para agricultura, sua propagação em ambientes alterados, bem como práticas culturais usadas para combater patógenos microbianos, podem resultar na perda em cultivares modernos dos endófitos presentes em seus ancestrais selvagems, ou tais práticas podem promover de modo inadvertido outras interações planta-endófito inovadoras ou raras, ou, de outro modo, alterar a população microbiana. O primeiro é o caso em milho e seu ancestral selvagem direto filogeneticamente confirmado, Parviglumis teosinte (Zea mays ssp. Parviglumis). É possível que essa maior diversidade e título de endófitos no ancestral esteja correlacionada a uma gama igualmente ampla de respostas fisiológicas derivadas da simbiose que permite que a planta se adapte melhor ao ambiente e tolere o estresse. Para sobrevivência, os grupos de plantas de endófitos potencialmente úteis, sementes de seus ancestrais, ancestrais selvagens, primitivos locais, locais modernos, linhagens reprodutivas modernas, e variedades agronômicas modernas elite podem ser podem ser testados quanto a endófitos microbianos por métodos de cultura e independentes de cultura conforme descrito no presente documento.

[00169] Em alguns casos, as plantas são inoculadas com endófitos que são exógenos à semente da planta inoculada. Em uma modalidade, o endófito é derivado de uma planta de outra espécie. Por exemplo, um endófito que é normalmente encontrado em dicotiledôneas é aplicado a uma planta monocotiledônea (por exemplo, inoculação de milho com um endófito derivado de soja), ou vice-versa. Em outros casos, o endófito que será inoculado em uma planta pode ser derivado de uma espécie relacionada da planta que está sendo inoculada. Em uma modalidade, o endófito pode ser derivado de um táxon relacionado, por exemplo, de uma espécie relacionada. A planta de outras espécies pode ser uma planta agrícola. Por exemplo, um endófito derivado de Hordeum irregulare pode ser usado para inocular uma planta Hordeum vulgare L. Alternativamente, o mesmo pode ser derivado de uma planta ‘selvagem' (isto é, uma planta não agrícola). Por exemplo, os endófitos normalmente associados ao algodão selvagem Gossypium klotzschianum podem ser usados para inocular variedades comerciais de plantas Gossypium hirsutum. Como um exemplo alternativo de derivar um endófito de uma planta ‘selvagem', bactérias endofíticas isoladas da orquídea da selva do sudeste asiático, Cymbidium eburneum, pode ser isolado e testado quanto à sua capacidade de beneficiar o desenvolvimento de muda e sobrevivência de culturas agrícolas como trigo, milho, soja e outros [Faria, D.C., et al., (2013) World Journal of Microbiology and Biotechnology. 29(2). pp. 217-221]. Em outros casos, o endófito pode ser isolado de uma espécie antiga da planta inoculada. Por exemplo, um endófito derivado de Zea diploperennis pode ser usado para inocular uma variedade comercial de milho moderno, ou Zea mays.

[00170] Relocalização de Endófitos. Embora o endófito que é revestido sobre a superfície da semente da primeira planta seja isolado de dentro da semente da segunda planta, o endófito pode ser re- localizado em outros tecidos ou partes da planta uma vez que a semente da primeira planta germina. Com isso, em uma modalidade, o endófito de semente que é revestido sobre a semente de uma planta é capaz, mediante a germinação da semente em um estado vegetativo, de ser localizado em um tecido diferente da planta. Por exemplo, o endófito pode ser capaz de ser localizado em qualquer um dos tecidos na planta, incluindo: a raiz, raiz adventícia, raiz seminal, pelo radicular, broto, folha, flor, botão, Borla, meristema, pólen, pistilo, ovário, estame, fruto, estolho, rizoma, nódulo, tubérculo, tricomas, células de guarda, hidatódio, pétala, sépala, gluma, ráquis, câmbio vascular, floema e xilema. Em uma modalidade, o endófito é capaz de ser localizado na raiz e/ou no pelo radicular da planta. Em uma outra modalidade, o endófito é capaz de ser localizado nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta. Em outros casos, o endófito fica localizado nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e floema. Ainda em uma outra modalidade, o endófito é capaz de ser localizado nos tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame, fruta) da planta. Em uma outra modalidade, o endófito é capaz de ser localizado na raiz, brotos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Ainda em uma outra modalidade, o endófito coloniza um fruto ou tecido da semente da planta. Ainda em uma outra modalidade, o endófito é capaz de colonizar a planta de modo que esteja presente na superfície da planta (isto é, sua presença está detectavelmente presente no exterior da planta, ou na episfera da planta). Ainda em outras modalidades, o endófito é capaz de ser localizado em substancialmente todos, ou todos, os tecidos da planta. Em certas modalidades, o endófito não fica localizado na raiz de uma planta. Em outros casos, o endófito não fica localizado nos tecidos fotossintéticos da planta.

Composições que compreendem endófitos

[00171] Em algumas modalidades, endófito é capaz de metabolizar D-alanina, ácido D-aspártico, D-serina, D-treonina, ácido glicil-L- aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L- aspártico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L- treonina, tiramina, uridina, prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico e salicina. Em uma modalidade, o endófito compreende em seu genoma uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína que permite que o mesmo metabolize arabinose. Em uma modalidade, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°: 3701 a 3813.

[00172] Em algumas modalidades, a planta ou elemento vegetal experimenta uma capacidade aprimorada de se desenvolver em condições hídricas limitadas, como resultado de estar associado ao endófito ou combinações de endófitos.

[00173] Ainda em uma outra modalidade, o elemento vegetal da primeira planta pode ser de uma planta geneticamente modificada. Em uma outra modalidade, o elemento vegetal da primeira planta pode ser de um elemento vegetal híbrido.

[00174] A combinação sintética pode compreender um elemento vegetal da primeira planta que é submetida à esterilização de superfície antes da combinação com os endófitos.

[00175] Conforme declarado acima, o endófito usado na combinação sintética é derivado de um elemento vegetal de uma segunda planta. Em uma modalidade, a segunda planta é uma planta monocotiledônea ou tecido da mesma. Em uma modalidade específica, a segunda planta é uma planta de cereais ou tecido da mesma. Em ainda outra modalidade, a segunda planta é selecionada a partir do grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de cevada, uma planta de trigo, uma planta de cana-de-açúcar ou uma planta de arroz. Em uma modalidade, o elemento vegetal é um grão nu (isto é, sem cascas). Em uma modalidade alternativa, a segunda planta é uma planta dicotiledônea. Por exemplo, a segunda planta pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma planta de algodão, uma planta de tomate, uma planta de pimenta, ou uma planta de soja.

[00176] A combinação sintética pode compreender, adicionalmente, uma composição de revestimento de semente, um tratamento de raiz, ou uma composição de aplicação foliar. A composição de revestimento de semente, ou o tratamento de raiz, ou a composição de aplicação foliar pode compreender um agente selecionado a partir do grupo que consiste em: um fungicida, um agente bactericida, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento vegetal, um rodenticida e um nutriente, ou uma combinação dos mesmos. A composição de revestimento de semente, ou o tratamento de raiz, ou a composição de aplicação foliar pode compreender adicionalmente um agente selecionado a partir do grupo que consiste em um veículo agricolamente aceitável, um acentuador de pegajosidade, um estabilizante microbiano, ou uma combinação dos mesmos. Ainda em uma outra modalidade, a composição de revestimento de semente, ou o tratamento de raiz, ou a composição de aplicação foliar pode conter uma segunda preparação microbiana, incluindo, mas não se limitando a, preparação bacteriana rizobial.

[00177] A presente invenção contempla o uso de endófitos que são não modificados, bem como aqueles que são modificados. Em uma modalidade, o endófito é um endófito recombinante. Em uma modalidade específica, o endófito é modificado antes do revestimento sobre a superfície do elemento vegetal de modo que o mesmo tenha compatibilidade aumentada com um agente antimicrobiano quando comparado com aquele não modificado. Por exemplo, o endófito pode ser modificado de modo que o mesmo tenha compatibilidade aumentada com um agente antibacteriano. Em uma modalidade alternativa, o endófito tem compatibilidade aumentada com um agente antifúngico. O endófito pode ser modificado de modo que o mesmo exiba pelo menos 3 vezes mais, por exemplo, pelo menos 5 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, pelo menos 30 vezes mais ou mais resistência a um agente antimicrobiano quando comparado com o endófito não modificado.

[00178] A presente invenção também contempla o uso de múltiplos endófitos. Por exemplo, em uma modalidade, a combinação sintética descrita acima pode compreender uma pluralidade de endófitos purificados, por exemplo, 2, 3, 4 ou mais tipos diferentes de endófitos.

[00179] Em uma modalidade, a formulação compreende um endófito que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 97% idêntica, por exemplo, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99.5% idêntica, ou 100% idêntica, a qualquer ácido nucleico selecionado dentre SEQ ID NOs: 1 a 3700.

[00180] Em uma modalidade, a formulação compreende pelo menos duas entidades microbianas endofíticas que compreendem separadamente uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 97% idêntica, por exemplo, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99,5% idêntica, ou 100% idêntica, a qualquer ácido nucleico selecionado dentre SEQ ID NOs: 1 a 3700.

[00181] Em uma modalidade, o traço agronômico é selecionado a partir do grupo que consiste em teor de óleo alterado, teor de proteína alterada, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, e composição de proteína de semente alterada, tolerância a produtos químicos, tolerância ao frio, senescência retardada, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da espiga, melhora do crescimento, melhora da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicida, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, arquitetura de raiz aprimorada, eficiência de uso de água aumentada, biomassa aumentada, comprimento de raiz aumentado, peso de semente aumentado, comprimento de broto aumentado, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições limitadas de água, massa de núcleo, teor de umidade de núcleo, tolerância a metal, número de espigas, número de núcleos por espiga, número de vagens, melhora da nutrição, resistência a patógenos, resistência a pragas, melhora da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, staygreen, melhora de vigor, peso seco aumentado de sementes maduras, peso fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta, teor de clorofila aumentado, número de vagens por planta aumentado, comprimento de vagens por planta aumentado, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta, e número aumentado de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de uma transcrição, e uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência. Em uma outra modalidade, pelo menos dois traços agronômicos são aperfeiçoados na planta agrícola.

[00182] Em uma outra modalidade, a formulação que compreende o endófito fica disposta em uma quantidade eficaz para aumentar detectavelmente a taxa de germinação da semente. Por exemplo, a taxa de germinação da semente é aumentada em pelo menos 0,5%, por exemplo, pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[00183] Em uma outra modalidade, a formulação que compreende o endófito fica disposta em uma quantidade eficaz para aumentar detectavelmente a biomassa da planta. Por exemplo, a biomassa da planta é detectavelmente aumentada em pelo menos 1%, por exemplo, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[00184] Em uma outra modalidade, a formulação que compreende o endófito fica disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa ou rendimento de um fruto ou semente da planta. Por exemplo, a biomassa do fruto ou semente da planta é detectavelmente aumentada em pelo menos 1%, por exemplo, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, ou mais, quando comparado com o fruto ou semente de uma planta agrícola de referência.

[00185] Ainda em uma outra modalidade, a formulação que compreende o endófito fica disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a altura da planta. A altura da planta, em algumas modalidades, é detectavelmente aumentada em pelo menos 1%, por exemplo, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparado com a altura de uma planta agrícola de referência.

COMBINAÇÕES DE ENDÓFITOS

[00186] Em uma outra modalidade, a presente invenção contempla métodos de associação de uma pluralidade de endófitos com um ou mais elementos vegetais, como uma semente, uma folha, ou uma raiz, para conferir um traço agronômico aprimorado ou potencial traço agronômico aprimorado ao dito elemento vegetal ou planta hospedeira.

[00187] Em algumas modalidades, a invenção contempla revestir a semente de uma planta com uma pluralidade de endófitos, bem como composições de semente que compreendem uma pluralidade de endófitos sobre e/ou na semente. Os métodos de acordo com essa modalidade podem ser realizados de maneira similar àqueles descritos no presente documento para revestimento de endófito simples. Em um exemplo, múltiplos endófitos podem ser preparados em uma única preparação que é revestida sobre a semente. Os endófitos podem ser de uma origem comum (isto é, a mesma planta). Alternativamente, os endófitos podem ser de plantas diferentes. Dessa forma, a presente invenção fornece combinações que compreendem pelo menos duas populações microbianas endofíticas com uma planta agrícola. As populações endofíticas ficam dispostas de modo heterólogo sobre uma superfície exterior ou dentro da planta em uma quantidade eficaz para colonizar a planta. A combinação pode compreender adicionalmente uma formulação que compreende pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em um veículo agricolamente compatível, um acentuador de pegajosidade, um estabilizante microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento vegetal, um rodenticida, e um nutriente.

[00188] Quando múltiplos endófitos são revestidos sobre a semente da planta, cada endófito pode ser uma bactéria. Alternativamente, cada endófito pode ser um fungo. Ainda em uma outra modalidade, uma mistura de endófitos bacterianos e fúngicos pode ser revestida sobre a superfície de uma semente.

[00189] Em uma modalidade, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais endófitos de uma combinação endofítica é uma bactéria selecionada dentre os seguintes gêneros: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Methylobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas, e Stenotrophomonas.

[00190] Em uma modalidade, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais endófitos de uma combinação endofítica é um fungo selecionado dentre os seguintes gêneros: Acremonium, Alternaria, Cladosporium, Cochliobolus, Embellisia, Epicoccum, Fusarium, Nigrospora, Phoma e Podospora.

[00191] Em uma modalidade, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais endófitos de uma combinação endofítica é uma bactéria selecionada dentre uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamona- daceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae.

[00192] Em uma modalidade, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais endófitos de uma combinação endofítica é um fungo selecionado dentre uma das seguintes famílias: Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae, Pleosporaceae.

[00193] Em uma modalidade, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais endófitos de uma combinação endofítica são selecionados dentre um dos seguintes gêneros: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Methylobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas, e Stenotrophomonas, Acremonium, Alternaria, Cladosporium, Cochliobolus, Embellisia, Epicoccum, Fusarium, Nigrospora, Phoma e Podospora.

[00194] Em uma modalidade, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais endófitos de uma combinação endofítica são selecionados dentre uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Entero- bacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbactéria- ceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomona- daceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae, Pleosporaceae.

[00195] Em uma modalidade, pelo menos uma das populações endofíticas compreende um ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntico, pelo menos 91% idêntico, pelo menos 92% idêntico, pelo menos 93% idêntico, pelo menos 94% idêntico, pelo menos 95% idêntico, pelo menos 96% idêntico, pelo menos 97% idêntico, pelo menos 98% idêntico, pelo menos 99% idêntico, pelo menos 99,5% idêntico, ou 100% idêntico a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 1 a 3700.

[00196] Em algumas modalidades, a combinação de endófitos compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou mais de cinco, endófitos, cada um compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°: 1 a 3700.

[00197] Em algumas modalidades, a combinação de endófitos compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou mais de cinco, endófitos, cada um compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°: 1 a 3700.

[00198] Em uma modalidade, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais endófitos de uma combinação endofítica é uma bactéria que compreende em seu genoma uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dentre SEQ ID NOs:3588, 3589, 3590, 3591, 3592, 3593, 3594, 3595, 3596, 3598, 3599, 3600, 3601, 3603, 3604, 3606, 3622, 3623, 3624, 3625, 3626, 3633, 3634, 3635, 3636, 3637, 3649, 3651, 3652, 3653, 3656, 3669, 3670, 3671. Em uma modalidade, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais endófitos de uma combinação endofítica é um fungo que compreende em seu genoma uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dentre SEQ ID NOs: 3597, 3602, 3605, 3610, 3611, 3612, 3613, 3614, 3615, 3616, 3617, 3618, 3640, 3642, 3643, 3644, 3647, 3650, 3654, 3655, 3657, 3658, 3659, 3660, 3624, 3625, 3626, 3661, 3662, 3672, 3673, 3674, 3675, 3676, 3677, 3678, 3679, 3680, 3681, 3682, 3683, 3684, 3685, 3686, 3687, 3688, 3689, 3690, 3691, 3692, 3693, 3694, 3695, 3696, 3697, 3698, 3699, 3700. Em uma modalidade, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais endófitos de uma combinação endofítica são endófitos cada um compreendendo em seu genoma uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 3588, 3589, 3590, 3591, 3592, 3593, 3594, 3595, 3596, 3598, 3599, 3600, 3601, 3603, 3604, 3606, 3607, 3608, 3609, 3619, 3620, 3621, 3622, 3623, 3624, 3625, 3626, 3627, 3628, 3629, 3630, 3631, 3632, 3633, 3634, 3635, 3636, 3637, 3638, 3639, 3641, 3645, 3646, 3648, 3649, 3651, 3652, 3653, 3656, 3663, 3664, 3665, 3666, 3667, 3668, 3669, 3670, 3671, 3597, 3602, 3605, 3610, 3611, 3612, 3613, 3614, 3615, 3616, 3617, 3618, 3640, 3642, 3643, 3644, 3647, 3650, 3654, 3655, 3657, 3658, 3659, 3660, 3661, 3662, 3672, 3673, 3674, 3675, 3676, 3677, 3678, 3679, 3680, 3681, 3682, 3683, 3684, 3685, 3686, 3687, 3688, 3689, 3690, 3691, 3692, 3693, 3694, 3695, 3696, 3697, 3698, 3699, 3700.

[00199] Em uma modalidade, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais endófitos de uma combinação endofítica é uma bactéria que compreende em seu genoma um ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntico, pelo menos 91% idêntico, pelo menos 92% idêntico, pelo menos 93% idêntico, pelo menos 94% idêntico, pelo menos 95% idêntico, pelo menos 96% idêntico, pelo menos 97% idêntico, pelo menos 98% idêntico, pelo menos 99% idêntico, pelo menos 99.5% idêntico, ou 100% idêntico a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 3588, 3589, 3590, 3591, 3592, 3593, 3594, 3595, 3596, 3598, 3599, 3600, 3601, 3603, 3604, 3606, 3607, 3608, 3609, 3619, 3620, 3621, 3622, 3623, 3624, 3625, 3626, 3627, 3628, 3629, 3630, 3631, 3632, 3633, 3634, 3635, 3636, 3637, 3638, 3639, 3641, 3645, 3646, 3648, 3649, 3651, 3652, 3653, 3656, 3663, 3664, 3665, 3666, 3667, 3668, 3669, 3670, 3671. Em uma modalidade, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais endófitos de uma combinação endofítica é um fungo que compreende em seu genoma um ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntico, pelo menos 91% idêntico, pelo menos 92% idêntico, pelo menos 93% idêntico, pelo menos 94% idêntico, pelo menos 95% idêntico, pelo menos 96% idêntico, pelo menos 97% idêntico, pelo menos 98% idêntico, pelo menos 99% idêntico, pelo menos 99.5% idêntico, ou 100% idêntico a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 3597, 3602, 3605, 3610, 3611, 3612, 3613, 3614, 3615, 3616, 3617, 3618, 3640, 3642, 3643, 3644, 3647, 3650, 3654, 3655, 3657, 3658, 3659, 3660, 3624, 3625, 3626, 3661, 3662, 3672, 3673, 3674, 3675, 3676, 3677, 3678, 3679, 3680, 3681, 3682, 3683, 3684, 3685, 3686, 3687, 3688, 3689, 3690, 3691, 3692, 3693, 3694, 3695, 3696, 3697, 3698, 3699, 3700. Em uma modalidade, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais endófitos de uma combinação endofítica são endófitos, cada um, compreendendo em seu genoma um ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntico, pelo menos 91% idêntico, pelo menos 92% idêntico, pelo menos 93% idêntico, pelo menos 94% idêntico, pelo menos 95% idêntico, pelo menos 96% idêntico, pelo menos 97% idêntico, pelo menos 98% idêntico, pelo menos 99% idêntico, pelo menos 99.5% idêntico, ou 100% idêntico a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 3588, 3589, 3590, 3591, 3592, 3593, 3594, 3595, 3596, 3598, 3599, 3600, 3601, 3603, 3604, 3606, 3607, 3608, 3609, 3619, 3620, 3621, 3622, 3623, 3624, 3625, 3626, 3627, 3628, 3629, 3630, 3631, 3632, 3633, 3634, 3635, 3636, 3637, 3638, 3639, 3641, 3645, 3646, 3648, 3649, 3651, 3652, 3653, 3656, 3663, 3664, 3665, 3666, 3667, 3668, 3669, 3670, 3671, 3597, 3602, 3605, 3610, 3611, 3612, 3613, 3614, 3615, 3616, 3617, 3618, 3640, 3642, 3643, 3644, 3647, 3650, 3654, 3655, 3657, 3658, 3659, 3660, 3661, 3662, 3672, 3673, 3674, 3675, 3676, 3677, 3678, 3679, 3680, 3681, 3682, 3683, 3684, 3685, 3686, 3687, 3688, 3689, 3690, 3691, 3692, 3693, 3694, 3695, 3696, 3697, 3698, 3699, 3700.

[00200] Em alguns aspectos, a combinação de endófitos compreende pelo menos dois endófitos que compreendem, cada um, pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idêntica, por exemplo, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99,5% idêntica ou 100% idêntica a qualquer ácido nucleico fornecido nas Tabelas 1 a 10 e 12 a 19.

[00201] Em alguns aspectos, a combinação de endófitos compreende pelo menos dois endófitos fornecidos na Tabela 11.

[00202] Quando múltiplos endófitos são revestidos sobre a semente, quaisquer ou todos os endófitos podem ser capazes de conferir um traço benéfico à planta hospedeira. Em alguns casos, todos os endófitos são capazes de conferir um traço benéfico à planta hospedeira. O traço conferido por cada um dos endófitos pode ser igual (por exemplo, ambos aprimoram a tolerância da planta hospedeira a um estresse biótico particular), ou pode ser diferente (por exemplo, um aprimora a tolerância da planta hospedeira À seca, enquanto outro aprimora a utilização de fosfato). Em outros casos, o traço conferido pode ser o resultado de interações entre os endófitos.

[00203] Combinações de endófitos podem ser selecionadas por qualquer um ou mais dentre vários critérios. Em uma modalidade, endófitos compatíveis são selecionados. Como usado no presente documento, "compatibilidade" refere-se a populações de endófitos que não interferem significativamente no crescimento, propagação e/ou produção de substâncias benéficas das outras. Populações de endófitos incompatíveis podem surgir, por exemplo, em que uma das populações produz ou secreta um composto que é tóxico ou prejudicial ao crescimento da(s) outra(s) população(ões). A incompatibilidade que surge da produção de compostos/agentes prejudiciais pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica, e conforme descrito em outro lugar no presente documento. De modo similar, as populações diferentes podem competir por recursos limitados de tal modo que torna a coexistência difícil.

[00204] Em uma outra modalidade, as combinações são selecionadas com base em compostos produzidos por cada população de endófitos. Por exemplo, a primeira população é capaz de produzir sideróforos, e outra população é capaz de produzir compostos antifúngicos. Em uma modalidade, a primeira população de endófitos ou componentes endofíticos é capaz de uma função selecionada a partir do grupo que consiste em produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobiano, produção de sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de celulase, produção de quitinase, produção de xilanase e produção de acetoína. Em uma outra modalidade, a segunda população de endófitos ou componente endofítico é capaz de uma função selecionada a partir do grupo que consiste em produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobiano, produção de sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de celulase, produção de quitinase, produção de xilanase e produção de acetoína. Em ainda uma outra modalidade, a primeira e a segunda populações são capazes de pelo menos uma função diferente.

[00205] Em uma outra modalidade, as combinações são selecionadas com base em fontes de carbono que as mesmas metabolizam. Em alguns aspectos, um endófito pode ser capaz de usar qualquer um ou mais dos seguintes: 1,2-Propanodiol, 2-Aminoetanol, 2- Desóxi adenosina, Ácido acético, Ácido acetoacético, Adenosina, Adonitol, Ácido bromo succínico, Ácido cítrico, D-Alanina, Ácido D- aspártico, D-Celobiose, D-Frutose, D-Frutose-6-Fosfato, Ácido D- galactônico-Y-lactona, D-Galactose, Ácido D-galacturônico, Ácido D- glucônico, Ácido D-glucosamínico, D-Glicose-1-Fosfato, D-Glicose-6- Fosfato, Ácido D-glucurônico, Ácido D-L-Málico, Fosfato de D-L-α- Glicerol, Ácido D-Málico, D-Manitol, D-Manose, D-Melibiose, D-Psicose, D-Ribose, Ácido D-Sacárico, D-Serina, D-Sorbitol, D-Treonina, D- Trealose, Dulcitol, D-Xilose, Ácido fórmico, Ácido fumárico, Glucuronamida, Glicerol, Ácido glicólico, Ácido Glicil-L-Aspártico, Ácido Glicil-L-Glutâmico, Glicil-L-Prolina, Ácido glioxílico, Inosina, Lactulose, L-Alanina, L-Alanil-Glicina, L-Arabinose, L-Asparagina, Ácido L- aspártico, L-Fucose, Ácido L-Galactônico—Y—lactona, Ácido L-Glutâmico, L-glutamina, Ácido L-Láctico, L-Xilose, Ácido L-Málico, L-Prolina, L- Ramose, L-Serina, L-Treonina, Maltose, Maltotriose, Piruvato de Metila, Ácido m-Hidróxi Fenil Acético, m-Inositol, Succinato de Mono Metila, Ácido m-Tartárico, Ácido Múcico, N-acetil- β-D-Manosamina, N-Acetil- D-Glucosamina, Feniletil-amina, Ácido p-Hidróxi Fenil acético, Ácido Propiônico, Ácido Pirúvico, Ácido Succínico, Sacarose, Timidina, Ácido Tricarbalílico, Tween 20, Tween 40, Tween 80, Tiramina, Uridina, α-D- Glicose, α-D-Lactose, Ácido a-Hidróxi Butírico, Ácido a-Hidróxi Glutárico- Y-lactona, Ácido a-Ceto-Butírico, Ácido a-Ceto-Glutárico, a- Metil-D-Galactosídeo, β-Metil-D-glicosideo. Em modalidades preferidas, pelo menos uma população é capaz de metabolizar qualquer um ou mais dos seguintes: D-alanina, Ácido D-aspártico, D-Serina, D- Treonina, Ácido glicil-L-aspártico, Ácido Glicil-L-Glutâmico, Glicil-L- Prolina, Ácido glioxílico, Inosina, L-Alanina, L-Alanil-Glicina, L- Arabinose, L-Asparagina, Ácido L-aspártico, Ácido L-glutâmico, L- Glutamina, L-Prolina, L-Serina, L-Treonina, Tiramina, Uridina, Prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico e salicina.

[00206] Em um outro aspecto, a combinação de endófitos compreende pelo menos um endófito que é capaz de metabolizar qualquer um ou mais dos seguintes: D-alanina, Ácido D-aspártico, D- Serina, D-Treonina, Ácido glicil-L-aspártico, Ácido Glicil-L-Glutâmico, Glicil-L-Prolina, Ácido glioxílico, Inosina, L-Alanina, L-Alanil-Glicina, L- Arabinose, L-Asparagina, Ácido L-aspártico, Ácido L-glutâmico, L- Glutamina, L-Prolina, L-Serina, L-Treonina, Tiramina, Uridina, Prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico e salicina.

[00207] Por exemplo, um endófito pode ser capaz de utilizar ácido oxálico e um segundo endófito pode ser capaz de utilizar arabinose. Por exemplo, pelo menos um endófito pode ser capaz de metabolizar prolina, pelo menos um endófito pode ser capaz de metabolizar manose. É contemplado que combinações de endófitos podem ser selecionadas com base em capacidades metabólicas complementares: por exemplo, um pode ser capaz de utilizar manose, porém não sacarose, e um segundo pode ser capaz de utilizar sacarose, porém não manose. Em um outro aspecto, é contemplado que combinações de endófitos podem ser selecionadas com base em capacidades metabólicas mútuas: por exemplo, dois endófitos que são, ambos, capazes de utilizar manose. Em um outro aspecto, é contemplado que combinações de endófitos são selecionadas com base nos efeitos sinérgicos de utilização de fonte de carbono: por exemplo, um endófito pode ter a capacidade de utilizar manose, porém não prolina mas quando em combinação com um segundo endófito pode, então, exibir a capacidade de utilizar prolina. Em outras palavras, um endófito pode ser capaz de promover a capacidade de outro endófito utilizar uma fonte de carbono particular. Em um outro aspecto, um endófito pode reduzir a capacidade de outro endófito utilizar uma fonte de carbono particular. Em um outro aspecto de sinergia, dois endófitos que são capazes de utilizar um tipo de fonte de carbono, por exemplo, maltose, podem aperfeiçoar as capacidades de outros utilizarem a dita fonte de carbono em uma maior eficácia. É contemplado que qualquer combinação (mútua, complementar, aditiva, sinérgica) de capacidades de utilização de substrato pode ser usada como critérios de seleção de endófitos da presente invenção. é adicionalmente contemplado que tais combinações de fonte de carbono de substrato para utilização de endófito podem incluir pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, e ainda mais de dez fontes de carbono diferentes.

[00208] Em algumas modalidades, a combinação de endófitos compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou mais de cinco, endófitos em que pelo menos um dos ditos endófitos compreende um gene em seu genoma que codifica uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: proteína de ligação a ATP de transportador ABC de arabinose, permease de transportador ABC de arabinose, proteína de ligação a substrato de transportador ABC de arabinose, proteína AraG de ligação a ATP de importação de arabinose, arabinose isomerase, simportador de arabinose-próton, proteína de ligação à L-arabinose periplásmica de transportador ABC de L-arabinose, L-arabinose isomerase, proteína araGde ligação à ATP de transportador de L-arabinose, proteína ligação à ATP de transportador de L-arabinose, proteína ligação à ATP de transportador de L-arabinose (plasmídeo), permease de transportador de L-arabinose, permease de transportador de L-arabinose (plasmídeo), proteína de permease de transportador de L-arabinose, proteína ligação à L-arabinose, simportador de arabinose-próton.

[00209] Em algumas modalidades, a combinação de endófitos compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou mais de cinco, endófitos em que cada endófito compreende um gene em seu genoma que codifica uma proteína selecionada a partir de SEQ ID N°: 3701 a 3913.

[00210] Em algumas modalidades, o primeiro endófito compreende em seu genoma um gene que codifica uma proteína com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3701 a 3913

[00211] Em algumas modalidades, o primeiro endófito compreende em seu genoma um gene que codifica uma proteína com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3701 a 3913, e o segundo endófito compreende em seu genoma um gene que codifica uma proteína com pelo menos 80% de identidade a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:3701 a 3913.

[00212] Em algumas modalidades, a primeira população compreende em seu genoma um gene que codifica uma proteína com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3701 a 3913. Em algumas modalidades, a segunda população compreende em seu genoma um gene que codifica uma proteína com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3701 a 3913.

[00213] Em algumas modalidades, a combinação de endófitos compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou mais de cinco, endófitos capazes de metabolizar pelo menos um dos seguintes: D-alanina, Ácido D-aspártico, D-Serina, D- Treonina, Ácido glicil-L-aspártico, Ácido Glicil-L-Glutâmico, Glicil-L- Prolina, Ácido glioxílico, Inosina, L-Alanina, L-Alanil-Glicina, L- Arabinose, L-Asparagina, Ácido L-aspártico, Ácido L-glutâmico, L- Glutamina, L-Prolina, L-Serina, L-Treonina, Tiramina, Uridina, Prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico e salicina.

[00214] Em algumas modalidades, a combinação de endófitos compreende pelo menos um endófito que compreende uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°: 1 a 3700, e pelo menos um endófito que é capaz de metabolizar pelo menos um dentre D-alanina, Ácido D-aspártico, D-Serina, D-Treonina, Ácido glicil-L-aspártico, Ácido Glicil-L-Glutâmico, Glicil-L-Prolina, Ácido glioxílico, Inosina, L-Alanina, L-Alanil-Glicina, L-Arabinose, L-Asparagina, Ácido L-aspártico, Ácido L-glutâmico, L-Glutamina, L-Prolina, L-Serina, L- Treonina, Tiramina, Uridina, Prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico e salicina.

[00215] Em uma outra modalidade, a combinação de endófitos compreende pelo menos um endófito que compreende uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°: 1 a 3700, e pelo menos um endófito que compreende em seu genoma um gene que codifica uma proteína selecionada dentre SEQ ID N°: 3701 a 3913.

[00216] Em uma outra modalidade, a combinação de endófitos compreende pelo menos um endófito que é capaz de metabolizar pelo menos um dentre D-alanina, Ácido D-aspártico, D-Serina, D-Treonina, Ácido glicil-L-aspártico, Ácido Glicil-L-Glutâmico, Glicil-L-Prolina, Ácido glioxílico, Inosina, L-Alanina, L-Alanil-Glicina, L-Arabinose, L- Asparagina, Ácido L-aspártico, Ácido L-glutâmico, L-Glutamina, L- Prolina, L-Serina, L-Treonina, Tiramina, Uridina, Prolina, arabinose, xilose, manose, sacarose, maltose, D-glucosamina, trealose, ácido oxálico e salicina, e pelo menos um endófito que compreende em seu genoma um gene que codifica uma proteína selecionada dentre SEQ ID N°: 3701 a 3913.

[00217] É contemplado que cada endófito na combinação de endófitos pode compreender características diferentes, por exemplo, compreende genes com porcentagens de identidade diferentes para qualquer uma das sequências de SEQS ID NOs: 1 a 3913.

[00218] Em ainda uma outra modalidade, as combinações de endófitos são selecionadas por sua localização diferente na planta após a colonização. Por exemplo, a primeira população de endófitos ou componentes endofíticos pode colonizar, e em alguns casos, de preferência, colonizar, o tecido da raiz, enquanto uma segunda população pode ser selecionada com base em sua colonização preferencial das partes aéreas da planta agrícola. Portanto, em uma modalidade, a primeira população é capaz de colonizar um ou mais dos tecidos selecionados a partir do grupo que consiste em uma raiz, broto, folha, flor e semente. Em uma outra modalidade, a segunda população é capaz de colonizar um ou mais tecidos selecionados a partir do grupo que consiste em raiz, broto, folha, flor e semente. Ainda em uma outra modalidade, a primeira e a segunda populações são capazes de colonizar um tecido diferente dentro da planta agrícola.

[00219] Ainda em uma outra modalidade, as combinações de endófitos são selecionadas por sua capacidade de conferir um ou mais traços agronômicos diferentes na planta agrícola inoculada, tanto individualmente como em associação sinérgica com outros endófitos. Alternativamente, dois ou mais endófitos induzem a colonização de um terceiro endófito. Por exemplo, a primeira população de endófitos ou componentes endofíticos é selecionada com base no fato de que a mesma confere um aumento significativo em biomassa, enquanto a segunda população promove tolerância à seca aumentada à planta agrícola inoculada. Portanto, em uma modalidade, a primeira população é capaz de conferir pelo menos um traço selecionado a partir do grupo que consiste em tolerância térmica, tolerância a herbicida, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungo, resistência a vírus, resistência a bactérias, esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância a sal, rendimento aumentado, eficiência de uso de nutriente aumentada, eficiência de uso de nitrogênio aumentada, tolerância aumentada a estresse por nitrogênio, teor de carboidrato fermentável aumentado, teor de lignina reduzido, teor de antioxidante aumentado, eficiência de uso de água aumentado, vigor aumentado, eficiência de germinação aumentada, floração precoce ou aumentada, biomassa aumentada, razão de biomassa raiz-para-raiz aumentada, retenção de água no solo aumentada, ou uma combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, a segunda população é capaz de conferir um traço selecionado a partir do grupo que consiste em tolerância térmica, tolerância a herbicida, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungo, resistência a vírus, resistência a bactérias, esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância a sal, rendimento aumentado, eficiência de uso de nutriente aumentada, eficiência de uso de nitrogênio aumentada, teor de carboidrato fermentável aumentado, teor de lignina reduzido, teor de antioxidante aumentado, eficiência de uso de água aumentado, vigor aumentado, eficiência de germinação aumentada, floração precoce ou aumentada, biomassa aumentada, razão de biomassa raiz-para-raiz aumentada e retenção de água no solo aumentada. Ainda em uma outra modalidade, cada uma dentre a primeira e a segunda população é capaz de conferir um traço diferente selecionado a partir do grupo que consiste em tolerância térmica, tolerância a herbicida, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungo, resistência a vírus, resistência a bactérias, esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância a sal, rendimento aumentado, eficiência de uso de nutriente aumentada, eficiência de uso de nitrogênio aumentada, teor de carboidrato fermentável aumentado, teor de lignina reduzido, teor de antioxidante aumentado, eficiência de uso de água aumentado, vigor aumentado, eficiência de germinação aumentada, floração precoce ou aumentada, biomassa aumentada, razão de biomassa raiz-para-raiz aumentada e retenção de água no solo aumentada. Em qualquer combinação de endófitos, qualquer um dos traços de importância agronômica pode ser modulado devido à associação de um ou mais endófitos na combinação com uma planta ou elemento vegetal: teor de óleo alterado, teor de proteína alterada, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, e composição de proteína de semente alterada, tolerância a produtos químicos, tolerância ao frio, senescência retardada, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da espiga, melhora do crescimento, melhora da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicida, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, arquitetura de raiz aprimorada, eficiência de uso de água aumentada, biomassa aumentada, comprimento de raiz aumentado, peso de semente aumentado, comprimento de broto aumentado, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições limitadas de água, massa de núcleo, teor de umidade de núcleo, tolerância a metal, número de espigas, número de núcleos por espiga, número de vagens, melhora da nutrição, resistência a patógenos, resistência a pragas, melhora da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, stay-green, melhora de vigor, peso seco aumentado de sementes maduras, peso fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta, teor de clorofila aumentado, número de vagens por planta aumentado, comprimento de vagens por planta aumentado, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta, e número aumentado de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de uma transcrição, ou uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência.

[00220] As combinações de endófitos também podem ser selecionadas com base nas combinações dos critérios acima. Por exemplo, a primeira população de endófitos pode ser selecionada com base no composto que a mesma produz (por exemplo, sua capacidade de fixação de nitrogênio, dessa forma, fornecendo uma fonte de nitrogênio potencial à planta), enquanto a segunda população pode ser selecionada com base em sua capacidade de conferir resistência aumentada da planta a um patógeno (por exemplo, um patógeno fúngico).

[00221] Em alguns aspectos da presente invenção, é contemplado que as combinações de endófitos podem fornecer um benefício aumentado à planta hospedeira, em comparação com aquele conferido por um único endófito, em virtude de efeitos aditivos. Por exemplo, uma cepa de endófito que induz um benefício na planta hospedeira pode induzir tal benefício igualmente bem em uma planta que também é colonizada com uma cepa de endófito diferente que também induz o mesmo benefício na planta hospedeira. Dessa forma, a planta hospedeira exibe o mesmo benefício total da pluralidade de cepas de endófito diferentes que o benefício aditivo a plantas individuais colonizadas com cada endófito individual da pluralidade. Em um exemplo, uma planta é colonizada com duas cepas de endófitos diferentes: uma fornece um aumento de 1X em biomassa quando associada à planta, e a outra fornece um aumento de 2X em biomassa quando associada a uma planta diferente. Quando ambas as cepas de endófito estão associadas à mesma planta, aquela planta poderia experimentar um aumento de 3X (aditivo de efeitos únicos 1X + 2X) em biomassa de auxina. Os efeitos aditivos são um aspecto surpreendente da presente invenção, visto que a não compatibilidade de endófitos pode resultar em um cancelamento dos efeitos benéficos de ambos os endófitos.

[00222] Em alguns aspectos da presente invenção, é contemplado que uma combinação de endófitos pode fornecer um benefício aumentado à planta hospedeira, em comparação com aquele conferido por um único endófito, em virtude de efeitos sinérgicos. Por exemplo, uma cepa de endófito que induz um benefício na planta hospedeira pode induzir tal benefício além de efeitos aditivos em uma planta que também é colonizada com uma cepa de endófito diferente que também induz aquele benefício na planta hospedeira. Dessa forma, a planta hospedeira exibe o maior benefício total da pluralidade de cepas de endófito diferentes que poderia ser esperado do benefício aditivo a plantas individuais colonizadas com cada endófito individual da pluralidade. Em um exemplo, uma planta é colonizada com duas cepas de endófitos diferentes: uma fornece um aumento de 1X em biomassa quando associada a uma planta, e a outra fornece um aumento de 2X em biomassa quando associada a uma planta diferente. Quando ambas as cepas de endófito estão associadas à mesma planta, aquela planta poderia experimentar um aumento de 5X (maior que um aditivo de efeitos únicos 1X + 2X) em biomassa. Os efeitos sinérgicos são um aspecto surpreendente da presente invenção.

[00223] Seleção de endófitos que conferem traços benéficos. A presente invenção contempla a inoculação de plantas com micróbios. Conforme anteriormente descrito, os micróbios podem ser derivados de muitas espécies de plantas diferentes, de partes diferentes das plantas e de plantas isoladas de diferentes ambientes. Uma vez que um micróbio é isolado, o mesmo pode ser testado quanto à sua capacidade de conferir um traço benéfico. Vários testes podem ser realizados tanto in vitro como in vivo para avaliar quais benefícios, se houver algum, são conferidos à planta. Em uma modalidade, um micróbio é testado in vitro quanto a uma atividade selecionada a partir do grupo que consiste em: liberação de fosfatos complexados, liberação de ferro complexado (por exemplo, através de secreção de sideróforos), produção de fito-hormônios, produção de compostos antibacterianos, produção de compostos antifúngicos, produção de compostos inseticidas, produção de compostos nematicidas, produção e/ou secreção de ACC desaminase, produção e/ou secreção de acetoína, produção e/ou secreção de pectinase, produção e/ou secreção de celulase, e produção e/ou secreção de RNAse. Métodos in vitro exemplificadores para a descrição acima podem ser encontrados nas seções de Exemplos abaixo.

[00224] É observado que o teste inicial das atividades mencionadas acima também pode ser realizado usando-se uma mistura de micróbios, por exemplo, uma comunidade de micróbios isolada de uma única planta. Uma leitura de atividade positiva que usa tal mistura pode ser seguida do isolamento de micróbios individuais dentro daquela população e repetindo-se os testes in vitro das atividades para isolar o micróbio responsável pela atividade particular. Uma vez validada usando-se um único micróbio isolado, então, a planta pode ser inoculada com um micróbio, e o teste realizado in vivo, tanto em condições de câmara de crescimento como estufa, e comparando-se com uma planta de controle que não foi inoculada com o micróbio.

[00225] É contemplado que cada endófito na combinação de endófitos pode compreender características diferentes, por exemplo, mas não se limitando a: compreende genes com porcentagens de identidade diferentes para qualquer uma das sequências de SEQS ID NOs: 1 a 3913, característica fenotípicas diferentes, capacidades diferentes de utilizar várias fontes de carbono, capacidades diferentes de conferir potenciais traços agronômicos ou traços agronômicos aprimorados a uma semente ou planta hospedeira à qual o mesmo se torna associado, localização diferente em elementos vegetais.

PLANTAS ÚTEIS PARA A PRESENTE INVENÇÃO

[00226] Os métodos e composições de acordo com a presente invenção podem ser implantados em qualquer espécie vegetal de semente. Dessa forma, a invenção tem uso em uma ampla gama de plantas, de preferência, plantas mais altas que pertencem às classes de Angiospermas e Gimnospermas.

[00227] Em uma modalidade, uma planta monocotiledônea é usada. As plantas monocotiledôneas pertencem às ordens da Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales, Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales e Zingiberales. As plantas que pertencem à classe das Gimnospermas são Cycadales, Ginkgoales, Gnetales e Pinales. Em uma modalidade particular, a planta monocotiledônea pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em um milho, arroz, trigo, cevada e cana-de-açúcar.

[00228] Em uma outra modalidade, uma planta dicotiledônea é usada, inclusive aqueles que pertencem às ordens da Aristochiales, Asterales, Batales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuarinales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebenales, Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Middles, Juglandales, Lamiales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumb aginales, Podostemales, Polemoniales, Polygalales, Polygonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales e Violates. Em uma modalidade particular, a planta dicotiledônea pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em um algodão, soja, pimenta e tomate.

[00229] A presente invenção contempla o uso de entidades endofíticas derivadas de plantas. É contemplado que as plantas podem ser plantas agrícolas. Em algumas modalidades, um cultivar ou variedade que é da mesma família que a planta a partir da qual o endófito é derivado é usado. Em algumas modalidades, um cultivar ou variedade que é do mesmo gênero que a planta a partir da qual o endófito é derivado é usado. Em algumas modalidades, um cultivar ou variedade que é da mesma espécie que a planta antiga a partir da qual o endófito é derivado é usado. Em algumas modalidades, um cultivar ou variedade moderna que é da mesma família que a planta antiga a partir da qual o endófito é derivado é usado. Em uma outra modalidade, um cultivar ou variedade moderna que é do mesmo gênero que a planta antiga a partir da qual o endófito é derivado é usado. Ainda em uma outra modalidade, um cultivar ou variedade moderna que é da mesma espécie que a planta antiga a partir da qual o endófito é derivado é usado.

[00230] Os métodos e composições da presente invenção são, de preferência, usados em plantas que são importantes ou interessantes para a agricultura, horticultura, biomassa para a produção de moléculas de biocombustível e outros produtos químicos e/ou silvicultura. Exemplos não limitadores incluem, por exemplo, Panicum virgatum (switch), Sorghum bicolor (sorgo, sudan), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana energia), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba), Pennisetum glaucum (milheto), Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum—trigo X centeio), Bamboo, Carthamus tinctorius (açafrão), Jatropha curcas (Jatropha), Ricinus communis (mamona), Elaeis guineensis (óleo de palma), Phoenix dactylifera (tâmara), Archontophoenix cunninghamiana (palmeira real), Syagrus romanzoffiana (palmeira rainha), Linum usitatissimum (linho), Brassica juncea, Manihot esculenta (aipim), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca saliva (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve-de-bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimenta & pimentão), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melão), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (berinjela), Papaver somniferum (papoula do ópio), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guaiúle), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (hortelã), Mentha piperita (hortelã), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveias), Hordeum vulgare (cevada), e Lolium spp. (centeio).

[00231] A presente invenção contempla o aprimoramento de um traço agronômico em uma planta agrícola colocando-se uma planta agrícola moderna com uma formulação que compreende um endófito derivado de uma planta ou um endófito conservado em diversas espécies e/ou cultivares de plantas agrícolas. Em uma modalidade, a planta agrícola moderna é uma planta híbrida. Em uma outra modalidade, a planta agrícola moderna é uma planta endocruzada. Exemplos não limitadores de tais plantas híbridas, endocruzadas e geneticamente modificadas são descritos a seguir. Ainda em uma outra modalidade, a planta agrícola moderna é uma planta geneticamente modificada. Os métodos descritos no presente documento também podem ser usados com plantas geneticamente modificadas, por exemplo, para produzir benefícios de traços adicionais a uma planta. Em uma modalidade, a planta agrícola moderna é uma planta geneticamente modificada que compreende um transgene que confere na planta um fenótipo selecionado a partir do grupo que consiste em teor de óleo alterado, teor de proteína alterada, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, e composição de proteína de semente alterada, tolerância a produtos químicos, tolerância ao frio, senescência retardada, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da espiga, melhora do crescimento, melhora da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicida, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, arquitetura de raiz aprimorada, eficiência de uso de água aumentada, biomassa aumentada, comprimento de raiz aumentado, peso de semente aumentado, comprimento de broto aumentado, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições limitadas de água, massa de núcleo, teor de umidade de núcleo, tolerância a metal, número de espigas, número de núcleos por espiga, número de vagens, melhora da nutrição, resistência a patógenos, resistência a pragas, melhora da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, stay-green, melhora de vigor, peso seco aumentado de sementes maduras, peso fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta, teor de clorofila aumentado, número de vagens por planta aumentado, comprimento de vagens por planta aumentado, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta, e número aumentado de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de uma transcrição, uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência, ou qualquer combinação dos mesmos.

ELEMENTO VEGETAL E COMBINAÇÕES DE ENDÓFITOS

[00232] É contemplado que os métodos e composições da presente invenção podem ser usados para aprimorar qualquer característica de qualquer planta agrícola. Os métodos descritos no presente documento também podem ser usados com plantas transgênicas que compreendem um ou mais transgenes exógenos, por exemplo, para produzir benefícios de traços adicionais conferidos pelos micróbios endofíticos recentemente introduzidos. Portanto, em uma modalidade, um elemento vegetal de uma planta transgênica de milho, trigo, arroz, algodão, canola, alfafa, ou cevada é colocado em contato com um micróbio endofítico.

[00233] A presença do endófito ou outros micróbios pode ser detectada e sua localização em ou sobre a planta hospedeira (incluindo um elemento vegetal da mesma) pode ser determinada usando várias metodologias diferentes. A presença do micróbio no embrião ou endosperma, bem como sua localização em relação às células vegetais, pode ser determinada usando métodos conhecidos na técnica, incluindo microscopia por imunofluorescência usando anticorpos específicos de micróbios, ou hibridização in situ por fluorescência (consulte, por exemplo, Amann et al. (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:231 a 236, incorporado no presente documento a título de referência). A presença e quantidade de outros micróbios podem ser estabelecidas por FISH, imunofluorescência e métodos de PCR usando sondas que são específicas para o micróbio. Alternativamente, sondas degeneradas que reconhecem sequências conservadas de muitas bactérias e/ou fungos podem ser empregadas para amplificar uma região, após isso, a identidade dos micróbios presentes no tecido/célula testada pode ser determinada por sequenciamento.

[00234] Em algumas modalidades, a presente invenção contempla o uso de endófitos que podem conferir um traço agronômico benéfico ao elemento vegetal ou planta resultante à qual o mesmo está associado.

[00235] Em alguns casos, os endófitos descritos no presente documento têm a capacidade de mudar de um tipo de tecido para outro. Por exemplo, a detecção e isolamento de endófitos da presente invenção dentro dos tecidos maduros de plantas após o revestimento no exterior de uma semente demonstra sua capacidade de se deslocar do exterior da semente para dentro dos tecidos vegetativos de uma planta em maturação. Portanto, em uma modalidade, a população de endófitos é capaz de se deslocar do exterior da semente para dentro dos tecidos vegetativos de uma planta. Em uma modalidade, o endófito que é revestido sobre a semente de uma planta é capaz de, mediante a germinação da semente em um estado vegetativo, ser localizada em um tecido diferente da planta. Por exemplo, os endófitos podem ser capazes de se localizarem em qualquer um dos tecidos na planta, incluindo: a raiz, raiz adventícia, raiz seminal, pelo radicular, broto, folha, flor, botão, Borla, meristema, pólen, pistilo, ovário, estame, fruto, estolho, rizoma, nódulo, tubérculo, tricomas, células de guarda, hidatódio, pétala, sépala, gluma, ráquis, câmbio vascular, floema e xilema. Em uma modalidade, o endófito é capaz de ser localizado na raiz e/ou no pelo radicular da planta. Em uma outra modalidade, o endófito é capaz de ser localizado nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta. Em outros casos, o endófito fica localizado nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e floema. Ainda em uma outra modalidade, o endófito é capaz de ser localizado nos tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame, fruta) da planta. Em uma outra modalidade, o endófito é capaz de ser localizado na raiz, brotos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Ainda em uma outra modalidade, o endófito coloniza um fruto ou tecido da semente da planta. Ainda em uma outra modalidade, o endófito é capaz de colonizar a planta de modo que esteja presente na superfície da planta (isto é, sua presença está detectavelmente presente no exterior da planta, ou na episfera da planta). Ainda em outras modalidades, o endófito é capaz de ser localizado em substancialmente todos, ou todos, os tecidos da planta. Em certas modalidades, o endófito não fica localizado na raiz de uma planta. Em outros casos, o endófito não fica localizado nos tecidos fotossintéticos da planta.

[00236] Em alguns casos, os endófitos são capazes de se replicar dentro da planta hospedeira e colonizar a planta.

[00237] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece combinações de entidades microbianas endofíticas e plantas. As entidades microbianas endofíticas descritas no presente documento são exclusivas pelo fato de que foram isoladas de sementes de plantas (por exemplo, uma planta agrícola, por exemplo, uma semente ou muda ou uma planta agrícola, que compreende uma população de entidades microbianas endofíticas que fica disposta de modo heterólogo sobre uma superfície exterior ou dentro da semente ou muda em uma quantidade eficaz para colonizar a planta). A combinação pode compreender adicionalmente uma formulação que compreende pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em um veículo agricolamente compatível, um acentuador de pegajosidade, um estabilizante microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento vegetal, um rodenticida, e um nutriente. Em algumas modalidades, a população de bactérias endofíticas está presente em uma quantidade eficaz para proporcionar um benefício a uma planta agrícola derivada de uma semente agrícola ou muda à qual a formulação é administrada.

[00238] A população de entidades microbianas endofíticas compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97% idêntica, por exemplo, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% idêntica, 99,8% idêntica, ou 100% idêntica, a uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 3700. Em uma outra modalidade, o endófito compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 3700. Ainda em uma outra modalidade, o endófito compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 3700.

[00239] Em algumas modalidades, é revelada uma semente de uma planta agrícola que compreende uma população exógena de um endófito que fica disposta sobre uma superfície exterior ou dentro da planta em uma quantidade eficaz para colonizar a planta. A população é considerada exógena à semente se aquela semente específica não contiver inerentemente a população de entidades microbianas endofíticas.

[00240] Em outros casos, a presente invenção revela uma semente de uma planta agrícola que compreende uma população de entidades microbianas endofíticas que fica disposta de modo heterólogo sobre uma superfície exterior ou dentro da planta em uma quantidade eficaz para colonizar a planta. Por exemplo, a população de entidades microbianas endofíticas que fica disposta sobre uma superfície exterior ou dentro da semente pode ser um endófito que pode estar associado à planta madura, mas não é encontrada sobre a superfície ou dentro da semente. Alternativamente, a população pode ser encontrada na superfície ou dentro da semente, porém em um número muito baixo do que o disposto.

[00241] Conforme mostrado na seção de Exemplos abaixo, as populações endofíticas descritas no presente documento são capazes de colonizar a planta hospedeira. Em certos casos, a população endofítica pode ser aplicada à planta, por exemplo, à semente da planta, ou por aplicação foliar, e uma colonização bem-sucedida pode ser confirmada detectando-se a presença da população microbiana endofítica dentro da planta. Por exemplo, após a aplicação do endófito às sementes, altos títulos do endófito podem ser detectados nas raízes e brotos das plantas que germinam das sementes. Além disso, quantidades significativas do endófito podem ser detectadas na rizosfera das plantas. Portanto, em uma modalidade, a população de micróbios endofíticos fica disposta em uma quantidade eficaz para colonizar a planta. A colonização da planta pode ser detectada, por exemplo, detectando-se a presença do micróbio endofítico dentro da planta. Isso pode ser realizado medindo-se a viabilidade do micróbio após a esterilização de superfície da semente ou da planta: a colonização endofítica resulta em uma localização interna do micróbio, tornando-o resistente a condições de esterilização de superfície. A presença e a quantidade do micróbio também podem ser estabelecidas usando-se outros meios conhecidos na técnica, por exemplo, microscopia por imunofluorescência que usa anticorpos específicos de micróbios, ou hibridização in situ por fluorescência (consulte, por exemplo, Amann et al. (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:231 a 236, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Alternativamente, as sondas de ácido nucléico específicas que reconhecem sequências conservadas da bactéria endofítica podem ser empregadas para amplificar uma região, por exemplo, por PCR quantitativa e a CFUs por meio de uma curva padrão.

[00242] Em uma outra modalidade, o micróbio endofítico fica disposto, por exemplo, sobre a superfície de uma semente de uma planta agrícola, em uma quantidade eficaz que será detectável na planta agrícola madura. Em uma modalidade, o micróbio endofítico fica disposto em uma quantidade eficaz que será detectável em uma quantidade de pelo menos cerca de 100 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 200 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 300 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 500 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 1.000 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 3.000 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 10.000 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 30.000 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 100.000 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 10A6 CFU ou esporos ou mais na planta agrícola madura.

[00243] Em alguns casos, o micróbio endofítico é capaz de colonizar tipos de tecidos particulares da planta. Em uma modalidade, o micróbio endofítico fica disposto sobre a semente ou muda em uma quantidade eficaz para ser detectável dentro de um tecido alvo da planta agrícola madura selecionada dentre um fruto, uma semente, uma folha, ou uma raiz, ou porção dos mesmos. Por exemplo, o o micróbio endofítico pode ser detectado em uma quantidade eficaz que será detectável em uma quantidade de pelo menos cerca de 100 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 200 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 300 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 500 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 1.000 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 3.000 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 10.000 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 30.000 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 100.000 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 10A6 CFU ou esporos ou mais, no tecido alvo da planta agrícola madura.

[00244] Em alguns casos, os micróbios dispostos sobre a semente ou muda podem ser detectados na rizosfera. Isso pode se dever à colonização bem-sucedida pelo micróbio endofítico, em que certas quantidades do micróbio são expelidas da raiz, dessa forma, colonizando a rizosfera. Em alguns casos, o micróbio localizado na rizosfera pode secretar compostos (como sideróforos ou ácidos orgânicos) que ajudam na aquisição de nutrientes pela planta. Portanto, em uma outra modalidade, o micróbio endofítico fica disposto sobre a superfície da semente em uma quantidade eficaz para colonizar de modo detectável o ambiente do solo que circunda a planta agrícola quando comparado com uma planta agrícola de referência. Por exemplo, o micróbio pode ser detectado em uma quantidade de pelo menos 100 CFU ou esporos/g DW, por exemplo, pelo menos 200 CFU ou esporos/g DW, pelo menos 500 CFU ou esporos/g DW, pelo menos 1.000 CFU ou esporos/g DW, pelo menos 3.000 CFU ou esporos/g DW, pelo menos 10.000 CFU ou esporos/g DW, pelo menos 30.000 CFU ou esporos/g DW, pelo menos 100.000 CFU ou esporos/g DW, pelo menos 300.000 CFU ou esporos/g DW, ou mais, na rizosfera.

[00245] As populações de entidades microbianas endofíticas descritas no presente documento também são capazes de proporcionar muitos benefícios agronômicos à planta hospedeira. Conforme mostrado na seção de Exemplos, as plantas inoculadas com endófito exibem germinação de semente aumentada, vigor aumentado, biomassa aumentada (por exemplo, raiz ou biomassa de broto aumentada). Portanto, em uma modalidade, a população fica disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa da planta, ou uma parte ou tecido da planta desenvolvida a partir da semente ou muda.

[00246] A biomassa aumentada é útil na produção de produto de consumo derivados da planta. Tais produto de consumo incluem uma ração animal, uma forragem para peixe, um produto de cereais, um produto alimentício para humano processado, um açúcar ou um álcool. Tais produtos podem ser um produto de fermentação ou um produto fermentável, tal produto exemplificador é um biocombustível. O aumento na biomassa pode ocorrer em uma parte da planta (por exemplo, o tecido da raiz, brotos, folhas, etc.), ou pode ser um aumento na biomassa total. Produção de biomassa aumentada, tal aumento indica pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou mais de 100% quando comparado com uma planta agrícola de referência. Tal aumento na biomassa total pode estar sob condições relativamente isentas de estresse. Em outros casos, o aumento na biomassa pode ocorrer em plantas desenvolvidas sob qualquer número de estresses abióticos ou bióticos, incluindo estresse por seca, estresse por sal, estresse por calor, estresse por frio, estresse por baixo teor de nutrientes, estresse por nematódeo, estresse de herbívoro por inseto, estresse por patógeno fúngico, estresse por patógeno bacteriano, e estresse por patógeno viral. Em uma modalidade específica, a população microbiana endofítica fica disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa de raiz em pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[00247] Em uma outra modalidade, a população microbiana endofítica fica disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a taxa de germinação de semente quando comparado com uma planta agrícola de referência. Por exemplo, o aumento na germinação de semente pode ser pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[00248] Em outros casos, o micróbio endofítico fica disposto sobre a semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa média do fruo ou espiga da planta resultante em pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[00249] Em alguns casos, as plantas são inoculadas com endófitos que são isolados da mesma espécie de planta que o elemento vegetal da planta inoculada. Por exemplo, um endófito que é naturalmente encontrado em uma variedade de Zea mays (milho) está associado a um elemento vegetal de uma planta de outra variedade de Zea mays que em seu estado natural é desprovida do dito endófito. Em uma modalidade, o endófito é derivado de uma planta de uma espécie relacionada de planta como o elemento vegetal da planta inoculada. Por exemplo, um endófito que é normalmente encontrado em Zea diploperennis Iltis et al., (diploperennial teosinte) é aplicado a um Zea mays (milho), ou vice-versa. Em alguns casos, as plantas são inoculadas com endófitos que são heterólogos ao elemento vegetal da planta inoculada. Em uma modalidade, o endófito é derivado de uma planta de outra espécie. Por exemplo, um endófito que é normalmente encontrado em dicotiledôneas é aplicado a uma planta monocotiledônea (por exemplo, inoculação de milho com um endófito derivado de soja), ou vice-versa. Em outros casos, o endófito que será inoculado em uma planta é derivado de uma espécie relacionada da planta que está sendo inoculada. Em uma modalidade, o endófito é derivado de um táxon relacionado, por exemplo, de uma espécie relacionada. A planta de outra espécie pode ser uma planta agrícola. Em uma outra modalidade, o endófito é parte de uma composição desenhada inoculada em qualquer elemento de planta hospedeira.

[00250] Como destacado na seção de Exemplos, as plantas inoculadas com a população microbiana endofítica também mostra um aumento na altura de planta total. Portanto, em uma modalidade, a presente invenção fornece uma semente que compreende uma população microbiana endofítica que fica disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a altura da planta. Por exemplo, a população microbiana endofítica fica disposta em uma quantidade eficaz para resultar em um aumento na altura da planta agrícola de modo que seja pelo menos 10% maior, por exemplo, pelo menos 20% maior, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 50% maior, pelo menos 60% maior, pelo menos 70% maior, pelo menos 80% maior, pelo menos 90% maior, pelo menos 100% maior, pelo menos 125% maior, pelo menos 150% maior ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência, a planta. Tal aumento na altura pode estar sob condições relativamente isentas de estresse. Em outros casos, o aumento na altura pode ocorrer em plantas desenvolvidas sob qualquer número de estresses abióticos ou bióticos, incluindo estresse por seca, estresse por sal, estresse por calor, estresse por frio, estresse por baixo teor de nutrientes, estresse por nematódeo, estresse de herbívoro por inseto, estresse por patógeno fúngico, estresse por patógeno bacteriano, e estresse por patógeno viral.

[00251] As plantas hospedeiras inoculadas com a população microbiana endofítica também mostra melhoras significativas em sua capacidade de utilizar água de modo mais eficiente. A eficiência de uso de água é um parâmetro frequentemente correlacionado à tolerância à seca. A eficiência de uso de água (WUE) é um parâmetro frequentemente correlacionado à tolerância à seca, e é a taxa de assimilação de CO2 por água transpirada pela planta. Um aumento na biomassa em baixa disponibilidade de água pode se dever à eficiência relativamente aprimorada de crescimento ou consumo de água reduzido. Selecionando-se traços para aperfeiçoar as culturas, uma redução no uso da água, sem uma mudança no crescimento poderia ter mérito particular em um sistema agrícola irrigado em que os custos de entrada de água eram altos. Um aumento no crescimento sem um salto correspondente no uso de água poderia ter aplicabilidade a todos os sistemas agrícolas. Em muitos sistemas agrícolas em que o suprimento não é limitador, um aumento no crescimento, mesmo que o mesmo tenha ocorrido à custa de um aumento no uso de água também aumenta o rendimento.

[00252] Quando a água do solo está esgotada ou se água não estiver disponível durante períodos de seca, os rendimentos de cultura são restringidos. O déficit hídrico da planta se desenvolve se a transpiração de folhas exceder o suprimento de água das raízes. O suprimento de água disponível está relacionado à quantidade de água retida no solo e à capacidade de a planta alcançar aquela água com seu sistema radicular. A transpiração de água das folhas está associada à fixação de dióxido de carbono por fotossíntese através do estômato. Os dois processos estão positivamente correlacionados de tal modo que o alto influxo de dióxido de carbono através de fotossíntese está estreitamente ligado à perda de água por transpiração. À medida que a água transpira da folha, o potencial hídrico da folha é reduzido e o estômato tende a fechar em um processo hidráulico que limita a quantidade de fotossíntese. Visto que o rendimento de cultura é dependente da fixação de dióxido de carbono na fotossíntese, a absorção e transpiração de água são fatores contribuintes para o rendimento de cultura. As plantas que são capazes de usar menos água para fixar a mesma quantidade de dióxido de carbono ou que são capazes de funcionar normalmente em um potencial hídrico mais baixo têm o potencial para conduzir mais fotossíntese e, desse modo, produzir mais biomassa e rendimento econômico em muitos sistemas agrícolas. Uma eficiência de uso de água aumentada da planta se refere a um tamanho ou número de frutos/núcleos.

[00253] Portanto, em uma modalidade, as plantas descritas no presente documento exibem uma eficiência de uso de água aumentada quando comparado com um crescimento agrícola de referência desenvolvido sob as mesmas condições. Por exemplo, as plantas desenvolvidas a partir das sementes que compreendem a população microbiana endofítica podem ter pelo menos 5% mais WUE, por exemplo, pelo menos 10% mais, pelo menos 20% mais, pelo menos 30% mais, pelo menos 40% mais, pelo menos 50% mais, pelo menos 60% mais, pelo menos 70% mais, pelo menos 80% mais, pelo menos 90% mais, pelo menos 100% mais WUE do que uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições. Tal aumento em WUE pode ocorrer sob condições sem déficit hídrico, ou sob condições de déficit hídrico, por exemplo, quando o teor hídrico de solo for menor ou igual a 60% de solo saturado com água, por exemplo, menor ou igual a 50%, menor ou igual a 40%, menor ou igual a 30%, menor ou igual a 20%, menor ou igual a 10% de solo saturado com água em uma base ponderal.

[00254] Em uma modalidade relacionada, a planta que compreende a população microbiana endofítica pode ter pelo menos 10% mais que o teor hídrico relativo (RWC), por exemplo, pelo menos 20% mais, pelo menos 30% mais, pelo menos 40% mais, pelo menos 50% mais, pelo menos 60% mais, pelo menos 70% mais, pelo menos 80% mais, pelo menos 90% mais, pelo menos 100% mais RWC do que uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições.

[00255] Muitos micróbios descritos no presente documento são capazes de produzir o ácido indol-3-acético de hormônio vegetal auxina (IAA) quando desenvolvidos em cultura. Auxina pode exercer uma função essencial na alteração da fisiologia da planta, incluindo a extensão de crescimento radicular. Portanto, em uma outra modalidade, a população microbiana endofítica fica disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para induzir detectavelmente a produção de auxina na planta agrícola. Por exemplo, o aumento na produção de auxina pode ser pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência. Em uma modalidade, a produção de auxina aumentada pode ser detectada em um tipo de tecido selecionado a partir do grupo que consiste na raiz, broto, folhas e flores.

[00256] Em uma outra modalidade, a população endofítica da presente invenção pode causar uma modulação detectável na quantidade de um metabólito na planta ou parte da planta. Tal modulação pode ser detectada, por exemplo, medindo-se os níveis de um dado metabólito e comparando-se com os níveis do metabólito em uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições.

FORMULAÇÕES PARA USO AGRÍCOLA

[00257] A presente invenção contempla uma combinação sintética de um elemento vegetal que está associado a um endófito para conferir um traço aprimorado de importância agronômica à planta hospedeira, ou um potencial de traço agronômico aprimorado a um elemento vegetal associado ao endófito, que durante e após a germinação irá conferir o dito benefício à planta hospedeira resultante.

[00258] Em algumas modalidades, o elemento vegetal está associado a um endófito sobre a sua superfície. Tal associação é contemplada para ocorrer através de um mecanismo selecionado a partir do grupo que consiste em: aspersão, imersão, revestimento, encapsulação, pulverização, gotejamento, aerossolização.

[00259] Em algumas modalidades, o elemento vegetal é uma folha, e a combinação sintética é formulada para aplicação como um tratamento foliar.

[00260] Em algumas modalidades, o elemento vegetal é uma semente, e a combinação sintética é formulada para aplicação como um revestimento de semente.

[00261] Em algumas modalidades, o elemento vegetal é uma raiz, e a combinação sintética é formulada para aplicação como um tratamento radicular.

[00262] Em certas modalidades, o elemento vegetal se torna associado ao(s) endófito(s) através de exposição retardada. Por exemplo, o solo no qual um elemento vegetal será introduzido é, primeiro, tratado com uma composição que compreende o endófito ou combinação de endófitos. Em um outro exemplo, a área em torno da planta ou elemento vegetal é exposta a uma formulação que compreende o(s) endófito(s), e o elemento vegetal se torna subsequentemente associado ao(s) endófito(s) devido ao movimento do solo, ar, água, insetos, mamíferos, intervenção humana, ou outros métodos.

[00263] O elemento vegetal pode ser obtido a partir de qualquer planta agrícola. Em uma modalidade, o elemento vegetal da primeira planta é de uma planta monocotiledônea. Por exemplo, o elemento vegetal da primeira planta é de uma planta de cereais. O elemento vegetal da primeira planta pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em uma semente de milho, uma semente de trigo, uma semente de cevada, uma semente de arroz, uma semente de cana-de- açúcar, uma raiz de milho, uma raiz de trigo, uma raiz de cevada, uma raiz de cana-de-açúcar, uma raiz de arroz, uma folha de milho, uma folha de trigo, uma folha de cevada, uma folha de cana-de-açúcar, ou uma folha de arroz. Em uma modalidade alternativa, o elemento vegetal da primeira planta é de uma planta dicotiledônea. O elemento vegetal da primeira planta pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em uma semente de algodão, uma semente de tomate, uma semente de canola, uma semente de pimenta, uma semente de soja, uma raiz de algodão, uma raiz de tomate, uma raiz de canola, uma raiz de pimenta, uma raiz de soja, uma folha de algodão, uma folha de tomate, uma folha de canola, uma folha de pimenta, ou uma folha de soja. Ainda em uma outra modalidade, o elemento vegetal da primeira planta pode ser de uma planta geneticamente modificada. Em uma outra modalidade, o elemento vegetal da primeira planta pode ser de um elemento vegetal híbrido.

[00264] A combinação sintética pode compreender um elemento vegetal da primeira planta que é submetida à esterilização de superfície antes da combinação com os endófitos. Tal pré-tratamento antes do revestimento da semente com endófitos remove a presença de outros micróbios que podem interferir na colonização, crescimento e/ou função ideal do endófito. A esterilização de superfície de sementes pode ser realizada sem matar as sementes conforme descrito no presente documento.

[00265] As populações de endófitos descritas no presente documento se destinam a ser úteis no aprimoramento de plantas agrícolas, e como tais, podem ser formuladas com outras composições como parte de um veículo agricolamente compatível. É contemplado que tais veículos podem incluir, mas não se limitando a: tratamento de semente, tratamento de raiz, tratamento foliar, tratamento do solo. A composição de veículo com as populações de endófitos, pode ser preparada para aplicações agrícolas como uma formulação líquida, sólida ou gasosa. A aplicação à planta pode ser realizada, por exemplo, como um pó para deposição sobre as folhas da planta, como uma aspersão à planta inteira ou elemento vegetal selecionado, como parte de um gotejamento para o solo ou raízes, ou como um revestimento sobre a semente antes do plantio. Tais exemplos destinam-se a ser ilustrativos e não limitadores ao escopo da invenção.

[00266] Em algumas modalidades, a presente invenção contempla elementos vegetais que compreendem uma população microbiana endofítica, e compreende adicionalmente uma formulação. A formulação útil dessas modalidades geralmente compreende pelo menos um membro selecionado a partir do grupo que consiste em um veículo agricolamente compatível, um acentuador de pegajosidade, um estabilizante microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento vegetal, um rodenticida, e um nutriente.

[00267] Em alguns casos, a população endofítica é misturada com um veículo agricolamente compatível. O veículo pode ser um veículo sólido ou veículo líquido. O veículo pode ser qualquer um ou mais dentre vários veículos que conferem uma variedade de propriedades, como estabilidade, molhabilidade, ou dispersibilidade aumentada. Agentes umectantes como tensoativos naturais ou sintéticos, que podem ser tensoativos não iônicos ou iônicos, ou uma combinação dos mesmos podem estar incluídos em uma composição da invenção. Emulsões de água em óleo também podem ser usadas para formular uma composição que inclui a população endofítica da presente invenção (consulte, por exemplo, Patente US n° 7.485.451, que está incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade). As formulações adequadas que podem ser preparadas incluem pós molháveis, grânulos, géis, tiras de ágar ou péletes, espessantes, e similares, partículas microencapsuladas, e similares, líquidos como fluidos aquosos, suspensões aquosas, emulsões de água em óleo, etc. A formulação pode incluir produtos de grão ou legume, por exemplo, grão moído ou feijões, caldo ou farinha derivada de grão ou feijões, amido, açúcar ou óleo.

[00268] Em algumas modalidades, o veículo agrícola pode ser o solo ou meio de crescimento vegetal. Outros veículos agrícolas que podem ser usados incluem fertilizantes, óleos à base de plantas, umectantes, ou combinações dos mesmos. Alternativamente, o veículo agrícola pode ser um sólido, como terra diatomácea, barro, sílica, alginato, argila, bentonita, vermiculita, cascas de semente, outros produtos de origem vegetal e animal, ou combinações, incluindo grânulos, péletes ou suspensões. Misturas de quaisquer dos ingredientes anteriormente mencionados também são contempladas como veículos, como, mas não limitados a, pesta (farinha e argila caulim), ágar ou péletes à base de farinha em barro, areia, ou argila, etc. As formulações podem incluir fontes alimentares para os organismos cultivados, como cevada, arroz, ou outros materiais biológicos como semente, folha, raiz, elementos vegetais, bagaço de cana-de-açúcar, cascas ou talos de processamento de grãos, material vegetal moído ou madeira de refugos de locais de construção, serragem ou pequenas fibras de reciclagem de papel, tecido ou madeira. Outras formulações adequadas serão conhecidas pelos versados na técnica.

[00269] Em uma modalidade, a formulação pode compreender um acentuador de pegajosidade ou aderente. Tais agentes são úteis para combinar a população microbiana da invenção com veículos que podem conter outros compostos (por exemplo, agentes de controle que não são biológicos), para produzir uma composição de revestimento. Tais composições podem ajudar a criar revestimentos em torno da planta ou elemento vegetal para manter o contato entre o micróbio e outros agentes com a planta ou parte da planta. Em uma modalidade, os aderentes são selecionados a partir do grupo que consiste em: alginato, gomas, amidos, lecitinas, formononetina, álcool polivinílico, álcali formononetinato, hesperetina, acetato de polivinila, cefalinas, Goma Arábica, Goma Xantana, Óleo Mineral, Polietileno Glicol (PEG), Polivinil pirrolidona (PVP), Arabino-galactana, Celulose de Metila, PEG 400, Quitosana, Poliacrilamida, Poliacrilato, Poliacrilonitrila, Glicerol, Trietileno glicol, Acetato de Vinila, Goma Gelana, Poliestireno, Polivinila, Carbóximetil celulose, Goma Ghatti, e copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxibutileno. Outros exemplos de composições aderentes que podem ser usados na preparação sintética incluem aqueles descritos no documento EP 0818135, CA 1229497, WO 2013090628, EP 0192342, WO 2008103422 e CA 1041788, cada um dos quais está incorporado no presente documento a título de referência.

[00270] A formulação também pode conter um tensoativo. Exemplos não limitadores de tensoativos incluem blendas de nitrogênio-tensoativo como Prefer 28 (Cenex), Surf-N(US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) e Patrol (Helena); óleos de sementes esterificados incluem Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) e Mes-100 (Drexel); e tensoativos à base de organo-silicone incluem Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) e Century (Precision). Em uma modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,01% v/v a 10% v/v. Em uma outra modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,1% v/v a 1% v/v.

[00271] Em certos casos, a formulação inclui um estabilizante microbiano. Tal agente pode incluir um dessecante. Conforme usado no presente documento, um "dessecante" pode incluir qualquer composto ou mistura de compostos que podem ser classificados como um dessecante independentemente de a possibilidade do composto ou compostos serem usados em tais concentrações que os mesmos, de fato, têm um efeito dessecante sobre o inoculante líquido. Tais dessecantes são idealmente compatíveis com a população endofítica usada, e deveriam promover a capacidade de a população microbiana sobreviver à aplicação aos elementos vegetais e sobreviver à dessecação. Exemplos de dessecantes adequados incluem um ou mais dentre trealose, sacarose, glicerol e Metileno glicol. Outros dessecantes adequados incluem, mas não se limitam a, açúcares não-redutores e álcoois de açúcar (por exemplo, manitol ou sorbitol). A quantidade de dessecante introduzida na formulação pode situar-se na faixa de cerca de 5% a cerca de 50% em peso/volume, por exemplo, entre cerca de 10% a cerca de 40%, entre cerca de 15% e cerca de 35%, ou entre cerca de 20% e cerca de 30%.

[00272] Em alguns casos, é vantajoso que a formulação contenha agentes como um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento vegetal, um rodenticida, e um nutriente. Tais agentes são idealmente compatíveis com o elemento vegetal agrícola ou muda ao qual a formulação é aplicada (por exemplo, não devem ser prejudiciais ao crescimento ou saúde da planta). Além disso, o agente é idealmente um que não causa preocupações de segurança para uso humano, animal ou industrial (por exemplo, nenhum problema de segurança, ou o composto é suficientemente instável que o produto de consumo vegetal derivado da planta contém quantidades desprezíveis do composto).

[00273] Na forma líquida, por exemplo, as soluções ou suspensões, as populações microbianas endofíticas da presente invenção podem ser misturadas ou suspensas em soluções aquosas. Os diluentes ou veículos líquidos adequados incluem soluções aquosas, destilados de petróleo, ou outros veículos líquidos.

[00274] As composições sólidas podem ser preparadas dispersando- se as populações microbianas endofíticas da invenção em e sobre um veículo sólido adequadamente dividido, como turfa, trigo, farelo, vermiculita, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, terra de Fuller, solo pasteurizado, e similares. Quando tais formulações forem usadas como pós molháveis, agentes dispersantes biologicamente compatíveis como agentes dispersantes e emulsificantes não iônicos, aniônicos, anfotéricos, ou catiônicos podem ser usados.

[00275] Os veículos sólidos usados na formulação incluem, por exemplo, veículos minerais como argila caulim, pirofilita, bentonita, montmorilonita, terra diatomácea, solo branco ácido, vermiculita, e perlita, e sais inorgânicos como sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, ureia, cloreto de amônio e carbonato de cálcio. Também, pós finos orgânicos como farinha de trigo, farelo de trigo e farelo de arroz podem ser usados. Os veículos líquidos incluem óleos vegetais como óleo de soja e óleo de semente de algodão, glicerol, etilenoglicol, polietileno glicol, propilenoglicol, polipropileno glicol, etc.

[00276] Em uma modalidade específica, a formulação é idealmente adequada para revestimento da população microbiana endofítica sobre os elementos vegetais. As populações microbianas endofíticas descritas na presente invenção são capazes de conferir muitos benefícios agronômicos às plantas hospedeiras. A capacidade de conferir tais benefícios revestindo-se as populações microbianas endofíticas sobre a superfície de elementos vegetais tem muitas vantagens potencias, particularmente quando usadas em uma escala comercial (agrícola).

[00277] As populações microbianas endofíticas no presente documento podem ser combinadas com um ou mais agentes descritos acima para produzir uma formulação adequada para combinação com um elemento vegetal agrícola ou muda. A população microbiana endofítica pode ser obtida a partir do crescimento em cultura, por exemplo, usando um meio de crescimento sintético. Além disso, o micróbio pode ser cultivado em meio sólido, por exemplo, em placas de Petri, raspadas e suspensas formando a preparação. Micróbios em fases de crescimento diferentes podem ser usados. Por exemplo, micróbios em fase de latência, fase logarítmica inicial, fase logarítmica intermediária, fase logarítmica tardia, fase estacionária, fase de morte precoce, ou fase de morte podem ser usados.

[00278] As formulações que compreendem a população microbiana endofítica da presente invenção contém, tipicamente, entre cerca de 0,1 a 95% em peso, por exemplo, entre cerca de 1% e 90%, entre cerca de 3% e 75%, entre cerca de 5% e 60%, entre cerca de 10% e 50% em peso úmido da população endofítica da presente invenção. É preferencial que a formulação contenha pelo menos cerca de 10A2 por ml de formulação, pelo menos cerca de IOA3 por ml de formulação, por exemplo, pelo menos cerca de 10A4, pelo menos cerca de 10A5, pelo menos cerca de 10A6, pelo menos cerca de 10A7 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 10A8 CFU ou esporos por ml de formulação.

[00279] Conforme descrito acima, em certas modalidades, a presente invenção contempla o uso de bactérias e/ou fungos endofíticos que ficam dispostos de modo heterólogo na planta, por exemplo, o elemento vegetal. Em certos casos, a planta agrícola pode conter bactérias que são substancialmente similares a, ou ainda geneticamente indistinguíveis de, bactérias que estão sendo aplicadas à planta. É observado que, em muitos casos, as bactérias que estão sendo aplicadas são substancialmente diferentes das bactérias já presentes de várias formas significativas. Primeiro, as bactérias que estão sendo aplicadas à planta agrícola foram adaptadas à cultura, ou adaptadas para serem capazes de se desenvolver em meio de crescimento em isolamento da planta. Segundo, em muitos casos, as bactérias que estão sendo aplicadas são derivadas de uma origem clonal, em vez de uma origem heteróloga e, como tais, podem ser distinguidas das bactérias que já estão presentes na planta agrícola pela similaridade clonal. Por exemplo, quando um micróbio que foi inoculado por uma planta também está presente na planta (por exemplo, em um tecido ou porção diferente da planta), ou quando o micróbio introduzido for suficientemente similar a um micróbio que está presente em algumas plantas (ou porção da planta, incluindo elementos vegetais), ainda é possível distinguir entre o micróbio inoculado e o micróbio nativo distinguindo-se entre os dois tipos de micróbios com base em seu estado epigenético (por exemplo, poderia ser esperado que as bactérias que são aplicadas, bem como sua progênie, tenham um padrão mais uniforme e similar de metilação de citosina de seu genoma, em relação à extensão e/ou localização de metilação).

ENDÓFITOS COMPATÍVEIS COM AGROQUÍMICOS

[00280] Em certas modalidades, o endófito é selecionado com base na sua compatibilidade com agroquímicos comumente usados. Como anteriormente mencionado, as plantas, particularmente plantas agrícolas, podem ser tratadas com uma ampla gama de agroquímicos, incluindo fungicidas, biocidas (agentes anticomplexo), herbicidas, inseticidas, nematicidas, rodenticidas, fertilizantes, e outros agentes.

[00281] Em alguns casos, pode ser importante que o endófito seja compatível com agroquímicos, particularmente aqueles com propriedades anticomplexo, para permanecer na planta embora, como mencionado anteriormente, haja muitos agentes anticomplexo que não penetram na planta, pelo menos em uma concentração suficiente para interferir no endófito. Portanto, quando um agente anticomplexo sistêmico for usado na planta, a compatibilidade do endófito que será inoculado com tais agentes será um critério importante.

[00282] Fungicidas. Em uma modalidade, o agente de controle é um fungicida. Como usado no presente documento, um fungicida é qualquer composto ou agente (seja químico ou biológico) que pode inibir o crescimento de um fungo ou matar um fungo. Nesse sentido, um "fungicida", como usado no presente documento, abrange compostos que podem ser fungistáticos ou fungicidas. Como usado no presente documento, o fungicida pode ser um protetor, ou agentes que são eficazes predominantemente sobre a superfície da semente, proporcionando proteção contra patógenos transmitidos pela superfície da semente e proporcionando algum nível de controle de patógenos transmitidos pelo solo. Exemplos não limitadores de fungicidas protetores incluem captano, manebe, tirame ou fludioxonil.

[00283] O fungicida pode ser um fungicida sistêmico, que pode ser absorvido na muda emergente e inibir ou matar o fungo dentro de tecidos da planta hospedeira. Os fungicidas sistêmicos usados para tratamento de semente incluem, mas não se limitam aos seguintes: azoxistrobina, carboxina, mefenoxam, metalaxil, tiabendazol, trifloxistrobina, e vários fungicidas triazóis, incluindo difenoconazol, ipconazol, tebuconazol e triticonazol. Mefenoxam e metalaxil são principalmente usados para alvejar os fungos de mofo aquáticos Pythium e Phytophthora. Alguns fungicidas são preferenciais sobre outros, dependendo da espécie da planta, devido a diferenças sutis na sensibilidade das espécies fúngicas patogênicas, ou devido às diferenças na distribuição de fungicidas ou sensibilidade das plantas.

[00284] Um fungicida pode ser um agente de controle biológico, como uma bactéria ou fungo. Tais organismos podem ser parasíticos aos fungos patogênicos, ou secretam toxinas ou outras substâncias que podem matar ou de outro modo prevenir o crescimento de fungos. Qualquer tipo de fungicida, particularmente aqueles que são comumente usados em plantas, pode ser usado como um agente de controle em uma composição de semente.

[00285] Agentes antibacterianos. Em alguns casos, a composição de revestimento de semente compreende um agente de controle que tem propriedades antibacterianas. Em uma modalidade, o agente de controle com propriedades antibacterianas é selecionado dentre os compostos descritos no presente documento. Em uma outra modalidade, o composto é Estreptomicina, oxitetraciclina, ácido oxolínico, ou gentamicina.

[00286] Reguladores de crescimento vegetal. A composição de revestimento das sementes pode compreender adicionalmente um regulador de crescimento vegetal. Em uma modalidade, o regulador de crescimento vegetal é selecionado a partir do grupo que consiste em: Ácido abscísico, amidoclor, ancimidol, 6-benzilaminopurina, brassinolídeo, butralina, clormequat (cloreto de clormequat), cloreto de colina, ciclanilida, daminozida, dikegulac, dimetipina, 2,6-dimetilpuridina, etefon, flumetralina, flurprimidol, flutiacet, forclorfenuron, ácido giberélico, inabenfida, ácido indol-3-acético, hidrazida maleico, mefluidida, mepiquat (cloreto de mepiquat), ácido naftalenoacético, N-6-benziladenina, paclobutrazol, proexadiona (proexadiona- cálcio), prohydrojasmon, tidiazuron, triapen- tenol, tributilfosforotritioato, ácido 2,3,5-tri-iodobenzoico, trinexapac-etila e uniconazol. Outros exemplos de compostos antibacterianos que podem ser uasdos como parte de uma composição de revestimento de semente incluem aqueles à base de diclorofeno e álcool benzílico hemiformal (Proxel® de ICI ou Acticide® RS de Thor Chemie e Kathon® MK de Rohm & Haas) e derivados de isotiazolinona como alquilisotiazolinonas e benzisotiazolinonas (Acticide® MBS de Thor Chemie). Outros reguladores de crescimento vegetal que podem ser incorporados nas composições de revestimento de semente são descritos no documento US 2012/0108431, que está incorporado a título de referência em sua totalidade.

[00287] Nematicidas. Os agentes de biocontrole antagonistas de nematódeo preferidos incluem as cepas ARF18; Arthrobotrys spp.; Chaetomium spp.; Cylindrocarpon spp.; Exophilia spp.; Fusarium spp.; Gliocladium spp.; Hirsutella spp.; Lecanicillium spp.; Monacrosporium spp.; Myrothecium spp.; Neocosmospora spp.; Paecilomyces spp.; Pochonia spp.; Stagonospora spp.; vesicular- arbuscular mycorrhizal fungi, Burkholderia spp.; Pasteuria spp., Brevibacillus spp.; Pseudomonas spp.; e Rhizobacteria. Os agentes de biocontrole de antagonistas de nematóeos particularmente preferidos incluem ARF18, Arthrobotrys oligospora, Arthrobotrys dactyloides, Chaetomium globosum, Cylindrocarpon heteronema, Exophilia jeanselmei, Exophilia pisciphila, Fusarium aspergilus, Fusarium solani, Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Gliocladium virens, Hirsutella rhossiliensis, Hirsutella minnesotensis, Lecanicillium lecanii, Monacrosporium drechsleri, Monacrosporium gephyropagum, Myrotehcium verrucaria, Neocosmos- pora vasinfecta, Paecilomyces lilacinus, Pochonia chlamydosporia, Stagonospora heteroderae, Stagonospora phaseoli, vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi, Burkholderia cepacia, Pasteuria penetrans, Pasteuria thornei, Pasteuria nishizawae, Pasteuria ramosa, Pastrueia usage, Brevibacillus laterosporus G4, Pseudomonas fluorescens e Rhizobacteria.

[00288] Nutrientes. Em uma outra modalidade, a composição de revestimento de semente pode compreender um nutriente. O nutriente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um fertilizante de nitrogênio incluindo, mas não se limitando a, Ureia, Nitrato de amônio, Sulfato de amônio, Soluções de nitrogênio sem pressão, Amônia líquida, Amônia anidra, Tiossulfato de amônio, Ureia revestida com enxofre, Ureia-formaldeídos, IBDU, Ureia revestida com polímero, Nitrato de cálcio, Ureaform, e Ureia de metileno, fertilizantes de fósforo como Fosfato de diamônio, Fosfato de monoamônio, Polifosfato de amônio, Superfosfato concentrado e Superfosfato triplo, e fertilizantes de potássio como Cloreto de potássio, Sulfato de potássio, Sulfato de potássio-magnésio, Nitrato de potássio. Tais composições podem existir como sais livres ou íons dentro da composição de revestimento das sementes. Alternativamente, nutrientes/fertilizantes podem ser complexados ou quelados para fornecer liberação sustentada ao longo do tempo.

[00289] Rodenticidas. Roedores como camundongos e ratos causam danos econômicos consideráveis por comerem e sujarem sementes plantadas ou armazenadas. Além disso, camundongos e ratos transmitem um grande número de doenças infecciosas como peste, febre tifoide, leptospirose, traquinose e salmonelose. Anticoagulantes como derivados de cumarina e indandiona exercem uma função importante no controle de roedores. Esses ingredientes ativos são simples de manipular, relativamente inócuos a humanos e têm a vantagem que, como resultado do início retardado da atividade, os animais que estão sendo controlados não identificam uma conexão com a isca que os mesmos ingeriram, portanto, não os evitam. Esse é um aspecto importante em particular em animais sociais como ratos, em que os indivíduos atuam como provadores. Em uma modalidade, a composição de revestimento de sementes compreende um rodenticida selecionado a partir do grupo de substâncias que consistem em 2- isovalerilindan-1,3-diona, 4-(quinoxalin-2-ilamino)benzenossulfonamida, alfa-cloridrina, fosfeto de alumínio, antu, óxido arsenoso, carbonato de bário, bistiosemi, brodifacoum, bromadiolona, brometalina, cianeto de cálcio, cloralose, clorofacinona, colecalciferol, coumaclor, coumafuril, coumatetralil, crimidina, difenacoum, difetialona, difacinona, ergocalciferol, flocoumafen, fluoroacetamida, flupropadina, cloridrato de flupropadina, cianeto de hidrogênio, iodometano, lindano, fosfeto de magnésio, brometo de metila, norbormida, fosacetim, fosfina, fósforo, pindona, arsenita de potássio, pirinurona, scilirosida, arsenita de sódio, cianeto de sódio, fluoroacetato de sódio, estriquinina, sulfato de tálio, warfarina e fosfeto de zinco.

COMPATIBILIDADE

[00290] Em uma modalidade, os isolados naturais de endófitos que são compatíveis com agroquímicos podem ser usados para inocular as plantas de acordo com os métodos descritos no presente documento. Por exemplo, os endófitos que são compatíveis com agentes anticomplexo agricolamente empregados podem ser isolados plaqueando-se uma cultura de endófitos em uma placa de Petri que compreende uma concentração eficaz do agente anticomplexo, e isolando-se as colônias de endófitos que são compatíveis com o agente anticomplexo. Em uma outra modalidade, um endófito que é compatível com um agente anticomplexo é usado nos métodos descritos no presente documento.

[00291] O endófito compatível com o bactericida também pode ser isolado em meio líquido. A cultura de endófitos pode ser plaqueada em placas de Petri se quaisquer formas de mutagênese; alternativamente, os endófitos podem ser mutagenizados usando quaisquer meios conhecidos na técnica. Por exemplo, as culturas de endófitos podem ser expostas à luz UV, irradiação gama, ou mutágenos químicos como etilmetanossulfonato (EMS) antes da seleção em meio compreendendo fungicida. Por fim, quando o mecanismo de ação de um bactericida particular for conhecido, o gene alvo pode ser especificamente modificado (tanto por deleção de gene, substituição de gene, mutagênese sítio-dirigida, etc.) para gerar um endófito que é resiliente contra o produto químico particular. É observado que os métodos descritos acima podem ser usados para isolar endófitos que são compatíveis tanto com compostos bacteriostáticos como bactericidas.

[00292] Também será entendido pelo versado na técnica que uma planta pode ser exposta a múltiplos tipos de compostos anticomplexo, simultaneamente ou em sucessão, por exemplo, em estágios diferentes de crescimento vegetal. Quando é provável que a planta alvo seja exposta a múltiplos agentes anticomplexo, um endófito que é compatível com muitos ou todos esses agroquímicos pode ser usado para inocular a planta. Um endófito que é compatível com vários agentes pode ser isolado, por exemplo, por seleção em série. Um endófito que é compatível com o primeiro agente pode ser isolado como descrito acima (com ou sem mutagênese anterior). Uma cultura do endófito resultante pode ser, então, selecionada quanto à capacidade de crescer em meio líquido ou sólido compreendendo o segundo agente (novamente, com ou sem mutagênese anterior). As colônias isoladas da segunda seleção são, então, testadas para confirmar sua compatibilidade com ambos os agentes.

[00293] Também, os endófitos que são compatíveis com biocidas (incluindo herbicidas como glifosato ou compostos anticomplexo, sejam bacteriostáticos ou bactericidas) que são agricolamente empregados podem ser isolados usando-se métodos similares àqueles descritos para isolar endófitos compatíveis. Em uma modalidade, a mutagênese da população de endófitos pode ser realizada antes da seleção com um agente anticomplexo. Em uma outra modalidade, a seleção é realizada na população de endófitos sem mutagênese anterior. Ainda em uma outra modalidade, a seleção em série é realizada em um endófito: o endófito é, primeiro, selecionado quanto à compatibilidade com um primeiro agente anticomplexo. O endófito compatível isolado é então cultivado e selecionado quanto à compatibilidade com o segundo agente anticomplexo. Dessa forma, qualquer colônia isolada é testada quanto à compatibilidade com cada, ou ambos os agentes anticomplexo para confirmar a compatibilidade com esses dois agentes.

[00294] A compatibilidade com um agente antimicrobiano pode ser determinada por vários meios conhecidos na técnica, incluindo a comparação entre a concentração inibitória mínima (MIC) dos endófitos não modificados e modificados. Portanto, em uma modalidade, a presente invenção revela um endófito modificado isolado, em que o endófito é modificado de modo que o mesmo exiba pelo menos 3 vezes mais, por exemplo, pelo menos 5 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, pelo menos 30 vezes mais ou mais MIC a um agente antimicrobiano quando comparado com o endófito não modificado.

[00295] Em um aspecto particular, são revelados no presente documento endófitos com compatibilidade aumentada com o herbicida glifosato. Em uma modalidade, o endófito tem um tempo de duplicação em meio de crescimento que compreende pelo menos 1 mM de glifosato, por exemplo, pelo menos 2 mM de glifosato, pelo menos 5mM de glifosato, pelo menos 10mM de glifosato, pelo menos 15mM de glifosato ou mais, que é não mais que 250%, por exemplo, não mais que 200%, não mais que 175%, não mais que 150%, ou não mais que 125%, do tempo de duplicação do endófito no mesmo meio de crescimento que não compreende glifosato. Em uma modalidade específica, o endófito tem um tempo de duplicação em meio de crescimento que compreende 5mM de glifosato que é não mais que 150% o tempo de duplicação do endófito no mesmo meio de crescimento que não compreende glifosato.

[00296] Em uma outra modalidade, o endófito tem um tempo de duplicação em um tecido vegetal que compreende pelo menos 10 ppM de glifosato, por exemplo, pelo menos 15 ppm de glifosato, pelo menos 20 ppm de glifosato, pelo menos 30 ppm de glifosato, pelo menos 40 ppm de glifosato ou mais, que é não mais que 250%, por exemplo, não mais que 200%, não mais que 175%, não mais que 150%, ou não mais que 125%, do tempo de duplicação do endófito e um tecido vegetal de referência que não compreende glifosato. Em uma modalidade específica, o endófito tem um tempo de duplicação em um tecido vegetal que compreende 40 ppm de glifosato que é não mais que 150% o tempo de duplicação do endófito em um tecido vegetal de referência que não compreende glifosato.

[00297] O processo de seleção descrito acima pode ser repetido para identificar isolados de endófitos que são compatíveis com vários agentes.

[00298] Os isolados candidatos podem ser testados para garantir que a seleção para compatibilidade agroquímica não resulte em perda de uma bioatividade desejada. Os isolados de endófitos que são compatíveis com agentes comumente empregados podem ser selecionados como descrito acima. O endófito compatível resultante pode ser comparado com o endófito parental em plantas em sua capacidade de promover germinação.

[00299] Os endófitos agroquímicos compatíveis gerados como descrito acima podem ser detectados em amostras. Por exemplo, quando um transgene foi introduzido para produzir o endófito compatível com o(s) agroquímico(s), o transgene pode ser usado como gene alvo para amplificação e detecção por PCR. Além disso, quando mutações pontuais ou deleções em uma porção de um gene específico ou vários genes resultam em compatibilidade com o(s) agroquímico(s), as mutações pontuais exclusivas também podem ser detectadas por PCR ou outros meios conhecidos na técnica. Tais métodos permitem a detecção do endófito mesmo que o mesmo não seja mais viável. Dessa forma, os produtos vegetais de consumo que usam os endófitos compatíveis agroquímicos no presente documento podem ser prontamente identificados empregando-se esses métodos e métodos relacionados de detecção de ácido nucleico.

ATRIBUTOS BENÉFICOS DE COMBINAÇÕES SINTÉTICAS DE ELEMENTOS VEGETAIS E ENDÓFITOS

[00300] Atributos aprimorados conferidos por endófitos. A presente invenção contempla o estabelecimento de um simbionte em um elemento vegetal. Em uma modalidade, a associação de endófito resulta em uma alteração detectável no elemento vegetal, em particular na semente ou planta inteira. A alteração detectável pode ser um aprimoramento em vários traços agronômicos (por exemplo, saúde geral melhorada, resposta aumentada a estresses bióticos ou abióticos, ou propriedades acentuada da planta ou de um elemento vegetal, incluindo frutos e grãos). Alternativamente, a alteração detectável pode ser uma alteração fisiológica ou biológica que pode ser medida por métodos conhecidos na técnica. As alterações detectáveis são descritas em mais detalhes nas seções abaixo. Como usado no presente documento, um endófito é considerado por conferir um traço agrícola aprimorado se o traço aprimorado surgiu ou não da planta, o endófito, ou a ação concertada entre a planta e o endófito. Portanto, por exemplo, se um hormônio benéfico ou produto químico for produzido pela planta ou o endófito, para propósitos da presente invenção, o endófito será considerado por conferir um traço agronômico aperfeiçoado à planta hospedeira.

[00301] Em alguns aspectos, são fornecidos no presente documento métodos para produzir uma semente de uma planta com um traço hereditariamente alterado. O traço da planta pode ser alterado sem modificação genética conhecida do genoma da planta e compreende as seguintes etapas. Primeiro, uma preparação de um endófito isolado que é heteróloga à semente da planta é fornecida, e opcionalmente processada para produzir uma formulação de endófito. A formulação de endófito é então colocada em contato com a planta. As plantas são, então, deixadas semear, e as sementes são coletadas.

[00302] Saúde geral melhorada. Também são descritas no presente documento plantas, e campos de plantas, que estão associados a endófitos benéficos, de modo que a adequação, produtividade ou saúde geral da planta ou uma porção da mesma, seja mantida, aumentado e/ou aprimorada ao longo de um período de tempo. A melhora na saúde geral da planta pode ser avaliada usando inúmeros parâmetros fisiológicos incluindo, mas não se limitando a, altura, biomassa total, biomassa da raiz e/ou broto, germinação da semente, sobrevivência de muda, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número de semente/fruto ou massa, grão de planta ou rendimento de fruto, teor de clorofila na folha, taxa fotossintética, comprimento de raiz, ou qualquer combinação dos mesmos. A saúde da planta melhorada, ou saúde de campo melhorada, também pode ser demonstrada através de resistência u resposta aumentada a um dado estresse, tanto estresse biótico como abiótico, ou uma combinação de um ou mais estresses abióticos, como fornecido no presente documento.

[00303] Outros estresses abióticos. São reveladas no presente documento plantas associadas a endófitos com resistência aumentada a um estresse abiótico. Os estresses abióticos exemplificadores incluem, mas não se limitam a:

[00304] Tolerância à seca e calor. Em alguns casos, uma planta que resulta de sementes ou outros componentes vegetais tratados com um endófito pode exibir uma alteração fisiológica, como uma compensação da redução induzida por estresse em atividade fotossintética (expressada, por exemplo, como ΔFv/Fm) após a exposição a condições de choque térmico ou seca em comparação com um controle correspondente, uma planta geneticamente idêntica que não contém os endófitos desenvolvidos nas mesmas condições. Em alguns casos, a planta associada a endófitos como revelado no presente documento pode exibir uma alteração acentuada em atividade fotossintética ΔFv(ΔFv/Fm) após o tratamento de choque térmico estresse de seca, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dias ou mais após o tratamento de choque térmico ou estresse de seca, ou até a fotossíntese terminar, em comparação com a planta de controle correspondente de estágio de desenvolvimento similar, porém não compreendendo endófitos. Por exemplo, uma planta que tem um endófito capaz de conferir tolerância ao calor e/ou seca pode exibir um ΔFv/Fm de cerca de 0,1 a cerca de 0,8 após exposição a choque térmico estresse de seca ou uma faixa de ΔFv/Fm de cerca de 0,03 a cerca de 0,8 em um dia, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou mais de 7 dias após o tratamento de choque térmico ou estresse de seca, ou até a fotossíntese terminar. Em algumas modalidades, as reduções induzidas por estresse em atividade fotossintética podem ser compensadas em pelo menos cerca de 0,25% (por exemplo, pelo menos cerca de 0,5%, pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos 100%) em comparação com a redução de atividade fotossintética em uma planta agrícola de referência correspondente após condições de choque térmico. A significância da diferença entre as plantas agrícolas associadas a endófito e de referência pode ser estabelecida demonstrando-se a significância estatística, por exemplo, em p<0,05 com uma estatística paramétrica ou não paramétrica, por exemplo, teste Qui-quadrado, testes t de Student, teste de Mann-Whitney, ou teste F baseado na suposição ou fatos conhecidos que a planta associada a endófitos e planta agrícola de referência têm genomas idênticos ou quase idênticos (comparação de isolina).

[00305] Em algumas modalidades, as plantas compreendem endófitos capazes de aumentar a tolerância ao calor e/ou seca em quantidade suficiente, de modo que o crescimento aumentado ou recuperação aprimorada de murchidão sob condições de estresse de calor ou seca seja observado. Por exemplo, uma população de endófitos descrita no presente documento pode estar presente em quantidade suficiente em uma planta, resultando em crescimento aumentado em comparação com uma planta que não contém endófitos, quando desenvolvida sob condições de seca ou condições de choque térmico, ou após tais condições. Uma tolerância ao calor e/ou seca pode ser avaliada com parâmetros fisiológicos incluindo, mas não se limitando a, altura aumentada, biomassa total, biomassa da raiz e/ou broto, germinação da semente, sobrevivência de muda, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número de semente/fruto ou massa, grão de planta ou rendimento de fruto, teor de clorofila na folha, taxa fotossintética, comprimento de raiz, recuperação de murchidão, pressão de turgidez, ou qualquer combinação dos mesmos, em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob condições similares.

[00306] Em várias modalidades, os endófitos introduzidos em microbiota de semente alterada podem conferir na planta resultante a primeira população é capaz de conferir pelo menos um traço selecionado a partir do grupo que consiste em tolerância térmica, tolerância a herbicida, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungo, resistência a vírus, resistência a bactérias, esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância a sal, rendimento aumentado, eficiência de uso de nutriente aumentada, eficiência de uso de nitrogênio aumentada, teor de proteínas aumentada, teor de carboidrato fermentável aumentado, teor de lignina reduzido, teor de antioxidante aumentado, eficiência de uso de água aumentado, vigor aumentado, eficiência de germinação aumentada, floração precoce ou aumentada, biomassa aumentada, razão de biomassa raiz-para-raiz aumentada, retenção de água no solo aumentada, ou uma combinação dos mesmos. Uma diferença entre a planta associada a endófitos e uma planta agrícola de referência também pode ser medida usando-se outros métodos conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Haake et al. (2002) Plant Physiol. 130: 639 a 648, incorporado no presente documento na íntegra, a título de referência)

[00307] Estresse Salino. Em outras modalidades, os endófitos capazes de conferir tolerância aumentada a estresse salino podem ser introduzidos em plantas. As plantas resultantes que compreendem endófitos podem exibir resistência aumentada a estresse salino, sejam medidas em termos de sobrevivência sob condições salinas, ou crescimento geral durante ou após o estresse salino. Os parâmetros fisiológicos de saúde da planta citados acima, incluindo altura, biomassa total, biomassa de raiz e/ou broto, germinação de semente, sobrevivência de muda, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, grão vegetal ou rendimento de fruto, teor de clorofila na folha, taxa fotossintética, comprimento de raiz, ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser usados para medir o crescimento, e em comparação com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas isogênicas sem os endófitos) desenvolvidas sob condições idênticas.

[00308] Em outros casos, as plantas associadas a endófitos e plantas agrícolas de referência podem ser desenvolvidas no solo ou meio de crescimento que compreende uma concentração diferente de sódio para estabelecer a concentração inibitória de sódio (expressada, por exemplo, como a concentração na qual o crescimento da planta é inibido em 50% quando comparado com plantas desenvolvidas sob nenhum estresse de sódio). Portanto, em uma outra modalidade, uma planta resultante de sementes que compreendem um endófito capaz de conferir tolerância salina descrita no presente documento exibe um aumento na concentração inibitória de sódio em pelo menos 10 mM, por exemplo pelo menos 15 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 30 mM, pelo menos 40 mM, pelo menos 50 mM, pelo menos 60 mM, pelo menos 70 mM, pelo menos 80 mM, pelo menos 90 mM, pelo menos 100 mM ou mais, quando comparado com as plantas agrícolas de referência.

[00309] Alto Teor de Metal. As plantas são organismos sésseis e, portanto, devem lidar com o ambiente no qual as mesmas são colocadas. As plantas se adaptaram a muitos mecanismos para lidar com produtos químicos e substâncias que podem ser prejudiciais à sua saúde. Os metais pesados, em particular, representam uma classe de toxinas que são altamente relevantes para o crescimento vegetal e agricultura, devido ao fato de muitas dessas estarem associadas a fertilizantes e lodo residual usados para alterar solos e podem se acumular a níveis tóxicos em campos agrícolas (Mortvedt 1996, Fertilizer Res. 43:55 a 61; Kidd et al. 2007, Chemosphere 66:1458 a 1467, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Portanto, para propósitos agrícolas, é importante gerar plantas que sejam capazes de tolerar solos que compreendem níveis elevados de metais pesados tóxicos. As plantas lidam com níveis tóxicos de metais pesados (por exemplo, níquel, cádmio, chumbo, mercúrio, arsênico ou alumínio) no solo por excreção e sequestro interno (Choi et al. 2001, Planta 213:45 a 50; Kumar et al. 1995, Environ. Sci. Technol. 29:1232 a 1238, incorporado no presente documento na íntegra, a título de referência)). Os endófitos que são capazes de conferir tolerância a metal pesado aumentada podem fazê-lo aumentando-se o sequestro do metal em certos compartimentos fora da semente ou fruto e/ou suplementando-se outros nutrientes necessários para remedir o estresse (Burd et al. 2000, Can. J. Microbiol. 46:237 a 245; Rajkumar et al. 2009, Chemosphere 77:153 a 160, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). O uso de tais endófitos em uma planta poderia permitir o desenvolvimento de combinações inovadoras de plantas-endófitos para propósitos de remediação ambiental (também conhecida como fitorremediação). Portanto, em uma modalidade, a planta que compreende endófitos mostra tolerância a metal aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob a mesma concentração de metais pesados no solo.

[00310] Alternativamente, a concentração inibitória do metal pesado pode ser determinada para planta associada a endófito e comparada com uma planta agrícola de referência sob as mesmas condições. Portanto, em uma modalidade, as plantas resultantes de sementes que compreendem um endófito capaz de conferir tolerância a metal pesado descrita no presente documento exibem um aumento na concentração inibitória de sódio em pelo menos 0,1 mM, por exemplo pelo menos 0,3 mM, pelo menos 0,5 mM, pelo menos 1 mM, pelo menos 2 mM, pelo menos 5 mM, pelo menos 10 mM, pelo menos 15 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 30 mM, pelo menos 50mM ou mais, quando comparado com as plantas agrícolas de referência.

[00311] Por fim, as plantas inoculadas com endófitos que são capazes de conferir tolerância a metal aumentada exibem um aumento na excreção de metal total de pelo menos 10%, por exemplo pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300% ou mais, quando comparado com plantas não inoculadas desenvolvidas sob as mesmas condições.

[00312] Estresse de Baixo Teor de Nutrientes. Os endófitos descritos no presente documento também podem conferir à planta uma capacidade aumentada de se desenvolver em condições limitadas de nutrientes, por exemplo, se solubilizando ou, de outro modo, se tornando disponível aos macronutrientes ou micronutrientes das plantas que são complexados, insolúveis, ou de outro modo em uma forma não disponível. Em uma modalidade, uma planta é inoculada com um endófito que confere capacidade aumentada de liberar e/ou de outro modo fornecer à planta nutrientes selecionados a partir do grupo que consiste em fosfato, nitrogênio, potássio, ferro, manganês, cálcio, molibdênio, vitaminas, ou outros micronutrientes. Tal planta pode exibir crescimento aumentado no solo que compreende quantidades limitadas de tais nutrientes quando comparado com a planta agrícola de referência. Diferenças entre a planta associada a endófitos e planta agrícola de referência podem ser medidas comparando-se a biomassa dos dois tipos de plantas desenvolvidos sob condições limitadas, ou medindo-se os parâmetros físicos descritos acima. Portanto, em uma modalidade, a planta que compreende endófito mostra tolerância aumentada a condições limitadas de nutrientes em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob a mesma concentração limitada de nutrientes no solo, como medido, por exemplo, por biomassa ou rendimento de semente aumentado de pelo menos 10%, por exemplo pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300% ou mais, quando comparado com plantas não inoculadas desenvolvidas sob as mesmas condições. Em uma outra modalidade, a planta contendo o endófito é capaz de se desenvolver sob condições de estresse de nutrientes enquanto não exibe diferença no parâmetro fisiológico em comparação com uma planta que é desenvolvida sem estresse de nutrientes. Em algumas modalidades, tal planta não exibirá diferença no parâmetro fisiológico quando desenvolvida com 2 a 5% menos nitrogênio do que práticas de cultivo médias em terras agrícolas normais, por exemplo, pelo menos 5 a 10% menos nitrogênio, pelo menos 10 a 15% menos nitrogênio, pelo menos 15 a 20% menos nitrogênio, pelo menos 20 a 25% menos nitrogênio, pelo menos 25 a 30% menos nitrogênio, pelo menos 30 a 35% menos nitrogênio, pelo menos 35 a 40% menos nitrogênio, pelo menos 40 a 45% menos nitrogênio, pelo menos 45 a 50% menos nitrogênio, pelo menos 50 a 55% menos nitrogênio, pelo menos 55 a 60% menos nitrogênio, pelo menos 60 a 65% menos nitrogênio, pelo menos 65 a 70% menos nitrogênio, pelo menos 70 a 75% menos nitrogênio, pelo menos 80 a 85% menos nitrogênio, pelo menos 85 a 90% menos nitrogênio, pelo menos 90 a 95% menos nitrogênio, ou menos, quando comparado com plantas de cultura sob condições normais durante um período de cultivo médio. Em algumas modalidades, o micróbio capaz de fornecer tolerância a estresse de nitrogênio a uma planta é diazotrófico. Em outras modalidades, o micróbio capaz de fornecer tolerância a estresse de nitrogênio a uma planta é não diazotrófico.

[00313] Estresse pelo Frio. Em alguns casos, os endófitos podem conferir à planta a capacidade de tolerar o estresse pelo frio. Há muitos métodos conhecidos para a medição da tolerância da planta ao estresse pelo frio (como analisado, por exemplo, em Thomashow (2001) Plant Physiol. 125: 89 a 93, e Gilmour et al. (2000) Plant Physiol. 124: 1854 a 1865, ambos estão incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade). Como usado no presente documento, o estresse pelo frio se refere tanto ao estresse induzido por resfriamento (0°C a 15°C) e congelamento (<0°C). Alguns cultivares de plantas agrícolas podem ser sensíveis a estresse pelo frio, porém os traços de tolerância ao frio podem ser multigênicos, tornando o processo reprodutivo difícil. Os endófitos capazes de conferir tolerância ao frio poderiam reduzir potencialmente o dano sofrido por fazendeiros em uma base anual Barka et al. 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72:7246 a 7252, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Uma resposta aprimorada ao estresse pelo frio pode ser medida por sobrevivência de plantas, produção de substâncias protetoras como antocianina, a quantidade de necrose de partes da planta, ou uma alteração na perda de rendimento de cultura, bem como os parâmetros fisiológicos usados em outros exemplos. Portanto, em uma modalidade, a planta que compreende endófitos mostra tolerância ao frio aumentada exibida em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições de estresse pelo frio.

[00314] Estresse Biótico. Em outras modalidades, o endófito protege a planta contra um estresse biótico, por exemplo, infestação de insetos, infestação de nematódeos, infecção por complexo, infecção fúngica, infecção por oomicetos, infecção por protozoários, infecção viral, e pastagem de herbívoros, ou uma combinação dos mesmos.

[00315] Insetos herbívoros. Há uma abundância de espécies de praga de inseto que podem infectar ou infestar uma ampla variedade de plantas. A infestação por pragas pode resultar em danos significativos. As pragas de insetos que infestam espécies de plantas são particularmente problemáticas na agricultura visto que as mesmas causam graves danos a culturas e reduzem significativamente os rendimentos de plantas. Uma ampla variedade de tipos diferentes de plantas é suscetível à infestação por pragas incluindo culturas comerciais como algodão, soja, trigo, cevada e milho.

[00316] Em alguns casos, os endófitos descritos no presente documento podem conferir à planta hospedeira a capacidade de repelir insetos herbívoros. Em outros casos, os endófitos podem produzir, ou induzir a produção na planta de compostos que são inseticidas ou repelentes de insetos. O inseto pode ser qualquer um dos insetos patogênicos comuns que afetam planta, particularmente plantas agrícolas.

[00317] A planta associada a endófito pode ser testada quanto à sua capacidade de resistir, ou de outro modo repelir, insetos patogênicos medindo-se, por exemplo, a carga de insetos, biomassa de plantas total, biomassa do fruto ou grão, porcentagem de folhas intactas, ou outros parâmetros fisiológicos descritos no presente documento, e comparando-se com uma planta agrícola de referência. Em uma modalidade, a planta associada a endófitos exibe biomassa aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições (por exemplo, desenvolvida lado a lado, ou adjacente, de plantas associadas a endófitos). Em outras modalidades, a planta associada a endófitos exibe rendimento de fruto ou grão aumentado em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições (por exemplo, desenvolvida lado a lado, ou adjacente, de plantas associadas a endófitos).

[00318] Nematódeos. Os nematódeos são lombrigas microscópicas que se alimentam nas raízes, fluidos, folhas e caules de mais de 2.000 culturas em fileiras, vegetais, frutas, e plantas ornamentais, causando uma perda de cultura estimada em $100 bilhões em todo o mundo e representando 13% de perdas de cultura globais devido à doença. Uma variedade de espécies de nematódeos parasíticos infectam plantas de cultura, incluindo nematódeos das galhas (RKN), nematódeos formadores de cistos e lesões. Os nematódeos das galhas, que são caracterizados por causarem a formação de galhas radiculares em locais de alimentação, têm uma faixa de hospedeiros relativamente grande e, portanto, são parasíticos em um grande número de espécies de culturas. As espécies de nematódeos formadoras de cistos e lesões têm uma faixa de hospedeiros mais limitada, porém ainda causam perdas consideráveis em culturas suscetíveis.

[00319] Os sinais de danos por nematódeos incluem nanismo e desbotamento de folhas, e murchidão das plantas durante períodos quentes. A infestação por nematódeos, entretanto, pode causar perdas de rendimento significativas sem quaisquer sintomas óbvios de doenças nas partes aéreas. As principais causas de redução de rendimento se devem a danos nas raízes subterrâneas. As raízes infectadas por SCN são ananicadas ou atrofiadas. A infestação por nematódeos também pode reduzir o número de nódulos fixadores de nitrogênio nas raízes, e podem tornar as raízes mais suscetíveis a ataques por outros nematódeos vegetais transmitidos pelo solo.

[00320] Em uma modalidade, a planta associada a endófitos tem uma resistência aumentada a um nematódeo quando comparada com uma planta agrícola de referência. Como anteriormente com insetos herbívoros, a biomassa da planta ou uma porção da planta, ou qualquer um dentre outros parâmetros fisiológicos mencionados, pode ser comparado com a planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições. As medições particularmente úteis incluem a biomassa da planta, biomassa e/ou tamanho da fruta ou grão, e biomassa da raiz total. Em uma modalidade, a planta associada a endófitos exibe biomassa aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições (por exemplo, desenvolvida lado a lado, ou adjacente, das plantas associadas a endófitos, sob condições de desafio de nematódeos). Em uma outra modalidade, a planta associada a endófitos exibe biomassa de raiz aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições (por exemplo, desenvolvida lado a lado, ou adjacente, das plantas associadas a endófitos, sob condições de desafio de nematódeos). Ainda em uma outra modalidade, a planta associada a endófitos exibe rendimento de fruta ou grão aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições (por exemplo, desenvolvida lado a lado, ou adjacente, das plantas associadas a endófitos, sob condições de desafio de nematódeos).

[00321] Patógenos Fúngicos. As doenças fúngicas são responsáveis por perdas anuais de mais de $10 bilhões em culturas agrícolas nos EUA, representam 42% de perdas de culturas globais devido à doença, e são causadas por uma grande variedade de patógenos biologicamente diversos. Estratégias diferentes foram tradicionalmente usadas para controlar as mesmas. Os traços de resistência foram criados em variedades agricolamente importantes, dessa forma, fornecendo níveis variados de resistência contra uma faixa estreita de isolados ou raças de patógenos, ou contra uma faixa mais ampla. Entretanto, isso envolve o processo longo e trabalhoso de introduzir traços desejados em linhagens comerciais por cruzamentos genéticos e, devido ao risco de pragas que evoluem para superar a resistência de planta natural, um esforço constante para criar novos traços de resistência em linhagens comerciais é exigido. Alternativamente, as doenças fúngicas foram controladas pela aplicação de fungicidas químicos. Essa estratégia geralmente resulta em controle eficiente, porém também está associada ao possível desenvolvimento de patógenos resistentes e pode estar associada a um impacto negativo sobre o ambiente. Além disso, em certas culturas, como cevada e trigo, o controle de patógenos fúngicos por fungicidas químicos é difícil ou pouco prático.

[00322] A presente invenção contempla o uso de endófitos que são capazes de conferir resistência a patógenos fúngicos à planta hospedeira. A resistência aumentada à inoculação fúngica pode ser medida, por exemplo, usando qualquer um dos parâmetros fisiológicos apresentados acima, em comparação com as plantas agrícolas de referência. Em uma modalidade, a planta associada a endófitos exibe biomassa aumentada e/ou sintomas da doença menos evidentes em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições (por exemplo, desenvolvida lado a lado, ou adjacente, das plantas associadas a endófitos, infectadas com o patógeno fúngico). Ainda em uma outra modalidade, a planta associada a endófitos exibe rendimento de fruta ou grão aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições (por exemplo, desenvolvida lado a lado, ou adjacente, das plantas associadas a endófitos, infectadas com o patógeno fúngico). Em uma outra modalidade, a planta associada a endófitos exibe crescimento de hifas reduzido em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições (por exemplo, desenvolvida lado a lado, ou adjacente, das plantas associadas a endófitos, infectadas com o patógeno fúngico).

[00323] Patógenos Virais. Estima-se que os vírus de plantas representam 18% de perdas de culturas globais devido à doença. Há vários exemplos de patógenos virais que afetam a produtividade agrícola. Em uma modalidade, o endófito fornece proteção contra tais patógenos virais de modo que a planta tenha biomassa aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições. Ainda em uma outra modalidade, a planta associada a endófitos exibe maior rendimento de frutos ou grãos, quando desafiada com um vírus, em comparação com uma planta agrícola de referência sob as mesmas condições. Ainda em uma outra modalidade, a planta associada a endófitos exibe título viral inferior, quando comparado com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições.

[00324] Patógenos do Complexo. De modo semelhante, os patógenos bacterianos endofúngicos são um problema significativo que afeta negativamente a produtividade agrícola e representam 27% de perdas de cultura globais devido à doença de plantas. Em uma modalidade, o endófito descrito no presente documento fornece proteção contra patógenos bacterianos endofúngicos de modo que a planta tenha maior biomassa em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições. Ainda em uma outra modalidade, a planta associada a endófitos exibe maior rendimento de frutos ou grãos, quando desafiada com um patógeno do complexo, em comparação com uma planta agrícola de referência sob as mesmas condições. Ainda em uma outra modalidade, a planta associada a endófitos exibe contagem de complexos inferior, quando desafiada com uma bactéria, em comparação com uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições.

[00325] Aprimoramento de outros traços. Em outras modalidades, o endófito pode conferir outros traços benéficos à planta. Os traços aprimorados podem incluir um teor nutricional aprimorado da planta ou elemento vegetal usado para consumo humano. Em uma modalidade, a planta associada a endófitos é capaz de produzir uma alteração detectável no teor de pelo menos um nutriente. Exemplos de tais nutrientes incluem aminoácido, proteína, óleo (incluindo qualquer um dentre Ácido oleico, Ácido linoleico, Ácido alfa-linoleico, Ácidos graxos saturados, Ácido palmítico, Ácido esteárico e Gorduras trans), carboidrato (incluindo açúcares como sacarose, glicose e frutose, amido, ou fibra dietética), Vitamina A, Tiamina (vit. B1), Riboflavina (vit. B2), Niacina (vit. B3), Ácido pantotênico (B5), Vitamina B6, Folato (vit. B9), Colina, Vitamina C, Vitamina E, Vitamina K, Cálcio, Ferro, Magnésio, Manganês, Fósforo, Potássio, Sódio, Zinco. Em uma modalidade, a planta associada a endófitos ou parte da mesma contém pelo menos um nutriente aumentado quando comparado com plantas agrícolas de referência.

[00326] Em outros casos, o traço aprimorado pode incluir um teor reduzido de uma substância prejudicial ou indesejável quando comparado com plantas agrícolas de referência. Tais compostos incluem aqueles que são prejudiciais quando ingeridos em grandes quantidades ou são amargos (por exemplo, ácido oxálico, amigdalina, certos alcaloides como solanina, cafeína, nicotina, quinina e morfina, taninas, cianeto). Com isso, em uma modalidade, A planta associada a endófitos ou parte da mesma contém menos substância indesejável quando comparada com a planta agrícola de referência. Em uma modalidade relacionada, o traço aprimorado pode incluir o sabor melhorado da planta ou uma parte da planta, incluindo o fruto ou semente. Em uma modalidade relacionada, o traço aprimorado pode incluir a redução de compostos indesejados produzidos por outros endófitos em plantas, como degradação de Desoxinivalenol produzido por fusário (também conhecido como vomitoxina e um fator de virulência envolvido em murcha-do-fusário de milho e trigo) em uma parte da planta, incluindo o fruto ou semente.

[00327] Em outros casos, o traço aprimorado pode ser um aumento na biomassa total da planta ou uma parte da planta, incluindo seu fruto ou semente.

[00328] A planta associada a endófitos também pode ter um estado hormonal alterado ou níveis alterados de produção de hormônios quando comparado com uma planta agrícola de referência. Uma alteração no estado hormonal pode afetar muitos parâmetros fisiológicos, incluindo tempo de floração, eficiência hídrica, dominância apical e/ou ramificação de brotos lateral, aumento no pelo radicular, e alteração no amadurecimento de frutos.

[00329] A associação entre o endófito e a planta também pode ser detectada usando outros métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os perfis bioquímicos, metabolômicos, proteômicos, genômicos, epigenômicos e/ou transcriptômicos de plantas associadas a endófitos podem ser comparados com plantas agrícolas de referência sob as mesmas condições.

[00330] As diferenças metabolômicas entre as plantas podem ser detectadas usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma amostra biológica (tecido inteiro, exsudato, seiva do floema, seiva do xilema, exsudato de raiz, etc.) de plantas agrícolas associadas a endófitos e de referência pode ser analisada essencialmente conforme descrito em Fiehn et al., (2000) Nature Biotechnol., 18, 1157 a 1161, ou Roessner et al., (2001) Plant Cell, 13, 11 a 29, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. Tais métodos metabolômicos podem ser usados para detectar diferenças em níveis em hormônio, nutrientes, metabólito secundários, exsudatos de raiz, teor de seiva de floema, teor de seiva de xilema, teor de metais pesados, e similares. Tais métodos também são úteis para detectar alterações no teor e estado de endófito; por exemplo, a presença e níveis de molécula de sinalização (por exemplo, autoindutores e feromônios), que podem indicar o estado de comportamento baseado em grupos de endófitos com base, por exemplo, na densidade de população (consulte, por exemplo Daniels et al., 2006, PNAS 103: 14965 a 14970; Eberhard et al. 1981, Biochemistry 20: 2444 a 2449, incorporado no presente documento na íntegra, a título de referência). A análise de transcriptoma (analisada, por exemplo, em Usadel & Fernie, 2013, Front. Plant Sci. 4:48, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade) de plantas agrícolas associadas a endófitos e de referência também pode ser realizada para detectar alterações na expressão de pelo menos uma transcrição, ou um conjunto ou rede de genes mediante associação de endófitos. De modo similar, alterações epigenéticas podem ser detectadas usando imunoprecipitação de DNA metilado seguido de sequenciamento de alto rendimento (Vining et al. 2013, BMC Plant Biol. 13:92, incorporado no presente documento na íntegra, a título de referência).

POPULAÇÕES DE ELEMENTOS VEGETAIS

[00331] Em um outro aspecto, a invenção, a invenção fornece uma população substancialmente uniforme de elementos vegetais que compreende uma pluralidade de elementos vegetais compreendendo a população microbiana endofítica, conforme descrito no presente documento acima. A uniformidade substancial pode ser determinada de muitas maneiras. Em alguns casos, pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais dos elementos vegetais na população, contêm a população microbiana endofítica em uma quantidade eficaz para colonizar a planta disposta sobre a superfície dos elementos vegetais. Em outros casos, pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais dos elementos vegetais na população, contêm pelo menos 100 CFU ou esporos sobre sua superfície, por exemplo, pelo menos 200 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, ou pelo menos 1.000,000 CFU ou esporos por elemento vegetal ou mais.

[00332] As combinações sintéticas da presente invenção podem ser confinadas dentro de um objeto selecionado a partir do grupo que consiste em: garrafa, vaso, ampola, embalagem, recipiente, saco, caixa, compartimento, envelope, pacote, contentor, silo, recipiente de transporte, carroceria de caminhão e cápsula. Em uma modalidade particular, a população de elementos vegetais é embalada em um saco ou recipiente adequado para venda comercial. Por exemplo, um saco contém uma unidade de peso ou contagem dos elementos vegetais que compreende a população microbiana endofítica conforme descrito no presente documento, e compreende adicionalmente um rótulo. Em uma modalidade, o saco ou recipiente contém pelo menos 1.000 elementos vegetais, por exemplo, pelo menos 5.000 elementos vegetais, pelo menos 10.000 elementos vegetais, pelo menos 20.000 elementos vegetais, pelo menos 30.000 elementos vegetais, pelo menos 50.000 elementos vegetais, pelo menos 70.000 elementos vegetais, pelo menos 80.000 elementos vegetais, pelo menos 90.000 elementos vegetais ou mais. Em uma outra modalidade, o saco ou recipiente pode compreender um peso distinto de elementos vegetais, por exemplo, pelo menos 1 lb, pelo menos 2 lbs, pelo menos 5 lbs, pelo menos 10 lbs, pelo menos 30 lbs, pelo menos 50 lbs, pelo menos 70 lbs ou mais. O saco ou recipiente compreende um rótulo que descreve os elementos vegetais e/ou dita população microbiana endofítica. O rótulo pode conter informações adicionais, por exemplo, as informações selecionadas a partir do grupo que consistem em: peso líquido, número do lote, origem geográfica dos elementos vegetais, data de teste, taxa de germinação, teor de matéria inerte, e a quantidade de ervas daninhas tóxicas, se houver alguma. Os recipientes ou embalagens adequados incluem aqueles tradicionalmente usados em comercialização de elemento vegetal. A invenção também contempla outros recipientes com capacidades de armazenamento mais sofisticadas (por exemplo, com invólucros microbiologicamente apertados ou com confinamentos à prova de gás ou água).

[00333] Em alguns casos, uma subpopulação de elementos vegetais que compreende a população microbiana endofítica é adicionalmente selecionada com base em uniformidade aumentada, por exemplo, com base em uniformidade de população microbiana. Por exemplo, elementos vegetais individuais de grupos coletados de espigas individuais, plantas individuais, terrenos individuais (representando plantas inoculadas no mesmo dia) ou campos individuais podem ser testados quanto a uniformidade de densidade microbiana, e apenas aqueles grupos que satisfazem as especificações (por exemplo, pelo menos 80% de elementos vegetais testados têm densidade mínima, como determinado por métodos quantitativos descritos em algum lugar) são combinados para fornecer a subpopulação de elementos vegetais agrícolas.

[00334] Os métodos descritos no presente documento também podem compreender uma etapa de validação. A etapa de validação pode implicar, por exemplo, desenvolver alguns elementos vegetais coletados das plantas inoculadas em plantas agrícolas maduras, e testar aquelas plantas individuais quanto à uniformidade. Tal etapa de validação pode ser realizada em elementos vegetais individuais coletados de espigas, plantas individuais, terrenos individuais (representando plantas inoculadas no mesmo dia) ou campos individuais, e testados conforme descrito acima para identificar grupos que satisfazem as especificações exigidas.

POPULAÇÕES DE PLANTAS, CAMPOS AGRÍCOLAS

[00335] Um dos principais focos dos esforços de melhoria das culturas foi selecionar variedades com traços que fornecem, além do maior retorno, a mais alta homogeneidade e uniformidade. Embora a endogamia possa produzir plantas com uma identidade genética substancial, heterogeneidade em relação à altura da planta, tempo de floração e tempo até a semeadura permanecem como impedimentos para a obtenção de um campo homogêneo de plantas. A variabilidade inevitável de planta a planta é causada por uma multiplicidade de fatores, incluindo condições ambientais irregulares e práticas de manejo. Outra possível fonte de variabilidade pode, em alguns casos, se dever à heterogeneidade da população microbiana que habita as plantas. Ao fornecer populações microbianas endofíticas sobre sêmentes e mudas, as plantas resultantes geradas germinando-se as sementes e mudas têm uma composição microbiana mais consistente, e assim se espera que produzam uma população mais uniforme de plantas.

[00336] Portanto, em um outro aspecto, a invenção proporciona uma população de plantas substancialmente uniforme. A população compreende pelo menos 100 plantas, por exemplo, pelo menos 300 plantas, pelo menos 1.000 plantas, pelo menos 3.000 plantas, pelo menos 10.000 plantas, pelo menos 30.000 plantas, pelo menos 100.000 plantas ou mais. As plantas são cultivadas a partir das sementes que compreendem a população microbiana endofítica, tal como descrito no presente documento. O aumento da uniformidade das plantas pode ser medido de várias maneiras diferentes.

[00337] Em uma modalidade, há uma uniformidade aumentada em relação aos micróbios dentro da população de plantas. Por exemplo, em uma modalidade, uma porção substancial da população de plantas, por exemplo pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das sementes ou plantas em uma população, contém um número limiar da população microbiana endofítica. O número limiar pode ser pelo menos 100 CFU ou esporos, por exemplo pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos ou mais, na planta ou uma parte da planta. Alternativamente, em uma porção substancial da população de plantas, por exemplo, em pelo menos 1%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das plantas na população, a população microbiana endofítica que é fornecida à semente ou muda representa pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, ou 100% da população microbiana total na planta/semente.

[00338] Em uma outra modalidade, há uma uniformidade aumentada em relação a um parâmetro fisiológico das plantas dentro da população. Em alguns casos, pode haver uma uniformidade aumentada na altura das plantas quando comparado com uma população de plantas agrícolas de referência desenvolvidas sob as mesmas condições. Por exemplo, pode haver uma redução no desvio padrão na altura das plantas na população de pelo menos 2%, por exemplo, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60% ou mais, quando comparado com uma população de plantas agrícolas de referência desenvolvidas sob as mesmas condições. Em outros casos, pode haver uma redução no desvio padrão no tempo de floração das plantas na população de pelo menos 2%, por exemplo, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60% ou mais, quando comparado com uma população de plantas agrícolas de referência desenvolvidas sob as mesmas condições.

PRODUTO VEGETAL DE CONSUMO

[00339] A presente invenção fornece um produto vegetal de consumo, bem como métodos para produzir um produto vegetal de consumo, que é derivado de uma planta da presente invenção. Conforme usado no presente documento, um "produto vegetal de consumo" refere-se a qualquer composição ou produto que é composto de material derivado de uma planta, semente, célula vegetal ou parte de planta da presente invenção. Os produtos vegetais de consumo podem ser vendidos aos consumidores e podem ser viáveis ou não viáveis Os produtos vegetais de consumo não-viáveis incluem, mas não se limitam a, sementes e grãos não viáveis; sementes processadas, partes de sementes e partes de plantas; tecido vegetal desidratado, tecido vegetal congelado e tecido vegetal processado; sementes e partes de plantas processadas para ração para consumo de animais terrestres e /ou aquáticos, óleo, refeição, farinha, flocos, farelo, fibra, papel, chá, café, silagem, triturado de cereais integrais e qualquer outro alimento para consumo humano e animal; e biomassas e produtos combustíveis; e matéria-prima na indústria. Usos industriais de óleos derivados das plantas agrícolas descritas no presente documento incluem ingredientes para tintas, plásticos, fibras, detergentes, cosméticos, lubrificantes e biodiesel. O óleo de soja pode ser dividido, interesterificado, sulfurado, epoxidado, polimerizado, etoxilado ou clivado. Projetando-se e produzindo-se derivados de óleo de soja com funcionalidade melhorada e oleoquímica melhorada é um campo em rápido crescimento. A mistura típica de triglicéridos é normalmente dividida e separada em ácidos graxos puros, que são então combinados com álcoois ou ácidos derivados de petróleo, nitrogênio, sulfonatos, cloro, ou com álcoois graxos derivados de gorduras e óleos para produzir o tipo desejado de óleo ou gordura. Os produtos vegetais de consumo também incluem compostos industriais, tais como uma grande variedade de resinas utilizadas na formulação de adesivos, filmes, plásticos, tintas, revestimentos e espumas.

[00340] Em alguns casos, os produtos vegetais de consumo derivados das plantas, ou que usam os métodos da presente invenção podem ser facilmente identificados. Em alguns casos, por exemplo, a presença de micróbios endofíticos viáveis pode ser detectada usando os métodos descritos no presente documento. Em outros casos, particularmente quando não há micróbios endofíticos viáveis, o produto vegetal de consumo ainda pode conter pelo menos uma quantidade detectável do DNA específico e exclusivo correspondente aos micróbios descritos no presente documento. Qualquer método padrão de detecção de moléculas polinucleotídicas pode ser usado, incluindo métodos de detecção revelados no presente documento.

[00341] Ao longo do relatório descritivo, a palavra "compreender", ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um número inteiro declarado ou grupo de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

MÉTODOS DE USO DE ENDÓFITOS E COMPOSIÇÕES SINTÉTICAS COMPREENDENDO ENDÓFITOS

[00342] Conforme descrito no presente documento, populações de endófitos purificados e composições que compreendem as mesmas (por exemplo, formulações) podem ser usadas para conferir traços benéficos à planta hospedeira incluindo, por exemplo, um ou mais dos seguintes: teor de óleo alterado, teor de proteína alterada, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, e composição de proteína de semente alterada, tolerância a produtos químicos, tolerância ao frio, senescência retardada, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da espiga, melhora do crescimento, melhora da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicida, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, arquitetura de raiz aprimorada, eficiência de uso de água aumentada, biomassa aumentada, comprimento de raiz aumentado, peso de semente aumentado, comprimento de broto aumentado, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições limitadas de água, massa de núcleo, teor de umidade de núcleo, tolerância a metal, número de espigas, número de núcleos por espiga, número de vagens, melhora da nutrição, resistência a patógenos, resistência a pragas, melhora da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, stay-green, melhora de vigor, peso seco aumentado de sementes maduras, peso fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta, teor de clorofila aumentado, número de vagens por planta aumentado, comprimento de vagens por planta aumentado, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta, e número aumentado de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de um transcrição, e uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência. Por exemplo, em algumas modalidades, uma população de endófitos purificados pode aperfeiçoar dois ou mais desses traços benéficos, por exemplo, eficiência no uso da água e tolerância aumentada à seca. Tais traços podem ser herdáveis pela progênie da planta agrícola à qual o endófito foi aplicado pela progênie da planta agrícola que foi cultivada a partir da semente associada ao endófito.

[00343] Em um aspecto da invenção, os endófitos conferem à planta hospedeira uma capacidade melhorada de lidar com condições hídricas limitadas.

[00344] Em alguns casos, o endófito pode produzir um ou mais compostos e/ou ter uma ou mais atividades, por exemplo, uma ou mais das seguintes: produção de um metabolito, produção de uma fitormônio tal como auxina, produção, produção de acetoína, produção de um composto antimicrobiano, produção de um sideróforo, produção de uma celulase, produção de uma pectinase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase, fixação de nitrogênio ou solubilização de fosfato mineral. Por exemplo, um endófito pode produzir um fitormônio selecionado a partir do grupo que consiste em uma auxina, uma citoquinina, uma giberelina, etileno, um brassinosteroide e ácido abscísico. EM uma modalidade específica, o endófito produz auxina (por exemplo, ácido indol-3-acético (IAA)). A produção de auxina pode ser analisada como descrito no presente documento. Muitos micróbios descritos no presente documento são capazes de produzir o ácido indol- 3-acético de hormônio vegetal auxina (IAA) quando desenvolvidos em cultura. Auxina exerce uma função essencial na alteração da fisiologia da planta, incluindo a extensão de crescimento radicular. Portanto, em uma outra modalidade, a população endofítica endofúngica fica disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar detectavelmente a produção de auxina na planta agrícola quando comparado com uma planta agrícola de referência. Em uma modalidade, a produção de auxina aumentada pode ser detectada em um tipo de tecido selecionado a partir do grupo que consiste na raiz, broto, folhas e flores.

[00345] Em algumas modalidades, o endófito pode produzir um composto com propriedades antimicrobianas. Por exemplo, o composto pode ter propriedades antibacterianas, como determinado pelos ensaios de crescimento fornecidos no presente documento. Em uma modalidade, o composto com propriedades antibacterianas apresenta atividade bacteriostática ou bactericida contra E. coli e/ou Bacillus sp. Em uma outra modalidade, o endófito produz um composto com propriedades antifúngicas, por exemplo, atividade fungicida ou fungistática contra S. cerevisiae e/ou Rhizoctonia.

[00346] Em algumas modalidades, o endófito é um fungo capaz de fixação de nitrogênio e, dessa forma, é capaz de produzir amônio a partir de nitrogênio atmosférico. A capacidade de um fungo fixar nitrogênio pode ser confirmada testando-se o crescimento do fungo em meio de crescimento isento de nitrogênio, por exemplo, meio LGI, como descrito no presente documento.

[00347] Em algumas modalidades, o endófito pode produzir um composto que aumenta a solubilidade do fosfato mineral no meio, isto é, a solubilização mineral do fosfato, por exemplo, utilizando os ensaios de crescimento como descrito no presente documento. Em uma modalidade, o endófito produz um composto que permite que a bactéria cresça em meio de crescimento compreendendo Ca3HPO4 como a única fonte de fosfato.

[00348] Em algumas modalidades, o endófito pode produzir um sideróforo. Sideróforos são pequenos agentes quelantes de ferro de alta afinidade secretados por microrganismos que aumentam a biodisponibilidade de ferro A produção de sideróforos pelo endófito pode ser detectada, por exemplo, utilizando-se os métodos descritos no presente documento, bem como em outros lugares (Perez-Miranda et al., 2007, J. Microbiol Methods. 70:127 a 31, incorporado no presente documento na íntegra, a título de referência).

[00349] Em algumas modalidades, o endófito pode produzir uma enzima hidrolítica. Por exemplo, em uma modalidade, um endófito pode produzir uma enzima hidrolítica selecionada a partir do grupo que consiste em uma celulase, uma pectinase, uma quitinase e uma xilanase. As enzimas hidrolíticas podem ser detectadas usando os métodos descritos no presente documento (consulte também, celulase: Quadt-Hallmann et al., (1997) Can. J. Microbiol., 43: 577 a 582; pectinase: Soares et al. (1999). Revista de Microbiolgia 30(4): 299 a 303; quitinase: Li et al., (2004) Mycologia 96: 526 a 536; e xilanase: Suto et al., (2002) J Biosci Bioeng. 93:88 a 90, cada uma das quais está incorporada a título de referência, em sua totalidade).

[00350] Em algumas modalidades, as combinações sintéticas compreendem populações endófitas endofúngicas sinérgicas. Como usado no presente documento, o termo "populações endofíticas sinérgicas" refere-se a duas ou mais populações de endófitos que produzem um ou mais efeitos (por exemplo, dois ou mais ou três ou mais efeitos) que são maiores do que a soma de seus efeitos individuais. Por exemplo, em algumas modalidades, uma população de endófitos purificados conta com dois ou mais endófitos diferentes que são capazes de aumentar sinergicamente pelo menos por exemplo, a produção de uma fitormônio como a auxina, a produção de acetoína, a produção de um composto antimicrobiano, a produção de um sideróforo, a produção de uma celulase, a produção de uma pectinase, a produção de uma quitinase, produção de uma xilanase, fixação de nitrogênio ou solubilização de fosfato mineral em uma planta agrícola. O aumento sinérgico de uma ou mais dessas propriedades pode aumentar um traço benéfico em uma planta agrícola, como um aumento na tolerância à seca.

[00351] Em algumas modalidades, uma população endofúngica purificada compreendendo um ou mais endófitos pode aumentar uma ou mais propriedades tais como a produção de um fitormônio tal como auxina, a produção de acetoína, a produção de um composto antimicrobiano, a produção de um sideróforo, a produção de uma celulase, a produção de uma pectinase, a produção de uma quitinase, a produção de uma xilanase ou a solubilização de fosfato mineral em uma planta agrícola, sem aumentar a fixação de nitrogênio na planta agrícola.

[00352] Em algumas modalidades, os metabólitos em plantas podem ser modulados fazendo combinações sintéticas de populações endofíticas purificadas. Por exemplo, um endófito descrito no presente documento pode causar uma modulação detectável (por exemplo, um aumento ou redução) no nível de vários metabólitos, por exemplo, ácido indol-3-carboxílico, trans-zeatina, ácido abscísico, ácido faseico, ácido indol-3-acético, ácido indol-3-acético, ácido indol-3-butírico, ácido indol- 3-acrílico, ácido jasmônico, metil éster do ácido jasmônico, ácido di- hidrofaseico, gibberelina A3, ácido salicílico, mediante a colonização de uma planta.

[00353] Em algumas modalidades, o endófito modula diretamente o nível do metabólito (por exemplo, o próprio micróbio produz o metabólito, resultando em um aumento global do nível do metabólito encontrado na planta). Em outros casos, a planta agrícola, como resultado da associação com o micróbio endofítico (por exemplo, um endófito), exibe um nível modulado do metabólito (por exemplo, a planta reduz a expressão de uma enzima biossintética responsável pela produção do metabólito como resultado da inoculação de micróbios). Ainda em outros casos, a modulação no nível do metabólito é uma sequência da atividade tanto do micróbio como da planta (por exemplo, a planta produz quantidades aumentadas do metabólito quando comparada com uma planta agrícola de referência e o micróbio endofítico também produz o metabólito). Portanto, como usado no presente documento, uma modulação no nível de um metabólito pode ser uma alteração no nível do metabólito através das ações do micróbio e/ou da planta inoculada.

[00354] Os níveis de um metabólito podem ser medidos em uma planta agrícola e comparados com os níveis do metabólito em uma planta agrícola de referência e cultivados sob as mesmas condições que a planta inoculada. A planta não inoculada que é usada como uma planta agrícola de referência é uma planta que não foi aplicada a uma formulação com o micróbio endofítico (por exemplo, uma formulação que compreende uma população de endófitos purificados). A planta não inoculada usada como a planta agrícola de referência é, em geral, a mesma espécie e cultivar que, e é isogênica à, a planta inoculada.

[00355] O metabólito cujos níveis são modulados (por exemplo, aumentados ou reduzidos) na planta associada ao endófito pode servir como um nutriente primário (isto é, fornece nutrição para os seres humanos e/ou animais que consomem a planta, o tecido vegetal, ou o produto vegetal de consumo derivado da mesma, incluindo, mas não se limitando a, um açúcar, um amido, um carboidrato, uma proteína, um óleo, um ácido graxo ou uma vitamina). O metabólito pode ser um composto que é importante para o crescimento, o desenvolvimento ou a homeostase da planta (por exemplo, um fitormônio como uma auxina, citoquinina, giberelina, um brassinosteroide, etileno ou ácido abscísico, uma molécula de sinalização ou um antioxidante). Em outras modalidades, o metabólito pode ter outras funções. Por exemplo, em uma modalidade, um metabólito pode ter propriedades bacteriostáticas, bactericidas, fungistáticas, fungicidas ou antivirais. Em outras modalidades, o metabólito pode ter propriedades repelentes de insetos, inseticidas, repelentes de nematódeos, ou nematicidas. Ainda em outras modalidades, o metabólito pode exercer uma função na proteção da planta contra estresses, pode ajudar a melhorar o vigor da planta ou a saúde geral da planta. Em ainda outra modalidade, o metabólito pode ser um composto útil para produção industrial. Por exemplo, o próprio metabólito pode ser um composto útil que é extraído para uso industrial, ou servir como um intermediário para a síntese de outros compostos utilizados na indústria. Em uma modalidade particular, o nível do metabólito é aumentado dentro da planta agrícola ou uma porção da mesma de modo que o mesmo esteja presente em uma concentração de pelo menos 0,1 ug/g em peso seco, por exemplo, pelo menos 0,3 ug/g em peso seco, 1,0 ug/g em peso seco, 3,0 ug/g em peso seco, 10 ug/g em peso seco, 30 ug/g em peso seco, 100 ug/g em peso seco, 300 ug/g em peso seco, 1 mg/g em peso seco, 3 mg/g em peso seco, 10 mg/g em peso seco, 30 mg/g em peso seco, 100 mg/g em peso seco ou mais, da planta ou porção da mesma.

[00356] Também, a modulação pode ser uma redução no nível de um metabólito. A redução pode estar em um metabólito que afeta o sabor de uma planta ou de um produto vegetal de consumo derivado de uma planta (por exemplo, um composto de sabor amargo), ou em um metabólito que torna uma planta ou o produto vegetal de consumo resultante de outro modo menos útil (por exemplo, a redução do teor de oxalato em certas plantas, ou compostos prejudiciais à saúde humana e/ou animal). O metabólito cujo nível deve ser reduzido pode ser um composto que afeta a qualidade de um produto vegetal de consumo (por exemplo, redução dos níveis de lignina).

[00357] Em algumas modalidades, o endófito é capaz de gerar uma rede de complexos na planta ou ambiente circundante da planta, tal rede é capaz de causar uma modulação detectável no nível de um metabólito na planta hospedeira.

[00358] Em uma modalidade particular, o metabólito pode servir como uma molécula de sinalização ou reguladora. A via de sinalização pode estar associada com uma resposta a um estresse, por exemplo, uma das condições de estresse selecionadas a partir do grupo que consiste em estresse por seca, estresse salino, estresse por calor, estresse por frio, estresse por baixo teor nutricional, estresse por nematódeos, estresse por insetos herbívoros, estresse de patógenos fúngicos, estresse de patógenos de complexos e estresse de patógenos virais

[00359] A planta agrícola inoculada é cultivada sob condições de modo que o nível de um ou mais metabólitos seja modulado na planta, em que a modulação é indicativa de resistência aumentada a um estresse selecionado a partir do grupo que consiste em estresse por seca, estresse salino, estresse por calor, estresse por frio, estresse por baixo teor nutricional, estresse por nematódeos, estresse por insetos herbívoros, estresse por fungos patogênicos, estresse por patógenos de complexos e estresse por patógenos virais. A resistência aumentada pode ser medida cerca de 10 minutos após a aplicação do estresse, por exemplo, cerca de 20 minutos, 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 4 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, cerca de 16 horas, Cerca de 20 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 72 horas, cerca de 96 horas, cerca de 120 horas, ou cerca de uma semana após a aplicação do estresse.

[00360] Os metabólitos ou outros compostos descritos no presente documento podem ser detectados utilizando qualquer método adequado incluindo, mas não se limitando a eletroforese em gel, cromatografia em fase líquida e em fase gasosa, tanto individualmente como acoplados à espectrometria de massa (Consulte, por exemplo, as seções dos Exemplos abaixo) RMN (Consulte, por exemplo, a publicação da patente US 20070055456, que está incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade), imunoensaios (ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA)), ensaios químicos, espectroscopia e similares. Em algumas modalidades, sistemas comerciais para cromatografia e análise por RMN são utilizados.

[00361] Em outras modalidades, os metabólitos ou outros compostos são detectados usando técnicas de imageamento óptico como espectroscopia de ressonância magnética (MRS), imageamento por ressonância magnética (MRI), tomografias computadorizadas CAT, ultrassom, imageamento de tecidos baseado em MS ou métodos de detecção de raios X (por exemplo, detecção por fluorescência de raios X com energia dispersiva).

[00362] Qualquer método adequado pode ser utilizado para analisar a amostra biológica (por exemplo, semente ou tecido vegetal) para determinar a presença, ausência ou nível(is) de um ou mais metabólitos ou outros compostos na amostra. Os métodos adequados incluem cromatografia (por exemplo, HPLC, cromatografia gasosa, cromatografia líquida), espectrometria de massa (por exemplo, MS, MS-MS), LC-MS, ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA), ligação de anticorpo, outras técnicas imunoquímicas, reações ou ensaios bioquímicos ou enzimáticos, e combinações dos mesmos. Os níveis de um ou mais dos compostos ou metabólitos citados podem ser determinados nos métodos da presente invenção. Por exemplo, o(s) nível(is) de um metabólito ou composto, dois ou mais metabólitos, três ou mais metabólitos, quatro ou mais metabólitos, cinco ou mais metabólitos, seis ou mais metabólitos, sete ou mais metabólitos, oito ou mais metabólitos, nove ou mais metabólitos, dez ou mais metabólitos, ou compostos, etc, incluindo uma combinação de alguns ou todos os metabólitos ou compostos incluindo, mas não limitando a, aqueles revelados no presente documento pode ser determinada e utilizada em tais métodos.

[00363] Conforme mostrado nos Exemplos e, de outro modo, no presente documento, as plantas inoculadas ao endófito exibem teor de óleo alterado, teor de proteína alterada, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, e composição de proteína de semente alterada, tolerância a produtos químicos, tolerância ao frio, senescência retardada, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da espiga, melhora do crescimento, melhora da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicida, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, arquitetura de raiz aprimorada, eficiência de uso de água aumentada, biomassa aumentada, comprimento de raiz aumentado, peso de semente aumentado, comprimento de broto aumentado, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições limitadas de água, massa de núcleo, teor de umidade de núcleo, tolerância a metal, número de espigas, número de núcleos por espiga, número de vagens, melhora da nutrição, resistência a patógenos, resistência a pragas, melhora da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, stay-green, melhora de vigor, peso seco aumentado de sementes maduras, peso fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta, teor de clorofila aumentado, número de vagens por planta aumentado, comprimento de vagens por planta aumentado, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta, e número aumentado de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de um transcrição, e uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência, ou uma combinação dos mesmos. Portanto, em uma modalidade, a população endofítica endofúngica fica disposta sobre a superfície ou em ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa da planta, ou uma parte ou tecido da planta desenvolvida a partir da semente ou muda. A biomassa aumentada é útil na produção de produto de consumo derivados da planta. Tais produto de consumo incluem uma ração animal, uma forragem para peixe, um produto de cereais, um produto alimentício para humano processado, um açúcar ou um álcool. Tais produtos podem ser um produto de fermentação ou um produto fermentável, tal produto exemplificador é um biocombustível. O aumento na biomassa pode ocorrer em uma parte da planta (por exemplo, o tecido da raiz, brotos, folhas, etc.), ou pode ser um aumento na biomassa total quando comparado com uma planta agrícola de referência. Tal aumento na biomassa total pode estar sob condições relativamente isentas de estresse. Em outros casos, o aumento na biomassa pode ocorrer em plantas desenvolvidas sob qualquer número de estresses abióticos ou bióticos, incluindo estresse por seca, estresse por sal, estresse por calor, estresse por frio, estresse por baixo teor de nutrientes, estresse por nematódeo, estresse por insetos herbívoros, estresse por patógeno fúngico, estresse por patógeno de complexos, e estresse por patógeno viral.

[00364] Em uma outra modalidade, a população endofítica endofúngica fica disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a taxa de germinação de semente quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[00365] Em outros casos, o micróbio endofúngico fica disposto sobre a semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa média do fruto ou espiga da planta resultante quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[00366] As plantas inoculadas com uma população endofítica endofúgica também podem mostrar um aumento na altura total da planta. Portanto, em uma modalidade, a presente invenção fornece uma semente que compreende uma população endofítica endofúngica que fica disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a altura da planta. Por exemplo, a população endofítica endofúngica fica disposta em uma quantidade eficaz para resultar em um aumento na altura da planta agrícola quando comparada com uma planta agrícola de referência. Tal aumento na altura pode estar sob condições relativamente isentas de estresse. Em outros casos, o aumento na altura pode ocorrer em plantas desenvolvidas sob qualquer número de estresses abióticos ou bióticos, incluindo estresse por seca, estresse por sal, estresse por calor, estresse por frio, estresse por baixo teor de nutrientes, estresse por nematódeo, estresse de herbívoro por inseto, estresse por patógeno fúngico, estresse por patógeno bacteriano, ou estresse por patógeno viral.

[00367] As plantas hospedeiras inoculadas com a população endofítica endofúngica também mostra melhoras significativas em sua capacidade de utilizar água de modo mais eficiente. A eficiência de uso de água é um parâmetro frequentemente correlacionado à tolerância à seca. A eficiência de uso de água (WUE) é um parâmetro frequentemente correlacionado à tolerância à seca, e é a taxa de assimilação de CO2 por quantidade de água transpirada pela planta. Um aumento na biomassa em baixa disponibilidade de água pode se dever à eficiência relativamente aprimorada de crescimento ou consumo de água reduzido. Selecionando-se traços para aperfeiçoar as culturas, uma redução no uso da água, sem uma mudança no crescimento poderia ter mérito particular em um sistema agrícola irrigado em que os custos de entrada de água eram altos. Um aumento no crescimento sem um salto correspondente no uso de água poderia ter aplicabilidade a todos os sistemas agrícolas. Em muitos sistemas agrícolas em que o suprimento não é limitador, um aumento no crescimento, mesmo que o mesmo tenha ocorrido à custa de um aumento no uso de água também aumenta o rendimento.

[00368] Quando a água do solo está esgotada ou se água não estiver disponível durante períodos de seca, os rendimentos de cultura são restringidos. O déficit hídrico da planta se desenvolve se a transpiração de folhas exceder o suprimento de água das raízes. O suprimento de água disponível está relacionado à quantidade de água retida no solo e à capacidade de a planta alcançar aquela água com seu sistema radicular. A transpiração de água das folhas está associada à fixação de dióxido de carbono por fotossíntese através do estômato. Os dois processos estão positivamente correlacionados de tal modo que o alto influxo de dióxido de carbono através de fotossíntese está estreitamente ligado à perda de água por transpiração. À medida que a água transpira da folha, o potencial hídrico da folha é reduzido e o estômato tende a fechar em um processo hidráulico que limita a quantidade de fotossíntese. Visto que o rendimento de cultura é dependente da fixação de dióxido de carbono na fotossíntese, a absorção e transpiração de água são fatores contribuintes para o rendimento de cultura. As plantas que são capazes de usar menos água para fixar a mesma quantidade de dióxido de carbono ou que são capazes de funcionar normalmente em um baixo potencial hídrico, são mais eficazes e, dessa forma, são capazes de produzir mais biomassa e rendimento econômico em muitos sistemas agrícolas. Uma eficiência de uso de água aumentada da planta se refere a um tamanho ou número de frutos/núcleos.

[00369] Portanto, em uma modalidade, as plantas descritas no presente documento exibem uma eficiência de uso de água (WUE) aumentada quando comparado com um crescimento agrícola de referência desenvolvido sob as mesmas condições. Tal aumento em WUE pode ocorrer sob condições sem déficit hídrico, ou sob condições de déficit hídrico, por exemplo, quando o teor hídrico de solo for menor ou igual a 60% de solo saturado com água, por exemplo, menor ou igual a 50%, menor ou igual a 40%, menor ou igual a 30%, menor ou igual a 20%, menor ou igual a 10% de solo saturado com água em uma base ponderal. Em algumas modalidades, as plantas inoculadas com a população endofítica endófugica mostram rendimento aumentado sob condições não irrigadas, em comparação com plantas agrícolas de referência cultivadas sob as mesmas condições.

[00370] Em uma modalidade relacionada, a planta que compreende endófito pode ter um teor hídrico relativo mais elevado (RWC), do que uma planta agrícola de referência cultivada sob as mesmas condições.

[00371] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes com referência aos exemplos abaixo, entende-se que podem ser feitas várias modificações sem se afastar do espírito da invenção. Por exemplo, embora os exemplos particulares abaixo possam ilustrar os métodos e modalidades descritos no presente documento utilizando uma planta específica, os princípios nestes exemplos podem ser aplicados a qualquer cultura agrícola. Portanto, será entendido que o escopo desta invenção é abrangido pelas modalidades das invenções citadas no presente documento e do relatório descritivo em vez dos exemplos específicos que são exemplificados abaixo. Todas as patentes e publicações citadas referidas neste pedido estão incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. ANÁLISE INDEPENDENTE DE CULTIVO DE TÁXONS MICROBIANOS EM COMUNIDADES DE SEMENTES AGRICOLA- MENTE RELEVANTES COM BASE EM SEQUENCIAMENTO DE ALTO RENDIMENTO DE GENE MARCADOR DESCRIÇÃO DE EXEMPLOS

[00372] Os táxons microbianos encontrados em comunidades agricolamente relevantes foram identificados usando sequenciamento de alto rendimento de gene marcador em várias culturas e inúmeras variedades de sementes.

DESCRIÇÃO EXPERIMENTAL

[00373] Empregando-se o sequenciamento de alto rendimento de genes marcadores para bactérias, arqueas e fungos em sementes de 50 cultivares comerciais, 22 selvagens e 33 locais de milho; 40 cultivares comerciais, 13 selvagens e 23 locais de trigo; 13 sementes de algodão; e 24 sementes de soja. As variedades não comerciais foram obtidas a partir de USDA GRIN através do seu sistema de Germoplasma de Plantas Nacional (http://www.ars-grin.gov/npgs/). Acessos foram categorizados em variedades locais, selvagens e endocruzados com base na avaliação do estado de melhoria. A fim de extrair o DNA microbiano, as sementes foram embebidas em água estéril, isenta de DNA durante 48 h para amaciá-las, e foram esterilizadas à superfície utilizando etanol a 95% para reduzir os micróbios contaminantes superficiais. As sementes foram, então, moídas usando um pilão e almofariz tratados com etanol a 95% e RNAse Away (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) para remover o DNA contaminante. O DNA foi extraído das sementes moídas usando o kit de extração de DNA PowerPlant Pro (Mo Bio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

[00374] Os genes marcadores foram amplificados e sequenciados a partir do DNA extraído utilizando um protocolo de alto rendimento semelhante ao de (Fierer et al., 2012, McGuire et al., 2013). Para as análises de bactérias e arqueas, a região hipervariável V4 do gene 16S rRNA foi alvejada (iniciadores 515f/806r), e para fungos, a primeira região espaçadora transcrita interna (ITS1) do operon rRNA (iniciadores ITS1f/ITS2r) foi alvejada. Os dois genes marcadores foram amplificados por PCR separadamente utilizando 35 ciclos, e foram utilizados iniciadores de código de barras de 12 pb com correção de erro específicos para cada amostra para facilitar a combinação de amostras. Para reduzir a amplificação do cloroplasto e do DNA mitocondrial, foram usados grampos PNA específicos para os genes rRNA nestas organelas (Lundberg et al., 2013). As reações de PCR para amplificar genes de rRNA 16S seguiram o protocolo de (Lundberg et al., 2013), e aqueles para amplificar regiões ITS seguiram o protocolo de (Fierer et al., 2012). Os produtos de PCR foram quantificados utilizando o ensaio PicoGreen (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY), reunidos em concentrações equimolares e limpos utilizando o kit UltraClean (Mo Bio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA). Os agrupamentos de DNA limpos foram sequenciados em um instrumento Illumina Mi-Seq na University of Colorado Next Generation Sequencing Facility.

ATRIBUIÇÃO DE OTU ANTIGA

[00375] Os dados brutos de sequências foram reatribuídos a amostras diferentes usando um script personalizado Python, e a filtragem de qualidade e agrupamento OTU (unidade taxonômica operacional) foi conduzida usando o pipeline UPARSE (Edgar 2013). Em suma, criou-se um banco de dados de sequência de novo com sequências representativas para cada OTU usando um limiar de similaridade de 97% e as leituras brutas foram mapeadas para este banco de dados para calcular as contagens de sequência por OTU por amostra. Antes da criação do banco de dados, as sequências foram filtradas por qualidade usando um limiar de frequência de erro esperado de 0,5 erro por sequência. Além disso, as sequências foram desreplicadas e os singletons foram removidos antes da criação do banco de dados. As OTUs forneceram classificações taxonômicas utilizando o classificador RDP (Wang et al., 2007), treinado com os bancos de dados Greengenes (McDonald et al., 2012) ou UNITE (Abarenkov et al., 2010) para sequências de rRNA 16S e sequências ITS, respectivamente. Para explicar as diferenças no número de sequências por amostra, cada amostra foi rarefeita para 1.000 e 6.500 sequências por amostra para os conjuntos de dados de 16S rRNA e ITS.

[00376] Isto resultou em amostras com menos sequências do que a profundidade de rarefação a ser descartada das análises a jusante. As OTU classificadas como cloroplastos ou mitocôndrias foram descartadas antes da rarefação.

ATRIBUIÇÃO DE OTU NOVA

[00377] Para ambas as sequências de 16S rRNA e ITS1, foram usados iniciadores com código de barras exclusivos para cada amostra para combinar múltiplas amostras em um teste de Illumina MiSeq. As leituras resultantes foram separadas novamente em suas respectivas amostras com base nos códigos de barras utilizando um script Python personalizado. Foi realizada a filtragem de qualidade seguindo o pipeline UPARSE (Edgar, 2013), incluindo incorporar as leituras finais emparelhadas, definindo uma taxa de erro esperada máxima de <= 1 erro por sequência mesclada e removendo singletons (leituras que ocorrem apenas uma em todas as amostras em um teste).

[00378] O agrupamento de OTU original de novo (unidades taxonômicas operacionais) foi realizado com uma similaridade de sequência de 97%, novamente seguindo o pipeline UPARSE. O agrupamento subsequente de OTU Nova (OTU nova) (Rideout et al, 2014) foi realizado utilizando uma abordagem em cascata, comparando-se as seqüências com os bancos de dados de Greengenes (McDonald et al, 2012) e UNITE (Abardenkov et al, 2010), que são fornecidos com agrupamento de comprimento total em várias larguras. As sequências bacterianas foram primeiro comparadas com as sequências representativas de OTU Greengenes a 99%. As sequências sem uma correspondência de 99% com as OTUs a 99% foram, então, comparadas com as OTUs a 97% de Greengenes a 97%. As sequências fúngicas foram primeiro comparadas com as sequências representativas de OTU UNITE Dynamic, em que a dinâmica representa valores entre 97% e 99% dependendo da OTU. As sequências que não correspondiam às OTUs UNITE Dynamic no nível de agrupamento apropriado, foram comparadas com as OTUs de UNITES a 97% a 97%. As sequências restantes que não correspondiam a Greengenes ou UNITE e estavam presentes a um nível de pelo menos 10 leituras nas amostras, foram agrupadas utilizando o método de novo acima (independentemente das sequências bacterianas e fúngicas). As sequências originais foram mapeadas para as OTUs Novas utilizando a mesma abordagem em cascata e quaisquer sequências que não correspondiam a uma OTU, mas correspondiam a uma sequência com menos de 10 cópias foram designadas com a ID de leitura representando essa sequência exclusiva.

[00379] As OTU originais de novo forneceram classificações taxonómicas usando o classificador RDP (Wang et al., 2007) treinado com os bancos de dados Greengenes (McDonald et al., 2012) e UNITE (Abarenkov et al., 2010) para sequências de 16S rRNA e ITS, respectivamente. Para explicar as diferenças no número variável de sequências por amostra, cada amostra foi rarefeita para 1000 sequências de 16S rRNA e 1000 de ITS por amostra. As OTU classificadas como cloroplastos ou mitocôndrias foram descartadas antes da rarefação.

[00380] As diferenças gerais na composição da comunidade bacteriana entre as plantas de controle e inoculadas foram avaliadas utilizando escalonamento multidimensional não métrico com base em dissimilaridades de Bray-Curtis, para visualizar as diferenças em pares entre as comunidades de amostras. Utilizou-se a análise de permutação de variância (PERMANOVA) para testar estatisticamente a significância destas diferenças. As análises foram realizadas usando o pacote vegan em R (R Core Team 2013). Para determinar as OTU que contribuem para as diferenças gerais entre os tipos de culturas, calculou-se a abundância relativa média para cada OTU dentro de cada tipo de cultura. Apenas OTUs com uma abundância relativa média de 0,1% em qualquer grupo foram incluídas nesta análise. As tabelas que demonstram a presença e ausência foram construídas utilizando as OTUs Novas, avaliando-se a presença de cada OTU em qualquer das réplicas da amostra e relatando-se apenas as OTUs que correspondem às sequências relevantes.

RESULTADOS DE EXEMPLO: TÁXONS DE NÚCLEO

[00381] As OTUs foram determinadas como sendo táxons de núcleo com base na detecção através de uma variedade de tipos de sementes. Por exemplo, os táxons de núcleo em culturas são aqueles presentes em sementes de > 2 culturas. De modo similar, os táxons de núcleo para uma cultura individual eram aqueles presentes em sementes de > 2 categorias de cultivares (isto é, selvagems, locais, endocruzadas ou modernas) dentro dessa cultura. Em um esforço para selecionar conservativamente táxons de núcleo existentes, as OTUs em que pelo menos a taxonomia de nível de classe poderia ser resolvida foram descartadas. As cepas representativas da presente coleta de cepas para cada OTU foram determinadas quando possível usando agrupamento de genes de 16S rRNA no limiar de 97% de similaridade em USEARCH (Edgar 2010).

[00382] Através de sementes de todas as culturas (milho, trigo, algodão e soja), 2.697 OTUs bacterianas e 415 fúngicas foram detectadas e avaliadas seguindo a presente abordagem rigorosa de filtragem de qualidade de sequência. As sequências fúngicas não foram detectáveis em amostras de soja e, assim, as análises de táxons fúngicos foram conduzidas dentro das 3 culturas restantes.

[00383] No algodão, foram encontradas 176 OTUs bacterianas e 68 fúngicas. Destas, 50 táxons, consistindo em 25 OTUs bacterianas e 25 fúngicas, foram encontrados apenas em sementes de algodão, e não em sementes de milho, trigo ou soja.

[00384] No milho, 2351 OTUs foram encontradas, incluindo 2169 OTUs bacterianas e 182 OTUs fúngicas. Dentre essas, 1964 OTUs, incluindo 1853 OTUs bacterianas e 111 OTUs fúngicas, foram encontradas somente em milho, e não em sementes de trigo, soja ou sementes de algodão testadas.

[00385] Na soja, foram encontradas 1097 OTUs bacterianas. Dessas, 367 táxons bacterianos foram encontrados apenas na soja, e não em sementes de milho, trigo ou sementes de algodão testadas.

[00386] No trigo, foram encontradas 557 OTUs, incluindo 354 OTUs bacterianas e 203 OTUs fúngicas. Dessas, 226 OTUs, incluindo 85 OTUs bacterianas e 149 OTUs fúngicas, foram encontradas apenas em trigo, e não em sementes de milho, soja ou sementes de algodão testadas.

RESULTADOS DE EXEMPLO: TÁXONS ANTIGOS VS. MODERNOS

[00387] As composições de comunidades bacterianas e fúngicas totais foram comparadas entre sementes antigas e modernas, primeiramente, visualizando-se as diferenças usando escalonamento multidimensional não métrico com base em dissimilaridades de Bray- Curtis. A significância estatística das diferenças foi testada usando a análise multivariada pemutacional de variância (PERMANOVA) com o pacote vegan em R (R Core Team 2013 R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Viena, Áustria ISBN: 3-900051-07-0. Disponível online em http://www.R-project.org/). O índice de diversidade de ShannonWiener também foi calculado com o pacote vegan em R. As OTUs com maiores associações com tipos de sementes antigas em comparação com sementes modernas foram identificadas utilizando comparações das abundâncias relativas de OTUs. Especificamente, as contagens de sequência por OTU foram convertidas em abundâncias relativas e as abundâncias relativas médias foram calculadas para cada tipo de semente. Foram avaliadas as diferenças entre as sementes antigas e modernas quando as abundâncias relativas médias eram > 0,1%. As OTU sem taxonomia resolvidas pelo menos ao nível de classe foram removidas da análise. As cepas representativas da coleção de cepas atuais foram encontradas em OTUs Novas quando possível utilizando o agrupamento de sequências de 16S rRNA no limiar de 97% em USEARCH v7.0 [Edgar (2010) Nature methods 10: 996 a 8, incorporado no presente documento a título de referência].

[00388] A composição da comunidade bacteriana se diferiu significativamente entre sementes selvagens e modernas tanto para o milho (P <0,001, Figura 1A) como para o trigo (P <0,001, Figura 1B). Este foi também o caso quando as sementes locais e modernas foram comparadas (P <0,05).

[00389] Entre as sementes de milho, 14 OTUs bacterianas foram sobre-representadas em variedades de sementes selvagens em comparação com variedades de sementes modernas. Estes táxons incluíam vários membros da família Enterobacteriaceae, bem como Paenibacillaceae, Planococcaceae e Oxalobacteraceae (Tabela 12). De modo similar, seis OTUs foram sobre-representadas em sementes de milho locais em comparação com sementes de milho modernas. Estas também incluíam várias Enterobacteriaceae, bem como uma Xanthomonadaceae (Tabela 13). Todas estas diferenças na composição foram traduzidas em diferenças na diversidade, com o milho moderno sendo significativamente mais diverso do que Teosinto e o Landrace (Figura 3).

[00390] Entre as sementes de trigo, 5 OTUs bacterianas foram sobre-representadas em variedades de sementes selvagens comparadas com as modernas (Tabela 14). 3 OTUs foram sobre- representadas em locais em comparação com as sementes de trigo modernas. Os táxons eram membros das Enterobacteriaceae (OTU_3078, OTU_2 e OTU_2912). (Tabela 15). A diversidade da comunidade bacteriana era maior no trigo moderno do que no local (Figura 4).

[00391] As comunidades fúngicas de sementes também eram diversas, embora menos do que as comunidades bacterianas (Figuras 5 e 6). O padrão de diversidade era oposto ao observado entre as comunidades bacterianas, com as variedades modernas contendo as comunidades fúngicas menos diversas. Foram observadas mais de 500 OTUs exclusivas em todas as amostras. A composição da comunidade fúngica se diferiu significativamente entre sementes selvagens e modernas de trigo P <0,001. Este foi também o caso para as variedades landrace e modernas de trigo. As diferenças entre sementes selvagens e modernas não eram significativamente diferentes para o milho (P> 0,01), mas provavelmente devido à replicação insuficiente.

[00392] Entre as sementes de milho, 1 OTU fúngica foi sobrerrepre- sentada em variedades de sementes selvagens em comparação com variedades de sementes modernas. Esta OTU foi classificada como uma espécie de Acremonium (Tabela 16). 2 OTUs fúngicas foram sobre-representadas em variedades de sementes locais em comparação com variedades de sementes modernas. Ambas as OTUs eram membros dos Sordariomycetes e uma era da mesma espécie de Acremonium que aquela que foi sobre-representada em sementes selvagens em comparação com sementes modernas (Tabela 17).

[00393] Entre as sementes de trigo, 7 OTUs fúngicas foram sobre- representadas em variedades de sementes selvagens em comparação com variedades de sementes modernas. Estas OTUs eram todas membros dos Dothideomycetes e incluíam 3 táxons identificados como Cladosporium (Tabela 18). Duas destas OTUs também foram sobre- representadas em variedades locais comparadas com variedades de sementes modernas (Tabela 19). As Figuras 3 e 4 mostram os índices de Diversidade de Shannon de comunidades bacterianas encontradas em cultivares modernas de milho e trigo Selvagens, Landrace, e modernos, respectivamente. As Figuras 5 e 6 mostram os índices de diversidade de Shannon de comunidades fúngicas encontradas em cultivares Teosinto, Locais, Endocruzados, e modernos de milho e trigo, respectivamente. O milho e o trigo modernos tiveram, cada um, uma diversidade menor de comunidades fúngicas.

[00394] Em conclusão, foram identificados vários de micróbios bacterianos e fúngicos presentes em cultivares antigos e locais de trigo e milho que estão sub-representados em cultivares modernos. A presente análise elucidou várias OTUs bacterianas e fúngicas que foram sobre-representadas em sementes antigas em comparação com sementes modernas.

EXEMPLO 2. IDENTIFICAÇÃO DE ENDÓFITOS RADICULARES PERTENCENTES A OTUs IDENTIFICADAS EM SEMENTES

[00395] Nos exemplos acima, foram identificados táxons microbianos de núcleo para sementes agricolamente relevantes. Neste exemplo, as sementes de várias culturas e inúmeras variedades foram cultivadas na estufa ou no campo, e o sequenciamento da comunidade foi realizado em amostras de raízes para identificar táxons correspondentes aos táxons de sementes de núcleo.

DESCRIÇÃO EXPERIMENTAL

[00396] As culturas utilizadas neste experimento foram designadas: Milho Moderno 1, Milho Moderno 2, Milho Local, Milho Selvagem, Trigo Moderno 1, Trigo Moderno 2, Trigo Local, Trigo Selvagem, Soja Moderna 1, Soja Moderna 2, Soja Selvagem 1, Soja Selvagem 2, Algodão Moderno 1, Algodão Moderno 2, Algodão Local e Algodão Selvagem.

[00397] O objetivo deste trabalho era usar o sequenciamento de Illumina para definir as populações de endófitos bacterianas e fúngicas que residem nas raízes de variedades selvagens, locais e modernas de milho, trigo, soja e algodão cultivadas em duas estufas diferentes (designadas como "Massachusetts" ou "Texas") ou em três locais de campo geograficamente diferentes (Minnesota e Idaho). Como um controle negativo para promover o enriquecimento de endófitos transmitidos por sementes, as plantas foram cultivadas em areia autoclavada (estéril) sob condições controladas na estufa Massachusetts. Para verificar se os endófitos transmitidos por sementes podem persistir em raízes cultivadas no solo, todos os genótipos listados acima de planta foram cultivados na estufa Massachusetts plantadas com solo de viveiro comercial de Massachusetts. Para verificar se algumas destas variedades modernas poderiam manter os endófitos transmitidos por sementes em raízes quando cultivadas em uma estufa diferente, Algodão Moderno 1 e 2, Soja Moderna 1 e 2, Milho Máis Moderno 1 e 2 e Trigo Moderno 1 e 2 foram plantadas em recipientes limpos cheios com o solo de campo de trigo do Texas, em uma estufa no Texas. Para verificar se algumas destas variedades modernas poderiam manter os endófitos transmitidos por sementes em raízes quando cultivadas em locais de campo geograficamente diferentes, Algodão Moderno 1 e 2, Soja Moderna 1 e 2, Milho Moderno 1 e 2 e Trigo Moderno 1 e 2 foram plantadas em campos de trigo em Minnesota e Idaho.

[00398] Novos recipientes de plástico foram preenchidos com areia de quartzo esterilizada por calor antes de cada semente ser plantada por acesso. Para tratamentos de solo em Massachusetts, a areia de quartzo esterilizada por calor foi misturada com o solo em uma razão de 3:1. Para tratamentos de solo no Texas, os recipientes foram preenchidos com solo de campo de trigo não misturado. Para pré- germinar mudas em Massachusetts, sementes não esterilizadas de cada adesão foram colocadas em areia estéril ou solo puro em uma placa de Petri, então, regadas com água estéril. Uma muda de cada muda de cada colheita foi plantada em cada um de 4 recipientes preenchidos com areia estéril, 4 recipientes preenchidos com areia: solo ou 4 recipientes preenchidos com solo. Na estufa do Texas, as sementes foram colocadas diretamente no solo em copos, sem pré- germinação. Do mesmo modo, nos locais de campo de Minnesota e Idaho, as sementes foram colocadas no solo sem pré-germinação. Plântulas cultivadas em estufa foram regadas com 25 mL de água estéril a cada dois dias, enquanto as plantas cultivadas em campo foram regadas apenas uma vez com água da torneira logo após o plantio. As plantas foram cultivadas durante 21 dias em Massachusetts e depois colhidas, enquanto que no Texas, Minnesota e Idaho as mesmas foram cultivadas durante 14 dias e, então, colhidas.

[00399] A colheita envolveu sacudir as plantas isentas de tanto solo/detritos quanto possível, cortando-se as plantas em brotos e raízes, colocando-as em tubos cônicos de 15 ml juntamente com 10 ml de água destilada, agitando-se vigorosamente, então, removendo-se a água suja por decantação. Esta etapa de lavagem foi repetida com água estéril até que a água de lavagem não estivesse mais turva (o último enxágue proveniente de cada raiz estivesse transparente). Então, ao material de raiz lavado em tubo cônico de 15 ml foram adicionadas duas microesferas de carboneto estéreis e 5 ml de água estéril antes da homogeneização na máquina Fastprep24 durante 1 minuto a 6M de vibrações por segundo.

[00400] O DNA foi extraído desse material utilizando um kit de extracção de DNA PowerPlant® Pro-htp 96 (Mo Bio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A composição microbiana foi avaliada em cada amostra utilizando os métodos descritos no Exemplo 1.

[00401] O agrupamento de OTUs original de novo (unidades taxonómicas operacionais) foi realizado com uma similaridade de sequência de 97%, seguindo novamente o pipeline UPARSE. O agrupamento subsequente de "OTU Nova" (Rideout et al, 2014) foi realizado utilizando uma abordagem em cascata, comparando as sequências com os bancos de dados de Greengenes (McDonald et al, 2012) e UNITE (Abardenkov et al, 2010), que são dotados de agrupamento de comprimento total em várias larguras. As sequências bacterianas foram primeiro comparadas com as sequências representativas de OTU de Greengenes a 99%. As sequências sem uma correspondência de 99% com as OTUs de 99% foram então comparadas com as OTUs de Greengenes a 97% a 97%. As seqüências fúngicas foram primeiramente comparadas com as sequências representativas de OTUs UNITE Dynamic, em que a dinâmica representa valores entre 97% e 99% dependendo da OTU. As sequências que não correspondem às OTUs UNITE Dynamic no nível de agrupamento apropriado foram comparadas com as OTUs a 97% de UNITE a 97%. As sequências restantes que não corresponderam a Greengenes ou UNITE e estavam presentes a um nível de pelo menos 10 leituras nas amostras, foram agrupadas utilizando o método de novo acima (independentemente das sequências bacterianas e fúngicas). As sequências originais foram mapeadas para as OTUs Novas usando a mesma abordagem em cascata e quaisquer sequências que não corresponderam a uma OTU, mas que correspondem a uma sequência com menos de 10 cópias foram designadas com a ID de leitura representando aquela sequência exclusiva.

[00402] As OTUs originais de novo forneceram classificações taxonômicas utilizando o classificador RDP (Wang et al., 2007) treinado com os bancos de dados Greengenes (McDonald et al., 2012) e UNITE (Abarenkov et al., 2010) para sequências de 16S rRNA e ITS, respectivamente. Para explicar as diferenças no número variável de sequências por amostra, cada amostra foi rarefeita para 1000 sequências de rRNA de 16S e 1000 sequências de ITS por amostra. As OTUs classificadas como cloroplastos ou mitocôndrias foram descartadas antes da rarefação.

[00403] As diferenças totais na composição da comunidade bacteriana entre as plantas de controle e inoculadas foram avaliadas utilizando escalonamento multidimensional não métrico com base em dissimilaridades de Bray-Curtis para visualizar as diferenças entre as comunidades de amostras. A análise permutacional de variância (PERMANOVA) foi usada para testar estatisticamente a significância destas diferenças. As análises foram realizadas usando o pacote vegan em R (R Core Team 2013). Para determinar as OTUs que contribuem para as diferenças gerais entre os tipos de culturas, as abundâncias relativas médias foram calculadas para cada OTU dentro de cada tipo de cultura. Apenas OTUs com uma abundância relativa média de 0,1% em qualquer grupo foram incluídas nesta análise. As tabelas que demonstram a presença e ausência foram construídas utilizando as OTUs Novas, avaliando-se a presença de cada OTU em qualquer das réplicas da amostra e relatando-se apenas as OTUs que correspondem às sequências relevantes.

RESULTADOS DE EXEMPLO

[00404] Os experimentos detectaram anteriormente 2.697 OTUs bacterianas e 415 fúngicas em sementes de milho, trigo, algodão e soja. Os táxons bacterianos representaram 218 famílias e 334 gêneros. Os táxons fúngicos representaram 48 famílias e 87 gêneros destacando a ampla diversidade de micróbios endofíticos dentro das sementes. Buscando-se estas mesmas OTUs em raízes lavadas de milho, trigo, algodão e soja cultivadas em estufa de Massachusetts ou Texas e no campo de Idaho ou Minnesota, 624 (23%) das OTUs bacterianas e 48 (12%) das fúngicas foram observadas em sementes. Buscando-se as mesmas apenas nas raízes de plantas cultivadas na estufa de Massachusetts (Tabelas 21, 22), 176 (7%) destas OTUs bacterianas e 33 (8%) destas fúngicas foram detectadas. Nas raízes de plantas cultivadas na estufa do Texas (Tabelas 23, 24), 395 (15%) destas OTUs bacterianas e 21 (5%) destas OTUs fúngicas foram detectadas. Nas raízes de plantas cultivadas na estufa do Texas (Tabelas 23, 24), 395 (15%) destas bactérias e 21 (5%) destas OTU fúngicas foram detectadas. Nas raízes de plantas cultivadas no campo de Idaho (Tabelas 25, 26), 364 (13%) destas OTUs bacterianas e 14 (3%) destas OTUs fúngicas foram detectadas. Nas raízes de plantas cultivadas no campo de Minnesota (Tabelas 27, 28), 335 (12%) destas OTUs bacterianas e 13 (3%) destas OTUs fúngicas foram detectadas.

[00405] Entre todas as OTUs de sementes anteriormente detectadas, 68 OTUs bacterianas e 27 OTUs fúngicas foram encontradas como sendo táxons nucleares em todas as culturas (Tabelas 9, 10). Buscando-se estas OTUs nucleares em raízes de plantas cultivadas na estufa de Massachusetts (Tabelas 21, 22), 27 (40%) das OTUs bacterianas e 6 (22%) das OTUs fúngicas foram detectadas. Nas raízes de plantas cultivadas na estufa do Texas (Tabelas 23, 24), 38 (56%) dessas OTUs bacterianas e 5 (19%) destas OTUs fúngicas nucleares foram detectadas. Nas raízes de plantas cultivadas no campo de Idaho (Tabelas 25, 26), 24 (35%) destas OTUs bacterianas nucleares e 5 (19%) destas OTUs fúngicas foram detectadas. Nas raízes de plantas cultivadas no campo de Minnesota (Tabelas 27, 28), 36 (53%) destas OTUs bacterianas nucleares e 6 (22%) destas OTUs fúngicas foram detectadas. Buscando-se OTUs de semente de núcleo que ocorreram no pelo menos uma amostra de raiz das estufas e campos, 49 (72%) de OTUs bacterianas e 7 (26%) de OTUs fúngicas foram detectadas. Entre estas, as OTUs de sementes bacterianas mais comuns observadas nas raízes foram B0.9|GG99|128181 (observado em 100% de todas as amostras), B0.9|GG99|73880 (observado em 96% de todas as amostras) B0.9|GG99|25580 (observado em 90% de todas as amostras) e B0.9|GG99|132333 (observado em 84% de todas as amostras). Entre as OTUs fúngicas das sementes, as mais comumente observadas nas raízes foram F0.9|UDYN|206476 (observado em 76% de todas as amostras), F0.9|UDYN|212600 (observado em 46% de todas as amostras), F0.9|UDYN|216250 (observada em 42% de todas as amostras) e F0.9|UDYN|216250 (observado em 42% de todas as amostras) e F0.9|UDYN|215392 (observado em 42% de todas as amostras). Todas as cepas fúngicas de SYM 15926, 15928, 00120, 00880, 01325, 01326, 01328 e 15811 têm uma identidade superior a 97% a OTU F0.9|UDYN|206476 e foram ensaiadas em mudas. Todas as cepas SYM de fungos 00741b, 01315, 01327 e 15890 têm uma identidade superior a 97% para OTU F0.9|UDYN|212600 e foram ensaiadas em mudas. Todas as cepas fúngicas de SYM 00154, 15825, 15828, 15837, 15839, 15870, 15872, 15901, 15920, 15932 e 15939 têm uma identidade superior a 97% a F0.9|UDYN|215392 e foram ensaiadas em mudas. As bactérias de sementes e raízes de núcleo observadas nestes experimentos pertencem às Phyla Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria e Tenericutes, enquanto que os fungos pertencem ao Phyla Ascomycota e às Classes Dothideomycetes e Sordariomycetes, o que significa que esses grupos pos- suem a capacidade de serem transmitidos por sementes e de colonizar diferentes estádios de vida de uma planta (tanto sementes como raízes), bem como uma ampla gama de hospedeiros e flexibilidade, permitindo que os mesmos existam dentro de diferentes espécies de plantas.

[00406] Foram observadas 29 OTUs bacterianas em raízes de plantas cultivadas em areia estéril, enquanto 43 OTUs bacterianas de semente foram observadas em raízes de plantas cultivadas em solo; 23 das mesmas OTUs de sementes foram observadas em ambas as condições (Tabelas 21, 22). Este padrão significa que a condição do solo aumenta a colonização de bactérias transmitidas por sementes na raiz. Observou-se uma tendência contrastante em fungos, em que 28 OTUs bacterianas foram observadas em raízes de plantas cultivadas em areia estéril, enquanto 19 OTUs bacterianas foram observadas em raízes de plantas cultivadas em solo; 15 das mesmas OTUs de semente foram observadas em ambas as condições. Ao contrário das bactérias, os fungos transmitidos por sementes que tentam colonizar raízes cultivadas em solo não estéril enfrentam uma maior competição pelo ni-cho da raiz, uma vez que os fungos transmitidos pelo solo tentam colonizar a raiz.

[00407] Alguns endófitos de semente são especialmente robustos e capazes de colonizar raízes de plantas que crescem em diferentes ambientes de campo e de estufa. Contando-se as OTUs de micróbios que ocorrem em pelo menos uma variedade de planta em cada campo e na estufa do Texas, 163 OTUs bacterianas (de um total de 583 OTUs de sementes bacterianas detectadas em raízes cultivadas em campo) e 8 OTUs fúngicos (dentre um total de 28 OTUs de sementes fúngicas detectadas nas raízes) foram observadas ocorrendo nas raízes dessas plantas em todos os três ambientes; estas sequências representam colonizadores de raiz robustos que permanecem em raízes apesar de condições ambientais diferentes.

[00408] Os microbiomas de raiz em ambos os ambientes compartilharam 45% de suas OTUs de semente bacteriana (216 OTUs) e 50% de suas OTUs de semente fúngicas (9 OTUs). Visto que estas plantas foram colhidas quando tinham duas semanas de idade, aproximadamente metade da diversidade de microbiomas transmitidos por sementes em sementes de milho, trigo e soja são capazes de colonizar e permanecer em mudas sob condições agronomicamente relevantes durante pelo menos duas semanas.

[00409] Entre todas as OTUs de sementes anteriormente detectadas encontradas em sementes de milho, 20 OTUs bacterianas e 3 OTUs fúngicas foram encontradas apenas sementes de variedades locais selvagens e antigas, mas não variedades modernas de milho. Buscandose estas em raízes de variedades de milho antigas cultivadas em areia estéril na estufa de Massachusetts, as OTUs bacterianas B0.9|GG99|813062, B0.9|GG99|9943 e B0.9|GG99|4327501 (mas não OTUs fúngicas) foram detectadas em milho selvagem e OTU B0.9|GG99|9943 bacteriana e OTU fúngica F0.9|UDYN|210204 foram detectadas em milho local antigo (Tabelas 25, 26). Não foi observada nenhuma OTU bacteriana de semente nas raízes de plantas de plantas de milho selvagens ou locais cultivadas em terra na estufa de Massachusetts, no entanto, OTU fúngica F0.9|UDYN|210204 foi observada nas raízes de milho locais cultivadas no solo (Tabelas 21, 22).

EXEMPLO 3. ISOLAMENTO DE ENDÓFITOS BACTERIANOS DE SEMENTES ANTIGAS

[00410] Para melhor compreender a função exercida por micróbios endofíticos derivados de sementes de espécies antigas de plantas na melhoria do vigor, da saúde geral e da resistência ao estresse de plantas hospedeiras modernas, iniciou-se uma análise sistemática para isolar e caracterizar microrganismos endofíticos de sementes de plantas de gramíneas comercialmente significativas.

[00411] Diversos tipos de ancestrais selvagens ou locais antigos de milho, trigo, arroz e outras sementes foram adquiridos e pesquisados para micróbios cultiváveis.

[00412] Grupos de 5 sementes foram embebidas em 10 mL de água estéril contida em tubos cônicos estéreis de 15 ml durante 24 horas. Alguns acessos de milho e arroz foram amostradas para micróbios de superfície de sementes. Nestes casos, após 24 horas de imersão, alíquotas de 50 μL de água de imersão não diluída, 100X diluída e 10000X diluída foram colocadas sobre ágar R2A [Proteína peptona (0,5 g/L), Casaminoácidos (0,5 g/L), Extrato de levedura (0,5 g/L), Dextrose (0,5 g/L), Amido Solúvel (0,5 g/L), Fosfato de Dipotássio (0,3 g/L), Sulfato de magnésio 7H2O (0,05 g/L), Piruvato de sódio (0,3 g/L) G/L) Ágar (15 g/L), pH final 7 ± 0,2 @ 25°C] para cultura de bactérias oligotróficas, enquanto os mesmos volumes e diluições foram também plaqueados em ágar de dextrose de batata (PDA) [Infusão de Batata de 200 g/L, Dextrose 20 g/L, Ágar 15 g/L, pH final: 5,6 ± 0,2 a 25°C] para cultura de bactérias copiotróficas e fungos. Todas as sementes no estudo foram amostradas para endófitos por esterilização de superfície, trituração e cultura do mosto. As sementes foram esterilizadas superficialmente por lavagem com EtOH a 70%, enxágue com água, depois lavagem com uma solução a 3% de hipoclorito de sódio seguida de 3 lavagens em água estéril. Todas as etapas de lavagem e enxágue duraram 5 minutos com agitação constante em 130 rpm. As sementes foram, então manchados em ágar R2A que foi incubado a 30°C durante 7 dias para confirmar a esterilização superficial bem-sucedida. Após o processo de esterilização, os lotes de sementes foram triturados com um almofariz e um pilão estéreis em caldo R2A estéril, enquanto um número seleção de sementes de milho, arroz e soja esterilizadas em superfície foram cultivadas em condições estéreis e as raízes ou brotos de mudas (sem esterilização adicional) foram esmagados por batimento de microesferas em uma máquina Fastprep24 com 3 microesferas de carboneto, 1 mL de R2A em um tubo Falcon de 15 mL com agitação em 6M/s durante 60 segundos. Os extratos de lavagens superficiais, sementes trituradas ou tecidos de mudas macerados foram diluídos em série por fatores de 1 a 10-3 e espalhados em quadrantes em ágar R2A e PDA de modo a isolar microrganismos cultiváveis transportados por sementes. As placas foram incubadas a 28°C durante 7 dias, monitorizando o surgimento de colônias diariamente. Após uma semana, as placas foram fotografadas e diferentes morfótipos de colônias foram identificados e marcados. As mesmas foram, então, selecionadas para identificação por sequenciamento, cópia como estoque de glicerol e ensaio de funções benéficas como descrito no presente documento.

PLANTIO E PONTUAÇÃO DE MICRÓBIOS

[00413] Após 7 dias de crescimento, a maioria das colônias microbianas teve um crescimento grande e distinto o suficiente para permitir a diferenciação baseada no tamanho, formato, cor e textura da colônia. Fotografias de cada placa foram tiradas e, com base na cor e no morfótipo, foram identificadas diferentes colónias por número para posterior referência. Estas cepas também foram semeadas em R2A ou PDA para verificar a pureza, e as culturas limpas foram, então, raspadas com uma alça da placa, ressuspensas em uma mistura de R2A e glicerol e congeladas em quadruplicata a -80°C para uso posterior.

ANÁLISE DE SEQUÊNCIA & ATRIBUIÇÃO FILOGENÉTICA DE MICRÓBIOS ISOLADOS DE SEMENTES ANTIGAS

[00414] Para caracterizar precisamente os endófitos microbianos isolados, as colônias foram submetidas a sequenciamento de gene marcador, e as sequências foram analisadas para fornecer classificações taxonômicas. As colônias foram submetidas à amplificação por PCR de gene de 16S rRNA usando o conjunto de iniciadores 27f/1492r, e o sequenciamento de Sanger de extremidades pareadas foi realizado em Genewiz (South Plainfield, NJ). Os cromatogramas brutos foram convertidos em sequências, e as pontuações de qualidade correspondentes foram atribuídas usando TraceTuner v3.0.6beta (US 6.681.186, incorporado no presente documento a título de referência). Essas sequências foram filtradas por qualidade usando PRINSEQ v0.20.3 [Schmieder e Edwards (2011) Bioinformatics. 2011;27:863 a 864, incorporado no presente documento a título de referência] com limiares de pontuação de corte esquerdo e direito de 30 e uma janela de qualidade de 20bp. As sequências sem leituras emparelhadas foram descartadas do processamento posterior. As sequências filtradas por qualidade de extremidade pareada foram mescladas utilizando USEARCH v7.0 [Edgar (2010) Nature methods 10: 996-8]. As classificações taxonómicas foram atribuídas às sequências utilizando o classificador RDP [Wang et al., (2007) Applied and environmental microbiology 73: 5261 a 7, incorporadas no presente documento a título de referência] treinadas no banco de dados de Greengenes [McDonald et al. Al. (2012), IS-ME journal 6: 610 a 8, incorporada no presente documento a título de referência]. Os 253 micróbios resultantes, derivados de variedades antigas (selvagems ou locais antigas) que representam mais de 41 OTUs distintas (utilizando um limiar de si-milaridade de 97%) são fornecidos na Tabela 20.

EXEMPLO 4. CARACTERIZAÇÃO DE ENDÓFITOS BACTERIANOS ISOLADOS DE SEMENTES ANTIGAS

[00415] Um total de 140 endófitos bacterianos de origem de semente foi inoculado em placas de 96 poços e testados para várias atividades e/ou produção de compostos, como descrito abaixo. Os resultados destes ensaios in vitro estão resumidos na Tabela 27. TABELA 27 (SUMÁRIO DE CARACTERIZAÇÃO IN VITRO DE ENDÓFITOS BACTERIANOS ISOLADOS DE SEMENTES ANTIGAS)

PRODUÇÃO DE AUXINA

[00416] O IAA contendo indol é capaz de gerar um cromóforo rosado sob condições ácidas na presença de cloreto férrico. As cepas microbianas foram inoculadas em R2A ambas suplementadas com L-TRP (5 mM) em placas de cultura de 96 poços de 2 m (1 mL). A placa foi vedada com uma membrana respirável e incubada a 23°C sob condições estáticas durante 5 dias. Após 5 dias, 150 μL de cada cultura foram transferidos para uma placa de 96 poços e mediu-se a DO600. Após a medição da OD600, a placa foi centrifugada e 50 μL de sobrenadante foram transferidos para uma nova placa de 96 poços, misturados com 100 μL de reagente de Salkowski (1 mL de solução de FeCl3 0,5 M para 50 mL de HClO4 a 35%), e incubadas no escuro durante 30 minutos e a OD530nm medida para detectar a cor rosa/vermelho.

[00417] A Auxina é um hormônio vegetal importante, que pode promover o alargamento das células e inibir o desenvolvimento de ramos (atividade meristemática) nos tecidos vegetais acima do solo, enquanto, aqueles abaixo do solo, têm o efeito oposto, promovendo a ramificação e o crescimento das raízes. Curiosamente, a auxina vegetal é fabricada acima do solo e transportada para as raízes. Desse modo, entende-se que a planta e especialmente micróbios que habitam as raízes que produzem quantidades significativas de auxina serão capazes de promover a ramificação e desenvolvimento das raízes mesmo sob condições em que a planta reduz a sua própria produção de auxina. Tais condições podem existir, por exemplo, quando o solo é inundado e as raízes encontram um ambiente anóxico.

[00418] Foram selecionadas bactérias derivadas de sementes por sua capacidade de produzir auxinas como possíveis agentes promotores do crescimento das raízes. Uma proporção muito grande das bactérias testadas, aproximadamente 103 de 140, ou 73% das cepas totais, apresentaram um nível detectável de desenvolvimento de cor rosa ou vermelha (a característica diagnóstica do ensaio sugerindo a produção de composto de auxina ou indol). 63 cepas (45% do total) tiveram uma produção particularmente forte de compostos de auxina ou indol.

SOLUBILIZAÇÃO DE FOSFATO MINERAL

[00419] Os micróbios foram plaqueados em meio de fosfato tricálcico como descrito em Rodriguez et al., (2001) J Biotechnol 84: 155 a 161 (incorporado não presente documento a título referência). Este foi preparado da seguinte forma: 10 g/L de glicose, 0,373 g/L de NH4NO3, 0,41 g/L de MgSO4, 0,295 g/L de NaCl, 0,003 de FeCl3, 0,7 g/L de Ca3HPO4, 100 mM de Tris e 20 g/L de Ágar, pH 7, então autoclavado e derramado em placas de Petri quadradas. Após 3 dias de crescimento a 28°C no escuro, os halos transparentes foram medidos em torno de colónias capazes de solubilizar o fosfato tricálcico.

[00420] Aproximadamente 50 cepas (36% das cepas), apresentaram alguma capacidade de solubilizar fosfato mineral, com 15 cepas (11%) produzindo fortes níveis de solubilização de fosfato mineral.

CRESCIMENTO DE MEIO LGI ISENTO DE NITROGÊNIO

[00421] Todos os produtos de vidro foram limpos com 6 M de HCl antes da preparação dos meios. Uma placa de 96 poços nova (300 μl de volume de poço) foi carregada com 250 ul / poço de caldo LGI estéril [por L, 50 g de Sacarose, 0,01 g de FeCl3-6H2O, 0,02 g de CaCl2, 0,8 g de K3PO4, 0,2 g de CaCl2, MgSO4-7H2O, 0,002 g de Na2MoO4-2H2O, pH 7,5]. Os micróbios foram inoculados nos 96 poços simultaneamente com um replicador de 96 pinos esterilizado por chama. A placa foi vedada com uma membrana permeável, incubada a 28°C sem agitação durante 3 dias e as leituras OD600 foram tiradas com um leitor de placas de 96 poços.

[00422] Uma bactéria associada à fixação de nitrogênio pode, teoricamente, adicionar-se ao metabolismo do nitrogênio do hospedeiro, e as bactérias associadas a plantas mais famosas, rizóbios, são capazes de fazê-lo dentro de cultivos de plantas leguminosas de órgãos especialmente adaptados para que as mesmas possam fazer isso. Essas bactérias associadas às sementes podem ser capazes de fixar o nitrogênio em associação com a muda em desenvolvimento, se as mesmas colonizarem as superfícies da planta ou interior e, assim, adicionar à nutrição nitrogenada da planta.

[00423] No total, dos 140 isolados havia 15 (10% das cepas testadas) que tinham crescimento detectável sob condições limitadas de nitrogênio (Tabela 27).

ATIVIDADE DE ACC DESAMINASE

[00424] Os micróbios foram ensaiados quanto ao crescimento com ACC como sua única fonte de nitrogênio. Antes da preparação de meio, todos os produtos de vidro foram limpos com 6 M de HCl. Uma solução esterilizada por filtração 2M de ACC (# 1373A, Research Organics, EUA) foi adicionada em água. 2 μl/mL desta foram adicionados a este caldo LGI autoclavado (ver acima) e alíquotas de 250 μL foram colocadas em uma placa de 96 poços nova (limpa). A placa foi inoculada com um replicador de biblioteca de 96 pinos, selada com uma membrana respirável, incubada a 28°C 3 dias sem agitação e as leituras de OD600 foram obtidas. Apenas poços que eram significativamente mais turvos do que os respectivos poços LGI livres de nitrogênio foram considerados como exibindo atividade de ACC desaminase.

[00425] As reações de estresse da planta são fortemente afetadas pela própria produção da planta e pela superprodução do hormônio gasosa, etileno. O etileno é metabolizado a partir do seu precursor 1- aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) que pode ser desviado do metabolismo do etileno por enzimas microbianas e de plantas com atividade de ACC desaminase. Como o nome sugere, a ACC desaminase remove o nitrogênio molecular do precursor de etileno, removendo-o como um substrato para a produção do hormônio do estresse da planta e proporcionando ao micróbio uma fonte de nutrição valiosa de nitrogênio. É um tanto surpreendente, mas esta capacidade bioquímica mediada microbialmente para reduzir o estresse da planta é muito importante visto que acredita-se que danos ao crescimento da planta sob várias condições de estresse resultem da produção excessiva de etileno (Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, Outubro de 2007, Volume 34, Edição 10, pp 635 a 648).

[00426] No total, dos 140 isolados existiam 28 cepas (20%) que tinham maior crescimento em meio LGI isento de nitrogênio suplementados com ACC, do que em LGI isento de nitrogênio. Destes, 14 cepas (10%) tinham atividade de ACC desaminase muito elevada.

PRODUÇÃO DE ACETOÍNA E DIACETILA

[00427] O método foi adaptado de Phalip et al., (1994) J Basic Microbiol 34: 277 a 280. (Incorporado no presente documento a título de referência). 250 ml de caldo de R2A autoclavado suplementado com 0,5% de glicose foram aliquotados em uma placa de 96 poços (# 07200-700, Fisher). Os endófitos microbianos de uma placa de estoque de glicerol foram inoculados utilizando um replicador de 96 pinos esterilizado por chama, selado com uma membrana respirável, então, depois incubado durante 3 dias sem agitação a 28°C. No dia 3 foram adicionados 50 μl/poço de Reagentes de Barritt A e B recentemente misturados [5 g/L de creatina misturada a 3: 1 (v/v) com α-naftol recentemente preparado (75 g/L em hidróxido de sódio 2,5 M)]. Após 15 minutos, as placas foram pontuadas para coloração vermelha ou rosa em relação a um controle negativo de cor de cobre (medido como absorção a 525 nm em um leitor de placas).

[00428] Verificou-se que uma proporção muito elevada das cepas testadas produz acetoína: 76 cepas das 140 testadas, ou 54%, produzidas pelo menos algum nível detectável de acetoína, com 40 cepas (28%) produzindo níveis moderados a elevados (Tabela 27).

PRODUÇÃO DE SIDERÓFOROS

[00429] Para garantir que nenhum ferro contaminante seja transportado a partir de experimentos anteriores, todos os artigos de vidro foram deferidos com HCl a 6 M e água antes da preparação do meio [Cox (1994) Methods Enzymol 235: 315 a 329, incorporado no presente documento a título de referência]. Neste material de vidro limpo, preparou-se um meio de caldo R2A, que é limitado de ferro, foi preparado e derramado (250 ul/poço) em placas de 96 poços e a placa, então inoculada com micróbios utilizando um replicador de placas de 96 pinos. Após 3 dias de incubação a 28°C sem agitação, foram adicionados a cada poço 100 ul de preparação de O-CAS sem agente gelificante [Perez-Miranda et al. (2007), J Microbiol Methods 70: 127 a 131, incorporado no presente documento a título de referência]. Utilizando-se novamente o material de vidro limpo, preparou-se 1 litro de revestimento de O-CAS misturando-se 60,5 mg de Chrome azurol S (CAS), 72,9 mg de brometo de hexadeciltrimetilamónio (HDTMA), 30,24 g de Piperazina-1 finamente triturada, Ácido 1,4-bis-2-etanossulfônico (PIPES) com 10 ml de FeCl3.6H2O a 1 mM em solvente HCl a 10 mM. O PIPES teve de ser finamente pulverizado e misturado suavemente com agitação (não sacudida) para evitar a produção de bolhas, até que uma cor azul escura seja alcançada. 15 minutos após a adição do reagente a cada poço, a alteração de cor foi pontuada buscando-se halos roxos (sideróforos do tipo catecol) ou colónias laranjas (sideróforos de hidroxamato) em relação ao azul profundo do O-Cas.

[00430] Em muitos ambientes, o ferro é um nutriente limitante para o crescimento. Um mecanismo de enfrentamento que muitos micróbios desenvolveram é produzir e secretar compostos quelantes de ferro chamados sideróforos, que muitas vezes apenas essa espécie ou cepa específica tem os meios para reabsorver e interagir com a liberação do ferro ligado, tornando-o disponível para o metabolismo. Um efeito de borda da produção e secreção de sideróforos é que um sideróforo que secreta micróbios pode remover todo o ferro biodisponível em seu ambiente, tornando difícil para uma espécie competitiva invadir e crescer nesse microambiente.

[00431] A produção de sideróforos por micróbios sobre uma superfície de planta ou dentro de uma planta pode mostrar que um micróbio está equipado para crescer em um ambiente limitado de nutrientes, e talvez proteger o ambiente da planta contra a invasão por outros micróbios, talvez indesejáveis. A produção de sideróforos foi detectável em 45 cepas (32%), com 18 cepas produzindo quantidades significativas.

ATIVIDADE DE CELULASE

[00432] O iodo reage com celulose para formar um complexo azul escuro, deixando halos transparentes como prova da atividade enzimática extracelular. Adaptando-se um protocolo anterior [Kasana et al.. (2008), Curr Microbiol 57: 503 a 507, incorporado no presente documento a título de referência] 0,2% de sal de sódio de carboximetilcelulose (CMC) (# C5678, Sigma) e 0,1% de triton X-100 foram adicionados a meio R2A, autoclavados e derramados em placas de 150 mm. Os micróbios foram inoculados utilizando um replicador de placa de 96 pinos. Após 3 dias de cultura no escuro a 25°C, a atividade de celulose foi visualizada inundando a placa com iodo de Gram. As colónias positivas foram circundadas por halos transparentes. Verificou- se que 47 cepas, ou aproximadamente 33%, produzem atividade de celulase. Curiosamente, 11 cepas produziram altos níveis de atividade da celulase (Tabela 27).

ANTIBIOSE

[00433] A produção de compostos antimicrobianos a partir de endófitos foi testada essencialmente como descrito em Johnston-Monje et ai., (2012) PLoS ONE 6 (6): e20396, que está incorporado no presente documento a título de referência. Em suma, colônias de E. coli DH5a (testador de gram negativos), Bacillus subtillus ssp. Subtilis (testador gram positivo), ou levedura Saccharomyces cerevisiae AH109 (testador fúngico) foram ressuspensas em 1 mL de LB para uma OD600 de 0,2 e 30 mL deste foram misturadas com 30 mL de ágar LB quente. Foram feitas diluições em série e as placas derramadas. Os micróbios foram inoculados em placas retangulares contendo ágar R2A utilizando um replicador de placa de 96 pinos, incubados durante um dia a 28°C e um dia a 23°C. A antibiose foi pontuada pela observação de halos claros ao redor de colônias de endófitos. Verificou-se que 30 cepas produziram atividade antagonista de E. coli, enquanto que 39 cepas tinham atividade contra S. cerevisiae.

EXEMPLO 5. TESTE DE POPULAÇÕES ENDOFÍTICAS BACTERIANAS DE ORIGEM DE SEMENTE ANTIGA EM PLANTAS OBJETIVO EXPERIMENTAL

[00434] Os resultados mostrados acima demonstram que muitas das bactérias endofíticas derivadas de parentes ancestrais de plantas agrícolas modernas possuem atividades que poderiam conferir traços benéficos a uma planta mediante a colonização. Primeiro, muitas das bactérias descritas aqui são capazes de produzir compostos que poderiam ser benéficos à planta, tal como detectado utilizando os ensaios in vitro descritos acima. Adicionalmente, testaram-se várias bactérias representativas e verificou-se colonizar com êxito plantas de milho tal como demonstrado no exemplo acima. O objetivo dos experimentos nesta seção refere-se à capacidade de os endófitos bacterianos conferirem traços benéficos em uma planta hospedeira. Vários métodos diferentes foram usados para determinar isso. Em primeiro lugar, as plantas inoculadas com bactérias foram testadas sob condições sem qualquer estresse para determinar se o micróbio confere um aumento no vigor. Em segundo lugar, as plantas inoculadas com endófito foram testadas sob condições de estresse específicas (por exemplo, estresse salino, estresse térmico, estresse hídrico e combinações dos mesmos) para testar se as bactérias conferem um aumento na tolerância a estes estresses. Estes testes de crescimento foram realizados utilizando dois métodos diferentes: usando ensaios de crescimento em placas de água-ágar e usando ensaios de crescimento em papéis de filtro estéreis.

DESCRIÇÃO EXPERIMENTAL ESTERILIZAÇÃO DE SUPERFÍCIE DE SEMENTES

[00435] As sementes de milho e sementes de trigo não tratadas foram esterilizadas de um dia para o outro com gás de cloro da seguinte forma: 200 g de sementes foram pesados e colocados em uma garrafa de vidro de 250 mL. A garrafa aberta e sua tampa foram colocadas em um frasco de dessecador em uma coifa. Um béquer contendo 100 ml de alvejante comercial (8,25% de hipoclorito de sódio) foi colocado no recipiente de dessecação. Imediatamente antes da vedação do frasco, 3 mL de ácido clorídrico concentrado (34 a 37,5%) foram cuidadosamente adicionados ao alvejante. A esterilização foi deixada prosseguir durante 18 a 24 h. Após a esterilização, a garrafa foi fechada com a sua tampa esterilizada e reaberta em uma coifa de fluxo estéril. A garrafa aberta foi deixada na coifa estéril por algumas horas para que o ar saia das sementes e remova o restante do gás de cloro. A garrafa foi então fechada e as sementes armazenadas à temperatura ambiente no escuro até o uso.

ENSAIOS DE ÁGUA E ÁGAR

[00436] Os endófitos bacterianos isolados a partir de sementes como descrito no presente documento foram testados quanto à sua capacidade de promover o crescimento vegetal sob condições normais e de estresse inoculando-se sementes de milho e trigo com aqueles endófitos e germinando-os em ágar-água. Para cada endófito bacteriano testado, foram inoculados 5 mL de meio R2A líquido com uma única colónia e a cultura cultivada à temperatura ambiente em um agitador até uma OD (600nm) entre 0,8 e 1,2.

[00437] As sementes de milho e trigo esterilizadas foram colocadas em placas de ágar e água (1,3% de ágar bacto) em uma coifa de fluxo laminar, utilizando um fórceps previamente flamejado. Colocou-se uma gota de inóculo com uma DO compreendida entre 0,8 e 1,2 (correspondente a cerca de 108 UFC / mL) em cada semente (50 μL de milho, 30 μL de trigo, representando aproximadamente 5,106 e 3,106 UFC de milho e trigo, respectivamente). Para cada tratamento, 3 placas foram preparadas com 12 sementes cada. As placas foram vedadas com fita cirúrgica, randomizadas para evitar efeitos de posição e colocadas em uma câmara de crescimento ajustada a 22°C, 60% de umidade relativa, no escuro durante quatro dias. Após quatro dias, foi tomada uma imagem de cada placa foi obtida e o comprimento da raiz de cada muda foi medido utilizando o software imageamento ImageJ. A diferença percentual entre as plantas tratadas e tradas com transfecção celular (controle R2A) foi, então, calculada. Para crescimento sob estresse salino, as placas de ágar- água foram suplementadas com 100 mM de NaCl. Para o crescimento sob estresse por calor, as placas foram colocadas a 40°C, 60% de umidade após dois dias de crescimento, e deixadas durante mais dois dias.

ENSAIO DE CRESCIMENTO EM PAPEL-FILTRO

[00438] Os papéis-filtro foram autoclavados e colocados em placas de Petri e, então, pré-embebidos com soluções de tratamento. Para simular condições normais, 3 a 4 mL de água estéril foram adicionados aos filtros. Os estresses hídricos e salinos foram induzidos pela adição de 3 a 4 mL de solução de PEG 6000 a 8% ou 50 ou 100 mM de NaCl aos papéis-filtro. As sementes esterilizadas em superfície foram incubadas em inóculos bacterianos durante pelo menos uma hora antes do plaqueamento. Nove sementes foram plaqueadas em triplicata para cada condição testada, incluindo temperatura ambiente e estresse por calor (40°C) para condições normais e salinas. Durante os estágios iniciais do experimento, as placas foram vedadas com parafilme para inibir a perda de água por evaporação e a secagem prematura dos papéis-filtro. As placas foram incubadas no escuro à temperatura ambiente durante dois dias, após tal tratamento térmico as placas foram deslocadas para 40°C durante 4 a 6 dias. O parafilme foi removido de todas as placas após 3 a 5 dias. Após 5 a 8 dias, as mudas foram pontuadas medindo-se manualmente o comprimento da raiz de milho e comprimento do broto de trigo e registrando-se a massa de mudas agrupadas a partir de réplicas individuais.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[00439] O vigor da planta e a resistência aumentada ao estresse são componentes importantes para fornecer a adequação a uma planta em um ambiente agrícola. Estes podem ser medidos em ensaios de germinação para testar a melhoria no fenótipo da planta como conferido por inoculação microbiana. A coleção de endófitos derivados de sementes produziu uma resposta mensurável em milho e trigo quando inoculados em comparação com controles não inoculados, como mostrado nas Tabelas 28A a 28D. Por exemplo, verificou-se que a maioria das cepas testadas produzem um fenótipo favorável em qualquer dos múltiplos parâmetros medidos tais como o comprimento da raiz, o peso, ou o comprimento da broto, sugerindo que as cepas exercem um papel íntimo modulando e melhorando o vigor da planta e conferindo resistência ao estresse à planta hospedeira. No trigo sob condições normais (vigor), 78% das cepas testadas mostraram algum nível de efeito e 63% uma resposta forte da planta sugerindo que a fisiologia e nichos ecológicos da coleção de cepas podem estar associados a uma função de planta benéfica. As respostas de estresse na coleção de cepas podem ser observadas pela capacidade de um subgrupo para conferir uma resposta benéfica sob condições diferentes, tais como estresse por calor e hídrico. Estes podem ser aplicados a produtos para terras áridas e marginais. Em uma grande proporção de casos para as cepas testadas, o efeito benéfico foi mensurável em ambas as culturas, indicando que as cepas são capazes de colonizar múltiplas variedades e espécies de plantas. Isso pode exercer uma função em seus mecanismos de dispersão e colonização de uma semente em uma planta madura, mas também como parte do ciclo de vida para estabelecer uma ampla gama de distribuição e persistência ecológica na natureza. TABELA 28A (POPULAÇÕES ENDOFÍTICAS BACTERIANAS DE ORI- GEM DE SEMENTE ANTIGA EM PLANTAS EM ENSAIOS DE MILHO)

TABELA 28B (COMPRIMENTO DE RAIZ E PESO DE POPULAÇÕES ENDOFÍTICAS BACTERIANAS DE ORIGEM DE SEMENTE ANTIGA EM PLANTAS)

TABELA 28C (COMPRIMENTO DE RAIZ EM MODOS DE ESTRESSE NORMAL, TÉRMICO E SALINO)

TABELA 28D (COMPRIMENTO DE RAIZ E PESO EM ESTRESSES NORMAL, SALINO E HÍDRICO)

EXEMPLO 6: IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ENDÓFITOS BACTERIANOS E FÚNGICOS CULTIVÁVEIS PERTENCENTES A OTUs PRESENTES EM SEMENTES DE MILHO E TRIGO LOCAIS E SELVAGENS QUE FORAM PERDIDAS EM SEMENTES DE MILHO E TRIGO MODERNAS ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE MICRÓBIOS CULTIVÁVEIS

[00440] Para melhor compreender a função exercida pelos micróbios endofíticos derivados de sementes selvagens e locais na melhoria do vigor, saúde geral e resistência ao estresse de plantas agrícolas modernas, foram identificados micróbios cultiváveis que pertencem às mesmas OTUs que certos micróbios das Tabelas 12 a 19 que estavam presentes em sementes locais e selvagens, mas estavam presentes em níveis muito mais baixos em trigo ou milho moderno. Usando-se os mesmos métodos que no Exemplo 3 e outras técnicas conhecidas, os endófitos bacterianos foram cultivados a partir de uma variedade de partes de plantas e uma variedade de plantas. Para caracterizar com precisão os endófitos microbianos isolados, as colônias foram submetidas a sequenciamento de genes marcadores e as sequências foram analisadas para proporcionar classificações taxonômicas. Entre os micróbios cultivados, aqueles com pelo menos 97% de similaridade de sequência de 16S ou ITS a certos micróbios das Tabelas 12 a 15 foram identificados. Esses micróbios estão listados na Tabela 29A. TABELA 29A: ISOLADOS BACTERIANOS CULTIVADOS PERTENCENTES ÀS MESMAS OTUs QUE CERTAS BACTÉRIAS DAS TABELAS 12 A 15 QUE ESTAVAM PRESENTES EM SEMENTES LOCAIS E SELVAGEMS, PORÉM ESTAVAM PRESENTES EM NÍVEIS MUITO MENORES EM TRIGO OU MILHO MODERNO.

CARACTERIZAÇÃO DE MICRÓB ÍIOS CULTIVÁV EIS: PRODUÇÃO DE AUXINA, ACETOÍNA E SIDERÓFORO

[00441] Os micróbios cultiváveis pertencentes às mesmas OTUs que certos micróbios das Tabelas 12 a 15 que estavam presentes em sementes locais e selvagens mas estavam presentes em níveis muito mais baixos em trigo ou milho moderno foram, então, inoculados em placas de 96 poços e testados para a produção de auxina, acetoína e sideróforo, utilizando os métodos descritos no Exemplo 5 com pequenas modificações. Para a medição de auxina, inocularam-se 1 μl de culturas cultivadas de um dia para o outro de cepas bacterianas endofíticas em 750 μl de caldo R2A suplementado com L-TRP (5 mM) em placas de cultura de 96 mL de 2 mL. As placas foram vedadas com uma membrana respirável e incubadas a 23 ° C com agitação constante a 200 rpm durante 4 dias. Para medir a produção de anxina por cepas fúngicas, inocularam-se 3 μl de culturas fúngicas líquidas de 5 dias em 1 ml de caldo R2A suplementado com L- TRP (5 mM) em placas de cultura de 24 poços. As placas foram vedadas com fita respirável e incubadas a 23 ° C com agitação constante a 130 rpm durante 4 dias. Após 4 dias, 100 μL de cada cultura foram transferidos para uma placa de 96 poços. Adicionou-se 25 μL de reagente de Salkowski (1 mL de solução de FeCl3 0,5 M a 50 mL de HClO4 a 35%) em cada poço e as placas foram incubadas no escuro durante 30 minutos antes de tirar a fotografia e medir a obsorção de 540 nm utilizando o leitor de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices). Para as medições de acetoína, as cepas microbianas foram cultivadas como descrito acima em caldo R2A suplementado com glicose a 5%. Após 4 dias, 100 μL de cada cultura foram transferidos para uma placa de 96 poços e misturados com 25 μL de Reagentes de Barritt (ver Exemplo 4) e uma absorção de 525 nm foi medida. Para as medições de sideróforos, as cepas microbianas foram cultivadas como descrito acima em caldo R2A. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 29B. TABELA 29B: PRODUÇÃO DE AUXINA, SIDERÓFORO E ACETOÍNA POR BACTÉRIAS CULTIVÁVEIS PERTENCENTES A OTUs PRESENTES EM SEMENTES DE MILHO E TRIGO LOCAIS E SELVAGENS QUE ESTÃO PRESENTES EM NÍVEIS MAIS BAIXOS EM SEMENTES DE MILHO E TRIGO MODERNAS

[00442] No total, uma grande proporção das cepas bacterianas, 18 das 21 cepas testadas, foram capazes de utilizar Triptofano suplementado no meio e mostraram um nível detectável de desenvolvimento de cor rosa ou vermelho (a característica diagnóstica do ensaio sugerindo a produção de compostos auxina ou indol). 7 cepas (33% do total) tiveram uma produção particularmente forte de compostos de auxina ou indol. Quanto à produção de acetoína, 13 das 21 cepas testadas mostraram um nível detectável de cor rosa ou vermelho (um substituto da produção de acetoína). Particularmente, 5 destas 13 cepas tiveram uma forte produção de acetoína. 7 das 21 cepas testadas apresentaram um nível detectável de acúmulo de sideróforos. Entre estas 7 cepas, 3 cepas apresentaram acúmulo muito forte de sideróforo.

CARACTERIZAÇÃO DE MICRÓBIOS CULTIVÁVEIS: USO DE SUBSTRATO

[00443] Além de determinar se as cepas produzem auxina, acetoína e sideróforos, a capacidade destas linhagens se desenvolverem em uma variedade de substratos foi determinada. Culturas líquidas de micróbios foram primeiro sonicadas para alcançar homogeneidade. 1 mL de cultura de cada cepa foi colhido por centrifugação durante 10 minutos a 4500 RPM e, subsequentemente, lavado três vezes com água destilada estéril para remover quaisquer vestígios de meio residual. As amostras microbianas foram ressuspensas em água destilada estéril até uma OD590 final de 0,2. As medições de absorvância foram feitas utilizando um leitor de microplacas SpectraMax M (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

[00444] Realizaram-se ensaios de substrato de carbono único utilizando BIOLOG Phenotype MicroArray (PM) 1 e MicroPlacas 2A (Hayward, CA). Uma alíquota de cada cultura de células bacterianas (2,32 mL) foi inoculada em 20 mL de fluido de inoculação IF-0a GN/GP Base (IF-0) estéril, 0,24 mL de 100X Dye F obtido junto à BIOLOG e conduzido a um volume final de 24 mL com água destilada estéril. Os ensaios de controle negativo PM1 e PM2A foram também feitos de forma similar menos as células bacterianas para detectar reações abióticas. Uma alíquota de cultura fúngica (0,05 mL) de cada cepa foi inoculada em 23,95 mL de meio FF-IF obtido a partir de BIOLOG. As suspensões de células microbianas foram agitadas para se obter uniformidade. Adicionaram-se cem microlitros da suspensão de células microbianas por poço utilizando um pipetador multicanal para as MicroPlacas BIOLOG PM1 e PM2A de 96 poços que cada uma continha 95 fontes de carbono e um poço de apenas água (controle negativo). As microplacas foram vedadas em fita cirúrgica de papel (Dynarex, Orangeburg, NY) para evitar efeitos de borda da placa e incubadas estacionárias a 24°C em um recipiente fechado durante 70 horas. A absorvância a 590 nm foi medida para todas as MicroPlacas no final do período de incubação para determinar a utilização de substrato de carbono para cada cepa e normalizada relativamente ao poço de controle negativo (apenas água) de cada placa (Garland e Mills, 1991; Barua et al. Al., 2010, Siemens et al., 2012, Blumenstein et al., 2015). Os ensaios bacterianos foram também calibrados contra os dados de microplacas PM1 e PM2A de controle negativos (sem células) para corrigir quaisquer desvios introduzidos por meios na análise colorimétrica (Borglin et al., 2012). Os valores de absorvância corrigidos que foram negativos foram considerados como zero para análise subsequente (Garland e Mills, 1991, Blumenstein et al., 2015) e um valor limiar de 0,1 e superior foi utilizado para indicar a capacidade de uma determinada cepa microbiana de usar um dado substrato carbono (Barua et al., 2010; Blumenstein et al., 2015). Adicionalmente, as microplacas bacterianas foram examinadas visualmente quanto à formação irreversível de cor violeta em poços indicando a redução do corante redox de tetrazólio ao formazano resultante da respiração celular (Garland e Mills, 1991). Os testes PM fúngicos foram medidos como ensaios de crescimento e a observação visual do crescimento micelial em cada poço foi feita. TABELA 29C: UTILIZAÇÃO DE SUBSTRATO COMO DETERMINADO POR MICROPLACAS BIOLOG PM1 POR BACTÉRIAS CULTIVÁVEIS PERTENCENTES A OTUs PRESENTES EM SEMENTES DE MILHO E TRIGO LOCAIS E SELVAGENS QUE ESTÃO PRESENTES EM NÍVEIS MAIS BAIXOS EM SEMENTES DE MILHO E TRIGO MODERNAS.

TABELA 29D: UTILIZAÇÃO DE SUBSTRATO COMO DETERMINADO POR MICROPLACAS BIOLOG PM2A POR BACTÉRIAS CULTIVÁVEIS PERTENCENTES A OTUs PRESENTES EM SEMENTES DE MILHO E TRIGO LOCAIS E SELVAGENS QUE ESTÃO PRESENTES EM NÍVEIS MAIS BAIXOS EM SEMENTES DE MILHO E TRIGO MODERNAS.

[00445] Foram testadas doze cepas SYM de bactérias cultiváveis pertencentes a OTUs presentes em sementes de milho e trigo locais e selvagens que estão presentes em níveis mais baixos em sementes de milho e trigo modernas para utilização de substrato de carbono único utilizando Microplacas BIOLOG PM1 e PM2A. Os substratos mais utilizados por estas cepas são L-alanina, ácido-L-galactônico-y-lactona, maltose, maltotriose, D-celobiose, gentiobiose e D-glicosamina. Os substratos menos utilizados por L-asparagina, L-glutamina, ácido D- aspártico, ácido tricarbalílico, L-serina, L-fucose, 1,2-propanodiol, D- treonina, L-treonina, ácido succínico, ácido fumárico, ácido bromo succínico, fosfato de D-La-glicerol, ácido a-ceto-butírico, ácido a-hidróxi- butírico, ácido acetoacético, glicuronamida, ácido glicólico, mono-metil succinato, ácido glioxílico, feniletilamina e ácido L-málico.

[00446] Os substratos mais utilizados por um grande número de bactérias cultiváveis pertencentes a OTUs nucleares são ácido múcico, L-arabinose, ácido-L-galactônico-lactona, N-acetil-D-glicosamina, maltose, maltotriose e D-celobiose. Estas bactérias nucleares não utilizaram ácido sedoeptulosano, ácido oxálico, ácido 2-hidroxibenzóico, ácido quínico, manano, L-metionina, N-acetil-D-glicosaminitol, ácido sórbico, 2,3-butanona, ácido succínico, feniletilamina e 3-hidróxi-2- butanona como únicas fontes de carbono. Os resultados para os fungos cultiváveis pertencentes a OTUs nucleares indicam que D-sorbitol, L- arabinose, N-acetil-D-glicosamina, glicerol, tween 40, tween 80, ácido D-glucônico, L-prolina, a-D-glicose, D-trealose, maltose, lactulose, D- manose, D-manitol, sacarose, D-celobiose, ácido L-glutâmico, L-ornitina e ácido L-piroglutâmico são substratos de carbono que são utilizados por um grande número das cepas de endófitos examinadas aqui. O substrato de carbono que parecia não ser utilizado por fungos nestes ensaios é 2-desóxi-D-ribose. Todos os outros substratos poderiam ser utilizados como um único nutriente de carbono por pelo menos uma cepa de fungos SYM.

EXEMPLO 6: TESTE DE ENDÓFITOS BACTERIANOS E FÚNGICOS CULTIVÁVEIS PERTENCENTES A OTUS PRESENTES EM SEMENTES DE MILHO E TRIGO LOCAIS E SELVAGENS QUE FORAM PERDIDAS EM SEMENTES DE MILHO E TRIGO MODERNAS

[00447] Os resultados mostrados acima demonstram que os micróbios cultiváveis pertencentes às mesmas OTU presentes em sementes de milho e de trigo locais e selvagens que foram perdidas em sementes de milho e trigo locais e selvagens que possuem atividades que poderiam conferir traços benéficos a uma planta mediante a colonização. O objetivo dos experimentos nesta seção refere-se à capacidade destes endófitos bacterianos e fúngicos cultiváveis para conferir traços benéficos a uma planta hospedeira. Vários métodos diferentes foram usados para determinar isso. Em primeiro lugar, as plantas inoculadas com bactérias ou fungos foram testadas sob condições sem qualquer de estresse para determinar se o micróbio confere um aumento no vigor. Em segundo lugar, as plantas inoculadas com endófito foram testadas sob condições de estresse hídrico para testar se os micróbios conferem um aumento na tolerância a este estresse. Estes testes de crescimento foram realizados utilizando ensaios de crescimento em papel-filtro.

SEMENTES, ESTERILIZAÇÃO DE SEMENTE E INOCULAÇÃO DE SEMENTE

[00448] As sementes de milho foram esterilizadas em superfície com gás de cloro conforme descrito no Exemplo 5. Inóculos também foram preparados e as sementes foram inoculadas como descrito no Exemplo 5.

ENSAIO DE CRESCIMENTO EM PAPEL-FILTRO

[00449] Os endófitos bacterianos isolados de sementes como descrito no presente documento foram testados quanto à sua capacidade de promover o crescimento vegetal sob condições normais e de estresse inoculando-se sementes de milho com esses endófitos e germinando-os em papel-filtro. Cada endófito bacteriano a ser testado foi semeado em 20% de Ágar de Soja Tríptico, formando uma relva em placas de Petri regulares (9 cm de diâmetro). Uma vez que as bactérias cresceram até uma densidade elevada, o que aconteceu após um ou dois dias, dependendo da taxa de crescimento bacteriano, uma placa por cepa bacteriana foi raspada com o auxílio de uma alça estéril (enchendo todo o orifício da alça e produzindo uma gotícula de biomassa bacteriana de cerca de 20 mg). As bactérias coletadas desta maneira foram transferidas para 1 ml de Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) estéril a 50 mM em um tubo de microcentrífuga e completamente ressuspensas por agitação em vórtice durante ~ 20 segundos à velocidade máxima. Este método obtém bactérias altamente concentradas (~ 0,5-1 densidade óptica, correspondendo a cerca de 108 UFC/mL) e viáveis pré-adaptadas para revestir uma superfície.

[00450] A inoculação de sementes foi realizada por alíquota de ~ 100 sementes em um tubo de ensaio estéril de 50 ml com fundo cônico. Alginato de Sódio (SA) foi utilizado como adesivo e adicionado às sementes em uma proporção de 8,4 ml/kg de semente. Após a aplicação do volume apropriado de SA com o auxílio de uma pipeta automatizada, as sementes foram sacudidas para assegurar um revestimento homogêneo. Imediatamente após a adição da SA, um volume igual da suspensão bacteriana foi adicionado às sementes e estas foram suavemente agitadas para assegurar um revestimento homogêneo.

[00451] Os papéis-filtro foram autoclavados e colocados em placas de Petri e, então, pré-embebidos com soluções de tratamento. Para simular condições normais, 4 mL de água estéril foram adicionados aos filtros. Estresses por seca e salinos foram induzidos por adição de 4 mL de solução de PEG 6000 a 8% ou 100 mM de NaCl aos papéis-filtro. Oito sementes foram plaqueadas em triplicata para cada condição testada. As placas de Petri foram vedadas com fita cirúrgica para evitar perda de água evaporativa e secagem prematura dos papéis-filtro, randomizadas dentro de caixas de papelão para evitar efeitos de posição e colocadas em câmara de crescimento ajustada a 22°C, 60% de umidade relativa, no escuro por cinco dias.

PONTUAÇÃO DE RESULTADOS E ANÁLISE DE DADOS

[00452] Uma vez que as mudas se desenvolveram durante o período de tempo prescrito, as mesmas foram removidas de placas de petri, montadas sobre suporte de cartolina preta e fotografadas. Após a mudas serem fotografadas, as imagens foram processadas para recuperar as medições fenotípicas para análise estatística adicional. O pipeline de processamento de imagem consistia em um método de cultivo que isola o ensaio de mudas dos metadados periféricos, um método de segmentação que isola mudas individuais do fundo e uma ferramenta de fenotipagem rápida que mede características de morfologias de raízes de mudas isoladas.

[00453] Imagens brutas foram cortadas usando rotação de matriz e métodos de subamostragem incluídos no pacote numpy python. (Van Rossum 2006, van der Walt, 2011). A Segmentação adicional nas imagens recortadas foi realizada de forma diferente dependendo do genótipo da cultura: mudas de soja foram segmentadas usando um algoritmo de bacias hidrográficas no gradiente Sobel discreto da imagem cortada em escala de cinza, enquanto as mudas de trigo e milho foram segmentadas usando o algoritmo de limiar binário de Otsu no gradiente laplaciano discreto de um kernel gaussiano convolucionado com a imagem cortada em escala de cinza (Ando 2000, Otsu 1979). O processamento de imagem foi realizado utilizando ferramentas incluídas no pacote de python Scikit-Image (vanderWalt, et al., 2014). Finalmente, a biomassa de mudas (raiz e broto) de cada tratamento foi determinada usando a presente métrica de processamento de imagem.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

[00454] Os efeitos de endófitos bacterianos e fúngicos pertencentes a OTUs presentes em sementes locais e selvagens e combinações de endófitos bacterianos ou de endófitos fúngicos sobre o crescimento de sementes de milho em um ensaio de papel-filtro são mostrados nas Tabelas 30A e 30B.

[00455] Tabela 30A: Crescimento de sementes de milho tratadas com endófitos bacterianos pertencentes a OTUs presentes em sementes locais e selvagens que são encontradas em níveis mais baixos em sementes modernas. Legenda: 0 indica <0% de efeito, 1 indica-se <20% de efeito, 2 indica <40% de efeito, 3 indica> 40% de efeito. Para Efeito Biológico: sim indica> 5% ou <-5% efeito, não indica efeito entre -5% e + 5%.

[00456] No estresse salino, 12,5% dos inoculantes microbianos obtiveram melhora de > 40% no fenótipo da planta em comparação com as sementes que foram tratadas com a formulação sugerindo uma função na melhoria do vigor da planta sob condição de estresse salino. Um dos dois melhores representantes é Pantoea sp. (SYM00018) e estas cepas estavam entre os maiores produtores de auxinas testados, o que pode indicar importantes traços benéficos para a planta associada a este género. Sob estresse hídrico, 25% dos inoculantes microbianos provocaram uma melhoria de > 40% no fenótipo da planta, sugerindo uma função na melhoria do vigor da planta sob uma condição de estresse hídrico. As quatro cepas que proporcionaram a maior melhoria ao fenótipo da planta são provenientes de gêneros diferentes, e duas dessas SYM00013 e SYM00184, mostraram a capacidade de utilizar vários substratos de carbono diferentes incluindo: L-Arabinose, N-Acetil- D -Glicosamina, L-Alanina, D-Galactose, Ácido a-Hidróxi Glutárico- lactona, L-Alanil-Glicina, D-Xilose, Ácido múcico, D-Alanina e Uridina. Isto sugere que podem ter funções similares na provisão de proteção contra o estresse hídrico para a planta. Sob condições normais, 6,25% dos inoculantes microbianos obtiveram melhora de > 40% no fenótipo da planta em comparação com as sementes que foram tratadas com a formulação sugerindo uma função na melhora do vigor da planta sob condição de estresse salino. O principal representante sob condições normais é Pantoea sp. (SYM00018) e estas cepas estavam entre os maiores produtores de auxina testados que podem indicar importantes traços benéficos para a planta associada a este género.

[00457] Tabela 30B: Crescimento de sementes de milho tratadas com combinações de endófitos bacterianos pertencentes a OTUs presentes em sementes locais e selvagens que são encontradas em níveis mais baixos em sementes modernas. *Qualquer símbolo à esquerda do "/" refere-se ao comprimento da radícula primária com +, 0, - representando um aumento, nenhuma alteração ou redução relativamente às radículas de muda de controle, respectivamente. A escala (a-e) à direita do "/" refere-se a aumentos ou reduções relativas nas características secundárias das mudas, da seguinte forma: a) desenvolvimento do pelo radicular, b) número de raízes laterais, c) Comprimento do broto, e) espessura da raiz.

[00458] Um microbioma vegetal benéfico é provavelmente constituído por múltiplas cepas que ocupam nichos de proteção contra o estresse dentro da planta. Estas combinações de endófitos bacterianos particulares foram avaliadas em ensaios de germinação para testar a melhora no fenótipo da planta conferido pela inoculação com múltiplas cepas bacterianas. Em plantas com estresse hídrico, a combinação SYM00646/SYM00662 e SYM00662/SYM00025 proporcionou melhora no fenótipo da planta em comparação com o controle de formulação.

EXEMPLO 8: IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ENDÓFITOS BACTERIANOS E FÚNGICOS CULTIVÁVEIS PERTENCENTES A OTUs DE NÚCLEO ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE MICRÓBIOS CULTIVÁVEIS

[00459] Para entender melhor a função exercida pelos micróbios endofíticos derivados de sementes nucleares na melhora do vigor, saúde geral e resistência ao estresse de plantas agrícolas, foram identificados micróbios cultiváveis que pertencem às mesmas OTUs que as OTUs de núcleo das Tabelas 9 e 10. Utilizando-se os mesmos métodos que no Exemplo 3 e outras técnicas conhecidas, endófitos bacterianos e fúngicos foram cultivados a partir de uma variedade de partes de plantas e uma variedade de plantas. Para caracterizar precisamente os endófitos microbianos isolados, as colônias foram submetidas a sequenciamento de genes marcadores, e as sequências foram analisadas para fornecer classificações taxonômicas. Dentre os micróbios cultivados, foram identificados aqueles com pelo menos 97% de similaridade de sequência de 16S ou ITS a certos micróbios de Tabelas 9 e 10. Esses micróbios estão listados nas Tabelas 31A e 31B. TABELA 31A: ISOLADOS BACTERIANOS CULTIVADOS PERTENCENTES ÀS MESMAS OTUs COMO CERTAS BACTÉRIAS DA TABELA 9.

TABELA 31B: ISOLADOS FÚNGICOS CULTIVADOS PERTENCENTES ÀS MESMAS OTUs COMO CERTOS FUNGOS DA TABELA 10.

CARACTERIZAÇÃO DE MICRÓBIOS CULTIVÁVEIS, PRODUÇÃO DE ACETOÍNA E SIDERÓFORO

[00460] Os micróbios cultiváveis pertencentes às mesmas OTUs que certos micróbios das Tabelas 9 ou Tabela 10 foram, então, inoculados em placas de 96 poços e testados quanto à produção de auxina, acetoína e sideróforo, utilizando os métodos descritos no Exemplo 4. Os resultados são apresentados nas Tabelas 32A e 32B. TABELA 32A: PRODUÇÃO DE AUXINA, SIDERÓFORO E ACETOÍNA POR BACTÉRIAS CULTIVÁVEIS PERTENCENTES A OTUs NUCLEARES

[00461] No total, uma proporção muito grande das cepas bacterianas, 44 das 55 cepas (80% do total) testadas, foram capazes de utilizar Triptofano suplementado no meio e mostraram um nível detectável de desenvolvimento de cor rosa ou vermelho (a característica diagnóstica do ensaio sugerindo a produção de compostos auxina ou indol). Essas incluem 8 Bacillus spp., 5 Paenibacillus spp., 6 Pantoea spp., e 5 Enterobacter spp. 10 cepas (18% do total) apresentaram produção particularmente forte de compostos auxina ou indol. Quanto à produção de acetoína, 32 das 21 cepas (58% do total) testadas mostraram um nível detectável de cor rosa ou vermelho (um substituto da produção de acetoína). Essas incluem 6 Enterobacter spp., 5 Paenibacillus spp., e 4 Bacillus spp. Particularmente, 12 destas 32 cepas tiveram uma forte produção de acetoína. 22 das 55 cepas (42% do total) testadas apresentaram um nível detectável de acúmulo de sideróforos. Essas incluem 4 Bacillus spp., 4 Paenibacillus spp., 4 Enterobacter spp., e 3 Pseudomonas spp. Entre estas 23 cepas, 5 cepas apresentaram acúmulo muito forte de sideróforo. TABELA 32B: PRODUÇÃO DE AUXINA, SIDERÓFORO E ACETOÍNA POR FUNGOS CULTIVÁVEIS PERTENCENTES A OTUs DE NÚCLEO

[00462] No otal, a maioria dos fungos não foi capaz de utilizar L- triptofano suplementado no meio. 17 das 51 cepas testadas (31% do total) apresentaram um nível detectável de desenvolvimento cor de rosa ou vermelho (a característica diagnóstica do ensaio sugerindo produção de composto auxina ou indólico). Estes incluem 5 Acremonium spp., 4 Alternaria spp., e 3 Fusariam spp. Apenas 2 cepas (4% do total) tiveram produção particularmente forte de compostos auxina ou indol. Quanto à produção de acetoína, 17 das 54 cepas (31% do total) testadas mostraram um nível detectável de cor rosa ou vermelho (um substituto da produção de acetoína). Essas incluem 5 Fusarium spp., 4 Alternaria spp., e 4 Acremonim spp. Particularmente, apenas 1 dessas 17 cepas apresentaram forte produção de acetoína. 13 das 21 cepas (24% do total) testadas mostraram um nível detectável de acúmulo de sideróforo. Essas incluem 4 Alternaria spp., 4 Acremonium spp., e 3 Fusarium spp. Dentre essas 13 cepas, 2 cepas mostraram acúmulo muito forte de sideróforo.

CARACTERIZAÇÃO DE MICRÓBIOS CULTIVÁVEIS: USO DE SUBSTRATO

[00463] O protocolo BIOLOG foi conduzido da mesma maneira como descrito anteriormente. A capacidade de uma cepa utilizar um substrato de carbono específico nas Microoplacas BIOLOG PM1 ou PM2A pode ser determinada por ensaio colorimétrico e turbidez aumentada devido ao crescimento celular naquele poço particular (Tabelas 32C, 32D, 32E e 32F).

EXEMPLO 9. TESTE DE ENDÓFITOS BACTERIANOS E FÚNGICOS CULTIVÁVEIS PERTENCENTES A OTUs NUCLEARES EM PLANTAS

[00464] Os resultados mostrados acima demonstram que os micróbios cultiváveis pertencentes às mesmas OTUs que os micróbios de trigo, soja, algodão e milho (bactérias) ou trigo, algodão e milho (fungos) possuem atividades que poderiam conferir traços benéficos a uma planta mediante a colonização. O objetivo dos experimentos nesta seção aborda a capacidade desses endófitos cultiváveis e fúngicos cultiváveis para conferir traços benéficos em uma planta hospedeira. Vários métodos diferentes foram usados para determinar isso. Em primeiro lugar, as plantas inoculadas com bactérias ou fungos foram testadas sob condições sem qualquer estresse para determinar se o micróbio confere um aumento no vigor. Em segundo lugar, as plantas inoculadas com endófito foram testadas sob condições de estresse específicas (por exemplo, estresse salino ou estresse pela seca) para testar se as bactérias conferem um aumento na tolerância a estes estresses. Estes testes de crescimento foram realizados utilizando três métodos diferentes: usando ensaios de crescimento em placas de água- ágar; usando ensaios de crescimento em papéis-filtro estéreis; e ensaios de crescimento em papel de germinação de sementes (para enrolamento). As sementes foram tratadas com uma única cepa bacteriana ou fúngica, ou com uma combinação de duas cepas bacterianas duas fúngicas.

SEMENTES E ESTERILIZAÇÃO DE SEMENTES

[00465] Sementes de soja, milho ou trigo foram esterilizadas em superfície com gás de cloro e ácido clorídrico como descrito no Exemplo 5. As sementes foram, então, revestidas com endófitos bacterianos ou fúngicos como descrito no Exemplo 5. No entanto, a quantidade de Alginato de Sódio e a suspensão bacteriana ou o inóculo fúngico foi ajustada para o trigo para 15 ml/kg para explicar a razão superfície/volume maior destas pequenas sementes.

CRESCIMENTO & AUMENTO DE FUNGOS PARA INOCULAÇÃO

[00466] Os isolados fúngicos foram cultivados a partir de um estoque congelado em placas de Petri contendo ágar de dextrose de batata e as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante cerca de uma semana. Após o desenvolvimento de micélios e esporos, foram utilizados quatro tampões de ágar (1 cm de diâmetro) para inocular erlenmeyers contendo 150 ml de caldo de dextrose de batata. As culturas líquidas foram desenvolvidas à temperatura ambiente e agitação em um agitador orbital a 115 rpm durante 4 dias. Em seguida, as culturas foram transferidas para tubos de teste estéreis de 50 ml com fundos cónicos. As camadas de micélio foram rompidas por sonicação por pulsos a 75% de ajuste e 3 pulsos de 20 segundos cada, utilizando um sonicador Fisher Scientific (Modelo FB120) com uma sonda manual (CL-18). As culturas sonicadas foram utilizadas da mesma maneira que as suspensões bacterianas para inoculação de sementes.

ENSAIOS DE ÁGUA-ÁGAR

[00467] Os endófitos bacterianos ou fúngicos pertencentes a OTUs microbianas nucleares foram testados quanto à sua capacidade de promover o crescimento vegetal sob condições normais e de estresse salino ou estresse pela seca inoculando-se sementes de trigo e de soja com esses endófitos e germinando-os em papel-filtro e/ou água-ágar.

[00468] Para testar o efeito dos endófitos sobre a soja sob estresse salino, as sementes de soja tratadas foram colocadas em placas de Petri (15 cm em diâmetro) carregadas com 50 ml de água-ágar (1,3% de bactoágar) e carregadas com 50 ml de ágar-água com 100 mM de NaCl para estresse salino. Três placas de Petri por tratamento (cada cepa bacteriana, sementes de controle tratadas com a formulação ou não tratadas) e 8 sementes por placa de Petri foram usadas. As sementes foram colocadas nas placas de Petri dentro de uma coifa biossegura laminar usando um fórceps anteriormente flamejado. As placas de Petri foram vedadas com fita cirúrgica, randomizadas para evitar efeitos de posição e colocadas em uma câmara de crescimento ajustada a 22°C, 60% de umidade relativa, no escuro por cinco dias. Para testar o efeito do estresse salino sobre o trigo, realizou-se um ensaio em ágar-água utilizando placas quadradas de 245 mm de comprimento em cada lado (Corning). Cada placa continha 100 ml de ágar água (1,3%) para a condição normal e suplementada com 100 mM de NaCl para o estresse salino. Duas placas foram usadas por tratamento e as sementes foram dispostas em duas fileiras de 6 sementes, cada uma ao longo do meio da placa, com os embriões voltados para fora de modo que as raízes possam crescer a partir do meio da placa para fora e em direções opostas, minimizando o cruzamento de raízes cruzando entre as mudas.

[00469] Após 5 dias de crescimento, imagens digitais das mudas foram obtidas e os dados foram pontuados e analisados como indicado no Exemplo 6. Os efeitos dos endófitos bacterianos e fúngicos nucleares, individualmente ou em combinação, em mudas de soja são mostrados em Tabelas 33A e B e 34A e B. Os efeitos dos endófitos bacterianos e fúngicos nucleares, individualmente ou em combinação, sobre mudas de trigo são mostrados nas Tabelas 35A e B e 36A e B. Tabela 33A: Ensaio para o crescimento de mudas de soja em condições de ágar-água, em que as sementes de soja foram tratadas com endófitos bacterianos nucleares. Legenda: 0 indica <0% de efeito, 1 indica <20% de efeito, 2 indica <40% de efeito, 3 indica> 40% de efeito. Para Efeito Biológico: sim indica> 5% ou <5% efeito, não indica efeito entre -5% e + 5%.

[00470] As mudas d e soja tra tadas com SYM00009 SYM00020, SYM00212, SYM00234, SYM00506c, SYM00507, SYM00525, SYM00538i, SYM00963 e SYM00982 mostraram melhor desempenho total em relação às plantas tratadas apenas com formulação. Estas estirpes conseguiram uma melhora de até 40% em condições normais. Sob condições de estresse salino, quatro cepas SYM realizaram até 20% melhor em relação à formulação somente. Estes dados são indicativos dos efeitos benéficos das muitas cepas SYM bacterianas nucleares na soja sob condições estressadas normais e bióticas.

[00471] Estas cepas apresentaram até 40% de melhora em condições normais. Sob condições de estresse salino, quatro cepas SYM realizaram até 20% melhor em relação à formulação individualmente. Estes dados são indicativos dos efeitos benéficos das muitas cepas SYM bacterianas nucleares sobre a soja sob condições normais e de estresse biótico.

[00472] Com base nos ensaios de fonte de carbono BIOLOG, SYM00212 que é uma das cepas que conferiu efeitos benéficos sobre a soja também é capaz de utilizar L-prolina como uma única fonte de carbono. Está bem estabelecido que o nível de prolina endógena é elevado em plantas submetidas a estresses de seca e salinos (Chen e Murata, 2002). Esse fenômeno pode permitir que mais nutrientes se tornem disponíveis para endófitos que vivem simbioticamente com plantas hospedeiras expostas a estresses abióticos. Por conseguinte, poderia ser possível que a capacidade de endófitos como SYM00212 de purificar e utilizar aminoácidos acumulados tais como prolina esteja associada à sua capacidade de conferir efeitos benéficos à planta hospedeira. Tabela 33B: Ensaio para o crescimento de mudas de soja em condições de água-ágar, em que as sementes de soja foram tratadas com combinações de endófitos bacterianos de núcleo. Legenda: 0 indica <0% de efeito, 1 indica <20% de efeito, 2 indica <40% de efeito, 3 indica> 40% de efeito. Para Efeito Biológico: sim indica> 5% ou <-5% efeito, não indica efeito entre -5% e + 5%.

[00473] Sob condições normais, 12,8% das combinações de bactérias nucleares aplicadas a sementes de soja resultaram em um aprimoramento de> 20% no fenótipo global de mudas em comparação com o tratamento apenas com a formulação. Em particular, as cepas bacterianas de núcleo SYM00053, SYM00207 e SYM00628 forneceram, cada uma, duas combinações com outras cepas que melhoraram o fenótipo medido em> 20% em comparação com o tratamento apenas com a formulação. Em combinação, estas cepas parecem conferir sinergicamente benefícios em relação ao desenvolvimento da planta. 46,8% das combinações de bactérias nucleares resultaram em um efeito biológico positivo > 5% e 29,8% das combinações de bactérias nucleares resultaram em um efeito biológico negativo de > 5% em comparação com o tratamento apenas com a formulação, indicando atividade das cepas bacterianas no desenvolvimento precoce da semente.

[00474] Sob estresse salino, 14,9% das combinações de bactérias nucleares aplicadas a sementes de soja resultaram em um efeito biológico positivo de> 5% e 14,9% das combinações de bactérias nucleares resultaram em um efeito biológico negativo de > 5% em comparação com tratamento apenas com a formulação, indicando atividade das cepas bacterianas nos estágios iniciais de desenvolvimento da semente. Tabela 34A: Ensaio para o crescimento de mudas de soja em condições de água-ágar, em que as sementes de soja foram tratadas com endófitos fúngicos nucleares. Legenda: 0 indica <0% de efeito, 1 indica <20% de efeito, 2 indica <40% de efeito, 3 indica> 40% de efeito. Para Efeito Biológico: sim indica> 5% ou <-5% efeito, não indica efeito entre -5% e + 5%.

[00475] Das 53 cepas de fungos nucleares de semente testadas em bioensaios de soja, 26 (50%) tiveram efeitos acentuadores de crescimento (> 20% de aumento de crescimento) em mudas sob condições normais, enquanto 6 (12%) tiveram efeitos acentuadores de crescimento sob condições salinas.

[00476] Todos os fungos SYM00066, SYM00122, SYM00135, SYM00880, SYM01315, SYM01327, SYM01333, SYM15811, SYM15820, SYM15821, SYM15870, SYM15872, SYM15890, SYM15901, SYM15920, SYM15932, e SYM15939 apresentaram fortes efeitos sobre o crescimento de muda de mais de 40% sob condições normais. 71% destas cepas são capazes de metabolizar L-arabinose e Sacarose, enquanto 64% são capazes de metabolizar L-Prolina, D- Trealose e D-Manose que são osmólitos compatíveis produzidos por plantas e micróbios sob condições de estresse hídrico. Sob condições de stress salino, nenhuma cepa aumentou o crescimento de mudas em mais de 40% em relação ao controle, no entanto SYM15872 e SYM01327 que tiveram efeitos fortes sob condições normais apresentaram efeitos moderados. Apesar de não serem capazes de aumentar significativamente o crescimento de mudas sob condições normais, SYM15932, SYM15825, SYM00629 e SYM00566B foram capazes de aumentar moderadamente o crescimento vegetal sob condições de estresse salino (20 a 40%). Tabela 34B: Ensaio para o crescimento de mudas de soja sob condições de água-ágar, em que as sementes de soja foram tratadas com combinações de endófitos fúngicos de núcleo. Legenda: 0 indica <0% efeito, 1 indica <20% efeito, 2 indica <40% efeito, 3 indica> 40% efeito. Para Efeito Biológico: sim indica> 5% ou <-5% efeito, não indica efeito entre -5% e + 5%.

[00477] Sob condições normais, 5 de 51 cepas (10% do total) conferiram um efeito benéfico com mais de 20% de aumento de crescimento incluindo duas combinações (SYM15890 + SYM15870 e SYM15821 + SYM15870) que tinham um aumento de crescimento superior a 40%. Sob estresse salino 11 das 51 cepas (22% do total) apresentaram aumento de significância (superior a 5%) em crescimento comparado com formulação Tabela 35A: Ensaio para o crescimento de mudas de trigo em condições de ágar-água, em que as sementes de trigo foram tratadas com endófitos bacterianos nucleares. Legenda: 0 indica <0% de efeito, 1 indica <20% de efeito, 2 indica <40% de efeito, 3 indica> 40% de efeito. Para Efeito Biológico: sim indica> 5% ou <5% efeito, não indica efeito entre -5% e + 5%.

[00478] Em geral, as mudas de trigo revestidas com endófito bacteriano funcionam bem em comparação com o controle de formulação sob condições normais, isto é, ágar-água. 17 das 47 cepas testadas (36% do total) exibiram mais de 20% do aumento em crescimento e conferiram um efeito benéfico significativamente notável às mudas de trigo. Sob a condição de estresse salino (ágar-água suplementado com 100 mM de NaCl), 12 das 44 estirpes testadas (25% do total) exibiram mais de 20% de aumento no crescimento, enquanto 6 das 47 cepas (12% do total) apresentaram mais de 40% do aumento no crescimento. Particularmente, 3 cepas, SYM00184, SYM00249 e SYM00628 conferiram um efeito benéfico a mudas de trigo em condições e de estresse salino. Tabela 35B: Ensaio para o crescimento de mudas de trigo em condições de agar-água, em que as sementes de trigo foram tratadas com combinações de endófitos bacterianos nucleares. Legenda: 0 indica <0% de efeito, 1 indica <20% de efeito, 2 indica <40% de efeito, 3 indica> 40% de efeito. Para Efeito Biológico: sim indica> 5% ou <-5% efeito, não indica efeito entre -5% e + 5%.

[00479] Sob Condições Normais (Água-ágar), 16 De 39 (41% De Totais) Combinações De Endófitos Bacterianos Conferiram Um Efeito Benéfico Notável Com Um Aumento De Crescimento Superior A 20%. De Modo Similar, Sob Condições De Estresse Salino (Água-ágar Suplementado Com 100 Mm De Nacl), 2 De 39 (5% Do Total) Combinações Testadas Conferiram Um Efeito Benéfico Notável Com Um Aumento De Crescimento Superior A 20%. Coletivamente, Há 3 Combinações Que Conferiram Um Efeito Em Todas As Condições Experimentais. Entre As 6 Cepas Nestas Combinações (3 Combinações X2), Sym00050, Sym00053, Sym00508, Sym00574, Sym0628 E Sym01049 Conferiram Um Efeito Benéfico A Mudas De Trigo Em Condições Normais E De Estresse Salino. Tabela 36a: Ensaio Para O Crescimento De Mudas De Trigo Em Condições De Água-ágar, Em Que As Sementes De Trigo Foram Tratadas Com Endófitos Fúngicos Nucleares. Legenda: 0 Indica <0% De Efeito, 1 Indica <20% De Efeito, 2 Indica <40% De Efeito, 3 Indica> 40% De Efeito. Para Efeito Biológico: Sim Indica> 5% Ou <-5% Efeito, Não Indica Efeito Entre -5% E + 5%.

[00480] Sob a condição normal (água-ágar), dos 53 endófitos fúngicos testados, 26 (~ 50% do total) conferiram um efeito benéfico ao trigo com mais de 50% de aumento no crescimento. Esses incluem 7 Fusarium spp., 4 Acremonium spp., 4 Alternaria spp., e 4 Cladosporium. Curiosamente, esses 4 grupos fungos também são top-hits (ocorrências mais relevantes) em produção de composto auxina e indólico, acúmulo de acetoína e acúmulo de sideróforo (Exemplo 5, Tabela 36B). Isto sugere uma correlação entre o acúmulo de auxina, composto indólico, acetoína e sideróforo e o efeito benéfico. Surpreendentemente, não foi possível identificar quaisquer cepas fúngicas que conferissem um efeito benéfico ao trigo em condições de estresse salino (ágar-água suplementado com 100 mM de NaCl). Tabela 36B: Ensaio para o crescimento de mudas de trigo em condições de ágar-água, em que as sementes de trigo foram tratadas com combinações de endófitos fúngicos nucleares. *Qualquer símbolo à esquerda do "/" refere-se ao comprimento da radícula primária com +, 0, - representando um aumento, nenhuma alteração ou redução relativa às radículas de muda de controle, respectivamente. A escala (a-e) à direita do "/" refere-se a aumentos ou reduções relativas nas características secundárias das mudas, da seguinte forma: a) desenvolvimento do pelo radicular, b) número da raiz lateral, c) comprimento de raiz lateral, d) comprimento do broto e e) espessura da raiz.

[00481] Sob condições normais (água-ágar), quatro combinações de endófitos fúngicos nuclearem conferem um efeito benéfico notável com maior crescimento radicular em relação a sementes tratadas apenas com a formulação. Sob condição de estresse salino (água-ágar suplementado com 100 mM de NaCl), sete combinações que foram testadas conferiram um efeito benéfico notável com um maior comprimento de raiz em comparação com as sementes de trigo tratadas apenas com a formulação.

ENSAIO DE CRESCIMENTO EM PAPEL-FILTRO

[00482] As sementes de trigo foram esterilizadas e revestidas com o endófito apropriado como descrito no Exemplo 7. Foram então colocadas em ensaios de crescimento de papel de filtro como descrito no Exemplo 6. Após 5 a 8 dias de crescimento, uma fotografia de cada placa foi tirada e analisada como descrito no Exemplo 6.

[00483] Os efeitos de endófitos bacterianos e fúngicos pertencentes a OTUs nucleares sobre o crescimento de sementes de trigo em um ensaio em papel-filtro são apresentados nas Tabelas 37A e B e 38A e B. Tabela 37A: Crescimento de sementes de trigo tratadas com endófitos bacterianos pertencentes a OTUs presentes em sementes de milho, trigo, algodão e soja. Legenda: 0 indica <0% de efeito, 1 indica <20% de efeito, 2 indica <40% de efeito, 3 indica> 40% de efeito. Para Efeito Biológico: sim indica> 5% ou <-5% efeito, não indica efeito entre -5% e + 5%.

[00484] Sob condições normais (papel-filtro embebido em água estéril), 12 das 32 cepas testadas (38% do total) conferiram efeito benéfico ao trigo com mais de 20% de aumento no crescimento, enquanto que 6 das 43 cepas (14% do total) testado apresentaram efeito benéfico sob condições de estresse hídrico (papel-filtro embebido com PEG 6000 a 8%). Os endófitos bacterianos tratados em sementes de trigo e testados em ensaios em papel-filtro que produziram efeitos benéficos pertencem a uma grande diversidade de gêneros: Pseudomonas, Curtobacterium, Paenibacillus, Bacillus, Enterobacter, Agrobacterium, Chrysobacterium, Escherichia e Methylobacterium. Não observou-se sobrerrepresentação de certos grupos taxonômicos de bactérias. Todas estas bactérias produziram níveis intermédios a elevados de produção de auxina, acetoína e sideróforo (Exemplo 5, Tabela 34A) e são capazes de metabolizar números intermediários a grandes de substratos (Tabela 31B). As exceções a estes eram SYM00982 que tinha baixos níveis de produção de sideróforos e apenas 3 substratos metabolizados e SYM00999 que tinha baixos níveis tanto de produção de sideróforo como de auxina e metabolizou 6 substratos. Tabela 37B: Crescimento de sementes de trigo tratadas com combinações de endófitos bacterianos, pertencentes a OTUs presentes em sementes de milho, trigo, algodão e soja.

[00485] Uma variedade de combinações binárias de endófitos bacterianos confere um benefício sob condições sem estresse e/ou de estresse hídrico. SYM00207, por exemplo, está presente em várias combinações que proporcionam um benefício sob condições normais, incluindo em combinação com SYM00574 ou SYM01049. Nenhuma destas cepas individualmente confere um benefício a plantas em condições normais. SYM00628 proporciona um benefício observável sob condições normais e limitadas em água. O benefício sob condições normais é aumentado quando SYM00628 é combinado com SYM00991, o mesmo também proporciona um benefício relativamente inferior sob a condição normal. SYM00628 pertence ao gênero Enterobacter, enquanto SYM00991 pertence ao gênero Acidovorax. TABELA 38A: CRESCIMENTO DE SEMENTES DE TRIGO TRATADAS COM ENDÓFITOS FÚNGICOS PERTENCENTES A OTUs PRESENTES EM SEMENTES DE MILHO, TRIGO E ALGODÃO

[00486] Sob condições normais (papel-filtro com água estéril), dos 53 endófitos fúngicos testados, 34 (~ 61% do total) conferiram um efeito benéfico ao trigo com mais de 20% de aumento no crescimento. Vários grupos taxonômicos de fungos, incluindo Fusarium, Acremonium, Alternaria, e Cladosporium, estão sobrerrepresentados. Curiosamente, estes 4 grupos de fungos são também top-hits na produção de compostos de auxina e indólicos, acúmulo de acetoína e acúmulo de sideróforo (Exemplo 5, Tabela 32B). Isto sugere uma correlação entre o acúmulo de auxina, composto indólico, acetoína e sideróforo e o efeito benéfico. Sob condições de estresse hídrico (papel-filtro com 8% de PEG 6000), 8 das 53 cepas testadas (15% do total) conferiram um efeito benéfico ao trigo com mais de 20% de aumento do crescimento. De modo similar, os top-hits pertencem aos gêneros de Fusarium, Al-ternaria, Acremonium e Cladosporium. No entanto, a sobrerrepresentação desses grupos taxonômicos não foi observada. De todas as cepas testadas, 9 cepas, incluindo 3 Alternaria spp. e 2 Fusarium spp., conferiram um efeito benéfico ao trigo em condições normais e de estresse hídrico. Tabela 38B: Crescimento de sementes de trigo tratadas com combinações de endófitos fúngicos pertencentes a OTUs presentes em sementes de milho, trigo e algodão. Legenda: 0 indica <0% efeito, 1 indica <20% efeito, 2 indicações <40% efeito, 3 indica> 40% efeito. Para Efeito Biológico: sim indica-se> 5% ou <5% efeito, não indica efeito entre -5% e + 5%.

[00487] Diversas combinações de cepas SYM fúngicas nucleares mostraram efeitos benéficos sobre o trigo sob condições normais e de estresse hídrico. O efeito combinatório destas cepas benéficas foi indicativo de mecanismos subjacentes sinérgicos globais que conduzem ao efeito benéfico sobre as mudas tratadas com essas cepas. Em particular, a combinação de SYM01315 + SYM15901 mostrou até 40% de efeito benéfico sobre as plantas de trigo em condições normais e de estresse hídrico em relação mudas de trigo tratamento apenas com a formulação. SYM01315 é capaz de utilizar L- prolina como um único substrato de carbono com base em ensaios BIOLOG. De modo similar, a prolina também era uma única fonte de carbono para SYM15901. Em conjunto, é altamente sugestivo que a capacidade de as cepas SYM utilizarem eficientemente prolina que é elevada sob estresses bióticos visto que água e sal consiste em um componente essencial potencial para conferir proteção à planta contra estresse hídrico.

ENSAIO EM PAPEL DE ENROLAR PARA AVALIAR A GERMINAÇÃO DE SEMENTE E TOLERÂNCIA À SECA DA MUDA

[00488] As sementes de soja foram esterilizadas e revestidas com o endófito apropriado como descrito no Exemplo 5. Um papel de germinação de sementes de peso normal (Anchor Paper Co.) foi utilizado para testar o efeito dos endófitos sobre a soja sob estresse hídrico. Em suma, o papel foi cortado sob medida a 60 cm X 15 cm e embebido em água estéril. Dezesseis sementes foram colocadas ao longo do meio (7,5 cm da borda) do eixo mais longo de um pedaço de papel, equidistantes um do outro. Um segundo pedaço de papel pré- embebida foi colocado sobre as sementes e o "sanduíche" criado desta maneira foi enrolado a partir de uma extremidade, tendo o cuidado de manter as sementes em posição, para formar um tubo com 15 cm de altura e cerca de 5 cm de diâmetro. Cada rolo de papel foi colocado verticalmente dentro de um frasco de vidro estéril com uma tampa para manter a água absorvida em papel de enrolar e foi, então, incubado em uma câmara de crescimento ajustada a 22°C, 60% de umidade relativa, no escuro durante dois dias. Em seguida, os frascos foram abertos e incubados durante mais dois dias com as condições alteradas para 12 horas à luz do dia (300 a 350 micro Einstein) 12 horas no escuro e 70% de umidade relativa.

[00489] A pontuação de dados e análises foram feitas manualmente, e os dados são apresentados em uma binagem de % de aumento no comprimento da raiz versus controle de formulação fúngica: >0% = 0, 0 a 5% = 1, 5 a 10% = 2, 10 a 15% = 3.

[00490] Os efeitos de endófitos bacterianos e fúngicos pertencentes a OTUs nucleares e combinações de endófitos bacterianos e fúngicos sobre o crescimento de sementes de soja em um ensaio de papel de enrolar são mostrados nas Tabelas 39 e 40A e B Tabela 39: Ensaio para o crescimento de mudas de soja em papel de enrolar, onde as sementes de soja foram tratadas com endófitos bacterianos nucleares. Medições de pontuação manual de ensaio de estresse hídrico de soja em papel de enrolar para cepas fúngicas nucleares foram feitas de acordo com a escala estabelecida anteriormente. Em suma, a pontuação que foi utilizada foi: <0% = 0; > 0% = 1; > 5% = 2 e > 10% = 3. A percentagem indica percentagem de alteração dos tratamentos em relação à formulação. Os comprimentos médios de raiz das réplicas biológicas de mudas de soja tratadas com SYM foram divididos em relação aos comprimentos médios de raiz da formulação fúngica.

[00491] Sob estresse hídrico, 73% das cepas bacterianas apresentaram efeito benéfico em comparação com controle superior a 20%, incluindo SYM00018, SYM00020 e SYM00219. Strains SYM00013, SYM00017A, SYM00070, SYM00525, SYM00538A, SYM00538i, SYM00627, SYM00987 (53,3% do total) mostraram efeito benéfico superior a 40%. Tabela 40A: Ensaio para o crescimento de mudas de soja em papel de enrolar, onde as sementes de soja foram tratadas com endófitos fúngicos nucleares. As medições para pontuação manual de ensaio de estresse hídrico de soja em papel de enrolar para cepas de fungos nucleares foram feitas de acordo com a escala estabelecida anteriormente. Em suma, a pontuação que foi utilizada foi: <0% = 0; > 0% = 1; > 5% = 2, e > 10%=3. A percentagem indica percentagem de alteração dos tratamentos em relação à formulação. Os comprimentos médios de raiz das réplicas biológicas de mudas de soja tratadas com SYM foram divididos em relação aos comprimentos médios de raiz da formulação fúngica.

[00492] Os experimentos de estresse hídrico que examinam o efeito de cepas fúngicas SYM sobre plantas de soja revelaram várias cepas muito promissoras que exibiram mais de 10% de aumento no comprimento de raiz de muda e relação a mudas tratadas apenas com a formulação. Essas eram SYM00122, SYM00124, SYM00135, SYM00741b, SYM01315, SYM01333, SYM15811, SYM15831, SYM15890, SYM15901 e SYM15932. Três cepas tiveram > 5% de aumento no comprimento de raiz, enquanto três mostraram >0% de aumento no comprimento de raiz em comparação com plantas tratadas apenas com a formulação.

[00493] Oito destas onze tinham a capacidade de utilizar L-prolina como único nutriente de carbono em testes de substrato BIOLOG. Está bem estabelecido que o nível de prolina é elevado em plantas expostas a estresses salino e hídrico. Estes dados podem indicar que, embora as cepas SYM tenham sido originadas de gêneros diferentes, as mesmas podem compartilhar mecanismos subjacentes similares quando se trata de afetar o fenótipo das plantas na atenuação do estresse por seca das plantas. Tabela 40B: Ensaio para crescimento de mudas de soja em papel laminado, onde as sementes de soja foram tratadas com combinações de endófitos fúngicos nucleares. As medições para a pontuação manual de ensaio de estresse hídrico de soja em papel de enrolar para as cepas fúngicas nucleares foram feitas de acordo com a escala estabelecida anteriormente. Em suma, a pontuação que foi utilizada foi: <0% = 0; > 0% = 1; > 5% = 2 e > 10% = 3. A percentagem indica percentagem de alteração dos tratamentos em relação à formulação. Os comprimentos médios de raiz das réplicas biológicas de mudas de soja tratadas com SYM foram divididos em relação aos comprimentos médios de raiz da formulação fúngica.

[00494] Um microbioma de planta benéfico é provavelmente constituído por múltiplas cepas que ocupam nichos de proteção contra o estresse dentro da planta. Isto foi avaliado no ensaio de papel de enrolar para testar a melhoria no fenótipo da planta conferido pela inoculação com múltiplas cepas fúngicas. Os três melhores representantes utilizam a-Ciclodextrina, que é um traço compartilhado por todos os tratamentos com fungos únicos que provocaram a mudança fenotípica vegetal mais positiva. A maioria das cepas que são parte das combinações também mostram padrões similares quando se trata de produção de sideróforos e auxinas. Isso pode indicar que, embora as mesmas sejam provenientes de gêneros diferentes, as mesmas podem ocupar nichos semelhantes quando se trata de afetar o fenótipo plantas ao ajudar a planta a lidar com o estresse pela seca.

EXEMPLO 10: TESTES PARA MATURAÇÃO PLENA DE PLANTAS PARA DEMONSTRAR O DESEMPENHO EM AMBIENTE DE CAMPO COMERCIAL PERFORMANCE

[00495] O milho foi cultivado em dois locais nos Estados Unidos. Seis lotes em réplica foram semeados para cada tratamento e combinação de variedades. Os lotes de controle foram plantados para sementes tratadas com formulação. As sementes foram semeadas em campo irrigado em lotes de 10 x 40 pés dispostas em um desenho em de blocos completo randomizado. Quatro fileiras foram plantadas por lote com um espaçamento entre as fileiras de 30 polegadas. A densidade de semeadura no local 1 foi de 576 g por acre. A densidade de semeadura no Local foi de 35.000 sementes por acre. As leituras de SPAD foram feitas no Local 2 apenas para 10 plantas por lote três meses após o plantio (um mês antes da colheita) para medir o teor de clorofila das folhas. As 2 fileiras internas foram colhidas por colheitadeira. O rendimento de grãos por lote, a umidade dos grãos e o peso de teste foram avaliados. O rendimento foi ajustado para o teor de umidade do grão a uma umidade de armazenamento de 14% (isto é, alqueires secos por acre para colheita com colheitadeira). Os dados mostrados para ambos os locais são mostrados nas Tabelas 41A e 41B. TABELA 41A TESTE DE IRRIGAÇÃO PLUVIAL NO LOCAL 1.

TABELA 41B TESTE DE IRRIGAÇÃO PLUVIAL NO LOCAL 2.

Comparação com controle de formulação fúngica Comparação com controle de formulação bacteriana

[00496] Para rendimento de colheitadeira, SYM00033 mostrou um aumento substancial em alqueires secos por acre em comparação com controles tratados com a formulação. Como indicador do teor de clorofila foliar, o SYM00066 mostrou um ligeiro aumento nas leituras de SPAD em comparação com o controle de formulação fúngica. Para o rendimento de colheitadeira, SYM00066 mostrou um aumento substancial em alqueires secos por acre em comparação com o controle de formulação fúngica. Como indicador do teor de clorofila foliar, o SYM00074 mostrou um ligeiro aumento nas leituras de SPAD em comparação com o controle de formulação bacteriana.

[00497] Outras modalidades serão evidentes para os versados na técnica a partir da consideração do relatório descritivo e prática das modalidades. Considera-se o relatório descritivo e exemplos apenas como exemplificadores, com um verdadeiro escopo e espírito sendo indicados pelas reivindicações a seguir. TABELAS E FIGURAS

REFERÊNCIAS Abarenkov, K., R. Henrik Nilsson, K.-H. Larsson, I. J. Alexander, U. Eberhardt, S. Erland, K. H0iland, R. Kj0ller, E. Larsson, T. Pennanen, R. Sen, A. F. S. Taylor, L. Tedersoo, B. M. Ursing, T. Vrâlstad, K. Liimatainen, U. Peintner, and U. Kõljalg. 2010. The UNITE database for molecular identification of fungi - recent updates and future perspectives. New Phytologist 186:281-285. Edgar, R. C. 2010. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics 26:2460-2461. Edgar, R. C. 2013. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature methods 10:996-8. Fierer, N., J. W. Leff, B. J. Adams, U. N. Nielsen, S. T. Bates, C. L. Lauber, S. Owens, J. a. Gilbert, D. H. Wall, and J. G. Caporaso. 2012. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences. Lundberg, D. S., S. Yourstone, P. Mieczkowski, C. D. Jones, and J. L. Dangl. 2013. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature methods 10:999-1002. McDonald, D., M. N. Price, J. Goodrich, E. P. Nawrocki, T. Z. DeSantis, A. Probst, G. L. Andersen, R. Knight, and P. Hugenholtz. 2012. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME journal 6:610-8. McGuire, K. L., S. G. Payne, M. I. Palmer, C. M. Gillikin, D. Keefe, S. J. Kim, S. M. Gedallovich, J. Discenza, R. Rangamannar, J. a Koshner, A. L. Massmann, G. Orazi, A. Essene, J. W. Leff, and N. Fierer. 2013. Digging the New York City Skyline: soil fungal communities in green roofs and city parks. PloS one 8:e58020. R Core Team. 2013. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. Wang, Q., G. M. Garrity, J. M. Tiedje, and J. R. Cole. 2007. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and environmental microbiology 73:5261-7. Abarenkov, K., R. Henrik Nilsson, K.-H. Larsson, I. J. Alexander, U. Eberhardt, S. Erland, K. H0iland, R. Kj0ller, E. Larsson, T. Pennanen, R. Sen, A. F. S. Taylor, L. Tedersoo, B. M. Ursing, T. Vrâlstad, K. Liimatainen, U. Peintner, and U. Kõljalg. 2010. The UNITE database for molecular identification of fungi - recent updates and future perspectives. New Phytologist 186:281-285. Edgar, R. C. 2013. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature methods 10:996-8. Fierer, N., J. W. Leff, B. J. Adams, U. N. Nielsen, S. T. Bates, C. L. Lauber, S. Owens, J. a. Gilbert, D. H. Wall, and J. G. Caporaso. 2012. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences. Lundberg, D. S., S. Yourstone, P. Mieczkowski, C. D. Jones, and J. L. Dangl. 2013. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature methods 10:999-1002. McDonald, D., M. N. Price, J. Goodrich, E. P. Nawrocki, T. Z. DeSantis, A. Probst, G. L. Andersen, R. Knight, and P. Hugenholtz. 2012. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME journal 6:610-8. McGuire, K. L., S. G. Payne, M. I. Palmer, C. M. Gillikin, D. Keefe, S. J. Kim, S. M. Gedallovich, J. Discenza, R. Rangamannar, J. a Koshner, A. L. Massmann, G. Orazi, A. Essene, J. W. Leff, and N. Fierer. 2013. Digging the New York City Skyline: soil fungal communities in green roofs and city parks. PloS one 8:e58020. R Core Team. 2013. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. Rideout JR, He Y, Navas-Molina JA, Walters WA, Ursell LK, Gibbons SM, Chase J, McDonald D, Gonzalez A, Robbins-Pianka A, Clemente JC, Gilbert JA, Huse SM, Zhou H, Knight R, Caporaso JG. (2014) Subsampled open-reference clustering creates consistent, comprehensive OTU definitions and scales to billions of sequences. PeerJ 2:e545https://dx.doi.org/10.7717/peerj.545 Wang, Q., G. M. Garrity, J. M. Tiedje, and J. R. Cole. 2007. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and environmental microbiology 73:5261-7. Barua, D., Kim, J., & Reed, J. L. (2010) An automated phenotype-driven approach (GeneForce) for refining metabolic and regulatory models. PLoS Comput Biol, 6(10), e1000970. Blumenstein, K., Albrectsen, B. R., Martín, J. A., Hultberg, M., Sieber, T. N., Helander, M., & Witzell, J. (2015) Nutritional niche overlap potentiates the use of endófitos in biocontrol of a tree disease. BioControl, 1-13. Borglin, S., Joyner, D., DeAngelis, K. M., Khudyakov, J., D'haeseleer, P., Joachimiak, M. P., & Hazen, T. (2012) Application of phenotypic microarrays to environmental microbiology. Current opinion in biotechnology, 23(1), 41-48. Garland, J. L., & Mills, A. L. (1991) Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization. Applied and environmental microbiology, 57(8), 2351-2359. Siemens, N., Fiedler, T., Normann, J., Klein, J., Münch, R., Patenge, N., & Kreikemeyer, B. (2012) Effects of the ERES pathogenicity region regulator Ralp3 on Streptococcus pyogenes serotype M49 virulence factor expression. Journal of bacteriology, 194(14), 3618-3626. Chen, T. H., & Murata, N. (2002). Enhancement of tolerance of abiotic stress by metabolic engineering of betaines and other compatible solutes. Current opinion in plant biology, 5(3), 250-257. Rideout JR, He Y, Navas-Molina JA, Walters WA, Ursell LK, Gibbons SM, Chase J, McDonald D, Gonzalez A, Robbins-Pianka A, Clemente JC, Gilbert JA, Huse SM, Zhou H, Knight R, Caporaso JG. (2014) Subsampled open-reference clustering creates consistent, comprehensive OTU definitions and scales to billions of sequences. PeerJ 2:e545 https://dx.doi.org/10.7717/peerj.545

Claims (27)

1. Combinação sintética, caracterizada pelo fato de que compreende uma população microbiana purificada em associação a uma pluralidade de sementes ou mudas de uma planta agrícola, em que a população microbiana purificada compreende um primeiro endófito capaz de pelo menos um dentre: produção de uma auxina, produção de um sideróforo, produção de acetoína, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, em que o primeiro endófito é do gênero Acremonium e compreende uma sequência de ácidos nucleicos de ITS rRNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3605, 3642, 3643, 3644, 3672, 3676, 3650, 3597, 3640, 3602, ou 3647, e em que o endófito está presente na combinação sintética em uma quantidade eficaz para fornecer um benefício às sementes ou mudas ou às plantas derivadas das sementes ou mudas.

2. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro endófito está localizado na superfície das sementes ou plântulas.

3. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro endófito é obtido de uma espécie de planta diferente das sementes ou mudas da combinação sintética.

4. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o benefício é selecionado do grupo que consiste em biomassa de raiz aumentada, comprimento de raiz aumentado, altura aumentada, comprimento de broto aumentado, número de folhas aumentado, eficiência de uso de água aumentada, biomassa total aumentada, rendimento de grãos aumentado , aumento da taxa de fotossíntese, aumento da tolerância à seca, aumento da tolerância ao calor, aumento da tolerância ao sal, aumento da resistência ao estresse de nematoides, aumento da resistência a um patógeno fúngico, aumento da resistência a um patógeno bacteriano, aumento da resistência a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabólito e uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência.

5. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a combinação compreende sementes e o primeiro endófito está associado às sementes como um revestimento na superfície das sementes.

6. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a combinação compreende mudas e o primeiro endófito é colocado em contato com as mudas como um spray aplicado a uma ou mais folhas e/ou uma ou mais raízes das mudas.

7. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os primeiros endófitos estão presentes em uma quantidade de pelo menos 100 UFC ou esporos, pelo menos 300 UFC ou esporos, pelo menos 1.000 UFC ou esporos, pelo menos 3.000 UFC ou esporos, pelo menos 10.000 UFC ou esporos, pelo menos 30.000 UFC ou esporos, pelo menos 100.000 UFC ou esporos, pelo menos 300.000 UFC ou esporos, pelo menos 1.000.000 esporos de UFC por semente.

8. Pluralidade de combinações sintéticas, como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é colocada em um meio que promove o crescimento vegetal, sendo o dito meio selecionado do grupo que consiste em: solo, aparato hidropônico e meio de crescimento artificial.

9. Produto agrícola, caracterizado pelo fato de que compreende uma quantidade em peso de semente de 1000 de uma combinação sintética, como definida na reivindicação 1, em que os endófitos estão presentes em uma concentração de pelo menos 102 CFU ou esporos/ml.

10. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a planta agrícola é uma monocotiledônea.

11. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a planta agrícola é milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, milheto, aveia, triticale, centeio, bambu ou cana-de-açúcar.

12. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a planta agrícola é trigo.

13. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a planta agrícola é uma dicotiledônea.

14. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a planta agrícola é soja, canola, colza, algodão, alfafa, mandioca, batata, tomate, ervilha, grão de bico, lentilha, linho ou pimenta.

15. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a planta agrícola é soja.

16. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro endófito é capaz de utilizar prolina como única fonte de carbono, o benefício é a resistência à seca ou tolerância à salinidade e a planta agrícola é o trigo.

17. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro endófito é capaz de utilizar prolina como única fonte de carbono, o benefício é resistência à seca ou tolerância à salinidade e a planta agrícola é soja.

18. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo endófito, em que o segundo endófito é do gênero Cladosporium.

19. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o benefício é a melhoria do crescimento e a planta agrícola é soja ou trigo.

20. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o segundo endófito compreende uma sequência de ácidos nucleicos de ITS compreendendo a SEQ ID NO: 3694 ou 3677.

21. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo endófito, em que o segundo endófito é do gênero Alternaria.

22. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o benefício é a melhoria do crescimento e a planta agrícola é soja ou trigo.

23. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o benefício é o aumento da resistência à seca, e a planta agrícola é soja ou trigo.

24. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o segundo endófito compreende uma sequência de ácido nucleico de ITS compreendendo a SEQ ID NO: 3682 ou 3683.

25. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo endófito, em que o segundo endófito é do gênero Embellisia.

26. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o benefício é a melhoria do crescimento e a planta agrícola é soja ou trigo.

27. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o segundo endófito compreende uma sequência de ácido nucleico de ITS compreendendo a SEQ ID NO: 3615.

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