CN111528219B - 一种用于t淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂及其应用 - Google Patents
一种用于t淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111528219B CN111528219B CN202010401219.8A CN202010401219A CN111528219B CN 111528219 B CN111528219 B CN 111528219B CN 202010401219 A CN202010401219 A CN 202010401219A CN 111528219 B CN111528219 B CN 111528219B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- standard substance
- freeze
- antibody
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于T淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂及其应用。所述冻干保护剂包括质量分数为2~10%的蔗糖和3~10%的海藻糖,并以细胞固定液为溶剂,使用所述冻干保护剂制备得到的T淋巴细胞亚群计数标准物质稳定性高。同时,所述T淋巴细胞亚群计数标准物质具有明确量值,均匀性良好,在4℃下可以稳定保存15天,在‑20℃条件下保存稳定性在1个月以上,能够实现流式细胞术检测结果的质量控制,保证检测结果的准确性,因此对于流式细胞仪的计量校准、T淋巴细胞流式细胞检测过程的方法验证和检测结果质量控制等方面具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及单细胞定量分析和分选技术,具体涉及一种T淋巴细胞亚群计数标准物质的制备方法和定值方法,尤其涉及一种用于T淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂及其应用。
背景技术
流式细胞技术(flow cytometry,FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术,是涉及众多学科的综合性技术,其涉及到的技术主要为计算机技术、细胞生物学技术、物理学技术、激光技术、免疫学技术等。流式细胞技术开展的基础在于细胞处于快速流动状态,随后对处于流动状态的细胞展开分析处理。
当前,临床流式细胞分析已成为检验医学发展的一个热点。临床检验过程中已经将流式细胞技术作为机体免疫状况的主要检测技术,检验指标以T淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀伤淋巴细胞的水平为主。检测处理过程需借助于表面标志物质,以便对各细胞及细胞内不同细胞因子在体内的水平有所了解与掌握,通过对患者淋巴细胞亚群数量的测定实现对患者免疫状况的有效检测处理,并为临床后续诊断及相关治疗处理提供可靠、有效的指导作用。相较于传统免疫学检测处理措施,流式细胞技术与单克隆抗体技术相结合,能够实现准确地定量检测。
流式细胞分析最大的优点是对混合细胞群体中亚群细胞的计数,如淋巴细胞可依其表面标志的不同分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-),T淋巴细胞又可进一步分为辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+CD8-)和抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD4-CD8+)等。例如,通过检测初诊老年多发性骨髓瘤(MM)患者外周血中T淋巴细胞亚群的表达水平,可以评估T淋巴细胞亚群在初诊老年MM患者中的预后价值。初诊时CD4/CD8比值和CD4+T细胞计数减低是老年MM不良预后因素,T淋巴细胞亚群水平可作为影响预后判断的潜在指标,CD4+T细胞的减少常见于而恶性肿瘤,遗传性免疫缺陷症、艾滋病等。
目前国内外用于流式细胞仪检测用标准物质(Certified Reference Materials,CRM)的研究较少,所述标准物质在检测校准流式细胞分析仪器的示值误差和重复性时起到重要作用。例如,T淋巴细胞亚群计数标准物质能够高效地计量校准流式细胞仪的运行情况,保障量值统一,保证检测结果的有效性。然而,可检索到的仅有中国计量科学研究院研制的淋巴细胞CD4+细胞占总淋巴细胞计数比例标准物质(GBW(E)090938),标准值为49.4%,不确定度4.8%。
因此,提供一种具有明确量值,均匀性良好且稳定性高的T淋巴细胞亚群计数标准物质对于流式细胞仪的计量校准、T淋巴细胞流式细胞检测过程的方法验证和检测结果质量控制等方面具有重要的意义。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题,本发明提供一种用于T淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂及其应用。使用所述冻干保护剂制备得到的T淋巴细胞亚群计数标准物质外观较好、稳定性高,可以用于检测的细胞样品,保证检测结果的准确性。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种用于T淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂,所述冻干保护剂包括质量分数为2~10%的蔗糖和3~10%的海藻糖,并以细胞固定液为溶剂。
向标准物质中添加冻干保护剂能够提高细胞在冷冻干燥过程中的存活率,保护剂的种类较多,主要分四种类型:渗透型抗冻剂、非渗透型抗冻剂、抗氧化剂和胶体。本发明中采用含有细胞固定液、蔗糖和海藻糖的复方冻干保护剂,属于非渗透型抗冻剂,来制备T淋巴细胞亚群计数标准物质,其中,细胞固定液、蔗糖和海藻糖之间协同配合,相互作用,能够明显提高T淋巴细胞在冷冻干燥过程中的存活率,保证标准物质的稳定性,使其在检测和校准流式细胞分析仪的示值误差和重复性时可靠性较高。
本发明中,所述细胞固定液为IC Fixation Buffer,成分为含有4%多聚甲醛的磷酸缓冲盐溶液(Paraformaldehyde in phosphate buffered saline),pH 7.3;本发明中所选用的IC Fixation Buffer购自Thermo公司。细胞固定液可以固定细胞形态,可与荧光染料偶联的抗体兼容以供表面染色,并可作为荧光染料(包括串联染料)染色细胞的短期储存缓冲液,最多可在2-8℃保存3天(避光保存)。使用时无需稀释。
所述蔗糖的质量分数为2~10%,例如可以是2%、3%、4%、5%、5.2%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%等。优选地,所述蔗糖的质量分数为5~9%,进一步优选为7.8-8.2%。
所述海藻糖的质量分数为3~10%,例如可以是3%、4%、5%、5.2%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%等。优选地,所述海藻糖的质量分数为6~9%,进一步优选为7.8-8.2%。
优选地,所述细胞固定液在使用前稀释5~12倍,例如可以是5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍或12倍等;优选为9.5-10.5倍。
本发明中,所述冻干保护剂优选为包括质量分数为8%的蔗糖和8%的海藻糖,并以稀释10倍的细胞固定液为溶剂时,所得T淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干品形貌和稳定性较好。
第二方面,如第一方面所述的制备方法制备得到的T淋巴细胞亚群计数标准物质。所述标准物质具有明确量值,均匀性良好,能够长时间稳定存在;是实际可以用于检测的细胞样品,能够实现流式细胞术检测结果的质量控制,保证检测结果的准确性。
第三方面,本发明提供一种T淋巴细胞亚群计数标准物质的制备方法,所述制备方法包括:
分选外周血单个核细胞得到T淋巴细胞,再将所述T淋巴细胞与如第一方面所述的冻干保护剂混合,冷冻干燥后得到所述T淋巴细胞亚群计数标准物质。
作为本发明优选的技术方案,所述分选外周血单个核细胞采用的方法为免疫磁珠分离法。
示例性的,本发明选择的T淋巴细胞分选方法包括如下步骤:
1)将2.5×108个PBMC细胞重悬在1mL MACS buffer中,平均分在5支EP管中,每支200μL;每支加入50μL人总T细胞分选试剂盒中的PanT Biotin-Antibody,斡旋混匀后在4℃静置5min;每支加入150μL MACS buffer,再加入100μL人总T细胞分选试剂盒中的PanTMicrobead;斡旋混匀后在4℃静置10min,5支500μL样品准备上分选柱子;
2)LS Columns加入3mL MACS buffer润湿柱子;加入500μL样品,注意不要碰到柱壁,在下方放置新的15mL离心管收集过滤液体;在样品快过滤完前,加入3mL缓冲液冲洗分选柱,重复冲洗三次,离心管中共收集9.5mL目标细胞;同样的方法重复4次将剩余的细胞分选收集完成。
优选地,所述混合后T淋巴细胞的细胞密度为(2~3)×106个/mL,在实验操作时,离心后的细胞沉淀约1×108个细胞,直接加保护剂40mL冻干保护剂,混匀后分装200管,每管200μL,平均细胞密度约为5×105个/管。
优选地,所述冷冻干燥的程序为:预冻温度为-45.5~-44.5℃,一次升华的温度为-40.5~-39.5℃,压力设定为0~2Pa,解压干燥的温度为24.5~25.5℃。
由于细胞冻存液或细胞固定液成分复杂,多含有Na+、K+等离子,其冻干参数偏低,冻干难度较大,本发明中采用保守工艺,即预冻温度为-45℃,一次升华采用-40℃,0Pa,待一次升华结束采用25℃进行解压干燥。
作为本发明优选的技术方案,所述T淋巴细胞亚群计数标准物质的制备方法包括:采用免疫磁珠分离法分选外周血单个核细胞获得T淋巴细胞,与如第一方面所述的冻干保护剂混合;按照预冻温度为-45.5~-44.5℃,一次升华的温度为-40.5~-39.5℃,压力设定为0~2Pa,解压干燥的温度为24.5~25.5℃的程序冷冻干燥,得到所述T淋巴细胞亚群计数标准物质。
第四方面,本发明提供一种如第三方面所述的T淋巴细胞亚群计数标准物质的定值方法,所述定值方法包括如下步骤:
使用复溶液复溶所述T淋巴细胞亚群计数标准物得到待测液,所述复溶液为含有BSA的PBS缓冲液;再将所述待测液加入流式管中,与染色抗体混合、孵育,清洗后,上机检测,得到所述T淋巴细胞亚群计数标准物质的标准值。
作为本发明优选的技术方案,使用复溶液复溶后待测液中细胞浓度为2000~3000个/μL,例如可以是2000个/μL、2100个/μL、2200个/μL、2300个/μL、2400个/μL、2500个/μL、2600个/μL、2700个/μL、2800个/μL、2900个/μL或3000个/μL等。
优选地,所述复溶液中BSA的质量分数为1.5-2.5%,例如可以是1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%或2.5%等,优选为2%。
优选地,所述染色抗体为混标抗体或单标抗体。
优选地,所述混标抗体包括PE-CD4/FITC-CD3/PerCP-CD45抗体。所述PE-CD4/FITC-CD3/PerCP-CD45抗体指的是能够同时标记CD4、CD3和CD45并能够发出不同荧光的混合抗体。
优选地,所述单标抗体包括FITC-CD4抗体。
优选地,所述清洗的次数为1~2次,优选为1次。
作为本发明优选的技术方案,所述定值方法包括如下步骤:使用复溶液复溶所述T淋巴细胞亚群计数标准物得到待测液,所述复溶液为含有质量分数为1.5-2.5%BSA的PBS缓冲液,使用复溶液复溶后待测液中细胞浓度为2000~3000个/μL;再将所述待测液加入流式管中,与染色抗体混合、孵育,清洗1~2次后,上机检测,得到所述T淋巴细胞亚群计数标准物质的标准值。
第五方面,本发明还提供一种如第二方面所述的T淋巴细胞亚群计数标准物质或如第四方面所述的定值方法在校准流式细胞仪、流式细胞检测方法验证或流式细胞检测结果的质量控制中的应用。
使用所述定值方法定值的T淋巴细胞亚群计数标准物质在校准流式细胞仪、流式细胞检测方法验证或流式细胞检测结果的质量控制中均有广泛地应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值,还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值,限于篇幅及出于简明的考虑,本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比,本发明至少具有以下有益效果:
(1)本发明提供的冻干保护剂包括10倍稀释的细胞固定液和高浓度糖(蔗糖8%和海藻糖8%),使用所述冻干保护剂并经过本发明所述的冻干程序后,所得细胞冻干物质的外观较好,且稳定性高,适用于T淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护;
(2)本发明提供的T淋巴细胞亚群计数标准物质具有明确量值,均匀性良好,在4℃下可以稳定保存15天,在-20℃条件下保存稳定性在1个月以上;同时根据多家实验室共同测量的结果,所述标准物质中CD4阳性细胞比例的总平均值为74%,是实际可以用于检测的细胞样品,能够实现流式细胞术检测结果的质量控制,保证检测结果的准确性;
(3)本发明提供的T淋巴细胞亚群计数标准物质的定值方法,选用合适的复溶液种类和复溶液体积,保证测样时细胞密度适宜,所述定值方法的检测结果具有较高的精密度、单色染色无需调节荧光通道补偿,满足T淋巴细胞亚群计数标准物质的定值要求等特点,重复性好,重复性RSD为0.82%,再现性佳,再现性RSD为0.39%。
附图说明
图1(a)为使用实施例1提供的冻干保护剂冻干的样品复溶后,其CD4淋巴细胞阳性比例检测结果图;图1(b)为使用实施例2后的检测结果图;图1(c)为使用对比例1后的检测结果图;图1(d)为使用对比例2后的检测结果图。
图2(a)为应用例2中使用混标抗体后,多色染色抗体中调节补偿后的PE-CD4+百分比检测结果图;图2(b)为应用例2中使用混标抗体后,峰图A、B和C分别为调节补偿后FITC-CD3抗体、PE-CD4抗体、PerCP-CD45抗体检测结果;散点图i、ii和iii为使用不同抗体双染色后的结果图;图2(c)为应用例2中使用单标抗体后TIFC-CD4+百分比检测结果图。
图3(a)为应用例2中以含有2%BSA的PBS作为复溶液复溶后样品在第0天时的流式细胞检测结果图;图3(b)为第1天时的流式细胞检测结果图;
图3(c)为第2天时的流式细胞检测结果图;图3(d)为应用例2中以PBS为复溶液复溶后样品在第0天时的流式细胞检测结果图;图3(e)为第1天时的流式细胞检测结果图;图3(f)为第2天时的流式细胞检测结果图。
图4为应用例2中使用方法(1)复溶样品(1000μL)流式细胞检测的散点图。
图5为应用例2中方法(2)复溶样品(100μL)的三次平行试验流式细胞检测FITC-CD4荧光信号峰图。
图6为应用例2中方法(3)复溶样品(100μL、200μL、300μL)的流式细胞检测FITC-CD4荧光信号峰图。
图7(a)为应用例3中标准物质在20℃保存3天得到的流式细胞散点图;图7(b)为保存7天后得到的流式细胞散点图;图7(c)为保存10天后得到的流式细胞散点图;图7(d)为保存15天后得到的流式细胞散点图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案,但下述的实例仅仅是本发明的简易例子,并不代表或限制本发明的权利保护范围,本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中,所述流式细胞仪购自美国BD公司;低温离心机购自德国Eppendorf公司;离心机购自中国卢湘仪公司;超低温冰箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司;冷冻干燥机购自中国Tofflon公司。
以下实施例中,所用PBMC细胞购自ALL CELLS公司;人总T细胞分选试剂盒、MACSbuffer、LS Columns和Pre-Separation Filters购自Miltenyibiotec公司;胎牛血清BSA购自MP公司;细胞冻存液、细胞固定液(IC Fixation Buffer)购自Thermo公司;1×PBS(pH7.2)购自Gibco公司;CD4-FITC抗体购自Beckman Coulter公司;PE-CD4/FITC-CD3/PerCP-CD45混合抗体购自BD公司;D-海藻糖购自润捷化学公司;蔗糖购自国药公司。
实施例1
本实施例提供一种用于T淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂,包括质量分数为8%的蔗糖、8%的海藻糖,并以稀释10倍的细胞固定液作为溶剂。
实施例2
本实施例提供一种用于T淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂,包括质量分数为2%的蔗糖、3%的海藻糖,并以稀释10倍的细胞固定液作为溶剂。
实施例3
本实施例提供一种用于T淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂,包括质量分数为8%的蔗糖、8%的海藻糖,并未稀释的细胞固定液作为溶剂。
实施例4
本实施例提供一种用于T淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂,包括质量分数为2%的蔗糖、3%的海藻糖,并未稀释的细胞固定液作为溶剂。
对比例1:与实施例1的区别在于将细胞固定液替换为细胞冻存液,其余组分与实施例1保持一致。
对比例2:与实施例2的区别在于将细胞固定液替换为细胞冻存液,其余组分与实施例1保持一致。
对比例3:与实施例3的区别在于将细胞固定液替换为细胞冻存液,其余组分与实施例1保持一致。
对比例4:与实施例4的区别在于将细胞固定液替换为细胞冻存液,其余组分与实施例1保持一致。
对比例5:不添加蔗糖和海藻糖,仅以未稀释的细胞固定液作为冻干保护剂。
对比例6:与实施例1的区别在于不添加蔗糖,仅含有16%的海藻糖,其余组分与实施例1保持一致。
对比例7:与实施例1的区别在于不添加海藻糖,仅含有16%的蔗糖,其余组分与实施例1保持一致。
冻干保护剂的选择
先在无细胞的状态下将实施例1~4和对比例1~7提供的冻干保护剂进行模拟样品冻干。
将上述含有稀释的细胞固定液或稀释的细胞冻存液的四种冻干保护剂(即实施例1、2,对比例1、2)加入细胞样品,比较不同糖浓度的冻干保护剂对细胞表面抗原的保护作用,用流式细胞仪检测复溶后样品中的CD4淋巴细胞阳性比例结果(如图1(a)~(d))显示,图1(a)对应实施例1,图1(b)对应实施例2,图1(c)对应对比例1,图1(d)对应对比例2。其中,对比例1和对比例2(即10倍稀释的细胞冻存液和两种糖浓度的冻干保护剂)冻干样品复溶后细胞数量都很少,且阴性和阳性峰无法区分。
而实施例1和实施例2(10倍稀释细胞固定液加两种糖浓度的冻干保护剂)冻干样品复溶后细胞数量较多,同时,实施例1即高糖浓度(蔗糖8%和海藻糖8%)的样本阴性和阳性峰区分度更好,说明该保护剂对细胞表面的抗原保护性较好。
对比例5~7的样品冻干形态较差,细胞数量很少,无法检测。
因此,实施例1提供冻干保护剂效果最佳,即10倍稀释细胞固定液、8%蔗糖和8%海藻糖为最优选的冻干保护剂。
冻干程序
将分装好的样品放置在冻干机隔板上,并在最外层放置温度探头,开启冻干机控制软件Netsacde,依据下表1设置冻干参数,开启冻干机进行冻干,冻干后真空压盖,取出样品并对外观及质量属性进行评价。
表1冻干参数设置
在冻干过程中,一次干燥分两段进行,-40℃时升华温度降低,担心终点判断会存在误差,所以在0℃过渡,保证冻干顺利进行。将冻干机的冷冻干燥程序按照上表设置,发现样本冻干的样品中10倍稀释的细胞冻存液加高浓度糖(蔗糖8%和海藻糖8%)的外观最好,该冻干程序条件满足实验需求。
应用例1
本应用例提供一种T淋巴细胞亚群计数标准物质及其制备方法。具体包括如下步骤:
T淋巴细胞的分选:将2.5×108个PBMC细胞重悬在1mL MACS buffer中,平均分在5支EP管中,每支200μL;每支加入50μL人总T细胞分选试剂盒中的PanT Biotin-Antibody,斡旋混匀后在4℃静置5min;每支加入150μL MACS buffer,再加入100μL人总T细胞分选试剂盒中的PanT Microbead;斡旋混匀后在4℃静置10min,5支500μL样品准备上分选柱子;
LS Columns加入3mL MACS buffer润湿;加入500μL样品,注意不要碰到柱壁,在下方放置新的15mL离心管收集过滤液体;在样品快过滤完前,加入3mL缓冲液冲洗分选柱,重复冲洗三次,离心管中共收集9.5mL目标细胞;同样的方法重复4次将剩余的细胞分选收集完成,得到T淋巴细胞;
再按照实施例1提供的冻干保护剂以及上述冻干程序制备T淋巴细胞亚群计数标准物质。
均匀性检验
按照JJG 1006-1994《一级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求,检测实施例1提供的标准物质的均匀性。
从实施例1提供的标准物质候选物中分别随机抽取15瓶(即m=15),每瓶各抽取3个样,以每瓶3次重复测试数据为一组(即n=3),每种标准物质共15组45个数据,采用单因素方差分析法(F-检验)检验均匀性,通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值之间有无系统性差异,如果测定方差无显著性差异,则应满足式(1)的统计要求。如果两者的比小于统计检验的临界值,则认为样品是均匀的,检测数据见表2。
其中,v1=m-1,表示组间自由度;v2=N-m,表示组内自由度,其中N为总检测样品数据个数;
表2 T淋巴细胞亚群计数标准物质均匀性检验结果(单位:%)
实验数据经统计分析,F小于F0.05(14,30),符合JJG1006-94《一级标准物质技术规范》均匀检验合格要求,证明研制的T淋巴细胞亚群计数标准物质是均匀的。
应用例2
本应用例的目的在于选择一种合适的针对应用例1制备得到的T淋巴细胞亚群计数标准物质的定值方法,具体包括:抗体的选择、复溶液的选择和复溶方法的选择。
1、抗体选择
由于不同的实验室采用不同的抗体染色,通常血液检测实验室在检测血液样本中时会采用多色抗体染色。将混标抗体(CD4-PE/CD3-FITC/CD45-PerCP)染色样品和CD4-FITC抗体单染样品的检测结果进行比较考察。
结果如图2(a~c)所示,Comp-PE-CD4+表示多色染色抗体中调节补偿后的PE-CD4+百分比:Comp-PE-A表示调节补偿后多色抗体中的PE-CD4染色结果:Comp-PerCP-A表示调节补偿后多色抗体中的PerCP-CD45染色结果:Comp-FITC-A表示调节补偿后多色抗体中的FITC-CD3染色结果。图中混标抗体检测结果(PE-CD4阳性)和单染的FITC CD4-阳性细胞比例检测结果一致性良好。
其中,图2(a)为使用混标抗体后,多色染色抗体中调节补偿后的PE-CD4+百分比为74.5%。图2(b)中峰图A、B和C分别为调节补偿后FITC-CD3抗体、PE-CD4抗体、PerCP-CD45抗体检测结果;散点图i为FITC-CD3和PE-CD4双染色结果,散点图ii为FITC-CD3和PerCP-CD45双染色结果,散点图ii为PE-CD4和PerCP-CD45双染色结果。图2(c)为单色染色后FITC-CD4百分比为73.7%。因此,在流式细胞检测实验中,采用FITC-CD4抗体单独染色样本。
2、复溶液种类的选择
分别采用1000μLPBS和1000μLPBS和2%BSA两种复溶液分别溶解两支样品,离心去除上清后,加入300μLPBS重悬,然后加入15μL CD4-FITC单克隆抗体孵育后PBS清洗2次,放入4℃冰箱,然后分别在当天、1天后、2天后进行流式细胞检测,每次测试收集细胞10000个以上。
结果如图3(a~f)所示,其中,图3(a)、图3(b)和图3(c)为用含有2%BSA的PBS作为复溶液的样品在第0天(Day0)、第1天(Day1)、第2天(Day2)的流式细胞检测结果,图3(d)、图3(e)和图3(f)为用PBS作为复溶液的样品第0天(Day0)、第1天(Day1)、第2天(Day2)的流式细胞检测结果,用PBS和2%BSA复溶液的样品比仅用PBS作为复溶液的样品可以保持在4℃储存48h后抗体信号更加稳定。
3、复溶方法的选择
方法(1):取两支样品平行实验,加入1000μL复溶液(PBS+2%BSA)复溶样品,离心去除上清后,加入300μL PBS重悬,然后加入15μL CD4-FITC单克隆抗体孵育后PBS清洗2次,上机收集相同体积的样品。
检测结果(图4)显示不同样品管内细胞的绝对个数相差2.5倍(Sample1为12990个,sample2为32290个),但CD4阳性细胞占比数据接近(Sample1为72.6%,sample2为73.5%)。
方法(2):在一支样品中加入的1000μL复溶液(PBS+2%BSA)复溶样品,用移液器平行三次取出100μL样品匀液加入新的流式管中,分别加入5μL CD4-FITC单克隆抗体孵育后清洗2次,上机检测。
3次平行实验的检测结果(图5)显示100μL内含有的细胞较少(800个~1700个),导致阳性和阴性峰区分不好,CD4阳性细胞比例检测结果不可信。
方法(3):加入的1000μL复溶液(PBS+2%BSA)复溶样品,用移液器分别取出100μL、200、300μL样品匀液加入新的流式管中,分别加入5μL、10μL、15μL CD4-FITC单克隆抗体孵育后不清洗,直接上机检测。其中300μL样品匀液连续进样8次。
检测结果显示(图6)不用PBS清洗,细胞损失较少,但CD4细胞比例峰图中的阴性和阳性峰区分仍不明显。300μL样品匀液连续进样8次的结果显示CD4阳性细胞计数比例的重复性RSD为0.83%。
方法(4):选择一支样品的1/3细胞数作为最小取样量,即单支样品加入600μL复溶液(PBS+2%BSA)复溶样品,用移液器分别取出200μL样品匀液加入新的流式管中,分别加入10μL CD4-FITC单克隆抗体孵育后,PBS清洗1次,上机重复6次检测,检测结果如下表3所示:
表3
重复次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 | RSD(%) |
检测结果 | 72.8 | 72.8 | 72.4 | 72.3 | 73.3 | 73.9 | 72.9 | 0.82 |
检测结果显示CD4细胞比例峰图中的阴性和阳性峰区分明显,且重复性RSD为0.82%。因此,本应用例确定的定值方法为方法(4)。
定值方法的再现性测试:由1个实验人员连续5天对同批次样品进行重复检测,检测结果如表4所示:
表4
本发明提供的定值方法具有较高的精密度、单色染色无需调节荧光通道补偿,具有很好的重复性和再现性,再现性良好,RSD为0.39%,满足检测淋巴细胞CD4阳性比例的定量测量方法的要求。
应用例3
本应用例利用应用例2提供的定值方法考察应用例1制备得到的T淋巴细胞亚群计数标准物质的稳定性。
1、短期稳定性检验结果
短期稳定性考察采用同步稳定性研究,即使所有稳定性研究的测量能在重复性条件下进行。目前产品运输时间一般3~10天,本应用例考察了标准物质在20℃(模拟室温)、4℃(模拟冰袋)、-20℃(冷冻条件)下的15天之内的短期稳定性,每个样品重复测定3次。
利用应用例2记载的定值方法对T淋巴细胞亚群计数标准物质进行短期稳定性进行了跟踪考察,其中CD4阳性细胞比例的数据见表5、表6、表7。采用线性模型为该标准物质进行短期稳定性评价,统计结果见表8。
表5标准物质在20℃保存下短期稳定性的检测结果(单位:%)
时间(天) | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值 |
0(2020.3.13) | 74.4 | 73.2 | 72.8 | 73.5 |
1(2020.3.14) | 75.5 | 74.6 | 72.6 | 74.2 |
3(2020.3.16) | 72.2 | 72.2 | 72.4 | 72.3 |
5(2020.3.18) | 74.3 | 74.5 | 72.9 | 73.9 |
7(2020.3.20) | 74.2 | 72.7 | 73.4 | 73.4 |
10(2020.3.23) | 73.3 | 73.0 | 72.7 | 73.0 |
15(2020.3.28) | 71.6 | 72.6 | 73.1 | 72.4 |
表6标准物质在4℃保存短期稳定性检测数据(单位:%)
时间(天) | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值 |
0(2020.3.13) | 74.4 | 73.2 | 72.8 | 73.5 |
1(2020.3.14) | 71.9 | 75.1 | 75.6 | 74.2 |
3(2020.3.16) | 73.4 | 73.6 | 73.0 | 73.3 |
5(2020.3.18) | 73.4 | 72.7 | 74.7 | 73.6 |
7(2020.3.20) | 73.9 | 74.1 | 72.2 | 73.4 |
10(2020.3.23) | 74.9 | 73.9 | 74.7 | 74.5 |
15(2020.3.28) | 73.2 | 73.6 | 73.9 | 73.6 |
表7标准物质在-20℃保存短期稳定性检测数据(单位:%)
表8标准物质在短期稳定性的统计结果
保存条件 | 20℃ | 4℃ | -20℃ |
斜率β<sub>1</sub> | -0.072 | 0.011 | -0.073 |
截距β<sub>0</sub> | 73.667 | 73.661 | 74.565 |
s(β<sub>1</sub>) | 0.042 | 0.043 | 0.039 |
t<sub>0.95,5</sub>·s(β<sub>1</sub>) | 0.108 | 0.111 | 0.100 |
结论 | 稳定 | 稳定 | 稳定 |
短期稳定性统计结果表明,|β1|<t0.95,5·s(β1)斜率不显著,标准物质在4℃下保存15天是稳定的。但根据流式细胞的散点图(图7(a~d))分析,其中,图7(a)、图7(b)、图7(c)和图7(d)分别表示标准物质在20℃保存3天、7天、10天和15天时得到的流式细胞散点图;在20℃保存10~15天后阳性和阴性信号区分度变差,说明样品表面的抗原开始变得不稳定,因此,标准物质在20℃保存10天内稳定。
2、长期稳定性检验结果
长期稳定性考察采用经典稳定性研究进行考察,即同时制备的样品在相同条件下随着时间的推移进行测量。本应用例将温度-20℃作为标准物质的特定储存条件,并对标准物质的稳定性进行了持续考察,分别在样品制备完成后0、0.5、1个月对制备的标准物质进行长期稳定性考察,每个时间点随机抽取3瓶,每个样品重复测定3次,以平均值作为检测结果。
将制备好的标准物质置于-20℃保存,对该保存条件下的标准物质进行稳定性监测,结果见表9。采用线性模型作为该标准物质的经验模型进行长期稳定性评价,统计结果见表10。
表9标准物质的-20℃长期稳定性监测数据(单位:%)
时间(天) | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值 |
0(2020.3.13) | 74.4 | 73.2 | 72.8 | 73.5 |
0.5(2020.3.28) | 73.9 | 73.6 | 73.3 | 73.6 |
1(2020.4.13) | 74.0 | 73.3 | 71.6 | 73.0 |
表10标准物质的-20℃长期稳定性统计结果
保存条件 | 斜率β<sub>1</sub> | 截距β<sub>0</sub> | s(β<sub>1</sub>) | t<sub>0.95,1</sub>·s(β<sub>1</sub>) | 结论 |
-20℃ | -0.5 | 73.594 | 0.684 | 8.691 | 稳定 |
标准物质的长期稳定性统计结果显示:|β1|<t0.95,1·s(β1)斜率不显著,表明标准物质在规定时间内保存在-20℃无明显的上升或下降趋势。
应用例4
依据JJF1343-2012《标准样品定值的通用原则及统计学原理》和ISO导则35《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》的要求,应用例1标准物质由采用多家实验室(协作单位见表11)合作,采用实施例2所述的定值方法进行定值。每个单位分别随机抽取3瓶标准物质,每瓶样品平行测定3次,进行定值分析,每个实验室检测结果见表12。
表11协作单位
表12
对所有数据按如下程序处理:
(1)利用格拉布斯(Grubbs)法和狄克逊(Dixon)法判断组内数据是否有可疑值,检测无可疑值;
(2)利用柯克伦(Cochran)法对这8组数据进行等精度检验,其判断方法如下:根据柯克伦准则,其中,Smax为Si中最大值,各组数据等精度。
表13柯克伦结果判定规则
C与临界值C<sub>0</sub>关系 | C≤C<sub>0(95%)</sub> | C<sub>0(95%)</sub>≤C≤C<sub>0(90%)</sub> | C>C<sub>0(90%)</sub> |
判定结果 | 正确值 | 可疑值 | 离群值 |
(3)利用狄克逊(Dixon)法对每组数据的平均值进行检验是否有显著性差异,检验结果发现平均值没有差异然后按照式(5)求所有数据的平均值:
(4)总平均结果见表14。
表14 T淋巴细胞亚群计数标准物质的定值数据的总平均值
项目 | 定值总平均值(%) |
CD4阳性细胞比例 | 74.0 |
本发明提供的T淋巴细胞亚群计数标准物质采用流式细胞术在多家细胞检测单位联合定值,检测该细胞标准物质中CD4阳性细胞比例,得到的结果重复、稳定,说明该细胞标准物质量值可靠,准确性和均匀性良好,为检测结果的溯源性、可靠性和可比性提供良好的保证,进一步完善了细胞标准物质的种类,能够应用于流式细胞仪的计量校准,满足T淋巴细胞检测实验室的质量控制及方法验证的需求。
申请人声明,以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,所属技术领域的技术人员应该明了,任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种用于T淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂,其特征在于,所述冻干保护剂包括质量分数为2~8%的蔗糖和3~8%的海藻糖,并以细胞固定液为溶剂,所述细胞固定液在使用前稀释8~12倍;
所述细胞固定液为IC Fixation Buffer,所述IC Fixation Buffer购自Thermo公司。
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂,其特征在于,所述蔗糖质量分数为5~8%;
所述海藻糖的质量分数为6~8%。
3.根据权利要求2所述的冻干保护剂,其特征在于,所述蔗糖质量分数为5~6%;
所述海藻糖的质量分数为6~7%;
所述细胞固定液在使用前稀释9.5~10.5倍。
4.利用如权利要求1-3中任一项所述的冻干保护剂制备得到的T淋巴细胞亚群计数标准物质。
5.一种如权利要求4所述的T淋巴细胞亚群计数标准物质的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
分选外周血单个核细胞得到T淋巴细胞,再将所述T淋巴细胞与如权利要求1-3中任一项所述的冻干保护剂混合,冷冻干燥后得到所述T淋巴细胞亚群计数标准物质。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述分选外周血单个核细胞采用的方法为免疫磁珠分离法;
所述混合后T淋巴细胞的细胞密度为(2~3)×106个/mL;
所述冷冻干燥的程序为:预冻温度为-45.5~-44.5℃,一次升华的温度为-40.5~-39.5℃,压力设定为0~2Pa,解压干燥的温度为24.5~25.5℃。
7.一种如权利要求4所述的T淋巴细胞亚群计数标准物质的定值方法,其特征在于,所述定值方法包括如下步骤:
使用复溶液复溶所述T淋巴细胞亚群计数标准物得到待测液,所述复溶液为含有BSA的PBS缓冲液;
再将所述待测液加入流式管中,与染色抗体混合、孵育,清洗后,上机检测,得到所述T淋巴细胞亚群计数标准物质的标准值。
8.根据权利要求7所述的定值方法,其特征在于,使用复溶液复溶后待测液中细胞浓度为2000~3000个/μL;
所述复溶液中BSA的质量分数为1.5-2.5%;
所述染色抗体为混标抗体或单标抗体;
所述混标抗体包括PE-CD4/FITC-CD3/PerCP-CD45抗体;
所述单标抗体包括FITC-CD4抗体;
所述清洗的次数为1~2次。
9.根据权利要求8所述的定值方法,其特征在于,所述复溶液中BSA的质量分数为2%;
所述清洗的次数为1次。
10.如权利要求4所述的T淋巴细胞亚群计数标准物质或如权利要求7-9任一项所述的定值方法,在校准流式细胞仪、流式细胞检测方法验证或流式细胞检测结果的质量控制中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010401219.8A CN111528219B (zh) | 2020-05-13 | 2020-05-13 | 一种用于t淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010401219.8A CN111528219B (zh) | 2020-05-13 | 2020-05-13 | 一种用于t淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111528219A CN111528219A (zh) | 2020-08-14 |
CN111528219B true CN111528219B (zh) | 2022-03-15 |
Family
ID=71968700
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010401219.8A Active CN111528219B (zh) | 2020-05-13 | 2020-05-13 | 一种用于t淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111528219B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116256513A (zh) * | 2023-03-20 | 2023-06-13 | 泰州宸安生物科技有限公司 | 单人份的混合型流式抗体冻干微芯检测试剂管及其制备与应用 |
Citations (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6291170A (ja) * | 1985-06-05 | 1987-04-25 | Jipukomu Kk | 食品の冷凍保存方法 |
CN101278695A (zh) * | 2008-05-12 | 2008-10-08 | 海南椰国食品有限公司 | 一种糖化椰果及其糖化方法 |
CN101310729A (zh) * | 2007-05-23 | 2008-11-26 | 辽宁省辽宁绒山羊育种中心 | 牛羊无动物源冻精稀释液及牛羊冷冻精液的制作方法 |
CN101358968A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-02-04 | 甘肃省医学科学研究院 | 冻干人淋巴细胞表面抗原质控品及其制备方法 |
CN101363846A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-02-11 | 甘肃省医学科学研究院 | 一种冻干人淋巴细胞表面抗原质控品及其制备方法 |
JP2013029436A (ja) * | 2011-07-29 | 2013-02-07 | Mayekawa Mfg Co Ltd | 凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法 |
CN103048448A (zh) * | 2012-12-21 | 2013-04-17 | 杭州茂天赛科技有限公司 | 一种固定液 |
CN103063830A (zh) * | 2012-12-21 | 2013-04-24 | 杭州茂天赛科技有限公司 | 一种elisa预包被酶标板的制备方法 |
CN104357432A (zh) * | 2014-11-27 | 2015-02-18 | 苏州嘉禧萝生物科技有限公司 | 一种谷氨酸脱羧酶的保存液 |
WO2017160835A1 (en) * | 2016-03-14 | 2017-09-21 | The Regents Of The University Of Michigan | A surface tension mediated lyo-processing technique for preservation of biologics |
CN107576789A (zh) * | 2017-11-03 | 2018-01-12 | 深圳市巴德生物科技有限公司 | 一种冻干nk细胞表面抗原质控品及其制备方法 |
CN107576788A (zh) * | 2017-11-03 | 2018-01-12 | 深圳市巴德生物科技有限公司 | 一种检测白细胞分化抗原的参照品及其制备方法 |
CN107576790A (zh) * | 2017-11-03 | 2018-01-12 | 深圳市巴德生物科技有限公司 | 一种冻干人淋巴细胞cd4表面抗原质控品及其制备方法 |
CN107807235A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-03-16 | 郑州欧柯奇仪器制造有限公司 | 克仑特罗elisa检测试剂盒、其制备方法及其应用 |
CN109311995A (zh) * | 2016-03-29 | 2019-02-05 | 台湾浩鼎生技股份有限公司 | 抗体、药物组合物和方法 |
CN109917134A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-06-21 | 广州市进德生物科技有限公司 | 一种校准品稳定剂、测定c肽的检测试剂盒及检测方法 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7345217B2 (en) * | 1998-09-22 | 2008-03-18 | Mendel Biotechnology, Inc. | Polynucleotides and polypeptides in plants |
US20120137382A1 (en) * | 1998-09-22 | 2012-05-31 | Mendel Biotechnology, Inc. | Stress tolerance in plants |
US20040229299A1 (en) * | 2002-05-21 | 2004-11-18 | Badal M. Youssouf | Intracellular complexes as biomarkers |
US7364846B2 (en) * | 2002-10-11 | 2008-04-29 | Molecular Devices Corporation | Gene expression profiling from FFPE samples |
EP1508805A1 (en) * | 2003-08-20 | 2005-02-23 | Seikagaku Corporation | Stabilizing agent and blocking agent |
EP2104420A2 (en) * | 2006-10-30 | 2009-09-30 | George Mason Intellectual Properties, Inc. | Tissue preservation and fixation method |
CN102419365B (zh) * | 2011-08-24 | 2013-09-11 | 山东兰桥医学科技有限公司 | 一种三分类血液分析仪用标准物质的制备方法 |
JP5944302B2 (ja) * | 2012-04-13 | 2016-07-05 | 富士フイルム株式会社 | 位相差フィルム、偏光板、及び液晶表示装置 |
AU2015279557B2 (en) * | 2014-06-26 | 2017-03-16 | Indigo Ag, Inc. | Endophytes, associated compositions, and methods of use thereof |
WO2018183941A2 (en) * | 2017-03-30 | 2018-10-04 | Progenity Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with live biotherapeutics |
WO2020046910A1 (en) * | 2018-08-27 | 2020-03-05 | Figene, Llc | Chimeric antigen receptor fibroblast cells for treatment of cancer |
-
2020
- 2020-05-13 CN CN202010401219.8A patent/CN111528219B/zh active Active
Patent Citations (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6291170A (ja) * | 1985-06-05 | 1987-04-25 | Jipukomu Kk | 食品の冷凍保存方法 |
CN101310729A (zh) * | 2007-05-23 | 2008-11-26 | 辽宁省辽宁绒山羊育种中心 | 牛羊无动物源冻精稀释液及牛羊冷冻精液的制作方法 |
CN101278695A (zh) * | 2008-05-12 | 2008-10-08 | 海南椰国食品有限公司 | 一种糖化椰果及其糖化方法 |
CN101358968A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-02-04 | 甘肃省医学科学研究院 | 冻干人淋巴细胞表面抗原质控品及其制备方法 |
CN101363846A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-02-11 | 甘肃省医学科学研究院 | 一种冻干人淋巴细胞表面抗原质控品及其制备方法 |
JP2013029436A (ja) * | 2011-07-29 | 2013-02-07 | Mayekawa Mfg Co Ltd | 凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法 |
CN103048448A (zh) * | 2012-12-21 | 2013-04-17 | 杭州茂天赛科技有限公司 | 一种固定液 |
CN103063830A (zh) * | 2012-12-21 | 2013-04-24 | 杭州茂天赛科技有限公司 | 一种elisa预包被酶标板的制备方法 |
CN104357432A (zh) * | 2014-11-27 | 2015-02-18 | 苏州嘉禧萝生物科技有限公司 | 一种谷氨酸脱羧酶的保存液 |
WO2017160835A1 (en) * | 2016-03-14 | 2017-09-21 | The Regents Of The University Of Michigan | A surface tension mediated lyo-processing technique for preservation of biologics |
CN109311995A (zh) * | 2016-03-29 | 2019-02-05 | 台湾浩鼎生技股份有限公司 | 抗体、药物组合物和方法 |
CN107807235A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-03-16 | 郑州欧柯奇仪器制造有限公司 | 克仑特罗elisa检测试剂盒、其制备方法及其应用 |
CN107576789A (zh) * | 2017-11-03 | 2018-01-12 | 深圳市巴德生物科技有限公司 | 一种冻干nk细胞表面抗原质控品及其制备方法 |
CN107576788A (zh) * | 2017-11-03 | 2018-01-12 | 深圳市巴德生物科技有限公司 | 一种检测白细胞分化抗原的参照品及其制备方法 |
CN107576790A (zh) * | 2017-11-03 | 2018-01-12 | 深圳市巴德生物科技有限公司 | 一种冻干人淋巴细胞cd4表面抗原质控品及其制备方法 |
CN109917134A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-06-21 | 广州市进德生物科技有限公司 | 一种校准品稳定剂、测定c肽的检测试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
冷冻干燥过程研究;zhangkuan153;《道客巴巴》;20150304;第85页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111528219A (zh) | 2020-08-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Horan et al. | Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking | |
Pachmann et al. | Standardized quantification of circulating peripheral tumor cells from lung and breast cancer | |
Kimoto et al. | Further development of the rat Pig‐a mutation assay: Measuring rat Pig‐a mutant bone marrow erythroids and a high throughput assay for mutant peripheral blood reticulocytes | |
Booker et al. | Enzymatic immunoassay vs. gas/liquid chromatography for determination of phenobarbital and diphenylhydantoin in serum | |
CN111527395B (zh) | 一种免疫细胞中淋巴细胞的流式细胞仪检测方法 | |
US20220018745A1 (en) | A method for preparing lymphocyte sample for flow cytometry analysis | |
WO2021012925A1 (zh) | 一种人外周血淋巴细胞的检测方法 | |
JPH08506421A (ja) | 細胞関連分子を検出し、その量を測定するための方法および器具 | |
Siemsen et al. | Neutrophil isolation from nonhuman species | |
CN110389221B (zh) | 一种用于分析CD1c+树突状细胞亚群表型和功能的组合配方试剂盒及其应用 | |
CN105223361A (zh) | 一种检测急性t淋巴细胞白血病幼稚t细胞的试剂盒、应用及方法 | |
Dzik | Principles of counting low numbers of leukocytes in leukoreduced blood components | |
CN101126758A (zh) | 流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法 | |
CN111528219B (zh) | 一种用于t淋巴细胞亚群计数标准物质的冻干保护剂及其应用 | |
Staats | Immunophenotyping of human regulatory T cells | |
US4822745A (en) | Method for quantifying human reticulocytes | |
JP4279900B2 (ja) | 細胞生存率、有核赤血球、および白血球分類の同時分析方法 | |
Mariani et al. | Evaluation of an easy and affordable flow cytometer for volumetric haematopoietic stem cell counting | |
Santoro et al. | Platelet concentrations and platelet‐associated IgG in greyhounds | |
Szpechcinski et al. | Simple flow cytometric protocol of CD4+/CD8+ lymphocyte ratio assessment in bronchoalveolar lavage fluids from patients with interstitial lung diseases | |
CN104634720B (zh) | 一种基于几何平均荧光指数检测弱抗原表达水平的方法 | |
WILSON et al. | An automated, rapid, and quantitative microassay for histocompatibility testing | |
Wearne et al. | Automated enumeration of reticulocytes using acridine orange | |
CN115197322B (zh) | 用于慢性淋巴细胞白血病微小残留病灶检测的抗体组合物及其应用 | |
Kemble et al. | Platelet counting |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |